KR20000049243A

KR20000049243A - 인터페론-알파 핵산의 운반 및 발현 방법 및 이를 위한 조성물

Info

Publication number: KR20000049243A
Application number: KR1019990703347A
Authority: KR
Inventors: 나가부샨탓타나할리엘; 사하디바피
Original assignee: 이. 엘. 나가부샨, 리차드 비. 머피; 캔지, 인크.
Priority date: 1996-10-18
Filing date: 1997-10-16
Publication date: 2000-07-25
Also published as: EP1591528A3; ZA979295B; TR199901190T2; JP2001502540A; JP2008301832A; AR013618A1; CZ131699A3; ID24500A; HUP9904219A2; NZ335134A; WO1998017801A1; SK50699A3; NO991839D0; EP1591528A2; EP0932679A1; PL332856A1; IL129387A0; DE932679T1; NO991839L; BR9712362A

Abstract

본원에는 치료 목적을 위한 인터페론 알파의 조직 특이적 발현 방법 및 이를 위한 조성물이 기재되어 있다.

Description

인터페론-알파 핵산의 운반 및 발현 방법 및 이를 위한 조성물{Methods and compositions for delivery and expression of interferon-alpha nucleic acids}

발명의 배경

사람 인터페론 알파(IFN-α)는 24개 이상의 아종을 포함하는 단백질의 부류이다[참조: Zoon, K.C., Interferon 9:1 (1987), Gresser, I., ed., Academic Press, NY]. 이러한 인터페론 알파는 본래, 세포에서 항바이러스성 상태를 유도시킬 수 있는 제제로서 기재되었지만, 지금은 면역 시스템의 수 많은 기능에 영향을 미치는 다상유전성(pleiotropic) 림포카인으로서 공지되어 있다[참조: Openakker et al., Experimentia 45:513 (1989)].

IFN-α는 유모상 세포성 백혈병, 카포시 육종, 신장 세포 암종, 비-호지킨 임파종(non Hodgkin's lymphoma), T-세포 백혈병, 다중 및 만성 골수성 백혈병, 악성 흑색종, 방광 세포 암종, 직장 암종(5-FU 지님), 첨규습우, 리노바이러스, 및 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 비 A 비 B형 바이러스(NANB) 또는 δ형 간염 바이러스(HDV) 감염으로 인해 발생되는 각종 형태의 만성 바이러스성 간염을 포함한 질병에 대한 치료 목적으로 광범위하게 사용되고 있다[참조: Pestka, AIDA Research & Human Retroviruses 8(5):776-786 (1992)]. IFN-α는 또한, 골수 증식성 장애가 있는 환자에게서 거핵구형성증과 조절성 혈소판증가증에 대해 상당히 효과적인 것으로 밝혀졌다[참조: Talpaz et al., Annals Int. Med. 99:789-792 (1983); Gisslinger et al., Lancet i:634-637 (1989); Ganser et al., Blood 70:1173-1179 (1987)].

유전자 치료 기술은 인터페론과 같은 치료학적 유전자의 발현을 관심있는 특정한 조직에 표적화시킴으로써, 특정 피검물이 이러한 치료학적 유전자 산물에만 노출되도록 제한하여 왔다. 그러나, 일반적으로, 관심있는 특정 조직을 표적화하는 능력은 유전자 치료 기술의 주요 도전과제 중의 하나이다. 인터페론 유전자를 표적화하는 것에 관한 한 예로서, WIPO 국제특허원공보 제WO 93/15609호는 인터페론 유전자를 카테터 시스템을 사용하여 혈관벽 손상 영역에 투여함으로써 상기 유전자를 혈관 조직에 운반하는 것에 관해 기술하고 있다. 또 다른 예로서는, 프로드럭을 효소적으로 전환시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 아데노바이러스성 벡터, "자살 유전자" 및 사이토킨을 암호화하는 유전자를 충실성 종양에 직접적으로 투여한다.

치료학적 유전자를 관심있는 조직에 표적화하는 기타 방법으로는 대체로 다음과 같은 세 가지 범주의 방법이 있는데, 즉 형질도입적 표적화, 위치적 표적화 및 전사적 표적화 방법이 있다[참조: Miller et al., FASEB J. 9:190-199 (1995)]. 형질도입적 표적화는 1차적으로 수용체 리간드를 선택함으로써 달성되는, 특이적 세포 내로의 선택적인 유입을 지칭한다. 게놈 내에서의 위치적 표적화는 크로마틴의 활성 영역과 같이 목적하는 유전자 위치 내로의 통합이나, 표적 유전자와 같은 내인성 뉴클레오티드 서열과의 동종 재조합을 통하여 통합되는 것을 지칭한다. 전사적 표적화는 관심있는 세포에 맞도록 조정된 유전자 발현을 고도로 특이적으로 조절시키는 전사 프로모터를 삽입시킴으로써 획득되는 선택적인 발현을 지칭한다.

조직 특이적 프로모터의 예로는 근육 및 심장 조직에서 디스트로핀 cDNA의 발현을 지시하는데 사용되어온, 크레아틴 키나제에 대한 프로모터[참조: Cox et al., Nature 364:725-729 (1993)]; 및 B 세포에서 자살 유전자의 발현을 위한 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 프로모터[참조: Maxwell et al., Cancer Res. 51:4299-4304 (1991)]가 있다. 내피 세포-특이적 조절 영역 또한 특징 확인되었다[참조: Jahroudi et al., Mol. Cell. Biol. 14:999-1008 (1994)]. 간 계통 세포와 간암 세포를 각각 표적화하기 위한, 알부민 또는 알파-페토프로테인 프로모터[참조: Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8039-8043 (1991)]의 조절 하에서 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자를 운반하는 암포트로픽(amphotrophic) 레트로바이러스성 벡터가 작제되었다. 이러한 조직 특이적 프로모터는 레트로바이러스성 벡터[참조: Hartzoglou et al., J. Biol. Chem. 265:17285-17293 (1990)]; 및 아데노바이러스 벡터[참조: Friedman et al., Mol. Cell. Biol. 6:3791-3797 (1986)]에 사용할 수 있고 여전히 이들의 조직 특이성을 유지하고 있다.

따라서, 암, 간염, 및 알파 인터페론을 이용하여 치료될 수 있는 기타 질환의 치료를 위해 알파 인터페론의 발현을 표적화할 필요가 있다. 본 발명은 이러한 필요성과 기타 사항에 역점을 두고 있다.

발명의 요약

본 발명의 한 국면은 관심있는 조직에 대한 특이성을 지니고 있는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고 인터페론 알파 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 절편을 포함하는 벡터를 환자의 관심있는 조직 내로 도입하는 것을 포함하여(여기서, 폴리펩티드는 관심있는 조직에서 발현된다), 환자에게 인터페론 알파 폴리펩티드를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 국면은 관심있는 조직에 대한 특이성을 지니고 있는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고 인터페론 알파 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 절편을 포함하는 벡터를 관심있는 조직 내로 도입하는 것을 포함하여(여기서, 인터페론 알파 폴리펩티드는 환자의 관심있는 조직에서 발현된다), 환자의 관심있는 조직에서 인터페론 알파 수준를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 국면은 암성(cancerous) 조직에 대한 특이성을 지니고 있는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고 인터페론 알파 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 절편을 포함하는 벡터를 암성 조직에 투여하는 것을 포함하여(여기서, 인터페론 알파 폴리펩티드는 조직에서 발현된다), 인터페론 알파에 반응성인 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 국면은 간 세포에 대한 특이성을 지니고 있는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고 인터페론 알파 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 절편을 포함하는 벡터를 환자의 간에 투여하는 것을 포함하여(여기서, 인터페론 알파 폴리펩티드는 환자의 간에서 발현된다), 간염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 국면은 관심있는 특정 조직에 대한 특이성을 지니고 있는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고 인터페론 알파 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 절편을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

도 1은 사람 전립선 암 세포에 대한 인터페론 알파의 항증식성 효과를 도시하는 그래프이다.

도 2는 간 특이적 유전자의 프로모터에 의해 구동된 루시퍼라제 발현의 측정치로서의 루시퍼라제 활성을 도시하는 그래프이다.

본 발명은 조직 특이적 프로모터를 사용하여 IFN-α를 조직 특이적으로 발현하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 IFN-α는 인터페론 알파, 이의 결실, 삽입 또는 치환 변이체, 생물학적 활성 단편, 및 대립유전자 형태의 모든 아부류를 포함하는 것으로 간주된다. 본원에서 사용된 바와 같은 "생물학적 활성"이란 당해 분야에서 널리 공지된 기술에 의해 측정된 바와 같이 항-바이러스성 또는 항-증식성 활성을 지칭한다[참조: Openakker et al., supra; Mossman J. Immunol. Methods 65:55 (1983)]. 재조합 인터페론 알파는 여러 그룹에 의해 클로닝된 다음 이. 콜라이에서 발현되었다[참조: Weissmann et al., Science 209:1343-1349 (1980); Sreuli et al., Science 209:1343-1347 (1980); Goeddel et al., Nature 290:20-26 (1981); Henco et al., J. Mol. Biol. 185:227-260 (1985)]. 바람직하게는, 인터페론 알파가 인터페론 알파 2a 또는 2b이긴 하지만[참조: 제WO 91/18927호], 어떠한 인터페론 알파도 사용될 수 있다.

IFN-α 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. "암호화하는 핵산 서열"이란 특이적 단백질 또는 펩티드의 발현을 지시하는 핵산을 지칭한다. 이러한 핵산 서열에는 RNA로 전사되는 DNA 스트랜드 서열과 단백질로 해독되는 RNA 서열 모두가 포함된다. 이러한 핵산 서열에는 완전한 길이의 핵산 서열 뿐만 아니라 완전한 길이의 단백질로부터 유도된 완전하지 않은 길이의 서열 모두가 포함된다. 이러한 서열에는 특이적 숙주 세포에 코돈 우선성을 제공하기 위해 도입될 수 있는 천연 서열(들)의 변성자 코돈이 포함된다는 것을 또한 인지해야 한다.

용어 "벡터"는 바이러스성 발현 시스템인 자율적인 자가-복제성 환상 DNA(플라스미드)를 지칭하고, 이에는 발현 플라스미드와 비-발현 플라스미드 모두가 포함된다. 재조합 미생물 또는 세포 배양물이 "발현 벡터"의 숙주로서 기재되는 경우에는, 이에는 염색체외 환상 DNA, 및 숙주 염색체(들) 내로 삽입된 DNA 모두가 포함된다. 벡터가 숙주 세포에 의해 유지되는 경우에는, 이러한 벡터는 유사분열 동안 상기 세포에 의해 자율적인 구조물로서 안정하게 복제되거나, 숙주의 게놈 내에 삽입될 수 있다. 벡터는 이러한 벡터 내에서 IFN-α를 암호화하는 핵산이 전사되고, 경우에 따라, 형질감염된 세포에서 해독되도록, 위치적이고도 순차적으로 배향된, 즉 기타 필수 요소와 작동적으로 연결된 다중 유전 요소를 함유한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "유전자"는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 지칭하는 것으로 간주된다. 이러한 정의는 유전자 생성물의 기능에 영향을 미치지 않는, 각종 서열 다형성, 돌연변이, 및/또는 서열 변이체를 포괄한다. 용어 "유전자"는 암호화 서열 뿐만 아니라 프로모터, 인핸서 및 종결 영역과 같이 조절 영역을 포함하는 것으로 간주된다. 이러한 용어는 추가로, 또 다른 스플라이스 부위로부터 발생된 변이체와 함께, mRNA 전사체로부터 스플라이스된 모든 인트론과 기타 DNA 서열을 포괄한다.

용어 "플라스미드"는 세포에서 복제될 수 있는 자율적인 환상 DNA 분자를 지칭하고, 이에는 발현형 및 비-발현형 모두가 포함된다. 재조합 미생물 또는 세포 배양물이 "발현 플라스미드"의 숙주로서 기재되는 경우에는, 이에는 염색체외 환상 DNA 분자 및 숙주 염색체(들) 내로 삽입된 DNA 모두가 포함된다. 플라스미드가 숙주 세포에 의해 유지되는 경우에는, 이러한 플라스미드는 유사분열 동안 상기 세포에 의해 자율적인 구조물로서 안정하게 복제되거나, 숙주의 게놈 내에 삽입될 수 있다.

"재조합 단백질" 또는 "재조합적으로 생성된 단백질"이란 단백질을 발현할 수 있는 DNA의 내인성 복사물을 갖고 있지 않는 천연이 아닌 세포를 사용하여 생성된 펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 이러한 세포는 적절한 핵산 서열의 도입으로 인해 유전적으로 변형되었기 때문에 단백질을 생성한다. 재조합 단백질은 단백질을 생성하는 세포와 정상적으로 연합된 단백질 및 기타 아세포성 성분과 연합해서는 발견되지 않을 것이다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

일반적으로, IFN-α는 작용적 발현을 위해 적절한 간격을 두고 순차적으로 연결된 다음 요소들을 포함하는 발현 벡터에 제공된다: 조직 특이적 프로모터, 전사용 개시 부위, 3' 비해독 영역, 5' mRNA 리더 서열, 알파 인터페론 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 및 폴리아데닐화 시그날. 발현 및/또는 분비를 보조해주는 인핸서 서열 및 기타 서열이 또한 상기 발현 벡터에 포함될 수 있다. 약물 내성을 암호화하는 유전자와 같은 부가의 유전자가 포함되어 재조합 벡터의 존재에 대해 선별 또는 스크리닝시킬 수 있다. 이러한 부가의 유전자에는, 예를 들면, 네오마이신 내성, 다중-약물 내성, 티미딘 키나제, 베타-갈락토시다제, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자가 포함될 수 있다.

본 발명에서는, 관심있는 특정한 조직에 의해 우선적으로 사용된 프로모터 및/또는 기타 발현 요소들을 사용함으로써, IFN-α를 관심있는 특정 조직에 표적화시킨다. 공지된 조직 특이적 프로모터의 예로는 근육 및 심장 조직에서 디스트로핀 cDNA의 발현을 지시하는데 사용되어 온, 크레아틴 키나제에 대한 프로모터[참조: Cox et al., Nature 364:725-729 (1993)]; B 세포에서 유전자의 발현을 위한 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 프로모터; 간 계통 세포와 간암 세포를 각각 표적화하기 위한 알부민 또는 알파-페토프로테인 프로모터가 있다.

간에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 HMG-CoA 리덕타제 프로모터[참조: Luskey, Mol. Cell. Biol. 7(5):1881-1893 (1987)]; 스테롤 조절 요소 1[참조: SRE-1; Smith et al., J. Biol. Chem. 265(4):2306-2310 (1990)]; 포스포에놀 피루베이트 카복시 키나제(PEPCK) 프로모터[참조: Eisenberger et al., Mol. Cell Biol. 12(3):1396-1403 (1992)]; 사람 C-반응성 단백질(CRP) 프로모터[참조: Li et al., J. Biol. Chem. 265(7):4136-4142 (1990)]; 사람 글루코키나제 프로모터[참조: Tanizawa et al., Mol. Endocrinology 6(7):1070-81 (1992)]; 콜레스테롤 7-알파 하이드로일라제(CYP-7) 프로모터[참조: Lee et al., J. Biol. Chem. 269(20):14681-9 (1994)]; 베타-갈락토시다제 알파-2,6 시알릴트랜스퍼라제 프로모터[참조: Svensson et al., J. Biol. Chem. 265(34):20863-8 (1990)]; 인슐린 유사 성장 인자 결합성 단백질(IGFBP-1) 프로모터[참조: Babajko et al., Biochem Biophys. Res. Comm. 196(1):480-6 (1993)]; 알도라제 B 프로모터[참조: Bingle et al., Biochem. J. 294(Pt2):473-9 (1993)]; 사람 트랜스페린 프로모터[참조: Mendelzon et al., Nucl. Acids Res. 18(19):5717-21 (1990)]; 콜라겐 유형 Ⅰ 프로모터[참조: Houglum et al., J. Clin Invest. 94(2):808-14 (1994)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

전립선에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 프로스태트산 포스파타제(PAP) 프로모터[참조: Banas et al., Biochim. Biophys. Acta. 1217(2):188-94 (1994)]; 94개의 전립선 분비성 단백질(PSP 94) 프로모터[참조: Nolet et al., Biochim. Biophys. ACTA 1098(2):247-9 (1991)]; 전립선 특이적 항원 복합체 프로모터[참조: Casper et al., J. Steroil Biochem. Mol. Biol. 47(1-6):127-35 (1993)]; 사람 선상 칼리크레인 유전자 프로모터(hgt-1)[참조: Lilja et al., World J. Urology 11(4):188-91 (1993)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

위 조직에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 사람 H⁺/K⁺-ATPase 알파 아단위 프로모터[참조: Tanura et al., FEBS Letters 298:(2-3):137-41 (1992)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

췌장에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 췌장염 관련 단백질 프로모터(PAP)[참조: Dusetti et al., J. Biol. Chem. 268(19):14470-5 (1993)]; 엘라스타제 1 전사 인핸서[참조: Kruse et al., Genes and Development 7(5):774-86 (1993)]; 췌장 특이적 아밀라제 및 엘라스타제 인핸서 프로모터[참조: Wu et al., Mol. Cell. Biol. 11(9):4423-30 (1991); Keller et al., Genes & Dev. 4(8):1316-21 (1990)]; 췌장 콜레스테롤 에스테라제 유전자 프로모터[참조: Fontaine et al., Biochemistry 30(28):7008-14 (1991)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

자궁내막에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 우테로글로빈 프로모터[참조: Helftenbein et al., Annal. NY Acad. Sci. 622:69-79 (1991)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

부신 세포에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 콜레스테롤 측쇄 절단(SCC) 프로모터[참조: Rice et al., J. Biol. Chem. 265:11713-20 (1990)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

전체적인 신경계에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 감마-감마 에놀라제(뉴론 특이적 에놀라제, NSE) 프로모터[참조: Forss-Petter et al., Neuron 5(2):187-97 (1990)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

뇌에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 신경섬유 중쇄(NF-H) 프로모터[참조: Schwartz et al., J. Biol. Chem. 269(18):13444-50 (1994)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

임파구에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 사람 CGL-1/그랜자임 B 프로모터[참조: Hanson et al., J. Biol. Chem. 266(36):24433-8 (1991)]; 말단 데옥시 트랜스퍼라제(TdT), 람다 5, VpreB, 및 lck(임파구 특이적 티로신 단백질 키나제 p561ck) 프로모터[참조: Lo et al., Mol. Cell. Biol. 11(10):5229-43 (1991)]; 사람 CD2 프로모터 및 이의 3' 전사 인핸서[참조: Lake et al., EMBO J. 9(10):3129-36 (1990)]; 및 사람 NK 및 T 세포 특이적 활성화(NKG5) 프로모터[참조: Houchins et al., Immunogenetics 37(2):102-7 (1993)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

결장에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 pp60c-src 티로신 키나제 프로모터[참조: Talamonti et al., J. Clin. Invest. 91(1):53-60 (1993)]; 기관 특이적 신생항원(OSNs), mw 40kDa(p40) 프로모터[참조: Ilantzis et al., Microbiol. Immunol. 37(2):119-28 (1993)]; 결장 특이적 항원-P 프로모터[참조: Sharkey et al., Cancer 73(3 supp.) 864-77 (1994)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

유방 세포에 대한 조직 특이적 발현 요소들의 예로는 사람 알파-락트알부민 프로모터[참조: Thean et al., British J. Cancer. 61(5):773-5(1990)]가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

관심있는 조직에서의 발현 특이성을 보조해주는 기타 요소들에는 분비 리더 서열, 인핸서, 핵상 국재화 시그날, 삼투용해성 펩티드 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 이들 요소들은 특이성을 보조하기 위해 관심있는 조직으로부터 유도된다.

본 발명의 핵산 서열을 핵산 조작하는 기술, 예를 들면, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 발현 벡터 내로 아클로링시키는 방법, 프로브를 표지시키는 방법, DNA 하이브리드화 방법 등이 일반적으로 본원에 참조문헌으로 삽입된 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual(2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)]에 기재되어 있다. 이러한 매뉴얼은 "Sambrook et al"으로서 후술된다.

관심있는 서열을 암호화하는 DNA를 분리시킨 다음 클로닝시키기만 하면, 암호화된 단백질을 재조합적으로 공학 처리된 각종 세포에서 발현시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련인들은 암호화하는 DNA의 발현에 이용될 수 있는 수 많은 발현 시스템에 관한 지식이 있는 것으로 예상된다. 본원에서는 원핵체 또는 진핵체에서 단백질을 발현하는 것으로 공지된 각종 방법을 상세히 기재하지는 않았다.

간략히 요약하면, 관심있는 서열을 암호화하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로, DNA 또는 cDNA를 프로모터(이는 구성적이거나 유도성이다)에 작동적으로 연결시킨 다음, 발현 벡터에 삽입시킴으로써 달성될 것이다. 이러한 벡터는 원핵체 또는 진핵체에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 발현 벡터는 전사 및 해독 터미네이터, 개시 서열 및 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 클로닝된 유전자의 고 수준의 발현을 획득하기 위해서는, 전사를 지시하는 강력한 프로모터, 해독 개시를 위한 리보좀 결합 부위 및 전사/해독 터미네이터를 최소한 함유하는 발현 플라스미드를 작제하는 것이 바람직하다. 이러한 발현 벡터는 또한, 하나 이상의 독립적인 터미네이터 서열, 진핵체와 원핵체 모두에서 플라스미드의 복제를 허용해 주는 서열, 즉 셔틀(shuttle) 벡터, 및 원핵성 및 진핵성 시스템 모두에 대한 선별 마커를 함유하는 유전적 발현 카셋트를 포함할 수 있다[참조: Sambrook et al].

본 발명의 작제물을 각종 방법에 의해 생체내 또는 생체외에서 관심있는 조직에 도입할 수 있다. 본 발명의 몇몇 양태에서는, 이러한 벡터를 현미주사법, 인산칼슘 침전법, 리포좀 융합법 또는 바이오리스틱(biolistics)과 같은 방법에 의해 세포에 도입한다. 추가의 양태에서는, DNA를 관심있는 조직에 의해 직접적으로 취한다. 기타 양태에서는, 상기 작제물을 바이러스성 벡터 시스템 내로 패키징하여 세포로의 도입을 촉진시킨다.

본 발명을 실시하는데 유용한 바이러스성 벡터 시스템으로는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노 관련 바이러스, 마우스의 미세한 바이러스(MVM); HIV, 신드비스(sindbis) 바이러스, 및 로우스(Rous) 육종 바이러스 및 MoMLV 등의 레트로바이러스가 있다. 전형적으로, 본 발명의 작제물을 이러한 벡터에 삽입시킴으로써, 전형적으로 바이러스성 DNA를 수반하는 인터페론 발현 작제물을 패키징하고, 민감성 숙주 세포를 감염시키며, 인터페론-α 유전자를 발현시킨다. 특히 유리한 벡터는 문헌[참조: Wills et al., Hum. Gene Therapy 5:1079-1088 (1994)]에 기재된 아데노바이러스 벡터이다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명의 재조합 IFN-α 작제물을 DNA 연결 잔기를 통하여 흡수 촉진(예를 들면, 피복된 소와의 함입 및 엔도좀의 내부이행)을 위해 세포 수용체 리간드에 접합시킨다[참조: Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); WO 92/06180]. 예를 들면, 본 발명의 DNA 작제물을 폴리리신 잔기를 통하여 간세포의 아시알로 당단백질 수용체에 대한 리간드인 아시알로-오로뮤코시드(asialo-oromucocid)에 연결시킬 수 있다.

유사하게, 수용체에 특이적인 수용체 리간드 또는 항체를 부가함으로써 본 발명의 작제물을 패키징하는데 사용된 바이러스성 외막을 변형시켜 특정한 세포 내로의 수용체-매개된 세포 이물 흡수 작용을 허용할 수 있다[참조: WO 93/20221, WO 93/14188 및 WO 94/06923]. 본 발명의 몇몇 양태에서는, 본 발명의 DNA 작제물을 아데노바이러스 입자와 같은 바이러스성 단백질에 연결시켜 세포 이물 흡수 작용을 촉진시킨다[참조: Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8850-8854 (1991)]. 다른 양태에서는, 본 발명의 분자상 접합체가 미소관 억제인자(WO 94/06922); 인플루엔자 바이러스 혈구응집소를 모사하는 합성 펩티드[참조: Plank et al., J. Biol. Chem. 269:12918-12924 (1994)]; 및 SV40 T 항원과 같은 핵상 국재화 시그날(WO 93/19768)을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료"는 관심있는 특정 조직, 특히 몇몇 병원성을 나타내는 하나 이상의 세포를 갖는 조직을 알파 인터페론에 노출시킬 목적으로 알파 인터페론을 암호화하는 핵산을 환자에게 도입하는 것을 지칭하는 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들면, "암성" 조직은 하나 이상의 세포가 암성, 악성, 종양성, 예비암성, 형질전환된 것이거나, 선종 또는 암종으로서 분류되거나, 이들 질환에 대해 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 기타 동의어로서 분류되는 조직을 지칭하는 것으로 간주된다.

본원에서 사용된 바와 같은 "비-암성" 세포는 당해 분야에서 암성 또는 암 세포의 정의로부터 배제된 것으로 인지되며, 이에는 정상 세포 및 몇몇 병원성 양상, 예를 들면, 바이러스, 세균, 기생충 또는 기타 유기체에 의한 감염을 나타내는 세포, 정상 또는 야생형 대응자보다 덜 최적인 상태로 만드는 유전이 가능한 상태에 의해 영향을 받는 세포, 당뇨병 등과 같이 몇몇 추정의 비-감염성 질환 상태에 의해 영향을 받는 세포 및 이들 스트레스 중 어떠한 것에도 견디어 내는 세포가 포함될 수 있다.

IFN-α의 투여가 도움을 주는 모든 질환의 치료 또는 치료법은 이러한 질환의 진단 이전에 시작하거나 이러한 질환의 진단 이후의 적절한 시기에 시작할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 예비암성 병변을 갖고 있는 것으로 추정되거나 몇몇 유형의 암이 발생할 가능성이 높은 환자는 본 발명에 따르는 조성물로 치료할 수 있다. 유사하게, B형 간염 바이러스와 같은 병원체에 노출된 사람은 간염 진단 전에 본 발명에 따르는 조성물로 치료할 수 있다. 추가로, HBV 운반체를 갖고 있거나 아마도 운반체로 되는 것을 갖는 것으로 추정되는 환자는 질환의 전반적인 증상이 개선된 후에 치료할 수 있다.

본 발명의 작제물은 각종 암, 간염, 및 조직에서의 IFN-α 수준을 증가시키기 위한 IFN-α 투여가 유용한 기타 질환, 예를 들면, 궤양성 대장염, 리노바이러스 감염, 첨규습우, 후두 유두염; HIV 감염, 섬유증, 과도한 IL-4 및 IgE 생성으로 인한 알레르기성 질환, 및 크론병(Crohn' disease) 등의 육아종 장애의 치료법에 유용하지만, 이에 제한되지는 않는다. 프로모터와 같이 몇몇 조직 특이적 발현 요소를 동정할 수 있는 어떠한 조직도 표적화할 수 있긴 하지만, 특히 관심있는 것은 사람 전립선 암종 및 간암 조직과 같은 암성 조직에서 IFN-α 수준을 증가시키기 위해 IFN-α를 조직 특이적으로 투여하는 것이다. 추가로, 본 발명의 작제물을 사용하여, 만성 B형 간염 바이러스 운반체에서와 같이, 비-암성 세포가 인터페론을 불충분하게 생성시키는, 즉 건강한 세포보다 인터페론을 덜 생성시키는 병리학적 상태의 조직에서 IFN-α 수준을 증가시킬 수 있다[참조: Nouri-Aria et al., Hepatology 14(6):1308-1311 (1991)]. 본 발명의 몇몇 양태에서는, 당해 재조합 작제물을 인접한 조직 또는 세포로 표적화시켜 관심있는 세포 집단에서의 인터페론 알파의 국소적 농도를 증가시킨다.

본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 포유동물 대상물, 바람직하게는 사람에게 투여하는 것이 허용되는 투여용으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 몇몇 양태에서는, 본 발명의 조성물을 특정 조직에 직접 주사하여 투여하거나 관심있는 조직내로 공급되는 혈관에 직접 투여할 수 있다. 본 발명의 추가의 양태에서는, 본 발명의 조성물을 "이동부위적으로", 즉 방광내, 병변내 및/또는 국소적으로 투여한다. 본 발명의 기타 양태에서는, 본 발명의 조성물을 주사, 흡입, 좌제식, 경피 운반 등에 의해 전신으로 투여한다. 본 발명의 추가의 양태에서는, 본 발명의 조성물을 카테터 또는 기타 장치를 통하여 투여하여 관심있는 원거리의 조직, 예를 들면, 내장 기관에 접근하도록 해준다. 본 발명의 조성물을 또한, 데포형 장치, 이식체 또는 캡슐화 제형으로 투여하여 당해 조성물이 서방출되도록 해준다.

본 발명은 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해되거나 현탁된 본 발명의 조성물의 용액을 포함하는 투여용 조성물을 제공한다. 각종 수성 담체, 예를 들면, 물, 완충수, 0.8% 식염수, 0.3% 글리신, 하이알루론산 등이 사용될 수 있다. 이들 조성물은 통상적이고 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균시킬 수 있거나, 멸균 여과시킬 수 있다. 이로써 생성된 수용액을 그 자체로서 사용하기 위해 패키징하거나, 동결건조시킬 수 있는데, 이러한 동결건조된 제제는 투여에 앞서 멸균성 용액과 배합된다. 당해 조성물은 생리학적 상태에 근접하기 위해 요구되는 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들면, pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제, 습윤제 등, 예를 들면, 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 솔비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등을 함유할 수 있다.

약제학적 제형 중의 본 발명의 조성물의 농도는 광범위할 수 있는데, 즉 약 0.1중량% 미만, 통상적으로는 약 2중량% 이상에서 20중량% 내지 50중량%로 많을 수 있으며, 선택된 특정한 투여 형태에 따라서 유체 용량, 점도 등에 의해 1차적으로 선택될 것이다.

본 발명의 조성물은 또한 리포좀을 통하여 투여될 수 있다. 리포좀에는 에멀전, 발포체, 미셀, 불용성 단층, 액정, 인지질 분산액, 박층 등이 포함된다. 이들 제제에서는, 운반시키고자 하는 본 발명의 조성물이 단독으로 또는 목적하는 표적에 결합되는 분자, 예를 들면, 항체와 함께 또는 기타 치료학적 또는 면역원성 조성물과 함께, 리포좀의 일부로서 혼입된다. 따라서, 본 발명의 목적하는 조성물로 충전되거나 장식된 리포좀을 전신에 운반시키거나, 관심있는 조직에 관련될 수 있는데, 이때 리포좀은 선택된 치료학적/면역원성 펩티드 조성물을 운반한다.

본 발명에서 사용하기 위한 리포좀은 일반적으로 중성 및 음성적으로 하전된 인지질 및 스테롤, 예를 들면, 콜레스테롤을 포함하는 표준 소포체-형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 일반적으로, 예를 들면, 리포좀 크기, 산 불안정성 및 혈류에서의 리포좀 안정성을 고려하여 이루어진다. 본원에 참조문헌으로 삽입된 문헌[참조: Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호]에 기재된 바와 같은 각종 방법이 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 함유하는 리포좀 현탁제는 특히 투여 방식에 따라서 다양하고 본 발명의 조성물이 운반되어 질병 단계가 치료되는 용량으로 정맥내, 국소, 국부 투여 등으로 투여할 수 있다.

고형 조성물의 경우, 통상적인 무독성 고체 담체가 사용될 수 있으며, 이의 예로는 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 탈큠, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈, 탄산마그네슘 등이 있다. 경구 투여의 경우, 약제학적으로 허용되는 무독성 조성물은 앞서 열거된 담체와 같이 통상적으로 이용되는 부형제와 일반적으로 활성 성분, 즉 본 발명에 따르는 하나 이상의 조성물을 10 내지 95%, 더욱 바람직하게는 25 내지 75%의 농도로 혼입함으로써 형성된다.

에어로졸 투여의 경우, 본 발명의 조성물은 계면활성제 및 추진제와 함께 바람직하게는 미분된 형태로 공급된다. 본 발명의 조성물의 전형적인 비율은 0.01 내지 20중량%, 바람직하게는 1 내지 10중량%이다. 계면활성제는 물론 무독성이어야 하고, 바람직하게는 추진제에 가용성이다. 이러한 제제의 대표적인 예는 카프로산, 옥탄산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산과 같은 탄소수 6 내지 22의 지방산과 지방족 다가 알콜 또는 이의 사이클릭 무수물과의 에스테르 또는 부분 에스테르이다. 혼합 또는 천연 글리세라이드 등의 혼합 에스테르가 사용될 수 있다. 계면활성제는 당해 조성물의 0.1 내지 20중량%, 바람직하게는 0.25 내지 5중량%를 구성할 수 있다. 당해 조성물의 잔여량은 통상적으로 추진제이다. 담체는 경우에 따라, 비내 운반용 레시틴을 포함할 수 있다.

본 발명의 작제물은 부가적으로, 당해 분야에 널리 공지된 기술에 의해 데포형 시스템, 캡슐화 형태 또는 이식체 형태로 운반될 수 있다. 유사하게, 당해 작제물은 펌프를 통하여 관심있는 조직에 운반될 수 있다.

본 발명의 몇몇 양태에서는, 본 발명의 조성물을 생체외에서 환자로부터 체외 배양된 세포 또는 조직에 투여한 다음, 이를 환자에게 다시 주입한다. 유전자 치료 작제물의 생체외 투여에 관한 예가 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Arteaga et al., Cancer Research 56(5):1098-1103 (1996); Nolta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(6):2414-9 (1996); Koc et al., Seminars in Oncology 23(1):46-65 (1996); Raper et al., Annals of Surgery 223(2):116-26 (1996); Dalesandro et al., J. Thorac. Cardi. Surg. 11(2):416-22 (1996); and Makarov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1):402-6 (1996)].

다음 실시예는 본 발명을 예시할 목적으로 제시된 것이며, 이로써 본 발명의 범주가 제한되지는 않는다.

실시예

Ⅰ. 전립선 암 세포 증식에 대해 효과적인 인터페론-알파

3가지 상이한 전립선 암종 세포, 즉 LNCaP(안드로겐 의존적, ATCC #CRL 1740), PC-3 세포(안드로겐 독립적, ATCC #CRL 1435) 및 DU-145(안드로겐 독립적, ATCC #HTB 81)를 연구하였다. 이들 세포를 다음 배지에서 72시간 동안 5가지 상이한 농도(10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵IU/ml)의 인터페론-α2b(쉐링-플라우(Schering-Plough))에서 생장시킨다: PC-3은 7% 태아 송아지 혈청이 보충된 햄(Ham's) F12 K 배지(GIBCO BRL)에서 배양하고; DU-145는 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 DMEM(GIBCO BRL)에서 배양하며; LnCaP는 5% 태아 송아지 혈청이 보충된 RPMI 1640(GIBCO BRL)에서 배양한다.

인터페론의 항증식성 효과를 MIT 검정에 의해 측정한다[참조: Mossman J. Immunol. Methods 65:55 (1983)]. PC-3 및 DU-145 세포는 인터페론의 농도 증가에 대해 지속적인 민감도를 나타내며, 10⁴IU/ml에서 안정 상태가 된다. 안드로겐 민감성 LNCaP 세포는 IFN에 반응하지 않는다. 두 가지 안드로겐 불응성 세포를 비교해보면, PC-3 세포가 DU-145 세포보다 더 민감성인 것으로 나타났다. 이들 데이터가 도 1에 요약되어 있다. 진한 막대가 세포주 PC-3(안드로겐 독립적)을 나타내고; 크로스-해치형 막대는 세포주 DU-145(안드로겐 독립적)을 나타내며; 사선 막대는 LNCaP(안드로겐 의존적)를 나타낸다.

Ⅱ. 발현 카셋트의 작제

전립선 암종 세포에서 IFN-α의 조직 특이적 발현을 위해 전립선 특이적 항원 유전자(PSA)에 대한 대략 600bp 기저 프로모터의 조절하에서 인터페론 알파 2b(IFN-α2b)의 완전한 cDNA 서열 및 IFN-α2b에 대한 완전한 시그날 서열[참조: Sreuli et al., Science 209:1343-1347 (1980); Goeddel et al., Nature 290:20-26 (1981); Henco et al., J. Mol. Biol. 185:227-260 (1985)]을 갖는 발현 벡터를 작제한다. 기본적으로, 5' 말단에 이의 추정상의 시그날 리더를 갖는 완전한 길이의 IFN-α2b cDNA를 포유류 발현 벡터 PCDNA3(인비트로겐(Invitrogen))에서 CMV 프로모터의 HindII 및 Eco RI 하부에 있는 폴리클로닝 부위 내로 클로닝하여 플라스미드 DIFN를 생성시킨다. PSA 프로모터(BBRC 161:1151-1159 (1989); Genebank #M27274)를 함유하는 PSA 유전자의 5' 플랭킹 서열로 CMV 프로모터를 대체시키면서 상기 벡터에 삽입시켜 플라스미드 PSADIFN를 생성시킨다.

Ⅲ. 간 특이적 유전자에 대한 기저 프로모터의 클로닝

4가지 사람 간 특이적 유전자, 즉 알부민(HAL), α1-항트립신(HAT), 알파 페토프로테인(AFP) 및 하이드록시-메틸-글루타릴 CoA 리덕타제(HMG)로부터의, 기저 프로모터를 포함하는 5' 플랭킹 서열을 각각 ATCC 65731, ATCC 61597, ATCC 65735, 및 ATCC 59567로부터 인터페론 유전자 운반 및 간 세포에서의 이의 조직 특이적 발현에 사용하기 위한 pCRScript 벡터 내로 아클로닝시킨다[참조: Luskey Mol. Cell. Biol. 7(5):1881-1893 (1987); Minghetti et al., J. Biol. Chem. 261(15):6747-6757 (1986); Long et al., Biochemistry 23:4828-4837 (1984); Gibbs Biochemistry 26:1332-1343 (1987)].

간 특이적 효소에 대한 상기 유전자의 5' 플랭킹 서열을 함유하는 pCRScript 벡터에서 상기 삽입체의 제한 효소 지도를 그린 후, 상기 삽입체를 pCRScript 벡터로부터의 리포터 플라스미드인 pGL3(프로메가(Promega))에서 루시퍼라제 유전자의 상부에 놓는다. 중국산 햄스터 난소(CHO-K1, ATCC #CCL-61), 사람 간암(HepG2, ATCC #NB 8065) 및 사람 간암(Hep3B ATCC #HB 8064) 세포를, 상기 4가지 작제물로 전기천공시킴으로써 형질감염시킬 뿐만 아니라 대조군 플라스미드 pGLC(프로메가 코포레이션(PROMEGA Corp))에 의해 형질감염시킨다. pGLC는 SV40 프로모터 및 SV40 인핸서의 조절하에서 루시퍼라제 유전자를 함유한다.

이와 같이 형질감염시킨 세포에서 상기 4가지 간 특이적 프로모터 서열에 의해 루시퍼라제 발현시킨 것을 대조군 플라스미드 pGLC 및 벡터 pGL3과 비교한다. 데이터가 도 2에 요약되어 있다(HAL 결과는 도시되지 않음). 3가지 세포 유형을 지시된 현저한 특징을 갖는 DNA 작제물에 의해 형질감염시킨다. 진한 막대는 사람 간암 HepG2 세포를 나타내고; 크로스-해치된 막대는 중국산 햄스터 난소 세포(CHO)를 나타내며; 사선 막대는 사람 간암 Hep3B 세포(Hep3B)를 나타낸다. pGLB는 음성 대조군 플라스미드이고; pGLC는 양성 대조군 플라스미드이며; HAT는 사람 α1-항트립신 프로모터이고; HMG는 사람 하이드록시-메틸-글루타릴 CoA 리덕타제 프로모터를 나타내며; AFP는 사람 α-페토 프로테인 프로모터를 나타낸다. 4가지 조직 특이적 프로모터 중에서, 사람 α1-항트립신(HAT) 프로모터가 이들 조건하에서 간 특이적 발현에 가장 우수한 후보자인 것으로 여겨진다.

HAT 프로모터에 의해 구동된 발현은 사람 α-페토프로테인 인핸서(참조: Watanabe et al., J. Biol. Chem. 262(10):4812-4818 (1987), Genebank # J02693), 사람 알부민 인핸서(참조: Hayashi et al., J. Biol. Chem. 267(21):14580-14585 (1992), Genebank #M92816), 사람 α-1 마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서(참조: Rouet et al., J. Biol. CHem. 267(29):20765-20773 (1992), Genebank #X67082) 또는 B형 간염 인핸서(참조: Valenzuela et al., Animal Virus Genetics ed. B. Biels et al., p.p. 57-70, Academic Press, N.Y.(1981); Galibert et al., Nature 281:646-650 (1979)) 등의 간 특이적 인핸서 서열을 갖는 발현 벡터를 작제함으로써 추가로 최적화시킬 수 있다.

본 발명이 보다 명백한 이해를 위해 상기한 예시 및 실시예를 통하여 보다 상세히 기재되었지만, 특정한 변화 및 변형도 첨부된 청구의 범위 내에서 실시될 수 있다는 것이 명백할 것이다.

본원에서 인용된 모든 문헌은 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입된 것이다.

Claims

관심있는 조직에 특이적인 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고 인터페론 알파 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 절편을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 벡터가 바이러스성인 조성물.
제2항에 있어서, 바이러스성 벡터가 아데노바이러스인 조성물.
제3항에 있어서, 프로모터가 간 특이적 프로모터인 조성물.
제4항에 있어서, 프로모터가 전립선 특이적 프로모터인 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 인터페론 알파 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있는 인터페론 알파 분비 리더를 추가로 포함하는 조성물.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따르는 조성물을 포함하는 약제학적 제형.
관심있는 조직에 대한 특이성을 지니고 있는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고 인터페론 알파 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 절편을 포함하는 벡터를 관심있는 조직 내로 도입하는 것을 포함하여(여기서, 인터페론 알파 폴리펩티드는 환자의 관심있는 조직에서 발현된다), 조직에 인터페론 알파 폴리펩티드를 제공하는 방법.
제8항에 있어서, 인터페론 알파가 인터페론 알파 2b인 방법.
제9항에 있어서, 바이러스성 벡터가 아데노바이러스 벡터인 방법.
제10항에 있어서, 프로모터가 간 특이적 프로모터인 방법.
제10항에 있어서, 프로모터가 전립선 특이적 프로모터인 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 인터페론 알파를 암호화하는 핵산 절편이 인터페론 알파 분비 리더를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결되는 방법.