CZ131699A3

CZ131699A3 - Způsob a kompozice pro zavedení a expresi nukleových kysselin interferonu-alfa

Info

Publication number: CZ131699A3
Application number: CZ991316A
Authority: CZ
Inventors: Tattanahalli L. Nagabhushan; Deba P. Saha
Original assignee: Canji, Inc.
Priority date: 1996-10-18
Filing date: 1997-10-16
Publication date: 1999-07-14
Also published as: EP0932679A1; ES2136583T1; NZ335134A; AR013618A1; KR20000049243A; AU4808097A; CA2269100A1; HUP9904219A2; JP2001502540A; NO991839D0; IL129387A0; PL332856A1; SK50699A3; NO991839L; JP2008301832A; EP1591528A3; ID24500A; TR199901190T2; ZA979295B; EP1591528A2

Description

Vynález se týká způsobů a kompozic pro tkáňově specifickou expresí interferonu alfa pro účely terapie.

i ώί *

1316-99 A3

Εΐ/Μ-'ϊ'?

Způsoby a kompozice pro zavedení a expresi nukleových kyselin

interferonu-a

Oblast techniky

Vynález se týká způsobů a kompozic pro tkáňově specifickou expresi interferonu-alfa pro účely terapie.

Dosavadní stav techniky

Lidské interferony-a (IFN-α) patří do rodiny proteinů, která zahrnuje alespoň 24 subspecií (Zoon, K. C., Interferon 9: 1 (1987), Gresser, I., ed., Academie Press, NY) . Interferony-a se obecně popisují jako činidla schopná indukovat v buňkách antivirový stav, v současné době jsou známy jako pleiotrofní

... lymfokinázy, které ovlivňují řadu funkcí imunitního systému (Openakker et al., Experimentia 45: 513 (1989)).

IFN-α se používá v širokém rozsahu pro terapeutické účely, například při léčení leukémie vlasových buněk, Kaposiho sarkomu, karcinomu renálních buněk, lymfomu jiného než Hodkinsova, leukémie T-buněk, vícenásobné a chronické myelogenní leukémie, malignantního melanomu, karcinomu buněk močového měchýře, karcinomu tlustého střeva (s 5-FU), kondylomu acuminata, rhinovirové infekce a různých forem chronické virové hepatitidy B, která se objevuje jako výsledek infekce virem hepatitidy B (HBV), viru hepatitidy C (HCV),

------NANB (ani viru hepa t i t i dy A: ani B) nebo vi ru hepatitidy δ (HDV) (Pestka AIDA Research and Human Retroviruses 8 (5) : 776-786 (1992)). Také se zjistilo, že IFN-α je vysoce účinný proti megakaryocytopoieze a při kontrole trombocytózy u pacientů s myeloproliferativními stavy (Talpaz et al., Annals Int. Med. 99: 789-792 (1983); Gisslinger et al., Lancet i: 634-637 (1989); Ganser et al., Blood 70: 1173-1179 (1987)).

»0 0000

0 0 0 0

0 0« 0 0000

0 0 0 0 «

0 0 0 I

0000

Způsoby genové terapie mají potenciál vystavit subjekt genovému produktu, jako je interferon, prostřednictvím cílené exprese terapeutického genu v tkáni. V obecném případě schopnost cíleně zavést gen do vybrané tkáně je jedním z hlavních vymožeností genové terapie. Jako příklad cíleného zavádění genů intérferonu, patentová přihláška WIPO č. WO „ 93/15609 popisuje zavedení genů intérferonu do vaskulární tkáně. Takové geny se do oblastí poškozených stěn cév zavádějí za použití katetárního systému. V jiném případě adenovirový vektor kódující protein schopný enzymaticky přeměnit pro-lék, „sebevražedný gen” a gen kódující cytokin se aplikuje přímo do pevného nádoru.

Jiné způsoby cílení terapeutických genů do tkání zahrnují tři základní kategorie transdukčního cílení, pozičního cílení a transkripčního cílení (popisuje se například v publikaci Miller et sl., FASEB J. 9: 190-199 (1995)). Transdukční cílení se vztahuje k selektivnímu vstupu do specifických buněk , kterého se dosáhne selekcí receptorového ligandu. Poziční cílení v genomu se vztahuje k integraci do požadovaného loku, jako jsou aktivní oblasti chromatinu, nebo homologní rekombinace s endogenní nukleotidovou sekvencí, jako je cílový gen. Transkripční cílení se vztahuje k selektivní expresi, které se dosáhne začleněním transkripčních promotorů s vysoce specifickou regulací genové exprese, jenž zcela vyhovují vybraným buňkám.

Příklady tkáňově specifických promotorů zahrnují promotor _—kinázy kreatinu, která se používá pro přímou expresi cDNA dystrofinu ve svalech a v kardiální tkáni (Cox et al., Nátuře 364: 725-729 (1993)); a promotory lehkého a těžkého řetězce imunoglobinu pro expresi sebevražedných genů v B buňkách (Maxwell et al., Cancer Res. 51: 4299-4304 (1991)). Také se charakterizovala endoteliální buněčně specifická regulační oblast (Jahroudi et al., Mol. Cell. Bioll. 14: 999-1008 (1994)) . Amfotrofní retrovirové vektory se zkonstruovaly tak,

-.i5“ ·· ··♦· » · · » · ··♦

4« 44 že nesou gen kinázy thymidinu viru herpes simplex řízený buď promotorem albuminu nebo alfa-fetoproteinu (Huber et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 88: 8039-8043 (1991)) za účelem cílení jaterních buněk a buněk hepatomu. Takové tkáňově specifické promotory se mohou použít v retrovirových vektorech (Hartzoglou et al., J. Biol. Chem. 265: 17285-17293 (1990)) a v adenovirových vektorech (Friedman et al., Mol. Cell. Biol. 6: 3791-3797 (1986)), přičemž si stále uchovávají svoji tkáňovou specífitu. . _ _________ - Z toho vyplývá, že cílená exprese alfa-interfeřonu je nutná při léčbě rakoviny, hepatitidy a jiných stavů citlivých k terapii alfa-interferonem.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsob aplikace polypeptidů interferonu-alfa pacientovi, který zahrnuje zavedení vektoru do tkáně pacienta, přičemž uvedený vektor obsahuje segment nukleové kyseliny kódující polypeptid interferonu-alfa, který je operativně spojen s promotorem vykazující specífitu k požadované tkáni, ve které se polypeptid exprimuje.

Vynález dále popisuje způsob zvýšení množství interferonu-alfa ve vybraných tkáních pacienta, který zahrnuje zavedení vektoru obsahujícího segment nukleové kyseliny kódující polypeptid interferonu-alfa do vybrané tkáně, přičemž segment nukleové kyseliny je operabilně spojen s promotorem, jenž vykazuje specífitu k vybrané tkáni,___kde se polypeptid interferonu-alfa exprimuje.

Vynález dále popisuje způsob léčby zhoubného bujení reagující na interferon-alfa, který zahrnuje aplikaci vektoru obsahujícího segment nukleové kyseliny kódující polypeptid interferonu-alfa do karcinogenní tkáně, přičemž segment nukleové kyseliny je operativně spojen s promotorem, jenž vykazuje specífitu k vybrané tkáni, kde se polypeptid interferonu-alfa exprimuje.

·· 0000 •0 0000

000

00 » 0 0 0 > 0 0 0

000 000 • 0

00

Dále vynález popisuje způsob léčby hepatitidy, který zahrnuje aplikaci vektoru obsahujícího segment nukleové kyseliny kódující polypeptid interferonu-alfa do jaterních buněk pacienta, přičemž segment nukleové kyseliny je operativně spojen s promotorem specifickým pro jaterní buňky, kde se polypeptid interferonu-alfa exprimuje.

Vynález dále popisuje kompozici zahrnující vektor obsahující segment nukleové kyseliny kódující polypeptid interferonualfa, přičemž segment nukleové kyseliny je operativně spojen s promotorem specifickým pro vybranou tkáň.

Vynález popisuje způsoby tkáňově specifické exprese IFN-α za použití tkáňově specifických promotorů. Termín IFN-α zahrnuje všechny podtřídy interferonu-alfa, delece, inzerce nebo jejich substituční varianty, biologicky aktivní fragmenty a alelické formy. Termín „biologicky aktivní znamená libovolnou antivirovou nebo antiproliferační aktivitu měřenou způsobem dobře známým v oboru (popisuje se například v publikaci Openakker et al., uvedeno dále v textu; Mossman, J. Immunol. Methods 65: 55 (1983). Rekombinantní interferony-alfa se klonovaly a exprimovaly v bakteriích E. coli (popisuje se například v publikacích Weissmann et al., Science 209: 1343-1349 (1980); Sreuli et al., Science 209: 1343-1347 (1980); Goeddel etal.,

Nátuře 290: 20-26 (1981); Henco et al., J. Mol. Biol. 185:

227-260 (1985)). Upřednostňuje se, aby interferonem-alfa byl interferon-alfa 2a nebo 2b (popisuje se například v publikaci WO 91/18927), ačkoli interferon-alfa se může také použít. Nukleové kyseliny kódující polypeptid interferonu-α jsou DNA nebo RNA. Fráze „nukleová kyselina kódující znamená nukleovou kyselinu, která řídí expresi specifického proteinu nebo peptidu. Sekvence nukleové kyseliny zahrnují jak řetězec sekvence DNA, který se přepisuje na RNA, tak i sekvenci RNA, která se překládá na protein. Sekvence nukleové kyseliny zahrnují sekvence nukleových kyselin v plné délce, tak i části •·· · ··<· ·· fc · · · • · · · · · · ··· ··· ··· ··· ·· ·· ··· ·· ··· fcfc ·· sekvencí, které se získaly z proteinu v plné délce. Rozumí se, že sekvence zahrnuje degenerativní kodony nativní sekvence nebo sekvencí, které mohou být zavedeny tak, aby vznikl kodon, jenž preferuje specifická hostitelská buňka.

Termín „vektor znamená virové expresivní systémy, autonomní samostatně se replikující kruhovou DNA (plazmidy) a zahrnuje jak expresivní tak neexpresivní plazmidy. V případě, že rekombinantní mikroorganizmus nebo buněčná kultura se popisuje jako hostitel „expresivního vektoru, může obsahovat jak ’ extrachromozomální kruhovou DNA tak DNA, která je začleněna do chromozomu(ů) hostitele. V případě, že vektor je držen hostitelskou buňkou, znamená to, že vektor se může buď stabilně replikovat v buňkách během mitózy, jako autonomní struktura, nebo je inkorporován v hostitelském genomu. Vektor obsahuje více genetických elementů pozičně a sekvenčně orientovaných, to znamená operativně spojených s jinými nezbytnými elementy tak, že se v transfekovaných buňkách může nukleová kyselina ve vektoru kódující IFN-α přepsat a když je třeba tak i přeložit.

Termín „gen popisuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid. Tato definice zahrnuje různé sekvenční polymorfizmy, mutace a/nebo variace sekvencí, kde uvedené změny neovlivňují funkci genového produktu. Termín „gen zahrnuje ne pouze kódující sekvence, ale také regulační oblasti, jako jsou promotory, zesilovače a terminační oblasti. Termín dále zahrnuje všechny introny a jiné sekvence DNA upravené střihem z transkriptú mRNA spolu s variantami, které vznikly na základě alternativních míst sestřihu.

Termín „plazmid znamená autonomní molekulu kruhové DNA, která je schopná se replikovat v buňce a zahrnuje jak typ expresivní tak typ, který není expresivní. V případě, že se rekombinantní mikroorganizmus nebo buněčná kultura popisuje jako hostitel „expresivního plazmidu, to znamená, že zahrnuje jak extrachromozomální kruhové molekuly DNA tak i DNA, která je • Φ φφφφ φ φ φ φφφ •Φ φφφφ * φ φ φφφφ φ φ φφφ φ · · φ • · ·· · φ φφ φφφφφ· • ΦΦΦΦ · ·· •Φ ··· φφ ··· ·· φφ začleněna do hostitelského chromozomu(ů). V případě, že plazmid je obsažen v hostitelské buňce znamená to, že se plazmid v buňkách buď stabilně replikuje během fáze mitózy jako autonomní struktura nebo se začlenil do hostitelského genomu.

Termín „rekombinantní protein nebo „rekombinantně produkovaný protein znamená peptid nebo protein produkovaný za použití nepřirozených buněk, které nemají endogenní kopii DNA schopnou exprimovat protein. Buňky produkují protein, protože se zavedením sekvence vhodné nukleové kyseliny geneticky změnily. Nezjistilo se, že rekombinantní protein je asociován s proteiny a se sub-buněčnými komponenty, které jsou v normálním případě spojeny s buňkami produkujícími protein. Termíny „protein a „polypeptid jsou zde zaměnitelné.

V obecném případě se IFN-α produkuje v expresivním vektoru, který obsahuje následující elementy postupně spojené ve vzdálenosti vhodné pro funkční expresi: tkáňově specifický promotor, iniciační místo pro transkripci, 3'nepřekládanou oblast, vedoucí sekvence 5'mRNA, sekvence nukleové kyseliny kódující polypeptid interferonu-alfa a polyadenylační signál.

V expresivním vektoru se mohou vyskytovat i zesilovací sekvence a jiné sekvence, které vedou k expresi a/nebo k sekreci. Za účelem selekce nebo testování přítomnosti rekombinantního vektoru se do vektoru přidávají geny, které kódují rezistenci na léky. Takové přídavné geny zahrnují například geny kódující rezistenci na neomycin, rezistenci na : více léků, kinázu thymidinů, beta-galaktozidázu, ’ reduktázu dihydrofolátu (DHFR) a acetyltransferázu chloramfenikolu.

Vynález popisuje cílené zavedení IFN-α do určité vybrané tkáně, které se uskutečnilo použitím promotoru a/nebo jiného expresivního elementu, které se s výhodou používají ve vybrané tkáni. Příklady známých tkáňově specifických promotorů zahrnují promotor kinázy kreatinu, který se používá při řízení exprese cDNA dystrofinu ve svalech a kardiální tkáni (Cox et .1

4444 ·· 4444 ·· 44 • · · · · · · 4 · · • · ··· · 4 ··· · 4 · · «4 4 4 4 4 44 444 444 • 4444 4 4 ·

444 44 4·· 44 44 cholesterolu (Lee et al. (1994)); promotor al., Nátuře 364: 725-729 (1993)); promotory těžkého a lehkého řetězce imunoglobinu pro expresi genů v B-buňkách; promotory albuminu nebo alfa-fetoproteinu, které jsou vhodné pro buňky jater a buňky hepatomu.

Příklady tkáňově specifických expresivních elementů vhodné pro jaterní buňky jsou například promotor HMG-CoA reduktázy HMGCoA (Luskey, Mol. Cell. Biol. 7(5):1881-1893 (1987); sterolový regulační element 1 {SRE-1, Smith et al., J. Biol. Chem. 265 (4) 2306-2310 (1990); promotor karboxykináza fosfoenolpyruvátu (PEPCK) (Esenberger et al., Mol. Cell Biol. 12(3):1396-1403 (1992)); promotor lidského C-reaktivního proteinu (CRP) (Li et al., J. Biol. Chem. 265 (7): 4136-4142 (1990)); lidský glukokinázový promotor (Tanizawa et al., Mol. Endocrinology 6(7): 1070-81 (1992); promotor 7-alfa-hydroylázy (CYP-7)

J. Biol. Chem. 269 (20): 14681-9 beta-galaktozidázové alfa-2,6sialyltransferázy (Svensson et al., J. Biol. Chem. 265(34): 20863-8 (1990); promotor proteinu vázající růstový faktor podobný inzulínu (IGFBP-1) (Babajko et al., Biochem, Biophys. Res. Comn. 196 (1): 480-6 (1993)); promotor aldolázy B (Bingle et al., Biochem. J. 294 (Pt2):473-9 (1993)); promotor lidského transferinu (Mendelzon et al., Nicl. Acids Res. 18 (19): 571721 (1990); promotor kolagenu typ I (Houglum et al., J. Clin.

Invest. 94(2): 808-14 (1994)).

specifických elementů

Příklady tkáňově prostatických buněk expresivních zahrnují například promotor fosfatázy iny pros tat ické (PAP)· (Banas et ál., Biochim. Biophys.

Acta. 1217 (2): 188-94; promotor prostatického sekrečního proteinu 94 (PSP 94) (Nolet et al., Biochim. Biophys. ACTA 1098 (2): 247-9 (1991)); promotor komplexu specifikého antigenu prostaty (Casper et al., J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 47 (1-6): 127-35 (1993)); promotor lidského glandulárního kallikreinového genu (hgt-1) (Lilja et al., World J. Urology 11(4): 188-91 (1993).

' 44 4444 44 4·4· 44 4·

8··· · · 4 · · · · • ···· · 4 4 · 4 · · 4 · • · 4 · 4 4 4 '· ···»··

4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 ·· · · · 4 4 44

Příklady tkáňově specifických expresivních elementů pro gastrickou tkáň zahrnují například promotor alfa-podjednotky

R H⁺/K⁺-ATPázy (Tanura et al., FEBS Letters 298: (2-3): 137-41 (1992)).

Příklady tkáňově specifických expresních elementů pro pankreas zahrnují například promotor proteinu spojený s pankreatitidou (PAP) (Dusetti et al., J. Biol. Chem. 268 (19): 14470-5 (1993)); zesilovač transkripce .elastázy 1 (Kruše et al., Genes and Development 7 (5) :774-86 . (1993)); promotor zesilovače specifické amylázy a elastázy specifické pro pankreas (Wu et al. Mol. Cell. Biol. 11(9):4423-30 (1991); Keller et al.,

Genes and Dev. 4(8): 1316-21 (1990)); promotor genu pankreatické esterázy cholesterolu (Fontaine et al., Biochemistry 30(28): 7008-14 (1991)).

Příklady tkáňově specifických expresivních elementů pro - endometrium zahrnují například promotor uteroglobinu . (Helftenbein et al., Annal. NY Acad. Sci. 622: 69-79 (1991)). Příklady tkáňově specifických expresivních elementů pro adrenalinové buňky zahrnují promotor štěpení bočního řetězce cholesterolu (SCC) (Rice et al., J. Biol. Chem. 265: 11713-20 (1990)) .

Příklady tkáňově specifických expresivních elementů pro nervový systém zahrnují například promotor gamma-gamma enolázy (neuron-specifická enoláza, NSE) (Forss-Petter et al., Neuron 5(2):187-97 (1990)).

Příklady tkáňově specifických expresivních elementů pro mozek _--zahrnuje například promotor těžkého řetězce neurovlákna '(NF-H) ’ (Schwartz et al., J. Biol. Chem. 269(18): 13444-50 (1994)). Příklady tkáňově specifických expresivních elementů pro lymfocyty zahrnují například promotor lidského CGL-l/granzymu B (Hanson et al., J. Biol. Chem. 266 (36): 24433-8 (1991));

promotor terminační deoxytransferázy (TdT), lambda 5, VpreB a lek kináza tyrozinu specifická pro lymfocyty p561ck) promotor (Lo et al., Mol. Cell. Biol. 11(10): 5229-43 (1991)); promotor

ΦΦ Φ··· • · » φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ ··* φ · · φ φ φ φφφ φ φφ φφφ φφφ φφφφφφ Φφ φφ φφφ φφ φφφ φφ φφ lidského CD2 a jeho zesilovač 3'transkripce (Lake et al., EMBO J. 9(10): 3129-36 (1990)) a specifický aktivační promotor lidských NK a T buněk (NKG5) (Houchins et al., Immunogenetics 37(2):102-7 (1993)).

Příklady tkáňově specifických expresivních elementů pro tlusté střevo zahrnují například promotor pp60c-src kinázy thyrozinu (Talamonti et al., J. Clin. Invest. 91 (1): 53-60 (1993));

promotor orgánově specifických antigenů (-OSN) , molekulová hmotnost 40 000 (p40) (Ilantzis et al.,. Microbiol. Immunol.

37(2): 119-28 (1993)); promotor antigenu P specifického pro tlusté střevo (Sharkey et al., Cancer 73(3 supp.) 864-77 (1994)) .

Příklady tkáňově specifických expresivních elementů pro buňky prsní žlázy zahrnují například promotor alfa-laktalalbuminu (Thean et al., British J. Cancer. 61 (5): 773-5 (1990)).

Jiné elementy, které umožňují specifitu exprese ve vybrané tkáni zahrnují sekvence vedoucí k sekrece, zesilovače, signály jaderné lokalizace, endosmolytické peptidy atd. Tyto elementy se získávají z vybrané tkáně, což umožňuje jejich specifitu. Způsoby manipulace sekvencí nukleových kyselin podle vynálezu, jako je sub-klónování sekvencí nukleových kyselin kódujících polypeptidy do expresivních vektorů, značení sond, hybridizace DNA a podobně se podrobně popisují v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2^nd Ed.), Vol. 13, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989).

..Jestliže se izolovala DNA kódující vybranou ' sekvenci a klonovala se, mohou se exprimovat kódované proteiny v různých rekombinantních buňkách. Očekávalo se, že v oboru je známa řada expresivních systémů, které jsou dostupné pro expresi kódující DNA. Zde se používá řada známých metod vhodných pro expresi proteinů v prokaryontech nebo eukaryontech.

Exprese přirozených nebo syntetických nukleových kyselin kódujících vybranou sekvenci se v typickém případě dosáhne •ft ···· • · • ··* ·· ··<· • · • ··· • ft ·· • · » · • · · · • « 9 · * · · 9 ··· ··· ······ 9 9 ··· ·· ··· ·· ftft operativním spojením DNA nebo cDNA s promotorem (který je buď konstitutivní nebo indukovatelný), pak následuje začlenění do expresivního vektoru. Vektory mohou být vhodné pro replikaci a integraci buď v prokaryontech nebo eukaryontech. Typické expresivní vektory obsahují transkripční a translační terminátory, iniciační sekvence a promotory použitelné pro regulaci exprese vybrané polynukleotidové sekvence. Aby se získala silná exprese klonovaného genu, je nutné konstruovat expresivní plazmidy, které obsahují minimálně silný promotor pro řízení transkripce, ribozomové vazebné místo za účelem translace a terminátor transkripce/translace. Expresivní vektory mohou také obsahovat generované expresivní kazety, které obsahují alespoň jednu nezávislou terminační sekvenci, sekvence umožňující replikaci plazmidu jak v prokaryontech tak v eukaryontech, to znamená pendlující vektory a selekční markéry pro prokaryontní a eukaryontní systémy (Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2^nd Ed.), Vol. 13, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989).

Konstrukce podle vynálezu se mohou zavést do vybrané tkáně in vivo nebo ex vivo pomocí různých způsobů. V některých provedeních vynálezu se vektor zavede do buněk způsobem, jako je mikroinjekce, precipitace fosforečnanem vápenatým, fúzí s lipozomy nebo prostřednictvím biologické balistiky. V jiném provedení vynálezu se DNA přímo zavádí do vybrané tkáně.

V jiných provedeních se konstrukce zabalí do virového vektorového systému, který·umožní jej i zavedení do buněk. ' ~

Virové vektorové systémy podle vynálezu zahrnují adenoviry, herpesviry, adeno-asociované viry, myší minutový virus (MVM), HIV, sindbis virus a retroviry, jako je virus Rousova sarkomu a MoMLV. V typickém případě konstrukce podle vynálezu se začleňují do takových vektorů, aby umožnily balení konstrukce exprimující interferon, většinou je doprovázena virovou DNA, dochází k infekci citlivých hostitelských buněk a k expresi ··· ·· · ·· ··· · genu interferonu-α. Zvláště výhodným vektorem je adenovirový vektor, který se popisuje v publikaci Wills et al., Hum. Gene Therapy 5: 1079-1088 (1994).

V jiném provedení vynálezu rekombinantní konstrukce- IFN-a podle vynálezu jsou spojeny s ligandem buněčného receptoru, což umožňuje příjem (například invaginace potažených částic a internalizace endozomu) prostřednictvím částic spojených s DNA (Wu et al., J. Biol.Chem. 263: 14621-14624 (1988); WO

92/06180) . Konstrukce DNA podle vynálezu může být například spojen prostřednictvím polylyzinů k asialo-oromukocidu, který je ligandem pro asialoglykoproteinový receptor hepatocytů. Virové obaly používané při balení konstrukcí podle vynálezu se mohou modifikovat přidáním receptorových ligandů nebo protilátek specifických pro receptor, aby mohlo dojít k endocytóze do specifických buněk zprostředkované receptorem (popisuje se například v publikaci WO 93/20221, WO 93/14188; WO 94/06923) . U některých provedeních vynálezu DNA konstrukce podle vynálezu jsou spojeny s virovými proteiny, jako jsou adenovirové partikule, aby se umožnila endocytóza (Curiel et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 88: 8850-8854 (1991)). U jiného provedení vynálezu molekulové konjugáty podle vynálezu mohou zahrnovat mikrotubulární inhibitory (popisuje se v publikaci WO/9406922); syntetické peptidy, které napodobují hemaglutinin viru chřipky (popisuje se v publikaci Plank et al., J. Biol. Chem. 269: 12918-12924 (1994)); a nukleární lokalizační signály, jako je antigen SV40 T (popisuje se v publikaci WO

9768).

Termín „léčba znamená zavedení nukleové kyseliny kódující alfa-interferon do pacienta za účelem expozice zvolené tkáně, zvláště tkáně, kde jedna nebo více buněk vykazuje patologické změny, alfa-interferonu. Termín tkáň „zhoubného bujení znamená tkáň, ve které jedna nebo více buněk se klasifikuje jako buňky zhoubného bujení, maligní, nádorové, pre-rakovinná, • · · · · · • · · φ φ ·

transformované nebo jako adenom nebo karcinom nebo se označuje jiným synonymem běžně používaným ve spojení s tímto stavem. „Nerakovinná buňka zde znamená buňku, která se vymyká definici rakovinná buňka a zahrnuje normální buňky a buňky vykazující některé patologické rysy, jako je například infekce virem, bakterií, parazitem nebo jiným organizmem, buňky ovlivněné dědičnou zátěží, to znamená, že nejsou v tak optimálním stavu, jak je tomu v normálním případě nebo jejich protějšky divokého typu, _ buňky ovlivněné neinfekčním onemocněním, jako je například diabetes, a buňky jenž přežily libovolný z těchto uvedených stresů atd..

Léčba libovolného stavu, který se zlepší po aplikaci IFN-a, může začít kdykoli před diagnózou stavu nebo kdykoli po ní. Tak například pacientovi, u kterého existuje podezření, že má pre-rakovinné léze nebo dispozici k vývoji některého typu zhoubného bujení, se mohou aplikovat kompozice podle vynálezu. Podobně osoba, která přišla do kontaktu s patogenem, jako je například virus hepatidy B, se může léčit kompozicemi podle vynálezu ještě před tím, než se hepatitida diagnostikuje. Navíc lidé, kteří jsou podezřelí, že jsou nosiči HBV, nebo pacienti, kteří by se jimi mohli s velkou pravděpodobností stát, se mohou léčit po té, co se zlepší nejtěžší symptomy onemocnění.

Konstrukce podle vynálezu se mohou použít při terapii různých druhů zhoubného bujení, hepatitidy a jiných stavů, kde je výhodné zvýšení množství IFN-α ve tkáni aplikací IFN-α. Mezi tyto onemocnění patří například vředová kolitidá, rhinovirové infekce, condyloma acuminata, laryngeální papilomitida; HIV infekce, fibróza, alergické onemocnění způsobené přebytkem IL4 a produkcí IgE a granulomatózní onemocnění, jako je Crohnova nemoc. Ačkoli se gen může cíleně zavést do libovolné tkáně, pro kterou existuje tkáňově specifiký expresivní element, jako je promotor, zvláštní pozornost se věnuje tkáňové specifické aplikaci IFN-^α za účelem zvýšení množství IFN-α ve tkáni » 0 · 000 0«

0 *

000 ·· · · zhoubného bujení, jako je karcinom lidské prostaty a tkáň hepatomu. Konstrukce podle vynálezu se mohou dále použít pro zvýšení množství IFN-α v tkáních, které vykazují patologické změny a jejich nerakovinné buňky jsou deficitní v produkci interferonu, to znamená, že produkují méně interferonu, než zdravé buňky. Jak je tomu například u nosičů viru hepatitidy B (Nouri-Aria et al., Hepatology 14(6): 1308-1311 (1991)).

V některých provedeních podle vynálezu rekombinantí konstrukce se cíleně zavádějí do vedlejší tkáně nebo do buněk, aby vzrostla lokální koncentrace interferonu alfa ve vybrané populaci buněk.

Kompozice podle vynálezu se budou připravovat pro způsob aplikace, která je přijatelná pro savce, preferuje se člověk.

V některých provedeních vynálezu se kompozice podle vynálezu -mohou aplikovat injekcí přímo do tkáně nebo do krevních cév, které zásobují vybranou tkáň. V jiném provedení vynálezu se kompozice podle vynálezu aplikují lokálně, to znamená intravezikálně, do lézí a/nebo povrchově. V jiném provedení vynálezu se kompozice podle vynálezu aplikuje systematicky injekcí, inhalací, čípky, transdermálním zavedením atd.

V dalším provedení vynálezu se kompozice aplikují katetrem nebo jiným zařízením, který umožní přístup kompozice do vybrané tkáně, jako je například vnitřní orgán. Kompozice podle vynálezu se také mohou aplikovat v podobě depotních nástrojů, implantátů nebo ve formě kapsulích, které umožňují pomalé nebo trvalé uvolňování kompozic.

: z pop i suj e kompo z i c e, kt eré obsahují roztok kompo ž i c podle vynálezu rozpuštěný nebo suspendovaný v přijatelném nosiči, s výhodou jde o vodný nosič. Může se použít řada vodných nosičů, jako je voda, pufrovaná voda, 0,8 % fyziologický roztok, 0,3 % glycin, kyselina hyaluronová a podobně. Tyto kompozice se mohou sterilizovat běžnými způsoby nebo se mohou sterilizovat filtrací. Výsledné vodné roztoky se mohou balit tak jak jsou, nebo se mohou lyofilizovat.

• to · · · ·

Lyofilizované roztoky se těsně před aplikací smíchají se sterilním roztokem. Kompozice mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné auxiliární substance, které jsou nutné vzhledem k fyziologickému stavu. Jsou to činidla pro úpravu pH a pufrovací činidla, činidla pro úpravu tonusu, smáčecí činidla a podobně. Jsou to například acetát sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, sorbitanmonolaurát, trietanolaminoleát, atd.

Koncentrace kompozic podle vynálezu ve farmaceutických formulaci značně kolísá, to znamená, že může být menší jak -přibližně 0,1 %, obvykle dosahuje alespoň okolo 2 %, až do hodnoty 20 až 50 % nebo více (hmotnostní procenta). Kompozice se pro určitý mód aplikace vybírají primárně na základě objemů kapalin, viskózity atd.

Kompozice podle vynálezu se mohou aplikovat prostřednictvím lipozomů. Lipozomy zahrnují emulze, pěnu, micely, nerozpustné monovrstvy, kapalné krystaly, fosfolipidové disperze, lamelární vrstvy a podobně. Do těchto přípravků se kompozice podle vynálezu zavedla jako součást lipozomů, samostatně nebo ve spojení s molekulou, která se váže na vybraný cíl, jako jsou protilátky nebo jiné terapeutické nebo imunogenní kompozice. Lipozomy, které jsou buď naplněny nebo pokryty požadovanou kompozicí podle vynálezu se mohou vnášet do organizmu systematicky nebo přímo do vybrané tkáně, kam lipozomy donesou vybranou terapeutickou/imunogenní peptidovou kompozici.

-Lipozomy vhodně pro použití~ podle “vynáTíézn ’ -vzni”kag~iztT standardních lipidů , které v obecném případě zahrnují neutrální nebo negativně nabité fosfolipidy a sterol, jako je cholesterol. Výběr velikosti lipozomů, v krevním řečišti.

lipidů doprovází zvažování například citlivost a stabilita vůči kyselinám Lipozomy se mohou připravovat řadou způsobů, jak se popisuje například v publikaci Szoka et al., • to · · to · • · 9·· · « ···· · ···· · ·· · to · · · · · ·· ······ ······ · · ·· ··· ·· ··· ·· ·*

Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), U.S. Patent Nos.

4,235, 871, 4,501,728, 4, 837, 028 a 5, 019, 369.

Lipozomová suspenze obsahující kompozici podle vynálezu se může aplikovat intravenózně, lokálně, povrchově atd. v dávce, která záleží na způsobu aplikace, způsobu zavedení kompozice a stádiu onemocnění, které se léčí.

V případě pevných kompozic se mohou použít běžné netoxické pevné nosiče, které zahrnují například manitol, laktózu, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodíku, celulózu, glukózu, uhličitan hořečnatý a podobně. V případě orální aplikace se farmaceuticky přijatelné netoxické kompozice tvoří smíšením libovolného normálně používaného ekcipientu, jako jsou nosiče vyjmenované shora v textu, a většinou 10 až 95 % aktivní látky. Výhodné je smíchat jednu * nebo více kompozic podle vynálezu a upřednostňuje se koncentrace 25 až 75 %.

V případě aplikace ve formě aerosolu se kompozice doplní povrchově aktivním činidlem a hnací látkou. V typickém případě procentuální zastoupení kompozice podle vynálezu je 0,01 až 20 % (hmotnostní procenta), upřednostňuje se 1 až 10 %. Povrchově aktivní činidlo nesmí být samozřejmě toxické a upřednostňuje se jeho rozpustnost v hnací látce. Zástupci takových činidel jsou estery nebo parciální estery mastných kyselin, které obsahují 6 až 22 atomů uhlíku, jako jsou estery kyseliny kapronové, oktanové, laurilové, palmitové, stearové, linoelové, olesterové a olejové s alifatickým polyhydrickým alkoholem nebo jeho cyklickým anhydridem. Mohou se použít smíšené estery, jako jsou smíchané nebo přirozené glyceridy. Povrchově aktivní činidlo může tvořit 0,1 až 20 % (váhová procenta) kompozice, upřednostňuje se koncentrace 0,25 až 5 %. Kompozice vyrovnává obyčejně hnací látka. Je-li to nutné může se také zahrnout nosič, například lecitin pro případ intranasální aplikace.

Konstrukce podle vynálezu se mohou dále zavádět depotním systémem, ve formě kapsulí nebo jako implantát metodami, které • · ···· • · · · · · ·· ··

jsou dobře známy v oboru. Podobně se mohou konstrukce zavádět přímo do vybrané tkáně pomocí pumpy.

V některých provedeních vynálezu se kompozice podle vynálezu aplikují ex vivo do buněk nebo tkáně vyňatých z pacienta, pak se tato tkáň do pacienta vrátí. Příklady aplikace konstrukcí ex vivo při genové terapii se popisují v publikacích Arteaga et al., Cancer Research 56(5) : 1098-1103 (1996); Nolta et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93 (6): 2414-9 (1996); Koc et al., Seminář in Oncology 23 (1). : 46-65 (1996); Raper et al.,

Annals of Surgery 223 (2): 116-26 (1996); Dalesandro et al.,

J. Thorac. Cardi. Surg. 11(2) : 416-22 (1996); and Makarov et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93(1): 402-6 (1996).

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je graf znázorňující antiproliferační účinky interferonu alfa na buňky zhoubného bujení lidské prostaty.

Na obrázku č. 2 je graf znázorňující aktivitu luciferázy jako měření exprese luciferázy řízené promotory genů specifických pro játra.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Účinek interferonu-alfa na proliferaci buněk karcinomu prostaty.

Studovaly se tři rozdílné druhy buněk karcinomu prostaty. Jsou to LNCaP (závislé na androgenu, ATCC #CRL 1740), buňky PC-3 ___ (nezávislé na androgenu, ATCC #CRL 1435) a DU-145 (nezávislé na androgenu, ATCC #HTB 81) . Buňky se kultivovaly v pěti odlišných koncentracích interferonu-a2b (10, ΙΟ², ΙΟ³, ΙΟ⁴, 10⁵ IU/ml) (Schering-Plough) po dobu 72 hodin v následujícím médiu: buňky PC-3 se kultivovaly v Ham F12 K mediu (GIBCO BRL) doplněném 7% fetálním boviním sérem; buňky DU-145 se kultivovaly v DMEM (GIBCO BRL) doplněném 10% fetálním boviním sérem; buňky LnCaP ···· 00 ·· • · 0 · · • 00 · 0 · 0 • 0 0 0 0 00 0 • · ·

0 0 0 ·· se kultivovaly v RPMI 1640 (GIBCO BRL) doplněném 5% fetálním boviním sérem.

Antiproliferační účinky interferonu se stanovily testem MTT (popisuje se v publikaci Mossman, J. Immunol. Methods 65: 55 (1983)). Buňky PC-3 a DU-145 vykazují konzistentí citlivost ke zvyšující se koncentraci interferonu, která se vyrovnala při koncentraci 10⁴ IU/ml. Buňky LNCaP citlivé na androgen nevykazují žádnou odezvu na IFN. Buňky PC-3 jsou citlivější vůči interferonu než buňky DU-145. Data jsou shrnuta na obrázku č. 1. Plné sloupce reprezentují buněčnou linii PC-3 (nezávislou na androgenu); šrafované sloupce reprezentují buněčnou linii DU-145 (nezávislou na androgenu); diagonálně šrafovaná sloupce reprezentují buňky LNCaP (závislé na androgenu).

Příklad 2: Konstrukce expresivních kazet

Za účelem exprese IFN-α v buňkách karcinomu prostaty se zkonstruoval expresivní vektor, který obsahuje celou sekvenci cDNA interferonu-alfa 2b (IFN-a2b) a celou signální sekvenci pro IFN-a2b (Sreuli et al., Science 209: 1343-1347 (1980); Goeddel et al., Nátuře 290: 20-26 (1981); Henco et al., J. Mol. Biol. 185: 227-260 (1985)), jenž jsou řízeny bazálním promotorem o velikosti přibližně 600 bp pro gen antigenu, který je specifický pro prostatu (PSA) . cDNA IFN-a2b v celé délce obsahující putativní signální vedoucí sekvenci na 5'konci se klonoval do polyklónovacího místa HindiI a EcoRl downstream CMV promotoru savčího expresivního vektoru PCDNA3 (Invitrogen) za vzniku plazmidu DIFN. Sekvence lemující 5'konec genu PSA obsahující promotor PSA (BBRC 161: 1151-1159 (1989); Genebank #M27274) se začlenil do vektoru, nahradil tak promotor CMV za vzniku plazmidu PSADIFN.

Příklad 3: Klonování bazálních promotorů pro jaterní specifické geny «· ··«·

5'lemující sekvence zahrnují bazální promotory ze čtyř specifických genů lidských jater, albumin (HAL), alantitrypsin (HAT), alfa-fetoprotein (AFP) a hydroxy-methylglutaryl-CoA reduktáza(HMG), se subklónavaly z ATCC 65731, ATCC 61597, ATCC 65735 a ATCC 59567 do vektoru pCRScript za účelem použití při zavedení genu intérferonu a jeho tkáňově specifikou expresi v hepatických buňkách (Luskey, Mol. Cell. Biol. 7(5): 1881-1893 (1987); Minghetti et al., J. Biol. Chem. 261 (15): 6747-6757 (1986); Long et al., Biochemistry 23:

4828-4837 (1984); Gibbs, Biochemistry 26: 1332-1343 (1987)). Inzerty se mapovaly pomocí restrikčních enzymů ve vektoru pCRScript, který obsahuje 5'-lemující sekvence shora uvedených genů, jenž kódují jaterní specifické enzymy. Pak se inzerty umístily z vektoru pCRScript do upstream pozice genu luciferázy do reportního plazmidu pGL3. Buňky z vaječníků čínských křečků (CHO-K1, ATCC # CCL-61), buňky lidského hepatomu (HepG2, ATCC #NB 8065) a (Hep3B ATCC # HB 8064) se transfekovaly elektroporací uvedenými čtyřmi konstrukcemi a kontrolním plazmidem pGLC (PROMEGA Corp.). pGLC obsahuje gen luciferázy řízený promotorem SV40 a zesilovač SV40.

Exprese luciferázy čtyřmi pro játra specifikými promotorovými sekvencemi v transfekovaných buňkách se porovnávala s kontrolním plazmidem pGLC a vektorem pGL3. Data jsou shrnuta na obrázku č. 2 (výsledky s HAL nejsou uvedeny) . Tři typy buněk se transfekovaly konstrukcemi DNA, které vykazují charakteristické rysy. Plné sloupce reprezentují buňky lidského hepatomu HepG2; šrafované sloupce reprezentují buňky vaječníků čínských křečků (CHO); diagonálně šrafované sloupce reprezentují buňky lidského hepatomu Hep3B (Hep3B). pGLB je plazmid sloužící jako negativní kontrola; pGLC je plazmid sloužící jako pozitivní kontrola; HAT je promotor lidského alantitrypsinu; HMG značí promotor lidské hydroxy-metylglutaryl-CoA reduktázy; AFP je promotor lidského afetoproteinu. Z uvedených čtyř tkáňově specifických promotorů ·· >··· • · • · ·· »· fcfc»· • · · · »· se jeví být nej lepším kandidátem pro expresi v játrech za uvedených podmínek promotor αΐ-antitrypsinu (HAT).

Exprese řízená promotorem HAT se může dále optimalizovat konstrukcí expresivního vektoru se sekvencí zesilovače specifického pro játra, jako je zesilovač lidského afetoproteinu (Watanabe, et al., J. Biol. Chem. 262 (10): 48124818 (1987), Genebank # J02693), zesilovač lidského albuminu (Hayashi et al., J. Biol. Chem. 267 (21): 14580-14585 (1992),

GeneBank # M92816), zesilovač lidského a-1mikroglobulinu/bikunin (Rouet et al., J. Biol. Chem. 267 (29): 20765-20773 (1992), Genebank # X67082) nebo zesilovač hepatitidy B (Valenzuela et al., Animal Virus Genetics ed. B. Biels et al., p.p. 57-70, Academie Press, N.Y. (1981); Galibert et al., Nátuře 281: 646-650 (1979)).

{' lf l!/ Mí • to «tototo ·· ···· ·· ·· • · to to to to to to · • · ·· to · · · · · • · to · · to · to · · ·· ··

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje vektor obsahující segment nukleové kyseliny kódující polypeptid interferonu-α, který je operativně spojen s promotore, který je specifický pro vybranou tkáň.

2. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že vektor je virový vektor.

3. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že virový vektor je adenovirus.

4. Kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že promotor je specifický pro játra.

5. Kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že promotor je specifický pro prostatu.

6. Kompozice podle nároku 4 nebo vyznačující se tím, že dále obsahuje sekvenci vedoucí k sekreci interferonu-alfa operativně spojenou s nukleovou kyselinou kódující polypeptid interferonu-alfa.

5,

7. Farmaceutická formulace, vyznačující se tím, že obsahuje kompozici podle libovolného z nároků 1 až 6.

8. Způsob vybavení tkáně polypeptidem interferonu-alfa, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení vektoru, který obsahuje segment nukleové kyseliny kódující • 9 99*9 99 9999 9'9 9*

9 9 9 9 9 9 * 9 9 9

9 9 999 9 9 999 9 9 9 9 polypeptid interferonu-alfa, do vybrané tkáně, přičemž segment uvedené nukleové kyseliny je operativně spojen s promotorem, který je specifický pro vybranou tkáň, kde se v pacientovi polypeptid interferonu-alfa exprimuje.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že interferon-alfa je interferon-alfa 2b.

10. Způsob podle nároku 9,. vyznačující se tím, že virovým vektorem je adenovirový vektor.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící se tím, že promotor je specifický pro játra.

12. Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící se tím, že promotor je specifický pro prostatu.

13. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že segment nukleové kyseliny kódující interferon-alfa je operativně spojen s nukleotidovou kyselinou kódující sekvenci vedoucí k sekreci interferonu-alfa.

Procento dostupných buněk

cý rt o< fl) H· ω P rt s CD X⁴ H H- i-3 P —' rt CD P Hi ro P

sd

I—¹

P)

SD

P

SD

P

ED

ΪΥ

O <

HP

P

CD' σ

P p<

v-*·

CL.

cn

X

CD'

Ό

P o

cn rt

SD rt

3:

Ol