JP4801594B2 - インターフェロン耐性腫瘍の処置のための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2003年12月10日に出願された米国仮出願番号第60/528,525号の利益を主張し、その出願は、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
インターフェロンタンパク質治療は、種々の癌に対する処置として、臨床的環境において十分に確立されている。組換えDNA技術によって産生される2種の広範に使用される市販のインターフェロン種は、インターフェロンα−2b組換え体(IntronA(登録商標)、Schering Corporation)およびインターフェロンα−2a組換え体(Roferon(登録商標)、Hoffman LaRoche、Inc.)である。IntronAは、外科手術と組み合わせた悪性黒色腫の処置、アントラサイクリン化学療法と組み合わせた攻撃的な濾胞性非ホジキンリンパ腫の処置、尖圭コンジローマの病変内処置、ヘアリーセル白血病の病変内処置、およびAIDS関連カポジ肉腫の病変内処置における使用のために必要とされる。Roferonは、フィラデルフィア染色体陽性の慢性骨髄性白血病(CML)の処置およびAIDS関連カポジ肉腫の処置における使用のために必要とされる。
Izawaら、「Clin.Cancer Res.」2002年、第8巻、p.1258−1270 Ahmedら、「Cancer Gene Therapy」2001年、第8巻、p.788−95 Herrら、「J.Urol」2000年、第163巻、p.60−61 Dalbagniら、「Urol.Clin.North Am.」2000年、第27巻、p.137−146 Belldegrunら、「J.Urol.」1998年、第159(6)巻、p.1793−801 O’Donnellら、「J.Urol.」2001年、第166巻、p.1300−1304
本発明は、インターフェロン種をコードする組換えベクターの使用によって、インターフェロン耐性腫瘍を処置するための方法を提供する。特に、組換えベクターによって提供されるインターフェロン種が、入手可能な組換え産生されたインターフェロンタンパク質と関連しない性質を有することが注目される。本発明は、インターフェロンをコードする組換えベクターを使用して、インターフェロン耐性腫瘍の処置において有用な組成物を、さらに提供する。
本発明は、インターフェロン耐性腫瘍を、インターフェロンをコードする組換えベクターと接触させる工程によって、その腫瘍を処置する方法を提供し、その結果、そのベクターによって形質導入された腫瘍細胞は、そのベクターによってコードされるインターフェロンを発現する。
は、正常な尿路上皮および表在性膀胱腫瘍の両方において顕著に導入遺伝子の発現を増加させた。Syn3の増強効果は、約1時間の時間帯にわたって持続する。従って、本発明の組換えベクターは、Syn3と併せて使用される場合、同時および概して、Syn3に対する膀胱の曝露後、約1時間以内に投与されることが好ましい。
膀胱癌細胞株として、KU7/GFPクローン6および253J−B−Vを、これらの研究のために使用した。KU7/GFPクローン6を、緑色蛍光タンパク質で、安定にトランスフェクトして、全てのインビボでの研究のために使用した。これらの細胞株は、Watanabeら、Cancer Gene Therapy、7:1575−1580(2000)に記載されている。上記細胞を、10%FCSを補充した改変した最小必須培地中で増殖させ、5%CO2および95%空気中で37℃にてインキュベーションした。
胸腺欠損マウスにおける表在性KU7−GFPヒト膀胱腫瘍を増殖させるための方法およびそれらの画像化を、Izawaら、Clin.Cancer Res、8:1258−1270(2002)およびZhouら、Cancer Gene Therapy、9:681−686(2002)において以前に記載したように実施した。つまり、上記腫瘍細胞を注入後、2週間、膀胱をGFP含有腫瘍の存在について画像化した。次いで、マウスに1時間、100μlのAd−IFN−α2α1/Syn3、Ad−IFN−α2b/Syn3、Ad−IFN−α2α1、Ad−β−gal/Syn3、Syn3またはIFN−α2α1タンパク質のいずれかの膀胱内注入を与えた。巾着縫合糸で尿道の周りを縛り、上記手順の間、確実に保持した。ウイルス、Syn3およびインターフェロンタンパク質の濃度は、それぞれ、1×1011P/ml、1mg/mlおよび2×105IU/100μlであった。それぞれ14匹と16匹のマウスを処置したAd−IFN−α2α1/Syn3およびAd−IFN−α2α1の群を除いて、1つの群あたり6匹と8匹との間のマウスを処置した。
雌性胸腺欠損マウスを麻酔し、カテーテル処置して、単一の100μlのIntronA(2×106IU/ml)の膀胱内投与または上記のように1時間、Ad−IFN/Syn3(1×1011P/ml:1mg/ml)を用いて1〜2日の処置のいずれかを与えた。種々の間隔で、膀胱を収集して凍結した。後で、膀胱を解凍して溶解緩衝液(Promega)に移した。サンプルを20秒間ホモジナイズした(Fast Prep、Q−BIOgene)。次いで、上記ホモジネートを、ELISA(Endogen)を使用して、ヒトインターフェロンαタンパク質濃度に関してアッセイした。インターフェロンタンパク質濃度を、pg IFN/mg膀胱組織として表した。
インビボでの研究のために、インターフェロン免疫組織化学を、上記のIzawaらの教示に実質的に従って実施した。陽性反応が、茶色の染色によって示された。同様に、培養物中の細胞についてのインターフェロン染色を、使用した主要な抗体が、ヒトインターフェロンα(Hu−IFN−α、PBL)に対するウサギのポリクローナル抗体の1:500の希釈であった以外は、Xuら、Oncogene、4:807−812(1989)の教示に実質的に従って実施した。
統計分析を、Windows(登録商標)用のImage−Pro(登録商標)Plusバージョン4.0ソフトウェア(Media Cybernetics、Inc.、8484 Georgia Avenue、Suite200、Silver Spring、MD20910−5611 USAから市販される)を用いて実施して、処置前の膀胱領域、処置前のGFP領域、処置後の膀胱領域および処置後のGFP領域の画素を計算した。続いて、処置前の膀胱領域に対する処置前のGFP領域、および処置後の膀胱領域に対する処置後のGFP領域の割合を計算した。本発明者らは、ノンパラメトリック検定(Kruskal−Wallis検定)を行い、KruskalおよびWallis、Journal of the American Statistical Association、47:583−621、Conover WJ、Practical Nonparametric Statistics.第3版、John Wiley & Sons、Inc.、New York(1952)に記載されるように7つの処置の間で、腫瘍サイズの割合の変化の差異を評価した。本発明者らは、試験のためのp値を決定するために、Monte−Carloシミュレーションを使用した。本発明者らが、各処置を他の処置と比較するために、多くの試験を実施しているという事実を調整するために、本発明者らは、Bonferroni補正を使用して、これらの試験の各々についての有意なレベルを調べた(0.05/21=0.0024)。MTTの結果に関して、上記分析を、General Lineal Models of the Statisticaソフトウェア(StatSoft、Inc.、2300 East 14th Street、Tulsa、OK 74104から市販される)を使用して行った。
MTTアッセイを、Zhangら、Cancer Res.、63:760−765(2003)の教示に実質的に従って実施した。つまり、膀胱腫瘍細胞を、2.5時間、50MOIおよび100MOIにて所定のアデノウイルスで感染させた。異なる時点において、上記培地を除去して、1mg/ml MTTを含んでいる200μlの培地を添加した。3時間後、この反応を200μlのN,N−ジメチルホルムアミド溶解緩衝液で停止させ、得られた溶液を、マイクロプレートリーダーを用いてA595にて読み取った。さらに60mmのディッシュを、同様またはIntronAを用いて処理して、フローサイトメトリーおよびカスパーゼ活性のために収集した。複製ディッシュからの上清を、Ad−IFN−α2bまたはIntronAに暴露された細胞についてのIFNの濃度を測定するために毎日得た。細胞周期分析として、サブジプロイド細胞およびカスパーゼ活性の割合を、Williamsら、Mol.Cancer Ther.、2:835−843(2003)の教示に実質的に従って決定した。IntronAの濃度を、製造業者の説明書に実質的に従ってPierce Biotechnology、Inc.、P.O.Box117,3747N.Meridian Road、Rockford、IL61105から提供されるカタログ番号EHIFNAとして市販のEndogen Brand Human IFNa ELISAキットを用いてFujisawaら、J.Interferon Cytokine Research、16:555−559(19996)の教示に従ってELISAを使用して測定した。
ヒト膀胱細胞株を、10%ウシ胎仔血清を補充したDMEM中のカバーガラス上で培養して、次いで50MOIおよび100MOIにてAd−α−gal、IFN−α2α1またはAd−IFN−α2bで感染させた。感染後36時間、氷冷したメタノール中で細胞を固定し、次いで、PBS中の10%ヤギ血清中でブロックし、そして一晩、それぞれ、1:1,000と1:500の希釈にて抗活性カスパーゼ−3モノクローナルウサギ(Research Diagnostics Inc.、Pleasant Hill Road、Flanders NJ 07836から提供されるカタログ番号RDI−CASP3ACTabRmとして市販されている)と抗IFN−αモノクローナルマウス(PBL Biomedical Laboratories、131 Ethel Road West、Suite 6、Piscataway、NJ 08854から提供されるカタログ番号31101−1として市販されている)の抗体とともにインキュベーションした。次いで、Alexa−488標識化したヤギ抗ウサギおよびAlexa−546標識化したヤギ抗マウス抗体(Molecular Probes、29851 Willow Creek Road、Eugene、OR 97402から提供され、それぞれ、カタログ番号11101および11010として市販されている)を、もう1時間、DNA色素、633−Topro−3(Molecular Probesから市販されている)と一緒に添加した。検鏡板に取り付けた(mounted)スライドを、共焦点顕微鏡(ZeissモデルLSM−510)を使用して画像化し、適切な光学フィルターを備えたArgonおよびHe/Neレーザーを使用して各チャネルにおいて画素を分析した。この画像化を、各条件について分析した少なくとも10個の顕微鏡視野について表した。各実験を、2連で実施して、少なくとも3回繰り返した。
Claims (10)
- 前記アデノウイルスによってコードされるインターフェロンが、インターフェロンα2bである、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記腫瘍は、約1時間の曝露時間で、約100,000,000ユニットの組換えインターフェロンα2bタンパク質(Intron A)の6週までの週に1回の投与の膀胱内投与の治療の過程において縮小しない、組成物。
- 請求項1、2、または、3に記載の組成物であって、ここで、前記組成物が、1×10 10 /ml〜1×10 12 /mlのアデノウイルス粒子を含む、組成物。
- 前記ベクターが、インターフェロンα2bをコードする、請求項5に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記増強剤と同時に投与されることを特徴とする、請求項6に記載の組成物。
- 前記ベクターが、前記増強剤とともに処方される、請求項5に記載の組成物。
- 請求項5に記載の組成物であって、ここで、前記腫瘍は、約1時間の曝露時間で、約100,000,000ユニットの組換えインターフェロンα2bタンパク質(Intron A)の6週までの週に1回の投与の膀胱内投与の治療の過程において縮小しない、組成物。
- 請求項5、6、7、8、または、9に記載の組成物であって、ここで、前記組成物が、1×10 10 /ml〜1×10 12 /mlのアデノウイルス粒子を含む、組成物。
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