CN115484985A - 温度响应病毒储存系统 - Google Patents

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Abstract

描述了一种温度响应病毒储存系统，所述温度响应病毒储存系统允许储存病毒，诸如非冷冻液体，并维持传染性。

Description

温度响应病毒储存系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月19日提交的美国临时专利申请第62/991,671号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
传染性病毒可用作例如疫苗和基因疗法载体。然而，随着时间的推移，病毒会失去传染性。
本领域教导的一种保持病毒传染性的方法是通过冷冻。本领域教导了储存悬浮在冷冻储存缓冲液中的传染性病毒，或者将病毒悬浮液冷冻，然后通过冷冻干燥除去冷冻储存缓冲液以产生干燥的冻干产品。
然而，无论冷冻是否需要随后的干燥/冻干，冷冻都会损害病毒，从而降低传染性。本领域解决此问题的一种传统方式是通过添加冷冻保护剂。例如，本领域教导了在含有10％至30％甘油作为冷冻保护剂的盐水中的悬浮液中冷冻传染性病毒(Graham等人，1991，Methods in Molecular Biology，第7卷，第11章，第109-127页；Ed Murrey The HumanPress Inc.；Precious和Russel，Virology,a Practical Approach，1985，第9章，第193-205页；编辑：BW Mahy，IRL Press,Washington DC；Kanegae等人，Jpn.J.Med.Sci.Biol.,47,157-166,1994和Green等人，Methods in Enzymology，第LVIII卷，第425-435页)，PCT专利公开W098/02522。甘油减少了病毒在冻融过程中造成的损害，从而在一定程度上保持了传染性。然而，本领域教导甘油具有刺激肺上皮的缺点，这在气管内和肺内施用(例如用于治疗囊性纤维化或肺道癌症)的情况下可能是不可接受的。
相对于盐水低浓度(1％至5％)的蔗糖也已用作冷冻病毒悬浮液的冷冻保护剂(Precious等人，见上文；Huyghe等人，Huyghe等人，Human Gene Therapy 6:1403-1416，1995年11月，和Rehir，Process Development and Production Issues for Viral Vectors&Vaccines，The Williamsburg Bio Processing Conference，第2届年会，1995年11月6-9日)。
还建议使用低浓度(2.5-5％)的乳糖或蔗糖来冷冻保存活病毒(参见JP88/555465)。
冷冻保护剂减少冷冻损害。然而，其并没有消除该损害。因此，本领域需要一种以非冷冻形式保存病毒的方式，其中病毒保留其大量的初始传染性。
发明内容
在一个方面，本公开的特征在于一种包含传染性病毒颗粒、氨丁三醇和环糊精的组合物，其中所述组合物包含每个病毒颗粒约1x109至约1x1012个环糊精分子(例如，每个病毒颗粒约1x109、约1x1010、约1x1011或约1x1012个环糊精分子)。在另一个方面，组合物包含传染性病毒颗粒、环糊精、氨丁三醇和磷酸钠，其中所述组合物包含每摩尔磷酸钠约1摩尔至约1.5摩尔氨丁三醇(例如，每摩尔磷酸钠约1摩尔、1.1摩尔、1.2摩尔、1.3摩尔、1.4或摩尔1.5摩尔氨丁三醇)。
在一些实施方案中，组合物包含冷冻保护剂(例如，冷冻保护有效量的甘油、蔗糖或两者)。
在一些实施方案中，组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约500倍、约600倍或约700倍的甘油。在一些实施方案中，组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约90倍、约100倍、约110倍、约120倍或约130倍的蔗糖。
在一些实施方案中，环糊精是羟丙基β-环糊精。在一些实施方案中，羟丙基β-环糊精的相对量为氨丁三醇量(w/w)的约5倍、约6倍或约7倍。
在一些实施方案中，组合物还包含(3α,5β,7α,12α)-N-[3-[(4-O-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖酰基)氨基]丙基]-3,7,12-三羟基-N-[3-[[(3α,5β,7α,12α)-3,7,12-三羟基-24-氧代基胆烷-24-基]氨基]丙基]-胆烷-24-酰胺(NODA)。在一些实施方案中，组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约0.5倍、约0.6倍、约0.7倍、约0.8倍、约0.9倍或约1倍的NODA。
在一些实施方案中，磷酸钠是磷酸二氢钠脱水物。在一些实施方案中，所述组合物还包含氯化镁、聚山梨醇酯80、柠檬酸钠和柠檬酸。
在一些实施方案中，病毒以每毫升组合物约1x 1011个病毒颗粒的量存在。
在一些实施方案中，组合物在第一温度下具有第一pH，并在第二温度下具有第二pH，其中第一温度低于第二温度，并且第一pH高于第二pH。在一些实施方案中，第一温度为约-60℃、约-20℃、约-0℃、约4℃，并且第一pH为碱性pH。在一些实施方案中，第二温度为约20℃至约25℃，并且第二pH为酸性pH。
在一些实施方案中，在作为非冷冻液体或以冷冻状态在约-60℃或约-20℃下储存约3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月或更长时间后，病毒颗粒保留初始总病毒颗粒浓度的至少约70％、80％、90％或95％，并且/或保留初始传染性滴度的至少约60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，传染性滴度测量为归一化和调整的标准-传染性单位(NAS IU)。
在一些实施方案中，传染性病毒是慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。在一些实施方案中，传染性病毒是复制缺陷型腺病毒。
在另一个方面，本公开的特征在于一种包含磷酸二氢钠脱水物、氨丁三醇、甘油、蔗糖、羟丙基β-环糊精、NODA和传染性复制缺陷型腺病毒的组合物，其中所述组合物包含：氨丁三醇，相对量为每摩尔磷酸二氢钠脱水物约1摩尔至约1.5摩尔氨丁三醇；甘油，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约600倍；蔗糖，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约120倍；羟丙基β-环糊精，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约6倍；NODA，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约0.7倍；和每毫升组合物约1x1011个复制缺陷型腺病毒颗粒。在一些实施方案中，组合物包含第一配制物，所述第一配制物包含磷酸二氢钠脱水物、氨丁三醇、甘油、蔗糖、羟丙基β-环糊精、NODA及传染性复制缺陷型腺病毒，其中所述组合物包含：氨丁三醇，相对量为每摩尔磷酸二氢钠脱水物约1摩尔至约1.5摩尔氨丁三醇；甘油，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约600倍；蔗糖，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约120倍；羟丙基β-环糊精，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约6倍；NODA，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约0.7倍；和每毫升组合物约1x1011个复制缺陷型腺病毒颗粒，其中所述组合物包含约1份第一配制物和约10份水。
在另一个方面，本公开的特征在于一种包含传染性病毒颗粒、氨丁三醇和环糊精的组合物，环糊精以每个病毒颗粒约1×109至约1×1012个环糊精分子的相对量存在，氨丁三醇能够响应温度变化改变pH，氨丁三醇以如下量存在：如果组合物以液体、非冷冻状态或冷冻状态在-20℃下储存一年，则病毒颗粒保留初始总病毒颗粒浓度的至少约95％和测量为NAS IU的其初始传染性滴度的至少约80％。
在一些实施方案中，组合物还包含以每摩尔磷酸钠约1摩尔至约1.5摩尔氨丁三醇的相对量存在的磷酸钠。在一些实施方案中，磷酸钠是磷酸二氢钠脱水物。
在一些实施方案中，组合物还包含冷冻保护有效量的甘油、蔗糖或两者。在一些实施方案中，组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约600倍的甘油，并且组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约120倍的蔗糖。
在一些实施方案中，环糊精是羟丙基β-环糊精。在一些实施方案中，组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约6倍的羟丙基β-环糊精。
在一些实施方案中，传染性病毒是慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。在一些实施方案中，传染性病毒是复制缺陷型腺病毒。
在一些实施方案中，组合物还包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约0.7倍的NODA，并且其中病毒以每毫升组合物约1x1011个病毒颗粒的量存在。
在一些实施方案中，组合物还包含以每摩尔磷酸二氢钠脱水物约1摩尔至约1.5摩尔氨丁三醇的相对量存在的磷酸二氢钠脱水物，并且还包含甘油和蔗糖，所述甘油以氨丁三醇量(w/w)的约600倍的相对量存在，并且蔗糖以氨丁三醇量(w/w)的约120倍的相对量存在，其中环糊精包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约6倍的羟丙基β-环糊精，其中传染性病毒包含复制缺陷型腺病毒，并且还包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约一倍的NODA，其中病毒以每毫升组合物约1x1011个病毒颗粒的量存在。
在另一个方面，本公开的特征在于一种保持传染性病毒的传染性水平的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将本文描述的任何方面的组合物以液体、非冷冻状态或以冷冻状态在约-60℃或约-20℃下储存约3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月或更长。在一些实施方案中，病毒颗粒保留初始总病毒颗粒浓度的至少约70％、80％、90％或95％，并且/或保留其初始传染性滴度的至少约60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，传染性滴度测量为归一化和调整的标准-传染性单位(NAS IU)。
在另一个方面，本公开的特征在于一种治疗患有癌症的受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用本文所述的任何方面的组合物。在一些实施方案中，其中病毒颗粒是编码人类干扰素α-2b的重组腺病毒颗粒。
定义
在本申请中，除非上下文另有明确说明，否则(i)术语“一”可理解为意指“至少一个”；(ii)术语“或”可理解为意指“和/或”；(iii)术语“包括”和“包括”可理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论是自身呈现还是与一个或多个额外组分或步骤一起呈现；(iv)术语“约”和“大约”可理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员所理解；(v)在提供范围的情况下，包括端点。
一(A或An)：冠词“一(a和an)”在本文中用于指一个或多于一个(即，指至少一个)冠词的语法对象。举例来说，“一要素”意指一个要素或多于一个要素。
施用：如本文所用，术语“施用”通常是指向受试者或系统施用组合物。本领域普通技术人员将了解在适当的情况下可用于施用于受试者(例如人类)的多种途径。例如，在一些实施方案中，施用可以是眼部、口服、肠胃外或局部的。亲代途径的实例包括(但不限于)膀胱内、腹内、羊膜腔内、动脉内、关节内、胆道内、支气管内、囊内、心脏内、软骨内、尾内、海绵窦内、腔内、大脑内、脑池内、角膜内、冠内、冠状动脉内、海绵体内、颅内、真皮内、椎间盘内、导管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、牙龈内、回肠内、病灶内、管腔内、淋巴内、髓内、脑膜内、肌肉内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、眼内、窦内、脊椎内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸廓内、管内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内(例如，推注或滴注)、心室内和皮下。在一些实施方案中，施用包括膀胱内施用。在一些实施方案中，施用可涉及间歇性(例如，在时间上分开的多个剂量)和/或周期性(例如，由相同的时间段分开的个体剂量)给药的给药。在一些实施方案中，施用可涉及连续给药(例如，灌注)至少选定的时间段。
大约或约：如本文所用，术语“大约”或“约”当应用于一个或多个所关注的值时，是指与所陈述的参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另外陈述或另外由本文显而易见(除了此类数字将超过可能的值的100％的情况)，否则术语“大约”或“约”是指属于所陈述的参考值在任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低内的值的范围。
癌症：术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”在本文中用于指细胞表现出相对异常的、不受控制的和/或自主的生长，使得其表现出特征为显著失控的细胞增殖的异常生长表型。在一些实施方案中，肿瘤可为或包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性细胞。本公开特别确定了其教导可能特别相关的某些癌症。在一些实施方案中，癌症可通过实体瘤表征。在一些实施方案中，癌症可通过血液肿瘤表征。一般来讲，本领域已知的不同类型的癌症的实例包括(例如)造血系统癌症，包括白血病、淋巴瘤(霍奇金氏和非霍奇金氏)、骨髓瘤和骨髓增殖性病症；肉瘤、黑色素瘤、腺瘤及实体组织癌；口腔、咽、喉和肺的鳞状细胞癌；肝癌；泌尿生殖系统癌症，诸如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌、子宫内膜癌或肾细胞癌；骨癌；胰腺癌；皮肤癌；皮肤或眼内黑色素瘤；内分泌系统癌；甲状腺癌；甲状旁腺癌；头颈癌；乳腺癌；胃肠癌；神经系统癌症；和良性病变，诸如乳头状瘤。在一些实施方案中，癌症包括或为膀胱癌，例如，高级非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)。在一些实施方案中，癌症包括或为原位癌(CIS)和/或高级乳头状疾病。在一些实施方案中，癌症包括或为Ta或T1膀胱癌。在一些实施方案中，癌症包括或为卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)抗性癌症。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指包含将活性剂与一种或多种药学上可接受的载体配制在一起的组合物。在一些实施方案中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量量存在，当施用于相关人群时，所述治疗方案显示出实现预定治疗效果的统计学显著概率。药物组合物可经特别配制用于以固体或液体形式施用，包括适合于以下的那些形式：口服施用，例如，浸剂(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如，靶向用于经颊、舌下和全身吸收)、推注剂、粉剂、颗粒剂、用于施用于舌的糊剂；肠胃外施用，例如通过膀胱内、皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，例如作为无菌溶液或悬浮液或缓释配制剂；局部应用，例如，作为乳霜、软膏或控释贴剂或喷雾剂应用于皮肤、肺或口腔；阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳霜或泡沫；舌下；眼睛；透皮；或鼻、肺和其他粘膜表面。在某些实施方案中，将药物组合物配制成用于膀胱内灌注的悬浮液(例如，无菌悬浮液)。在一些实施方案中，药物组合物意图且适合施用于人类受试者。
药学上可接受的载体：如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指参与将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的一部分的药学上可接受的材料、组合物或媒剂，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。从与配制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上来说，每一载体必须为“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲液，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer’s solution)；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及药物配制剂中采用的其他无毒的相容性物质。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指生物体，例如哺乳动物(例如，人类、非人类哺乳动物、非人类灵长类动物、灵长类动物、实验动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、猫或狗)。在一些实施方案中，人类受试者为成人、青少年或儿科受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病、病症或病状，例如，如本文所提供的可治疗的疾病、病症或病状，例如，本文列出的癌症或肿瘤(例如，膀胱癌或肿瘤，例如高级非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC))。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或病状。在一些实施方案中，易感受试者倾向于并且/或显示出发展疾病、病症或病状的增加的风险(与在参考受试者或群体中观察到的平均风险相比)。在一些实施方案中，受试者已经诊断为患有一种或多种疾病、病症或病状。在一些实施方案中，受试者表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状。在一些实施方案中，受试者不表现出疾病、病症或病状的特定症状(例如，疾病的临床表现)或特性。在一些实施方案中，受试者不表现出疾病、病症或病状的任何症状或特性。在一些实施方案中，受试者为患者。在一些实施方案中，受试者为施用和/或已施用诊断和/或疗法的个体。在一些实施方案中，受试者正在接受或已经接受某些疗法以诊断和/或治疗疾病、病症或病状。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(还有“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征和/或病因、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的疗法的任何施用。在一些实施方案中，此类治疗可以针对不表现出相关疾病、病症和/或病状的迹象的受试者和/或针对仅表现出疾病、病症和/或病状的早期迹象的受试者。或者或另外，此类治疗可以针对表现出相关疾病、病症和/或病状的一种或多种确定迹象的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已被诊断为罹患相关疾病、病症和/或病状的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已知具有在统计学上与相关疾病、病症和/或病状的发展的风险增加相关的一种或多种易感因素的受试者。
具体实施方式
本公开部分基于发现一种在不冷冻和/或不以冷冻状态储存的情况下保持病毒传染性的方法。该发现使用环糊精(一种环状寡糖)作为保护病毒的剂，以及可例如响应温度变化改变pH的液体储存缓冲液。不受理论的束缚，据信在碱性更大的pH下，缓冲液影响环糊精内腔内的电荷，从而促进病毒衣壳多肽与内腔结合。虽然与环糊精内部有关，但病毒在物理上免受低温的损害效果。在酸性更大的pH下，缓冲液具有相反的效果，使得病毒衣壳多肽不再与环糊精的内腔结合，从而促进病毒从环糊精中释放。因此，该系统能够实现pH依赖性转换，使得病毒可加载到环糊精内部以在储存期间进行保护，然后病毒可随后从环糊精中释放。
在一些实施方案中，向受试者施用载有病毒的环糊精导致pH依赖性转换，从而从环糊精中释放病毒颗粒。在一些实施方案中，例如可以由医师、药剂师或其他医疗保健提供者在施用于受试者之前调整pH，使得病毒颗粒在施用于受试者之前从环糊精中释放。
在一些实施方案中，本文所述的系统使用响应于温度变化而改变pH的缓冲液。例如，在较低温度下，缓冲液保持更大碱性，从而促进病毒衣壳多肽与环糊精内部结合。在较高温度下，缓冲液的酸性更大，从而促进病毒从环糊精中释放。本文所述的系统可用于(例如)将液体病毒悬浮液储存为冷但未冷冻的液体(例如，在约-20℃)，然后，在施用于受试者之前，可使悬浮液升温(例如，至室温)，从而从环糊精中释放病毒。
如本文所讨论的，发现本公开的温度响应性病毒储存系统在以液体悬浮液储存至少一整年时保持病毒传染性。因此，本公开至少部分地提供了一种用于以非冷冻液体形式储存的病毒的长期保存方法。本公开的储存系统对于多种医学上有用的病毒将是有效的，包括例如传染性腺病毒、慢病毒和腺相关病毒、由所述病毒制成的病毒疫苗以及所述病毒的重组形式，其中病毒以液体形式储存，但仍维持其初始传染性的高百分比。
系统组分
本公开的温度响应系统可包括环糊精、缓冲液、Tris和各种其他组分。
环糊精
环糊精是已知的环状寡糖家族，由通过α-1,4糖苷键连接的葡萄糖亚基大环组成。环糊精由淀粉通过酶促转化产生。正如今天所知，环糊精在1891年由A Villiers首次描述时被称为“木粉(cellulosine)”。不久之后，F.Schardinger鉴定了三种天然存在的环糊精-α、-β和-γ。因此，这些化合物被称为Schardinger糖。在1911年到1935年之间的25年里，德国的Schardinger是该领域的主要研究人员，证明环糊精与许多其他化学物质形成了稳定的水性复合物。环糊精具有环形结构，并且内部环形孔或腔可容纳或包封其他化合物。因此，已经进行了广泛的工作来探索环糊精及其衍生物在工业和药理学应用中的包封。现有技术教导在用于复合的方法中，“捏合”方法是最好的方法之一。然而，值得注意的是，本公开的系统不要求这样做。
如在直链淀粉(淀粉的片段)中，环糊精由5个或更多个1->4连接的α-D-吡喃葡萄糖苷单元构成。典型的环糊精在一个环中含有6到8个单元范围内的葡萄糖单体数量，从而产生锥形，其中β(贝塔)-环糊精含有7个葡萄糖亚单元。目前已知的最大的、充分表征的环糊精含有32个1,4-脱水吡喃葡萄糖苷单元，而作为表征不佳的混合物，至少150元环状寡糖也是已知的。在一些实施方案中，环糊精是羟丙基β-环糊精(例如，CAS登记号128446-35-5)。
具有疏水内部和亲水外部，环糊精与疏水化合物形成复合物。α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精都被美国FDA通常认为是安全的。它们已应用于递送多种药物，包括氢化可的松(hydrocortisone)、前列腺素(prostaglandin)、硝酸甘油(nitroglycerin)、伊曲康唑(itraconazol)、氯霉素(chloramphenicol)。环糊精赋予这些药物溶解性和稳定性。具有疏水性分子的环糊精的包涵化合物能够穿透身体组织，这些可用于在特定条件下释放生物活性化合物。
与环糊精的各种已知用途相反，我们的系统包括用于全新用途的环糊精：保护传染性病毒不被碱性更大的pH储存缓冲液还原，直到缓冲液升温，从而增加缓冲液的pH。由于缓冲溶液的pH变化，这导致病毒-环糊精复合物的受控降解，从而导致环糊精和病毒衣壳多肽之间的氢键结或离子键结的损失。不受理论的束缚，该系统可在储存期间将病毒隔离在环糊精内部，并在使配制剂升温时、例如在施用于患者之前，从环糊精复合物中释放病毒。
在一些实施方案中，一种病毒颗粒可具有许多与其结合的环糊精分子。例如，病毒表面上的一种或多种病毒刺突囊微粒可各自与一个或多个环糊精分子结合。为了确保有足够的环糊精分子来保护病毒颗粒，本文所述系统的一些优选实施方案包括比病毒颗粒多得多的环糊精分子，例如，约1x109至约1x1012(例如，约每个病毒颗粒有1x109、约1x1010、约1x1011或约1x1012)个环糊精分子。
缓冲液
本公开的系统包括类似于McIlvaine缓冲液的缓冲溶液。McIlvaine缓冲液是由柠檬酸和磷酸氢二钠构成的缓冲溶液，也称为柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液。它是在1921年由一位美国农学家发明的(来自West Virginia University的Theodore Clinton McIlvaine)。它可通过混合两种储备溶液在pH 2.2至8中制备。McIlvaine缓冲液当与甘油1:1混合时可用于制备水溶性封固介质。虽然McIlvaine缓冲液的制备需要磷酸二钠和柠檬酸，但本公开的系统的缓冲液用磷酸一钠(二水合物)代替磷酸二钠。
磷酸一钠(二水合物)也称为磷酸二氢钠脱水物(CAS登记号：13472-35-0)、磷酸氢钠脱水物和磷酸二氢一钠脱水物。它常用作乳化剂、增稠剂，用于软化水，并且用作高效防锈溶液。在本公开的系统中，磷酸一钠(二水合物)当作为缓冲液的一部分包括时可控制pH。
柠檬酸是一种具有化学式C6H8O7的弱有机酸。它天然存在于柑橘类水果中。在生物化学中，它是柠檬酸循环的中间体，其发生在所有需氧生物体的代谢中。它广泛用作酸化剂、抗氧化剂、调味剂和螯合剂。本文使用的术语“柠檬酸盐”如本领域常规使用的那样，表示柠檬酸的衍生物，即在溶液中发现的盐、酯和多原子阴离子。例如，示例性柠檬酸盐是柠檬酸三钠；柠檬酸酯是柠檬酸三乙酯。作为盐的一部分，柠檬酸根离子的式写为C6H5O3- 7或C3H5O(COO)3- 3。在一些实施例中，本公开的系统包括柠檬酸一水合物。
例如通过将0.2摩尔的磷酸一钠(二水合物)溶解在水中并添加足以制成一升的水量，可制备一升0.2M磷酸二钠储备溶液。例如通过将0.1摩尔(19.21克)柠檬酸溶解在水中并添加足以制成一升的水量，可制备一升0.1M柠檬酸储备溶液。在一些实施方案中，磷酸一钠(二水合物)和柠檬酸以约1.7:约0.01的比率使用。在一些实施方案中，磷酸一钠(二水合物)和柠檬酸以约1.5:约0.01、至约2.0:约0.01的比率使用。
本文所述的缓冲液还可包括柠檬酸钠二水合物。柠檬酸钠脱水物用作食品中的乳化剂，并且也用作抗凝血剂，以防止捐献的血液在储存中凝结。在一些实施方案中，包括柠檬酸钠脱水物并且其与柠檬酸结合用作pH调节剂。
本文所述的缓冲液还可包括氯化镁。氯化镁可指具有式MgCl2的化合物或它的各种水合物MgCl2(H2O)x。水合氯化镁可从盐水或海水中提取出。一些氯化镁是由海水的太阳能蒸发制成的。在一些实施方案中，氯化镁是MgCl六水合物。氯化镁是已知的并且可商购获得(例如，USP，CAS登记号7791-18-6)。
Tris
本公开的系统包括Tris以赋予温度依赖性pH变化性质。Tris，也称为三(羟甲基)氨基甲烷、氨丁三醇或THAM，是一种具有式为(HOCH2)3CNH2的有机化合物。它含有伯胺，因此会发生与典型胺相关的反应，例如与醛的缩合。在医学上，氨丁三醇偶尔用作药物，在特定情况下在重症监护中用于治疗严重代谢性酸中毒。一些药物被配制成氨丁三醇盐。这些氨丁三醇盐包括欣母沛(hemabate)(作为氨丁三醇盐的卡前列素(carboprost))和酮咯酸氨丁三醇。在本公开的系统中，例如在施用于受试者之前，当配制剂的温度从较低温度改变到较高温度(例如，从冷藏库中取出并升温(例如，到室温或体温))时，Tris缓冲液导致pH降低。在一些实施方案中，例如，随着温度从5摄氏度增加到25摄氏度，pH变化是平均约0.03单位pH/摄氏度。
在一些实施方案中，温度依赖性pH变化性质是基于Tris与磷酸钠的比率。在一些实施方案中，本公开的系统包括每摩尔磷酸钠约0.5摩尔至约2摩尔Tris的Tris与磷酸钠的摩尔比(例如，每摩尔磷酸钠约1摩尔至约1.5摩尔Tris，例如，每摩尔磷酸钠约1摩尔Tris、每摩尔磷酸钠约1.25摩尔Tris或每摩尔磷酸钠约1.5摩尔Tris)。
额外组分
在一些实施方案中，本公开的系统包括聚山梨醇酯80(吐温80(Tween 80))。聚山梨醇酯80是一种非离子表面活性剂和乳化剂，常用于食品、化妆品和疫苗悬浮液，以确保病毒在缓冲液中的规则分布。这种合成化合物是一种粘稠的水溶性黄色液体。聚山梨醇酯80是一种用于稳定用于肠胃外施用的药物的水性配制剂并在制备流行的抗心律失常药物胺碘达隆(amiodarone)中用作乳化剂的赋形剂。它还用作一些欧洲和加拿大流感疫苗中的赋形剂。例如，市售流感疫苗每剂量含有2.5μg聚山梨醇酯80。它还用于在Middlebrook 7H9肉汤中培养结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。它还用作雌激素调节药物埃斯曲索(Estrasorb)中的乳化剂，用于制粒以稳定药物和赋形剂，同时进行IPA(异丙醇)结合。
在一些实施方案中，本公开的系统包括一种或多种本领域已知的冷冻保护剂。在一些实施方案中，如果期望和/或需要，包括冷冻保护剂允许冷冻病毒悬浮液。冷冻保护剂的一个实例是甘油。它也称为甘油(glycerin)，是一种简单的多元醇化合物。它是一种味甜且无毒的无色、无味、粘稠的液体。甘油骨架发现于那些称为甘油酯的脂质中。由于具有抗微生物和抗病毒性质，它被广泛用于FDA批准的伤口和烧伤治疗。它也可用作衡量肝病的有效标记物。它还广泛用作食品工业中的甜味剂并用作药物配制剂中的保湿剂。由于存在三个羟基，甘油可与水混溶并具有吸湿性。
在一些实施方案中，本公开的系统包括蔗糖(普通糖)作为冷冻保护剂。它是一种二糖，一种由两种单糖构成的分子：葡萄糖和果糖。蔗糖是在植物中自然产生的，从中精制食糖。它具有分子式C12H22O11。
在一些实施方案中，本公开的系统包括类固醇类菲衍生物，(3α,5β,7α,12α)-N-[3-[(4-O-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖酰基)氨基]丙基]-3,7,12-三羟基-N-[3-[[(3α,5β,7α,12α)-3,7,12-三羟基-24-氧代基胆烷-24-基]氨基]丙基]-胆烷-24-酰胺，CAS登记号2127497-44-5，也通常称为NODA(参见例如WO 2017/180344；WO 2005/058368；US 6,392,069)。已知NODA有助于病毒穿透粘多糖涂层。因此，在将病毒施用于粘多糖涂布的身体部位的一些实施方案中，包括NODA。
示例性温度响应病毒储存系统
在一些实施方案中，本公开的储存系统包含初始配制剂，所述初始配制剂包括以下组分，每种组分的量表示为Tris(氨丁三醇)的重量百分比(w/w)：约5,000％至约7,000％甘油；约900％至约1,300％蔗糖；约100％氨丁三醇；约75％至约125％磷酸二氢钠脱水物；约500％至约700％羟丙基β-环糊精；约10％至约30％MgCl六水合物；0％至约100％NODA；约20％至约50％聚山梨醇酯80；约1％至约4％柠檬酸钠脱水物；和约0.5％至约2％柠檬酸一水合物。在一些实施方案中，本公开的储存系统包含一份初始配制剂和约7份、8份、9份、10份、11份或12份水。
在一些实施方案中，本公开的储存系统包含初始配制剂，所述初始配制剂包含以下组分，每种组分的量表示为Tris(氨丁三醇)的重量百分比(w/w)：约4,500％、约5,000％、约5,500％、约6,000％、约6,500％、约7,000％或约7,500％甘油；约800％、约900％、约1,000％、约1,100％、约1,200％、约1,300％或约1,400％蔗糖；约100％氨丁三醇；约65％、约75％、约85％、约95％、约100％、约105％、约115％或约125％磷酸二氢钠脱水物；约400％、约500％、约550％、约575％、约580％、约590％、约600％、约700％或约800％羟丙基β-环糊精；约5％、约10％、约15％、约20％、约21％、约22％、约25％、约30％、约35％或约40％MgCl六水合物；0％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％NODA；约10％、约20％、约30％、约35％、约40％、约50％或约60％聚山梨醇酯80；约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％或约5％柠檬酸钠脱水物；和约0.25％、约0.5％、约1％、约1.5％、约2％或约2.5％柠檬酸一水合物。在一些实施方案中，本公开的储存系统包含一份初始配制剂和约7份、8份、9份、10份、11份或12份水。
在一些实施方案中，本公开的储存系统包含初始配制剂，所述初始配制剂包含以下组分，每种组分的量表示为Tris(氨丁三醇)的重量百分比(w/w)：约6,000％甘油；约1,200％蔗糖；约100％氨丁三醇；约100％磷酸二氢钠脱水物；约600％羟丙基β-环糊精；约20％MgCl六水合物；0％NODA；约35％聚山梨醇酯80；约3％柠檬酸钠脱水物；和约0.75％柠檬酸一水合物。在一些实施方案中，本公开的储存系统包含一份初始配制剂和约7份、8份、9份、10份、11份或12份水。
在一些实施方案中，本公开的储存系统包含初始配制剂，所述初始配制剂包含以下组分，每种组分的量表示为Tris(氨丁三醇)的重量百分比(w/w)：约4,000％甘油；约700％蔗糖；约100％氨丁三醇；约150％磷酸二氢钠脱水物；约400％羟丙基β-环糊精；约60％MgCl六水合物；约75％NODA；约90％聚山梨醇酯80；约6％柠檬酸钠脱水物；和约3％柠檬酸一水合物。在一些实施方案中，本公开的储存系统包含一份初始配制剂和约7份、8份、9份、10份、11份或12份水。
在一些实施方案中，本公开的储存系统包含初始配制剂，所述初始配制剂包含以下组分，每种组分的量表示为Tris(氨丁三醇)的重量百分比(w/w)：约6,000％甘油；约1,200％蔗糖；约100％氨丁三醇；约100％磷酸二氢钠脱水物；约590％羟丙基β-环糊精；约21％MgCl六水合物；约71％NODA；约36％聚山梨醇酯80；约3％柠檬酸钠脱水物；和约1％柠檬酸一水合物。在一些实施方案中，本公开的储存系统包含一份初始配制剂和约7份、8份、9份、10份、11份或12份水。
在一些实施方案中，本公开的储存系统包含初始配制剂，所述初始配制剂包含以下组分，每种组分的量表示为Tris(氨丁三醇)的重量百分比(w/w)：约92％磷酸钠、约100％Tris、约11％氯化镁、约1,180％蔗糖、约5,900％甘油。在一些实施方案中，本公开的储存系统包含一份初始配制剂和约7份、8份、9份、10份、11份或12份水。
在一些实施方案中，例如，随着温度从5摄氏度增加到25摄氏度，本公开的系统表现出每摄氏度约0.03单位pH的pH变化。
病毒
本公开的系统可包括任何类型的病毒，例如病毒载体，例如用于基因疗法的病毒载体。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、1型单纯疱疹病毒、疱疹病毒、癌病毒(例如，鼠白血病病毒)等。一般而言，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
逆转录病毒是属于逆转录病毒科的包膜病毒。一旦进入宿主细胞，所述病毒就会通过使用病毒逆转录酶将其RNA转录成DNA进行复制。逆转录病毒DNA作为宿主基因组的一部分进行复制，并且被称为前病毒。可以使用本领域已知的技术将转基因插入到载体中并包装到逆转录病毒颗粒中。然后可将重组病毒分离并在体内或离体递送到受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的(参见例如美国专利号5,994,136、6,165,782和6,428,953)。
逆转录病毒包括α逆转录病毒属(Alpharetrovirus)(例如，禽白血病病毒)、β逆转录病毒属(Betaretrovirus)(例如，小鼠乳腺肿瘤病毒)、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus)(例如，牛白血病病毒和人嗜T淋巴细胞病毒)、ε逆转录病毒属(Epsilonretrovirus)(例如，大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒(Walleye dermal sarcoma virus))和慢病毒属(Lentivirus)。
在一些实施方案中，逆转录病毒是一种慢病毒，一种特征在于长孵育期的逆转录病毒科病毒属。慢病毒能够感染非分裂细胞，这在逆转录病毒中是独特的；慢病毒可将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此其是基因递送载体的最有效方法之一。慢病毒载体与其他病毒载体相比所具有的优势在于其可转导非增殖细胞并显示出低免疫原性。在一些实例中，慢病毒包括(但不限于)人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(S1V)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血(EIA)和维斯纳病毒(visna virus)。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
在实施方案中，载体是腺病毒载体。腺病毒是一大类含有双链DNA的病毒。其复制宿主细胞的DNA，同时使用宿主的细胞机制合成病毒RNA、DNA和蛋白质。本领域已知腺病毒影响复制和非复制细胞，容纳大的转基因，并且编码蛋白质而无需整合到宿主细胞基因组中。
在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。AAV系统在本领域中通常是众所周知的(参见，例如，Kelleher和Vos,Biotechniques,17(6):1110-17(1994)；Cotten等人，P.N.A.S.U.S.A.,89(13):6094-98(1992)；Curiel,Nat Immun,13(2-3):141-64(1994)；Muzyczka,Curr Top Microbiol Immunol,158:97-129(1992)；和Asokan A等人，Mol.Ther.,20(4):699-708(2012))。用于产生和使用重组AAV(rAAV)载体的方法描述于(例如)美国专利号5,139,941和4,797,368中。已经表征了几种AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3(例如，AAV3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，以及它们的变体。
转基因
本公开的系统可包括本文所述的病毒，其包括或编码任何所关注的转基因。在一些实施方案中，病毒包括或编码1型和/或2型干扰素，包括它们的缺失、插入或取代变体、生物活性片段和等位基因形式。1型干扰素包括干扰素-α、-β、-ε、-κ、-ω、-δ、-ζ和-τ及它们的亚型，而2型干扰素称为干扰素-γ(参见Lee等人，Front.Immunol.9:2061(2018))。特定干扰素-α包括人类干扰素α亚型，包括但不限于α-1(GenBank登录号NP 076918)、α-1b(GenBank登录号AAL35223)、α-2、α-2a(GenBank登录号NP000596)、α-2b(GenBank登录号AAP20099)、α-4(GenBank登录号NP066546)、α-4b(GenBank登录号CAA26701)、α-5(GenBank登录号NP 002160和CAA26702)、α-6(GenBank登录号CAA26704)、α-7(GenBank登录号NP066401和CAA 26706)、α-8(GenBank登录号NP002161和CAA 26903)、α-10(GenBank登录号NP002162)、α-13(GenBank登录号NP 008831和CAA 53538)、α-14(GenBank登录号NP 002163和CAA 26705)、α-16(GenBank登录号NP 002164和CAA 26703)、α-17(GenBank登录号NP067091)、α-21(GenBank登录号P01568和NP002166)；和美国专利号5,541,293、美国专利4,897,471和美国专利4,695,629中描述的共有干扰素；和美国专利号4,414,150中描述的杂合干扰素。干扰素-γ描述在(例如)EP 77,670A和EP 146,354A以及GenBank登录号NP002168中。本公开的特定组合物包含编码美国专利号6,835,557中描述的干扰素-α的重组腺病毒载体，例如，有或没有信号序列。在一些实施方案中，非复制型重组腺病毒载体包含或是5型非复制型腺病毒载体。在一些实施方案中，非复制型重组腺病毒载体是在例如美国专利号6,210,939中描述的重组腺病毒载体。在一些实施方案中，重组腺病毒载体编码至少一种IFNα-2(例如，IFNα-2a或IFNα-2b中的一种或两种)。在某些实施方案中，重组腺病毒载体编码人类IFNα-2b。
病毒颗粒的储存
本公开的系统可用于储存包括病毒颗粒(例如，病毒载体颗粒)的配制剂。在一些实施方案中，使用本公开的系统配制病毒载体(例如腺病毒载体，例如编码干扰素α-2b的腺病毒载体)并使其经受储存条件，例如冷冻或非冷冻(例如，在约-60℃下、在约-20℃下、在约-15℃下、在约-10℃下、在约-5℃下、在约0℃下、在约4℃下或在约8℃下)储存约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月、24个月、28个月、32个月、36个月、48个月或更长。在一些实施方案中，在所述储存条件下储存后，病毒载体相对于对照维持高水平的传染性。例如，在所述储存条件下储存后，病毒载体表现出相对于对照传染性水平(例如，所述病毒载体在所述储存条件下储存之前的传染性水平，或所述病毒载体在所述储存条件期间的先前时间的传染性水平)为至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多的传染性水平。在一些实施方案中，在所述储存条件下储存后，病毒载体表现出相对于对照传染性水平(例如，所述病毒载体在所述储存条件下储存之前的传染性水平，或所述病毒载体在所述储存条件期间的先前时间的传染性水平)，降低不超过约40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的传染性水平。
在一些实施方案中，使用本公开的系统配制病毒载体(例如腺病毒载体，例如编码干扰素α-2b的腺病毒载体)并使其经受储存条件，例如冷冻或非冷冻(例如，在约-60℃下、在约-20℃下、在约-15℃下、在约-10℃下、在约-5℃下、在约0℃下、在约4℃下或在约8℃下)储存约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月、24个月、28个月、32个月、36个月、48个月或更长。在一些实施方案中，在所述储存条件下储存后，配制剂相对于对照维持高水平的总病毒颗粒浓度。例如，相对于总病毒颗粒浓度的对照水平(例如，在所述储存条件下储存之前的总病毒颗粒浓度水平，或在所述储存条件期间的先前时间的总病毒颗粒浓度水平)，在所述储存条件下储存后，总病毒颗粒浓度水平为至少约70％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，相对于总病毒颗粒浓度的对照水平(例如，在所述储存条件下储存之前的总病毒颗粒浓度水平，或在所述储存条件期间的先前时间的总病毒颗粒浓度水平)，在所述储存条件下储存后，总病毒颗粒浓度水平降低不超过约30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少。
用于测量病毒颗粒浓度和传染性的方法和测定是本领域已知的。参见，例如，Nyberg-Hoffman等人，Nat.Med.3:808-11(1997)；Barde等人，Curr.Protoc.Neurosci.53:4.21.1-4.21.23(2010)；Pankaj,Mater.Methods 3:207(2013)；WO2017/048599。在一些实施方案中，在测量病毒颗粒浓度或传染性之前，将在本文所述的储存条件下储存的病毒载体的样品置于室温(例如，在室温下保持约15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时或更长)。如本领域已知的，传染性水平可表示为(例如)NAS IU(归一化和调整的标准-传染性单位)/mL。
组成和施用
本文所述的系统(例如，包含本文所述的系统组分和病毒载体的组合物)可配制成药物组合物。所述药物组合物可用于例如预防和/或治疗疾病，例如癌症(例如膀胱癌)。在一些实施方案中，药物组合物可经配制以包括药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方案中，本文所述的组合物可根据常规药学实践配制成用于注射的无菌配制剂。在一些实施方案中，本文所述的组合物是用于膀胱内灌注的无菌悬浮液。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物基本上不含污染物(例如，宿主细胞(例如，HEK293细胞)和/或血清(例如，胎牛血清)的组分(例如，DNA和蛋白质))。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物包含痕量的污染物(例如，宿主细胞(例如，HEK293细胞)和/或血清(例如，胎牛血清)的组分(例如，DNA和蛋白质))。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物基本上不含防腐剂。
任何特定形式的选择或使用可部分取决于预期的施用方式和治疗应用。例如，意图用于全身或局部递送的组合物可呈可注射或可输注溶液的形式。因此，组合物可经配制用于通过肠胃外方式(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射)施用。如本文所用，肠胃外施用是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于膀胱内、静脉内、鼻内、眼内、经肺、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、肺内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、硬膜外、大脑内、颅内、颈动脉内和胸骨内注射和输注。施用可以是全身的或局部的。施用途径可以是肠道外施用，例如通过膀胱内灌注或注射施用。在一些实施方案中，膀胱内施用可通过诸如导管的装置来完成。
如本文所讨论的，本文所述的系统可与病毒载体一起配制以在本文所述的储存条件下储存。在一些实施方案中，将组合物冷冻储存并在室温(例如，约20℃至约25℃)下解冻，直到在施用于受试者之前呈液态。在一些实施方案中，将组合物非冷冻储存并在施用于受试者之前，升温至室温(例如，约20℃至约25℃)。在一些实施方案中，将组合物升温至室温，并在施用于受试者之前在室温下维持约15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时或更长。
本文所述的药物组合物可用于治疗受试者。本文所述的组合物可用于(例如)治疗或预防癌症(例如癌症，例如癌或其他实体或血液癌症、癌症转移)。如本文所用，术语“癌症”意图包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭性阶段如何。本文公开的方法和组合物特别可用于治疗与癌症相关的转移性病变，或减少其大小、数量或生长速率。
癌症的实例包括但不限于实体瘤、软组织肿瘤、造血系统肿瘤和转移性病变。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和癌，诸如影响头颈部(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌)、乳腺、淋巴、胃肠道(例如，口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和泌尿生殖道(例如，肾、尿路上皮、膀胱、卵巢、子宫、子宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如，神经或神经胶质细胞，例如，神经母细胞瘤或神经胶质瘤)、皮肤(例如，黑色素瘤)的那些肿瘤。可治疗的造血系统癌症的实例包括血管瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病以及骨髓增生异常。本文公开的方法和组合物特别可用于治疗、例如减少或延迟与上述癌症相关的转移性病变。在一些实施方案中，受试者将经历组织手术去除、化学疗法或其他抗癌疗法中的一种或多种，并且主要或唯一目标将是转移性病变，例如骨或淋巴结或肺或肝或腹腔或CNS或其他器官中的转移。
本领域普通技术人员应了解，由细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。本文所述的组合物的适当剂量通常位于包括ED50且毒性很小或没有毒性的组合物的循环浓度范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于本文所述的组合物，可由细胞培养测定来初始估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量来实现包括如在细胞培养中测定的IC50的循环血浆浓度范围。所述信息可用于更准确地测定在人类中的有用剂量。可例如通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。在一些实施方案中，例如，在需要局部施用(例如，对膀胱组织)的情况下，细胞培养物或动物模型可用于确定在局部部位内达到治疗有效浓度所需的剂量。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入本文。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不是意图具有限制性。除非另有限定，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明领域内的普通技术人员对于该发明所属的通常理解的意义相同的意义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可于本发明的实践或测试中，但本文描述适合的方法和材料。
通过以下实施例进一步说明本公开。提供的实施例仅用于说明目的。它们不应被解释为以任何方式限制本公开的范围或内容。
实施例
实施例1提供了每种成分的示例性重量范围，每种组分的量表示为用于制备组合物的Tris(氨丁三醇)重量的百分比。
Figure BDA0003848929610000241
Figure BDA0003848929610000251
将其中的一份(w/w)与约10份(w/w)纯化水合并以制成最终缓冲液。然后该缓冲液用于悬浮传染性病毒。缓冲液中病毒的密度取决于病毒的最终医疗用途。疫苗和其他可注射产品将需要更浓缩的制剂(病毒对缓冲液的体积更小)。用于例如膀胱灌注或胸腔冲洗的冲洗产品可使用更稀释的制剂，例如每毫升缓冲液约1x1010至约1x1013个病毒颗粒。在本实施例中，每毫升使用4x1016个慢病毒颗粒。
实施例2：示例性缓冲液在此显示为实施例2，每种组分的量表示为用于制备组合物的Tris(氨丁三醇)重量的百分比。
Figure BDA0003848929610000252
将其中的一份(w/w)与9份(w/w)纯化水合并以制成最终缓冲液。然后，该缓冲液用于悬浮传染性病毒，浓度为每毫升缓冲液约1x1011个腺相关病毒颗粒。
实施例3：另一示例性缓冲液在此显示为实施例3，每种组分的量表示为用于制备组合物的Tris(氨丁三醇)重量的百分比。
Figure BDA0003848929610000261
将其中的一份(w/w)与9份(w/w)纯化水合并以制成最终缓冲液。然后，该缓冲液用于悬浮传染性病毒，浓度为每毫升缓冲液约3x1011个腺病毒颗粒。
实施例4：另一示例性缓冲液在此显示为实施例4，每种组分的量表示为用于制备组合物的Tris(氨丁三醇)重量的百分比。
Figure BDA0003848929610000262
将其中的一份(w/w)与9份(w/w)纯化水合并以制成最终缓冲液。然后，该缓冲液用于悬浮传染性病毒，浓度为每毫升缓冲液约3x1011个腺病毒颗粒。
我们测试了我们的缓冲液，并且发现，即使当将悬浮的病毒作为非冷冻液体储存时，它也能保持病毒的传染性，并且这样做能保持传染性至少一整年。
实施例5：传染性测定方案
我们使用荧光激活细胞分选仪(FACS)分析了病毒样品的传染性。
对于病毒，我们使用复制缺陷型重组腺病毒5型(rAd)。测定原理是将HEK293细胞用30个、60个和90个病毒颗粒(vp)/细胞(ppc)的rAd感染15分钟，并放置48小时产生病毒。HEK293细胞含有补偿功能，并因此使复制缺陷型病毒能够复制。孵育后，将感染的细胞固定并用针对腺病毒六邻体结构蛋白的FITC缀合抗体染色。然后可用流式细胞仪对在感染细胞内积累的六邻体进行量化。作为测定传染性的第二种方法，我们使用带有干扰素基因的rAd(rAd-IFN)。该基因的表达使我们能够测量干扰素活性，这是病毒传染性的代表。
所有细胞工作和固定细胞的程序均使用无菌技术在层流罩中进行，以最小化对操作员的生物危害风险。固定后，细胞仪分析前的其余程序在通风罩中进行。
将对照样品rAd在10.9mM磷酸钠、14mM Tris碱、2mM氯化镁、2％(w/v)蔗糖、10％(w/v)甘油的最终配制剂缓冲液中配制，其在室温下提供8.1的微碱性pH。我们使用5.4x1011vp/ml的病毒颗粒浓度。
作为参考标准，我们使用Merck Sharpe&Dohme,Switzerland制造的纯化rAd病毒。参考标准的病毒颗粒浓度为1.4x1012vp/ml，在我们测试开始时的传染性为1.37x1011NASIu/ml(“NAS IU”是归一化和调整的标准-传染性单位)，并且效力为251IU/ml。
根据要分析的样品数量而定，rAd方法开发样品的传染性测定可使用6孔或96孔板进行。结果报告为针对参考标准的相对滴度，并使用对照样品监测测定性能。在6孔板测定中，可分析三个测试样品(TS)、参考标准(RS)和对照样品(CS)。在96孔板上，可分析15个测试样品。如果需要对不同样品的传染性进行比较，则应在同一测定中分析样品。
我们的标准测定由20个孔、三个完整板和第四个孔中的两个孔组成。为了进行测定，我们首先制备具有7.4x105个细胞/ml的细胞悬浮液。为此，我们将计算量的预热的生长培养基移液到无菌容器中。然后，在将计算量的悬浮液移液到具有生长培养基的容器中之前，我们通过颠倒至少10次轻轻但彻底地混合细胞悬浮液。然后，我们通过用
Figure BDA0003848929610000281
上下移液至少10次，彻底混合接种细胞悬浮液。然后，我们在6孔板上接种1ml/孔，在板之间更换移液器吸头，并摇动板以将细胞悬浮液均匀地分散在孔中。然后，我们将接种板转移到37℃、5％CO2孵育箱中22±4小时。
该工作在LFH中进行直到细胞经固定，并且其后在通风罩中进行。离心后，我们总是会留下少量的上清液；这个小步骤在固定前尤为重要，这是因为如果吸出的细胞太干，细胞很容易聚集。然后我们将板从孵育箱中取出，记下取出的日期和时间。然后我们在显微镜下检查细胞并记录附着和聚合程度。然后，我们使用无菌玻璃巴斯德(Pasteur)移液器和真空泵从样品的所有孔中吸出培养基。然后我们添加0.5ml TTrypLETM express并留在细胞上，然后我们继续进行下一个样品。我们在样品之间更换了巴斯德玻璃。
然后我们在室温(“RT”)下孵育细胞，直到细胞脱落(这有时需要超过3分钟)。然后我们在显微镜下检查细胞是否已脱落，这是因为此时所有细胞都已脱落至关重要。然后，我们按照添加TrypLETM的相同顺序将2ml预热的生长培养基添加到每个孔中。然后我们小心地上下移液以确保所有细胞都处于悬浮状态。然后我们将细胞从每个管转移到Falcon管并离心所述管。然后我们从每个管中吸出培养基，留下约50-100μl上清液。
然后我们将细胞重新悬浮在剩余的上清液中。然后我们添加1ml冰冷的丙酮:甲醇来固定细胞并使其具有渗透性，通过轻轻上下移液混合。极为重要的是，细胞此时处于单细胞悬浮液中。然后我们将样品在4℃下孵育15分钟到60分钟。然后我们向每个管中添加1ml1％BSA的PBS溶液。然后我们离心，然后从每个管中吸出上清液，留下约50-100μl上清液。
然后我们将细胞重新悬浮在剩余的上清液中。然后我们向每个管中添加70μl单克隆抗体，并在4℃下用抗体染色细胞15分钟。对于我们的利用腺病毒的实验，我们使用了腺病毒六邻体衣壳多肽特异性抗体。对于另一种病毒，当然可以使用对这种病毒特异的抗体；病毒和抗体的具体选择对于要求保护的发明并不重要。
我们使用CANTO IITM品牌荧光激活细胞分选仪对含有荧光抗体标记多肽的细胞进行计数。在分析之前打开荧光激活细胞分选仪的电源，并首先运行CST珠子作为性能检查。在运行第一个样品期间，我们移动P1闸，使其覆盖主要的细胞群。我们更喜欢数据收集设置应该是这样的，即每个96孔板在每个P1闸中产生约10,000个事件，并且每个管在每个P1闸中产生约50,000个事件。
实施例6：非冷冻液体缓冲液保持传染性至少一年。我们在实施例4的缓冲液中制备病毒的悬浮液，将所述悬浮液在-20℃保存一年以上，并定期测量病毒颗粒浓度。在-20℃，由于缓冲液中包括各种盐和赋形剂，缓冲液保持液态(非冷冻)。我们的实验数据显示，总病毒颗粒浓度在一整年过程中下降，但并不显著。此外，并且更重要的是，储存的病毒的传染性滴度在三个月后略有下降，但随后稳定下来，并且其后至少一整年保持相当高(作为初始传染性滴度的百分比)。
Figure BDA0003848929610000301
我们的温度响应缓冲液系统在一年多时间内实现了显著的稳定性，这表明我们的缓冲液系统将在液态下保持传染性达18个月、24个月和更长的储存时间。
实施例7：我们重复实施例6的方案。那些数据再次显示储存12个月后病毒颗粒浓度和传染性滴度两者的稳定性。
Figure BDA0003848929610000302
实施例8：我们重复实施例6的方案。那些数据再次显示储存12个月时病毒颗粒浓度和传染性滴度的显著稳定性。
Figure BDA0003848929610000311
实施例9：我们重复实施例6的方案。那些数据再次显示储存12个月后病毒颗粒浓度和传染性滴度两者的稳定性。
Figure BDA0003848929610000312
实施例10：使用实施例1的制剂，重复实施例6的方案。那些数据再次显示储存12个月后病毒颗粒浓度和传染性滴度两者的稳定性。
Figure BDA0003848929610000313
等效方案
应当理解，虽然已经结合其详细描述描述了本发明，但前述描述旨在说明而不是限制由所附权利要求的范围限定的本发明的范围。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (32)

1.一种包含传染性病毒颗粒、氨丁三醇和环糊精的组合物，其中所述组合物包含每个病毒颗粒约1x109至约1x1012个环糊精分子。
2.一种包含传染性病毒颗粒、环糊精、氨丁三醇和磷酸钠的组合物，其中所述组合物包含每摩尔磷酸钠约1摩尔至约1.5摩尔氨丁三醇。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含每个病毒颗粒约1x109至约1x1012个环糊精分子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，所述组合物还包含冷冻保护有效量的甘油、蔗糖或两者。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约600倍的甘油，并且所述组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约120倍的蔗糖。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述环糊精是羟丙基β-环糊精。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约6倍的羟丙基β-环糊精。
8.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，所述组合物还包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约0.7倍的(3α,5β,7α,12α)-N-[3-[(4-O-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖酰基)氨基]丙基]-3,7,12-三羟基-N-[3-[[(3α,5β,7α,12α)-3,7,12-三羟基-24-氧代基胆烷-24-基]氨基]丙基]-胆烷-24-酰胺(NODA)。
9.如权利要求2-8中任一项所述的组合物，其中所述磷酸钠是磷酸二氢钠二水合物。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，所述组合物还包含氯化镁、聚山梨醇酯80、柠檬酸钠和柠檬酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述病毒以每毫升组合物约1x1011个病毒颗粒的量存在。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述组合物在第一温度下具有第一pH并且在第二温度下具有第二pH，其中所述第一温度低于所述第二温度，并且所述第一pH高于所述第二pH。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述第一温度为约-20℃，并且所述第一pH为碱性pH。
14.如权利要求12或13所述的组合物，其中所述第二温度为约20℃至约25℃，并且所述第二pH为酸性pH。
15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中在作为非冷冻液体或以冷冻状态在-20℃下储存约一年后，所述病毒颗粒保留初始总病毒颗粒浓度的至少约95％以及其初始传染性滴度的至少约80％，所述初始传染性滴度测量为归一化和调整的标准-传染性单位(NAS IU)。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述传染性病毒是慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述传染性病毒是复制缺陷型腺病毒。
18.一种包含磷酸二氢钠脱水物、氨丁三醇、甘油、蔗糖、羟丙基β-环糊精、NODA和传染性复制缺陷型腺病毒的组合物，其中所述组合物包含：
氨丁三醇，相对量为每摩尔磷酸二氢钠脱水物约1摩尔至约1.5摩尔氨丁三醇；
甘油，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约600倍；
蔗糖，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约120倍；
羟丙基β-环糊精，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约6倍；
NODA，相对量为氨丁三醇量(w/w)的约0.7倍；和
每毫升组合物约1x1011个复制缺陷型腺病毒颗粒。
19.一种包含传染性病毒颗粒、氨丁三醇和环糊精的组合物，所述环糊精以每个病毒颗粒约1×109至约1×1012个环糊精分子的相对量存在，所述氨丁三醇能够响应温度变化改变pH，所述氨丁三醇以如下量存在：如果所述组合物以液体、非冷冻状态或冷冻状态在-20℃下储存一年，则所述病毒颗粒保留初始总病毒颗粒浓度的至少约95％和测量为NAS IU的其初始传染性滴度的至少约80％。
20.如权利要求19所述的组合物，所述组合物还包含以每摩尔磷酸钠约1摩尔至约1.5摩尔氨丁三醇的相对量存在的磷酸钠。
21.如权利要求20所述的组合物，所述磷酸钠为磷酸二氢钠脱水物。
22.如权利要求19-21中任一项所述的组合物，所述组合物还包含冷冻保护有效量的甘油、蔗糖或两者。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约600倍的甘油，并且所述组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约120倍的蔗糖。
24.如权利要求19-25中任一项所述的组合物，其中所述环糊精是羟丙基β-环糊精。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述组合物包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约6倍的羟丙基β-环糊精。
26.如权利要求19-25中任一项所述的组合物，其中所述传染性病毒是慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。
27.如权利要求19-26中任一项所述的组合物，其中所述传染性病毒是复制缺陷型腺病毒。
28.如权利要求19-27中任一项所述的组合物，所述组合物还包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约0.7倍的NODA，并且其中所述病毒以每毫升组合物约1x1011个病毒颗粒的量存在。
29.如权利要求19所述的组合物，所述组合物还包含以每摩尔磷酸二氢钠脱水物约1摩尔至约1.5摩尔氨丁三醇的相对量存在的磷酸二氢钠脱水物，并且还包含甘油和蔗糖，所述甘油以氨丁三醇量(w/w)的约600倍的相对量存在，并且所述蔗糖以氨丁三醇量(w/w)的约120倍的相对量存在，其中所述环糊精包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约6倍的羟丙基β-环糊精，其中所述传染性病毒包含复制缺陷型腺病毒，并且还包含相对量为氨丁三醇量(w/w)的约一倍的NODA，其中所述病毒以每毫升组合物约1x1011个病毒颗粒的量存在。
30.一种保持传染性病毒的传染性水平的方法，所述方法包括将如权利要求1-29中任一项所述的组合物以液体、非冷冻状态或以冷冻状态在-20℃下储存至少一年。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述病毒颗粒保留初始总病毒颗粒浓度的至少约95％和测量为NAS IU的其初始传染性滴度的至少约80％。
32.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-29中任一项所述的组合物，其中所述病毒颗粒是编码人类干扰素α-2b的重组腺病毒颗粒。
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