TW202200197A - 溫度反應型病毒儲存系統 - Google Patents

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尼格爾 帕克
羅伯特 蕭
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Abstract

本發明描述一種溫度反應型病毒儲存系統，該系統允許儲存病毒(諸如非冷凍液體)，及保持傳染力。

Description

溫度反應型病毒儲存系統
傳染性病毒可用作例如疫苗及基因療法載體。然而，病毒會隨著時間的推移而損失傳染力。
此項技術教示的保持病毒傳染力之一種方法係藉由冷凍。此項技術教示儲存懸浮在經冷凍之儲存緩衝液中之傳染性病毒，或冷凍病毒懸浮液且然後藉由冷凍-乾燥移除經冷凍之儲存緩衝液以產生經乾燥之凍乾產物。
然而，不管冷凍是否需要隨後之乾燥/凍乾，冷凍可損傷病毒，降低傳染力。此項技術解決此點之一種傳統方式係藉由添加冷凍保護劑(cryo-protectant)。例如，此項技術教示將傳染性病毒以含於含有10至30%甘油作為冷凍保護劑之鹽水中之懸浮液形式進行冷凍(Graham等人，1991，Methods in Molecular Biology ，第7卷，第11章，第109至127頁；Ed Murrey The Human Press Inc.；Precious及Russel，Virology, a Practical Approach ，1985，第9章，第193至205頁；編輯：BW Mahy，IRL Press，Washington DC；Kanegae等人，Jpn. J. Med. Sci. Biol.，47，157-166，1994及Green等人，Methods in Enzymology ，第LVIII卷，第425至435頁)，PCT專利公開案W098/02522。甘油減少病毒在冷凍-解凍過程期間引起之損傷，保留某種程度的傳染力。然而，此項技術教示甘油具有刺激肺上皮之缺點，此在氣管內及肺內投與(例如用於治療囊性纖維化或肺道之癌症)之情況下可為不可接受的。
低濃度(1至5%)蔗糖之鹽水亦已用作用於經冷凍之病毒懸浮液之冷凍保護劑(Precious等人，參見以上；Huyghe等人，Human Gene Therapy 6：1403-1416，1995年11月，及Rehir，Process Development and Production Issues for Viral Vectors & Vaccines ，The Williamsburg Bio Processing Conference，第2屆年會，1995年11月6日至9日)。
亦已建議使用低濃度(2.5至5%)之乳糖或蔗糖冷凍保存活病毒(參見JP88/555465)。
冷凍保護劑會減少冷凍損害。然而，冷凍保護劑並沒有消除冷凍損害。因此，此項技術需要一種以非冷凍形式保存病毒之方式，其中該病毒保留其大量原始傳染力。
在一個態樣中，本發明之特徵係一種包含傳染性病毒顆粒、胺丁三醇及環糊精之組合物，其中該組合物包含約1 x 109 至約1 x 1012 個環糊精分子/病毒顆粒(例如約1 x 109 、約1 x 1010 、約1 x 1011 或約1 x 1012 個環糊精分子/病毒顆粒)。在另一個態樣中，該組合物包含傳染性病毒顆粒、環糊精、胺丁三醇及磷酸鈉，其中該組合物包含約1至約1.5莫耳胺丁三醇/莫耳磷酸鈉(例如約1、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5莫耳胺丁三醇/莫耳磷酸鈉)。
在一些實施例中，該組合物包含冷凍保護劑(例如冷凍保護有效量之甘油、蔗糖或兩者)。
在一些實施例中，該組合物包含相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約500倍、約600倍或約700倍之甘油。在一些實施例中，該組合物包含相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約90倍、約100倍、約110倍、約120倍或約130倍之蔗糖。
在一些實施例中，環糊精為羥丙基β-環糊精。在一些實施例中，羥丙基β-環糊精係以相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約5倍、約6倍或約7倍。
在一些實施例中，該組合物進一步包含(3α,5β,7α,12α)-N-[3-[(4-O-D-半乳糖吡喃糖基-D-葡糖醯基)胺基]丙基]-3,7,12-三羥基-N-[3-[[(3α,5β,7α,12α)-3,7,12-三羥基-24-側氧基膽烷-24-基]胺基]丙基]-膽烷-24-醯胺(NODA)。在一些實施例中，該組合物包含相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約0.5倍、約0.6倍、約0.7倍、約0.8倍、約0.9倍或約1倍之NODA。
在一些實施例中，磷酸鈉為磷酸二氫鈉脫水物。在一些實施例中，該組合物進一步包含氯化鎂、聚山梨醇酯80、檸檬酸鈉及檸檬酸。
在一些實施例中，病毒係以約1 x 1011 個病毒顆粒/毫升組合物之量存在。
在一些實施例中，該組合物在第一溫度下具有第一pH，及在第二溫度下具有第二pH，其中該第一溫度係低於該第二溫度，及該第一pH係高於該第二pH。在一些實施例中，第一溫度為約-60℃、約-20℃、約-0℃、約4℃，及第一pH為鹼性pH。在一些實施例中，第二溫度為約20℃至約25℃，及第二pH為酸性pH。
在一些實施例中，在約-60℃或在約-20℃下以非冷凍液體或以冷凍狀態儲存約3個月、6個月、9個月、12個月、15個月、18個月、21個月、24個月或更長時間之後，病毒顆粒保留初始總病毒顆粒濃度之至少約70%、80%、90%或95%，及/或保留其初始傳染效價之至少約60%、70%、80%、90%或95%。在一些實施例中，傳染效價係測量為標準化及經調整之標準-傳染單位(NAS IU)。
在一些實施例中，傳染性病毒為慢病毒、腺病毒或腺相關病毒。在一些實施例中，傳染性病毒為複製缺陷型腺病毒。
在另一個態樣中，本發明之特徵係一種包含磷酸二氫鈉脫水物、胺丁三醇、甘油、蔗糖、羥丙基β-環糊精、NODA及傳染性複製缺陷型腺病毒之組合物，其中該組合物包含：相對量為約1至約1.5莫耳胺丁三醇/莫耳磷酸二氫鈉脫水物之胺丁三醇；相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約600倍之甘油；相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約120倍之蔗糖；相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約6倍之羥丙基β-環糊精；相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約0.7倍之NODA；及約1 x 1011 個複製缺陷型腺病毒顆粒/毫升組合物。在一些實施例中，該組合物包含第一調配物，其包含磷酸二氫鈉脫水物、胺丁三醇、甘油、蔗糖、羥丙基β-環糊精、NODA及傳染性複製缺陷型腺病毒，其中該組合物包含：相對量為約1至約1.5莫耳胺丁三醇/莫耳磷酸二氫鈉脫水物之胺丁三醇；相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約600倍之甘油；相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約120倍之蔗糖；相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約6倍之羥丙基β-環糊精；相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約0.7倍之NODA；及約1 x 1011 個複製缺陷型腺病毒顆粒/毫升組合物，其中該組合物包含約1份第一調配物及約10份水。
在另一個態樣中，本發明之特徵係一種包含傳染性病毒顆粒、胺丁三醇及環糊精之組合物，該環糊精係以相對量為約1 x 109 至約1 x 1012 個環糊精分子/病毒顆粒存在，該胺丁三醇能夠對溫度改變反應而改變pH，該胺丁三醇的存在量為使得若該組合物以液體、非冷凍狀態或以冷凍狀態在-20℃下儲存一年，則病毒顆粒保留初始總病毒顆粒濃度之至少約95%及以NAS IU測得之其初始傳染效價之至少約80%。
在一些實施例中，該組合物進一步包含以相對量為約1至約1.5莫耳胺丁三醇/莫耳磷酸鈉存在之磷酸鈉。在一些實施例中，磷酸鈉為磷酸二氫鈉脫水物。
在一些實施例中，該組合物進一步包含冷凍保護有效量之甘油、蔗糖或兩者。在一些實施例中，該組合物包含相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約600倍之甘油，及該組合物包含相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約120倍之蔗糖。
在一些實施例中，環糊精為羥丙基β-環糊精。在一些實施例中，該組合物包含相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約6倍之羥丙基β-環糊精。
在一些實施例中，傳染性病毒為慢病毒、腺病毒或腺相關病毒。在一些實施例中，傳染性病毒為複製缺陷型腺病毒。
在一些實施例中，該組合物進一步包含相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約0.7倍之NODA，且其中該病毒係以約1 x 1011 個病毒顆粒/毫升組合物之量存在。
在一些實施例中，該組合物進一步包含以相對量為約1至約1.5莫耳胺丁三醇/莫耳磷酸二氫鈉脫水物存在之磷酸二氫鈉脫水物，且進一步包含甘油及蔗糖，該甘油係以相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約600倍存在及該蔗糖係以相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約120倍存在，其中該環糊精包含相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約6倍之羥丙基β-環糊精，其中該傳染性病毒包含複製缺陷型腺病毒，且進一步包含相對量(w/w)為胺丁三醇的量的約一倍之NODA，其中該病毒係以約1 x 1011 個病毒顆粒/毫升組合物之量存在。
在另一個態樣中，本發明之特徵係一種保持傳染性病毒之傳染力水平之方法。在一些實施例中，該方法包括在將如本文所述態樣中任一態樣之組合物以液體、非冷凍狀態或以冷凍狀態在約-60℃或約-20℃下儲存約3個月、6個月、9個月、12個月、15個月、18個月、21個月、24個月或更長時間。在一些實施例中，病毒顆粒保留初始總病毒顆粒濃度之至少約70%、80%、90%或95%，及/或保留其初始傳染效價之至少約60%、70%、80%、90%或95%。在一些實施例中，傳染效價係測量為標準化及經調整之標準-傳染單位(NAS IU)。
在另一個態樣中，本發明之特徵係一種治療罹患癌症的個體之方法。在一些實施例中，該方法包括對個體投與如本文所述態樣中任一態樣之組合物。在一些實施例中，其中該等病毒顆粒為編碼人類干擾素α-2b之重組腺病毒顆粒。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年3月19日申請之美國臨時專利申請案第62/991,671號之權益，其全部內容係以引用之方式併入本文中。定義
在本申請案中，除本文清楚地另作指明，否則(i)術語「一(a)」可理解為意指「至少一個」；(ii)術語「或」可理解為意指「及/或」；(iii)術語「包含(comprising)」及「包括(including)」可理解為涵蓋逐項列出的組分或步驟，不論單獨或與一或多種另外組分或步驟一起呈現；及(iv)術語「約」及「近似」可理解為允許標準變化，如熟習此項技術者將明瞭；及(v)在提供範圍之處，包括終點。
一 (A) 或一個 (An) ：冠詞「一」及「一個」在本文中用於指一個或超過一個(亦即至少一個)該冠詞的語法對象。舉例來說，「一個要素」意指一個要素或超過一個要素。
投與 ：如本文所用，術語「投與」通常係指投與組合物至個體或系統。一般技術者將知曉在適宜情況下可用於投與個體例如人類之多種途徑。例如，在一些實施例中，投與可為眼、口腔、非經腸或局部。非經腸途徑之實例包括但不限於膀胱內、腹腔內、羊膜內、動脈內、關節內、膽道內、支氣管內、黏液囊內、心內、軟骨內、尾內、陰莖海綿體內、腔內、腦內、腦池內、角膜內、冠內、冠狀動脈內、體內、顱內、真皮內、椎間盤內、導管內、十二指腸內、硬膜內、表皮內、食道內、胃內、齒齦內、迴腸內、病灶內、管腔內、淋巴管內、髓內、腦膜內、肌肉內、眼內、卵巢內、心包內、腹膜內、肋膜內、前列腺內、肺內、眼內、竇內、脊柱內、滑膜內、腱內、睾丸內、鞘內、胸腔內、小管內、鼓室內、子宮內、血管內、靜脈內(例如推注或滴注)、室內及皮下。在一些實施例中，投與包括膀胱內投與。在一些實施例中，投與可涉及間歇給藥(例如在時間上分開的複數個劑量)及/或週期性(例如間隔一段共同時間期之個別劑量)給藥。在一些實施例中，投與可涉及連續給藥(例如灌注)至少一段選定時間期。
大致 或約： 如本文所用，術語「大致」或「約」應用於一或多個所關注的值時係指類似於規定參考值之值。在某些實施例中，術語「大致」或「約」係指落入在規定參考值之任一方向(大於或小於)上25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小內的值之範圍，除非另有說明或另外從本文可明顯看出(此數字將超過可能值的100%之情況除外)。
癌症 ：術語「癌症」、「惡性疾病」、「贅瘤(neoplasm)」、「腫瘤(tumor)」及「癌」在本文中用於指展現相對異常、不受控制及/或自主生長之細胞，因此其展現以細胞增殖之控制顯著損失為特徵之異常生長表型。在一些實施例中，腫瘤可為或包括為癌前(例如良性)、惡性、轉移前、轉移性及/或非轉移性之細胞。本發明具體而言識別其教示可能特別相關之某些癌症。在一些實施例中，癌症可以實體瘤為特徵。在一些實施例中，癌症可以血液性腫瘤為特徵。一般而言，此項技術中已知的不同類型之癌症之實例包括例如造血癌，包括白血病、淋巴瘤(霍奇金氏(Hodgkin’s)及非霍奇金氏)、骨髓瘤及骨髓增生性疾病；實體組織之肉瘤、黑色素瘤、腺瘤及癌；口腔、喉部、喉頭及肺之鱗狀細胞癌；肝癌；泌尿生殖器癌症，諸如前列腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、子宮癌、子宮內膜癌或腎細胞癌；骨癌；胰臟癌；皮膚癌；皮膚或眼內黑色素瘤；內分泌系統癌；甲狀腺癌；副甲狀腺癌；頭頸癌；乳癌；胃腸道癌症；神經系統癌症；及良性病灶，諸如乳頭瘤。在一些實施例中，癌症包括或為膀胱癌，例如高惡性度非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)。在一些實施例中，癌症包括或為原位癌(CIS)及/或高惡性度乳頭狀疾病。在一些實施例中，癌症包括或為Ta或T1膀胱癌。在一些實施例中，癌症包括或為卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin) (BCG)抗性癌。
醫藥組合物 ：如本文所用，術語「醫藥組合物」係指其中活性劑經與一或多種醫藥上可接受之載劑一起調配之組合物。在一些實施例中，活性劑係以適於治療方案中之投與之單位劑量量存在，該治療方案顯示在投與相關群體時達成預定治療效應之統計學上顯著的概率。可將醫藥組合物特別調配為以固體或液體形式投與，包括適於以下之彼等：經口投與，例如灌劑(drenches) (水性或非水性溶液或懸浮液)、錠劑(例如靶向口頰、舌下及全身性吸收)、大丸劑(boluses)、粉末、顆粒、用於施用至舌頭之膏劑；非經腸投與，例如藉由膀胱內、皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射，諸如例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放型調配物；局部施用，例如，呈霜劑、軟膏或控制釋放型貼劑或噴霧，施用至皮膚、肺或口腔；經陰道內或經直腸內，例如呈子宮托、霜劑或泡沫；經舌下；經眼；經皮；或經鼻、肺、及至其他黏膜表面。在某些實施例中，醫藥組合物係調配成用於膀胱內滴注之懸浮液(例如無菌懸浮液)。在一些實施例中，醫藥組合物意欲且適於投與人類個體。
醫藥上可接受之載劑： 如本文所用，術語「醫藥上可接受之載劑」意指醫藥上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑包封材料，其參與自一個器官或身體之一部分攜載或轉運標題化合物至另一器官或身體之一部分。各載劑在與調配物之其他成分相容且對患者無害之意義上必須係「可接受」。可用作醫藥上可接受之載劑之材料之一些實例包括：糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、红花子油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如丙三醇、山梨糖醇、甘露醇及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝液，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液(Ringer’s solution)；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯及/或聚酸酐；及用於醫藥調配物中之其他非毒性相容性物質。
個體 ：如本文所用，術語「個體」係指生物體，例如哺乳動物(例如人類、非人類的哺乳動物、非人類的靈長類動物、靈長類動物、實驗室動物、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、貓或狗)。在一些實施例中，人類個體為成年、青少年或兒童個體。在一些實施例中，個體係罹患疾病、疾患或病症，例如可如本文所提供進行治療的疾病、疾患或病症，例如本文列出的癌症或腫瘤(例如膀胱癌或腫瘤，例如高惡性度非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC))。在一些實施例中，個體易感疾病、疾患或病症。在一些實施例中，易感個體傾向於發展及/或顯示發展疾病、疾患或病症之風險增加(與在參考個體或群體中所觀測到的平均風險相比)。在一些實施例中，個體已診斷患有一或多種疾病、疾患或病症。在一些實施例中，個體展現疾病、疾患或病症之一或多種症狀。在一些實施例中，個體沒有展現疾病、疾患或病症之特定症狀(例如疾病之臨床表現症狀)或特性。在一些實施例中，個體沒有展現疾病、疾患或病症之任何症狀或特性。在一些實施例中，個體為患者。在一些實施例中，個體為對其及/或已對其投與診斷及/或療法之個體。在一些實施例中，個體正在接受或已接受某種療法以診斷及/或治療疾病、疾患或病症。
治療 ：如本文所用，術語「治療(treatment)」 (亦稱「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指部分或完全緩解、改善、重生、抑制特定疾病、疾患及/或病症之一或多種症狀、特徵及/或原因，延遲其發作，降低其嚴重度及/或降低其發生率之療法之任何投與。在一些實施例中，此種治療可針對沒有展現相關疾病、疾患及/或病症之徵兆之個體及/或僅展現疾病、疾患及/或病症之早期徵兆之個體。替代地或另外地，此種治療可針對展現有關疾病、疾患及/或病症之一或多種確定徵兆之個體。在一些實施例中，治療可針對已診斷為罹患相關疾病、疾患及/或病症之個體。在一些實施例中，治療可針對已知具有與發展相關疾病、疾患及/或病症之風險增加統計學上相關之一或多種易感因素之個體。
本發明部分地基於在不冷凍及/或不以冷凍狀態儲存下保持病毒傳染力之方式之發現。該發現使用作為保護病毒之試劑之環糊精(一種環狀寡糖)及可例如對溫度變化反應而改變pH之液體儲存緩衝液。在無意受理論約束下，咸信在更大鹼性pH下，緩衝液影響環糊精內部腔內的電荷，從而促進病毒蛋白衣多肽結合至內部。當與環糊精內部結合時，病毒在物理上免受低溫之損傷作用。在更大酸性pH下，緩衝液具有相反作用，使得病毒蛋白衣多肽不再結合至環糊精之內部腔，從而促進自環糊精釋放病毒。此系統因此使得能夠進行pH依賴性轉換，使得可將病毒負載至環糊精內部以在儲存期間進行保護，且然後可於隨後自環糊精釋放病毒。
在一些實施例中，對個體投與病毒負載環糊精導致pH依賴性轉換，從而自環糊精釋放病毒顆粒。在一些實施例中，pH可在投與個體之前例如由醫師、藥劑師或其他健康照護提供者調整，使得在投與個體之前自環糊精釋放病毒顆粒。
在一些實施例中，本文描述的系統使用對溫度變化反應而改變pH之緩衝液。例如，在較低溫度下，緩衝液保持較鹼性，促進病毒蛋白衣多肽結合至環糊精之內部。在較高溫度下，緩衝液變得較酸性，促進自環糊精釋放病毒。本文描述的系統可用於例如儲存液體病毒懸浮液以冷而非冷凍液體(例如在約-20℃)，且然後在投與個體之前，可將懸浮液升溫(例如至室溫)，而自環糊精釋放病毒。
如本文中所論述，發現本發明之溫度反應型病毒儲存系統在儲存於液體懸浮液中至少一整年時維持病毒傳染力。本發明因此至少部分地提供以非冷凍液體儲存病毒之長期保存方法。本發明之儲存系統可有效用於多種醫學上有用之病毒，包括例如傳染性腺病毒、慢病毒及腺相關病毒、由此類病毒製成的病毒疫苗，及此類病毒之重組形式，其中該病毒係以液體形式儲存但仍保持高百分比之其原始傳染力。系統組分
本發明之溫度反應型系統可包含環糊精、緩衝液、Tris及各種其他組分。環糊精
環糊精係已知環狀寡糖家族，由α-1,4糖苷鍵接合之葡萄糖亞單元之大環組成。環糊精係由澱粉經酶轉化製得。如目前已知，環糊精由A Villiers於1891年首次描述時被稱為「木粉（cellulosine）」。之後不久，F. Schardinger識別三種天然存在之環糊精-α、-β及-γ。此等化合物因此稱為Schardinger糖。在1911年至1935年的25年間，德國的Pringsheim係此領域的領先研究者，證實環糊精與許多其他化學品形成穩定水性複合物。環糊精具有甜甜圈狀結構，及甜甜圈內部孔或腔可容納或封裝其他化合物。因此，已實施廣泛工作來探索藉由環糊精及其衍生物用於工業及藥理學應用之封裝。先前技術教示，在用於複合之製程中，「捏合」製程係最佳製程之一。然而，值得注意的是本發明之系統不需要此。
環糊精由1-＞4連接之5個或更多個α-D-吡喃葡萄糖苷單位組成，如直鏈澱粉(澱粉之片段)一般。典型環糊精在環中包含在六個至八個單位範圍內之許多葡萄糖單體，建立圓錐形，其中β (貝塔)-環糊精包含7個葡萄糖亞單元。最大的目前已知、明確表徵之環糊精包含32個1,4-脫水葡萄吡喃糖苷單元，而作為表徵不充分之混合物，亦已知至少150員環狀寡糖。在一些實施例中，環糊精為羥丙基β-環糊精(例如CAS登記號128446-35-5)。
由於疏水性內部及親水性外部，環糊精與疏水性化合物形成複合物。美國FDA一般識別α-、β-及γ-環糊精均係安全。其已應用於遞送多種藥物，包括氫皮質酮(hydrocortisone)、前列腺素、硝酸甘油、伊曲康唑(itraconazol)、氯黴素。環糊精賦予此等藥物溶解性及穩定性。環糊精與疏水性分子之包含物(inclusion compound)能夠穿透人體組織，此等可在特定條件下用於釋放生物活性化合物。
與環糊精之此等各種已知用途對比，吾人系統包括環糊精之全新用途：保護傳染性病毒免於被更大鹼性pH儲存緩衝液還原直至緩衝液升溫，從而增加緩衝液pH。由於緩衝溶液之pH變化，此導致病毒-環糊精複合物之受控降解，從而導致環糊精與病毒蛋白衣多肽間之氫或離子鍵結之損失。在無意受理論約束下，此系統可在儲存期間將病毒隔離於環糊精之內部內，且在使調配物升溫時，例如在投與患者之前，自環糊精複合物釋放病毒。
在一些實施例中，一個病毒顆粒可具有結合至其之許多環糊精分子。例如，病毒之表面上的一或多種病毒刺突包膜體(peplomer)可各自結合至一或多個環糊精分子。為確保有足夠的環糊精分子來保護病毒顆粒，本文描述的系統之一些較佳實施例包括比病毒顆粒多得多的環糊精分子，例如約1 x 109 至約1 x 1012 (例如約1 x 109 、約1 x 1010 、約1 x 1011 或約1 x 1012 )個環糊精分子/病毒顆粒。 緩衝液
本發明之系統包括類似於McIlvaine緩衝液之緩衝溶液。McIlvaine緩衝液係由檸檬酸及磷酸氫二鈉組成之緩衝溶液，亦稱為檸檬酸-磷酸鹽緩衝液。其係由美國農藝師(來自West Virginia University的Theodore Clinton McIlvaine)於1921年發明。其可藉由混合兩種儲備溶液製備成pH 2.2至8。當與甘油混合1:1時，McIlvaine緩衝液可用於製備水溶性固定介質。儘管製備McIlvaine緩衝液需要磷酸二鈉及檸檬酸，但用於本發明之系統之緩衝液改用磷酸一鈉(二水合物)替代磷酸二鈉。
磷酸一鈉(二水合物)亦稱為磷酸二氫鈉脫水物(CAS登錄號：13472-35-0)、磷酸一鈉脫水物及磷酸二氫一鈉脫水物。其通常用作用於軟化水之乳化劑、增稠劑，及用作有效防銹溶液。在本發明之系統中，磷酸一鈉(二水合物)在包含作為緩衝液之一部分時可控制pH。
檸檬酸係一種弱有機酸，其具有化學式C6 H8 O7 。其天然存在於柑橘類水果中。在生物化學中，其為檸檬酸循環中之中間物，其在所有好氧生物之代謝中產生。其廣泛地用作酸化劑、抗氧化劑、矯味劑及螯合劑。術語「檸檬酸鹽」在本文中如其在此項技術中習知上使用用於表示檸檬酸之衍生物，亦即在溶液中發現之鹽、酯及多原子陰離子。例如，一種示例性檸檬酸鹽為檸檬酸三鈉；檸檬酸酯為檸檬酸三乙酯。當為鹽之一部分時，檸檬酸根離子之式子書寫為C6 H5 O3- 7 或C3 H5 O(COO)3- 3 。在一些實施例中，本發明之系統包含檸檬酸單水合物。
可例如藉由將0.2莫耳磷酸一鈉(二水合物)溶解於水中，且添加足以製成一公升之量之水來製備磷酸二鈉之一公升0.2M儲備溶液。可例如藉由將0.1莫耳(19.21 g)檸檬酸溶解於水中，且添加足以製成一公升之量之水來製備檸檬酸之一公升0.1M儲備溶液。在一些實施例中，磷酸一鈉(二水合物)及檸檬酸係以約1.7:約0.01之比率使用。在一些實施例中，磷酸一鈉(二水合物)及檸檬酸係以約1.5:約0.01至約2.0:約0.01之比率使用。
本文描述的緩衝液亦可包含檸檬酸鈉二水合物。檸檬酸鈉脫水物係作為乳化劑用於食品中，且亦作為抗凝劑以防止捐贈的血液在儲存中凝結。在一些實施例中，包括檸檬酸鈉脫水物且與檸檬酸搭配用作pH調節劑。
本文描述的緩衝液亦可包含氯化鎂。氯化鎂可指具有式MgCl2 之化學化合物或其各種水合物MgCl2 (H2 O) x 。可自鹽水或海水萃取水合氯化鎂。一些氯化鎂係藉由海水之太陽能蒸發製得。在一些實施例中，氯化鎂為MgCl六水合物。氯化鎂係已知且可購買獲得的(例如USP，CAS登錄號7791-18-6)。 Tris
本發明之系統包括Tris以賦予溫度依賴性pH移位性質。Tris(亦稱為參(羥基甲基)胺基甲烷、胺丁三醇或THAM)為具有式(HOCH2 )3 CNH2 之有機化合物。其包含一級胺且因此會發生與典型胺結合之反應，例如與醛之縮合。在醫學上，偶爾使用胺丁三醇作為藥物，在特定情況下給予深層照護(intensive care)以治療嚴重代謝性酸中毒。一些藥物經調配成胺丁三醇鹽。此等包括欣母沛(hemabate) (呈胺丁三醇鹽之卡前列素(carboprost))及酮洛酸胺基丁三醇(ketorolac trometamol)。在本發明之系統中，Tris緩衝液導致pH例如在投與個體之前隨著調配物自較低溫度改變溫度至較高溫度(例如係自冷藏移出且升溫(例如至室溫或體溫))而降低。在一些實施例中，pH變化為例如當溫度自5攝氏度增加至25攝氏度時約0.03單位pH/攝氏度之平均值。
在一些實施例中，溫度依賴性pH移位性質係基於Tris與磷酸鈉之比率。在一些實施例中，本發明之系統包括約0.5至約2莫耳Tris/莫耳磷酸鈉(例如約1至約1.5莫耳Tris/莫耳磷酸鈉，例如約1莫耳Tris/莫耳磷酸鈉、約1.25莫耳Tris/莫耳磷酸鈉或約1.5莫耳Tris/莫耳磷酸鈉)之Tris與磷酸鈉之莫耳比率。 另外組分
在一些實施例中，本發明之系統包括聚山梨醇酯80(吐溫(Tween) 80)。聚山梨醇酯80係通常用於食品、化妝品及疫苗懸浮液中以確保病毒規則分佈於緩衝液中之非離子表面活性劑及乳化劑。此合成化合物為黏性、水溶性黃色液體。聚山梨醇酯80係用於穩定用於非經腸投與之藥物之水性調配物之賦形劑，且作為乳化劑用於製備流行的抗心律不整藥物胺碘酮。其亦作為賦形劑用於一些歐洲及加拿大流感疫苗中。市售流感疫苗例如包含2.5 µg聚山梨醇酯80/劑量。其亦用於結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )於Middlebrook 7H9肉湯中之培養中。其亦作為乳化劑用於雌激素調節藥物Estrasorb中，及用於製粒以穩定藥物及賦形劑同時進行IPA(異丙醇)結合。
在一些實施例中，本發明之系統包括一或多種此項技術已知之冷凍保護劑。在一些實施例中，若期望及/或需要，則包含冷凍保護劑允許病毒懸浮液進行冷凍。冷凍保護劑之一個實例為甘油。亦稱為丙三醇，其為簡單多元醇化合物。其係無色、無味、黏性液體，其味甜且無毒。甘油主鏈係於稱為甘油酯的彼等脂質中發現。由於具有抗微生物及抗病毒性質，故其廣泛地用於FDA批准的傷口及燒傷治療。其亦可用作測定肝臟疾病之有效標記。其亦廣泛地用作食品工業中之甜味劑及醫藥調配物中之保濕劑。由於存在三個羥基基團，故甘油可與水混溶且本質上具有吸濕性。
在一些實施例中，本發明之系統包括蔗糖(葡萄糖(common sugar))作為冷凍保護劑。其係二糖，一種由兩種單糖組成之分子：葡萄糖及果糖。蔗糖係在植物中天然產生，自其精煉食糖(table sugar)。其具有分子式C12 H22 O11 。
在一些實施例中，本發明之系統包括類固醇樣菲衍生物(3α,5β,7α,12α)-N-[3-[(4-O-D-半乳糖吡喃糖基-D-葡糖醯基)胺基]丙基]-3,7,12-三羥基-N-[3-[[(3α,5β,7α,12α)-3,7,12-三羥基-24-側氧基膽烷-24-基]胺基]丙基]-膽烷-24-醯胺(CAS登錄號2127497-44-5)，亦通常稱為NODA (參見例如WO 2017/180344；WO 2005/058368；US 6,392,069)。已知NODA有助於黏多糖塗層之病毒穿透。因此，在將病毒投與黏多糖塗覆身體部位之一些實施例中，包括NODA。示例性溫度反應型病毒儲存系統
在一些實施例中，本發明之儲存系統包含包括以下組分之初始調配物，其中各組分之量表示為Tris (胺丁三醇)重量之百分比(w/w)：約5,000%至約7,000%甘油；約900%至約1,300%蔗糖；約100%胺丁三醇；約75%至約125%磷酸二氫鈉脫水物；約500%至約700%羥丙基β-環糊精；約10%至約30% MgCl六水合物；0%至約100% NODA；約20%至約50%聚山梨醇酯80；約1%至約4%檸檬酸鈉脫水物；及約0.5%至約2%檸檬酸單水合物。在一些實施例中，本發明之儲存系統包含一份初始調配物及約7、8、9、10、11或12份水。
在一些實施例中，本發明之儲存系統包含包括以下組分之初始調配物，其中各組分之量表示為Tris (胺丁三醇)重量之百分比(w/w)：約4,500%、約5,000%、約5,500%、約6,000%、約6,500%、約7,000%或約7,500%甘油；約800%、約900%、約1,000%、約1,100%、約1,200%、約1,300%或約1,400%蔗糖；約100%胺丁三醇；約65%、約75%、約85%、約95%、約100%、約105%、約115%或約125%磷酸二氫鈉脫水物；約400%、約500%、約550%、約575%、約580%、約590%、約600%、約700%或約800%羥丙基β-環糊精；約5%、約10%、約15%、約0%、約21%、約22%、約25%、約30%、約35%或約40% MgCl六水合物；0%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約100% NODA；約10%、約20%、約30%、約35%、約40%、約50%或約60%聚山梨醇酯80；約0.5%、約1%、約2%、約3%、約4%或約5%檸檬酸鈉脫水物；及約0.25%、約0.5%、約1%、約1.5%、約2%或約2.5%檸檬酸單水合物。在一些實施例中，本發明之儲存系統包含一份初始調配物及約7、8、9、10、11或12份水。
在一些實施例中，本發明之儲存系統包含包括以下組分之初始調配物，其中各組分之量表示為Tris (胺丁三醇)重量之百分比(w/w)：約6,000%甘油；約1,200%蔗糖；約100%胺丁三醇；約100%磷酸二氫鈉脫水物；約600%羥丙基β-環糊精；約20% MgCl六水合物；0% NODA；約35%聚山梨醇酯80；約3%檸檬酸鈉脫水物；及約0.75%檸檬酸單水合物。在一些實施例中，本發明之儲存系統包含一份初始調配物及約7、8、9、10、11或12份水。
在一些實施例中，本發明之儲存系統包含包括以下組分之初始調配物，其中各組分之量表示為Tris (胺丁三醇)重量之百分比(w/w)：約4,000%甘油；約700%蔗糖；約100%胺丁三醇；約150%磷酸二氫鈉脫水物；約400%羥丙基β-環糊精；約60% MgCl六水合物；約75% NODA；約90%聚山梨醇酯80；約6%檸檬酸鈉脫水物；及約3%檸檬酸單水合物。在一些實施例中，本發明之儲存系統包含一份初始調配物及約7、8、9、10、11或12份水。
在一些實施例中，本發明之儲存系統包含包括以下組分之初始調配物，其中各組分之量表示為Tris (胺丁三醇)重量之百分比(w/w)：約6,000%甘油；約1,200%蔗糖；約100%胺丁三醇；約100%磷酸二氫鈉脫水物；約590%羥丙基β-環糊精；約21% MgCl六水合物；約71% NODA；約36%聚山梨醇酯80；約3%檸檬酸鈉脫水物；及約1%檸檬酸單水合物。在一些實施例中，本發明之儲存系統包含一份初始調配物及約7、8、9、10、11或12份水。
在一些實施例中，本發明之儲存系統包含包括以下組分之初始調配物，其中各組分之量表示為Tris (胺丁三醇)重量之百分比(w/w)：約92%磷酸鈉、約100% Tris、約11%氯化鎂、約1,180%蔗糖、約5,900%甘油。在一些實施例中，本發明之儲存系統包含一份初始調配物及約7、8、9、10、11或12份水。
在一些實施例中，例如隨著溫度自5攝氏度增加至25攝氏度，本發明之系統展現約0.03單位pH/攝氏度之pH移位。病毒
本發明之系統可包括任何類型之病毒，例如病毒載體，例如用於基因療法之病毒載體。已開發用於將基因轉移至哺乳動物細胞中之許多以病毒為主之系統。病毒載體之實例包括但不限於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、慢病毒、痘病毒、單純皰疹1病毒、皰疹病毒、癌病毒(例如鼠科白血病病毒)及類似者。一般而言，適宜載體包含在至少一種生物中起作用之複製起點、啟動子序列、方便之限制性核酸酶內切位點及一或多種可篩選標記(例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
逆轉錄病毒係屬於病毒家族逆轉錄病毒科之包膜病毒。一旦在宿主細胞中，該病毒藉由使用病毒逆轉錄酶酵素將其RNA轉錄為DNA進行複製。逆轉錄病毒DNA作為宿主基因組之一部分複製，且稱為原病毒。可使用此項技術中已知的技術將轉基因插入至載體中且包裝於逆轉錄病毒顆粒中。可然後分離重組病毒且體內或離體遞送至個體之細胞。許多逆轉錄病毒系統係此項技術中已知的，例如參見美國專利第5,994,136號、第6,165,782號及第6,428,953號。
逆轉錄病毒包括α逆轉錄病毒屬(例如禽類白血病病毒)、β逆轉錄病毒屬(例如小鼠乳腺腫瘤病毒)；δ逆轉錄病毒屬(例如牛白血病病毒及人類T-淋巴細胞病毒)、ε逆轉錄病毒屬(例如白眼魚經皮肉瘤病毒(Walleye dermal sarcoma virus))及慢病毒屬。
在一些實施例中，逆轉錄病毒為慢病毒，一種逆轉錄病毒科之病毒屬，其特徵係長培養期。慢病毒於逆轉錄病毒當中的獨特之處在於能夠感染非分裂細胞；其可遞送大量遺傳資訊至宿主細胞之DNA中，因此其為基因遞送載體中之最有效方法之一。慢病毒載體相對於其他病毒載體之優點在於其可轉導非增殖細胞且顯示低免疫原性。在一些實例中，慢病毒包括但不限於人類免疫缺陷病毒(HIV-1及HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(S1V)、貓類免疫缺陷病毒(FIV)、馬類感染貧血(EIA)及綿羊髓鞘脫落病毒(visna virus)。衍生自慢病毒之載體提供達成體內顯著水平之基因轉移之手段。
在實施例中，載體為腺病毒載體。腺病毒為包含雙股DNA之一大類病毒。其複製宿主細胞之DNA，同時使用宿主的細胞機制以合成病毒RNA、DNA及蛋白質。此項技術中已知腺病毒可影響複製及非複製細胞兩者，以容納大型轉基因，且編碼蛋白質而不整合至宿主細胞基因組中。
在一些實施例中，病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。AAV系統係此項技術中一般熟知的(參見例如Kelleher及Vos，Biotechniques，17(6):1110-17 (1994)；Cotten等人，P.N.A.S. U.S.A.，89(13):6094-98 (1992)；Curiel, Nat Immun，13(2-3):141-64 (1994)；Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol，158:97-129 (1992)；及Asokan A等人，Mol. Ther.，20(4):699-708 (2012))。用於產生及使用重組AAV (rAAV)載體之方法描述於例如美國專利第5,139,941號及第4,797,368號中。已表徵幾種AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3 (例如AAV3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及AAV11、以及其變體。轉基因
本發明之系統可包括本文描述的病毒，其包括或編碼所關注的任何轉基因。在一些實施例中，病毒包括或編碼1型及/或2型干擾素，包括其刪除、插入或取代變體、生物活性片段及對偶基因形式。1型干擾素包括干擾素-α、-β、-ε、-κ、-ω、-δ、-ζ及-τ及其亞型，而2型干擾素稱為干擾素-γ (參見例如Lee等人，Front. Immunol. 9:2061 (2018))。特定干擾素-α包括人類干擾素α亞型，包括但不限於α-1 (GenBank登錄號NP 076918)、α-1b (GenBank登錄號AAL35223)、α-2、α-2a (GenBank登錄號NP000596)、α-2b (GenBank登錄號AAP20099)、α-4 (GenBank登錄號NP066546)、α-4b (GenBank登錄號CAA26701)、α-5 (GenBank登錄號NP 002160及CAA26702)、α-6 (GenBank登錄號CAA26704)、α-7 (GenBank登錄號NP 066401及CAA 26706)、α-8 (GenBank登錄號NP002161及CAA 26903)、α-10 (GenBank登錄號NP 002162)、α-13 (GenBank登錄號NP 008831及CAA 53538)、α-14 (GenBank登錄號NP 002163及CAA 26705)、α-16 (GenBank登錄號NP 002164及CAA 26703)、α-17 (GenBank登錄號NP 067091)、α-21 (GenBank登錄號P01568及NP002166)及如美國專利第5,541,293號；美國專利第4,897,471號；及美國專利第4,695,629號中所述的複合干擾素；及如描述於美國專利第4,414,150號中之混合干擾素。干擾素-γ描述於例如EP 77,670A及EP 146,354A、及GenBank登錄號NP 002168中。本發明之特定組合物包含描述於美國專利第6,835,557號中之編碼干擾素-α之重組腺病毒載體，例如具有或不具有信號序列。在一些實施例中，非複製重組腺病毒載體包含或為5型非複製腺病毒載體。在一些實施例中，非複製重組腺病毒載體為描述於例如美國專利第6,210,939號中之重組腺病毒載體。在一些實施例中，重組腺病毒載體編碼至少一種IFN α-2 (例如IFN α-2a或IFN α-2b中之一者或兩者)。在某些實施例中，重組腺病毒載體編碼人類IFN α-2b。病毒顆粒之儲存
本發明之系統可用於儲存包括病毒顆粒(例如病毒載體顆粒)之調配物。在一些實施例中，病毒載體(例如腺病毒載體，例如編碼干擾素α-2b之腺病毒載體)係使用本發明之系統調配且經歷儲存條件，例如冷凍或非冷凍(例如在約-60℃，在約-20℃下，在約-15℃下，在約-10℃下，在約-5℃下，在約0℃下，在約4℃下，或在約8℃下)儲存約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、14個月、16個月、18個月、20個月、22個月、24個月、28個月、32個月、36個月、48個月或更長時間。在一些實施例中，在此種儲存條件下儲存之後，相對於對照，病毒載體保持高水平之傳染力。例如，在此種儲存條件下儲存之後，相對於對照傳染力水平(例如在此種儲存條件下儲存之前的此種病毒載體之傳染力水平或在此種儲存條件期間在先前時間的此種病毒載體之傳染力水平)，病毒載體證實至少約50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更高之傳染力水平。在一些實施例中，在此種儲存條件下儲存之後，相對於對照傳染力水平(例如在此種儲存條件下儲存之前的此種病毒載體之傳染力水平或在此種儲存條件期間在先前時間的此種病毒載體之傳染力水平)，病毒載體證實降低不大於約40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或更低之傳染力水平。
在一些實施例中，病毒載體(例如腺病毒載體，例如編碼干擾素α-2b之腺病毒載體)係使用本發明之系統調配且經歷儲存條件，例如冷凍或非冷凍(例如在約-60℃，在約-20℃，在約-15℃，在約-10℃，在約-5℃，在約0℃，在約4℃，或在約8℃)儲存約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、14個月、16個月、18個月、20個月、22個月、24個月、28個月、32個月、36個月、48個月或更長時間。在一些實施例中，在此種儲存條件下儲存之後，相對於對照，調配物維持高水平之總病毒顆粒濃度。例如，在此種儲存條件下儲存之後，相對於對照之總病毒顆粒濃度水平(例如在此種儲存條件下儲存之前的總病毒顆粒濃度水平，或在此種儲存條件期間在前期的總病毒顆粒濃度水平)，總病毒顆粒濃度水平為至少約70%、80%、85%、90%、95%或更高。在一些實施例中，在此種儲存條件下儲存之後，相對於對照總病毒顆粒濃度水平(例如在此種儲存條件下儲存之前的總病毒顆粒濃度水平，或在此種儲存條件期間在前期的總病毒顆粒濃度水平)，總病毒顆粒濃度水平降低不大於約30%、25%、20%、15%、10%、5%或更低。
用於測定病毒顆粒濃度及傳染力之方法及分析係此項技術中已知的。參見例如Nyberg-Hoffman等人，Nat. Med. 3:808-11 (1997)；Barde等人，Curr. Protoc. Neurosci. 53:4.21.1-4.21.23 (2010)；Pankaj，Mater. Methods 3:207 (2013)；WO2017/048599。在一些實施例中，在測定病毒顆粒濃度或傳染力之前，將在本文描述的儲存條件下儲存的病毒載體之樣品置於室溫(例如維持在室溫下約15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時或更長時間)。如此項技術中已知，傳染力水平可表示為例如NAS IU (經標準化及調整之標準-傳染單位)/mL。組合物及投與
本文描述的系統(例如包含本文描述的系統組分及病毒載體之組合物)可調配成醫藥組合物。此種醫藥組合物可適用於例如預防及/或治療疾病，例如癌症(例如膀胱癌)。在一些實施例中，醫藥組合物可調配成包括醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
在一些實施例中，本文描述的組合物可根據習知醫藥實務調配成注射用無菌調配物。在一些實施例中，本文描述的組合物係用於膀胱內滴注之無菌懸浮液調配物。
在一些實施例中，本文描述的醫藥組合物實質上不含污染物(例如宿主細胞(例如HEK293細胞)之組分(例如DNA及蛋白質)及/或血清(例如胎牛血清))。在一些實施例中，本文描述的醫藥組合物包含痕量之污染物(例如宿主細胞(例如HEK293細胞)之組分(例如DNA及蛋白質)及/或血清(例如胎牛血清))。在一些實施例中，本文描述的醫藥組合物實質上不含防腐劑。
任何特定形式之選擇或使用可部分取決於所欲投與模式及治療應用。例如，意欲用於全身性或局部遞送之組合物可呈可注射或可輸注之溶液之形式。因此，組合物可經調配以藉由非經腸模式(例如靜脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射)投與。如本文所用，非經腸投與係指除腸內及局部投與以外的投與模式，通常藉由注射，且包括但不限於膀胱內、靜脈內、鼻內、眼內、肺、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、肺內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外、腦內、顱內、頸動脈內及胸骨內注射及輸注。投與可為全身或局部。投與途徑可為非經腸，例如藉由膀胱內滴注或注射投與。在一些實施例中，膀胱內投與可藉助於裝置諸如導管來達成。
如本文所論述，本文描述的系統可與病毒載體調配以在本文描述的儲存條件下儲存。在一些實施例中，將組合物冷凍儲存且在投與於個體之前在室溫(例如約20℃至約25℃)下解凍直至為液體。在一些實施例中，將組合物非冷凍儲存且在投與於個體之前升溫至室溫(例如約20℃至約25℃)。在一些實施例中，在投與給個體之前，將組合物升溫至室溫，且維持在室溫約15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時或更長時間。
本文描述的醫藥組合物可用於治療個體。本文描述的組合物可用於例如治療或預防癌症(例如癌症，例如癌或其他實體或血液性癌、癌症轉移)。如本文所用，術語「癌症」意欲包括所有類型之癌性生長或致癌過程、轉移組織或惡性轉化細胞、組織或器官，而與組織病理學類型或侵襲階段無關。本文揭示的方法及組合物特別用於治療或減少與癌症相關之轉移性病灶之尺寸、數量或生長速率。
癌症之實例包括但不限於實體腫瘤、軟組織腫瘤、造血腫瘤及轉移性病灶。實體腫瘤之實例包括惡性疾病，例如各種器官系統之肉瘤、腺癌及癌，諸如影響頭部及頸部(包括咽)、甲狀腺、肺(小細胞或非小細胞肺癌)、乳房、淋巴、胃腸道(例如口腔、食道、胃、肝臟、胰臟、小腸、結腸及直腸、肛管)、生殖器及泌尿生殖道(例如腎、尿路上皮、膀胱、卵巢、子宮、子宮頸、子宮內膜、前列腺、睾丸)、CNS (例如神經或神經膠質細胞，例如神經母細胞瘤(neorublastoma)或神經膠質瘤)、皮膚(例如黑色素瘤)之彼等。可治療的造血癌症之實例包括肝血管瘤、多發性骨髓瘤、淋巴瘤及白血病及骨髓增生異常。本文揭示的方法及組合物特別用於治療例如減少或延遲與前面提及的癌症相關之轉移性病灶。在一些實施例中，個體將經歷組織之手術移除、化學療法或其他抗癌療法中之一者或多者及主要或唯一標靶將係轉移性病灶，例如在骨骼或淋巴結或肺或肝臟或腹膜腔或CNS或其他器官中之轉移。
熟習此項技術者將明瞭，自細胞培養分析及動物研究獲得的資料可用於調配用於人類之劑量範圍。本文描述的組合物之適宜劑量一般位於包括ED50 而幾乎沒有或沒有毒性之組合物之循環濃度範圍內。劑量可在此範圍內變化，視所採用的劑型及所利用的投與途徑而定。對於本文描述的組合物，治療有效劑量可最初自細胞培養分析估計。劑量可在動物模型中加以調配以達成包括如在細胞培養中測得的IC50 之循環血漿濃度範圍。此資訊可用於更準確地確定人類之有用的劑量。血漿中之濃度可例如藉由高效液相層析測定。在一些實施例中，例如在需要局部投與(例如投與膀胱組織)之情況下，可使用細胞培養或動物模型化以確定在局部部位內達成治療有效濃度所需的劑量。
本文提及的所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻係以全文引用之方式併入本文中。另外，材料、方法及實例僅係例示性而無意為限制性。除非另外定義，否則本文使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬技術中之一般技術者通常所理解相同的含義。儘管類似或等效於彼等本文所述者之方法及材料可用於本發明之實踐或測試，但本文描述適宜方法及材料。
藉由以下實例進一步說明本發明。該等實例係僅出於說明目的而提供。其不應以任何方式解釋為限制本發明之範疇或內容。實例
實例 1 提供各成分之重量之示例性範圍，其中各組分之量表示為用於製備組合物之Tris (胺丁三醇)重量之百分比。
實例1配方
成分 量(w/w)
甘油 5,000至7,000%
蔗糖 900至1,300%
胺丁三醇 100%
磷酸二氫鈉二水合物 75至125%
羥丙基β-環糊精 500至700%
MgCl六水合物 10至30%
NODA 0至100%
聚山梨醇酯80 20至50%
檸檬酸鈉二水合物 1至4%
檸檬酸單水合物 0.5至2%
將一份(w/w)此物質與約10份(w/w)純水組合以製備最終緩衝液。然後，將此緩衝液用於懸浮傳染性病毒。病毒於緩衝液中之密度取決於病毒之最終醫學用途。疫苗及其他可注射之產品將需要更濃製劑(較少體積之緩衝液對病毒)。用於例如膀胱滴注或胸腔灌溉之灌溉產品可使用更稀製劑，例如約1 x 1010 至約1 x 1013 個病毒顆粒/mL緩衝液。在此實例中，使用4 x 1016 個慢病毒顆粒/mL。
實例 2 ：一個示例性緩衝液在此顯示為實例2，其中各組分之量表示為用於製備該組合物之Tris (胺丁三醇)重量之百分比。
實例2配方
成分 量(w/w)
甘油 6,000%
蔗糖 1,200%
胺丁三醇 100%
磷酸二氫鈉二水合物 100%
羥丙基β-環糊精 600%
氯化鎂六水合物 20%
NODA 0%
聚山梨醇酯80 (吐溫80) 35%
檸檬酸鈉二水合物 3%
檸檬酸單水合物 0.75%
將一份(w/w)此物質與九份(w/w)純水組合以製備最終緩衝液。然後將此緩衝液用於以約1 x 1011 個腺相關病毒顆粒/mL緩衝液之濃度懸浮傳染性病毒。
實例 3 ：另一個示例性緩衝液在此顯示為實例3，其中各組分之量表示為用於製備該組合物之Tris (胺丁三醇)重量之百分比。
實例3配方
成分 量(w/w)
甘油 4,000%
蔗糖 700%
胺丁三醇 100%
磷酸二氫鈉二水合物 150%
羥丙基β-環糊精 400%
氯化鎂六水合物 60%
NODA 75%
聚山梨醇酯80 90%
檸檬酸鈉二水合物 6%
檸檬酸單水合物 3%
將一份(w/w)此物質與九份(w/w)純水組合以製備最終緩衝液。然後將此緩衝液用於以約3 x 1011 個腺病毒顆粒/mL緩衝液之濃度懸浮傳染性病毒。
實例 4 ：另一個示例性緩衝液在此顯示為實例4，其中各組分之量表示為用於製備該組合物之Tris (胺丁三醇)重量之百分比。
實例4配方
成分 量(w/w)
甘油 6,000%
蔗糖 1,200%
胺丁三醇 100%
磷酸二氫鈉二水合物 100%
羥丙基β-環糊精 590%
氯化鎂六水合物 21%
NODA 71%
聚山梨醇酯80 (吐溫80) 36%
檸檬酸鈉二水合物 3%
檸檬酸單水合物 1%
將一份(w/w)此物質與九份(w/w)純水組合以製備最終緩衝液。然後將此緩衝液用於以約3 x 1011 個腺病毒顆粒/mL緩衝液之濃度懸浮傳染性病毒。
吾人已測試吾人緩衝液且發現其甚至在懸浮的病毒以非冷凍液體儲存時仍保留病毒之傳染力，且如此做保留傳染力至少整整一年。
實例 5 ：傳染力分析方案
吾人使用螢光活化細胞分選儀(FACS)來檢測病毒樣品之傳染力。
對於病毒，吾人使用複製缺陷型5型重組腺病毒(rAd)。該分析原理係HEK293細胞以30、60及90個病毒顆粒(vp)/細胞(ppc)之rAd感染15分鐘且讓其產生病毒48小時。HEK293細胞包含互補功能且因此可使複製缺陷型病毒複製。培養後，感染的細胞經固定且用抗腺病毒六鄰體結構蛋白之FITC偶聯抗體染色。可然後用流式細胞儀定量已積聚於感染的細胞內的六鄰體。作為分析傳染力之第二方式，吾人使用帶有針對干擾素之基因之rAd (rAd-IFN)。此基因之表現使吾人能夠測定干擾素活性(病毒傳染力之一代表)。
使用無菌技術在層流櫥(laminar flow hood)中進行固定細胞之所有細胞工作及程序以將對操作者之生物危害風險最小化。固定後，在通風櫃中進行細胞計數儀分析之前的其餘程序。
將對照樣品rAd調配成10.9 mM磷酸鈉、14 mM Tris鹼、2 mM氯化鎂、2% (w/v)蔗糖、10% (w/v)甘油之最終調配緩衝液，其在室溫下提供8.1之略微鹼性pH。吾人使用5.4 x 1011 vp/ml之病毒顆粒濃度。
作為參考標準，吾人使用由Merck Sharpe & Dohme，Switzerland製造的經純化之rAd病毒。參考標準品具有1.4 x 1012 vp/ml之病毒顆粒濃度、在吾人測試開始時之1.37 x 1011 NAS IU/ml之傳染力(「NAS IU」為經標準化且調整之標準品-傳染單位)及251 Iu/ml之效價。
可使用6孔板或96孔板進行rAd製程開發樣品之傳染力分析，端視待分析的樣品之數量而定。結果報告為針對於參考標準品之相對滴度，且使用對照樣品監測分析性能。基於6孔板分析，可分析三個測試樣品(TS)、參考標準品(RS)及對照樣品(CS)。在96孔板上，可分析15個測試樣品。若需要進行不同樣品之傳染力之比較，則應在相同分析中分析樣品。
吾人標準分析由20個孔三個整板及第四個板上的兩個孔組成。為了進行分析，吾人首先製備具有7.4 x 105 個細胞/ml之細胞懸浮液。如此，吾人將計算量之預熱生長培養基吸移至無菌容器。然後吾人藉由在將計算量之懸浮液轉移至具有生長培養基之容器之前顛倒至少10次將細胞懸浮液輕輕但徹底地混合。然後吾人藉由用PIPETBOY®向上及向下吸移至少10次將銷售接種懸浮液(seeding sell suspension)徹底地混合。然後吾人在6孔板上接種1 ml/孔，更換介於板之間的吸移管尖端，且搖動該等板以使細胞懸浮液均勻地分散於孔中。然後吾人將接種的板轉移至37℃，5% CO2 培養箱22 ±4小時。
該工作在LFH中進行直至固定細胞且此後在通風櫥中進行。離心後，吾人將始終留下少量上清液；此一小步驟在固定之前尤其重要，因為細胞在其被吸清過於乾燥之情況下會很容易聚集。吾人然後將板自培養箱移出，註明移出的日期及時間。吾人然後在顯微鏡下檢查細胞且記錄附著程度及匯合度。使用無菌玻璃巴斯德(Pasteur)吸移管及真空泵，吾人然後自所有樣品孔吸清培養基。吾人然後添加0.5 ml TrypLE™ express且隨著吾人移至下一個樣品而留在細胞上。吾人更換介於樣品之間的巴斯德玻璃。
吾人然後在室溫(「RT」)下培養該等細胞直至細胞分離(此偶爾耗費超過3分鐘)。吾人然後在顯微鏡下檢查到細胞已分離，因為至關重要的是所有細胞在此刻已分離。吾人然後以添加TrypLE™之相同順序添加2 ml預溫熱的生長培養基至各孔。吾人然後小心地向上及向下吸移以確保所有細胞處於懸浮。吾人然後將細胞自各管轉移至Falcon管且離心該等管。吾人然後自各管吸清培養基，留下約50至100 µl上清液。
吾人然後將細胞再懸浮於剩餘上清液中。吾人然後添加1 ml冰冷丙酮:甲醇以固定細胞且使得其成為可滲透，藉由輕輕地向上及向下吸移進行混合。極其重要的是細胞在此刻處於單細胞懸浮。吾人然後在4℃下培養樣品15至60分鐘。吾人然後添加在PBS中之1 ml 1% BSA至各管。吾人然後離心，接著自各管吸清上清液而留下約50至100 µl上清液。
吾人然後將細胞再懸浮於剩餘上清液中。吾人然後添加70 µl單株抗體至各管，且在4℃下用抗體染色細胞15分鐘。對於吾人腺病毒實驗，吾人使用對腺病毒六鄰體蛋白衣多肽具有特異性之抗體。對於另一種病毒，可當然使用對該種病毒具有特異性之抗體；病毒及抗體之特定選擇對於所主張發明而言並不重要。
吾人使用CANTO II™品牌螢光活化細胞分選儀以計數包含螢光抗體標籤化多肽之細胞。在分析之前打開螢光活化細胞分選儀且首先運行CST珠作為性能檢查。在運行第一樣品期間，吾人移動P1閘使得其覆蓋主要細胞群體。吾人希望資料收集設置應使各96孔板在各P1閘中產生約10,000個事件，且各管在各P1閘中產生約50,000個事件。
實例 6 ：非冷凍液體緩衝液保持傳染力至少一年。吾人製備病毒在實例4之緩衝液中之懸浮液，將該懸浮液在-20 C下儲存超過一年，且定期測定病毒顆粒濃度。在-20 C下，該緩衝液由於其中所包含的各種鹽及賦形劑而保持液態(未冷凍)。吾人實驗資料顯示，總病毒顆粒濃度在整整一年之過程中降低，但可忽略。此外且更重要的是，所儲存的病毒之傳染效價在三個月後有點下降，但然後穩定且此後保持相當高(以初始傳染效價之百分比)至少整整一年。
實例6 在-20℃儲存下之總病毒顆粒及傳染性病毒顆粒與時間(運行代碼#5)
時間(月) 總病毒顆粒濃度 與T=0之差異% 傳染效價(NAS IU/ml) 與T=0之差異%
0 3.1E+11 vp/ml1) 0% 3.7E+10 0%
3 3.0E+11 vp/ml1) -3% 3.1E+10 -16%
6 2.8E+11 vp/ml4) -10% 2.8E+10 -24%
9 2.9E+11 vp/ml8) -6% 3.0E+10 -19%
12 3.0E+11 vp/ml8) -3% 3.1E+106) -16%
備註： 使用陰離子交換層析測定總病毒顆粒濃度。使用螢光活化細胞分選測定傳染效價。 1)使用校正因子0.862。使用校正因子係因為尚未實施工作標準品(WS)濃度之改變。結果係可相比擬。 4)改變工作標準品2濃度且因此不再需要使用0.862之校正因子來校正總病毒顆粒濃度結果。結果係可相比擬。 6)使用那多拉金非拉維克(nadofaragene firadenovec)藥物產品作為參考標準品(RS)。 8)提高偏差以涵蓋使用再冷凍之樣品進行時間點9M及12M總病毒顆粒濃度(AEX-HPLC)之分析。時間點12M結果被認為是有效，因為使用原始玻璃小瓶進行3次分析及2次再冷凍之小瓶給出極相似結果(RSD% 3%)。時間點9M及12M結果被認為是有效，因為結果處於如針對使用儲存在-20℃下的原始小瓶進行的先前時間點分析(0M至6M)所觀測到的相同水平。
吾人溫度反應型緩衝系統在一年內達成顯著穩定性指示吾人緩衝液系統將在液體狀態下保持傳染力以進行18個月、24個月及更長時間之儲存。
實例 7 ：吾人重複實例6之方案。彼等資料再次顯示在12個月之儲存後病毒顆粒濃度及傳染效價兩者之穩定性。
實例7 在-20℃儲存下之總病毒顆粒及傳染性病毒顆粒與時間(運行代碼#6)
   時間(月) 總病毒顆粒濃度 與T=0之差異% 傳染效價(NAS IU/ml) 與T=0之差異%
0 3.2E+11 vp/ml1)    3.4E+10   
3 3.0E+11 vp/ml1) -6% 3.1E+10 -9%
6 3.1E+11 vp/ml4) -3% 3.1E+10 -9%
9 2.8E+11  vp/ml8) -13% 3.1E+10 -9%
12 3.1E+11 vp/ml -3% 2.7E+106) -21%
關於備註，參見以上實例6。
實例 8 ：吾人重複實例6之方案。彼等資料再次顯示在儲存12個月時病毒顆粒濃度及傳染效價兩者之顯著穩定性。
實例8 在-20℃儲存下之總病毒顆粒及傳染性病毒顆粒與時間(運行代碼#7)
時間(月) 總病毒顆粒濃度 與T=0之差異% 傳染效價(NAS IU/ml) 與T=0之差異%
0 2.9E+11 vp/ml1)    3.6E+10   
3 2.6E+11 vp/ml1) -10% 3.0E+10 -17%
6 2.7E+11 vp/ ml6) -7% 2.9E+10 -19%
9 2.8E+11 vp/ml -3% 2.9E+10 -19%
12 2.9E+11 vp/ml 0% 3.1E+106) -14%
  
實例 9 ：吾人重複實例6之方案。彼等資料再次顯示在12個月之儲存後病毒顆粒濃度及傳染效價兩者之穩定性。
實例9 在-20℃儲存下之總病毒顆粒及傳染性病毒顆粒與時間(運行代碼#8)
時間(月) 總病毒顆粒濃度 與T=0之差異% 傳染效價(NAS IU/ml) 與T=0之差異%
0 3.1E+11 vp/ml1)    3.7E+10   
3 3.0E+11 vp/ml1) -3% 3.1E+10 -16%
6 2.8E+11 vp/ml4) -10% 2.8E+10 -24%
9 2.9E+11 vp/ml8) -6% 3.0E+10 -19%
12 3.0E+11 vp/ml8) -3% 3.1E+106) -16%
  
實例 10 ：使用實例1之製劑，重複實例6之方案。彼等資料再次顯示在12個月之儲存後病毒顆粒濃度及傳染效價兩者之穩定性。
實例10 在-20℃儲存下之總病毒顆粒及傳染性病毒顆粒與時間
時間(月) 總病毒顆粒濃度 與T=0之差異% 傳染效價(NAS IU/ml) 與T=0之差異%
0            
3    -5%    -17%
6    -5%    -17%
9    -5%    -17%
12    -5%    -17%
  
等效物
應瞭解，儘管已結合本發明之實施方式描述本發明，但前述描述意欲說明而非限制由隨附申請專利範圍之範疇限定之本發明之範疇。其他態樣、優點及修改在隨後申請專利範圍之範疇內。

Claims (32)

  1. 一種組合物，其包含傳染性病毒顆粒、胺丁三醇(tromethamine)及環糊精，其中該組合物包含約1 x 109 至約1 x 1012 個環糊精分子/病毒顆粒。
  2. 一種組合物，其包含傳染性病毒顆粒、環糊精、胺丁三醇及磷酸鈉，其中該組合物包含約1至約1.5莫耳胺丁三醇/莫耳磷酸鈉。
  3. 如請求項2之組合物，其中該組合物包含約1 x 109 至約1 x 1012 個環糊精分子/病毒顆粒。
  4. 如請求項1至3中任一項之組合物，其進一步包含冷凍保護有效量之甘油、蔗糖或兩者。
  5. 如請求項4之組合物，其中該組合物包含胺丁三醇的量約600倍相對量(w/w)之甘油，及該組合物包含胺丁三醇的量約120倍相對量(w/w)之蔗糖。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中該環糊精為羥丙基β-環糊精。
  7. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中該組合物包含胺丁三醇的量約6倍相對量(w/w)之羥丙基β-環糊精。
  8. 如請求項1至6中任一項之組合物，其進一步包含胺丁三醇的量約0.7倍相對量(w/w)之(3α,5β,7α,12α)-N-[3-[(4-O-D-半乳糖吡喃糖基-D-葡糖醯基(gluconoyl))胺基]丙基]-3,7,12-三羥基-N-[3-[[(3α,5β,7α,12α)-3,7,12-三羥基-24側氧基膽烷-24-基]胺基]丙基]-膽烷-24-醯胺(NODA)。
  9. 如請求項2至8中任一項之組合物，其中該磷酸鈉為磷酸二氫鈉二水合物。
  10. 如請求項1至9中任一項之組合物，其進一步包含氯化鎂、聚山梨醇酯80、檸檬酸鈉及檸檬酸。
  11. 如請求項1至10中任一項之組合物，其中該病毒係以約1 x 1011 個病毒顆粒/毫升組合物之量存在。
  12. 如請求項1至11中任一項之組合物，其中該組合物在第一溫度下具有第一pH，及在第二溫度下具有第二pH，其中該第一溫度係低於該第二溫度，及該第一pH係高於該第二pH。
  13. 如請求項12之組合物，其中該第一溫度為約-20℃，及該第一pH為鹼性pH。
  14. 如請求項12或13之組合物，其中該第二溫度為約20℃至約25℃，及該第二pH為酸性pH。
  15. 如請求項1至14中任一項之組合物，其中在-20℃下以非冷凍液體或以冷凍狀態儲存約一年之後，該等病毒顆粒保留至少約95%之初始總病毒顆粒濃度及至少約80%之初始傳染效價(infectious titer)，以經標準化及調整之標準品 - 傳染單位(NAS IU)測得。
  16. 如請求項1至15中任一項之組合物，其中該傳染性病毒為慢病毒、腺病毒或腺相關病毒。
  17. 如請求項1至16中任一項之組合物，其中該傳染性病毒為複製缺陷型腺病毒。
  18. 一種組合物，其包含磷酸二氫鈉脫水物、胺丁三醇、甘油、蔗糖、羥丙基β-環糊精、NODA及傳染性複製缺陷型腺病毒，其中該組合物包含： 約1至約1.5莫耳胺丁三醇/莫耳磷酸二氫鈉脫水物相對量之胺丁三醇； 胺丁三醇的量約600倍相對量(w/w)之甘油； 胺丁三醇的量約120倍相對量(w/w)之蔗糖； 胺丁三醇的量約6倍相對量(w/w)之羥丙基β-環糊精； 胺丁三醇的量約0.7倍相對量(w/w)之NODA；及 約1 x 1011 個複製缺陷型腺病毒顆粒/毫升組合物。
  19. 一種組合物，其包含傳染性病毒顆粒、胺丁三醇及環糊精，該環糊精係以約1 x 109 至約1 x 1012 個環糊精分子/病毒顆粒之相對量存在，該胺丁三醇能夠對溫度改變反應而改變pH，該胺丁三醇的存在量使得若該組合物以液體、非冷凍狀態或以冷凍狀態在-20℃下儲存一年，則病毒顆粒保留至少約95%之初始總病毒顆粒濃度及至少約80%之初始傳染效價，以NAS IU測得。
  20. 如請求項19之組合物，其進一步包含以約1至約1.5莫耳胺丁三醇/莫耳磷酸鈉相對量存在之磷酸鈉。
  21. 如請求項20之組合物，該磷酸鈉為磷酸二氫鈉脫水物。
  22. 如請求項19至21中任一項之組合物，其進一步包含冷凍保護有效量之甘油、蔗糖或兩者。
  23. 如請求項22之組合物，其中該組合物包含胺丁三醇的量約600倍相對量(w/w)之甘油，及該組合物包含胺丁三醇的量約120倍相對量(w/w)之蔗糖。
  24. 如請求項19至25中任一項之組合物，其中該環糊精為羥丙基β-環糊精。
  25. 如請求項24之組合物，其中該組合物包含胺丁三醇的量約6倍相對量(w/w)之羥丙基β-環糊精。
  26. 如請求項19至25中任一項之組合物，其中該傳染性病毒為慢病毒、腺病毒或腺相關病毒。
  27. 如請求項19至26中任一項之組合物，其中該傳染性病毒為複製缺陷型腺病毒。
  28. 如請求項19至27中任一項之組合物，其進一步包含胺丁三醇的量約0.7倍相對量(w/w)之NODA，且其中該病毒係以約1 x 1011 個病毒顆粒/毫升組合物之量存在。
  29. 如請求項19之組合物，其進一步包含以約1至約1.5莫耳胺丁三醇/莫耳磷酸二氫鈉脫水物相對量存在之磷酸二氫鈉脫水物，且進一步包含甘油及蔗糖，該甘油係以胺丁三醇的量約600倍相對量(w/w)存在，及該蔗糖係以胺丁三醇的量約120倍相對量(w/w)存在，其中該環糊精包含胺丁三醇的量約6倍相對量(w/w)之羥丙基β-環糊精，其中該傳染性病毒包含複製缺陷型腺病毒，且進一步包含胺丁三醇的量約一倍相對量(w/w)之NODA，其中該病毒係以約1 x 1011 個病毒顆粒/毫升組合物之量存在。
  30. 一種保持傳染性病毒之傳染力水平之方法，該方法包括將如請求項1至29中任一項之組合物以液體、非冷凍狀態或冷凍狀態在-20℃下儲存至少一年。
  31. 如請求項30之方法，其中該等病毒顆粒保留至少約95%之初始總病毒顆粒濃度及至少約80%之初始傳染效價，以NAS IU測得。
  32. 一種治療罹患癌症個體之方法，該方法包括對該個體投與如請求項1至29中任一項之組合物，其中該等病毒顆粒為編碼人類干擾素α-2b之重組腺病毒顆粒。
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