BR112020012717A2 - proteínas de fusão - Google Patents

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Carmela De Santo
Steven Lee
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Abstract

São fornecidas proteínas de ligação ao alvo de fusão que compreendem uma fração de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina. O domínio pode ser um domínio enzimático, como um domínio enzimático da argininosuccinato sintase (ASS-1) ou um domínio enzimático da ornitina transcarbamilase (OTC). Também são fornecidas células que compreendem essa proteína de ligação ao alvo de fusão (por exemplo, células que expressam a proteína de ligação ao alvo de fusão) e ácidos nucleicos que codificam essas proteínas de ligação ao alvo de fusão. A invenção também fornece proteínas de ligação ao alvo de fusão compreendendo uma fração de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano. São divulgadas composições farmacêuticas, usos médicos e métodos de tratamento, todos utilizando proteínas, células ou ácidos nucleicos de ligação ao alvo de fusão. As proteínas, células, ácidos nucleicos e composições farmacêuticas podem ser usadas na prevenção e/ou tratamento de câncer, como neuroblastoma ou leucemia mieloide aguda.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “PROTEÍNAS DE FUSÃO”
CAMPO DE INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a proteínas de ligação ao alvo de fusão, e de células compreendendo tais proteínas. Também se refere a ácidos nucleicos que codificam proteínas de ligação ao alvo de fusão. A invenção se refere a composições farmacêuticas, utilizações médicas, e métodos de tratamento, todos utilizando as proteínas de ligação ao alvo de fusão, células, ou ácidos nucleicos descritos.
FUNDAMENTOS
[002] Proteínas de fusão com capacidades de ligação ao alvo têm sido utilizadas em diversas aplicações terapêuticas. Mais notavelmente, células T projetadas para expressar receptores de antígeno quiméricos (CARs) têm sido usadas no tratamento de câncer. No entanto, como discutido mais abaixo, apesar de mostrar uma promessa clínica considerável, esses tratamentos não foram universalmente eficazes.
Falha de CAR-T em estudos pré-clínicos e clínicos
[003] Apesar dos avanços na quimioterapia citotóxica para câncer adulto e pediátrico, é claro que vários subtipos de câncer importantes ainda têm um prognóstico extremamente ruim. As terapias imunológicas fornecem uma abordagem alternativa para atingir diretamente as células cancerígenas malignas e evitam os efeitos colaterais tóxicos para as células normais das abordagens padrão.
[004] As células T de Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) (CAR-T) são células T autólogas derivadas do paciente que foram manipuladas, tipicamente com um fragmento de anticorpo (scFv), para reconhecer especificamente antígenos de superfície em células tumorais. A prova de funcionamento do uso de células CAR-T para o tratamento bem-sucedido de câncer pediátrico foi estabelecida em pacientes com leucemia linfoblástica aguda B pediátrica quimiorresistente e reincidente, submetidos a remissões rápidas e sustentadas usando células CAR-T anti-CD19. Nos tumores sólidos de neuroblastoma, o câncer sólido mais comum da infância, tem sido o modelo de escolha e mostrou-se altamente informativo na resposta de tumores sólidos à terapia celular com CAR-T.
Estudos pré-clínicos indicam que as células T CAR que reconhecem o antígeno disialogangliosídeo 2 (GD2) podem representar uma nova maneira poderosa de matar células de neuroblastoma. Embora o neuroblastoma tenha se tornado o paradigma para o desenvolvimento de células CAR-T contra tumores sólidos, apenas uma eficácia antitumoral limitada foi observada em modelos pré-clínicos e em ensaios de fase inicial. As células CAR-T anti-GD2 de primeira geração não persistiram in vivo e tiveram efeitos antitumorais mínimos.
As células CAR-T anti-GD2 de segunda geração (com domínios coestimuladores CD28 ou 4-1BB) apresentaram persistência melhorada in vivo, levando a regressões tumorais moderadas, mas ficaram funcionalmente esgotadas na presença de neuroblastoma. Em humanos, um estudo de células T CAR anti- GD2 fez a observação principal de que, apesar da infusão de um grande número dessas células, os números de células T CAR tornam-se baixos ou indetectáveis em semanas e que a maioria dos pacientes com doença ativa não alcançou uma remissão completa. É importante ressaltar que os pacientes que tiveram persistência de baixo nível das células T CAR tiveram uma sobrevida mais longa. Esses achados sugerem que o microambiente local e sistêmico do tumor prejudica a persistência das células CAR-T, apesar da presença de grande carga antigênica alvo nos tumores residuais de neuroblastoma.
[005] A terapia com células CAR-T também foi testada contra um número limitado de outros tumores sólidos in vitro, in vivo e no homem. Em cada caso, os resultados contra essas neoplasias falharam em replicar os dados empolgantes encontrados para as células CAR-T anti-CD19 em ALL.
Leucemia mieloide aguda
[006] Leucemia mieloide aguda, é a leucemia aguda mais comum em adultos e a segunda leucemia mais comum na infância.
A incidência aumenta com a idade e, para pacientes com alto risco ou doença reincidente, o prognóstico é extremamente ruim com sobrevida <12 meses em adultos, apesar do transplante de células-tronco hematopoiéticas.
Para pacientes idosos ou com comorbidades coexistentes, os esquemas quimioterapêuticos padrão são pouco tolerados, levando a um tratamento subótimo e uma incapacidade de cura.
Poucos novos medicamentos eficazes foram desenvolvidos para a LMA, pois esses imunoterapêuticos oferecem o potencial de uma abordagem diferente.
O CD33 é quase universalmente expresso em blastos de LMA e provou ser um alvo eficaz para terapêuticas baseadas em imunotoxinas (gemtuzumabe ozogamicina). As células CAR-T anti-CD33 são citotóxicas para blastos de LMA in vitro e erradicam a carga leucêmica in vivo.
Com base nisso, foi iniciado um estudo clínico de
Fase I de células T CAR anti-CD33 na China (NCT01864902 e
NCT02958397). Relatos de um paciente com LMA quimiorrefratária mostraram uma redução nos blastos da LMA da medula óssea.
Esses resultados fornecem uma prova de princípio de que as células T CAR anti-CD33 podem ser eficazes.
Contudo, a doença reincidiu 9 semanas após a infusão de CAR, apesar das células CAR-T mensuráveis permanecerem no sangue e na medula óssea.
A descoberta sugere que as células CAR-T foram desativadas pelo microambiente da leucemia (nenhuma evidência de perda de CD33 nos blastos de LMA como mecanismo de escape).
Mesotelioma, câncer de ovário e pancreático
[007] O mesotelioma, um tumor relacionado ao amianto com prognóstico quase universalmente ruim em adultos, expressa a glicoproteína mesotelina da superfície celular.
A mesotelina também é expressa em cânceres epiteliais, como ovário, adenocarcinoma de pulmão e câncer de pâncreas. A mesotelina demonstrou ser um alvo eficaz e seletivo para imunoterapia passiva com imunotoxinas como SS1P, levando à sua escolha para o desenvolvimento em tecnologias CAR T.
Nos modelos murinos, as células CAR-T anti-mesotelina demonstram atividade antitumoral clara e persistente. As células CAR-T anti-mesotelina também foram administradas a pacientes com esses tumores e, embora respostas limitadas tenham sido detectadas (PR, SD) em cada caso, os tumores progrediram. A persistência das células CAR-T foi extremamente baixa, com as células se tornando indetectáveis em apenas alguns dias após a administração inicial ou repetida. Mesmo quando as células CAR-T são colocadas dentro do tumor e, portanto, próximas ao antígeno alvo, as respostas permanecem silenciadas, sugerindo um forte microambiente imunossupressor que reduz a função das células T.
Glioblastoma
[008] O glioblastoma é um dos tumores cerebrais mais devastadores de adultos e crianças, com pacientes frequentemente apresentando uma rápida progressão da doença e falha no tratamento, apesar dos regimes intensivos de quimioterapia e radioterapia. Os glioblastomas expressam uma variante do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico-EGFRvIII, fornecendo um antígeno específico do tumor que pode ser direcionado por imunoterapia. O EGFRvIII também pode ser expresso em aproximadamente um terço dos cânceres colorretais avançados. Células CAR-T Anti- EGFRvIIII demonstraram controle da doença dos glioblastomas em xenoenxertos de murino ortotópicos. No entanto, em todos os casos, os tumores continuam a crescer, levando à morte de murinos, apesar dos níveis detectáveis de células CAR-T em todos os órgãos, incluindo o cérebro. Novamente, esses dados sugerem que as células CAR-T são inativadas pelo microambiente do tumor. Um estudo de fase I com base nessa lógica está atualmente em andamento (NCT02844062, NCT02664363).
Arginina e o microambiente imunossupressor
[009] A arginina é um aminoácido semi-essencial, exigido por tecidos saudáveis para vários processos celulares, incluindo viabilidade celular, proliferação e síntese de proteínas. Os níveis de arginina no corpo inteiro são mantidos principalmente pela ingestão alimentar e, em menor grau, pela síntese de precursores no "eixo intestinal-renal". No nível celular, a arginina é importada do fluido extracelular via família de transportadores de Aminoácidos Catiônicos (CAT; SLC7A) e entra no ciclo da uréia. Em condições de alta demanda, como inflamação, gravidez e câncer, os níveis de arginina podem ficar limitados no microambiente local do tecido e sistemicamente. Alguns tecidos e células podem se proteger ressintetizando a arginina de precursores, através da expressão da Arginino-Succinato Sintase (ASS1) e Ornitina- Transcarbamilase (OTC). As células que não têm expressão de pelo menos uma dessas enzimas dependem da importação de arginina extracelular, um estado conhecido como auxotrofismo da arginina.
[0010] Estudos anteriores sugeriram que a inibição da arginase no local do tumor pode ser benéfica no tratamento de problemas de baixa atividade das células T CAR in vivo.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[0011] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece uma proteína de fusão de ligação ao alvo compreendendo uma porção de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina. Por uma questão de brevidade, as proteínas de ligação ao alvo de fusão, de acordo com os vários aspectos e modalidades da invenção, serão referidas aqui como "proteínas da invenção".
[0012] Em um segundo aspecto, a invenção fornece uma célula compreendendo uma proteína de fusão de ligação ao alvo compreendendo uma porção de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina. A célula pode expressar a proteína de fusão de ligação ao alvo.
[0013] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de ligação ao alvo compreendendo uma porção de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina. Será apreciado que os ácidos nucleicos, de acordo com o terceiro aspecto da invenção, podem ser expressos para produzir uma proteína de fusão de ligação ao alvo de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou uma célula de acordo com o segundo aspecto da invenção.
[0014] Em um quarto aspecto, a invenção fornece uma proteína de fusão de ligação ao alvo compreendendo uma porção de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano.
[0015] Em um quinto aspecto, a invenção fornece uma célula compreendendo uma proteína de fusão de ligação ao alvo compreendendo uma fração de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano. A célula pode expressar a proteína de fusão de ligação ao alvo.
[0016] Em um sexto aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de ligação ao alvo compreendendo uma porção de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano. Será apreciado que os ácidos nucleicos, de acordo com o sexto aspecto da invenção, podem ser expressos para produzir uma proteína de fusão de ligação ao alvo de acordo com o quarto aspecto da invenção ou uma célula de acordo com o quinto aspecto da invenção.
[0017] Em um sétimo aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão de ligação ao alvo ou célula de acordo com o primeiro, segundo, quarto ou quinto aspecto da invenção, ou um ácido nucleico de acordo com o terceiro ou sexto aspecto a invenção.
[0018] Em um oitavo aspecto, a invenção fornece uma proteína de fusão de ligação ao alvo, de acordo com o primeiro ou quarto aspecto da invenção, para uso como medicamento.
[0019] Em um nono aspecto, a invenção fornece uma célula, de acordo com o segundo ou quinto aspecto da invenção, para uso como medicamento.
[0020] Em um décimo aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico, de acordo com o terceiro ou sexto aspectos da invenção, para utilização como um medicamento.
[0021] Em um décimo primeiro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica, de acordo com o sétimo aspecto da invenção, para utilização como um medicamento.
[0022] Em um décimo segundo aspecto, a invenção fornece um método de prevenção e/ou tratamento de uma doença em um indivíduo necessitado de tal prevenção e/ou tratamento, o método compreendendo fornecer ao sujeito uma proteína de fusão de ligação ao alvo da invenção. A proteína de fusão de ligação ao alvo pode estar de acordo com o primeiro, quarto ou décimo primeiro aspecto da invenção. A proteína da invenção pode ser fornecida como parte de uma célula da invenção, tal como uma célula dos segundo ou quinto aspectos da invenção.
[0023] Como discutido ainda em outras partes do relatório descritivo, as proteínas de ligação ao alvo de fusão, células, ácidos nucléicos e composições farmacêuticas da invenção podem ser utilizadas na prevenção e/ou tratamento de um ou mais distúrbios selecionados do grupo que consiste em: câncer; infecções, como infecções virais; e doenças auto-imunes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0024] Figura 1. Ilustra a otimização da proteína de fusão de ligação ao alvo contendo títulos virais. O painel A mostra que as concentrações de partículas retrovirais aumentam d ao longo de 72 horas nos sobrenadantes das células AMPHO Phoenix. O painel B mostra que a eficiência da transdução de células T da proteína de ligação ao alvo foi avaliada por detecção de tCD34 por citometria de fluxo.
Não foi observada diferença na eficiência de transdução de PBMCs usando sobrenadantes da linha celular AMPHO.
[0025] Figura 2. Mostra que as enzimas da via da arginina demonstram atividade em células Jurkat transduzidas. O painel A mostra que os construtos de enzimas proteicas podem ser produzidos com um alto grau de pureza, avaliadas medindo a expressão de tCD34 usando citometria de fluxo. O painel B ilustra um aumento na expressão de ASS-1 e OTC nas células transduzidas. O painel C ilustra a capacidade dos domínios que promovem a síntese de arginina ou de um precursor de arginina nas células transduzidas para desempenhar sua função. O painel D mostra os resultados de um estudo do catabolismo celular de ornitina em citrulina (pela OTC). A quantidade de citrulina produzida por células que expressam proteínas de ligação ao alvo de fusão contendo domínios de enzimas OTC (“GD2-OTC”),
ou proteínas de ligação ao alvo de fusão contendo ambos os domínios de enzimas ASS-1 e OTC (“GD2-ASS-OTC”), foi avaliada e comparada com as células que expressam construtos de controle sem um domínio de enzima OTC (‘GD2’), ou proteínas de ligação ao alvo de fusão contendo um domínio de enzima ASS-1 (‘GD2-ASS’). O painel E mostra a persistência de células T de proteína de fusão de ligação ao alvo transduzidas com construtos compreendendo domínios (ASS-1) que promovem a síntese do precursor de arginina, arginino-succinato, em um microambiente de tumor em camundongo. Painel F mostra que células T com proteínas de ligação ao alvo de fusão que compreendem um domínio de OTC (GD2-OTC) mostraram uma persistência significativamente melhorada em comparação com células T sem proteínas de ligação ao alvo de fusão compreendendo o domínio OTC (somente GD2).
[0026] Figura 3. Ilustra que enzimas da via da arginina pode ser transduzidas em PBMC a partir de células de doador humano. O painel A mostra que os construtos enzimáticos de proteínas de ligação ao alvo de fusão podem ser produzidos com um elevado grau de pureza nas PBMC, por medição da expressão de tCD34 utilizando citometria de fluxo. O Painel B mostra um aumento na expressão de ASS-1 e OTC em células transduzidas. O painel C mostra que não foram observadas diferenças na expressão dos receptores co-
inibidores LAG-3, a TIM-3 e DP-1 em células T com proteínas de ligação ao alvo de fusão que também contém os construtos compreendendo um domínio enzimático que promove síntese de arginina ou um precursor de arginina. O painel D mostra a persistência de PBMCs transduzidas com os construtos compreendendo um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina, medido durante uma expansão de 7 dias, conforme detectado pela citometria de fluxo de tCD34.
[0027] Figura 4. Mostra que os domínios das enzimas ASS-1 e OTC conferem uma vantagem metabólica e proliferativa significativa em condições de tumor de baixa arginina. O painel A mostra células T com proteínas de fusão de ligação ao alvo que compreendem o domínio enzimático ASS-1 (GD2-ASS) e domínio enzimático OTC (GD2- OTC) para aumentar o metabolismo de citrulina quando cultivadas em condições de meio de arginina normal e reduzido de 75% de arginina, detectada por ELISA de sobrenadantes da cultura. O painel B ilustra a lise celular específica das linhagens celulares de neuroblastoma e leucemia mieloide por células T que expressam proteínas de ligação ao alvo de fusão da invenção (compreendendo um domínio ASS-1 (“GD2-ASS”) ou um domínio OTC (“GD2-OTC”) como avaliado contra a lise pelas células T que expressam uma proteína controle (‘GD2-BB’ sem ASS-1 ou OTC). O painel
C mostra que as células T com proteína de fusão de ligação ao alvo que compreendem o domínio enzimático ASS-1 ou OTC mostraram um resgate significativo da proliferação em condições de baixa arginina em comparação com o controle (GD2 sem enzima). As condições mostradas no gráfico são: arginina normal (RPMI + 10% FCS), sobrenadantes com baixa arginina derivada de neuroblastoma (Lan-1 TCM) ou meio reduzido de arginina a 75%.
[0028] Figura 5. Mostra que as células T com proteína de fusão de ligação ao alvo modificada têm atividade antitumoral aumentada in vivo e podem ser aplicadas a células T com proteína de fusão de ligação ao alvo não GD2.
O painel A mostra o volume relativo do tumor de camundongos NOG-SCID enxertados com células tumorais GD2 + e administrados com as células T com proteína de fusão de ligação ao alvo compreendendo um domínio ASS-1 (GD2-ASS) e sem (apenas GD2). O crescimento relativo do tumor foi medido ao longo do tempo. O painel B mostra a porcentagem de sobrevivência dos camundongos após a administração de células T com proteínas de ligação ao alvo de fusão de GD2- ASS-1 e GD2 apenas para. O painel C ilustra viabilidade de células T com proteínas de ligação ao alvo de fusão de CD33 e CD33- ASS-1 em meios de condição com 50%-75% de linhagem celular AML (baixos em arginina) ou meio reduzido com 75% de arginina.
[0029] Figura 6. Mostra persistência aumentada de células da invenção em condições de depleção de arginina in vivo. Demonstrado em camundongos NOG-SCID enxertados com 5x106 de células Jurkat CAR-T anti-GD2 (células controle), ou células Jurkat que expressam as proteínas da invenção, compreendendo uma porção alvo GD2 e um domínio ASS-1 (GD2- ASS), ou células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma fração de direcionamento a GD2 e um domínio OTC (GD2-OTC), administrado por via intravenosa. As células CAR-T GD2-ASS-1 e GD2-OTC mostraram persistência significativamente aprimorada em comparação com as células de controle que compreendem o construto GD2 CAR-T não modificado.
[0030] Figura 7. Mostra que as enzimas da via da rginina podem ser transduzidas em PBMCs a partir de doadores humanos compreendendo várias porções de ligação ao alvo. Western blots mostram que a expressão de ASS-1 e OTC é aumentada em células PBMC transduzidas com proteínas da invenção em comparação com um controle (painel A). O painel B mostra expressões de LAG-3, TIM-3 e PD-1 avaliadas por citometria de fluxo.
[0031] Figura 8. Mostra a atividade citocida das células T CAR expressando um domínio alvo CD33 em combinação com um domínio ASS-1, um domínio OTC ou um domínio ASS-1 e OTC, cultivados na presença de células de leucemia K562 em efetor de diferença para alvejar rações por 4 horas. Os grupos que compreendem proteínas da invenção mantêm a atividade citocida.
[0032] Figura 9. Mostra células T CAR que expressam as proteínas da presente invenção que compreendem os anticorpos anti-GD2, anti-CD33, anti-mesotelina, ou anti- porção alvo de EGFRvIII, em combinação tanto com um domínio ASS-1, um domínio de balcão ou um ASS-1 e domínio OTC confere uma vantagem metabólica e proliferativa significativa em condições de tumor de baixa arginina em comparação com células de controle. Células CAR-T não modificadas que compartilham os mesmos domínios de ligação (isto é, anti-GD2, anti-CD33, anti-mesotelina ou anti EGFRvIII), mas sem os domínios enzimáticos, foram usadas como células T CAR de controle que expressam proteínas da invenção.
[0033] Figura 10. Mostra células que expressam as proteínas da invenção que compreende uma porção de ligação ao GD2 em combinação com: um domínio ASS-1, um domínio OTC, ou um ASS-1 e o domínio OTC, cultivadas em meio condicionado do tumor (TCM) conferem vantagem metabólica e proliferativa significativa (painel A). O painel B mostra que as células que expressam as proteínas da invenção, compreendendo uma porção de ligação a CD33, em combinação com: um domínio ASS-1, um domínio OTC, ou um ASS-1 e domínio OTC, cultivadas em meio condicionado do tumor (TCM) também conferem uma vantagem metabólica e proliferativa significativa.
[0034] Figura 11. Mostra células CAR-T que expressam uma proteína da invenção compreendendo um domínio ASS-1 (células CAR-T Anti-CD33-ASS-1) aumentam significativamente a depuração de LMA da medula óssea de camundongos portadores de leucemia. Estes dados referem-se à depuração de células HL-60 de leucemia mieloide aguda (AML) enxertadas em camundongos NOG-SCID.
[0035] Figura 12. O painel A ilustra uma persistência aumentada das células da invenção dentro dos baços de camundongos xenoenxertados com neuroblastoma, tratados com células que expressam uma proteína da invenção compreendendo uma fração de ligação a GD2 e um domínio ASS-
1. Melhor capacidade das células da invenção para proliferar em resposta à estimulação com antígeno é demonstrado no Painel B.
[0036] Figura 13. O painel A ilustra a persistência aumentada das células da invenção dentro dos baços de camundongos xenoenxertados com AML foram tratados com células que expressam uma proteína da invenção compreendendo uma fração de ligação a CD33 e uma de: um domínio ASS-1, um domínio OTC; ou um domínio ASS-1 e um domínio OTC. A capacidade melhorada das células da invenção de proliferar em resposta à estimulação de antígeno é demonstrada no Painel B.
[0037] Figura 14. Estabelece detalhes de construtos, compreendendo ácidos nucleicos da invenção, que foram utilizadas na produção lentiviral bem-sucedida de células da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0038] A presente invenção é baseada no reconhecimento do inventor de que as células que expressam proteínas de ligação ao alvo de fusão que incorporam um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina (e/ou um domínio que promove a síntese de triptofano ou precursor de triptofano) exibem vantagens significativas em vivo. Em particular, os inventores descobriram que as células que expressam essas proteínas são capazes de superar os efeitos imunossupressores associados ao microambiente do tumor, que os inventores acreditam ter contribuído para as falhas de muitas terapias baseadas em CAR do estado da técnica.
[0039] Uma das vantagens particulares exibidas pelas células que expressam proteínas da invenção é sua persistência e proliferação aumentadas no microambiente tumoral. Sabe-se que este microambiente pode reduzir de outro modo dramaticamente a eficácia de células T CAR do estado da técnica.
[0040] Além disso, as células que expressam as proteínas da invenção apresentam uma melhor capacidade para proliferar em condições do microambiente imunossupressor do tumor. A proliferação de células que expressam CARs é geralmente dramaticamente inibida por condições de depleção de arginina.
[0041] Ambas as vantagens permitem tratamentos melhorados, nos quais o número de células que expressam proteínas da invenção é aumentado, e essas células têm residência prolongada no local do tumor, permitindo, assim, a morte intesificada das células cancerígenas. A este respeito, é importante notar que as modificações feitas em relação às proteínas e células da invenção não prejudicam significativamente sua capacidade de matar células cancerígenas (seja por ação citotóxica ou lise celular específica).
[0042] Por conseguinte, será reconhecido que as proteínas e células da invenção fornecem agentes terapêuticos melhorados em comparação com terapias baseadas em CAR do estado da técnica. Os vários aspectos e modalidades da invenção aqui descritos surgem ou contribuem para essas melhorias.
[0043] Para os propósitos de entender a invenção, ela será agora descrita com referência às seguintes definições.
Por uma questão de brevidade, os parágrafos que se seguem podem se referir a modalidades particulares apenas no contexto de proteínas da invenção, mas será apreciado que, exceto para onde o contexto requer de outro modo, modalidades que se referem a ligação com as proteínas da invenção podem ser empregadas em qualquer um dos outros aspectos da invenção aqui descritos.
Proteínas de ligação ao alvo de fusão
[0044] As proteínas de ligação ao alvo de fusão são proteínas de fusão artificiais que permitem conferir uma especificidade desejada às propriedades biológicas desejadas de uma célula pela qual a proteína da invenção é expressa. Por uma questão de brevidade, eles também serão referidos como "proteínas" ou "proteínas da invenção" na presente invenção. Diferentes tipos de células, e as propriedades biológicas desejadas que eles são capazes de fornecer respectivamente no contexto da presente invenção, são discutidos mais adiante em outras partes do relatório descritivo. Tipicamente, no contexto das utilizações médicas de proteínas de ligação ao alvo de fusão e células que expressam tais proteínas, atividade citocida contra as células alvo associadas com uma doença (tais como células de câncer ou células infectadas) confere a utilidade terapêutica necessária.
[0045] As proteínas da invenção compreendem pelo menos uma porção de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina e/ou um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano. Esses termos são definidos em outras partes do presente relatório descritivo. O técnico no assunto apreciará que essas proteínas também podem incorporar vários outros domínios ou regiões opcionais.
a. As diferentes porções da proteína de fusão de ligação ao alvo (porções de ligação ao alvo, regiões de sinalização intracelular e domínios que promovem a síntese de arginina ou um precursor de arginina e/ou domínios que promovem a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano) podem ser derivadas de duas ou mais “fontes” diferentes. Assim, as diferentes porções podem ser derivadas de duas ou mais moléculas que ocorrem naturalmente, como proteínas. Além disso, as diferentes partes podem ser derivadas de diferentes fontes em termos de diferentes reinos ou espécies originários.
[0046] Uma classe de proteínas de ligação ao alvo de fusão de interesse particular no contexto da presente invenção são proteínas quiméricas do receptor de antígeno (CAR). Os CARs utilizam anticorpos, ou seus fragmentos, para conferir especificidade de ligação e regiões de sinalização intracelular para determinar a atividade biológica específica necessária. São conhecidas várias gerações diferentes de CARs, e cada uma dessas gerações diferentes representa um exemplo adequado de uma proteína de fusão de ligação ao alvo da invenção, a menos que o contexto da presente invenção exija o contrário.
[0047] Para evitar dúvidas, as proteínas da invenção também podem ser consideradas como receptores de células T (TCRs) modificados para compreender um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina e/ou um domínio que promove a síntese de triptofano ou precursor de triptofano.. Em tais modalidades, a porção de ligação ao alvo pode ser fornecida pelas cadeias TCR α e TCR β do receptor. Uma vez que a porção de ligação ao alvo e o domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina e/ou um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano são de fontes diferentes, tais TCRs modificados são quiméricos para os fins da presente invenção.
[0048] As proteínas da invenção tipicamente compreendem ainda porções adicionais, incluindo uma ou mais do grupo que consiste em: uma porção transmembranar, uma porção espaçadora de CH2CH3, uma porção de dobradiça de CD8 e uma porção de sinalização de CD8a.
[0049] As sequências de aminoácidos de proteínas exemplificativas da invenção são apresentadas nas SEQ ID NOs: 12 a 23. Será apreciado que uma molécula compreendendo ou consistindo em qualquer uma dessas sequências represente uma proteína de acordo com o primeiro aspecto da invenção.
Qualquer uma das proteínas estabelecidas nas SEQ ID NOs: 12 a 23 pode ser utilizada nos usos médicos, métodos de tratamento ou composições farmacêuticas da invenção.
Os fragmentos ou variantes das sequências das proteínas exemplificativas da invenção
[0050] O relatório descritivo contém um número de sequências exemplificativas de proteínas e ácidos nucleicos. Bem como as proteínas de ligação ao alvo de fusão e os ácidos nucleicos que os codificam, incluem sequências de porções de ligação ao alvo, regiões de sinalização intracelular e domínios enzimáticos.
[0051] Será apreciado que, exceto onde o contexto exigir de outra forma, o escopo da invenção não deve ser limitado às sequências exemplificativas específicas aqui estabelecidas. Em particular, o técnico no assunto reconhecerá que fragmentos ou variantes das sequências exemplificativas ainda podem ser capazes de fornecer a atividade requerida conferida pelas sequências exemplificativas. Tais fragmentos ou variantes adequados das sequências exemplificativas podem ser utilizados nos vários aspectos e modalidades da invenção.
[0052] Por conseguinte, as referências no presente relatório descritivo a sequências exemplificativas de aminoácidos ou ácidos nucleicos devem, exceto onde o contexto exigir de outra forma, ser tomadas como também englobando fragmentos funcionais ou variantes das sequências exemplificativas. Por exemplo, um fragmento adequado pode compreender pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% do comprimento total de uma sequência exemplificativa relevante. De fato, uma variante adequada pode compreender pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de todo o comprimento da sequência exemplificativa.
[0053] Uma variante adequada pode compartilhar pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com uma sequência exemplificativa relevante. De fato, uma variante adequada pode compartilhar pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência exemplificativa relevante.
[0054] Que um fragmento ou variante é "funcional" pode ser avaliado experimentalmente, com referência a ensaios conhecidos dos técnicos no assunto, incluindo aqueles descritos nos Exemplos.
Arginina ou um precursor da arginina
[0055] A presente invenção se refere a fusão de proteínas de ligação ao alvo que compreendem um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina.
[0056] A arginina (frequentemente abreviada para " Arg " ou "R") é um aminoácido semi-essencial. Possui uma massa molecular de 174,2 g/mol-1 e também pode ser referido como ácido 2-amino-5-guanidinopentanóico.
[0057] No contexto da presente invenção, as referências aos precursores da arginina devem ser interpretadas no contexto da via da arginina, a série de reações químicas pelas quais a arginina metabólica é importada, catabolisada ou reciclada. Assim, um precursor da arginina pode, para os presentes fins, ser considerado como abrangendo qualquer composto que seja direta ou indiretamente convertido em arginina.
Um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina
[0058] As proteínas da invenção compreendem um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina. A capacidade de um domínio para cumprir esta função, isto é, promover a síntese de arginina ou um precursor de arginina, pode ser investigada por qualquer meio ou ensaio adequado.
[0059] O técnico no assunto compreenderá que um meio ou ensaio adequado pode ser selecionado com referência ao composto, por exemplo arginina ou um precursor de arginina,
cuja síntese deve ser promovida. Apenas a título de exemplo, ensaios adequados pelos quais a capacidade de um domínio para promover a síntese necessária são descritos mais adiante nos Exemplos, em relação à caracterização de células exemplificativas da invenção.
[0060] Adequadamente, o domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina pode ser um domínio enzimático capaz de promover a síntese de arginina ou um precursor de arginina. Em tal modalidade, o domínio enzimático pode compreender o domínio enzimático completo, ou um fragmento ou uma variante desse domínio, desde que o domínio exiba a atividade necessária.
[0061] Em uma modalidade adequada, o precursor da arginina, cuja síntese é promovida, é arginosuccinato. Em tal modalidade, o domínio que promove essa síntese pode ser selecionado; uma Argino-succinato sintase (domínio ASS-1) da enzima; e Argino-succinato sitetase (domínio argg).
Adequadamente, o domínio que promove essa síntese é um domínio enzimático arginino-succinato sintase (ASS-1).
[0062] Em uma modalidade aceitável, o precursor da arginina, cuja síntese é promovida, é arginosuccinato. A catálise de arginosuccinato, tal como por arginino- succinato liase, produz arginina. Em tal modalidade, o domínio que promove essa síntese pode ser selecionado de; um domínio enzimático arginino-succicinato liase (ASL); e domínio enzimático Arginino-succicinato liase (ArgH).
[0063] Em uma modalidade adequada, o precursor da arginina, cuja síntese é promovida, é a citrulina. Em tal modalidade, o domínio que promove essa síntese pode ser selecionado de; um domínio enzimático de ornitinatranscarbamilase (OTC); descarboxilase de ornitina (ODC1); e um domínio enzimático de ornitina carbamoiltransferase (ArgF). Adequadamente, o domínio que promove essa síntese é um domínio enzimático de ornitina transcarbamilase (OTC).
[0064] Por conseguinte, em uma modalidade adequada, o domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina compreende um domínio enzimático selecionado do grupo que consiste em: um domínio ASS-1; um domínio OTC; um domínio ASL; um domínio OCD1; um domínio ArgG ; um domínio ArgH ; e um domínio ArgF. O domínio pode ser selecionado de um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC.
[0065] Adequadamente, uma proteína de acordo com a invenção pode compreender uma pluralidade de domínios que promovem a síntese de arginina ou um precursor de arginina.
Adequadamente, essa pluralidade pode compreender uma pluralidade de domínios enzimáticos. A pluralidade pode compreender mais de uma cópia de um domínio enzimático individual e/ou uma combinação de múltiplos domínios enzimáticos. Por exemplo, uma proteína de acordo com a invenção pode compreender uma combinação de domínios enzimáticos selecionados a partir do grupo que consiste em: um domínio ASS-1; um domínio OTC; um domínio ASL; um domínio OCD1; um domínio ArgG; um domínio ArgH; e domínio ArgF. Apenas a título de exemplo, uma proteína da invenção pode compreender um domínio ASS-1 e um domínio OTC.
[0066] Um domínio enzimático adequado que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina pode ser um domínio enzimático humano. Em tal modalidade, estes podem ser ASS-1, OTC, ASL ou ODC1.
[0067] Um domínio enzimático adequado que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina pode ser um domínio enzimático de ocorrência natural. Alternativamente, um domínio enzimático adequado que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina pode ser um fragmento ou derivado de um domínio enzimático de ocorrência natural que é capaz de recapitular a atividade sintética do domínio de ocorrência natural. Tal fragmento ou derivado pode ter atividade sintética que é 50%, ou mais, daquela do domínio que ocorre naturalmente; 60% ou mais do domínio que ocorre naturalmente; 70% ou mais do domínio que ocorre naturalmente; 80% ou mais do domínio que ocorre naturalmente; 90% ou mais do domínio que ocorre naturalmente; ou 95%, ou mais, do domínio que ocorre naturalmente. De fato, um fragmento ou derivado adequado pode ter maior atividade sintética do que o domínio que ocorre naturalmente do qual é derivado, ou seja, pode ter 100%, ou mais, da atividade sintética do domínio que ocorre naturalmente.
[0068] Detalhes adicionais de domínios enzimáticos adequados que promovem a síntese de um precursor de arginina para os fins da presente invenção, são apresentados abaixo.
Um domínio enzimático ASS-1
[0069] Um exemplo de um domínio enzimático ASS-1 adequado para incorporação nas proteínas da invenção é apresentado na SEQ ID NO: 1.
[0070] Alternativamente, um fragmento ou derivado da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 pode ser usado como um domínio enzimático ASS-1 adequado para incorporação em uma proteína da invenção.
[0071] Qualquer domínio enzimático que confere atividade de ASS-1 às proteínas da invenção pode ser usado em tal modalidade. A atividade do ASS-1 pode ser avaliada por um ensaio descrito na seção de Exemplos da invenção.
[0072] Um nível adequado de atividade do ASS-1 pode ser equivalente ao conferido pela SEQ ID NO: 1.
Alternativamente, os domínios enzimáticos que conferem níveis mais baixos ou mais altos de atividade do ASS-1 ainda podem ser benéficos.
[0073] Um fragmento adequado do domínio enzimático ASS-1 estabelecido na SEQ ID NO: 1 pode compreender todos, exceto 1 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 1, todos, exceto 2 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 1, todos, exceto 3 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 1, todos, exceto 4 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 1, todos, exceto 5 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 1, todos, exceto 6 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 1, todos, exceto 7 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 1, todos, exceto 8 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos em SEQ ID NO: 1, todos, exceto 9 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 1, ou todos, exceto 10 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 1.
[0074] Apenas a título de exemplo, uma variante adequada da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 pode compartilhar pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou com um fragmento da SEQ ID NO: 1, como definido acima.
Uma variante adequada pode compartilhar pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou um fragmento da mesma; pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma; pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou um fragmento da mesma; pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma; pelo menos 96% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma; pelo menos 97% de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou um fragmento da mesma; pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou um fragmento da mesma; ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma. Para serem adequadas para incorporação nos CARs da invenção, essas variantes devem reter a atividade sintética do ASS-1, como mencionado acima.
[0075] Um domínio enzimático ASS-1 adequado pode fornecer pelo menos 50% da atividade daquela fornecida pelo domínio da SEQ ID NO: 1. De um modo adequado, pode proporcionar pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% da atividade que é proporcionada pelo domínio de SEQ ID NO: 1. De um modo adequado, pode ainda proporcionar, pelo menos, 100% da atividade que é proporcionada pelo domínio de SEQ ID NO: 1.
[0076] De fato, um domínio ASS-1 adequado pode fornecer pelo menos 110% da atividade fornecida pelo domínio da SEQ ID NO: 1. Adequadamente, ele pode fornecer pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% da atividade fornecida pelo domínio da SEQ ID NO: 1. Adequadamente, pode até fornecer pelo menos 200% da atividade fornecida pelo domínio da SEQ ID
NO: 1.
Um domínio enzimático OTC
[0077] Um exemplo de um domínio enzimático OTC adequado para incorporação nas proteínas da invenção é apresentado na SEQ ID NO: 2.
[0078] Alternativamente, um fragmento ou derivado da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 pode ser usado como um domínio enzimático OTC adequado para incorporação em uma proteína da invenção.
[0079] Qualquer domínio enzimático que confere atividade de OTC às proteínas da invenção pode ser usado em tal modalidade. A atividade de OTC pode ser avaliada por um ensaio descrito na seção Exemplos da invenção.
[0080] Um nível adequado de atividade de OTC pode ser equivalente ao conferido pela SEQ ID NO: 2.
Alternativamente, os domínios enzimáticos que conferem níveis mais baixos ou mais altos de atividade de OTC ainda podem ser benéficos.
[0081] Um fragmento adequado do domínio enzimático OTC estabelecido na SEQ ID NO: 2 pode compreender todos, exceto 1 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 2, todos, exceto 2 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 2, todos, exceto 3 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 2, todos, exceto 4 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:
2, todos, exceto 5 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO : 2, todos, exceto 6 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 2, todos, exceto 7 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 2, todos, exceto 8 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 2, todos, exceto 9 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 2, ou todos, exceto 10 dos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 2.
[0082] Apenas a título de exemplo, uma variante adequada da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 pode compartilhar pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou com um fragmento da SEQ ID NO: 2, como definido acima.
Uma variante adequada pode compartilhar pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2, ou um fragmento da mesma; pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma; pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma; pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma; pelo menos 96% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma; pelo menos 97% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma; pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma; ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma. Para serem adequadas para incorporação nos CARs da invenção, essas variantes devem reter a atividade sintética do OTC, conforme mencionado acima.
[0083] Um domínio enzimático de OTC adequado pode fornecer pelo menos 50% da atividade fornecida pelo domínio da SEQ ID NO: 2. Adequadamente, pode fornecer pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90 % de atividade da atividade fornecida pelo domínio da SEQ ID NO:
2. Adequadamente, pode até fornecer pelo menos 100% da atividade daquela fornecida pelo domínio da SEQ ID NO: 2.
[0084] De fato, um domínio de OTC adequado pode fornecer pelo menos 110% da atividade da fornecida pelo domínio da SEQ ID NO: 2. Adequadamente, pode fornecer pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, a pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% da atividade fornecida pelo domínio da SEQ ID NO: 2. Adequadamente, pode até fornecer pelo menos 200% da atividade fornecida pelo domínio da SEQ ID NO: 2.
Um domínio enzimático de arginosuccinato-liase (ASL)
[0085] Um exemplo de um domínio enzimático de ASL adequado para incorporação nas proteínas da presente invenção é codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 30.
[0086] Alternativamente, um fragmento ou derivado da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 30 pode ser usado para codificar um domínio enzimático ASL adequado para incorporação em uma proteína da invenção.
[0087] Qualquer domínio enzimático que confere atividade de ASL à proteína da invenção pode ser usado em tal modalidade.
[0088] Um nível adequado de atividade de ASL pode ser equivalente ao conferido por uma proteína codificada pela SEQ ID NO: 30. Alternativamente, os domínios enzimáticos que conferem níveis mais baixos ou mais altos de atividade de ASL ainda podem ser benéficos.
Um domínio enzimático da ornitina descarboxilase (ODC1)
[0089] Um exemplo de um domínio enzimático de ODC1 adequados para incorporação nas proteínas da invenção é codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 31.
[0090] Alternativamente, um fragmento ou derivado da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 31 pode ser usado para codificar um domínio enzimático de ODC1 adequado para incorporação em uma proteína da invenção.
[0091] Qualquer domínio enzimático que confere atividade de ODC1 às proteínas da invenção pode ser utilizado em tal modalidade.
[0092] Um nível adequado de atividade de ODC1 pode ser equivalente ao conferido por uma proteína codificada pela SEQ ID NO: 31. Alternativamente, os domínios enzimáticos que conferem níveis mais baixos ou mais altos de atividade de ODC1 ainda podem ser benéficos.
Um domínio enzimático de arginosuccinato sintetase (ArgG) a. Um exemplo de um domínio enzimático de ArgG adequado para incorporação nos CARs da invenção é codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 32.
[0093] Alternativamente, um fragmento ou derivado da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 32 pode ser usado para codificar um domínio enzimático de ArgG adequado para incorporação em uma proteína da invenção.
[0094] Qualquer domínio enzimático que confere atividade de ArgG às proteínas da invenção pode ser usado em tal modalidade.
[0095] Um nível adequado de atividade de ArgG pode ser equivalente ao conferido por uma proteína codificada pela SEQ ID NO: 32. Alternativamente, os domínios enzimáticos que conferem níveis mais baixos ou mais altos de atividade de ArgG podem ainda ser benéficos.
Um domínio enzimático da arginosuccinato-liase (ArgH)
[0096] Um exemplo de um domínio enzimático de ArgH adequado para incorporação nas proteínas da invenção é codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 33.
[0097] Alternativamente, um fragmento ou derivado da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 33 pode ser usado para codificar um domínio enzimático de ArgH adequado para incorporação em uma proteína da invenção.
[0098] Qualquer domínio enzimático que confere atividade de ArgH às proteínas da invenção pode ser utilizado em tal modalidade.
[0099] Um nível adequado de atividade de ArgH pode ser equivalente ao conferido por uma proteína codificada pela SEQ ID NO: 33. Alternativamente, os domínios enzimáticos que conferem níveis mais baixos ou mais altos de atividade de ArgH podem ainda ser benéficos.
Um domínio enzimático de ornitina carbamoiltransferase (argF)
[00100] Um exemplo de um domínio enzimático de argF adequado para incorporação nas proteínas da invenção é codificado pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 34.
[00101] Alternativamente, um fragmento ou derivado da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 34 pode ser usado para codificar um domínio enzimático de ArgF adequado para incorporação em uma proteína da invenção.
[00102] Qualquer domínio enzimático que confere atividade de ArgF às proteínas da invenção pode ser usado em tal modalidade.
[00103] Um nível adequado de atividade de ArgF pode ser equivalente ao conferido por uma proteína codificada pela SEQ ID NO: 34. Alternativamente, os domínios enzimáticos que conferem níveis mais baixos ou mais altos de atividade de ArgF ainda podem ser benéficos.
Triptofano ou um precursor de triptofano
[00104] A presente invenção se refere a proteínas que compreendem um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano.
[00105] O triptofano (frequentemente abreviado para "Trp" ou "W") é um aminoácido não polar. Possui uma massa molecular de 204,2 g/mol-1 e também pode ser referido como ácido 2-amino-3-(1H-indol-3-il)propanóico.
[00106] Para os fins da presente invenção, um "precursor de triptofano" pode ser considerado como qualquer composto que preceda o triptofano na cascata de produção de triptofano.
Um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano
[00107] As proteínas da invenção compreendem um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano. A capacidade de um domínio para cumprir esta função, isto é, promover a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano, pode ser investigada por qualquer meio ou ensaio adequado.
[00108] O técnico no assunto compreenderá que um meio ou ensaio adequado pode ser selecionado com referência ao composto, por exemplo triptofano ou um precursor de triptofano, cuja síntese deve ser promovida. Apenas a título de exemplo, ensaios adequados pelos quais a capacidade de um domínio para promover a síntese necessária são descritos mais adiante nos Exemplos, em relação à caracterização de células exemplificativas da invenção.
[00109] Adequadamente, o domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano pode ser um domínio enzimático capaz de promover a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano. Em tal modalidade, o domínio enzimático pode compreender o domínio enzimático completo, ou um fragmento ou uma variante desse domínio, desde que o domínio exiba a atividade necessária.
[00110] Em uma modalidade adequada, o precursor do triptofano, cuja síntese é promovida, é o fosfato de indolglicerol. Em tal modalidade, o domínio que promove essa síntese pode ser um domínio enzimático de triptofano sintetase (TRP5).
[00111] Em uma modalidade adequada, a síntese de triptofano é promovida. Em tal modalidade, o domínio que promove essa síntese pode ser um domínio da enzima indolamina 2,3-dioxigenase (IDO).
Um domínio enzimático de triptofano sintetase (TRP5)
[00112] Um exemplo de um domínio enzimático de TRP5 adequado para incorporação nas proteínas da invenção é codificado pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 35.
[00113] Alternativamente, um fragmento ou derivado da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 35 pode ser usado para codificar um domínio enzimático de TRP5 adequado para incorporação em uma proteína da invenção.
[00114] Qualquer domínio enzimático que confere atividade de TRP5 às proteínas da invenção pode ser usado em tal modalidade.
[00115] Um nível adequado de atividade de TRP5 pode ser equivalente ao conferido por uma proteína codificada pela SEQ ID NO: 35. Alternativamente, os domínios enzimáticos que conferem níveis mais baixos ou mais altos de atividade de TRP5 ainda podem ser benéficos.
Domínio enzimático da indolamina 2,3-dioxigenase (IDO)
[00116] Um exemplo de um domínio enzimático de IDO adequado para incorporação nas proteínas da invenção é codificado pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 36.
[00117] Alternativamente, um fragmento ou derivado da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 36 pode ser usado para codificar um domínio enzimático de IDO adequado para incorporação em uma proteína da invenção.
[00118] Qualquer domínio enzimático que confere atividade de IDO às proteínas da invenção pode ser utilizado em tal modalidade.
[00119] Um nível adequado de atividade de IDO pode ser equivalente ao conferido por uma proteína codificada pela SEQ ID NO: 36. Alternativamente, os domínios enzimáticos que conferem níveis mais baixos ou mais altos de atividade de IDO ainda podem ser benéficos.
Porções de ligação ao alvo
[00120] As proteínas da invenção compreendem uma porção de ligação ao alvo. A porção de ligação ao alvo confere especificidade à ligação das proteínas e, portanto, à atividade citocida das células que expressam proteínas da invenção, para direcionar estruturas, como células, nas quais é encontrada uma molécula alvo, reconhecida pela porção de ligação ao alvo.
[00121] Em particular, as porções de ligação ao alvo conferem especificidade às atividades biológicas das células da invenção (por exemplo, atividade citocida ou proliferação celular em resposta à ativação) que atribuem a sua utilidade terapêutica. Exceto quando o contexto exigir de outra forma, as referências a ligação específica na presente invenção podem ser interpretadas como se referindo à capacidade de uma porção de ligação ao alvo de discriminar entre possíveis parceiros no ambiente em que a ligação deve ocorrer. Uma fração de ligação ao alvo que interage com uma molécula alvo particular quando outros alvos potenciais estão presentes é dita que "se liga especificamente" com a molécula alvo com a qual interage.
Em algumas modalidades, a ligação específica é avaliada pela detecção ou determinação do grau de associação entre a porção de ligação ao alvo e sua molécula alvo ; em algumas modalidades, a ligação específica é avaliada através da detecção ou a determinação do grau de dissociação de um complexo porção de ligação-molécula alvo; em algumas modalidades, a ligação específica é avaliada pela detecção ou determinação da capacidade da porção de ligação ao alvo de competir com uma interação alternativa entre sua molécula alvo e outra entidade. Em algumas modalidades, a ligação específica é avaliada através da realização de tais detecções ou determinações em uma faixa de concentrações.
Em uma modalidade adequada, a ligação específica é avaliada determinando a diferença na afinidade de ligação entre alvos cognatos e não cognatos. Por exemplo, uma porção de ligação ao alvo que é específica pode ter uma afinidade de ligação para uma molécula alvo cognata que é cerca de 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais do que a afinidade de ligação para um alvo não cognato.
[00122] No contexto da presente invenção,
"especificidade" é uma medida da capacidade de uma determinada porção de ligação ao alvo para distinguir seu parceiro de ligação à molécula alvo de outros possíveis parceiros de ligação.
[00123] Uma porção de ligação ao alvo adequada pode ser direcionada a qualquer molécula alvo desejada. A porção de ligação ao alvo pode ser direcionada a uma molécula alvo expressa exclusivamente, ou extensivamente, por um alvo contra o qual se deseja direcionar a atividade citocida de uma célula que expressa uma proteína da invenção. Por exemplo, uma porção de ligação ao alvo pode ser direcionada a uma molécula alvo associada a uma doença. Adequadamente, a porção de ligação ao alvo pode ser direcionada a uma molécula alvo associada ao câncer ou a uma infecção.
a. Em uma modalidade adequada, a porção de ligação ao alvo é selecionada do grupo que consiste em: uma porção de ligação ao alvo de GD2; uma porção de ligação ao alvo de CD33; uma porção de ligação ao alvo da mesotelina; e uma porção de ligação ao alvo de EGFRvIII.
[00124] Exemplos de tais porções de ligação ao alvo são apresentados nas SEQ ID NOs: 3 a 6. Será apreciado que fragmentos ou variantes (por exemplo, diferindo da sequência exemplificativa por 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos de aminoácidos) podem ser utilizados como porções de ligação ao alvo alternativas, desde que o fragmento ou variante retenha a capacidade de se ligar à molécula alvo.
[00125] Sem limitação, porções adequadas de ligação ao alvo podem ser selecionadas do grupo que consiste em: anticorpos ou fragmentos (como scFvs) ou seus derivados; TCRs, tais como cadeias α de TCR ou cadeias β de TCR; e aptâmeros.
Uma porção de ligação ao alvo de GD2
[00126] Uma porção de ligação ao alvo de GD2 é uma porção capaz de se ligar ao disialogangliosídeo 2 (GD2), que também pode ser referido como gangliosídeo GD2. Uma proteína da invenção compreendendo uma fração de ligação ao alvo de GD2 é adequada para uso em circunstâncias nas quais se deseja exercer a atividade citocida de uma célula que expressa uma proteína da invenção contra um alvo que compreende moléculas de GD2, por exemplo, uma célula que expressa GD2.
[00127] O GD2 é expresso por cânceres de origem neuroectodérmica, incluindo neuroblastoma, osteossarcoma e melanoma. Portanto, será apreciado que uma proteína (tal como um CAR) da presente invenção compreendendo uma porção de ligação ao alvo de GD2 é adequado para utilização em circunstâncias em que se deseje utilizar uma proteína da invenção em um uso médico para a prevenção e/ou tratamento de quaisquer destes cânceres, e particularmente o neuroblastoma.
[00128] Uma porção de ligação ao alvo de GD2 adequada para incorporação em uma proteína de acordo com a invenção pode ser um anticorpo anti-GD2, tal como um anticorpo monoclonal anti-GD2, ou um fragmento de ligação ao antígeno ou um derivado do mesmo. Por exemplo, uma porção de ligação ao alvo de GD2 pode ser um fragmento de anticorpo scFv anti-GD2. Apenas a título de exemplo, um domínio alvo de GD2 adequado compreendendo um fragmento de anticorpo scFv é apresentado na SEQ ID NO: 3.
[00129] O fragmento de anticorpo scFv apresentado na SEQ ID NO: 3 também é referido como 14g2a scFv, como descrito na US 9.493.740 B2. É derivado do anticorpo ch14.18 descrito em US 9.777.068 B2, e será apreciado que outros fragmentos ou variantes de anticorpo ch14.18 possam ser utilizados como porções de ligação ao alvo de GD2 nas proteínas da invenção.
[00130] Alternativamente, uma porção de ligação ao GD2 adequada pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em: um aptâmero anti-GD2; ou um fragmento ou derivado do mesmo.
[00131] Adequadamente, uma porção de ligação ao alvo de GD2 é capaz de se ligar especificamente a GD2.
Uma porção de ligação ao alvo de CD33
[00132] Uma porção de ligação ao alvo de CD33 é uma porção capaz de se ligar a CD33 (também conhecido como
Siglec-3). CD33 é proteína transmembranar. Uma proteína da invenção compreendendo uma porção de ligação ao alvo de CD33 é adequada para uso em circunstâncias nas quais se deseja exercer a atividade biológica de uma célula que expressa uma proteína da invenção contra um alvo que compreende moléculas de CD33, por exemplo, uma célula que expressa CD33.
[00133] CD33 é expresso por células de leucemia mieloide aguda (LMA). Portanto, será apreciado que uma proteína da invenção, compreendendo uma porção de ligação ao alvo de CD33 é adequado para utilização em circunstâncias em que é desejável utilizar uma proteína da invenção em um uso médico para a prevenção e/ou tratamento de AML.
[00134] Uma porção de ligação ao alvo de CD33 adequada para incorporação em uma proteína de acordo com a invenção pode ser um anticorpo anti-CD33, tal como um anticorpo monoclonal anti-CD33, ou um fragmento de ligação ao antígeno ou seu derivado. Por exemplo, uma porção de ligação ao alvo CD33 pode ser um fragmento de anticorpo scFv anti-CD33. Apenas a título de exemplo, um domínio alvo de CD33 adequado compreendendo um fragmento de anticorpo scFv é apresentado na SEQ ID NO: 4.
[00135] O fragmento de anticorpo scFv é apresentado na SEQ ID NO: 4 é derivado do anticorpo monoclonal humanizado my96. Os detalhes do anticorpo my96 são apresentados em Leucemia. 2015 ago; 29 (8): 1637-47, e os detalhes do fragmento scFv da SEQ ID NO: 4 são apresentados em US20160096892A1 (onde este scFv é descrito como SEQ ID NO: 147). Será apreciado que outros fragmentos de anticorpos my96 ou variantes podem ser utilizadas como porções de ligação ao alvo de CD33 nas proteínas da invenção.
[00136] Alternativamente, uma porção de ligação ao CD33 adequada pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em: um aptâmero anti-CD33; ou um fragmento ou derivado do mesmo.
[00137] Adequadamente, uma porção de ligação ao alvo de CD33 é capaz de se ligar especificamente a CD33.
Uma porção de ligação ao alvo da mesotelina
[00138] Uma porção de ligação ao alvo da mesotelina é uma porção capaz de se ligar à mesotelina. A mesotelina é uma proteína de 40 kDa que é o produto do MSLN. Uma proteína da invenção compreendendo uma porção de ligação ao alvo da mesotelina é adequada para uso em circunstâncias nas quais é desejado exercer a atividade biológica de uma célula que expressa uma proteína da invenção contra um alvo que compreende moléculas de mesotelina, por exemplo, uma célula que expressa mesotelina.
[00139] Mesotelina é expressa por células de um número de diferentes tipos de cânceres. Os cânceres que expressam mesotelina incluem, por exemplo, cânceress epiteliais, tais como câncer do ovário, adenocarcinoma do pulmão e câncer do pâncreas. Portanto, será apreciado que uma proteína da invenção, compreendendo uma porção de ligação ao alvo de mesotelina é adequado para utilização em circunstâncias em que é desejável utilizar uma proteína da invenção em um uso médico para a prevenção e/ou tratamento de um câncer que expressa mesotelina.
[00140] Uma porção de ligação ao alvo da mesotelina adequada para incorporação em uma proteína de acordo com a invenção pode ser um anticorpo anti-mesotelina, tal como um anticorpo monoclonal anti-mesotelina, ou um fragmento de ligação ao antígeno ou seu derivado. Por exemplo, uma porção de ligação ao alvo da mesotelina pode ser um fragmento de anticorpo scFv anti-mesotelina. Apenas a título de exemplo, um domínio alvo de mesotelina adequado compreendendo um fragmento de anticorpo scFv é apresentado na SEQ ID NO: 5.
[00141] O fragmento de anticorpo scFv é apresentado na SEQ ID NO: 5 é derivado do anticorpo SS1. Detalhes deste anticorpo, e um scFV derivado do mesmo, são estabelecidos em WO 2015/090230 A (onda sequência de aminoácidos de murino SS1 scFv é fornecida na SEQ ID NO: 279). será apreciado que outros fragmentos de anticorpos SS1 ou variantes podem ser utilizados como porções de ligação ao alvo de mesotelina nas proteínas da invenção.
[00142] Alternativamente, uma porção de ligação ao alvo de mesotelina adequada pode ser selecionada do grupo que consiste em: um aptâmero anti-mesotelina; ou um fragmento ou derivado do mesmo.
[00143] Adequadamente, uma porção de ligação ao alvo de GD2 é capaz de se ligar especificamente a GD2.
Uma porção de ligação ao alvo de EGFRvIII
[00144] Uma porção de ligação ao alvo de EGFRvIII é um grupo capaz de se ligar a variante III do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFRvIII). Uma proteína da invenção compreendendo uma porção de ligação ao EGFRvIII é adequada para uso em circunstâncias em que é desejável exercer a atividade biológica de uma célula que expressa uma proteína da invenção contra um alvo que compreende moléculas de EGFRvIII, por exemplo, uma célula que expressa EGFRvIII.
[00145] O EGFRvIII é expresso por uma variedade de cânceres de origem epitelial. Portanto, será apreciado que uma proteína da invenção que compreende uma porção de ligação ao alvo de EGFRvIII é adequada para utilização em circunstâncias em que é desejável utilizar uma proteína da invenção em um uso médico para a prevenção e/ou tratamento de cânceres que expressam EGFR, como glioblastomas e cânceres colorretais. Em particular, uma proteína da invenção compreendendo uma porção de ligação ao alvo de EGFRvIII é adequada para uso na prevenção e/ou tratamento de glioblastoma.
[00146] Uma porção de ligação ao alvo EGFRvIII adequada para incorporação em uma proteína de acordo com a invenção pode ser um anticorpo anti- EGFRvIII, como um anticorpo monoclonal anti- EGFRvIII, ou um fragmento de ligação ao antígeno ou seu derivado. Por exemplo, uma porção de ligação ao alvo de EGFRvIII pode ser um fragmento de anticorpo scFv anti-EGFRvIII. Apenas a título de exemplo, um domínio alvo adequado para EGFRvIII compreendendo um fragmento de anticorpo scFv é apresentado na SEQ ID NO: 6.
[00147] O fragmento de anticorpo scFv que é estabelecido em SEQ ID NO: 6 é derivado do anticorpo 139 descrito em WO 2012/138475 A1 (no qual um scFV humano do anticorpo 139 é estabelecido como SEQ ID NO: 5, e um construto de CAR incorporando o scFv é definido como SEQ ID NO: 11). Será apreciado que outros 139 fragmentos de anticorpos ou variantes podem ser utilizados como porções de ligação ao alvo de mesotelina nas proteínas da invenção.
[00148] Uma fração de ligação ao alvo de EGFRvIII alternativa pode ser derivada do anticorpo anti- EGFRvIII MR1. Um exemplo dessa porção de ligação ao alvo de EGFRvIII é o scFv (derivado de MR1) codificado pela sequência de DNA da SEQ ID NO: 41. Essa porção de ligação ao alvo de EGFRvIII alternativa é incorporada nas proteínas exemplificativas da invenção estabelecidas na SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44. Estas proteínas exemplificativas da invenção foram utilizadas nos estudos descritos nos Exemplos.
[00149] Alternativamente, uma porção de ligação ao EGFRvIII adequada pode ser selecionada do grupo que consiste em: um aptâmero anti-EGFRvIII; ou um fragmento ou derivado do mesmo.
[00150] Adequadamente uma porção de ligação ao alvo de EGFRvIII é capaz de se ligar especificamente ao EGFRvIII.
Regiões de sinalização intracelular
[00151] As proteínas da invenção compreendem pelo menos uma região de sinalização intracelular. A região de sinalização intracelular serve para acoplar a ligação da porção de ligação ao alvo a uma molécula alvo com outras atividades biológicas da célula que expressa a proteína. Em particular, uma região de sinalização intracelular adequada pode acoplar a ligação da porção de ligação ao alvo à sua molécula alvo com a ativação da atividade citocida da célula e/ou à capacidade das células de proliferar em resposta à ativação.
[00152] Como estabelecido nos Exemplos, uma região de sinalização intracelular adequada pode ativar a atividade citotóxica ou citolítica específica em resposta à ligação da molécula alvo à fração de ligação ao alvo.
Alternativamente, ou adicionalmente, uma região de sinalização intracelular adequada pode facilitar a proliferação celular induzida por ativação em resposta à ligação da molécula alvo à porção de ligação alvo.
[00153] Em uma modalidade adequada, a região de sinalização intracelular compreende uma região selecionada do grupo que consiste em: uma região de sinalização 4-1BB; uma região de sinalização OX-40; uma região de sinalização CD28; uma região de sinalização ICOS; e uma região de sinalização CD3 ζ.
[00154] Será apreciado que as proteínas de acordo com a invenção podem compreender uma pluralidade de regiões de sinalização intracelular. Adequadamente, a pluralidade pode compreender mais de uma cópia de uma região de sinalização intracelular individual. Por exemplo, uma proteína da invenção pode compreender várias cópias de uma, ou mais, de: uma região de sinalização 4-1BB; uma região de sinalização OX-40; uma região de sinalização CD28; uma região de sinalização ICOS; e uma região de sinalização CD3 ζ.
[00155] Adicionalmente, ou alternativamente, uma proteína da invenção pode compreender uma combinação de múltiplas regiões de sinalização intracelular. Por exemplo, uma proteína de acordo com a invenção pode compreender uma combinação de regiões de sinalização intracelular selecionadas do grupo que consiste em: uma região de sinalização de 4-1BB; uma região de sinalização OX-40; uma região de sinalização CD28; uma região de sinalização ICOS; e uma região de sinalização CD3 ζ. Apenas a título de exemplo, uma proteína da invenção pode compreender uma região de sinalização 4-1BB e uma região de sinalização CD3 ζ.
[00156] Uma região de sinalização 4-1BB adequada é aquela que é capaz de fornecer sinalização co-estimulatória suficiente para uma célula que expressa uma proteína compreendendo uma região de sinalização para promover pelo menos um dentre: ativação da célula e/ou função da célula, como liberação de citocinas pela célula e/ou citotoxicidade pela célula; e/ou proliferação e/ou persistência da célula.
Esta persistência pode ser persistência in vivo ou in vitro. A persistência pode, em particular, ser a persistência da célula em condições do microambiente tumoral imunossupressor ou que replicam esse microambiente.
A título de exemplo, a liberação de citocinas pode incluir uma ou mais citocinas do grupo que consiste em: IFN-gama, e/ou TNFα e/ou IL2.
[00157] Adequadamente, a região de sinalização 4-1BB pode compreender a sequência completa de 4-1BB.
Alternativamente, uma região de sinalização 4-1BB pode compreender uma forma truncada e/ou modificada da sequência completa. Apenas a título de exemplo, uma região de sinalização 4-1BB adequada pode compreender a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 ou uma porção desta sequência. Adequadamente, uma região de sinalização 4-1BB para incorporação em uma proteína da invenção pode consistir na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7.
[00158] Em uma modalidade adequada, uma região de sinalização OX-40 é aquela que é capaz de fornecer sinalização co-estimulatória suficiente para uma célula que expressa uma proteína compreendendo essa região de sinalização para promover pelo menos um dos seguintes: ativação da célula e/ou função da célula e/ou persistência da célula. Esta persistência pode ser persistência do in vivo ou in vitro. A persistência pode, em particular, ser a persistência da célula em condições do microambiente tumoral imunossupressor ou que replicam esse microambiente.
[00159] Adequadamente, a região de sinalização OX-40 pode compreender a sequência completa de OX-40.
Alternativamente, uma região de sinalização OX-40 pode compreender uma forma truncada e/ou modificada da sequência completa. Apenas a título de exemplo, uma região de sinalização OX-40 adequada pode compreender a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8 ou uma porção desta sequência. Adequadamente, uma região de sinalização 4-1 OX-40 BB para incorporação em uma proteína da invenção pode consistir na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8.
[00160] Uma região de sinalização CD28 adequada é aquela que é capaz de fornecer sinalização co-estimulatória suficiente para uma célula que expressa uma proteína compreendendo uma região de sinalização para promover pelo menos um dentre: ativação da célula e/ou função da célula, e/ou persistência da célula. Esta persistência pode ser persistência in vivo ou in vitro. A persistência pode, em particular, ser persistência da célula em condições do microambiente tumoral imunossupressor ou que replicam esse microambiente.
[00161] Adequadamente, a região de sinalização CD28 pode compreender a sequência completa de CD28.
Alternativamente, uma região de sinalização CD28 pode compreender uma forma truncada e/ou modificada da sequência completa. Apenas a título de exemplo, uma região de sinalização de CD28 adequada pode compreender a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 9 ou uma porção desta sequência. Adequadamente, uma região de sinalização
CD28 para incorporação em uma proteína da invenção pode consistir na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 9.
[00162] Uma região de sinalização ICOS é aquela que é capaz de fornecer sinalização co-estimulatória suficiente para uma célula que expressa uma proteína compreendendo essa região de sinalização para promover pelo menos um dos seguintes: ativação da célula e/ou função da célula, como liberação de citocinas por a célula e/ou citotoxicidade pela célula; e/ou proliferação e/ou persistência da célula.
Esta persistência pode ser persistência do in vivo ou in vitro. A persistência pode, em particular, ser a persistência da célula em condições do microambiente tumoral imunossupressor ou que replicam esse microambiente.
[00163] Adequadamente, a região de sinalização ICOS pode compreender a sequência completa de ICOS (também conhecida como CD278). Alternativamente, uma região de sinalização ICOS pode compreender uma forma truncada e/ou modificada da sequência completa. Apenas a título de exemplo, uma região de sinalização ICOS adequada pode compreender a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10 ou uma porção desta sequência. Adequadamente, uma região de sinalização ICOS para incorporação em uma proteína da invenção pode consistir na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10. Uma forma truncada ou modificada de ICOS pode compreender pelo menos o motivo YMFM encontrado nos resíduos 180-183 da proteína ICOS completa.
[00164] Uma região de sinalização CD3ζ adequada é uma que é capaz de ativar uma resposta funcional dentro da célula T (por exemplo, libertação de citocina (por exemplo, Interferon-gama, TNF e/ou IL-2), citotoxicidade e/ou proliferação).
[00165] Adequadamente, a região de sinalização CD3ζ pode compreender a sequência completa CD3ζ.
Alternativamente, uma região de sinalização CD3ζ pode compreender uma forma truncada e/ou modificada da sequência completa. Meramente a título de exemplo, uma região sinalização CD3ζ adequada pode compreender a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 40, ou uma porção destas sequências. Adequadamente, uma região de sinalização CD3ζ para incorporação em uma proteína da invenção pode consistir na sequência de aminoácidos indicados na SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 40.
Proteínas da invenção direcionadas a GD2
[00166] Uma proteína da invenção que é direcionada a GD2 pode compreender uma porção de direcionamento a GD2, em combinação com uma região intracelular de sinalização adequada (tal como uma região de sinalização intracelular 4-1BB e uma região de sinalização intracelular CD3ζ). A proteína pode ainda compreender um domínio ASS-1; e/ou um domínio OTC; e/ou um domínio ASL; e/ou um domínio OCD1; e/ou um domínio ArgG; e/ou um domínio ArgH; e/ou um domínio ArgF. Adequadamente, a proteína pode compreender um domínio ASS-1; e/ou um domínio OTC.
[00167] Os inventores descobriram que as proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC são particularmente úteis em relação a várias propriedades que demonstram sua utilidade terapêutica.
[00168] Por exemplo, os inventores descobriram que as células que expressam uma proteína da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC exibem viabilidade comparável ou aprimorada em comparação com Células CAR-T GD2 conhecidas no estado da técnica.
[00169] De um modo vantajoso, os inventores verificaram que as células que expressam as proteínas da invenção, compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC são capazes de demonstrar aumento da persistência em comparação com células controle CAR-T comparáveis. Células que expressam as proteínas da invenção, compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio ASS-1 demonstram persistência aumentada particularmente vantajosa em comparação com células controle.
[00170] Os inventores também verificaram que as células que expressam as proteínas da invenção, compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC são capazes de demonstrar o aumento da proliferação em comparação com células CAR-T controle em condições representativas do microambiente tumoral (como condições experimentais de depleção de arginina).
[00171] Em particular, as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio OTC são capazes de demonstrar uma proliferação aumentada em comparação com as células de controle em condições, tais como condições de depleção de arginina, representativas do microambiente do tumor. Surpreendentemente, as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio ASS-1 e domínio OTC são capazes de demonstrar um aumento ainda maior na proliferação em comparação com as células controle em condições, tais como condições de depleção de arginina, representativas do microambiente do tumor.
[00172] Como mostrado nos exemplos, as células que expressam as proteínas da invenção, compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio
OTC são capazes de demonstrar um aumento de 5 vezes em comparação com a proliferação de células controle em condições do microambiente do tumor, tais como condições de depleção de arginina.
[00173] Ainda mais surpreendentemente, as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio ASS-1 e um domínio OTC são capazes de demonstrar um aumento de 10 vezes na proliferação em comparação com as células de controle nas condições do microambiente tumoral, como condições de depleção de arginina.
[00174] Os inventores descobriram que as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC demonstram atividade citocida em relação às células cancerígenas. Apenas a título de exemplo, eles demonstraram que as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio ASS-1 ou um domínio OTC são capazes de demonstrar atividade citocida específica comparável às células GD2 CAR-T conhecidas no estado da técnica.
[00175] Vantajosamente, as células que expressam as proteínas da invenção, compreendendo uma porção de direcionamento a GD2 em combinação com um domínio ASS-1 ou um domínio OTC são capazes de demonstrar atividade citocida, em adição ao aumento da persistência e proliferação, que melhora a sobrevivência dos destinatários em um modelo de câncer in vivo.
[00176] Essas vantagens são discutidas mais adiante na seção Exemplos do relatório descritivo.
[00177] A sequência de aminoácidos de proteínas s exemplificativas da invenção que são direcionadas a GD2 são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 12 a 14. A presente invenção deve ser considerada como abrangendo não só estas proteínas específicas, mas também como incluindo variantes destas proteínas que compartilham a atividade biológica (em particular a atividade citocida e capacidade de promover a proliferação em resposta à proteína de ligação) destas proteínas exemplificativas. Tais variantes podem compartilhar pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas de SEQ ID NOs: 12 a 14.
Adequadamente, essas variantes podem compartilhar pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas das SEQ ID NOs: 12 a 14.
Proteínas da invenção que são direcionadas a mesotelina
[00178] Uma proteína da invenção que tem como alvo a mesotelina pode compreender uma fração de alvo da mesotelina derivada do anticorpo anti-mesotelina SS1, em combinação com uma região de sinalização intracelular adequada (como uma região de sinalização intracelular 4-1BB e uma região de sinalização intracelular CD3 ζ). A proteína pode ainda compreender um domínio ASS-1; e/ou um domínio OTC; e/ou um domínio ASL; e/ou um domínio OCD1; e/ou um domínio ArgG; e/ou um domínio ArgH; e/ou um domínio ArgF.
Adequadamente, a proteína pode compreender um domínio ASS- 1; e/ou um domínio OTC.
[00179] Os inventores descobriram que as proteínas da invenção compreendendo uma fração de direcionamento a de mesotelina em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC são particularmente úteis em relação a várias propriedades que demonstram sua utilidade terapêutica.
[00180] Por exemplo, os inventores descobriram que as células que expressam uma proteína da invenção compreendendo uma fração de direcionamento a de mesotelina em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC exibem viabilidade comparável ou aprimorada, quando comparada às células CAR-T de mesotelina conhecidas no estado da técnica.
[00181] Vantajosamente, os inventores descobriram que as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma fração de direcionamento a de mesotelina em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC são capazes de demonstrar proliferação aumentada em comparação com células CAR-T de controle em condições representativas do microambiente tumoral (como condições experimentais de depleção de arginina).
[00182] As células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de mesotelina em combinação com um domínio OTC demonstram uma proliferação particularmente aumentada em comparação com as células de controle em condições, tais como condições de depleção de arginina, representativas do microambiente tumoral. Como ilustrado nos exemplos, este aumento particular na proliferação é demonstrado por proteínas da invenção compreendendo um domínio OTC por si só ou com um domínio ASS-1. Pode-se observar que as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de mesotelina em combinação com um domínio OTC demonstram um aumento de aproximadamente quatro vezes na proliferação em comparação com as células de controle em condições que replicam as encontradas no microambiente do tumor.
[00183] Também mostrado nos Exemplos, as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de mesotelina em combinação com um domínio ASS-1 e um domínio
OTC são capazes de demonstrar um aumento de mais de 3 vezes na proliferação em comparação com as células de controle em condições de o microambiente do tumor, como condições de depleção de arginina.
[00184] Essas vantagens são discutidas mais adiante na seção Exemplos do relatório descritivo.
[00185] A sequência de aminoácidos de proteínas exemplificativas da invenção que são direcionadas a mesotelina são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 15 a 17. A presente invenção deve ser considerada como abrangendo não só estas proteínas específicas, mas também como incluindo variantes destas proteínas que compartilham a atividade biológica (em particular a atividade citocida e capacidade de promover a proliferação em resposta à proteína de ligação) destas proteínas exemplificativas. Tais variantes podem compartilhar pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas de SEQ ID NOs: 15 a 17. Adequadamente, essas variantes podem compartilhar pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas da SEQ ID NOs: 15 a 17.
Proteínas da invenção que têm como alvo CD33
[00186] Uma proteína da invenção que tem como alvo CD33 pode compreender uma porção de direcionamento para CD33 derivada do anticorpo anti-CD33 my96, em combinação com uma região de sinalização intracelular adequada (como uma região de sinalização intracelular 4-1BB e uma região de sinalização intracelular CD3ζ). A proteína pode ainda compreender um domínio ASS-1; e/ou um domínio OTC domínio ASS-1; e/ou um domínio OTC; e/ou um domínio ASL; e/ou um domínio OCD1; e/ou um domínio ArgG; e/ou um domínio ArgH; e/ou um domínio ArgF. Adequadamente, a proteína pode compreender um domínio ASS-1; e/ou um domínio OTC.
[00187] As Proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a CD33 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC são particularmente úteis no que diz respeito a várias propriedades que demonstram sua utilidade terapêutica.
[00188] Por exemplo, os inventores descobriram que as células que expressam uma proteína da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a CD33 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC exibem viabilidade comparável ou aprimorada em comparação com células CAR-T de CD33 conhecidas no estado da técnica.
[00189] Vantajosamente, os inventores descobriram que as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a CD33 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC são capazes de demonstrar persistência aumentada em comparação com células CAR-T de controle comparáveis. As células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a CD33 em combinação com um domínio ASS-1 demonstram uma persistência aumentada particularmente vantajosa em comparação com as células de controle.
[00190] Os inventores também descobriram que as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma fração de direcionamento a CD33 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC são capazes de demonstrar proliferação aumentada em comparação com células CAR-T de controle em condições representativas do microambiente do tumor (como condições experimentais de depleção de arginina).
[00191] As células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a CD33 em combinação com um domínio OTC demonstram proliferação significativamente aumentada em comparação com células de controle em condições, tais como condições de depleção de arginina, representativas do microambiente tumoral. Os inventores também descobriram que as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de CD 33 em combinação com um domínio ASS-1 e um domínio OTC demonstram um aumento ainda maior na proliferação em comparação com as células de controle em condições representativas do microambiente do tumor.
[00192] Como mostrado nos Exemplos, as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a CD33 em combinação com um domínio OTC demonstram um aumento de mais de 5 vezes na proliferação em comparação com as células de controle em condições que representam o microambiente do tumor. Ainda mais vantajosamente, as células que expressam as proteínas da invenção, compreendendo uma porção de direcionamento a CD33, em combinação com um domínio ASS-1 e um domínio de OTC demonstram um aumento de aproximadamente 6 vezes de proliferação em comparação com células de controle sob as mesmas condições.
[00193] Os inventores descobriram que as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de direcionamento a CD33 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC demonstram atividade citocida em relação a células cancerígenas comparável à das células CD33 CAR-T conhecidas no estado da técnica.
[00194] Vantajosamente, as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma fração de CD33 em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC são capazes de demonstrar atividade citocida, além de persistência e proliferação aumentadas, que melhoram a sobrevivência dos receptores em um modelo de câncer in vivo.
[00195] Essas vantagens são discutidas mais adiante na seção Exemplos do relatório descritivo.
[00196] A sequência de aminoácidos das proteínas exemplificativas da invenção que são direcionadas a CD33 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 18 a 20. A presente invenção deve ser considerada como abrangendo não só estas proteínas específicas, mas também como incluindo variantes destas proteínas que compartilham a atividade biológica (em particular a atividade citocida e capacidade de promover a proliferação em resposta à proteína de ligação) destas proteínas exemplificativas. Tais variantes podem compartilhar pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas de SEQ ID NOs: 18 a 20.
Adequadamente, essas variantes podem compartilhar pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas das SEQ ID NOs: 18 a 20.
Proteínas da invenção que são direcionadas a EGFRvIII
[00197] Uma proteína da invenção que tem como alvo EGFRvIII pode compreender uma porção de direcionamento a
EGFRvIII derivada do anticorpo anti-EGFRvIII 139, em combinação com uma região intracelular de sinalização adequada (tal como uma região de 4-1BB intracelular de sinalização e uma região de sinalização intracelular CD3ζ).
A proteína pode ainda compreender um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC; e/ou um domínio ASL; e/ou um domínio OCD1; e/ou um domínio ArgG; e/ou um domínio ArgH; e/ou um domínio ArgF. Em particular, a proteína pode compreender um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC.
[00198] Os resultados dos inventores demonstram que as células que expressam uma proteína da invenção que compreende uma porção de direcionamento a EGFRvIII, em combinação com um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC exibem viabilidade que é comparável, ou melhorada, em comparação com células CAR-T EGFRvIII conhecidas no estado da técnica.
[00199] Os inventores descobriram que as células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma fração de direcionamento a EGFRvIII em combinação com um domínio ASS- 1 demonstram proliferação aumentada em comparação com células CAR-T de controle em condições representativas do microambiente tumoral (como condições experimentais de depleção de arginina). Tais células que expressam as proteínas da invenção que compreendem uma porção de direcionamento a EGFRvIII, em combinação com um domínio ASS-1 demonstram um aumento de mais do que duas vezes na proliferação em comparação com células de controle em tais condições.
[00200] Essas vantagens são discutidas mais adiante na seção Exemplos do relatório descritivo.
[00201] A sequência de aminoácidos de proteínas exemplificativas da invenção que têm como alvo EGFRvIII é apresentada nas SEQ ID NOs: 21 a 23. A presente invenção deve ser tomada como abrangendo não apenas essas proteínas específicas, mas também como abrangendo variantes dessas proteínas que compartilham a atividade biológica (particularmente a atividade citocida e a capacidade de promover a proliferação em resposta à ligação às proteínas) dessas proteínas exemplificativas. Tais variantes podem compartilhar pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas das SEQ ID NOs: 21 a 23.
Adequadamente, essas variantes podem compartilhar pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas das SEQ ID NOs: 21 a 23.
Ácidos nucleicos que codificam proteínas da invenção
[00202] O terceiro aspecto da invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína da invenção. As proteínas podem estar de acordo com qualquer um dos aspectos ou modalidades da invenção aqui descritos.
[00203] Adequadamente, um ácido nucleico de acordo com a invenção compreende DNA. Em uma modalidade adequada, um ácido nucleico da invenção compreende RNA. Será apreciado que um ácido nucleico adequado pode consistir essencialmente em DNA, pode consistir essencialmente em RNA ou pode compreender uma combinação de DNA e RNA.
[00204] Exemplos de ácidos nucleicos que codificam proteínas da invenção são apresentados nas SEQ ID NOs: 37 a
39. Essas sequências de ácidos nucleicos são moléculas de DNA que codificam proteínas exemplificativas estabelecidas no relatório descritivo da seguinte maneira: Ácido nucleico da invenção Codifica a proteína da invenção estabelecido na SEQ ID NO estabelecida na SEQ ID NO
37. 12
38. 13
39. 14
[00205] Será apreciado que a degeneração do códon significa que pode haver diferenças notáveis nas sequências de ácidos nucleicos da invenção que codificam uma única proteína dada da invenção.
[00206] Apenas a título de exemplo, um ácido nucleico adequado da invenção pode compartilhar pelo menos 70% de identidade de sequência com um dos ácidos nucleicos exemplificativas da invenção apresentados nas SEQ ID NOs: 37 a 39. Um ácido nucleico adequado da invenção pode compartilhar pelo menos 75% de identidade de sequência; pelo menos 80% de identidade de sequência; pelo menos 85% de identidade de sequência; pelo menos 90% de identidade de sequência; pelo menos 95% de identidade de sequência; pelo menos 96% de identidade de sequência; pelo menos 97% de identidade de sequência; pelo menos 98% de identidade de sequência; ou mesmo 99% ou mais de identidade de sequência com um dos ácidos nucleicos exemplificativas da invenção estabelecidos nas SEQ ID NOs: 37 a 39.
[00207] Uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da invenção que tem como alvo a mesotelina pode ser o mesmo que as sequências de ácidos nucleicos de qualquer de SEQ ID NOs: 37, 38, ou 39 exceto que a parte destas sequências de ácidos nucleicos que codifica a porção de ligação ao alvo é substituída pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 28.
[00208] Uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da invenção que tem como alvo CD33 pode ser a mesma que as sequências de ácidos nucleicos de qualquer de SEQ ID NOs: 37, 38, ou 39 exceto que a parte destas sequências de ácidos nucleicos que codifica a porção de ligação ao alvo é substituída pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 27.
[00209] Uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da presente invenção que tem como alvo EGFRvII pode ser a mesma que as sequências de ácidos nucleicos de qualquer de SEQ ID NOs: 37, 38, ou 39 exceto que a parte destes ácidos nucleicos que codifica a porção de ligação ao alvo é substituída pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 29.
[00210] Um ácido nucleico que codifica uma proteína da invenção pode ser fornecido na forma de um vetor.
Adequadamente, o vetor pode ser um vetor viral, como um vetor retroviral ou um vetor lentiviral, ou um transposon.
As abordagens retroviral e lentiviral foram utilizadas com sucesso na produção de células da invenção.
[00211] Detalhes de construtos que foram usadas na produção lentiviral bem sucedida de células da invenção são apresentados na Figura 14. Esses construtos fornecem mais exemplos de ácidos nucleicos da invenção.
Células da invenção
[00212] O segundo aspecto da invenção fornece uma célula compreendendo uma proteína de acordo com o primeiro aspecto da invenção. A célula pode expressar a proteína. A proteína pode estar de acordo com qualquer uma das modalidades do primeiro aspecto da invenção aqui descrita.
[00213] Adequadamente, uma célula de acordo com o segundo aspecto da invenção pode ser uma célula capaz de exercer uma resposta imune mediada por células. Uma célula adequada pode ser capaz de exercer atividade citocida, por exemplo, por ação citotóxica ou por indução de lise celular específica. Além disso, uma célula adequada pode ser capaz de proliferar em resposta à ligação da proteína à sua molécula alvo correspondente. Adequadamente, uma célula de acordo com o segundo aspecto da invenção pode ser selecionada do grupo que consiste em: uma célula T; e uma célula natural killer (NK).
[00214] Adequadamente, uma célula T pode ser selecionada do grupo que consiste em: uma célula T natural killer invariável (iNKT); uma célula T natural killer (NKT); uma célula T gama delta (célula T gd); uma célula T alfa beta (célula T ab); uma célula T efetora; e uma célula T de memória.
[00215] Adequadamente, uma célula T pode ser selecionada do grupo que consiste em: um linfócito CD4+; e um linfócito CD8+.
[00216] A célula pode ser de um sujeito que requer prevenção e/ou tratamento de uma doença. A célula pode ser retirada de uma amostra desse sujeito.
[00217] Alternativamente, a célula pode ser de um indivíduo doador saudável (para os propósitos da presente invenção, tomada como um sujeito não afetado pela doença a ser tratado com a proteína ou célula da invenção).
[00218] Será apreciado que as células adequadas também podem incluir células de linhagens celulares.
[00219] As técnicas padrão para a coleta de células humanas, e sua transformação com proteínas, tais como as proteínas da invenção, são bem conhecidas dos técnicos no assunto. As técnicas preferidas para a transdução retroviral de células T humanas, determinação da eficiência da transdução e classificação de células T transduzidas por classificação de células ativadas magneticamente, são descritas mais adiante nos Exemplos.
Atividade biológica das células da invenção
[00220] As células da invenção, compreendendo proteínas da invenção, exibem uma série de atividades que são benéficas em aplicações como a prevenção e/ou tratamento de doenças.
[00221] Essas atividades biológicas podem ser ainda consideradas com referência às atividades citocidas (que representam os meios pelos quais as células da invenção são capazes de exercer seus efeitos terapêuticos) e atividades como proliferação (por exemplo, em resposta à ativação) e persistência in vivo, que permitem que as células da invenção exerçam seus efeitos terapêuticos por mais tempo do que tem sido o caso das células que expressam CAR do estado da técnica.
[00222] Essas atividades biológicas respectivas são descritas mais adiante. Será apreciado que as vantagens oferecidas pelas proteínas e células da invenção surgem principalmente como resultado da combinação dessas atividades biológicas.
[00223] A atividade biológica das células da invenção pode ser determinada com referência a células comparadoras adequadas. Exemplos de células comparadoras adequadas incluem células do mesmo tipo que as da invenção que não foram transduzidas com uma proteína ou células do mesmo tipo que as da invenção que foram transduzidas com uma proteína que não compreende um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina.
Atividade citocida de células da invenção
[00224] Para os fins da presente invenção, a atividade citocida deve ser considerada como abrangendo qualquer atividade pela qual as células da invenção (por exemplo, células que expressam proteínas da invenção) matam outras células. A título de exemplo, a morte de outras células pode ser alcançada por meio de ação citotóxica das células da invenção ou por lise celular específica mediada pelas células da invenção.
[00225] As células da invenção exercem sua atividade citocida em relação às estruturas alvo que compreendem moléculas alvo ligadas pelas porções de ligação ao alvo das proteínas da invenção.
[00226] Preferencialmente, as células mortas pela atividade citocida das células da invenção são células associadas a uma doença. Adequadamente, as células associadas a uma doença podem ser células cancerígenas ou células infectadas.
[00227] Como estabelecido nos Exemplos, os inventores demonstraram que as células da invenção (compreendendo proteínas da invenção) exibem atividade citocida que é especificamente direcionada para células que expressam moléculas alvo ligadas pelas porções de ligação ao alvo das proteínas da invenção. A extensão da atividade citocida observada em relação às células da invenção está amplamente alinhada com a das células que expressam proteínas descritas no estado da técnica. No entanto, a combinação desta atividade citocida mantida, com melhor proliferação e/ou persistência, exibida pelas células da invenção confere benefícios não observados em relação às células do estado da técnica.
[00228] O técnico no assunto terá conhecimento de muitos ensaios adequados pelos quais a atividade citocida, seja atividade citotóxica ou lise celular específica, de uma célula da invenção ou célula comparadora adequada, podem ser avaliadas. Apenas a título de exemplo, os ensaios adequados são descritos nos Exemplos, onde são utilizados na caracterização de células exemplificativas da invenção.
[00229] O técnico no assunto, ao considerar as informações apresentadas nos Exemplos, reconhecerá que as células da invenção exibem atividade citocida que as torna bem adequadas para uso terapêutico na prevenção e/ou tratamento de doenças da maneira descrita neste relatório descritivo.
Persistência das células da invenção
[00230] A persistência in vivo, e particularmente dentro de um sujeito, de células que exercem um efeito terapêutico é importante para a prevenção e/ou tratamento eficaz de doenças. Como mencionado anteriormente, o microambiente em torno de tumores, como o neuroblastoma, é particularmente prejudicial às células terapêuticas, como as células T CAR. Pensa-se que os efeitos deste microambiente e a incapacidade de células terapêuticas persistirem dentro dele contribuíram significativamente para as falhas observadas em relação a muitos tratamentos do estado da técnica.
[00231] As células da invenção, compreendendo proteína da presente invenção, exibem aumento da persistência no microambiente tumoral. Esta persistência aumentada in vivo, que é demonstrada nos Exemplos, representa um mecanismo pelo qual os efeitos terapêuticos das células da invenção podem ser prolongados e, portanto, sua utilidade terapêutica aumentada, em comparação com as células do estado da técnica.
[00232] A persistência das células da invenção, ou células comparadoras adequadas, pode ser avaliada experimentalmente de várias maneiras diferentes. Meramente a título de exemplo, a persistência de células pode ser definida com referência à percentagem de células originalmente administrados que permanecem viáveis dentro de um receptor depois de um determinado período de tempo.
Será apreciado que uma comparação útil entre duas ou mais populações de células (como uma população de células da invenção e uma população de células comparadoras adequadas) pode ser feita após qualquer período de tempo, desde que o tempo decorrido seja aproximadamente o mesmo para cada uma das populações de células. Dito isto, os inventores descobriram que as comparações feitas 17 dias após a administração de células são bem adequados para tais cálculos, por exemplo, no caso de camundongos NOG-SCID enxertados com 5x10 6 das células da invenção, como mostrado nos Exemplos. Será apreciado que outros pontos no tempo podem ser utilizados com referência a modelos experimentais particulares de interesse, e que outros métodos para medir a persistência nas células serão conhecidos pelos técnicos no assunto.
[00233] A proporção de células da invenção que persiste após um período de tempo definido pode ser pelo menos 5% superior à das células comparadoras adequadas. De fato, a proporção de células da invenção que persiste pode ser de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45 %, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% superior ao das células comparadoras adequadas. A proporção de células da invenção que persiste após um período de tempo definido pode ser pelo menos 100%, ou mais, superior à das células comparadoras adequadas.
[00234] A proporção de células da invenção que persiste após um período de tempo definido pode ser de até 10%, até 15%, até 20%, até 25%, até 30%, até 35%, até 40%, até 45%, até 50%, até 55%, até 60%, até 65%, até 70%, até 75%, até 80%, até 85%, até 90%, até 95%, ou até 100% do número total de células da invenção originalmente administradas.
[00235] As células da invenção podem persistir em um recipiente por um períodomais longo do que as células comparadoras adequadas. As células da invenção podem persistir no recipiente por até 5% a mais do que uma célula comparadora adequada. As células da invenção podem persistir no recipiente por até 10% a mais, até 15%, até 20%, até 25%, até 30%, até 35%, até 40%, até 45 %, até 50%,
até 55%, até 60%, até 65%, até 70%, até 75%, até 80%, até 85%, até 90%, até 95% ou até 100% a mais do que uma célula comparadora adequada.
[00236] Outra maneira pela qual a persistência de células, como as células da invenção, pode ser avaliada é com referência ao tempo em que uma célula permanece viável em um recipiente. Adequadamente, uma célula da invenção, compreendendo uma proteína da invenção, pode permanecer viável por pelo menos 5 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 15 dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 2 5 dias, pelo menos 30 dias, pelo menos pelo menos 35 dias, pelo menos 40 dias, pelo menos 45 dias, pelo menos 50 dias, pelo menos 55 dias, pelo menos 60 dias, pelo menos 65 dias, pelo menos 70 dias, pelo menos 7 5 dias, pelo menos 80 dias, pelo menos 8 5 dias, pelo menos 90 dias, pelo menos 95 dias ou pelo menos 100 dias ou mais em um recipiente.
Adequadamente, uma célula da invenção, compreendendo uma proteína da invenção, pode permanecer viável por pelo menos 150 dias, pelo menos 200 dias, pelo menos 250 dias, pelo menos 300 dias ou pelo menos 350 dias ou mais em um recipiente. Adequadamente, uma célula da invenção compreendendo uma proteína da invenção, pode permanecer viável durante pelo menos 6 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 15 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 21 meses, pelo l leste 24 meses ou mais no recipiente. Adequadamente, uma célula da invenção compreendendo uma proteína da invenção pode permanecer viável por pelo menos 1 ano, pelo menos 2 anos, pelo menos 3 anos, pelo menos 4 anos, pelo menos 5 anos, pelo menos 6 anos, pelo menos 7 anos, pelo menos 8 anos, pelo menos 9 anos ou pelo menos 10 anos ou mais no recipiente. Adequada, a célula da invenção compreendendo a proteína da invenção pode permanecer viável por pelo menos 10 anos, por pelo menos 15 anos, por pelo menos 20 anos, por pelo menos 25 anos, por pelo menos 30 anos, por pelo menos 35 anos, por pelo menos 40 anos, por pelo menos 45 anos, por pelo menos 50 anos ou mais no recipiente.
Proliferação de células da invenção
[00237] A ativação das células da invenção, através da ligação da proteína à molécula alvo correspondente, induz a proliferação celular. Isso permite a produção de um número maior de células capazes de exercer uma atividade terapêutica. No entanto, essa proliferação celular é normalmente inibida no microambiente tumoral, e isso contribuiu para o fracasso dos tratamentos com células T CAR descritos no estado da técnica.
[00238] As células da invenção exibem capacidade de proliferação dentro do microambiente tumoral com depleção de arginina que é notavelmente aprimorado em comparação com o observado em relação às células T CAR do estado da técnica. Uma vez que a proliferação celular resulta na expansão de populações de células da invenção que são capazes de exercer sua atividade citocida terapêutica dentro do microambiente tumoral, isso é altamente vantajoso.
[00239] A proliferação de células, como as células da invenção, pode ser avaliada experimentalmente de várias maneiras. Apenas a título de exemplo, a proliferação celular pode ser avaliada em condições que replicam o microambiente do tumor. Tais condições podem envolver o uso de meios de cultura que foram depletados em relação à arginina, por exemplo, condicionando com células tumorais.
Em tais condições, as células da invenção podem exibir uma taxa de proliferação que é pelo menos 5% maior que a das células comparadoras adequadas, pelo menos 10% maior que a das células comparadoras adequadas, pelo menos 15% maior que a das células comparadores adequadas células, pelo menos 20% superior à das células comparadoras adequadas, pelo menos 25% superior à das células comparadoras adequadas, pelo menos 30% superior à das células comparadoras adequadas, pelo menos 35% superior à das células comparadoras adequadas, pelo menos 40% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 45% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 50% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos
55% superior ao das células comparadoras adequadas, em pelo menos 60% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 65% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 70% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 75% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 8 0% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 85% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 90% superior ao das células comparadoras adequadas ou pelo menos 95% superior ao das células comparadoras adequadas.
De fato, as células da invenção podem exibir uma taxa de proliferação que é pelo menos 100%, ou mais, superior à das células comparadoras adequadas nas mesmas condições experimentais.
[00240] Alternativamente, a proliferação de células pode ser avaliada com referência ao número de células presentes em um recipiente após um período de tempo definido após a administração, em comparação com o número de células comparadoras presentes nas mesmas condições. O número de células da invenção presentes em um recipiente após um determinado tempo pode ser pelo menos 5% maior que o das células comparadoras adequadas, pelo menos 10% maior que o das células comparadoras adequadas, pelo menos 15% maior que o das células comparadoras adequadas, pelo menos 20% superior à das células comparadoras adequadas, pelo menos 25% superior à das células comparadoras adequadas, pelo menos 30% superior à das células comparadoras adequadas, pelo menos 35% superior à das células comparadoras adequadas, pelo menos 40% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 45% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 50% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 55% superior ao das células comparadoras adequadas, em pelo menos 60% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 65% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 70% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 75% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 80% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 85% superior ao das células comparadoras adequadas, pelo menos 90% superior ao das células comparadoras adequadas ou pelo menos 95% superior ao das células comparadoras adequadas se ambas as células da invenção e células comparadoras são administradas em quantidades aproximadamente iguais.
Utilizações médicas e métodos de tratamento
[00241] As proteínas da invenção, particularmente na forma de células do segundo aspecto da invenção que expressam essas proteínas, são bem adequadas para uso médico, ou seja, para uso como medicamentos na prevenção e/ou tratamento de doenças. Tais usos médicos são o assunto do quinto, sexto e sétimo aspectos da invenção.
[00242] A prevenção de uma doença pode ser necessária quando um indivíduo ainda não desenvolveu uma doença, mas foi identificado como estando em risco de desenvolver a doença no futuro. Adequadamente, essa identificação pode ser baseada em detalhes como a história clínica do sujeito ou de sua família, resultados de testes genéticos do sujeito de sua família ou risco de exposição a agentes causadores de doenças conhecidos. No caso de câncer, a prevenção pode ser desejável no caso de um sujeito exibindo sintomas ou características de doença pré- maligna.
[00243] O tratamento de uma doença pode ser necessário uma vez que um indivíduo tenha sido identificado como já tendo desenvolvido uma doença. O estágio de desenvolvimento da doença no momento da identificação pode ser sintomático ou assintomático. Essa identificação pode ser baseada na avaliação clínica do sujeito, nos sintomas apresentados pelo sujeito ou na análise de amostras fornecidas pelo sujeito (tais como biópsias, amostras de sangue ou similares, permitindo a identificação da presença de malignidades, agentes infecciosos, ou outros indicadores de patologia).
[00244] O oitavo aspecto da invenção se refere a um método de prevenção e/ou tratamento de uma doença em um indivíduo necessitado de tal prevenção e/ou tratamento, o método compreendendo proporcionar ao sujeito uma proteína da invenção. A proteína da invenção é fornecida em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Essa quantidade terapeuticamente eficaz pode ser alcançada por uma única incidência de fornecer uma proteína da invenção ou cumulativamente através de múltiplas incidências de fornecer proteínas da invenção.
[00245] A proteína da invenção pode ser adequadamente fornecida ao sujeito direta ou indiretamente.
Por provisão direta entende-se a administração da proteína, particularmente na forma de uma célula que expressa a proteína, ao sujeito. Por provisão indireta entende-se induzir o sujeito a expressar uma proteína da invenção.
Será apreciado que uma proteína da invenção pode ser fornecida indiretamente a um sujeito via administração de um ácido nucleico do terceiro aspecto da invenção, que codifica uma proteína de acordo com o primeiro aspecto da invenção.
[00246] Será apreciado que as células que expressam proteínas s podem ser usadas na prevenção ou tratamento de uma ampla gama de doenças, incluindo cânceres, doenças autoimunes e doenças causadas por infecções, como infecções virais. Adequadamente, tais doenças podem ser prevenidas e/ou tratadas por usos médicos de métodos de tratamento utilizando proteínas, células, ácidos nucleicos ou composições farmacêuticas da invenção.
Prevenção e/ou tratamento de câncer
[00247] Em particular, as proteínas, células, ácidos nucleicos ou composições farmacêuticas da invenção podem ser úteis na prevenção e/ou tratamento de câncer. É nestas aplicações que a capacidade das células da invenção de funcionar, persistir e proliferar no microambiente tumoral depletado de arginina é particularmente vantajosa.
[00248] Exemplos adequados de câncer que podem ser prevenidos e/ou tratados por usos médicos de métodos de tratamento que utilizam proteínas, células, ácidos nucleicos ou composições farmacêuticas da invenção incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em: neuroblastoma; mesotelioma; câncer do ovário; câncer de mama; Cancer de colo; meduloblastoma; câncer de pâncreas; câncer de próstata; Câncer de testículo; leucemia mieloide aguda; glioblastoma; osteossarcoma; e melanoma.
Composições farmacêuticas e formulação
[00249] A presente invenção também fornece composições incluindo proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção. Em particular, a invenção fornece composições e formulações farmacêuticas, tais como composições em forma de dose unitária, incluindo proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção para administração em uma dada dose ou fração. As composições e formulações farmacêuticas incluem geralmente um ou mais carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis opcionais. Em algumas modalidades, a composição inclui pelo menos um agente terapêutico adicional.
[00250] O termo "formulação farmacêutica" se refere a uma preparação que é de forma a permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo nela contido seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada.
[00251] Um "carreador farmaceuticamente aceitável" se refere a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, que não seja um ingrediente ativo, que não é tóxico para um sujeito. Um carreador farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante.
[00252] Em algumas modalidades, a escolha do carreador é determinada em parte pela proteína, célula ou ácido nucleico específico da invenção e/ou pelo método de administração. Por conseguinte, existe uma variedade de formulações adequadas. Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter conservantes. Conservantes adequados podem incluir, por exemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sódio e cloreto de benzalcônio.
Em alguns aspectos, é usada uma mistura de dois ou mais conservantes.
O conservante ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,0001 a cerca de 2% em peso da composição total.
Os carreadores são descritos, por exemplo, por Remington's Pharmaceutical
Sciences 16ª edição, Osol, A.
Ed. (1980). Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, mas não estão limitados a: tampões como fosfato,
citcamundongo e outros ácidos orgânicos; antioxidantes,
incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio
; fenol, álcool butílico ou benzílico; álquil parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-
hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas,
como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas;
polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona;
aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina,
histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos,
dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose,
manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA;
açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol;
contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína-Zn); e/ou tensoativos não iónicos, tais como polietilenoglicol (PEG).
[00253] Os agentes tamponantes estão incluídos em algumas modalidades das composições da invenção. Os agentes tamponantes adequados incluem, por exemplo, ácido cítrico, citrato de sódio, ácido fosfórico, fosfato de potássio e vários outros ácidos e sais. Em alguns aspectos, é usada uma mistura de dois ou mais agentes tamponantes. O agente tampão ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,001 a cerca de 4% em peso da composição total. São conhecidos métodos para preparar composições farmacêuticas administráveis. Métodos exemplificativos são descritos em mais detalhes, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (1 de maio de 2005).
[00254] As formulações podem incluir soluções aquosas. A formulação ou composição também pode conter mais de um ingrediente ativo útil para a indicação, doença ou condição específica sendo tratada com as proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção, de preferência aqueles com atividades complementares às proteínas, células, ou ácidos nucleicos da invenção, em que as atividades respectivas não afetam adversamente uma à outra. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades efetivas para a finalidade pretendida. Assim, em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui ainda outros agentes ou fármacos farmaceuticamente ativos, como agentes quimioterapêuticos, por exemplo, asparaginase, bussulfano, carboplatina, cisplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracil, gemcitabina, hidroxiureia, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina e/ou vincristina.
[00255] A composição farmacêutica em algumas modalidades contém os CARs, células ou ácidos nucleicos da invenção em quantidades eficazes para tratar ou prevenir a doença ou condição, tal como uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz. A eficácia terapêutica ou profilática em algumas modalidades é monitorada por avaliação periódica dos indivíduos tratados. A dosagem desejada pode ser administrada por uma única administração em bolus das proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção, por múltiplas administrações em bolus das proteínas, células ou ácidos nucleicos, ou por administração de infusão contínua das proteínas, células ou ácidos nucleicos.
[00256] As composições podem ser administradas usando técnicas de administração padrão, formulações e/ou dispositivos. A administração das células pode ser autóloga ou heteróloga. Por exemplo, células ou progenitores imunorresponsivos podem ser obtidos de um sujeito e administrados ao mesmo sujeito ou a um sujeito compatível diferente. As células imunorresponsivas derivadas de sangue periférico ou sua progênie (por exemplo, derivada in vivo, ex vivo ou in vitro) podem ser administradas por injeção localizada, incluindo administração de cateter, injeção sistêmica, injeção localizada, injeção intravenosa ou administração parenteral. Ao administrar uma composição terapêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica contendo uma célula imunorresponsiva geneticamente modificada), ela geralmente será formulada em uma forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão, emulsão).
[00257] As formulações incluem aquelas para administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou supositória. Em algumas modalidades, as populações celulares são administradas parentericamente. O termo "parenteral", como aqui utilizado, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal e intraperitoneal. Em algumas modalidades, as células são administradas ao sujeito usando administração sistêmica periférica por injeção intravenosa, intraperitoneal ou subcutânea.
[00258] As composições em algumas modalidades são fornecidas como preparações líquidas estéreis, por exemplo,
soluções aquosas isotônicas, suspensões, emulsões, dispersões ou composições viscosas, que podem em alguns aspectos ser tamponadas a um pH selecionado. As preparações líquidas são normalmente mais fáceis de preparar do que os géis, outras composições viscosas e composições sólidas.
Além disso, as composições líquidas são um pouco mais convenientes para administrar, especialmente por injeção.
As composições viscosas, por outro lado, podem ser formuladas dentro da faixa de viscosidade apropriada para proporcionar períodos de contato mais longos com tecidos específicos. As composições líquidas ou viscosas podem compreender veículos, que podem ser um solvente ou meio dispersante contendo, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, poliol (1 por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido) e misturas adequadas dos mesmos.
[00259] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando as proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção em um solvente, como em mistura com um veículo, diluente ou excipiente adequado, como água estéril, solução salina fisiológica, glicose, dextrose ou similares. As composições podem conter substâncias auxiliares, como agentes umectantes, dispersantes ou emulsificantes (por exemplo, metilcelulose), agentes tamponantes de pH, aditivos gelificantes ou melhoradores de viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes e/ou cores, dependendo da via de administração e preparação desejado. Em alguns aspectos, textos padrão podem ser consultados para preparar as preparações adequados.
[00260] Vários aditivos que aumentam a estabilidade e esterilidade das composições, incluindo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e tampões, podem ser adicionados. A prevenção da ação de microrganismos pode ser assegurada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol e ácido sórbico. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00261] As formulações a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente alcançada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.
Doses e regimes de dosagens Tamanho ou quantidade de doses
[00262] As proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção podem ser fornecidos em uma primeira dose e, opcionalmente, em doses subsequentes. Em algumas modalidades, a primeira dose ou subsequente contém um número de proteínas s, células ou ácidos nucleicos da invenção na faixa de cerca de 105 a cerca de 106 dessas células por quilograma de peso corporal do sujeito e/ou um número de tais células que não mais do que cerca de 105 ou cerca de 106 de tais células por quilograma de peso corporal do sujeito. Por exemplo, em algumas modalidades, a primeira dose ou a subsequente inclui menos ou não mais do que aproximadamente 1 x 105, aproximadamente 2 x 105, aproximadamente 5 x 105 ou aproximadamente 1 x 106 dessas células por quilograma de peso corporal do sujeito. Em algumas modalidades, a primeira dose inclui aproximadamente 1 x 105, aproximadamente 2 x 105, aproximadamente 5 x 105, ou aproximadamente 1 x 106 dessas células por quilograma de peso corporal do sujeito, ou um valor dentro do intervalo entre dois dos valores anteriores.
[00263] Em algumas modalidades, por exemplo, onde o sujeito é humano, a primeira dose ou a subsequente inclui menos de cerca de 1 x 10 proteínas, células ou ácidos nucleicos totais da invenção, por exemplo, na faixa de cerca de 1 x 106 a 1 x 108 células, como 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 ou 1 x 108 ou total dessas células, ou o intervalo entre quaisquer dois dos valores anteriores.
[00264] Em algumas modalidades, a primeira dose ou a subsequente contém menos de cerca de 1 x 108 proteínas totais, células ou ácidos nucleicos da invenção por m2 do sujeito, por exemplo, na faixa de cerca de 1 x 106 a 1 x 108 dessas células por m2 do sujeito, como 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 ou 1 x 108 dessas células por m2 do sujeito, ou o intervalo entre quaisquer dois dos valores anteriores. Em certas modalidades, o número de proteínas, células, ou os ácidos nucleicos da invenção, na primeira dose ou a subsequente é maior do que cerca de 1 x 106 de tais proteínas, células, ou os ácidos nucleicos da invenção por quilograma de peso corporal do sujeito, por exemplo, 2 x 106, 3 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1 x 109 ou 1 x 1010 dessas células por quilograma de peso corporal e/ou, l x 108, ou l x 109, l x 1010 de tais células por m2 do indivíduo ou total, ou o intervalo entre quaisquer dois dos valores anteriores.
[00265] Em algumas modalidades, o número de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção administrada na dose subsequente é igual ou semelhante ao número de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção administrada na primeira dose em qualquer uma das as modalidades deste documento, tal como menos ou não mais do que aproximadamente 1 x 105, aproximadamente 2 x 105, aproximadamente 5 x 105 ou aproximadamente 1 x 106 dessas células por quilograma de peso corporal do sujeito. Em algumas modalidades, a(s) dose(s) subsequente(s) contém aproximadamente 1 x 105, aproximadamente 2 x 105, aproximadamente 5 x 105 ou aproximadamente 1 x 106 dessas células por quilograma de peso corporal do sujeito ou um valor dentro da faixa entre dois dos valores anteriores.
Em algumas modalidades, esses valores se referem ao número de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção.
Em alguns aspectos, a dose subsequente é maior que a primeira dose.
Por exemplo, em algumas modalidades, a dose subsequente contém mais do que cerca de 1 x 106 proteínas,
células, ou os ácidos nucleicos da invenção por quilograma de peso corporal do sujeito, tais como de cerca de 3 x 106,
5 x 106, 1 x 107, 1 x 108 ou 1 x 109 dessas células por quilograma de peso corporal do sujeito.
Em algumas modalidades, a quantidade ou tamanho da dose subsequente é suficiente para reduzir a carga da doença ou um indicador da mesma e/ou um ou mais sintomas da doença ou condição.
Em algumas modalidades, a segunda dose (ou outra subsequente)
é de um tamanho eficaz para melhorar a sobrevivência do sujeito, por exemplo, para induzir a sobrevivência, a sobrevida livre de recaídas ou a sobrevida livre de eventos do indivíduo por pelo menos 6 meses, ou pelo menos 1, 2, 3,
4 ou 5 anos.
Em algumas modalidades, o número de proteínas,
células ou ácidos nucleicos da invenção administrados e/ou número de tais células administradas por peso corporal do indivíduo na dose subsequente é pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes ou mais que o número administrado na primeira dose.
Em algumas modalidades, a carga da doença, o tamanho do tumor, o volume do tumor, a massa do tumor e/ou a carga ou volume do tumor são reduzidos após a dose subsequente em pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90% ou mais em comparação com a imediatamente antes da administração da primeira dose ou da segunda dose (ou outra subsequente).
[00266] Noutras modalidades, o número de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção administrados na dose subsequente é inferior ao número de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção administrados na primeira dose.
[00267] Em algumas modalidades, várias doses subsequentes são administradas após a primeira dose, de modo que uma dose ou doses adicionais sejam administradas após a administração da segunda dose (ou outra dose subsequente). Em alguns aspectos, o número de células administradas ao sujeito nas doses ou doses adicionais subsequentes (ou seja, a terceira, quarta, quinta e assim por diante) é igual ou semelhante à primeira dose, à segunda dose e/ou outra dose subsequente. Em algumas modalidades, a dose ou doses adicionais são maiores que as doses anteriores.
[00268] Em alguns aspectos, o tamanho da primeira e/ou dose subsequente é determinado com base em um ou mais critérios, como resposta do sujeito a tratamento anterior,
por exemplo, quimioterapia, carga de doença no sujeito, como carga tumoral, volume, tamanho, ou grau, extensão, ou tipo de metástase, fase, e/ou risco ou incidência do sujeito desenvolver resultados tóxicos, por exemplo, CRS, síndrome de activação dos macrófagos, do tumor síndrome de lise, neurotoxicidade, e/ou uma resposta imune do hospedeiro contra as células e/ou receptores recombinantes sendo administrados.
[00269] Em alguns aspectos, o tamanho da primeira e/ou dose subsequente é determinado pela carga da doença ou condição no indivíduo. Por exemplo, em alguns aspectos, o número de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção administrados na primeira dose é determinado com base na carga do tumor que está presente no indivíduo imediatamente antes da administração da primeira dose. Em algumas modalidades, o tamanho da primeira e/ou dose subsequente é inversamente correlacionada com a carga da doença. Em alguns aspectos, como no contexto de uma grande carga de doença, o indivíduo é administrado um baixo número de proteínas, células, ou os ácidos nucleicos da invenção, por exemplo, menos do que cerca de 1 x 106 proteínas, células, ou os ácidos nucleicos da invenção por quilograma de peso corporal do sujeito. Em outras modalidades, como no contexto de uma menor carga de doença, o sujeito recebe um número maior de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção, como mais de cerca de 1 x 106 proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção por quilograma de peso corporal do sujeito.
[00270] Em alguns aspectos, o número de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção administrados na dose subsequente é determinado com base na carga do tumor que está presente no indivíduo após a administração da primeira dose. Em algumas modalidades, por exemplo, onde a primeira dose diminuiu a carga da doença ou o fez abaixo de uma quantidade ou nível limite específico, por exemplo, uma acima da qual existe um risco aumentado de resultado tóxico, a dose subsequente é grande, por exemplo, mais de 1 x 106 proteínas, células, ou ácidos nucleicos da invenção por quilograma de peso corporal, e/ou é maior do que a primeira dose. Noutros aspectos, o número de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção administrados na dose subsequente é baixo, por exemplo, inferior a cerca de 1 x 106, por exemplo, o mesmo que ou inferior à primeira dose, em que a primeira dose reduziu a carga tumoral em pequena extensão ou quando a primeira dose não levou a uma redução detectável na carga tumoral.
[00271] Em algumas modalidades, o número de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção administrados na primeira dose é menor que o número de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção administrados em outros métodos, como aqueles nos quais uma dose única grande de células é administrada, tal como para administrar as proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção antes que uma resposta imune se desenvolva. Assim, em algumas modalidades, os métodos reduzem a toxicidade ou resultados tóxicos em comparação com outros métodos que envolvem administração de uma dose maior.
[00272] Em algumas modalidades, a primeira dose inclui as proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção em uma quantidade que não causa ou reduz a probabilidade de toxicidade ou resultados tóxicos, como síndrome de liberação de citocinas (SRC), SRC grave (sCRS), síndrome de ativação de macrófagos, síndrome de lise tumoral, febre de pelo menos cerca de 38 graus Celsius por três ou mais dias e um nível plasmático de CRP de pelo menos aproximadamente 20 mg/dL e/ou neurotoxicidade. Em alguns aspectos, o número de células administradas na primeira dose é determinado com base na probabilidade de o indivíduo exibir toxicidade ou resultados tóxicos, como CRS, sCRS e/ou resultados relacionados a CRS após a administração das células. Por exemplo, em algumas modalidades, a probabilidade de desenvolvimento de resultados tóxicos em um sujeito é prevista com base na carga do tumor. Em algumas modalidades, os métodos incluem detectar ou avaliar o resultado tóxico e/ou a carga da doença antes da administração da dose.
[00273] Em algumas modalidades, a segunda dose (ou outra subsequente) é administrada em um momento no qual um risco clínico para o desenvolvimento de síndrome de liberação de citocinas (CRS), síndrome de ativação de macrófagos ou síndrome de lise tumoral, ou a presença de neurotoxicidade não está presente ou já passou ou diminuiu após a primeira administração, tal como após uma janela crítica após a qual esses eventos geralmente diminuíram e/ou têm menor probabilidade de ocorrer, por exemplo, em 60, 70, 80, 90 ou 95% dos indivíduos com uma doença específica ou condição.
Momento das doses
[00274] Em alguns aspectos, o momento da segunda dose ou subsequente é medido desde o início da primeira dose até o início da dose subsequente. Em outras modalidades, o momento da dose subsequente é medido a partir da conclusão da primeira dose, ou a partir do dia mediano de administração da primeira dose, por exemplo, no contexto de dosagem dividida, descrita aqui, onde uma dose é administrada em mais de um dia, por exemplo, mais de 2 dias ou mais de 3 dias.
[00275] Em algumas modalidades, se uma dose subsequente de proteínas, células ou ácidos nucléicos da invenção, distinta daquela da primeira dose, é administrada, é determinada com base na presença ou grau de uma resposta imune ou resposta imune detectável no sujeito para proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção da primeira dose. Em alguns aspectos, uma dose subsequente contendo células que expressam um receptor diferente das células da primeira dose será administrada a um indivíduo com uma resposta imune adaptativa do hospedeiro detectável ou uma resposta imune que se estabeleceu ou atingiu um certo nível, estágio ou grau.
[00276] Em algumas modalidades, a segunda dose (ou outra subsequente) é administrada em um momento no qual é provável que uma segunda administração de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção seja ou se prevê que seja eliminada pelo sistema imunológico do hospedeiro.
A probabilidade de desenvolver uma resposta imune pode ser determinada medindo as respostas imunes específicas do receptor no sujeito após a administração da primeira dose, como aqui descrito.
[00277] Por exemplo, em algumas modalidades, os sujeitos podem ser testados após a primeira (ou outra dose anterior) e antes da segunda (ou outra dose subsequente) para determinar se uma resposta imune é detectável no sujeito após a primeira dose. Em algumas dessas modalidades, a detecção de uma resposta imune à primeira dose pode desencadear a necessidade de administrar a segunda dose.
[00278] Em alguns aspectos, amostras dos sujeitos podem ser testadas para determinar se há um declínio ou menor que a exposição desejada, por exemplo, menor que um determinado número ou concentração de células, conforme descrito aqui, no sujeito após a primeira ou a dose anterior. Em alguns desses aspectos, a detecção de um declínio na exposição do sujeito às células pode desencadear a necessidade de administrar a segunda dose.
[00279] Em algumas modalidades, a dose subsequente é administrada em um momento no qual a doença ou condição no indivíduo não recidivou após a redução na carga da doença em resposta à primeira ou à dose anterior. Em algumas modalidades, a redução da carga da doença é indicada por uma redução em um ou mais fatores, como carga ou número de células da doença no sujeito ou fluido ou órgão ou tecido do mesmo, massa ou volume de um tumor, ou grau ou extensão das metástases. Considera-se que esse fator recidivou se após a redução do fator em resposta a um tratamento ou administração inicial, o fator subsequentemente aumentar.
[00280] Em algumas modalidades, a segunda dose é administrada em um momento no qual a doença recidivou. Em algumas modalidades, a recaída ocorre em um ou um ou mais fatores, ou na carga da doença em geral. Em alguns aspectos, a dose subsequente é administrada em um ponto no tempo em que o indivíduo, a carga da doença ou o fator dela recidivou em comparação com o ponto mais baixo medido ou atingido após a primeira ou a administração anterior, mas ainda é menor em comparação ao momento imediatamente antes da primeira dose. Em algumas modalidades, o sujeito recebe a dose subsequente em um momento no qual a carga da doença ou fator indicativo da mesma não mudou, por exemplo, em um momento em que um aumento na carga da doença foi impedido.
[00281] Em algumas modalidades, a dose subsequente é administrada no momento em que uma resposta imune adaptativa do hospedeiro é detectada, foi estabelecida ou atingiu um certo nível, grau ou estágio. Em alguns aspectos, a dose subsequente é administrada após o desenvolvimento de uma resposta imune de memória no sujeito.
[00282] Em alguns aspectos, o tempo entre a administração da primeira dose e a administração da dose subsequente é de cerca de 28 a cerca de 35 dias, cerca de 29 a cerca de 35 dias ou mais de cerca de 35 dias. Em algumas modalidades, a administração da segunda dose é em um ponto no tempo mais de cerca de 28 dias após a administração da primeira dose. Em alguns aspectos, o tempo entre a primeira e a dose subsequente é de aproximadamente 28 dias.
[00283] Em algumas modalidades, uma dose ou doses adicionais, por exemplo, doses subsequentes, são administradas após a administração da segunda dose. Em alguns aspectos, a dose ou doses adicionais são administradas pelo menos cerca de 28 dias após a administração de uma dose anterior. Em algumas modalidades, nenhuma dose é administrada menos de cerca de 28 dias após a dose anterior.
[00284] Em algumas modalidades, por exemplo, onde uma ou mais doses consecutivas são administradas ao sujeito, as doses consecutivas podem ser separadas por cerca de 7, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 21, cerca de 27 ou cerca de 28 dias. Em alguns aspectos, a dose consecutiva é administrada 21 dias após uma dose anterior.
Em algumas modalidades, a dose consecutiva é administrada entre 14 e 28 dias após a administração de uma dose anterior.
[00285] Em qualquer uma das modalidades, os métodos em alguns casos incluem a administração da primeira dose ou da dose anterior e a(s) dose(s) subsequente(s), e em outros casos incluem a administração da(s) dose(s) subsequente(s) a um sujeito que recebeu anteriormente a primeira ou dose anterior, mas não inclui a administração da primeira ou da dose anterior. Assim, em alguns casos, os métodos envolvem a administração do tratamento de consolidação, tal como a administração de uma dose subsequente de consolidação a um sujeito que recebeu anteriormente uma dose de proteínas, células ou ácidos nucleicos da invenção.
[00286] Em algumas modalidades, a carga da doença, o tamanho do tumor, o volume do tumor, a massa do tumor e/ou a carga ou volume do tumor são reduzidos após a dose subsequente em pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90 % ou mais em comparação com a dose imediatamente antes da administração da primeira dose ou dose anterior ou da segunda dose ou dose subsequente.
Produção de células que expressam proteínas da invenção
[00287] O técnico no assunto terá conhecimento de métodos adequados pelos quais os ácidos nucleicos, tais como os ácidos nucleicos da invenção, podem ser utilizados na produção de células transduzidas que expressam proteínas. Tais métodos podem ser utilizados na produção de células da invenção, que expressam proteínas da invenção.
[00288] Apenas a título de exemplo, os protocolos adequados que podem ser utilizados na produção de células da invenção são descritos mais adiante nos Exemplos abaixo.
[00289] Outros exemplos de métodos para a produção de células que expressam proteínas da invenção serão evidentes para os técnicos no assunto. Sem limitação, estes incluem métodos pelos quais os ácidos nucleicos da invenção são introduzidos nas células por meios tais como vírus ou nanopartículas.
EXEMPLOS
[00290] As proteínas da invenção foram investigadas com referência a CARs exemplificativas, como discutido mais abaixo.
1 Otimização de títulos virais contendo CAR
[00291] Os inventores mostraram que as concentrações de partículas retrovirais aumentam ao longo de 72 horas nos sobrenadantes das células AMPHO Phoenix, mostradas na Figura 1a.
[00292] A eficiência da transdução de células T-CAR foi avaliada pela detecção por citometria de fluxo de tCD34. Não foi observada diferença na eficiência de transdução de PBMCs usando sobrenadantes da linha celular AMPHO coletados em 24 ou 72 horas, mostrados na Figura 1b.
2 As enzimas da via da arginina demonstram atividade em células Jurkat transduzidas.
[00293] Os inventores investigaram o papel das enzimas da via da arginina em uma linha imortalizada de células de linfócitos T humanos (células Jurkat). Os resultados deste estudo estão apresentados na Figura 2.
a. As células Jurkat foram transduzidas com construtos de proteína de fusão de ligação ao alvo compreendendo as enzimas da via da arginina ou construtos controle de CAR-T. Para fins experimentais, tanto as células da invenção como as células de controle foram transduzidas para expressar proteínas compreendendo uma porção de ligação a GD2. A pureza dos construtos de proteína-enzima produzidos foi avaliada medindo a expressão de tCD34 usando a citometria de fluxo. Os resultados mostram que os construtos proteína-enzima podem ser produzidos com um alto grau de pureza nas células Jurkat, mostradas na Figura 2a.
[00294] Houve um aumento na expressão de ASS-1 e OTC nas células transduzidas (note que Jurkat tem uma expressão ASS-1 de base mais alta em comparação com PBMCs primárias), mostrada na Figura 2b.
[00295] Os inventores investigaram a capacidade dos domínios que promovem a síntese de arginina nas células transduzidas para desempenhar sua função.
[00296] O catabolismo de citrulina em arginossuccinato por ASS-1 foi avaliado e comparado com construtos de controle, (sem um domínio ASS-1, GD2-CAR), uma proteína de fusão de ligação ao alvo contendo um domínio OTC (GD2-OTC) e proteína de fusão de ligação ao alvo contendo os domínios ASS-1 e OTC (GD2-ASS-OTC). Os lisados da célula Jurkat transduzida por GD2-ASS foram testados em um ensaio colorimétrico quanto à atividade da enzima ASS-1 para catabolizar diretamente a citrulina em argininosuccinato. A proteína de fusão de ligação ao alvo contendo um domínio ASS-1 que promove a síntese de arginina demonstrou que proteínas de ligação ao alvo de fusão GD2- ASS-1 têm uma atividade significativamente maior de ASS-1 do que as células que contêm os construtos de proteína de fusão de ligação ao alvo controle. Mostrado na Figura 2c.
[00297] O catabolismo da ornitina em citrulina por OTC foi avaliado e comparado com construtos de controle, sem um domínio OTC (apenas GD2), uma proteína de fusão de ligação ao alvo contendo um domínio ASS-1 (GD2-ASS) e proteína de fusão de ligação ao alvo contendo os domínios ASS-1 e OTC (GD2-ASS-OTC). Os lisados das células Jurkat transduzidas por GD2-OTC foram testados em um ensaio colorimétrico para a atividade da enzima OTC de catabolizar diretamente a ornitina em citrulina. A proteína de fusão de ligação ao alvo contendo um domínio OTC (GD2-OTC) e os construtos de proteína de fusão de ligação ao alvo contendo um domínio ASS-1 e um domínio OTC (GD2-ASS-OTC) tiveram uma atividade significativamente maior de OTC que as células contendo os construtos de CAR controle, mostradas na Figura 2d.
[00298] Os inventores investigaram a persistência de células T de proteína de fusão de ligação ao alvo transduzidas com construtos que compreendem domínios que promovem a síntese de arginina em um microambiente tumoral.
[00299] Camundongos NOG-SCID foram enxertados com
5x106 células T de proteína fusão de ligação ao alvo. A PEG-arginase recombinante foi administrada duas vezes por semana para criar um microambiente reprodutível e com baixo nível de arginina (confirmado com ELISA de arginina). Os camundongos foram sacrificados e a percentagem de células T de proteínas de ligação ao alvo de fusão no sangue foram medidas por citometria de fluxo. As células T da proteína de fusão de ligação ao alvo compreendendo um domínio ASS-1 (GD2-ASS) mostraram uma persistência significativamente melhorada em comparação com as proteínas de ligação ao alvo de fusão sem o domínio ASS-1 (células T GD2-CAR), mostradas na Figura 2e.
[00300] As células T da proteína de fusão ligação ao alvo compreendendo um domínio OTC (GD2-OTC) mostraram uma persistência significativamente melhorada em comparação com as células T sem a proteína de fusão de ligação ao alvo compreendendo o domínio OTC (células T GD2-CAR), mostrada na Figura 2f.
3 As enzimas da via da arginina podem ser transduzidas em PBMCs a partir de doadores humanos.
[00301] Os inventores investigaram o papel das enzimas da via da arginina em PBMCs de células de doadores humanos). Os resultados deste estudo estão apresentados na Figura 3.
[00302] As PBMCs foram transduzidas com construtos de proteínas de ligação ao alvo de fusão compreendendo as enzimas da via da arginina. A pureza dos construtos da enzima CAR produzidos foi avaliada medindo a expressão de tCD34 usando citometria de fluxo. Os resultados mostram que os construtos de proteínas-enzimas de fusão de ligação ao alvo podem ser produzidos com um elevado grau de pureza nas PBMCs, mostrado na Figura 3a.
[00303] Houve um aumento na expressão de ASS-1 e o OTC é aumentado nas células transduzidas, mostrado na Figura 3b.
[00304] Os inventores descobriram que não havia diferenças na expressão dos receptores co-inibidores LAG-3, TIM-3 e PD-1 em células CAR-T também contendo os construtos que compreendem um domínio que promove a síntese de arginina.
[00305] A persistência de PBMCs transduzidas com os construtos que compreendem um domínio que promove a síntese de arginina foi medida durante uma expansão de 7 dias, conforme detectado por citometria de fluxo de tCD34. O construto GD2 -ASS-1 demonstrou persistência semelhante ao construto GD2 sozinho. Com o tempo, os construtos GD2-OTC e GD2-ASS-OTC não foram mantidos, como mostrado na Figura 3d.
Estas experiências foram realizadas em condições normais de arginina sem antígeno presente. Os inventores levantam a hipótese de que uma vantagem de sobrevivência pode ser vista em condições de baixa arginina e na presença de um antígeno. Qualquer perda de células que ocorra in vivo pode ser superada pela administração repetida de células da invenção a um paciente, com o intervalo de administração refletindo o tempo durante o qual as células sobrevivem no corpo.
4 ASS-1 e OTC conferem uma vantagem metabólica e proliferativa significativa em condições tumorais com baixa arginina
[00306] A capacidade das células T de proteínas de ligação ao alvo de fusão compreendendo um domínio que promove a síntese de arginina, (GD2-ASS, e GD2-OTC) para melhorar o metabolismo de citrulina quando cultivadas em arginina normal (RPMI + 10% de FCS), sobrenadante LAN-1 condicionado por neuroblastoma e condições de meio de depleção de arginina a 75% foram detectadas por ELISA de sobrenadantes da cultura. Sob condições de baixa arginina derivadas de tumor, proteínas de ligação ao alvo de fusão de GD2- ASS-1 e proteínas de ligação ao alvo de fusão de GD2-OTC suprarregularam significativamente o metabolismo de citrulina, consistente com a enzima de expressão e ativação em comparação com o controle (sem um domínio que promove a síntese de arginina, apenas GD2), mostrado na figura 4a.
[00307] A lise celular específica de proteínas de ligação ao alvo de fusão compreendendo células T de proteínas de ligação ao alvo de fusão com um domínio ASS-1 (“GD2-ASS -BB") e um domínio OTC (“GD2-OTC -BB"), em linhagens celulares de neuroblastoma e linhagem celulares de leucemia mieloide, foi avaliada contra o controle (apenas GD2 : "GD2-BB"). As células T de proteína de fusão de ligação ao alvo foram cultivadas na presença de células de neuroblastoma GD2 + LAN-1 marcadas com cromo em diferentes proporções de efetoras-alvo por 4 horas. Todos os construtos de células CAR-T matam especificamente células de neuroblastoma efetivamente (35-45%), consistente com os dados anteriores dos inventores. Nenhum prejuízo à citotoxicidade é observado com a adição de ASS-1 ou OTC. A especificidade desta atividade citocida foi demonstrada pelo fato de que as células T GD2-CAR (seja de controle ou da invenção) teve morte mínima da linhagem celular de leucemia mielói (GD2- K562) (lise específica < 5%).
Mostrado na Figura 4b.
[00308] As células T CAR que compreendem um domínio que promove a síntese de arginina (ASS-1 ou OTC) mostraram um resgate significativo da proliferação em condições de baixa arginina. As células CAR-T foram cultivadas em sobrenadantes de baixa arginina derivados de neuroblastoma com arginina normal (RPMI + 10% FCS) ou meio com depleção de arginina de 75%. Proliferação de células T foi medida por timidina tritiada após 96 horas. As células CAR-T mostram uma redução na proliferação de células T em condições de baixa arginina, consistente com nossos achados anteriores. As células transfectadas com um construto compreendendo um domínio ASS-1 (GD2-ASS) e um domínio OTC (GD2-OTC) mostraram um resgate significativo da proliferação nessas condições em comparação com o controle (GD2-CAR), como mostrado na Figura 4c.
5 Células CAR-T modificadas têm atividade antitumoral aumentada in vivo e podem ser aplicadas a células CAR-T não GD2
[00309] Camundongos NOG-SCID enxertados com células tumorais GD2 +. As células CAR-T compreendendo um domínio ASS-1 (GD2-ASS) e sem (GD2-CAR) foram administradas por injeção na veia da cauda. O crescimento relativo do tumor foi medido ao longo do tempo. A administração de células T CAR GD2- ASS-1 levou a uma redução no crescimento do tumor, em comparação com as células T GD2-CAR, como mostrado na Figura 5a.
[00310] A administração de células T CAR GD2 -ASS-1 também levou a uma melhor sobrevivência de murinos, como mostrado na Figura 5b. Os resultados mostrados nesta figura ilustram não apenas a atividade citocida (e, portanto, terapêutica) das células da invenção, mas também sua persistência melhorada in vivo, uma vez que essa atividade terapêutica é observada por um período de tempo mais longo do que para as células de controle.
[00311] A viabilidade das células T CAR CD33 e CD33- ASS-1 foi avaliada. CARs CD33-ASS-1 foram cultivados em meio de condição de linhagem de células AML (com baixo teor de arginina) ou meio de 50-75% de depleção de arginina.
CARs CD33-ASS-1 mostraram viabilidade significativamente aprimorada em condições de baixa arginina em comparação aos CARs CD33. Os resultados que ilustram isso são mostrados na Figura 5c.
6 Maior persistência de células da invenção em condições de depleção de arginina in vivo.
[00312] A melhoria da persistência das células da invenção foi demonstrada em camundongos NOG-SCID enxertados com 5x106 células CAR-T Jurkat anti-GD2 (células de controle), ou células Jurkat que expressam as proteínas da invenção, compreendendo uma porção de alvo GD2 e um domínio GD2-ASS-1(GD2-ASS), ou células que expressam proteínas da invenção compreendendo uma porção de alvo GD2 e um domínio OTC (GD2-OTC), administrado por via intravenosa. A PEG- arginase recombinante foi administrada duas vezes por semana a camundongos, a fim de criar um microambiente reprodutível e com baixa arginina (para replicar um microambiente tumoral). As condições de baixa arginina foram confirmadas por ELISA (dados não mostrados). Após 17 dias, os camundongos foram sacrificados e a porcentagem de células CAR-T no sangue (controle ou da invenção) foi medida por citometria de fluxo. As células CAR-T GD2-ASS-1 e GD2-OTC mostraram persistência significativamente aprimorada em comparação com as células de controle que compreendem o construto de CAR-T GD2 não modificado. Esses resultados são mostrados na Figura 6.
7 As enzimas da via da arginina podem ser transduzidas em PBMCs de doadores humanos compreendendo várias porções de ligação ao alvo.
[00313] PBMCs (especificamente células T) de doadores humanos foram transduzidos com proteínas da invenção compreendendo um domínio ASS-1 e/ou um domínio OTC em combinação com porções de ligação ao alvo selecionadas na lista que consiste em: GD2, CD33, Mesotelina ou EGFRvIII. Os Western blot mostram que a expressão de ASS-1 e OTC é aumentada em células transduzidas com proteínas da invenção em comparação com uma célula de controle (coluna da esquerda de cada Western blot). Isso é mostrado na Figura 7a.
[00314] A expressão de LAG-3, TIM-3 e DP-1 (receptores co-inibidores de potencial importância no tratamento de câncer) também foi avaliada por citometria de fluxo nas células CAR-T transduzidas que expressam as proteínas da presente invenção que compreendem: um Domínio ASS-1; um domínio OTC; ou um domínio ASS-1 e domínio OTC.
Exemplos de células CAR-T anti-GD2, anti-CD33, anti-MESO, e anti-EGFRvIII mostrados na Figura 7, painel B.
8 Atividade citocida de células que expressam um domínio de direcionamento a CD33
[00315] As células CAR-T da invenção foram produzidas por expressão de proteínas da invenção compreendendo um domínio de direcionamento a CD33 em combinação com um domínio ASS-1, um domínio OTC ou um domínio ASS-1 e OTC. As células T CAR foram cultivadas na presença de células de leucemia K562 em diferentes proporções efetor-alvo por 4 horas. Todas os construtos de células CAR-T matam especificamente células de leucemia efetivamente (70-90%). A transdução de células CAR T CD33 com as proteínas da invenção não afeta negativamente a citotoxicidade das células T CAR, mostradas na Figura 8. A capacidade das células que compreendem proteínas da invenção para manter a atividade citocida, além de demonstrar persistência aumentada e a proliferação, como mostrado no restante dos exemplos, ilustra sua utilidade terapêutica.
9 As modificações enzimáticas conferem uma vantagem metabólica e proliferativa significativa em condições tumorais com baixa arginina.
[00316] As células foram transduzidas para expressar uma das seguintes proteínas da invenção:
[00317] Proteína que compreende um domínio de ligação a GD2 e um domínio ASS-1
[00318] Proteína que compreende um domínio de ligação a GD2 e um domínio OTC
[00319] Proteína que compreende um domínio de ligação a GD2 e um domínio ASS-1 e OTC
[00320] Proteína que compreende um domínio de ligação a CD33 e um domínio ASS-1
[00321] Proteína que compreende um domínio de ligação a CD33 e um domínio OTC
[00322] Proteína que compreende um domínio de ligação a CD33 e um domínio ASS-1 e OTC
[00323] Proteína que compreende um domínio de ligação à mesotelina e um domínio ASS-1
[00324] Proteína que compreende um domínio de ligação à mesotelina e um domínio OTC
[00325] Proteína que compreende um domínio de ligação à mesotelina e um domínio ASS-1 e OTC
[00326] Proteína que compreende um domínio de ligação a EGFRvIII e um domínio ASS-1
[00327] Proteína que compreende um domínio de ligação a EGFRvIII e um domínio OTC
[00328] Proteína que compreende um domínio de ligação ao EGFRvIII e um domínio ASS-1 e OTC
[00329] Eles foram cultivados em condições de baixa arginina (75% de meio depletado de arginina completo).
Células CAR-T não modificadas partilhado os mesmos domínios de ligação (isto é, anti-GD2, anti-CD33, anti-mesotelina, ou anti EGFRvIII), mas sem os domínios de enzimas, foram utilizadas como controle. A proliferação de todas as células foi medida por citometria de fluxo após 96 horas.
[00330] No caso de células anti-GD2, a adição de um domínio ASS-1, um domínio OTC ou domínio ASS-1 e OTC aumentou significativamente a proliferação de células CAR-T em comparação com as células CAR-T de controle não modificadas. De fato, as células T CAR GD2-OTC demonstram um aumento de 5 vezes na proliferação em comparação com a célula de controle apenas GD2. Além disso, as células T CAR GD2-ASS/OTC demonstram um aumento de 10 vezes na proliferação em comparação com o controle de células T CAR- GD2 somente. Mostrado na Figura 9 do painel A.
[00331] No caso de células CAR-T CD33, a adição de um domínio ASS-1, um domínio OTC ou domínio ASS-1 e OTC aumentou significativamente a proliferação de células CAR-T em comparação com as células CAR-T de controle não modificadas. As células CAR-T CD33-OTC demonstram aproximadamente um aumento de 5 vezes em proliferação em comparação com célula de controle CD33-somente. Além disso, as células T CAR CD33-ASS/OTC demonstram um aumento de 6 vezes na proliferação em comparação com o controle de células T CAR-somente GD2. Mostrado na Figura 9 do painel B.
[00332] Para células CAR-T anti-mesotelina, a adição de um domínio ASS-1, um domínio OTC ou um domínio ASS-1 e OTC aumentou significativamente a proliferação de células CAR-T em comparação com as células CAR-T de controle não modificadas. As células T CAR mesotelina-OTC demonstram um aumento de aproximadamente 4 vezes de proliferação em comparação com célula de controle apenas-CD33. Além disso, as células T CAR mesotelina-ASS/OTC demonstram um aumento de proliferação de aproximadamente 3,5 vezes em comparação com células T de controle mesotelina-apenas. Mostrado na Figura 9 do painel C.
[00333] Em células CAR-T anti- EGFRvIII, a adição de um domínio ASS-1 aumentou significativamente a proliferação em aproximadamente 2,5 vezes em comparação com as células CAR-T de controle não modificadas, mostradas na Figura 9 do painel D.
10 As modificações enzimáticas conferem uma vantagem metabólica e proliferativa significativa no meio condicionado pelo tumor (TCM).
[00334] Células expressando proteínas da invenção que compreendem uma porção de ligação ao GD2 em combinação com: um domínio ASS-1, um domínio de OTC, ou um ASS-1 e o domínio de OTC, foram cultivadas em meios condicionado de tumor de neuroblastoma. Tais meios têm condições baixas de arginina, devido à ação das células tumorais. Células CAR-T anti-GD2 sem domínios enzimáticos foram utilizadas como células de controle.
[00335] A proliferação das células cultivadas foi medida por citometria de fluxo após 96 horas. A adição de uma proteína da invenção compreendendo um domínio ASS-1 aumentou significativamente a proliferação de células T CAR em comparação com as células CAR-T de controle não modificadas, como mostrado na Figura 10, painel A.
[00336] Células expressando proteínas da invenção que compreendem uma porção de ligação a CD33, em combinação com: um domínio ASS-1, um domínio de OTC, ou um domínio ASS-1 e OTC, foram cultivadas em meios condicionado de tumor em leucemia (que também contém níveis baixos de arginina). Neste caso, células CAR-T anti-CD33 sem domínios enzimáticos foram utilizadas como células de controle, e a proliferação celular foi (novamente) medida por citometria de fluxo após 96 horas.
[00337] A adição de uma proteína da invenção compreendendo um domínio ASS-1, domínio OTC ou um domínio ASS-1 e OTC aumentou significativamente a proliferação de células CAR-T em comparação com as células CAR-T de controle não modificadas. As células CAR T CD33 que compreendem um domínio de OTC demonstram um aumento de aproximadamente 4 vezes na proliferação. As células T CAR CD33 compreendendo um domínio ASS-1 e OTC demonstram aproximadamente um aumento de 3,5 vezes na proliferação em comparação com a célula T CAR decontrole não modificada.
Estes resultados são mostrados na Figura 10, painel B.
11 A modificação enzimática aumenta significativamente a atividade antitumoral in vivo
[00338] As células de leucemia mieloide aguda HL-60 (AML) foram enxertadas em camundongos NOG-SCID. Os camundongos portadores de leucemia foram tratados com as células que expressam as proteínas da invenção, compreendendo uma porção de ligação a CD33 e ou: um domínio ASS-1, um domínio OTC, ou um domínio ASS-1 e um domínio de OTC. As células CAR-T anti-CD33 sem um domínio enzimático (células CAR-T não modificadas) foram usadas como controle.
As células da invenção ou de controle foram administradas por via intravenosa a uma dose de 5x106 células.
[00339] Como mostrado na Figura 11, as células CAR-T que expressam uma proteína da invenção compreendendo um domínio ASS-1 (células CAR-T anti-CD33-ASS-1) aumentaram significativamente a depuração de LMA da medula óssea, em comparação com células CAR-T de controle.
12 A modificação enzimática das células T CART GD2 aumenta significativamente a atividade antitumoral in vivo
[00340] Os camundongos xenoenxertados com neuroblastoma foram tratados com células que expressam uma proteína da invenção compreendendo uma porção de ligação a GD2 e um domínio ASS-1. Os animais de controle receberam células CAR-T GD2 (sem um domínio ASS-1) ou nenhum tratamento com CAR-T. Os baços de todos os animais foram colhidos e extraídos leucócitos caracterizados por citometria de fluxo. Os resultados são mostrados no Painel A da Figura 12 e ilustram que os números de células foram marcadamente aumentados para as células da invenção, em comparação com as células de controle. Isto indica que as células da invenção (expressando uma proteína da invenção compreendendo um domínio ASS-1) têm persistência melhorada nos baços dos camundongos tratados, em comparação com os controles.
[00341] Os leucócitos extraídos também foram co- cultivados com células alvo de neuroblastoma (linha celular IMR32 ou células tumorais) ex vivo para investigar a capacidade das células da invenção que persistiram no receptor de sofrer expansão em resposta à estimulação do antígeno. Os resultados são mostrados no Painel B da Figura
12. Pode ser visto que o número de células da invenção é significativamente maior que o dos controles. Isso indica que as células t persistentes da invenção mantêm uma capacidade de proliferar em resposta à estimulação de antígeno que é maior que a dos controles.
13 A modificação enzimática das células T CART CD33 aumenta significativamente a atividade antitumoral in vivo
[00342] Camundongos xenoenxertados com AML foram tratados com células que expressam uma proteína da invenção compreendendo uma fração de ligação a CD33 e um de: um domínio ASS-1, um domínio OTC; ou um domínio ASS-1 e um domínio OTC. Os grupos de controle receberam células CAR-T CD33 (sem um domínio enzimático-mostrado como "enzima") ou nenhum tratamento com CAR-T. Os baços de todos os animais foram colhidos e os leucócitos extraídos foram caracterizados por citometria de fluxo. Os resultados, mostrados no Painel A da Figura 1 3, ilustram que os números de células foram marcadamente aumentados para as células da invenção, em comparação com as células de controle. Isto indica que as células da invenção também têm persistência melhorada nos baços dos camundongos tratados (em comparação com os controles) no contexto da LMA.
[00343] Os leucócitos extraídos também foram co- cultivados com células alvo de AML ex vivo para investigar a capacidade das células da invenção que persistiram no receptor de sofrer expansão em resposta à estimulação do antígeno. Os resultados são mostrados no Painel B da Figura
13. O número de células da invenção é significativamente maior que o dos controles, particularmente no caso das células que expressam uma proteína da invenção com o domínio e ASS-1. Esses resultados indicam que as células da invenção que persistem dentro do receptor retêm a capacidade de proliferar em resposta à estimulação com antégeno que é maior do que as células de controle.
Protocolos para a produção de células da invenção
[00344] As células da invenção foram produzidas com sucesso por abordagens de transdução retroviral e lentiviral. Detalhes de um protocolo exemplificativo para a produção retroviral de células da invenção são apresentados abaixo.
Transdução retroviral de células T humanas
[00345] O que se segue fornece um protocolo para a produção de células da invenção por transfecção com ácidos nucleicos da invenção.
Dia -2: Descongelamento de células Phoenix Ampho
[00346] No final da tarde, tire as células Phoenix Ampho (linha celular de empacotamento retroviral para transdução de células humanas) de -80 e coloque-as em cultura. As células Phoenix Ampho são cultivadas em DMEM com 10% de FCS, 1% de glutamina (sem antibióticos). As células Phoenix Ampho nunca devem atingir a confluência.
Colocar tipicamente 2-3x106 células Phoenix Ampho em cada frasco T150 em 30 ml de meio. No dia 0, você deve ter cerca de 30-40x106 células Phoenix Ampho.
Dia 1: configurar as células Phoenix Ampho
[00347] Tripsinize as células Phoenix ampho utilizando TryLE e coloque as células Phoenix ampho a 8 x 106 células/frasco em 30 ml de DMEM com 10% de FCS e 1% de L-glutamina (sem antibióticos) (volume para frasco T150, dimensione como apropriado). Incube as células durante a noite (37o C/5% de CO2).
Dia 2: Transfecção das células Phoenix ampho
[00348] As células Phoenix Ampho devem estar 50-80% confluentes no dia da transfecção. As células devem ser transfectadas pelo método a seguir (para um frasco T150, dimensione conforme apropriado se estiver usando balões diferentes).
[00349] Para cada frasco T150 de células Phoenix, coloque 12 ug de DNA de plasmídeo (isto é, o plasmídeo CAR) + 12 ug de plasmídeo pCl ampho em um falcon de 15 ml e complete o volume de 1800μl com OptiMEM (Gibco) misturando suavemente com uma pipeta. Para outro falcon de 15 ml, adicione 1680μl de OptiMEM e adicione 120μl de reagente de transfecção Fugene 6 (disponível em lojas), garantindo que o Fugene entre diretamente no OptiMEM em vez de grudar nas laterais do tubo; misture delicadamente com uma pipeta. Em seguida, adicione 1800 µl de mistura OptiMEM/fugene aos tubos que contêm o DNA do plasmídeo e misture delicadamente com uma pipeta. Incubar à temperatura ambiente por 45 minutos. Isso permite que o fugene forme complexos com o
DNA com carga neutra, permitindo que o DNA seja transportado através da membrana celular das Phoenix Ampho com carga negativa.
[00350] Substitua muito suavemente o meio nas células Phoenix Ampno por 9 ml de DMEM fresco com 10% de FCS e glutamina e, em seguida, sobreponha imediatamente os complexos de DNA/fugene ou OptiMEM (para controles simulados) nas células. Misture delicadamente com os movimentos norte-sul e leste-oeste da placa.
[00351] Incube as células durante 24 horas (37 o C/5% de CO2) Dia 2: Ativação das células T
[00352] As células T não se expandirão nas primeiras 48 horas após a ativação, portanto, normalmente ative quantas células T você precisar (ou mais em caso de morte celular) para sua transdução.
Método usando anticorpos anti-CD3/CD28:
[00353] Preparar Lymphoprep de um tubo (cone) de leucócitos frescos.
[00354] Contar as células e cultura a 1x106/ml em meio de célula T (soro humano a 1%, FCS a 10%, P/S, RPMI L- glut). Tipicamente 200 ml por frasco T150.
[00355] Adicionar IL-2 a 300U/ml, adicionar OKT3 (anti-CD3) a 30ng/ml, adicionar mAB anti-CD28 a 30ng/ml (# MAB342-SP, R&D).
[00356] Incubar a 37oC/5% de CO2 por 48 horas.
Método usando dynabeads anti-CD3/CD28: a. Preparar Lymphoprep de um tubo (cone) fresco.
Conte as células e assuma que 50% dos PBMCs são células T CD3+.
b. Ressuspender as células em um falcon de 15 ml a 10x106 de células T CD3+ por ml de soro humano a 5%, PBS.
c. Adicione dois Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 por célula CD3+. Dynabeads de lavagem: colocar o frasco em vortex de esferas (beads) por 30s. Remova o volume necessário de esferas (beads) e coloque em um falcon de 15 ml. Adicione 1 ml de PBS estéril e misture bem com uma pipeta. Coloque o falcon no dynabead magent – os dynabeads grudarão na borda do falcon. Remova com cuidado o sobrenadante sem perturbar as esferas (beads). Retire o falcon do ímã e repita a etapa de lavagem. Adicione dynabeads às células T em um pequeno volume de PBS.
d. Incubar as células T em um copo em temperatura ambiente por pelo menos uma hora. As células T irão ligar as dynabeads durante esta etapa, permitindo a seleção de células T CD3+ e a ativação ao mesmo tempo.
e. Coloque as células no ímã do dynabead para remover as células não ligadas. Contar células e cultura a 1x106/ml em meio de célula T (soro humano a 1%, FCS a 10%, P/S, RPMI com excesso de L) com IL-2 300U/ml f. Incubar a 37oC/5% de CO2 por 48 horas.
Dia 3 : Alterar o meio Phoenix Ampho
[00357] As células ampho Phoenix agora produzirão retrovírus contendo seu DNA plasmídico, portanto, leve isso em consideração ao manusear células/sobrenadantes. Coloque uma bolsa de autoclave dentro do capô do seu TC e coloque qualquer plástico contaminado com retrovírus (células/sups) dentro dele. Quando terminar, feche o saco da autoclave e coloque-o em uma lata de autoclave. Coloque qualquer resíduo líquido em uma panela e sele. Leve o lixo contaminado com retrovírus para a lavagem o mais rápido possível.
[00358] Substitua cuidadosamente o meio nas células Phoenix Ampho por 21 ml/balão (volume para o frasco T150, dimensione conforme apropriado) de DMEM + 10% de FCS + 2 mM de L-glutamina (sem antibióticos). Incube as células por mais 24 horas.
[00359] Dia 4: Transdução de células T humanas
[00360] Adicione 2 ml de retronectina (30μg/ml) (# T100B-Fragmento de Fibronectina Humana Recombinante Takara RetroNectin ®) a cada um dos números necessários de poços de uma placa de 6 poços (não tratados com cultura de tecidos) e incube à temperatura ambiente por 3 horas (também pode ser montado no dia anterior e revestido durante a noite na geladeira). Lembre-se de incluir poços para controles transfectados por simulação no experimento.
As placas de cultura são revestidas em retronectina para co-localizar células T e partículas de vírus para permitir a transdução eficiente das células
[00361] Remova a retronectina (pode ser reutilizada até acabar) e bloqueie os poços com 2,5 ml de PBS estéril/2% BSA/poço por 30 minutos. Remova a solução de bloqueio e lave os poços duas vezes com 2,5 ml de PBS estéril (mantenha a última lavagem com PBS no poço até que esteja pronto para adicionar vírus).
[00362] Pré-aqueça meio de célula T.
[00363] Pré-aqueça a centrífuga para spinfection por movimento giratório com baldes vazios a 3160rpm/2000g durante 60 min à 32 oC. Isso pode ser interrompido quando estiver pronto para fazer spinfection.
[00364] Colha o sobrenadante da cultura contendo retrovírus das células Phoenix Ampho e inicie os giros (1500 rpm por 5 minutos). Transfira o retrovírus para tubos novos. Algumas pessoas filtram seus retrovírus usando um filtro de 0,45 µm, para remover as células Phoenix ampho comtaminantes, mas isso pode diminuir o título retroviral.
Se necessário, o vírus pode ser congelado rapidamente em pasta de gelo seco/etanol e armazenado a -80oC, mas o título é dividido pela metade a cada descongelamento.
[00365] Spinfection: Adicione 2 ml/poço de sobrenadante de vírus (ou simulação de sobrenadante) para poços revestidos com retronectina e gire a 3160rpm/2000g durante 2 horas à 32o C.
[00366] 45 minutos antes do término dessa rotação, prepare as células T a serem transduzidas. Colete as células T e conte. Ressuspenda as células T a 1x106 em meio de células T + IL-2 (100 U/ml) e incube (37 o C/5% de CO2) durante 15-20 minutos para permitir que as células se recuperem da centrifugação.
[00367] Quando o vírus terminar de girar, remova os sobrenadantes e lave os poços uma vez com PBS (2,5 ml/poço).
[00368] Remova o PBS da placa revestida com vírus/retronectina e adicione células T que serão transduzidas (2 ml/poço). Garanta que as células estejam distribuídas uniformemente sobre a placa balançando para o norte:sul e leste:oeste. Gire as placas a 1300 rpm por 5 minutos.
[00369] Coloque as placas na incubadora (37o C/5% de CO2).
Dia 5: Alimente células T transduzidas
[00370] Adicione outros 6 ml de meio de células T + IL-2 (100 UI/mL) a cada poço de células T e retorne a incubadora (37o C/5% de CO2).
Determinando a eficiência da transdução do CAR
[00371] A eficiência dos métodos para a transdução de células para produzir células da invenção pode ser determinada usando o procedimento a seguir.
[00372] A eficiência da transdução de células T CAR é determinada 4 dias após a infecção. Colha amostras de poços simulados e de células T CAR e core da seguinte maneira:
[00373] Lavar x1 com tampão FACs (10% FCS, PBS)
[00374] Corar com CD34-APC (1 µl/amostra), CD4-FITC (2 µl/amostra) e CD8-PE (1 µl/amostra) em 50 µl de tampão FACs
[00375] Incubar por 20 minutos no gelo
[00376] Lavar x1 com tampão FACS
[00377] Ressuspender as células em 200 µl de tampão FACs e analisar por citometria de fluxo (LSRII).
Classificação de células da invenção (como células T CAR) por classificação de células ativadas magneticamente por CD34
[00378] As células transduzidas por CAR (como células T) são classificadas da seguinte forma: a. gire as células T a 1500rpm, 5 minutos e despeje o sobrenadante.
b. Ressuspenda as células em 10 ml de tampão MACS frio e gire a 1500rpm, por 5 minutos e verta o sobrenadante.
c. Ressuspenda as células em 300 µl de tampão MACS frio, adicione 100 µl de agente bloqueador FcR e 100 µl de microesferas CD34 (Miltenyi Biotech 130-046-702). Essas quantidades são adequadas para até 108 células - se mais do que isso, dimensione de acordo.
d. Misture bem e incube por 30 minutos na geladeira (2-8 oC).
e. Lave em 50 ml de tampão MACS frio e gire a 1500 rpm, por 5 minutos e despeje o sobrenadante.
f. Ressuspenda as células em 500 µl de tampão MACS frio e carregue a suspensão de células em uma coluna MS que foi pré-lavada com 500 µl de tampão MACS frio.
g. Permita que as células gotejem pelo fluxo de gravidade e lave as colunas 3 vezes com 500 µl de tampão MACS frio.
h. Remova as colunas do ímã e lave com 1 ml de tampão MACS frio, coletando as células em um tubo estéril.
i. Centrífugue as células CAR T separadas e ressuspenda em meio de células T normais (soro humano a 1%, FBS a 10%, P/S, L-glut, 100 U/ml de IL-2, RPMI 1640) a uma concentração de 1x106 células CAR T por ml.
j. Verifique a pureza das células T CAR por coloração com anticorpo de superfície CD34 no dia seguinte.
Ensaio para determinar a atividade da enzima Arginosuccinato sintase (ASS-1) ou Arginosuccinato sintetase (ArgG)- Depleção de L-Citrulina
[00379] Faça um pellet com 5x10 6 células por amostra (se tiver número suficiente de células, faça um pellet adicional de 5x106 células para um controle sem substrato).
[00380] Ressuspenda em 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1% (Triton-X a 0,1% é armazenado em um tubo de 50ml a 4 ° C em laboratório molecular) e incube em gelo por 20 minutos com vórtice ocasional.
[00381] Centrifugue as amostras a 13.000 rpm por 20 minutos a 4 °C para agrupar resíduos de células.
[00382] Tome 20μl de lisado celular em eppendorfs frescos e mantenha no gelo.
[00383] Pegue um eppendorf fresco para cada amostra e adicione 10 μl de L-citrulina (4 mM, pH 7,5), 10 μl de ácido L-aspártico (4 mM, pH 7,5), 10 μl de MgCl 2 (6 mM), 10 μl de ATP (4 mM, pH 7,5), 40μl de Tris-HCl (20mM) e 20μl de lisado celular.
[00384] Para um controle sem enzimas, adicione 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1% em vez de lisado celular.
[00385] Se não houver controles sem substrato, não adicione os substrato de ASS-1 ou ArgG, isto é, L-citrulina e ácido L-aspártico. Em vez disso, complete o volume final de 100μl com Tris-HCl (20mM).
[00386] Incube as amostras a 37 °C por 1,5 horas.
Ocorrerá reação da enzima ASS-1 ou ArgG.
[00387] Estabeleça os padrões de L-citrulina, criando uma solução de L-citrulina 1 mM, executando uma diluição de 1:4 da solução de L-citrulina 4 mM. Para eppendorfs, adicione 10, 20, 30, 50, 80 e 100μl de L- citrulina (1mM) e faça com que cada padrão atinja 100μl com água destilada estéril. Isso faz com que as concentrações de L-citrulina sejam de 0, 10, 20, 30, 50, 80 e 100nM.
Inclua um controle em branco.
[00388] Para cada padrão, adicione 10 μl de ácido L- aspártico (4mM, pH 7,5), 10 μl de MgCl2 (6mM), 10 μl de ATP (4mM, pH 7,5) e 20 μl de 0,1% de Triton-X + inibidores da protease. Os reagentes da enzima ASS-1 ou ArgG são adicionados aos padrões para determinar com maior precisão as concentrações de L-citrulina nas amostras de atividade da enzima ASS-1 ou ArgG.
[00389] Após 1,5 horas a 37 °C, adicione 80 μl de solução de parada (mistura 3:1 de ácido fosfórico e ácido sulfúrico, respectivamente) e 20 μl de 3% de 2,3- butanodiona monoxima (fresco no dia com água destilada estéril e em uma capela porque cheira muito mal) para cada amostra e padrão.
[00390] Misture os tubos por vórtice e centrífuga de pulso. Incube todas as amostras e padrões a 95 °C por 30 minutos. Uma cor amarela/laranja aparecerá quando 2,3 butanodiona monoxima reagir com L-citrulina em condições ácidas a 95 °C.
[00391] Centrifugue os tubos a 13000 rpm por 1 minuto para agrupar todos os detritos. Em duplicado, adicione 50μl de sobrenadante aos poços de uma placa de fundo plano de 96 poços.
[00392] Leia a absorvância a 490 nm usando o leitor de absorvância de microplacas.
Ensaio para determinar o ensaio de atividade enzimática da ornitina transcarbamilase (OTC) ou ornitina carbamoiltransferase (ArgF)- Produção de L-citrulina
[00393] agrupe 5x106 células por amostra (se tiver número suficiente de células agrupe adicionalmente 5x106 células para um controle sem substrato).
[00394] Ressuspenda em 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1% (Triton-X a 0,1% é armazenado em um tubo de 50ml a 4 °C em laboratório molecular) e incubar em gelo por 20 minutos com vórtice ocasional.
[00395] Centrifugue as amostras a 13.000 rpm por 20 minutos a 4 °C para agrupar resíduos de células.
[00396] Tome 20μl de lisado celular em eppendorfs frescos e mantenha no gelo.
[00397] Pegue um eppendorf fresco para cada amostra e adicione 25 μL de L-Ornitina (50 mM, pH 8,0), 25 μ de trietanolamina (pipeta diretamente da garrafa, a solução é muito viscosa, então pipete lentamente), 25 μL de fosfato de carbamil preparado na hora (150 mM, pH 8.0) e 10 ul de SDW.
[00398] Em seguida, adicione 20 µL de lisado celular a cada tubo. Para um controle sem enzimas, adicione 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1% em vez de lisado celular.
[00399] Se não houver controles de substrato, não adicione os substratos de OTC ou ArgF, isto é, L-Ornitina e Carbamil Fosfato. Em vez disso, complete o volume final de 100μl com SDW.
[00400] Incube as amostras a 37 °C por 1,5 horas.
Ocorrerá reação enzimática OTC ou ArgF.
[00401] Estabeleça os padrões de L-citrulina, fazendo uma solução de 1mM de L-citrulina, realizando uma diluição 1:4 de uma solução de 4mM de L-citrulina (estoques em -20 usados para o teste de atividade da enzima ASS-1).
Para eppendorfs, adicione 10, 20, 30, 50, 80 e 100μl de L- citrulina (1mM) e faça com que cada padrão atinja 100μl com água destilada estéril. Isso faz com que as concentrações de L-citrulina sejam de 0, 10, 20, 30, 50, 80 e 100nM.
Inclua um controle em branco.
[00402] A cada padrão, adicione 25 μL de L-Ornitina (50 mM), 25 μ de trietanolamina, 25 μL de fosfato de carbamil recém-preparado (150 mM) e 20 μl de 0,1% Triton-x + inibidores de protease. Os reagentes enzimáticos OTC são adicionados aos padrões para determinar com maior precisão as concentrações de L-citrulina nas amostras de atividade enzimática OTC ou ArgF.
[00403] Após 1,5 horas a 37 °C, adicione 80 μl de solução de parada (mistura 3:1 de ácido fosfórico e ácido sulfúrico, respectivamente) e 20 μl de 3% de 2,3 butanodiona monoxima (fresco no dia com água destilada estéril e em uma capela porque cheira muito mal) para cada amostra e padrão.
[00404] Misture os tubos por vórtice e centrífuga de pulso. Incube todas as amostras e padrões a 95 °C por 30 minutos. Uma cor amarela/laranja aparecerá quando 2,3 butanodiona monoxima reagir com L-citrulina em condições ácidas a 95°C.
[00405] Centrifugue os tubos a 13000 rpm por 1 minuto para agrupar todos os detritos. Em duplicado, adicione 50μl de sobrenadante aos poços de uma placa de fundo plano de 96 poços.
[00406] Leia a absorvância a 490 nm usando o leitor de absorvância de microplacas.
Ensaio para determinar a atividade da enzima argininosuccinato lisase (ASL) ou (ArgH)-produção de L- fumarato ou produção de arginina
[00407] Agrupe 5x106 células por amostra (se tiver número suficiente de células sedimentar a adição de 5x10 6 células para um controlo sem substrato).
[00408] Ressuspenda em 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1% (Triton-X a 0,1% é armazenado em um tubo de 50ml a 4 ° C em laboratório molecular) e incubar em gelo por 20 minutos com vórtice ocasional.
[00409] Centrifugue as amostras a 13.000 rpm por 20 minutos a 4 °C para agrupar resíduos de células.
[00410] Tome 20μl de lisado celular em eppendorfs frescos e mantenha no gelo.
[00411] Tome um novo tubo eppendorf para cada amostra e adicione 25 μL de ácido L-argininosuccinóico (11,7 mm), e 55 μL de PBS
[00412] Em seguida, adicione 20 µL de lisado celular a cada tubo. Para um controle sem enzimas, adicione 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1% em vez de lisado celular.
[00413] Se não houver controle de substrato, não adicione o substrato ASL ou ArgH, isto é, ácido L- argininosuccinóico. Em vez disso, complete o volume final de 100μl com SDW.
[00414] Incube as amostras a 37 °C por 1,5 horas.
Ocorrerá reação enzimática de ASL ou ArgH.
[00415] Faça padrões de L-fumarato, fazendo uma solução de 1mM de L-fumarato, realizando uma diluição 1:4 de uma solução de 4mM de L-fumarato. Para eppendorfs, adicione 10, 20, 30, 50, 80 e 100μl de L-fumarato (1mM) e faça com que cada padrão atinja 100μl com água destilada estéril. Isso faz com que as concentrações de L-fumarato sejam de 0, 10, 20, 30, 50, 80 e 100nM. Inclua um controle em branco.
[00416] A cada padrão, adicione 25 μL de ácido L- argininosuccinóico (11,7 mM) e 20 μl de Triton-X + 0,1% de inibidores da protease. Os reagentes enzimáticos de ASL são adicionados aos padrões para determinar com mais precisão as concentrações de L-fumarato nas amostras de atividade enzimática de ASL ou ArgH.
[00417] Após 1,5 horas a 37 °C, centrifugue os tubos a 13000 rpm por 1 minuto para agrupar todos os detritos. Em duplicado, adicione 50μl de sobrenadante aos poços de uma placa de fundo plano de 96 poços.
[00418] Leia a absorvância a 2400 nm usando o leitor de absorvância de microplacas.
[00419] A produção de arginina também pode ser medida na Etapa 11 acima, usando HPLC ou ELISA de arginina de acordo com as instruções do fabricante. Para a medição das concentrações de sobrenadante celular, o protocolo acima pode ser modificado de acordo, usando 100 µL de sobrenadante celular em vez de lisado celular.
Ensaio para determinar a atividade da enzima triptofano sintase (Trp5) - Depleção de indol ou produção de triptofano
[00420] Agrupe 5x106 células por amostra (se tiver número suficiente de células agrupe 5x106 células adicionais para um controle sem substrato).
[00421] Ressuspenda em 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1% (Triton-X a 0,1% é armazenado em um tubo de 50ml a 4 ° C em laboratório molecular) e incube em gelo por 20 minutos com vórtice ocasional.
[00422] Centrifugue as amostras a 13.000 rpm por 20 minutos a 4 °C para agrupar resíduos de células.
[00423] Tome 20 μl de lisado celular em eppendorfs frescos e mantenha no gelo. μL
[00424] Tomar um Eppendorf fresco para cada amostra e adicionar 80 μL solução de Indol (0,005 M), 400 μL solução de DL-serina (0,2 M), 100 μL solução de fosfato de piridoxal, 20 μL glutationa (0,05 M), e 120 μL de tampão de fosfato (0,5 M, pH 7,8), 260 μL de água.
[00425] Em seguida, adicione 20 µL de lisado celular a cada tubo. Para um controle sem enzimas, adicione 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1% em vez de lisado celular.
[00426] Se não houver controles de substrato, não adicione o substrato Trp5, isto é, soluções de indol e serina. Em vez disso, complete o volume final de 1000μl com SDW.
[00427] Incubar as amostras a 37 °C por 1,5 horas. A reação da enzima Trp5 ocorrerá.
[00428] Faça os padrões de indol criando uma solução de indol de 1 mM executando uma diluição de 1:4 de uma solução de L-fumarato de 4 mM. Para eppendorfs, adicione 10, 20, 30, 50, 80 e 100μl de Indol (1mM) e faça com que cada padrão atinja 1000μl com água destilada estéril. Isso produz concentrações de indol de 0, 10, 20, 30, 50, 80 e 100nM. Inclua um controle em branco. Para cada padrão, adicione 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1%.
[00429] Após 1,5 horas a 37 °C, adicione 200μl de NaOH a 5%. Adicione 4 ml de tolueno em cada tubo e centrifugue para separar a solução em 2 camadas.
[00430] Pipete até 1 ml da camada de tolueno em tubos de ensaio separados. Adicione 4 ml de etanol e 2 ml de solução de p-dimetilaminobenzaldeído (faça o seguinte: 36g dissolvidos em 500 ml de etanol. Adicione 180 ml de Hcl concentrado. Quando esfriar, complete o volume a 1 L com etanol). Permita que a mudança de cor ocorra por 60 minutos.
[00431] Leia a absorvância a 550 nm usando o leitor de absorvância de microplacas.
[00432] A produção de triptofano também pode ser medida na Etapa 10 acima, usando HPLC ou ELISA de triptofano, de acordo com as instruções do fabricante. Para a medição das concentrações de sobrenadante celular, o protocolo acima pode ser modificado de acordo, usando 100 µL de sobrenadante celular em vez de lisado celular.
Ensaio para determinar o ensaio de atividade enzimática da indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) - produção de quinurenina
[00433] agrupe 5x106 células por amostra (se tiver número suficiente de células agrupe 5x106 células adicionais para um controle sem substrato).
[00434] Ressuspender em 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1% (Triton-X a 0,1% é armazenado em um tubo de 50ml a 4 ° C em laboratório molecular) e incubar em gelo por 20 minutos com vórtice ocasional.
[00435] Centrifugue as amostras a 13.000 rpm por 20 minutos a 4 °C para agrupar resíduos de células.
[00436] Tome 20μl de lisado celular em eppendorfs frescos e mantenha no gelo.
[00437] Pegue um Eppendorf fresco para cada amostra e adicione 50 μl de ácido tricloroacético (30%) aos lisados celulares. Agite no vórtex e centrifugue a 10.000 rpm por 5 minutos.
[00438] Recolha os sobrenadantes e adicione a volumes iguais de reagente de Ehrlich (100 mg de P-
dimetilbenzaldeído, 5 ml de ácido acético).
[00439] Estabeleça os padrões de cinurenina, criando uma solução de cinurenina a 1 mM, realizando uma diluição de 1:4 de uma solução de cinurenina 4 mM. Para eppendorfs, adicione 10, 20, 30, 50, 80 e 100μl de quinurenina (1mM) e faça com que cada padrão atinja 1000μl com água destilada estéril. Isso faz com que as concentrações de cinurenina sejam de 0, 10, 20, 30, 50, 80 e 100nM. Inclua um controle em branco. Para cada padrão, adicione 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1%.
[00440] Leia a absorvância a 492nm usando o leitor de absorvância de microplacas.
[00441] A produção de cinurenina também pode ser medida na Etapa 4 acima, usando HPLC ou ELISA de cinurenina, de acordo com as instruções do fabricante. Para a medição das concentrações de sobrenadante celular, o protocolo acima pode ser modificado de acordo, usando 100 µL de sobrenadante celular em vez de lisado celular.
Ensaio para determinar a atividade enzimática da ornitina descarboxilase (ODC1 ) -Produção de poliamina
[00442] agrupe 5x106 células por amostra (se tiver número suficiente de células agrupe 5x106 células adicionais para um controle sem substrato).
[00443] Ressuspenda em 20μl de Triton-X + inibidores de protease a 0,1% (Triton-X a 0,1% é armazenado em um tubo de 50ml a 4 °C em laboratório molecular) e incubar em gelo por 20 minutos com vórtice ocasional.
[00444] Centrifugue as amostras a 13.000 rpm por 20 minutos a 4 °C para agrupar resíduos de células.
[00445] Tome 20μl de lisado celular em eppendorfs frescos e mantenha no gelo.
[00446] A produção de poliamina é medida usando HPLC ou ELISA de poliamina de acordo com as instruções do fabricante. Para a medição das concentrações de sobrenadante celular, o protocolo acima pode ser modificado de acordo, usando 100 µL de sobrenadante celular em vez de lisado celular.
INFORMAÇÃO DE SEQUÊNCIA ID de Sequência NO: 1 - Sequência de aminoácidos do domínio enzimático ASS-1 exemplificativa
MSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKV FIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGA TGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKN PWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVT NVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHL DIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVL
KGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK ID de Sequência NO: 2 - Sequência de aminoácidos do domínio enzimático OTC exemplificativa
MLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWL SADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHL GVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYL TLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQY AKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAA
SDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF ID de Sequência NO: 3 - Sequência de aminoácidos da porção de ligação ao alvo de GD2 exemplificativa
DILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELKRADAA PTVSIFPGSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGK SLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEY
WGQGTSVTVSSAKTTPPSVYGRVTVSS ID de Sequência NO: 4 - Sequência de aminoácidos da porção de ligação ao alvo de CD33 exemplificativa
GSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWA STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRGGG GSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEW VGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFD
VWGAGTTVTVSS ID de Sequência NO: 5 - Sequência de aminoácidos da porção de ligação ao alvo de mesotelina exemplificativa
MQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGAS SYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTV SSGVGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTS PKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPLTFGAGT
KLEIK ID de Sequência NO: 6 - Sequência de aminoácidos da porção de ligação ao alvo de EGFRVIII exemplificativa
QVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTY YSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTV SSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGE
PPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDY ID de Sequência NO: 7 - Sequência de aminoácidos da região de sinalização intracelular 4-1BB exemplificativa
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL ID de Sequência NO: 8 - Sequência de aminoácidos da região de sinalização intracelular OX-40 exemplificativa
RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI ID de Sequência NO: 9 - Sequência de aminoácidos da região de sinalização intracelular CD28 com domínio transmembranar exemplificativa
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTV
AFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS ID de Sequência NO: 10 - Sequência de aminoácidos da região de sinalização intracelular de ICOS exemplificativa
CWLTKKKYS SSVHDPNGEY MFMRAVNTAK KSRLTDVTL (a porção citoplasmática de ICOS, compreendendo os resíduos 162-199 da proteína de comprimento total.
O motivo YMFM (resíduos 180-183 da proteína completa) é de particular relevância e deve ser mantido em uma região de sinalização intracelular do ICOS adequada para uso em uma proteína da invenção) ID de Sequência NO: 11 - Sequência de aminoácidos da região de sinalização intracelular de CD3ζ exemplificativa
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY
NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR ID de Sequência NO: 12 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção GD2 ASS + OTC
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPDILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSP KLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGT KLELKRADAAPTVSIFPGSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKASGSSFTGYN MNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSA VYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYGRVTVSSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLS LRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIF KQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGR REEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYS GGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEE FIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFEL SCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHIS YEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSL ELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVR KIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESP LSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAKGSGEGRGSLLTCG DVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGE EIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCF LTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHP IQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDAS VTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQV TMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDY
SPQLQKPKF ID de Sequência NO: 13 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção GD2 ASS1
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPDILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSP KLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGT KLELKRADAAPTVSIFPGSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKASGSSFTGYN MNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSA VYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYGRVTVSSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLS LRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIF KQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGR REEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYS GGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEE FIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFEL SCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHIS YEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSL ELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVR KIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESP
LSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK ID de Sequência NO: 14 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção GD2 OTC
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPDILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSP KLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGT KLELKRADAAPTVSIFPGSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKASGSSFTGYN MNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSA VYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYGRVTVSSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLS LRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIF KQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGR REEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLFNLRILLNNA AFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKG EYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARV LSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGL TLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTN DPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRK
PEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF ID de Sequência NO: 15 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção Mesotelina ASS1 + OTC
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPMQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWI GLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFD YWGQGTTVTVSSGVGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYM HWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWS GYPLTFGAGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAC DIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPE EEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYL ANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLA RPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNR FKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQD PAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVEN RFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPE CEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDAT GFININSLRLKEYHRLQSKVTAKGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFR NGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYL PLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSS MADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLS WIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPL EAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEE
VDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF ID de Sequência NO: 16 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção Mesotelina ASS
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPMQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWI GLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFD YWGQGTTVTVSSGVGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYM HWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWS GYPLTFGAGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAC DIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPE EEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYL ANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLA RPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNR FKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQD PAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVEN RFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPE CEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDAT GFININSLRLKEYHRLQSKVTAK
ID de Sequência NO: 17 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção Mesotelina OTC
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPMQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWI GLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFD YWGQGTTVTVSSGVGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYM HWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWS GYPLTFGAGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAC DIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPE EEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKV QLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTR LSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAK EASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFG MHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQE EEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENR
KWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF ID de Sequência NO: 18 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção CD33 ASS + OTC
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYS QKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGD VESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQ SVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQS EDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGAS VKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSS TTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIAS QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKL LYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNEL NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG KGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVV LAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSRE FVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQV RFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENL MHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTH QTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMD REVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILG RESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAKGSGEGRGSL LTCGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKN FTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGG HPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSD LYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYE PDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQG YQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLL
TDYSPQLQKPKF ID de Sequência NO: 19 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção CD33 ASS1
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPG QSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGG TKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWI KQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYC AREVRLRYFDVWGAGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHT RGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDG CSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA LHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQG YDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRY LLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWR MPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPG LYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVG RIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYT GFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGD
YEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK ID de Sequência NO: 20 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção CD33 OTC
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FPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF ID de Sequência NO: 21 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção EGFR ASS1 + OTC
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVA SISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMD YWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDD MNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSF NVPLTFGDGTKLEKALEQKLISEEDLAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTA TKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCIL VWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSS ALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQI KVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENP KNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEV AGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLK FAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELV SMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAKGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPM LFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLS ADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLG VNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLT LQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYA KENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAAS
DWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF ID de Sequência NO: 22 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção EGFR ASS1
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVA SISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMD YWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDD MNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSF NVPLTFGDGTKLEKALEQKLISEEDLAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTA TKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCIL VWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSS ALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQI KVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENP KNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEV AGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLK FAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELV
SMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK ID de Sequência NO: 23 - Sequência de aminoácidos de proteína exemplificativa da invenção EGFR OTC
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVA SISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMD YWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDD MNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSF NVPLTFGDGTKLEKALEQKLISEEDLAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTA TKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFM VRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGK SLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVL ARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGN NILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGG NVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVF
YSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF ID de Sequência No: 24 - sequência de DNA que codifica ASS1 atgtccagcaaaggctccgtggttctggcctacagtggcggcctggacacctcgtgcat cctcgtgtggctgaaggaacaaggctatgacgtcattgcctatctggccaacattggcc agaaggaagacttcgaggaagccaggaagaaggcactgaaActtggggccaaaaaggtg ttcattgaggatgtcagcagggagtttgtggaggagttcatctggccggccatccagtc cagcgcactgtatgaggaccgctacctcctgggcacctctcttgccaggccctgcatcg cccgcaaacaagtggaaatcgcccagcgggagggggccaagtatgtgtcccacggcgcc acaggaaaggggaacgatcaggtccggtttgagctcagctgctactcactggcccccca gataaaggtcattgctccctggaggatgcctgaattctacaaccggttcaagggccgca atgacctgatggagtacgcaaagcaacacgggattcccatcccggtcactcccaagaac ccgtggagcatggatgagaacctcatgcacatcagctacgaggctggaatcctggagaa ccccaagaaccaagcgcctccaggtctctacacgaagacccaggacccagccaaagccc ccaacacccctgacattctcgagatcgagttcaaaaaaggggtccctgtgaaggtgacc aacgtcaaggatggcaccacccaccagacctccttggagctcttcatgtacctgaacga agtcgcgggcaagcatggcgtgggccgtattgacatcgtggagaaccgcttcattggaa tgaagtcccgaggtatctacgagaccccagcaggcaccatcctttaccatgctcattta gacatcgaggccttcaccatggaccgggaagtgcgcaaaatcaaacaaggcctgggctt gaaatttgctgagctggtgtataccggtttctggcacagccctgagtgtgaatttgtcc gccactgcatcgccaagtcccaggagcgagtggaagggaaagtgcaggtgtccgtcctc aagggccaggtgtacatcctcggccgggagtccccactgtctctctacaatgaggagct ggtgagcatgaacgtgcagggtgattatgagccaactgatgccaccgggttcatcaaca tcaattccctcaggctgaaggaatatcatcgtctccagagcaaggtcactgccaaa
ID de Sequência No: 25 - sequência de DNA que codifica OTC Atgctgtttaatctgaggatcctgttaaacaatgcagcttttagaaatggtcacaactt catggttcgaaattttcggtgtggacaaccactacaaaataaagtgcagctgaagggcc gtgaccttctcactctaaaaaactttaccggagaagaaattaaatatatgctatggcta tcagcagatctgaaatttaggataaaacagaaaggagagtatttgcctttattgcaagg gaagtccttaggcatgatttttgagaaaagaagtactcgaacaagattgtctacagaaa caggcttagcacttctgggaggacatccttgttttcttaccacacaagatattcatttg ggtgtgaatgaaagtctcacggacacggcccgtgtattgtctagcatggcagatgcagt attggctcgagtgtataaacaatcagatttggacaccctggctaaagaagcatccatcc caattatcaatgggctgtcagatttgtaccatcctatccagatcctggctgattacctc acgctccaggaacactatagctctctgaaaggtcttaccctcagctggatcggggatgg gaacaatatcctgcactccatcatgatgagcgcagcgaaattcggaatgcaccttcagg cagctactccaaagggttatgagccggatgctagtgtaaccaagttggcagagcagtat gccaaagagaatggtaccaagctgttgctgacaaatgatccattggaagcagcgcatgg aggcaatgtattaattacagacacttggataagcatgggacaagaagaggagaagaaaa agcggctccaggctttccaaggttaccaggttacaatgaagactgctaaagttgctgcc tctgactggacatttttacactgcttgcccagaaagccagaagaagtggatgatgaagt cttttattctcctcgatcactagtgttcccagaggcagaaaacagaaagtggacaatca tggctgtcatggtgtccctgctgacagattactcacctcagctccagaagcctaaattt ID de Sequência No: 26 - sequência de DNA que codifica GD2 scFv
GATATTCTGCTCACACAGACCCCACTCTCCCTGCCCGTGTCACTCGGGGATCAGGCTAG CATTTCTTGCCGCTCATCTCAGTCTCTGGTCCACCGGAATGGGAACACATACCTCCATT GGTACCTCCAGAAACCTGGACAGAGCCCTAAACTGCTCATCCACAAAGTCTCAAATCGG TTCTCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGGACCGACTTCACACTGAA AATCTCACGAGTGGAGGCTGAGGATCTCGGCGTCTACTTCTGTAGTCAGAGTACCCACG TCCCACCCCTCACCTTTGGCGCTGGAACAAAACTGGAGCTGAAACGAGCCGATGCTGCT CCTACCGTGTCCATCTTTCCTGGCTCCGGGGGAGGCGGGAGCGGAGGCGAAGTGAAACT CCAGCAGTCTGGCCCTTCTCTCGTGGAACCTGGCGCTTCTGTGATGATCTCCTGTAAGG CCTCTGGATCTTCCTTTACCGGCTACAACATGAACTGGGTCCGGCAGAACATTGGCAAA TCCCTGGAATGGATTGGCGCCATCGATCCTTACTACGGCGGCACATCATACAATCAGAA ATTCAAGGGGCGAGCAACACTCACTGTCGACAAATCTTCATCCACCGCCTACATGCACC TGAAATCTCTCACATCCGAGGATAGTGCTGTCTACTACTGTGTCTCTGGCATGGAATAC TGGGGACAGGGAACTTCTGTCACCGTGTCTAGTGCCAAAACCACACCTCCCTCCGTGTA
CGGACGAGTCACTGTCTCATCT ID de Sequência NO: 27 - sequência de DNA que codifica CD33 scFv Ggatccaacatcatgctgacccagagccctagcagcctggccgtgtctgccggcgagaa agtgaccatgagctgcaagagcagccagagcgtgttcttcagcagctcccagaagaact acctagcctggtatcagcagatcccaggccagagccctaagctgctgatctactgggcc agcaccagagaaagcggcgtgcccgatagattcaccggaagcggttctggcaccgactt caccctgacaatcagcagcgtgcagagcgaggacctggccatctactactgccaccagt acctgagcagccggacctttggcggaggcaccaagctggaaatcaagagaggcggcgga ggctcaggcggaggcggatctagtggcggaggatctcaggtgcagctgcagcagccagg cgccgaggtcgtgaaacctggcgcctctgtgaagatgtcctgcaaggccagcggctaca ccttcaccagctactacatccactggatcaagcagacccctggacagggcctggaatgg gtgggagtgatctaccccggcaacgacgacatcagctacaaccagaagttcaagggcaa ggccaccctgaccgccgacaagtctagcaccaccgcctacatgcagctgtccagcctga ccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgccagagaagtgcggctgcggtacttcgat gtgtggggagccggcaccaccgtgaccgtgtcatct
ID de Sequência NO: 28 - sequência de DNA que codifica
Mesotelina scFv
Atgcaggtacaactgcagcagtctgggcctgagctggagaagcctggcgcttcagtgaa gatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagc agagccatggaaagagccttgagtggattggacttattactccttacaatggtgcttct agctacaaccagaagttcaggggcaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcac agcctacatggacctcctcagtctgacatctgaagactctgcagtctatttctgtgcaa gggggggttacgacgggaggggttttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtc tcctcaggtgtaggcggttcaggcggcggtggctctggcggtggcggatcggacatcga gctcactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacct gcagtgccagctcaagtgtaagttacatgcactggtaccagcagaagtcaggcacctcc cccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtcccaggtcgcttcag tggcagtgggtctggaaactcttactctctcacaatcagcagcgtggaggctgaagatg atgcaacttattactgccagcagtggagtggttaccctctcacgttcggtgctgggaca aagttggaaataaaa
ID de Sequência NO: 29 - sequência de DNA que codifica
EGFRvIII scFv
Caggtacaactccagcagtctgggggaggcttagtgaagcctggagcgtctctgaaact ctcctgtgtaacctctggattcactttcagaaaatttggcatgtcttgggttcgccaga ctagtgacaagaggctggaatgggtcgcaTccattagtactggcggttataacacgtac tattcagacaatgtaaagggccgattcaccatctccagagagaatgccaagaacaccct gtacctgcaaatgagtagtctgaagtctgaggacacggccttgtattactgtacaagaG gctattctagtacctcttatgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtc tcctcaagtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacatcga gctcactcagtctccagcatccctgtccGtggctacaggagaaaaagtcactatcagat gcatgaccagcactgatattgatgatgatatgaactggtaccagcagaagccaggggaa ccccctaagttccttatttcagaaggcaatactcttcggccgggagtcccatcccGatt ttccagcagtggcactggcacagattttgtttttacaattgaaaacacactctcggaag atgttggagattactactgtttgcaaagctttaacgtgcctcttacattcggtgatggc accaagcttgaaaaagctctagagcagaaactgatctcggaagaagatctggcgaagcc c ID de Sequência No: 30 - sequência de DNA que codifica ASL
GACGCCATCCCGGCCAGAAAAGCCCTGGCCAGTGGCGGGCGCGACACTATCCGTGCGGC CAGGCGGAGGTGAGTGCGCGGCGGCCGGATGGGCGGGACGGGCGTGGAGGACGCCGAGC ACCGTGGCGCGCGCTCACGTCCGCGTCCCCAAGGGCTGCGCTCCCTCAAGCGCAGTGCC CAGAACTCGGAGCCAGCCCGGCCCGGGGGACCCTGCTGGCCAAGGAGGTCGTCAGTCCG GTCTTGTCTTCCAGACCCGGAGGACCGAAGCTTCCGGACGACGAGGAACCGCCCAACAT GGCCTCGGAGGTGAGTGGGACCTCGGGGACTCCGGTCCTCCTAGCCTCCAAAGGAGAGA GTGGGGGCGCCAGACCTGCCTCGGGCCACCCTGCTGGGAATCGCCCTCCAGGAAGCAAT TTTGAAAATTACCTAGGAAGCCTGCACCCCCAGCCCTCCCGGGCGCATCATCTGGAGCC CAGCAGTCACCTTTACCAGGACTCACCAGTATCCGCAGGCAGCCCTTGTGGCAAACCCA CCAACCCACACTACTAGGGGTAGAGTGGCTCTGCCCTCACCTCACAGTGATGCCTGCCT GGCCAGGAAAAGTGGCTCCCAAGCCTTCAGCCTTCCAACTCTTCCTTCCTTCTTACCAC GTGTCCTCCTGTCAGGTCCCACCCCACACCACATCCCTTCTCCTGCTAGAGCAATTGTC CCTGTTTATAGAATAAAGCTCAGCCCCTAAGTGTTCTTGTCCTTGACTGTGGCATGTGG AAAGAGCCAGGAAAAAGGGGACGTCGCCTCGTGGCTCCAGCAACCCTGGTGCCTGGTCC CTTCCTGTCTCACTGGACCCTGCCTCTTAGGGTCAGTGGCTCCTGGCCTCTCCTCCTGA CCACTGAGATGCTGGATTCCCAGGCAGAGGTTTTCCTTCCTTGGGCCATAGTTGATTTA TCTGGCAATGGGGGTAATAATAGCTGTCGGCCTCACTCTGTAAGGCACTAGATTATGAG GCCATTGCTTTGGACCCTTCAGGTGAGAGGGGCTGTTCGCCTGATGCTTGATGAAGGGA ACTCCGGGAAGCAGGAGGTCTGGGTTCCAGGCCCTTTTGGCCTTCATTAGCTAGCAATT CACTTCCTCTTTCTCAATGCCCTGCAAGCTCAGTGCCCTGCAAGCTTCTGGGTCATGGC AGGGGGGTAGGGCCTGGACTTTGGAGCCAAACAGACTTGGTTTCTGTACCAGTCACTTG AGCCCTTTAAACCTCTTTCCTCATTTGTGAAATAGGGGTAATATTGCCCACCTCATAAA AGGCCGTAATAACATATGTGAAATCCCTAGCACAGGGCTGAGCAACAGTAGGTGCTCAA TAAATGGTGGCTAACCACAACAATACTGATATTTCTACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGAG GACTGCTGAAGCCCAGGAATTCCAGACCAGCCAGGGCAATGTAATGAGACCCTGTCTCT ACAAAAAGATTTTGAAAATTACCCAGGTGTGGTGGCGTACACCTGTAGTCTCACAGGAG GCGGAGGCATGAGGATTGCTTGAGCCCAGGAGTTTGAGACTGCAGTGAGCATGATCTCA CCACTGCACTCCAGCCCAGGCAACAGAGTGAGATCCAGTTTCAAAAAAATAAAAATAAA AAAACCTGGCAGGCATGGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGTCGAGGT GGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCG TCTCTACTAAAAATGCAAAAATTAGCTGGGTGTAGTGGTGGGTGCCTGTAGTCCCAGCT ATTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACTCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGC TGAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAAAGCAAGACTCCACCTCAAAAAAA GAAAAAAAACCCACAAGTCCCAAAACCAAAACTGGTATTTCCCATGTACATTCGACCTT AACTGTTGCTCATTCAACCCAGCCCAACTCAGTGCCCCATCCCCTGGCCCTGAAGAGAC CATTCTGGCCCAGATGTGTCCTGGCTTGGAGTAGCACCTTCTGCTACCACACTAGGCCT CCACTCTCCTCAGTGCCCAAGGGGAGGCACCTCACTCTGATCTCCCTGTGGGGTCCTCT TATGCCTGCCAGTAAGGATAGGAGTTTGGTTCTAGAGCAGAGTGGTCTGGCTTCCAACA AGCCCAGTGTTCTAGGTGACCTCAGGTTGCCCCAGGCCTTCCTGTAGGTTGGCACTAAT TGGTTTGGCTGCAGCTCCACTTATTAAGTAGTTATTTTTATTACTAACAACCTAGGCAG GGTGGCCCAGGAGCCCGCTGGGGGAGGCGGTGCCAGGCTCCTGGCTGAGGGGCAGGCTG GCCCCAATTCTGACTGGCTGGCTCCAGTGATCAGGACCAGGGCCCCACGTGGTGCTTTG CTGGAGATCTAGGCTTGGTGGGGCAGCTGTGGGGTAAGGGGCAGGACCAGCTCAAAGAT GGGGTGGGGGCGGAGGCTGCCTCTGCAGGGCAGAGTCCTTTGGCAGTCGGGACTGTTGG GCATAGAGGAGTCAGCTCACAGCTCAGGGCCAGAGCACTGGAGAGGTCTCTGGGGTGCA TACAGGAACCAGGAGTGGAGCTGAAGCATGTCCTATCCCCTGCCAGCCCTCCCTTAGTA ACAGCTGGCATTTCTCGAGTCCTTCCTGAGCACCAGGCACCGTGTTATGTATGCAATTT GCAAATATTATCTGATTAAATGCTCACAATAAGGCTATCAGAGAGGTACTATTATTATC 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TATCGATAATTATGAGAAGATGGTTCAAGTTGAGAGTGAGACAGAGCCGAGTGGGTAAG AGAGTATCTGCCCAAGGCAGGGATGTCCTGGCAGAGGGGCAGGTCCTGGGCCTGGCAGC TTCAGATCCCAGGGTCCCCAGGGCTCACCACTCGCCCACCTGTGCCCCCAGATTCACCA AGAGAACATGGGACAGGCTCTCAGCCCCGACATGCTGGCCACTGACCTTGCCTATTACC TGGTCCGCAAAGGGGTAAGTGTGTAGCAGCCAGGGGGAGGGTGAGGAGATGGGGTGCCC CCCCCAGAGGGTGGGGGAGCTCAGGAATGGGTGCAAGCGGCCCAGCCTGGTGGCTCACC CCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAAGCCGAGGTGGGCGGGTCACTTGAGGCCAGGAGTTC GAGACCAGCCTGGTCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTTTTGATGTAAAAATACAACAAT TAGCTGGGTGTGGTGGCACACTCCTGTAATCCCAGTTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAG AATTGATTGAACTGGGAGGTGGAGTTTGCGGTGAGGTGAGATCGCGCCACTGCACTCCA GCCTGGGCAACAGAGCGAGACTTTGTGTCAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAGGGG GTGCAGGCAATGGAGGCAGATCAGGGCATGGAGAAACCTGCCTCAGCGCCATCTTCCTC CCTGGCACCCAGATGCCATTCCGCCAGGCCCACGAGGCCTCCGGGAAAGCTGTGTTCAT GGCCGAGACCAAGGGGGTCGCCCTCAACCAGCTGTCACTGCAGGAGCTGCAGACCATCA GGTACGGCCCATCCCCTTCCCCATGCTGCCTCCTAGGAAGTGAGCCTGGGTGCCTGGAG CCCAGGGTGGCCTGGCGCCCTGGCCCACCTCTTCCTCTCTCCCCAGCCCCCTGTTCTCG GGCGACGTGATCTGCGTGTGGGACTACGGGCACAGTGTGGAGCAGTATGGTGCCCTGGG CGGCACTGCGCGCTCCAGCGTCGACTGGCAGATCCGCCAGGTGCGGGCGCTACTGCAGG CACAGCAGGCCTAGGTCCTCCCACACCTGCCCCCTAATAAAGTGGGCGCGAGAGGAGGC TGCTGTGTGTTTCCTGCCCCAGCCTGGCTCCCTCGTTGCTGGGCTTTCGGGGCTGGCCA GTGGGGACAGTCAGGGACTGGAGAGGCAGGGCAGGGTGGCCTGTAATCCCAGCACTTTG GAAGGGCAAGGTGCGAGGATGCTTGAGGCCAGGAGTTTGACACAGCCTGGGCAACACAG GGAGACCCCCATCTCTACTCAATAATAAAACAAATAGCCTGGCGTGGTGGCCCATGCAT ATAGTCCCAGCTACTTGTAAGGCTGAGGTGAGAGGACACTTGTGCCCAGGAGTGGAGGC TGCAGTGAGCTATGATCACGCCACTGCATTCCAGCCTGGATAACAGAGTGAGAACCTAT
CTCTAAAAATAAATAAATAAACGAAAAATAAA ID de Sequência No: 31 - sequência de DNA que codifica ODC1
GAAGCCGGGGGCGGGGGCCACGCGTGGGGCAGGCGGTGCTCGGCTCGGCTGACGTCGGC CCGCCGGCGCCCCACCAGCTCCGCGCGGGCCCGGGTTGGCCACCGCCGGGCCCCCGCCC CTCCCCCGGCGGTGTCCCGGCCGGAACCGATCGTGGCTGGTTTGAGCTGGTGCGTCTCC ATGGCGACCCGCCGGTGCTATAAGTAGGGAGCGGCGTGCCGTGGGGCTTTGTCAGTCCC TCCTGTAGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCCGCCCCTCTGCCAGCAGCTCCGGCGCCACCT CGGGCCGGCGTCTCCGGCGGGCGGGAGCCAGGCGCTGACGGGCGCGGCGGGGGCGGCCG AGCGCTCCTGCGGCTGCGACTCAGGCTCCGGCGTCTGCGCTTCCCCATGGGGCTGGCCT GCGGCGCCTGGGCGCTCTGAGGTGAGGGACTCCCCGGCCGCGGAGGAAGGGAGGGAGCG AGGGCGGGAGCCGGGGCGGGCTGCGGGCCCCGGGCCCCGGGCACGTGTGCGGCGCGCCT CGCCGGCCTGCGGAGACACGTGGTCGCCGAGCGGGCCACGACCTTGAGGCGCCGCTTCC TCCCGGCCCGGGGTTCTCCCGCGGCTGGATAAGGGTGATCCGGGCGCCTCGTTCTGCCC CCGTCTTCACAGCTCGGGGCTGGAGGGGCCTAGGGGAGACCCACCCGGAGACCCTGCGG CCCCGCGCCGGCCTCTTTCCCAACCCTTCGGCGGCCGCGCGCTGGCCGGGGAGCCGTTG GGGAGGCCCTGGCGGCCGCGCAGCAGGTGCAGGGGCGCAGAGCCCGGGCTCGCCTTGGT ACAGACGAGCGGGCCCCGGCCTTGGCGCCTTCAGTTTCCTTCCAGTTTTTATTTTCGCT GTGTCTACAGAGCAGATGACACCAATTTGGAAACCCGCGAGAGTGGGTAGAGCTAAGAT AGTCTTGCTGTAGTAGCTGTGATATTAGATGCTCGGCCATGACTTAGAGGTGTTTATTT AAGGACTGTGAATGACTCGGTGATTTCGGAAAAGCTTGGCTTAGATGAACGGACATACA CAGGGGAGACAGCCCTAAGGTTTGCAGAAAAGGCTGATTGTGCTGTTTGCGAAGTCGAA ATAATTGGTGAAAGTGTAGAAGGCAGAACCTCTCAGGAATGTCTGGGGAGGACAAAGAA TGTGTTGGCTGACTTTGTTTAAACATAAAATTGGGCAGACTTTAATTGATTTGTGAAAT TTTTTTCAAAGTTTGTTTGAATTAGCCCCTATCTCTTCTAACATTATCCTCTTGTGCTA ATTGATTGACCATTTTAAATAACTTAGCTGTTACAGAAAGACCGAAAGGTGTTCTTCAG TAAAATATATTCAAGTAAGTTACTTAAGTAACGCCTTAAAAGATACAGAAAAGCAAAAA AGTATTGGCGTATTAAAAAGAAATCAAAACTTTCCAAGTTTAGGCCTGAACATTGCCTT AAAAATATTTAATAAGGCCTCAAATGACCCAGTCCGAGACTGCATGAGCCTATTTATTA TTAAATTGTAAATATTCTTCATATAAACAAAAATATATAACCATGTCTGTAACAAAAAT GGTTTTGCTAGCGTTGTTACTCTCTTCCCTTCTCCGAGGGGTGATTTAGGCAACTTCGG AGGTTGACAATGCCAAGCAGTCACAATAGATAGAGCTTTAAAGCAAATTCTATGCATGG GTTTGGATTTATGACAGGCCCGTCACCCTGGGCCTGTCATAGTACCCCATGCCAGAGCA AACTGTGTCCCCGAACCATTGCCTGGCCTCTGTGCCCGTAGGCTGCTGGCACTGAAGTG GGTTGCACAGTGGAAAAGAAGAAAGCTCTACCTGGCAGAAATTTTTAAAGGTTAAAATA AATAATTTTAAGAAAGCTGGTTCACAAGGTGCCACATTTGATGAAAGCAAAATACAGTG GCTTTTATTGTTACTAGAGTGATGTTCTTGCTTGTTTTTCTTTTTTGGTGAAGTTAGCC CCAAATTATTCTCATAGCTAAGCAAATACGAGAGTGACTGTAAGGACAGTTGGCATTCC CGGAATTGCTAAACTTGGTAGGCAACGCTGGTTTAAGAATACTGAGTTCTAGCCGGGCG TGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAACACTTTGGGAGGCTGAGGCAGGCGGATCACCTGA GGTCGGGAGTTGGAGACCAGCCTGACTAACATGGAGAAACGCCATCTCCACTAAAAATA TAAAATTAGCCAGGCCCCGGGTGTGGTGGCACATGCCGGTAATCCCAGCTACTCGGGAG ACTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGAGGTGAGCCGAGATCAT GCCATTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAGAGTAAAACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAA AAATACTGAATTCTGATCAGGTAACAGCAACTGTAATACAATGTGATAAGTTGACTTGA AGATTACAGTTTTTAAGAAGTATATACCCAGCTAATACATGAAAATTAACTCGTAAAAT CTCAAATGCTCCAGACATTTCCATGATGCCTGTTGGTCAGTAAAAATCATTCTAAGACT TAGTGGAAGTAGGAAATGTTTGTATGGCTGTGTATAAAGGCTATAATGTAATCCCAGCA CTTTGGAAGACCGAGGCGGGTGGATCACCTGGGGTCAGGAGTTTGAGACCCACCTGGAC AACGTGGTGAAATCCTGTCTCTACTAAAAACACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCAGG CGCCTGTAATCCCAGCTGCTGGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGG CAGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATTGCACCGCTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGCGTGAG ACTCTGTCTCAAAAAAAATAAAAAAGTCTATAATGCTATTTTAAGTTTCTAAGGAACTG AAACTGCTCTGAAATAAATCAGACCATTATAAGACTTTTTTCCATATCAGTGAGCTAAG TGCAGATAAGCTTCTGAAACTTGCATGCTAGATTTTTTTGGTACAAATATTTGAAATGC TTAGTGTGCTGCCTTGGAAAAACCTGGTATTTTTTGTTGTGTCCTTATACTGCCAAGGT TTATGGAATCATGTACCTTATGCCTAGTAATAATTAGGATGACCAGGCCAGTGAGTGGT TCATATCCGGGGCATGATTAGCTCTGCGTGTGCTCAGCCAGTGCCCCATCTTCAACTCG ATGTGTTCCTAAGGTAGACAGCAAATTCCCTATTTTATTTCTCAGATTGTCACTGCTGT TCCAAGGGCACACGCAGAGGGATTTGGAATTCCTGGAGAGTTGCCTTTGTGAGAAGCTG GAAATATTTCTTTCAATTCCATCTCTTAGTTTTCCATGTAAGTATTCAGTTTACATTTA TGTTGCAGGTTAATCTTAAGAATTGTATTGCTAAGGCTTCTAAGTGAATTTCTCCACTC TATTTGCATTTTGTTGCATTTCAGAGGAACATCAAGAAATCATGAACAACTTTGGTAAT GAAGAGTTTGACTGCCACTTCCTCGATGAAGGTTTTACTGCCAAGGACATTCTGGACCA GAAAATTAATGAAGTTTCTTCTTCTGTAAGTATATGAGGCCCATGCTGGCAGTGCAGCT GAGAGTGCCAGGCAAGTGGAAAACTTTGGCAAGGTCTAAGGAAGAGCAATGAGGCTTAC ATGTCTTGTTATGGAATGTAGAAATTAATTCACTGGTGGTAAATTAATAGTGATAATGG TGATACTCATATCAGTGGCTAGACTCAAAAGAGCAGGATTCATTGTGACTGATGGGAAT GAAGGTCGCTGGCTATTGGTGTGGTGTGTGGTGAGGCTGCTAGTGAGTCACCTGTGACC ACTCTTGTTTCAGGATGATAAGGATGCCTTCTATGTGGCAGACCTGGGAGACATTCTAA AGAAACATCTGAGGTGGTTAAAAGCTCTCCCTCGTGTCACCCCCTTTTATGCAGTCAAA TGTAATGATAGCAAAGCCATCGTGAAGACCCTTGCTGCTACCGGGACAGGATTTGACTG TGCTAGCAAGGTAAGCGATAGCAGCAGGCCTCAAAAGCGTTGTATAAAATGGGCCTGGT ATTCCCCACGAGGCAGATACAAGTTGTGTTTTTTGGGCAATAAATGCTCACTAAAGGCA AATGGGGCGGGGGGGTACATGACAACTTCCCATGCTTTTCTGTTTATTCCACGTGTTAA GCCACATATGGATAGCATGACACCACTCTTCTTTTTCAGACTGAAATACAGTTGGTGCA GAGTCTGGGGGTGCCTCCAGAGAGGATTATCTATGCAAATCCTTGTAAACAAGTATCTC AAATTAAGTATGCTGCTAATAATGGAGTCCAGATGATGACTTTTGATAGTGAAGTTGAG TTGATGAAAGTTGCCAGAGCACATCCCAAAGCAAAGTGAGTTATTCCCCCATCTGAGGG CAAGATCGGGAGCATAAGATATGTGGATTCTTATCAAACAAACTTAAATTTCTGATTAT TATATTTCTATACTTTAGTAGAAAGTAGTTGAAACCCCCATTGAGTCATGAAGCCTGGG ACTCAAACTACAGAATATATCAGCGACAGTATTTAGAACAGGATTGTTTTTATTTTAAT TGTGGCTATAAGTGAACATCTATCATGAGACATTTGCTGCACTTTCCTTGCTTGTAGGT TGGTTTTGCGGATTGCCACTGATGATTCCAAAGCAGTCTGTCGTCTCAGTGTGAAATTC GGTGCCACGCTCAGAACCAGCAGGCTCCTTTTGGAACGGGCGAAAGAGCTAAATATCGA TGTTGTTGGTGTCAGGTGAGATTTTGGTGGGATAGCTAGAGGTCAAGACATTGAACAGT TTGAGTTTTACAGGCTTTCTCCTAGTGTTTGCTATTATTTTAAGAAATACTAAGACACA GTGTCTCGTCTCTTTATTTTACCCCAGCTTCCATGTAGGAAGCGGCTGTACCGATCCTG AGACCTTCGTGCAGGCAATCTCTGATGCCCGCTGTGTTTTTGACATGGGGGTGAGTATA CGTGACCCTGTTAGGGAAGGGCGGGACACAACTGACAATAACTAGTCTTAATTCTAGAG TTAACTTTTTATGGCAGTTGGTTCTGTATTACATGGGTTTCAGCCTATCTGCTGCATAC ATTTTTGTTATTAGCTGTGGATCTGGCTGACTTATTTTCTTGATTCTAGGCTGAGGTTG GTTTCAGCATGTATCTGCTTGATATTGGCGGTGGCTTTCCTGGATCTGAGGATGTGAAA CTTAAATTTGAAGAGGTAATTTAGAACAAAACTGTAATACTCAGTAGCCGTTCTAATAA ATTCCTTTTTGGAATATTTCAAAATTTAAGTGTCTTAACTAATACCACAATGGGCTGAA GTGTCTTGGTGTGATATTTTGAGTGATTTCTTTGTGCTGTCTGACATTACACTTGATAC CATTTGGTTTTCTAAAGTGTGAATCAGCTTTCCCAGAAGTCTTGGATAATTGGTTACAT TGGAAATCATGGCTCACACCTGTAATCCAGCACTTGGGGAGGCCAAGGTGGTAGGATCA CTTGAGCCCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGGCAACACAGTGAGACCCCATCTCTACAAA AAAAATTTTAAAATTAGCCTGGTGTGGTGGCGGGCACCTGTAATCCCAGCTACTTGGAA GGCTGAGGTGGGAGGATCACTTGAGCCCAGGAGGTTGAGGCTGCAGTGAGCCATGATCA TGCCACTGCACTCAGCCTGGGCTACAGAGTGAGACCCTGTCTCAAAAAAAAAAAAGAAA AAGCATGTTGCTGTGGGCTTCCTAGAGAATATGCTGACTGTAGCACATCATCACCCCAA ATGTGCTTTGCTAGACCTATGCTTCCTCTCCTTAAAATACTTGAAATGTTTAGTCACTT AGGAAGTTAAGCCATTATATTGGTGCTTGAATTTATAAAATATATCCACATGGTTTGTT AAAATCATGACGTAGGCAGAATAGGATTTTTATCCTGTTGGCATGTATTTGTTAAAATG TTTTGACATCTTGATGCCTTCCTAGGTAGTAGTTAGTTGCGTACTGTTCTTTGATAAAA ATCATACCCATAACATCCTAAAGGAGATAGGGTGCCTGGAGGGGAATGAAAACGAGCCA CCTGGGATATGTAGCCTGGTTTTCAGGGAGATGTTGATGTTTTTTTGCTTTTGTTACTT TAATGATAAACCTGTCTGTTGATGCCTGGTCTCATGATGTCATGTCACAAGGCCCTGTG ATGTTACTCCCCCATGTGAATTTCCCACAATGAAGGCTGCTCTTTCTTTTCTGTTTCAC TCTCTTAGATCACCGGCGTAATCAACCCAGCGTTGGACAAATACTTTCCGTCAGACTCT GGAGTGAGAATCATAGCTGAGCCCGGCAGATACTATGTTGCATCAGCTTTCACGCTTGC AGTTAATATCATTGCCAAGAAAATTGTATTAAAGGAACAGACGGGCTCTGATGGTATGT ATAAAGGACGAATCACTTCATGTATAACTGAAAGCTGATGCAAAAAGTCATTAAGATTG TTGATCTGCCTTTCTAGACGAAGATGAGTCGAGTGAGCAGACCTTTATGTATTATGTGA ATGATGGCGTCTATGGATCATTTAATTGCATACTCTATGACCACGCACATGTAAAGCCC CTTCTGCAAAAGGTAATTTCTGAGCATACTGTATAAAACAATTAAGAGGACTGGTCACA ACACGTGTAATTAAGTAGTACTTCCTCTCTCCGTCTCTTTATATAGAGACCTAAACCAG ATGAGAAGTATTATTCATCCAGCATATGGGGACCAACATGTGATGGCCTCGATCGGATT GTTGAGCGCTGTGACCTGCCTGAAATGCATGTGGGTGATTGGATGCTCTTTGAAAACAT GGGCGCTTACACTGTTGCTGCTGCCTCTACGTTCAATGGCTTCCAGAGGCCGACGATCT ACTATGTGATGTCAGGGCCTGCGTGGTAAGTAAGCCATGCATGTTGATGGTGCTGCCAA GAATAGGCACCTTCTTGGATGTGTGCTTCTTGTCTAGACGAATAAGAAATTGTCTTGCC TAAGATTAAATATATATGGATATTTTTCCTAAGAAAAGTTTTAGAAAAGACTGATGAGT GTATTTCTATGTAATTGGAATATATTTAAGTTCATGCCATGTGTCTTGTGGTTTCCTTA TTACCAAAACGGTGACTGAAGAAACGCTTGCTTTAGAAATACATTGAATTGGCCAGGTG TGCTGGCTCACACCTGAAATCACAACACATTGGGAGGCCAAGGCAGAAGGATCACTTGA GCCCAGGAGTTCGAGCCTGGGCAACATAGTGAGACCCTGTCTCTACAAAAAATTAAAAA ATTAGTTGGCCATGGTAGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTGCTTGGCTAAGGTGAGAGGT TTGCTTGAGCCTGGGAGGTTGAGGCTGCGGTGAGCTATGATAGCACCATTGTATTCCAG CCTGAGTAACAGAGAAAGACCCTGTCTCAGAAAAAAAAAAAATACATTGAATTGTTTCC TGATGGGAAGTAAATACTCTCATGCCCAGTTAGGAGTGAGTCAGGGTTTTTAATATGCC ACTTTTTCTTTCTCAGGCAACTCATGCAGCAATTCCAGAACCCCGACTTCCCACCCGAA GTAGAGGAACAGGATGCCAGCACCCTGCCTGTGTCTTGTGCCTGGGAGAGTGGGATGAA ACGCCACAGAGCAGCCTGTGCTTCGGCTAGTATTAATGTGTAGATAGCACTCTGGTAGC TGTTAACTGCAAGTTTAGCTTGAATTAAGGGATTTGGGGGGACCATGTAACTTAATTAC TGCTAGTTTTGAAATGTCTTTGTAAGAGTAGGGTCGCCATGATGCAGCCATATGGAAGA CTAGGATATGGGTCACACTTATCTGTGTTCCTATGGAAACTATTTGAATATTTGTTTTA TATGGATTTTTATTCACTCTTCAGACACGCTACTCAAGAGTGCCCCTCAGCTGCTGAAC AAGCATTTGTAGCTTGTACAATGGCAGAATGGGCCAAAAGCTTAGTGTTGTGACCTGTT
TTTAAAATAAAGTATCTTGAAATAATTAGGCATTGGGACGTT ID de Sequência No: 32-sequência de DNA que codifica ArgG >NC_000913.3: 3318637-3319980 Escherichia coli str.
Substrato K-12. MG1655, genoma completo
ATGACGACGATTCTCAAGCATCTCCCGGTAGGTCAACGTATTGGTATCGCTTTTTCTGG CGGTCTGGACACCAGTGCCGCACTGCTGTGGATGCGACAAAAGGGAGCGGTTCCTTATG CATATACTGCAAACCTGGGCCAGCCAGACGAAGAGGATTATGATGCGATCCCTCGTCGT GCCATGGAATACGGCGCGGAGAACGCACGTCTGATCGACTGCCGCAAACAACTGGTGGC CGAAGGTATTGCCGCTATTCAGTGTGGCGCATTTCATAACACCACCGGCGGCCTGACCT ATTTCAACACGACGCCGCTGGGCCGCGCCGTGACTGGTACCATGCTGGTTGCTGCGATG AAAGAAGATGGCGTGAATATCTGGGGTGACGGTAGCACCTACAAAGGAAACGATATCGA ACGTTTCTATCGTTATGGTCTGCTGACCAATGCTGAACTGCAGATTTACAAACCGTGGC TTGATACTGACTTTATTGATGAACTGGGCGGCCGTCATGAGATGTCTGAATTTATGATT GCCTGCGGTTTCGACTACAAAATGTCTGCGAAAAAGCCTACTCCACAGACTCCAACATG CTTGGTGCAACGCATGAAGCGAAGGATCTGGAATACCTCAACTCCAGCGTCAAAATCGT CAACCCGATTATGGGCGTGAAATTCTGGGATGAGAGCGTGAAGATCCCGGCAGAAGAAG TCACAGTACGCTTTGAACAAGGTCATCCGGTGGCGCTGAACGGTAAAACCTTTAGCGAC GACGTAGAAATGATGCTGGAAGCTAACCGCATCGGCGGTCGTCACGGCCTGGGCATGAG CGACCAGATTGAAAACCGTATCATCGAAGCGAAAAGCCGTGGTATTTACGAAGCTCCGG GGGGGCACTGCTGCACATTGCGTATGAACGCCTGTTGACCGGTATTCACAACGAAGACA CCATTGAGCAGTATCACGCGCATGGTCGTCAGTTGGGCCGTCTGCTGTACCAGGGGCGT TGGTTTGACTCCCAGGCGCTGATGCTGCGTGACTGACTCTCTGCAACGCTGGGTTGCCA GCCAGATCACTGGTGAAGTTACCCTGGAGCTGCGCCGTGGGAACGATTATTCAATCCTG AATACCGTCTCAGAGAACCTGACCTACAAGCCAGAGCGTCTGACGATGGAAAAAGGCGA CTCGGTGTTCTCGCCAGATGATCGTATTGGTCAATTGACCATGCGTAACCTGGATATCA CTGATACCCGCGAGAAACTTTTCGGTTATGCCAAAACTGGCCTGCTTTCCTCCTCTGCC
GCTTCAGGCGTGCCGCAGGTGGAGAATCTGGAAAACAAAGGCCAGTAA ID de Sequência NO: 33 - sequência de DNA que codifica ArgH >NC_000913.3: 4156850-4158223 Escherichia coli str.
Substrato K-12. MG1655, genoma completo
ATGGCACTTTGGGGCGGGCGTTTTACCCAGGCAGCAGATCAACGGTTCAAACAATTCAA CGACTCACTGCGCTTTGATTACCGTCTGGCGGAGCAGGATATTGTTGGCTCTGTGGCCT GGTCCAAAGCCCTGGTCACGGTAGGCGTGTTAACCGCAGAAGAGCAGGCGCAACTGGAA GAGGCGCTGAACGTGTTGCTGGAAGATGTTCGCGCCAGGCCACAACAAATCCTTGAAAG CGACGCCGAAGATATCCATAGCTGGGTGGAAGGCAAACTGATCGACAAAGTGGGCCAGT TAGGCAAAAAGCTGCATACCGGGCGTAGCCGTAATGATCAGGTAGCGACTGACCTGAAA CTGTGGTGCAAAGATACCGTTAGCGAGTTACTGACGGCTAACCGGCAGCTGCAATCGGC GCTGGTGGAAACCGCACAAAACAATCAGGACGCGGTAATGCCAGGTTACACTCACCTGC AACGCGCCCAGCCGGTGACGTTCGCGCACTGGTGCCTGGCCTATGTTGAGATGCTGGCG CGTGATGAAAGCCGTTTGCAGGATGCGCTTAAGCGTCTGGATGTCAGCCCGCTAGGCTG TGGCGCGCTGGCGGGAACGGCCTATGAAATCGACCGTGAACAGTTAGCAGGCTGGCTGG GCTTTGCTTCGGCGACCCGTAACAGTCTCGACAGCGTTTCTGACCGTGACCATGTGTTG GAACTGCTTTCTGCTGCCGCTATCGGCATGGTGCATCTGTCGCGTTTTGCTGAAGATCT GATTTTCTTTAACACCGGCGAAGCGGGGTTTGTGGAGCTTTCTGACCGCGTGACTTCCG GTTCATCATTAATGCCGCAGAAGAAAAACCCGGATGCGCTGGAGCTGATTCGCGGTAAA TGCGGCCGGGTGCAGGGGGCGTTAACCGGCATGATGATGACGCTGAAAGGTTTGCCGCT GGCTTACAACAAAGATATGCAGGAAGACAAAGAAGGTCTGTTCGACGCGCTCGATACCT GGCTGGACTGCCTGCATATGGCGGCGCTGGTGCTGGACGGCATTCAGGTGAAACGTCCA CGTTGCCAGGAAGCGGCTCAGCAGGGTTACGCCAACGCCACCGAACTGGCGGATTATCT GGTGGCGAAAGGCGTACCGTTCCGCGAGGCGCACCATATTGTTGGTGAAGCGGTGGTGG AAGCCATTCGTCAGGGCAAACCGCTGGAAGATCTGCCGCTCAGTGAGTTGCAGAAATTC AGTCAGGTGATTGACGAAGATGTCTATCCGATTCTGTCGCTGCAATCGTGCCTCGACAA GCGTGCGGCAAAAGGCGGCGTCTCACCGCAGCAGGTGGCGCAGGCGATTGCTTTTGCGC
AGGCTCGGTTAGGGTAA ID de Sequência No: 34 - sequência de DNA que codifica ArgF >NC_000913.3: c290305-289301 Escherichia coli str.
Substrato K-12. MG1655, genoma completo
ATGTCCGATTTATACAAAAAACACTTTCTGAAACTGCTCGACTTTACCCCTGCACAGTT CACTTCTCTGCTGACCCTTGCCGCACAGCTCAAAGCCGATAAAAAAAATGGCAAGGAAG TACAGAAGCTTACCGGTAAAAACATCGCGCTCATCTTCGAAAAAGACTCGACTCGTACC CGTTGCTCTTTCGAAGTTGCCGCATTTGACCAGGGCGCGCGCGTTACCTATTTAGGGCC GAGCGGCAGCCAGATTGGGCATAAAGAGTCAATTAAGGACACCGCGCGGGTTCTCGGGC GGATGTATGACGGCATTCAGTATCGCGGTCACGGCCAGGAAGTGGTCGAAACGCTGGCG CAGTATGCGGGCGTGCCGGTGTGGAACGGGCTGACCAACGAGTTCCACCCGACCCAGCT GCTGGCGGACCTGATGACCATGCAGGAGCACCTGCCGGGCAAGGCGTTTAACGAGATGA CGCTGGTCTACGCGGGCGATGCGCGCAACAACATGGGCAACTCGATGCTGGAAGCGGCG GCGCTGACCGGGCTGGATCTGCGCCTGTTGGCCCCGAAAGCCTGCTGGCCGGAAGAGAG CCTGGTGGCGGAGTGCAGCGCGCTGGCGGAGAAGCACGGCGGGAAAATTACTCTGACGG AAGACGTGGCGGCAGGCGTTAAGGGCGCGGACTTTATCTATACCGACGTGTGGGTGTCG ATGGGCGAGGCCAAAGAGAAGTGGGCAGAGCGGATTGCGCTGCTGCGCGGGTATCAGGT GAACGCGCAGATGATGGCGCTGACCGACAACCCGAACGTGAAGTTCCTGCACTGTCTGC CGGCGTTCCATGACGACCAGACTACGCTCGGCAAGCAGATGGCGAAGGAGTTCGATCTG CACGGCGGGATGGAGGTGACGGACGAGGTGTTTGAGTCGGCGGCGAGCATCGTGTTCGA CCAGGCGGAAAACCGGATGCATACGATTAAGGCGGTGATGATGGCAACGCTTGGGGAGT
GA ID de Sequência No: 35-sequência de DNA que codifica Trp5 >NC_001139.9: c448535-446412 Cromossomo VII de Saccharomyces cerevisiae S288c, sequência completa
ATGTCAGAACAACTCAGACAAACATTTGCTAACGCTAAAAAAGAAAACAGGAACGCCTT GGTCACATTTATGACCGCAGGTTACCCAACAGTCAAAGACACTGTCCCTATTCTCAAGG GTTTCCAGGATGGTGGTGTAGATATCATCGAATTGGGTATGCCCTTCTCTGATCCAATT GCAGATGGTCCTACAATTCAATTATCTAATACTGTGGCTTTGCAAAACGGTGTTACCTT GCCTCAAACTCTAGAAATGGTCTCCCAAGCTAGAAATGAAGGTGTTACCGTACCCATAA TCCTAATGGGTTACTATAACCCTATTCTAAACTACGGTGAAGAAAGATTTATTCAGGAC GCTGCCAAGGCTGGTGCTAATGGTTTTATCATCGTCGATTTGCCACCAGAGGAGGCGTT GAAGGTCAGAAACTACATCAATGATAATGGTTTGAGCCTGATCCCACTAGTGGCTCCTT CTACCACCGACGAAAGATTGGAATTACTATCGCATATTGCCGATTCGTTTGTCTACGTT GTGTCTAGAATGGGTACTACTGGTGTTCAAAGTTCTGTGGCCAGTGATTTGGATGAACT CATCTCTAGAGTCAGAAAGTACACCAAGGATACTCCTTTGGCCGTTGGGTTTGGTGTCT CTACCAGAGAACATTTCCAATCAGTTGGTAGTGTTGCTGACGGTGTAGTGATTGGTTCC AAAATCGTCACATTATGTGGAGATGCTCCAGAGGGCAAAAGGTACGACGTTGCTAAGGA ATATGTACAGGGAATTCTAAATGGTGCTAAGCATAAGGTTCTGTCCAAGGACGAATTCT TTGCCTTTCAAAAAGAGTCCTTGAAGTCCGCAAACGTTAAGAAGGAAATACTGGACGAA TTTGATGAAAATCACAAGCACCCAATTAGATTTGGGGACTTTGGTGGTCAGTATGTCCC AGAAGCTCTTCATGCATGTCTAAGAGAGTTGGAAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCGCCG ATCCCACATTCTGGGAAGACTTCAAATCCTTGTATTCTTATATTGGCCGTCCTTCTTCA CTACACAAAGCTGAGAGATTAACTGAGCATTGTCAAGGTGCTCAAATCTGGTTGAAGAG AGAAGATCTTAACCACACGGGATCTCACAAGATCAACAATGCTTTAGCACAAGTTCTTC TAGCTAAAAGATTAGGCAAGAAGAACGTTATTGCTGAAACCGGTGCTGGTCAACACGGT GTTGCCACTGCCACTGCATGTGCTAAATTTGGCTTAACCTGTACTGTGTTCATGGGTGC AGAAGATGTTCGTCGCCAAGCTTTAAACGTCTTCAGAATGAGAATTCTCGGTGCTAAAG TAATTGCTGTTACTAATGGTACAAAGACTCTAAGAGACGCTACTTCAGAGGCATTCAGA TTTTGGGTTACTAACTTGAAAACTACTTACTACGTCGTCGGTTCTGCCATTGGTCCTCA CCCATATCCAACTTTGGTTAGAACTTTCCAAAGTGTCATTGGTAAAGAAACCAAGGAAC AGTTTGCTGCCATGAACAATGGTAAATTACCTGACGCAGTTGTTGCATGTGTTGGGGGT GGTTCCAACTCTACAGGTATGTTTTCACCATTCGAGCATGATACTTCCGTTAAGTTATT GGGTGTGGAAGCCGGTGGTGATGGTGTAGATACAAAGTTCCACTCTGCTACTCTAACTG CCGGTAGACCTGGTGTCTTCCATGGTGTCAAGACTTATGTCTTGCAAGATAGTGATGGT CAAGTCCATGATACTCATTCTGTTTCTGCTGGGTTAGACTACCCAGGTGTCGGTCCAGA ATTGGCATATTGGAAATCTACTGGCCGTGCTCAATTCATTGCAGCTACTGACGCTCAGG CTCTGCTTGGCTTTAAATTATTATCTCAATTAGAAGGTATTATTCCCGCTTTGGAATCT TCTCATGCTGTTTATGGCGCTTGCGAATTGGCTAAGACGATGAAGCCTGATCAACATTT GGTTATCAATATTTCTGGTAGAGGTGATAAAGATGTCCAAAGTGTCGCTGAAGTCTTGC
CGAAATTAGGTCCAAAGATAGGTTGGGATTTGAGATTCGAAGAAGACCCATCTGCCTAA ID de Sequência NO: 36 - sequência de DNA que codifica IDO >NC_001139.9: c448535-446412 Cromossomo VII de Saccharomyces cerevisiae S288c, sequência completa >NC_001139.9: c448535-446412 Cromossomo VII de Saccharomyces cerevisiae S288c, sequência completa
ATGTCAGAACAACTCAGACAAACATTTGCTAACGCTAAAAAAGAAAACAGGAACGCCTT GGTCACATTTATGACCGCAGGTTACCCAACAGTCAAAGACACTGTCCCTATTCTCAAGG GTTTCCAGGATGGTGGTGTAGATATCATCGAATTGGGTATGCCCTTCTCTGATCCAATT GCAGATGGTCCTACAATTCAATTATCTAATACTGTGGCTTTGCAAAACGGTGTTACCTT GCCTCAAACTCTAGAAATGGTCTCCCAAGCTAGAAATGAAGGTGTTACCGTACCCATAA TCCTAATGGGTTACTATAACCCTATTCTAAACTACGGTGAAGAAAGATTTATTCAGGAC GCTGCCAAGGCTGGTGCTAATGGTTTTATCATCGTCGATTTGCCACCAGAGGAGGCGTT GAAGGTCAGAAACTACATCAATGATAATGGTTTGAGCCTGATCCCACTAGTGGCTCCTT CTACCACCGACGAAAGATTGGAATTACTATCGCATATTGCCGATTCGTTTGTCTACGTT GTGTCTAGAATGGGTACTACTGGTGTTCAAAGTTCTGTGGCCAGTGATTTGGATGAACT CATCTCTAGAGTCAGAAAGTACACCAAGGATACTCCTTTGGCCGTTGGGTTTGGTGTCT CTACCAGAGAACATTTCCAATCAGTTGGTAGTGTTGCTGACGGTGTAGTGATTGGTTCC AAAATCGTCACATTATGTGGAGATGCTCCAGAGGGCAAAAGGTACGACGTTGCTAAGGA ATATGTACAGGGAATTCTAAATGGTGCTAAGCATAAGGTTCTGTCCAAGGACGAATTCT TTGCCTTTCAAAAAGAGTCCTTGAAGTCCGCAAACGTTAAGAAGGAAATACTGGACGAA TTTGATGAAAATCACAAGCACCCAATTAGATTTGGGGACTTTGGTGGTCAGTATGTCCC AGAAGCTCTTCATGCATGTCTAAGAGAGTTGGAAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCGCCG ATCCCACATTCTGGGAAGACTTCAAATCCTTGTATTCTTATATTGGCCGTCCTTCTTCA CTACACAAAGCTGAGAGATTAACTGAGCATTGTCAAGGTGCTCAAATCTGGTTGAAGAG AGAAGATCTTAACCACACGGGATCTCACAAGATCAACAATGCTTTAGCACAAGTTCTTC TAGCTAAAAGATTAGGCAAGAAGAACGTTATTGCTGAAACCGGTGCTGGTCAACACGGT GTTGCCACTGCCACTGCATGTGCTAAATTTGGCTTAACCTGTACTGTGTTCATGGGTGC AGAAGATGTTCGTCGCCAAGCTTTAAACGTCTTCAGAATGAGAATTCTCGGTGCTAAAG TAATTGCTGTTACTAATGGTACAAAGACTCTAAGAGACGCTACTTCAGAGGCATTCAGA TTTTGGGTTACTAACTTGAAAACTACTTACTACGTCGTCGGTTCTGCCATTGGTCCTCA CCCATATCCAACTTTGGTTAGAACTTTCCAAAGTGTCATTGGTAAAGAAACCAAGGAAC AGTTTGCTGCCATGAACAATGGTAAATTACCTGACGCAGTTGTTGCATGTGTTGGGGGT GGTTCCAACTCTACAGGTATGTTTTCACCATTCGAGCATGATACTTCCGTTAAGTTATT GGGTGTGGAAGCCGGTGGTGATGGTGTAGATACAAAGTTCCACTCTGCTACTCTAACTG CCGGTAGACCTGGTGTCTTCCATGGTGTCAAGACTTATGTCTTGCAAGATAGTGATGGT CAAGTCCATGATACTCATTCTGTTTCTGCTGGGTTAGACTACCCAGGTGTCGGTCCAGA ATTGGCATATTGGAAATCTACTGGCCGTGCTCAATTCATTGCAGCTACTGACGCTCAGG CTCTGCTTGGCTTTAAATTATTATCTCAATTAGAAGGTATTATTCCCGCTTTGGAATCT TCTCATGCTGTTTATGGCGCTTGCGAATTGGCTAAGACGATGAAGCCTGATCAACATTT GGTTATCAATATTTCTGGTAGAGGTGATAAAGATGTCCAAAGTGTCGCTGAAGTCTTGC
CGAAATTAGGTCCAAAGATAGGTTGGGATTTGAGATTCGAAGAAGACCCATCTGCCTAA ID de Sequência NO: 37 - sequência de DNA que codifica CAR
GD2 ASS1 + OTC exemplificativa sem vetor MP71
ATGCCTCGCGGCTGGACAGCCCTGTGCCTGCTGTCTCTGCTGCCATCCGGCTTCATGAG CCTGGATAATAACGGCACAGCCACCCCAGAGCTGCCTACACAGGGCACCTTCAGCAATG TGTCCACAAACGTGAGCTATCAGGAGACCACAACCCCTTCTACCCTGGGATCCACAAGC CTGCACCCCGTGTCTCAGCACGGCAACGAAGCCACCACCAACATCACCGAGACCACAGT GAAGTTTACCTCCACCTCTGTGATTACCTCTGTGTACGGAAATACAAACTCCAGCGTGC AGTCTCAGACATCTGTGATCTCCACAGTGTTTACAACACCTGCCAATGTGTCCACCCCA GAGACAACCCTGAAGCCCAGCCTGTCTCCTGGAAATGTGTCCGATCTGTCTACCACCTC CACCAGCCTGGCCACCTCTCCCACCAAGCCCTATACCTCCTCTTCTCCCATCCTGAGCG ATATCAAAGCCGAGATCAAATGCAGCGGGATTCGGGAAGTGAAACTGACACAGGGCATC TGCCTGGAACAGAATAAGACATCCAGCTGCGCCGAGTTTAAGAAAGATAGAGGAGAGGG ACTGGCCAGGGTGCTGTGTGGCGAAGAGCAGGCCGACGCCGATGCCGGCGCCCAGGTGT GTTCCCTGCTGCTGGCCCAGTCTGAGGTGCGCCCCCAGTGCCTGCTGCTGGTGCTGGCC AATCGGACAGAAATTAGCAGCAAGCTGCAGCTGATGAAAAAACACCAGAGCGATCTGAA AAAGCTGGGCATCCTGGACTTTACCGAGCAGGACGTGGCCTCTCACCAGAGCTACAGCC AGAAAACACTGATCGCCCTGGTGACCAGCGGAGCCCTGCTGGCCGTGCTGGGCATCACC GGATATTTCCTGATGAATAGGCGCAGCTGGAGCCCCACCGGCGAACGGCTGGAGCTGGA GCCTGTCGACCGAGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACG TGGAGTCCAACCCCGGGCCAGGGAATATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCG CTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGATATTCTGCTCACACAGACCCCACTCTC CCTGCCCGTGTCACTCGGGGATCAGGCTAGCATTTCTTGCCGCTCATCTCAGTCTCTGG TCCACCGGAATGGGAACACATACCTCCATTGGTACCTCCAGAAACCTGGACAGAGCCCT AAACTGCTCATCCACAAAGTCTCAAATCGGTTCTCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGG ATCCGGATCTGGGACCGACTTCACACTGAAAATCTCACGAGTGGAGGCTGAGGATCTCG GCGTCTACTTCTGTAGTCAGAGTACCCACGTCCCACCCCTCACCTTTGGCGCTGGAACA AAACTGGAGCTGAAACGAGCCGATGCTGCTCCTACCGTGTCCATCTTTCCTGGCTCCGG GGGAGGCGGGAGCGGAGGCGAAGTGAAACTCCAGCAGTCTGGCCCTTCTCTCGTGGAAC CTGGCGCTTCTGTGATGATCTCCTGTAAGGCCTCTGGATCTTCCTTTACCGGCTACAAC ATGAACTGGGTCCGGCAGAACATTGGCAAATCCCTGGAATGGATTGGCGCCATCGATCC TTACTACGGCGGCACATCATACAATCAGAAATTCAAGGGGCGAGCAACACTCACTGTCG ACAAATCTTCATCCACCGCCTACATGCACCTGAAATCTCTCACATCCGAGGATAGTGCT GTCTACTACTGTGTCTCTGGCATGGAATACTGGGGACAGGGAACTTCTGTCACCGTGTC TAGTGCCAAAACCACACCTCCCTCCGTGTACGGACGAGTCACTGTCTCATCTGCTGAAC CAAAATCCTGTGACAAAACACACACATGCCCACCTTGTCCTGCCCCTGAACTGCTCGGC GGACCTTCCGTCTTTCTGTTTCCCCCCAAACCCAAGGATACACTCATGATTTCTAGGAC CCCCGAAGTCACTTGTGTCGTGGTCGATGTGTCTCACGAGGATCCTGAAGTGAAATTCA ACTGGTACGTGGACGGAGTCGAGGTCCACAATGCCAAAACAAAACCCCGGGAGGAACAG TACAATAGCACCTACCGAGTCGTGTCCGTGCTCACCGTCCTCCATCAGGATTGGCTGAA CGGCAAAGAGTACAAGTGTAAAGTGAGTAACAAGGCTCTCCCCGCTCCTATTGAAAAAA CCATCTCAAAAGCAAAAGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCCTCA CGGGACGAACTCACCAAAAATCAGGTGTCCCTCACTTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCC TTCCGATATCGCTGTGGAATGGGAGTCAAATGGGCAGCCCGAAAACAACTACAAAACAA CCCCCCCTGTGCTCGATTCCGATGGCTCTTTTTTCCTGTACTCCAAACTCACCGTGGAC AAATCACGCTGGCAGCAGGGGAATGTCTTTTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCA CAATCATTACACCCAGAAATCCCTCTCACTCTCACCCGGCAAAAAGGACCCTAAAACCA CGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCC CTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGA CTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCC TGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTC AAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCG ATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG ACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGA AGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAA GCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGG CGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGAT GGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCA GGCCCTGCCCCCTCGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCG ACGTGGAGGAAAACCCTGGCCCCATGTCCAGCAAAGGCTCCGTGGTTCTGGCCTACAGT GGCGGCCTGGACACCTCGTGCATCCTCGTGTGGCTGAAGGAACAAGGCTATGACGTCAT TGCCTATCTGGCCAACATTGGCCAGAAGGAAGACTTCGAGGAAGCCAGGAAGAAGGCAC TGAAACTTGGGGCCAAAAAGGTGTTCATTGAGGATGTCAGCAGGGAGTTTGTGGAGGAG TTCATCTGGCCGGCCATCCAGTCCAGCGCACTGTATGAGGACCGCTACCTCCTGGGCAC CTCTCTTGCCAGGCCCTGCATCGCCCGCAAACAAGTGGAAATCGCCCAGCGGGAGGGGG CCAAGTATGTGTCCCACGGCGCCACAGGAAAGGGGAACGATCAGGTCCGGTTTGAGCTC AGCTGCTACTCACTGGCCCCCCAGATAAAGGTCATTGCTCCCTGGAGGATGCCTGAATT CTACAACCGGTTCAAGGGCCGCAATGACCTGATGGAGTACGCAAAGCAACACGGGATTC CCATCCCGGTCACTCCCAAGAACCCGTGGAGCATGGATGAGAACCTCATGCACATCAGC TACGAGGCTGGAATCCTGGAGAACCCCAAGAACCAAGCGCCTCCAGGTCTCTACACGAA GACCCAGGACCCAGCCAAAGCCCCCAACACCCCTGACATTCTCGAGATCGAGTTCAAAA AAGGGGTCCCTGTGAAGGTGACCAACGTCAAGGATGGCACCACCCACCAGACCTCCTTG GAGCTCTTCATGTACCTGAACGAAGTCGCGGGCAAGCATGGCGTGGGCCGTATTGACAT CGTGGAGAACCGCTTCATTGGAATGAAGTCCCGAGGTATCTACGAGACCCCAGCAGGCA CCATCCTTTACCATGCTCATTTAGACATCGAGGCCTTCACCATGGACCGGGAAGTGCGC AAAATCAAACAAGGCCTGGGCTTGAAATTTGCTGAGCTGGTGTATACCGGTTTCTGGCA CAGCCCTGAGTGTGAATTTGTCCGCCACTGCATCGCCAAGTCCCAGGAGCGAGTGGAAG GGAAAGTGCAGGTGTCCGTCCTCAAGGGCCAGGTGTACATCCTCGGCCGGGAGTCCCCA CTGTCTCTCTACAATGAGGAGCTGGTGAGCATGAACGTGCAGGGTGATTATGAGCCAAC TGATGCCACCGGGTTCATCAACATCAATTCCCTCAGGCTGAAGGAATATCATCGTCTCC AGAGCAAGGTCACTGCCAAAGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGT GACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGCTGTTTAATCTGAGGATCCTGTTAAACAATGC AGCTTTTAGAAATGGTCACAACTTCATGGTTCGAAATTTTCGGTGTGGACAACCACTAC AAAATAAAGTGCAGCTGAAGGGCCGTGACCTTCTCACTCTAAAAAACTTTACCGGAGAA GAAATTAAATATATGCTATGGCTATCAGCAGATCTGAAATTTAGGATAAAACAGAAAGG AGAGTATTTGCCTTTATTGCAAGGGAAGTCCTTAGGCATGATTTTTGAGAAAAGAAGTA CTCGAACAAGATTGTCTACAGAAACAGGCTTAGCACTTCTGGGAGGACATCCTTGTTTT CTTACCACACAAGATATTCATTTGGGTGTGAATGAAAGTCTCACGGACACGGCCCGTGT ATTGTCTAGCATGGCAGATGCAGTATTGGCTCGAGTGTATAAACAATCAGATTTGGACA CCCTGGCTAAAGAAGCATCCATCCCAATTATCAATGGGCTGTCAGATTTGTACCATCCT ATCCAGATCCTGGCTGATTACCTCACGCTCCAGGAACACTATAGCTCTCTGAAAGGTCT TACCCTCAGCTGGATCGGGGATGGGAACAATATCCTGCACTCCATCATGATGAGCGCAG CGAAATTCGGAATGCACCTTCAGGCAGCTACTCCAAAGGGTTATGAGCCGGATGCTAGT GTAACCAAGTTGGCAGAGCAGTATGCCAAAGAGAATGGTACCAAGCTGTTGCTGACAAA TGATCCATTGGAAGCAGCGCATGGAGGCAATGTATTAATTACAGACACTTGGATAAGCA TGGGACAAGAAGAGGAGAAGAAAAAGCGGCTCCAGGCTTTCCAAGGTTACCAGGTTACA ATGAAGACTGCTAAAGTTGCTGCCTCTGACTGGACATTTTTACACTGCTTGCCCAGAAA GCCAGAAGAAGTGGATGATGAAGTCTTTTATTCTCCTCGATCACTAGTGTTCCCAGAGG CAGAAAACAGAAAGTGGACAATCATGGCTGTCATGGTGTCCCTGCTGACAGATTACTCA
CCTCAGCTCCAGAAGCCTAAATTTTAA ID de Sequência NO: 38 - sequência de DNA que codifica CAR exemplificativa de GD2 ASS1 sem vetor MP71
ATGCCTCGCGGCTGGACAGCCCTGTGCCTGCTGTCTCTGCTGCCATCCGGCTTCATGAG CCTGGATAATAACGGCACAGCCACCCCAGAGCTGCCTACACAGGGCACCTTCAGCAATG TGTCCACAAACGTGAGCTATCAGGAGACCACAACCCCTTCTACCCTGGGATCCACAAGC CTGCACCCCGTGTCTCAGCACGGCAACGAAGCCACCACCAACATCACCGAGACCACAGT GAAGTTTACCTCCACCTCTGTGATTACCTCTGTGTACGGAAATACAAACTCCAGCGTGC AGTCTCAGACATCTGTGATCTCCACAGTGTTTACAACACCTGCCAATGTGTCCACCCCA GAGACAACCCTGAAGCCCAGCCTGTCTCCTGGAAATGTGTCCGATCTGTCTACCACCTC CACCAGCCTGGCCACCTCTCCCACCAAGCCCTATACCTCCTCTTCTCCCATCCTGAGCG ATATCAAAGCCGAGATCAAATGCAGCGGGATTCGGGAAGTGAAACTGACACAGGGCATC TGCCTGGAACAGAATAAGACATCCAGCTGCGCCGAGTTTAAGAAAGATAGAGGAGAGGG ACTGGCCAGGGTGCTGTGTGGCGAAGAGCAGGCCGACGCCGATGCCGGCGCCCAGGTGT GTTCCCTGCTGCTGGCCCAGTCTGAGGTGCGCCCCCAGTGCCTGCTGCTGGTGCTGGCC AATCGGACAGAAATTAGCAGCAAGCTGCAGCTGATGAAAAAACACCAGAGCGATCTGAA AAAGCTGGGCATCCTGGACTTTACCGAGCAGGACGTGGCCTCTCACCAGAGCTACAGCC AGAAAACACTGATCGCCCTGGTGACCAGCGGAGCCCTGCTGGCCGTGCTGGGCATCACC GGATATTTCCTGATGAATAGGCGCAGCTGGAGCCCCACCGGCGAACGGCTGGAGCTGGA GCCTGTCGACCGAGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACG TGGAGTCCAACCCCGGGCCAGGGAATATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCG CTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGATATTCTGCTCACACAGACCCCACTCTC CCTGCCCGTGTCACTCGGGGATCAGGCTAGCATTTCTTGCCGCTCATCTCAGTCTCTGG TCCACCGGAATGGGAACACATACCTCCATTGGTACCTCCAGAAACCTGGACAGAGCCCT AAACTGCTCATCCACAAAGTCTCAAATCGGTTCTCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGG ATCCGGATCTGGGACCGACTTCACACTGAAAATCTCACGAGTGGAGGCTGAGGATCTCG GCGTCTACTTCTGTAGTCAGAGTACCCACGTCCCACCCCTCACCTTTGGCGCTGGAACA AAACTGGAGCTGAAACGAGCCGATGCTGCTCCTACCGTGTCCATCTTTCCTGGCTCCGG GGGAGGCGGGAGCGGAGGCGAAGTGAAACTCCAGCAGTCTGGCCCTTCTCTCGTGGAAC CTGGCGCTTCTGTGATGATCTCCTGTAAGGCCTCTGGATCTTCCTTTACCGGCTACAAC ATGAACTGGGTCCGGCAGAACATTGGCAAATCCCTGGAATGGATTGGCGCCATCGATCC TTACTACGGCGGCACATCATACAATCAGAAATTCAAGGGGCGAGCAACACTCACTGTCG ACAAATCTTCATCCACCGCCTACATGCACCTGAAATCTCTCACATCCGAGGATAGTGCT GTCTACTACTGTGTCTCTGGCATGGAATACTGGGGACAGGGAACTTCTGTCACCGTGTC TAGTGCCAAAACCACACCTCCCTCCGTGTACGGACGAGTCACTGTCTCATCTGCTGAAC CAAAATCCTGTGACAAAACACACACATGCCCACCTTGTCCTGCCCCTGAACTGCTCGGC GGACCTTCCGTCTTTCTGTTTCCCCCCAAACCCAAGGATACACTCATGATTTCTAGGAC CCCCGAAGTCACTTGTGTCGTGGTCGATGTGTCTCACGAGGATCCTGAAGTGAAATTCA ACTGGTACGTGGACGGAGTCGAGGTCCACAATGCCAAAACAAAACCCCGGGAGGAACAG TACAATAGCACCTACCGAGTCGTGTCCGTGCTCACCGTCCTCCATCAGGATTGGCTGAA CGGCAAAGAGTACAAGTGTAAAGTGAGTAACAAGGCTCTCCCCGCTCCTATTGAAAAAA CCATCTCAAAAGCAAAAGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCCTCA CGGGACGAACTCACCAAAAATCAGGTGTCCCTCACTTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCC TTCCGATATCGCTGTGGAATGGGAGTCAAATGGGCAGCCCGAAAACAACTACAAAACAA CCCCCCCTGTGCTCGATTCCGATGGCTCTTTTTTCCTGTACTCCAAACTCACCGTGGAC AAATCACGCTGGCAGCAGGGGAATGTCTTTTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCA CAATCATTACACCCAGAAATCCCTCTCACTCTCACCCGGCAAAAAGGACCCTAAAACCA CGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCC CTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGA CTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCC TGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTC AAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCG ATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG ACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGA AGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAA GCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGG CGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGAT GGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCA GGCCCTGCCCCCTCGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCG ACGTGGAGGAAAACCCTGGCCCCATGTCCAGCAAAGGCTCCGTGGTTCTGGCCTACAGT GGCGGCCTGGACACCTCGTGCATCCTCGTGTGGCTGAAGGAACAAGGCTATGACGTCAT TGCCTATCTGGCCAACATTGGCCAGAAGGAAGACTTCGAGGAAGCCAGGAAGAAGGCAC TGAAACTTGGGGCCAAAAAGGTGTTCATTGAGGATGTCAGCAGGGAGTTTGTGGAGGAG TTCATCTGGCCGGCCATCCAGTCCAGCGCACTGTATGAGGACCGCTACCTCCTGGGCAC CTCTCTTGCCAGGCCCTGCATCGCCCGCAAACAAGTGGAAATCGCCCAGCGGGAGGGGG CCAAGTATGTGTCCCACGGCGCCACAGGAAAGGGGAACGATCAGGTCCGGTTTGAGCTC AGCTGCTACTCACTGGCCCCCCAGATAAAGGTCATTGCTCCCTGGAGGATGCCTGAATT CTACAACCGGTTCAAGGGCCGCAATGACCTGATGGAGTACGCAAAGCAACACGGGATTC CCATCCCGGTCACTCCCAAGAACCCGTGGAGCATGGATGAGAACCTCATGCACATCAGC TACGAGGCTGGAATCCTGGAGAACCCCAAGAACCAAGCGCCTCCAGGTCTCTACACGAA GACCCAGGACCCAGCCAAAGCCCCCAACACCCCTGACATTCTCGAGATCGAGTTCAAAA AAGGGGTCCCTGTGAAGGTGACCAACGTCAAGGATGGCACCACCCACCAGACCTCCTTG GAGCTCTTCATGTACCTGAACGAAGTCGCGGGCAAGCATGGCGTGGGCCGTATTGACAT CGTGGAGAACCGCTTCATTGGAATGAAGTCCCGAGGTATCTACGAGACCCCAGCAGGCA CCATCCTTTACCATGCTCATTTAGACATCGAGGCCTTCACCATGGACCGGGAAGTGCGC AAAATCAAACAAGGCCTGGGCTTGAAATTTGCTGAGCTGGTGTATACCGGTTTCTGGCA CAGCCCTGAGTGTGAATTTGTCCGCCACTGCATCGCCAAGTCCCAGGAGCGAGTGGAAG GGAAAGTGCAGGTGTCCGTCCTCAAGGGCCAGGTGTACATCCTCGGCCGGGAGTCCCCA CTGTCTCTCTACAATGAGGAGCTGGTGAGCATGAACGTGCAGGGTGATTATGAGCCAAC TGATGCCACCGGGTTCATCAACATCAATTCCCTCAGGCTGAAGGAATATCATCGTCTCC
AGAGCAAGGTCACTGCCAAATAA ID de Sequência NO: 39 - sequência de DNA que codifica CAR exemplificativa de GD2 OTC sem vetor MP71
ATGCCTCGCGGCTGGACAGCCCTGTGCCTGCTGTCTCTGCTGCCATCCGGCTTCATGAG CCTGGATAATAACGGCACAGCCACCCCAGAGCTGCCTACACAGGGCACCTTCAGCAATG TGTCCACAAACGTGAGCTATCAGGAGACCACAACCCCTTCTACCCTGGGATCCACAAGC CTGCACCCCGTGTCTCAGCACGGCAACGAAGCCACCACCAACATCACCGAGACCACAGT GAAGTTTACCTCCACCTCTGTGATTACCTCTGTGTACGGAAATACAAACTCCAGCGTGC AGTCTCAGACATCTGTGATCTCCACAGTGTTTACAACACCTGCCAATGTGTCCACCCCA GAGACAACCCTGAAGCCCAGCCTGTCTCCTGGAAATGTGTCCGATCTGTCTACCACCTC CACCAGCCTGGCCACCTCTCCCACCAAGCCCTATACCTCCTCTTCTCCCATCCTGAGCG ATATCAAAGCCGAGATCAAATGCAGCGGGATTCGGGAAGTGAAACTGACACAGGGCATC TGCCTGGAACAGAATAAGACATCCAGCTGCGCCGAGTTTAAGAAAGATAGAGGAGAGGG ACTGGCCAGGGTGCTGTGTGGCGAAGAGCAGGCCGACGCCGATGCCGGCGCCCAGGTGT GTTCCCTGCTGCTGGCCCAGTCTGAGGTGCGCCCCCAGTGCCTGCTGCTGGTGCTGGCC AATCGGACAGAAATTAGCAGCAAGCTGCAGCTGATGAAAAAACACCAGAGCGATCTGAA AAAGCTGGGCATCCTGGACTTTACCGAGCAGGACGTGGCCTCTCACCAGAGCTACAGCC AGAAAACACTGATCGCCCTGGTGACCAGCGGAGCCCTGCTGGCCGTGCTGGGCATCACC GGATATTTCCTGATGAATAGGCGCAGCTGGAGCCCCACCGGCGAACGGCTGGAGCTGGA GCCTGTCGACCGAGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACG TGGAGTCCAACCCCGGGCCAGGGAATATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCG CTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGATATTCTGCTCACACAGACCCCACTCTC CCTGCCCGTGTCACTCGGGGATCAGGCTAGCATTTCTTGCCGCTCATCTCAGTCTCTGG TCCACCGGAATGGGAACACATACCTCCATTGGTACCTCCAGAAACCTGGACAGAGCCCT AAACTGCTCATCCACAAAGTCTCAAATCGGTTCTCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGG ATCCGGATCTGGGACCGACTTCACACTGAAAATCTCACGAGTGGAGGCTGAGGATCTCG GCGTCTACTTCTGTAGTCAGAGTACCCACGTCCCACCCCTCACCTTTGGCGCTGGAACA AAACTGGAGCTGAAACGAGCCGATGCTGCTCCTACCGTGTCCATCTTTCCTGGCTCCGG GGGAGGCGGGAGCGGAGGCGAAGTGAAACTCCAGCAGTCTGGCCCTTCTCTCGTGGAAC CTGGCGCTTCTGTGATGATCTCCTGTAAGGCCTCTGGATCTTCCTTTACCGGCTACAAC ATGAACTGGGTCCGGCAGAACATTGGCAAATCCCTGGAATGGATTGGCGCCATCGATCC TTACTACGGCGGCACATCATACAATCAGAAATTCAAGGGGCGAGCAACACTCACTGTCG ACAAATCTTCATCCACCGCCTACATGCACCTGAAATCTCTCACATCCGAGGATAGTGCT GTCTACTACTGTGTCTCTGGCATGGAATACTGGGGACAGGGAACTTCTGTCACCGTGTC TAGTGCCAAAACCACACCTCCCTCCGTGTACGGACGAGTCACTGTCTCATCTGCTGAAC CAAAATCCTGTGACAAAACACACACATGCCCACCTTGTCCTGCCCCTGAACTGCTCGGC GGACCTTCCGTCTTTCTGTTTCCCCCCAAACCCAAGGATACACTCATGATTTCTAGGAC CCCCGAAGTCACTTGTGTCGTGGTCGATGTGTCTCACGAGGATCCTGAAGTGAAATTCA ACTGGTACGTGGACGGAGTCGAGGTCCACAATGCCAAAACAAAACCCCGGGAGGAACAG TACAATAGCACCTACCGAGTCGTGTCCGTGCTCACCGTCCTCCATCAGGATTGGCTGAA CGGCAAAGAGTACAAGTGTAAAGTGAGTAACAAGGCTCTCCCCGCTCCTATTGAAAAAA CCATCTCAAAAGCAAAAGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCCTCA CGGGACGAACTCACCAAAAATCAGGTGTCCCTCACTTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCC TTCCGATATCGCTGTGGAATGGGAGTCAAATGGGCAGCCCGAAAACAACTACAAAACAA CCCCCCCTGTGCTCGATTCCGATGGCTCTTTTTTCCTGTACTCCAAACTCACCGTGGAC AAATCACGCTGGCAGCAGGGGAATGTCTTTTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCA CAATCATTACACCCAGAAATCCCTCTCACTCTCACCCGGCAAAAAGGACCCTAAAACCA CGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCC CTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGA CTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCT TGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTG CACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCA GCCCTATGCCCCACCTCGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGA GCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTA GGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGG GGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATA AGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGG CACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCA CATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGG CCGGCGACGTGGAGGAAAACCCTGGCCCCATGCTGTTTAATCTGAGGATCCTGTTAAAC AATGCAGCTTTTAGAAATGGTCACAACTTCATGGTTCGAAATTTTCGGTGTGGACAACC ACTACAAAATAAAGTGCAGCTGAAGGGCCGTGACCTTCTCACTCTAAAAAACTTTACCG GAGAAGAAATTAAATATATGCTATGGCTATCAGCAGATCTGAAATTTAGGATAAAACAG AAAGGAGAGTATTTGCCTTTATTGCAAGGGAAGTCCTTAGGCATGATTTTTGAGAAAAG AAGTACTCGAACAAGATTGTCTACAGAAACAGGCTTAGCACTTCTGGGAGGACATCCTT GTTTTCTTACCACACAAGATATTCATTTGGGTGTGAATGAAAGTCTCACGGACACGGCC CGTGTATTGTCTAGCATGGCAGATGCAGTATTGGCTCGAGTGTATAAACAATCAGATTT GGACACCCTGGCTAAAGAAGCATCCATCCCAATTATCAATGGGCTGTCAGATTTGTACC ATCCTATCCAGATCCTGGCTGATTACCTCACGCTCCAGGAACACTATAGCTCTCTGAAA GGTCTTACCCTCAGCTGGATCGGGGATGGGAACAATATCCTGCACTCCATCATGATGAG CGCAGCGAAATTCGGAATGCACCTTCAGGCAGCTACTCCAAAGGGTTATGAGCCGGATG CTAGTGTAACCAAGTTGGCAGAGCAGTATGCCAAAGAGAATGGTACCAAGCTGTTGCTG ACAAATGATCCATTGGAAGCAGCGCATGGAGGCAATGTATTAATTACAGACACTTGGAT AAGCATGGGACAAGAAGAGGAGAAGAAAAAGCGGCTCCAGGCTTTCCAAGGTTACCAGG TTACAATGAAGACTGCTAAAGTTGCTGCCTCTGACTGGACATTTTTACACTGCTTGCCC AGAAAGCCAGAAGAAGTGGATGATGAAGTCTTTTATTCTCCTCGATCACTAGTGTTCCC AGAGGCAGAAAACAGAAAGTGGACAATCATGGCTGTCATGGTGTCCCTGCTGACAGATT
ACTCACCTCAGCTCCAGAAGCCTAAATTTTAA ID de Sequência No: 40 - CD3z alternativo
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCT CTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTG GCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTG TACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGG CGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCA
AGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA ID de Sequência No: 41 - DNA que codifica uma porção de ligação a EGFRvIII alternativa (sequência scFv de EGFRvIII derivada de anticorpo MR1) atggactggatttggcgcatccttttccttgtcggcgctgctaccggcgcgcattctca ggtacaactccagcagtctgggggaggcttagtgaagcctggagcgtctctgaaactct cctgtgtaacctctggattcactttcagaaaatttggcatgtcttgggttcgccagact agtgacaagaggctggaatgggtcgcatccattagtactggcggttataacacgtacta ttcagacaatgtaaagggccgattcaccatctccagagagaatgccaagaacaccctgt acctgcaaatgagtagtctgaagtctgaggacacggccttgtattactgtacaagaggc tattctagtacctcttatgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctc ctcaagtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacatcgagc tcactcagtctccagcatccctgtccgtggctacaggagaaaaagtcactatcagatgc atgaccagcactgatattgatgatgatatgaactggtaccagcagaagccaggggaacc ccctaagttccttatttcagaaggcaatactcttcggccgggagtcccatcccgatttt ccagcagtggcactggcacagattttgtttttacaattgaaaacacactctcggaagat gttggagattactactgtttgcaaagctttaacgtgcctcttacattcggtgatggcac caagcttgaaaaagctcta ID de Sequência No: 42 - sequência de aminoácidos de um CAR exemplificativo de EGFRvIII (empregando a porção de ligação a EGFRvIII alternativa codificada pela SEQ ID NO: 41) incluindo um domínio ASS-1
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPMDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFR KFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSE DTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSV ATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFV FTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR PEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQ PFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRRE EYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGG LDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFI WPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSC YSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYE AGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLEL FMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKI KQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLS
LYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK ID de Sequência No: 43 - aminoácidos de um CAR exemplificativa de EGFRvIII (empregando a porção de ligação a EGFRvIII alternativa codificada pela SEQ ID NO: 41) incluindo um domínio OTC
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPMDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFR KFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSE DTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSV ATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFV FTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR PEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQ PFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRRE EYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAF RNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEY LPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLS SMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTL SWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDP LEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPE
EVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF ID de Sequência No: 44 - sequência de aminoácidos de um CAR exemplificativa de EGFRvIII (empregando a porção de ligação alvo de EGFRvIII alternativa codificado por SEQ ID NO: 41), incluindo um ASS-1 de domínio e um domínio de OTC
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTS LHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTP ETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGI CLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLA NRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGIT GYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLP LALLLHAARPMDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFR KFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSE DTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSV ATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFV FTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR PEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQ PFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRRE EYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGG LDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFI WPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSC YSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYE AGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLEL FMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKI KQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLS LYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAKGSGEGRGSLLTCGDV EENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEI KYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLT TQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQ ILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVT KLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMK TAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQ LQKPKF

Claims (51)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína de ligação ao alvo de fusão caracterizada pelo fato de que compreende uma fração de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina.
2. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina compreende um domínio enzimático.
3. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o domínio enzimático é selecionado do grupo que consiste em: um domínio ASS-1; um domínio OTC; um domínio ASL; um domínio OCD1; um domínio ArgG; um domínio ArgH; e um domínio ArgF.
4. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o domínio ASS-1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1.
5. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 3 ou reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o domínio OTC compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 2.
6. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que o domínio ASL compreende a sequência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO. 30.
7. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada pelo fato de que o domínio ODC1 compreende a sequência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO. 31.
8. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizada pelo fato de que o domínio ArgG compreende a sequência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO. 32.
9 Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizada pelo fato de que o domínio ArgH compreende a sequência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO. 33.
10. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, caracterizada pelo fato de que o domínio ArgF compreende a sequência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO. 34.
11. Proteína de ligação ao alvo de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende uma fração de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano.
12. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano compreende um domínio enzimático.
13. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 11 ou reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o domínio enzimático é selecionado do grupo que consiste em: um domínio TRP5; e um domínio IDO;
14. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o domínio TRP5 compreende a sequência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO. 35.
15. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 13 ou reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o domínio IDO compreende a sequência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO. 36.
16. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a fração de ligação ao alvo é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma fração de ligação ao alvo de GD2; uma fração de ligação ao alvo CD33; uma fração de ligação ao alvo da mesotelina; e uma fração de ligação ao alvo de EGFRvIII.
17. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a fração de ligação ao alvo GD2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 3.
18. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a fração de ligação ao alvo CD33 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 4.
19. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a fração de ligação ao alvo de mesotelina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 5.
20. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a fração de ligação ao alvo de EGFRvIII compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 6
21. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende uma região selecionada do grupo que consiste em: uma região de sinalização 4-1BB; uma região de sinalização OX-40; uma região de sinalização CD28; uma região de sinalização ICOS; e uma região de sinalização CD3.
22. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende uma região de sinalização 4-1BB.
23. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 21 ou reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a região de sinalização intracelular 4-1BB compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 7.
24. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 23, caracterizada pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende um domínio CD3 ζ.
25. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o domínio CD3 ζ compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 40.
26. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizada pelo fato de que compreende ambos um domínio 4-1BB e um domínio CD3 ζ.
27. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12 a 23.
28. Proteína de ligação ao alvo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento.
29. Proteína de ligação ao alvo de fusão para uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção ou tratamento de câncer.
30. Célula caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de ligação ao alvo de fusão compreendendo uma fração de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina.
31. Célula, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao alvo de fusão é conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 16 a 27.
32. Célula caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de ligação ao alvo de fusão compreendendo uma fração de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano.
33. Célula, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao alvo de fusão é conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 27.
34. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento.
35. Célula para uso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que para uso na prevenção ou tratamento de câncer.
36. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína de ligação ao alvo de fusão compreendendo uma fração de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de arginina ou um precursor de arginina.
37. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação ao alvo de fusão é conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 16 a 27.
38. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 36 ou reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de DNA da SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; ou SEQ ID NO: 37.
39. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína de ligação ao alvo de fusão compreendendo uma fração de ligação ao alvo, uma região de sinalização intracelular e um domínio que promove a síntese de triptofano ou um precursor de triptofano.
40. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação ao alvo de fusão é conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 27.
41. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 40, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.
42. Ácido nucleico para uso, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de ser para uso na prevenção ou tratamento de câncer.
43. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de ligação ao alvo de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30; e/ou uma célula conforme definida em qualquer uma das reivindicações 30 a 35; e/ou um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 36 a 42.
44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento.
45. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de para uso na prevenção ou tratamento de câncer.
46. Método para tratamento de uma condição em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende fornecer ao indivíduo uma proteína de ligação ao alvo de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 29.
47. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação ao alvo de fusão é fornecida pela expressão celular de uma sequência de ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 37 a 43.
48. Método para tratamento de uma condição em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende fornecer ao indivíduo uma célula conforme definida em qualquer uma das reivindicações 30 a
35.
49. Método para tratar uma condição em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende fornecer ao indivíduo um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 36 a
42.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de câncer.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de infecção viral.
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