BR112019024918A2

BR112019024918A2 - Vírus oncolítico e método

Info

Publication number: BR112019024918A2
Application number: BR112019024918-4A
Authority: BR
Inventors: champion Brian; Brian Champion; Calire Noel Bromley Alice; Alice Calire Noel Bromley; Besneux Mathieu; Mathieu BESNEUX
Original assignee: Psioxus Therapeutics Limited
Priority date: 2017-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2020-06-23
Also published as: EP4269438A3; CL2019003393A1; IL270989B2; PL3630143T3; PH12019502522A1; JP7394628B2; IL270989B1; AU2018277294A1; ES2952601T3; MX2019014184A; EP3630143B1; HRP20230812T1; KR20200026835A; CN111246867A; US11142580B2; ZA201907351B; MY197684A; WO2018220207A1; PT3630143T; CN111246867B

Abstract

Trata-se de um vírus oncolítico (por exemplo, um vírus competente para replicação) que compreende um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação do mesmo, em que o cassete de transgene compreende uma sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 12 ou uma sequência pelo menos 95% idêntica à mesma (tal como 96, 97, 98 ou 99% idêntica à mesma), em particular, um cassete da SEQ ID NO: 12; composições farmacêuticas que compreendem o mesmo, métodos para preparar o dito vírus oncolítico e composições e uso do vírus oncolítico ou composição em tratamento, em particular no tratamento de câncer. Também é fornecido o tratamento de uma população de pacientes caracterizada como tendo um câncer que expressa CD40, em particular um câncer que superexpressa CD40, com uma terapia de acordo com a presente revelação.

Description

“VÍRUS ONCOLÍTICO E MÉTODO”

[0001] A presente revelação refere-se a um vírus oncolítico, tal como um adenovírus, composições que compreendem o vírus oncolítico da presente revelação, métodos para preparar o dito vírus oncolítico e composições e uso do vírus oncolítico ou composição em tratamento, em particular no tratamento de câncer. Também é fornecido o tratamento de uma população de pacientes caracterizada como tendo um câncer que expressa CD40, em particular um câncer que superexpressa CD40, com uma terapia de acordo com a presente revelação.

ANTECEDENTES

[0002] CD40 é um ativador para células B e T, por exemplo, CD40 em células apresentadoras de antígeno se liga a CD40L (também conhecido como CD 154) em células T para ativar o mesmo. CD40 está também presente em diversas células tumorais, que usam o CD40 para obter citocinas e fatores de crescimento das células circundantes para sustentar o crescimento e a expansão do câncer.

[0003] Os anticorpos anti-CD40 agonísticos in vivo podem ter capacidade para estimular respostas imunológicas antitumorais devido à ação sobre células imunes. Isso pode ser pelo fato de que o CD40 tem a capacidade de, por exemplo, ativar macrófagos e "pré-condicionar" células dendríticas, permitindo que as mesmas iniciem as respostas eficazes de células T citotóxicas.

[0004] No presente momento, há um interesse significativo em terapias de imuno-oncologia e/ou terapias direcionadas a macrófagos associados a tumor (TAMs). Esses macrófagos associados a tumor circundam o tumor e contribuem para criar um microambiente, que é permissivo ao crescimento e desenvolvimento tumoral. Esse microambiente é frequentemente hipóxico e pode neutralizar células imunes enviadas para se fixar e eliminar o tumor. Assim, o microambiente protege fisicamente o tumor. Além disso, fornece energia e nutrientes para sustentar o crescimento tumoral.

[0005] Entretanto, para serem eficazes as terapias precisam realmente ter como alvo esse ambiente para revigorar, liberar, recrutar e reativar células imunes, por exemplo, já aprisionadas no microambiente. Esse alvejamento do microambiente não é fácil de realizar devido ao fato de que, algumas vezes, o tumor tem mecanismos de desenvolvimento para proteção, tais como mecanismos de transporte ativos que movem produtos terapêuticos para fora do ambiente tumoral. Ou seja, por exemplo, um dos mecanismos envolvidos na resistência.

[0006] Os vírus oncolíticos, tais como adenovírus oncolíticos do grupo B, que se direcionam às células tumorais e infectam seletivamente as células cancerosas podem ser aproveitadas para entregar o anticorpo anti-CD40 ao microambiente do tumor. O vírus oncolítico tem propriedades anticâncer, que resultam na morte da célula cancerosa e liberação do conteúdo da dita célula. O conteúdo da célula inclui o anticorpo anti-CD40 produzido pelo vírus oncolítico. Assim, a morte da célula cancerosa libera o anticorpo no microambiente do tumor. Surpreendentemente, os presentes inventores mostraram que os anticorpos anti-CD40 podem ser eficazmente entregues por uma variedade de diferentes vírus oncolíticos incorporando-se transgenes que codifica anticorpos anti-CD40 em tais vírus, por exemplo, transduzindo-se os vírus com um cassete de transgene da presente revelação.

[0007] Adicionalmente, devido ao fato de que os tumores desenvolveram múltiplos mecanismos para proteção, acredita-se que as terapias contra câncer mais eficazes no futuro precisarão atacar o câncer por meio de dois ou mais mecanismos biológicos.

[0008] Empregar anticorpos anti-CD40 agonísticos pode ter o benefício adicional de que, uma vez que o anticorpo esteja no microambiente tumoral em concentrações adequadas, o mesmo pode competir com células cancerosas que expressam CD40 pela ligação a CD40L. Isso significa por fim que haverá menos oportunidade para as células cancerosas se ligarem a CD40L na célula T. Por sua vez, isso pode significar que a quantidade de energia e nutrientes disponíveis para o pode ser reduzida.

[0009] Os presentes inventores projetaram um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação do mesmo que pode ser usado para produzir vírus estáveis.

PARÁGRAFOS DE RESUMO DA REVELAÇÃO

[0010] A presente revelação fornece:

[0011] 1. Um vírus oncolítico (por exemplo, um vírus competente para replicação) que compreende um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação do mesmo, em que o cassete de transgene compreende uma sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 12 ou uma sequência pelo menos 95% idêntica à mesma (tal como 96, 97, 98 ou 99% idêntica à mesma, especialmente sobre o comprimento completo da sequência), em particular, um cassete da SEQ ID NO: 12.

[0012] (Alternativo) parágrafo 1: Um adenovírus oncolítico (por exemplo, um adenovírus oncolítico compreende para replicação) que codifica um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação do mesmo, em que o adenovírus compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência pelo menos 95% idêntica à mesma (tal como 96, 97,98 ou 99% idêntica à mesma).

[0013] 2. Um vírus oncolítico, de acordo com o parágrafo 1, em que o vírus é selecionado dentre um adenovírus, vírus herpes simplex, reovírus, vírus do sarampo, vírus da doença de Newcastle, vírus Seneca Valley, vírus da estomatite vesicular, poliovírus, enterovírus ECHO, vírus de Coxsackie e vírus vaccinia, em particular um adenovírus.

[0014] 3. Um vírus oncolítico, de acordo com 1 ou 2, em que o vírus é selecionado a partir do grupo que consiste em Enadenotucirev, talimogene laherparepvec, R1GV1R, Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12, Cavatak™, CG0070, DNX-2401, G207, HF10, Imlygic®, JX-594, MG1-MA3, MV- N1S, OBP-301, Reolysin®, Toca 511, em particular Enadenotucirev.

[0015] 4. Um vírus oncolítico, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que o vírus compreende a SEQ ID NO: 1.

[0016] 5. Vírus oncolítico, de acordo com o parágrafo 4, que consiste na SEQ ID NO: 1.

[0017] 6. Uma composição farmacêutica que compreende um vírus, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, e um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[0018] 7. Um vírus oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma composição farmacêutica, de acordo com o parágrafo 6, para uso em tratamento.

[0019] 8. Um vírus oncolítico, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, ou uma composição farmacêutica, de acordo com o parágrafo 6, para uso no tratamento de câncer, resistência à insulina, obesidade e/ou imunodeficiência.

[0020] 9. Um uso, de acordo com o parágrafo 6, em que o vírus ou a composição é para uso no tratamento de câncer, por exemplo, para o tratamento de câncer que expressa CD40 (tal como câncer com expressão regulada de modo crescente de CD40)

[0021] 10. Uma terapia de combinação (por exemplo, para uso no tratamento de câncer) que compreende um vírus, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, ou uma composição, de acordo com o parágrafo 6, e uma terapia anticâncer adicional.

[0022] 11. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 10, em que a terapia anticâncer adicional é quimioterapia.

[0023] 12. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 10 ou 11, em que a terapia anticâncer adicional é um inibidor de ponto de verificação.

[0024] 13. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 12, em que a terapia anticâncer é selecionada a partir do grupo que compreende um inibidor de PD-1, um inibidor de a PD-L1, um inibidor de CTLA-4, um inibidor de TIM-3, um inibidor de LAG-3, um inibidor de TIGIT, um inibidor de B7-H3 (CD276), um inibidor de B7-H4 (B7S1), um inibidor de B7H7

(HHLA2), um inibidor de CD96, um inibidor de VISTA e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

[0025] 14. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 13, em que o inibidor é um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo.

[0026] 15. Uma terapia de combinação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 14, em que a terapia anticâncer adicional é um agonista da trajetória de coestimulação.

[0027] 16. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 15, em que a terapia anticâncer adicional é selecionada a partir do grupo que consiste em um agonista de CD27, um agonista de CD28, um agonista de IGOS, um agonista de TMIGD2 (1GPR-1/CD28H), um agonista de CD226, um agonista de OX40, um agonista de 4-1BB e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

[0028] 17. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 16, em que a terapia é um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo.

[0029] 18. Uma terapia de combinação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 17, em que a terapia anticâncer adicional ativa as respostas imunológicas ou a supressão reversa de respostas imunológicas, por exemplo selecionadas dentre IL-10, TGFβ, inibidores de IDO e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

[0030] 19. Uma terapia de combinação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 18, caracterizada pelo fato de que a terapia contra câncer adicional é um vírus oncolítico (um vírus oncolítico adicional), por exemplo, um vírus oncolítico competente para replicação, tal como um adenovírus, em particular um adenovírus do grupo B.

[0031] 20. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 19, em que o vírus oncolítico (um vírus oncolítico adicional) codifica um gene terapêutico que codifica material selecionado a partir do grupo que consiste em uma sequência de RNAi, um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo, quimiocinas, citocinas, imunomodulador e enzimas.

[0032] 21. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 20, em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é específico para OX40, ligante de OX40, CD27, CD28, CD30, CD40, ligante de CD40, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS, ligante de IC0S, CTLA-4, PD-1, PD- L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT, CD160, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD40, ligante de CD40 e combinações de dois ou mais dos mesmos.

[0033] 22. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 20 ou 21, em que a citocina é independentemente selecionada a partir do grupo que compreende IL-1α, IL-1β,IL-6,IL-9,IL-12, IL-13,IL-17, IL-18, IL-22,IL-23,IL-24, IL-25, IL-26,IL-27,IL-33, IL-35, IL-2,IL-4, IL-5, IL-7,IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNα, IFNβ, IFNY, TNFα, TGFβ, linfotoxina α (LTA) e GM- CSF, por exemplo, IL-12, IL-18, IL-22, IL-7, IL-15, IL-21, IFNY, TNFα ,TGFβ e linfotoxina α (LTA) e combinações de dois ou mais dos mesmos.

[0034] 23. Uma terapia de combinação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 20 a 22, em que a quimiocina é independentemente selecionada a partir do grupo que compreende IL-8, CCL3, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5 e CRTH2, por exemplo, CCL5, CXCL9, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4 e CXCR4, um receptor de qualquer um dos mesmos, e combinações de dois ou mais dos mesmos.

[0035] 24. Uma terapia de combinação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 19 a 23, em que o vírus oncolítico (vírus oncolítico adicional) codifica uma forma ancorada de transmembrana de uma proteína B7, por exemplo, B7-1 ou B7-2.

[0036] 25. Uma terapia de combinação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 19 a 24, em que o vírus oncolítico (vírus oncolítico adicional) codifica um inibidor de ponto de verificação selecionado a partir do grupo que compreende um inibidor de PD-1, um inibidor de PD-L1, um inibidor de CTLA-4, um inibidor de TIM-3, um inibidor de LAG-3, um inibidor de TIGIT, um inibidor de B7-H3 (CD276), um inibidor de B7-H4 (B7S1), um inibidor de B7H7 (HHLA2), um inibidor de CD96, um inibidor de VISTA e combinações de dois ou mais dos mesmos.

[0037] 26. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 25, em que o inibidor é um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo.

[0038] 27. Uma terapia de combinação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 19 a 26, em que o vírus oncolítico (vírus oncolítico adicional) codifica um agonista de trajetória de coestimulação.

[0039] 28. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 27, em que o vírus oncolítico (vírus oncolítico adicional) codifica um agonista de trajetória de coestimulação selecionado a partir do grupo que consiste em um agonista de CD27, um agonista de CD28, um agonista de ICOS, um agonista de TMIGD2 (1GPR-1/CD28H), um agonista de CD226, um agonista de OX40, um agonista de 4-1BB e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

[0040] 29. Uma terapia de combinação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 19 a 28, em que o vírus oncolítico (vírus oncolítico adicional) codifica uma molécula que ativa as respostas imunológicas ou a supressão reversa de respostas imunológicas, por exemplo selecionadas dentre IL-10, TGFβ, inibidores de IDO e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

[0041] 30. Uma formulação farmacêutica que compreende um adenovírus oncolítico, conforme definido em qualquer um dos parágrafos 1 a 5, e que compreende um vírus oncolítico adicional, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 29.

[0042] 31. Uma terapia de combinação, conforme definido em qualquer um dos parágrafos 19 a 29, ou uma composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 30, para uso em tratamento.

[0043] 32. Um vírus oncolítico, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a parágrafo 6 ou 30, para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, resistência à insulina, obesidade e/ou imunodeficiência.

[0044] 33. Um uso de acordo com parágrafo 32, em que o adenovírus ou composição é para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0045] 34. Um uso de acordo com parágrafo 33, em que a população de pacientes alvo para o tratamento tem câncer que expressa CD40, tal como uma população em que CD40 é regulado de modo crescente no câncer.

[0046] 35. Uma terapia de combinação para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer que compreende um vírus, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, ou uma composição, de acordo com o parágrafo 6 ou 30, e uma terapia anticâncer adicional, por exemplo, em que a população de pacientes alvo para tratamento têm câncer que expressa CD40, tal como uma população em que CD40 é regulado de modo crescente no câncer.

[0047] 36. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 35, em que a terapia anticâncer adicional é quimioterapia.

[0048] 37. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 35 ou 36, em que a terapia anticâncer adicional é um inibidor de ponto de verificação.

[0049] 38. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 37, em que a terapia anticâncer é selecionada a partir do grupo que compreende um inibidor de PD-1, um inibidor de a PD-L1, um inibidor de CTLA-4, um inibidor de TIM-3, um inibidor de LAG-3, um inibidor de TIGIT, um inibidor de B7-H3 (CD276), um inibidor de B7-H4 (B7S1), um inibidor de B7H7

(HHLA2), um inibidor de CD96, um inibidor de VISTA e combinações de dois ou mais dos mesmos.

[0050] 39. Uma terapia de combinação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 35 a 38, em que a terapia contra câncer adicional é um vírus oncolítico, por exemplo, um vírus competente para replicação oncolítico, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 29.

[0051] 40. Um método de tratamento que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um adenovírus oncolítico, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, ou uma composição farmacêutica, de acordo com o parágrafo 6 ou 30, a um paciente que precisa do mesmo.

[0052] 41. Um método, de acordo com o parágrafo 40, para o tratamento de câncer, resistência à insulina, obesidade e/ou imunodeficiência.

[0053] 42. Um método, de acordo com o parágrafo 41, para o tratamento de câncer, por exemplo, um câncer que expressa CD40 (tal como um câncer com expressão de CD40 regulada de modo crescente).

[0054] 43. Um método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 37 a 42, em que o tratamento compreende, ainda, uma terapia anticâncer adicional.

[0055] 44. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 43, em que a terapia anticâncer adicional é quimioterapia.

[0056] 45. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 42 ou 44, em que a terapia anticâncer adicional é um inibidor de ponto de verificação.

[0057] 46. Uma terapia de combinação, de acordo com o parágrafo 45, em que a terapia anticâncer é selecionada a partir do grupo que compreende um inibidor de PD-1, um inibidor de a PD-L1, um inibidor de CTLA-4, um inibidor de TIM-3, um inibidor de LAG-3, um inibidor de TIGIT, um inibidor de B7-H3 (CD276), um inibidor de B7-H4 (B7S1), um inibidor de B7H7 (HHLA2), um inibidor de CD96, um inibidor de VISTA e combinações de dois ou mais dos mesmos.

[0058] 47. Uma terapia de combinação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 42 a 46, em que a terapia contra câncer adicional é um vírus oncolítico, por exemplo, um vírus competente para replicação oncolítico, por exemplo, um vírus definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 29.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0059] A Figura 1 mostra um esquema do cassete de transgene anti-CD40.

[0060] As Figuras 2A e B mostram a atividade de vírus NG-350 em termos de produção total de partículas (A) e produção de partículas virais no sobrenadante celular (B)

[0061] A Figura 2C mostra a concentração de anticorpo anti-CD40 lgG2 secretado medida com o uso de ELISA.

[0062] A Figura 3 mostra os resultados de digestão por restrição de controle vs DNA de NG-350 com o uso da combinação EcoRv/NheI (A) ou enzimas individuais NcoI ou FspI (B).

[0063] A Figura 4 mostra a localização no cassete de transgene NG-350 em que os iniciadores se ligam.

[0064] A Figura 5 mostra a separação de produtos de PCR com o uso de eletroforese em gel.

[0065] A Figura 6 mostra a separação de produtos de PCR com o uso do conjunto de iniciadores D (A) e do conjunto de iniciadores K (B).

[0066] A Figura 7A mostra a quantificação da % de sobrevivência celular em várias densidades de infecção para EnAd e NG-350A (vírus da SEQ ID NO: 1).

[0067] As Figuras 7 e 8 mostram a quantificação do número de genomas virais detectados por célula para NG-350A e EnAd.

[0068] As Figuras 9A e B mostram a absorbância a 450 nm em cada poço da placa medida com o uso de um leitor de placa (BioTek) e as concentrações de anticorpo anti-CD40 lgG2 secretado.

[0069] A Figura 9C mostra a absorbância a 450 nm para EnAd, NG-350A e controles positivos (Figura 4C) e ligação específica a CD40 pelo anticorpo anti-CD40 secretado presente no sobrenadante de células infectadas com NG-350A.

[0070] A Figura 10 mostra a absorbância a 620 nm medida para cada amostra com o uso de um leitor de placa para células infectadas com NG-350A, EnAd ou NG-165.

[0071] As Figuras 11A e B mostram a absorbância a 450 nm em cada poço da placa que medida com o uso de um leitor de placa (BioTek) e as concentrações de anticorpo anti-CD40 lgG2 secretado.

[0072] A Figura 12 mostra a concentração de anticorpo anti-CD40 lgG2 secretado medida com o uso de ELISA.

[0073] A Figura 13 mostra a porcentagem de moDCs que expressam marcadores de ativação de CD86 (A), CD54 (B) e HLA-DR (C).

[0074] A Figura 14 mostra a secreção de IL12p40 por moDCs cultivadas com anticorpo anti-CD40 purificado produzido por células tumorais infectadas com NG-350A na presença ou ausência de vírus EnAd ou vírus EnAd apenas.

[0075] A Figura 15 mostra a porcentagem de células CD19+ que expressam CD86 (A), CD54 (B), MFI HLA-DR (C) e CD80 (D).

[0076] A Figura 16 mostra a porcentagem de células B em divisão após o tratamento com anticorpo anti-CD40 purificado produzido por células tumorais infectadas com NG-350A e vírus EnAd juntamente em comparação com tratamento com anticorpo ou vírus apenas.

[0077] A Figura 17 mostra que uma preparação de anticorpo depletado de vírus produzida por células tumorais infectadas com NG-

350A se liga a CD40 na superfície de MoDCs humanas.

[0078] A Figura 18 mostra os efeitos de Ab anti-CD40 depletado de vírus produzido por células tumorais infectadas com NG-350A sobre a regulação crescente de marcador de superfície celular em MoDCs humanas como um exemplo (A) e respostas à dose em 24 e 48 horas para 4 doadores de MoDC diferentes (B a E)

[0079] A Figura 19 mostra os efeitos de Ab anti-CD40 depletado de vírus produzido por células tumorais infectadas com NG-350A sobre secreções de citocina por MoDCs humanas como respostas à dose em 24 e 48 horas para 4 doadores de MoDC diferentes (B a D)

[0080] A Figura 20 mostra que uma preparação de anticorpo produzida por células tumorais infectadas com NG-350A, não depletadas de vírus, se liga a CD40 na superfície de MoDCs humanas.

[0081] A Figura 21 mostra os efeitos de Ab anti-CD40 produzido por células tumorais infectadas com NG-350A, não depletadas de vírus, sobre a regulação crescente de marcador de superfície celular em 24 e 48 horas em MoDCs humanas de 2 doadores diferentes.

[0082] A Figura 22 mostra os efeitos de Ab anti-CD40 produzido por células tumorais infectadas com NG-350A, não depletadas de vírus, sobre secreções de citocina por MoDCs humanas como respostas à dose em 24 e 48 horas por 2 doadores diferentes.

[0083] A Figura 23 mostra efeitos de Ab anti-CD40 depletado de vírus produzido por células tumorais infectadas com NG-350A sobre a regulação crescente de marcador de superfície celular em células B humanas como respostas à dose em 24 e 48 horas para 3 doadores de célula B diferentes.

[0084] A Figura 24 mostra os efeitos de Ab anti-CD40 produzido por células tumorais infectadas com NG-350A, não depletadas de vírus, sobre a regulação crescente de marcador de superfície celular em 24 e 48 horas em células B humanas de 3 doadores diferentes.

[0085] A Figura 25 mostra cursos de tempo de replicação de genoma viral (qPCR) por 10 linhagens de células tumorais diferentes infectadas com NG-350A, em comparação com aquelas para EnAd.

[0086] A Figura 26 mostra os cursos de tempo de oncologia induzida por vírus (ensaio xCELLigence) em quatro linhagens de células tumorais exemplificativas infectadas com NG-350A, em comparação com aquelas para EnAd.

[0087] A Figura 27 mostra os cursos de tempo de expressão de mRNA de anticorpo anti-CD40 por 10 linhagens de células tumorais diferentes infectadas com NG-350A.

[0088] A Figura 28 mostra a detecção de expressão de proteína de transgene anti-CD40 por ELISA de lgG2 por linhagens de células tumorais diferentes.

[0089] A Figura 29 mostra um curso de tempo de respostas agudas de citocina plasmática após dosagem IV com partículas de NG-350A em comparação com aquelas de EnAd; MCP-1 (A), IL-6 (B) e TNFα (C)

[0090] A Figura 30 mostra um curso de tempo de concentrações de alanina transaminase (ALT) em plasma após uma única dose intravenosa de EnAd ou NG-350A.

[0091] A Figura 31 mostra as respostas agudas de citocina plasmática após a primeira e a terceira doses de um regime de dosagem IV repetido com partículas de NG-350A em comparação com aquelas para EnAd; MCP-1 (A), IL-6 (B)

[0092] A Figura 32 mostra a farmacocinética viral em sangue periférico após cada uma das três doses intravenosas de EnAd ou NG- 350A.

[0093] A Figura 33 mostra a recuperação de vírus vivo de tecidos murinos após uma única dose intravenosa de partículas de vírus NG-350A.

[0094] A Figura 34 mostra a replicação de genoma viral em tumores A549 (A&B) e HCT116 (C&D) subcutâneos após três injeções IV ou uma única dose IT fracionada de NG-350A ou EnAd.

[0095] A Figura 35 mostra a expressão de mRNA de vírus E3 em tumores A549 (A&B) ou HCT-116 (C&D) subcutâneos após três injeções IV ou uma única dose IT fracionada de NG-350A ou EnAd.

[0096] A Figura 36 mostra a expressão de mRNA de transgene de anticorpo agonista anti-CD40 em tumores A549 (A&B) e HCT-116 (C&D) subcutâneos após três injeções IV ou uma única dose IT fracionada de NG-350A ou EnAd.

[0097] A Figura 37 mostra a proteína de anticorpo anti-CD40 em tumores A549 subcutâneos após três injeções IV ou uma única dose IT fracionada ou NG-350A ou EnAd.

REVELAÇÃO DETALHADA

[0098] O CD40 é uma proteína coestimuladora encontrada, por exemplo, em células apresentadoras de antígeno. CD40 é também conhecido como Bp50, CDW40, TNFRSF5, p50, proteína de CD40, molécula de CD40. A proteína humana tem o número UniProt P25942. A proteína murina tem o número UniProt 5 P27512.

[0099] O vírus oncolítico com seletividade para células cancerosas, conforme empregado no presente documento, se refere a um vírus que, de preferência, extermina células cancerosas, por exemplo, devido ao fato de que o mesmo, de preferência, infecta células cancerosas e/ou o ciclo de vida viral é dependente de um gene, tal como p53 que é desregulado, por exemplo, superexpresso em células cancerosas. Em uma modalidade, o vírus oncolítico, de preferência, infecta células cancerosas e continua a replicar seu genoma e produzir proteínas de capsídeo para gerar novas partículas de vírus, por exemplo, como por EnAd.

[0100] A seletividade para células cancerosas (índice terapêutico) pode ser testada conforme descrito no documento no

WO2005/118825, incorporado ao presente documento a título de referência.

[0101] Em uma modalidade, o vírus oncolítico é um vírus selecionado dentre um adenovírus, vírus herpes simplex, reovírus, vírus do sarampo, vírus da doença de Newcastle, vírus Seneca Valley, vírus da estomatite vesicular, poliovírus, enterovírus ECHO, vírus de Coxsackie e vírus vaccinia, em particular um adenovírus.

[0102] Em uma modalidade, o adenovírus é selecionado a partir do grupo que consiste em Enadenotucirev, talimogene laherparepvec, R1GV1R, Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12, Cavatak™, CG0070, DNX-2401, G207, HF10, Imlygic®, JX-594, MG1-MA3, MV-N1S, OBP-301, Reolysin®, Toca 511, em particular Enadenotucirev.

[0103] Em uma modalidade, o adenovírus oncolítico empregado na terapia de combinação da presente revelação é competente para replicação.

[0104] Em uma modalidade, o adenovírus oncolítico empregado na combinação da presente revelação é deficiente para replicação.

[0105] Em uma modalidade, o vírus da presente revelação é empregado em uma terapia de combinação.

[0106] Em uma modalidade, um adenovírus oncolítico empregado na presente revelação ou como um segundo componente em terapia de combinação da presente revelação, por exemplo, tem uma fórmula (I): 5’ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3’ITR (I)

[0107] em que:

[0108] B1 é uma ligação ou compreende: E1A, E1B ou E1A-E1B (em particular E1A, E1B ou E1A-E1B);

[0109] BA é E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;

[0110] B2 é uma ligação ou compreende E3 ou um transgene, por exemplo, sob um promotor endógeno ou exógeno;

[0111] ΒX é uma ligação ou uma sequência de DNA que compreende: um sítio de restrição, um ou mais transgenes ou ambos;

[0112] BB compreende L5;

[0113] BY compreende o cassete de transgene que codifica uma proteína terapêutica ou um fragmento ativo do mesmo (em particular, compreende SEQ ID NO: 12); e

[0114] B3 é uma ligação ou compreende E4.

[0115] Em uma modalidade, o adenovírus oncolítico tem uma fórmula (la): 5’ITR-B1-BA-B2-BB-BY-B3-3’ITR (la)

[0116] em que:

[0117] B1 é uma ligação ou compreende: E1A, E1B ou E1A-E1B (em particular E1A, E1B ou E1A-E1B);

[0118] BA é E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;

[0119] B2 é uma ligação ou compreende E3;

[0120] BB compreende L5;

[0121] BY compreende o cassete de transgene que codifica uma proteína terapêutica ou um fragmento ativo do mesmo (em particular compreende SEQ ID NO: 12); e

[0122] B3 é uma ligação ou compreende E4.

[0123] Em uma modalidade, o genoma de vírus em construtos de fórmula (I) e/ou (la) é de Ad11 ou EnAd, em particular, EnAd.

[0124] Em uma modalidade, o cassete de transgene está sob o controle de um promotor endógeno, por exemplo, o promotor tardio principal.

[0125] As proteínas terapêuticas incluem um anticorpo ou fragmento de ligação (por exemplo, selecionado a partir do grupo que compreende anticorpos ou fragmentos específicos para CTLA-4, PD-1, PD- L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, 1LT-2,1LT-3,1LT-4, T1M-3, LAG-3, BTLA, LIGHT ou CD160, por exemplo, CTLA-4, PD-1, PD-L1 e/ou PD-L2], uma proteína B-7 (tal como B7-1 e/ou B7-2], uma citocina (por exemplo, selecionada dentre IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12,IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25,

IL-26, IL-27, IL-33, IL-35, interleucina-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNα, IFNβ, IFNY, TNFα, TGFβ, linfotoxina α (LTA) e GM-CSF) e uma quimiocina (por exemplo, IL-8, CCL3, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5 e/ou CRTH2) e combinações de dois ou mais dos mesmos.

[0126] A terapia da presente revelação pode compreender dois ou mais vírus oncolíticos.

ELEMENTOS REGULADORES

[0127] Em uma modalidade, BY compreende um cassete de transgene de acordo com a presente revelação, em que o dito cassete compreende, ainda, um transgene que codifica um inibidor de ponto de verificação, por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD-1 e um anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação de qualquer um dos mesmos e um elemento regulador, tal como combinação de elementos reguladores.

[0128] Em uma modalidade, o elemento regulador é uma sequência de aceitante de splice.

[0129] Em uma modalidade, o elemento regulador é uma sequência de Kozak.

[0130] Em uma modalidade, por exemplo, quando o transgene codifica uma molécula de RNA policistrônica, o elemento regulador é uma sequência de IRES.

[0131] Em uma modalidade, a sequência reguladora é uma sequência de peptídeo autoclivável de alta eficiência, tal como P2A, T2A, F2A, E2A.

[0132] Em uma modalidade, a sequência reguladora é uma cauda poliA.

[0133] Em uma modalidade, há pelo menos duas sequências reguladoras, por exemplo, uma aceitante de splice e uma sequência de Kozak, ou uma aceitante de splice e uma cauda poliA, ou uma aceitante de splice e uma sequência de IRES, ou uma aceitante de splice e uma sequência de P2A.

[0134] Em uma modalidade, há pelo menos três sequências reguladoras, por exemplo, uma sequência de aceitante de splice, uma sequência de Kozak e cauda poliA ou uma sequência de aceitante de splice, uma sequência de IRES ou 2A e uma cauda poliA; ou uma sequência de aceitante de splice, sequência de Kozak e sequência IRES ou 2A.

[0135] Em uma modalidade, há pelo menos quatro sequências reguladoras, por exemplo, uma sequência de aceitante de splice, uma sequência de Kozak, uma sequência de IRES ou 2A e uma cauda poliA, em particular, localizada entre L5 e E4 na ordem sequência de aceitante de splice, sequência de Kozak, sequência de IRES ou 2A e uma cauda poliA.

[0136] Em uma modalidade, o transgene codifica uma molécula de RNA policistrônica que compreende tanto sequência reguladora de IRES quanto 2A.

[0137] Em uma modalidade, a proteína ou proteínas codificadas no cassete de transgene para expressão de membrana celular podem também compreender um ligante ou espaçador de peptídeo entre o domínio de transmembrana ou a âncora de GPI e o domínio de ligação de ligante extracelular. Tais ligantes ou espaçadores podem adicionar flexibilidade à proteína expressa na superfície celular que aumenta a capacidade da proteína de interagir com sua molécula alvo, por exemplo, em uma célula adjacente. Tais ligantes ou espaçadores podem também ser projetados ou selecionados para promover dimerização ou trimerização das proteínas na superfície celular, através da formação de ligação de dissulfeto ou interações proteína-proteína. Por exemplo, as regiões de dobradiça de moléculas de imunoglobulina ou CD8 podem ser empregadas para aumentar tanto a flexibilidade quanto a dimerização

[0138] Em uma modalidade, a proteína ou proteínas codificadas no cassete de transgene podem também compreender um marcador de peptídeo.

[0139] A etiqueta de peptídeo pode incluir as etiquetas c-myc, poli-histidina, V5 ou FLAG e pode estar localizada no terminal N ou no terminal C do polipeptídeo, por exemplo, de modo intracelular ou extracelular, ou pode ser codificada dentro da proteína, por exemplo, em um laço extracelular ou entre o domínio transmembranar e o domínio extracelular. As etiquetas de peptídeo podem ser usadas como espaçadores ou ligantes entre diferentes domínios de proteína, por exemplo, o domínio transmembranar e o extracelular, e podem ser usadas para detecção ou purificação da proteína, ou células que expressam a proteína.

[0140] Em uma modalidade, o um ou mais transgenes adicionais, por exemplo, no vírus de fórmula (I) ou (la), estão sob o controle de um promotor exógeno ou endógeno, por exemplo, um promotor endógeno. Em uma modalidade, um transgene na região E3 (B 2) está sob o controle de um promotor exógeno.

[0141] Em uma modalidade, o um ou mais genes transgenes adicionais estão entre a região E3 e a fibra L5 no genoma de adenovírus, por exemplo, em uma posição BX no construto de fórmula (I), em particular sob o controle de um promotor exógeno. Assim, em uma modalidade, um transgene em BX está sob o controle de um promotor exógeno.

[0142] Em uma modalidade, o um ou mais genes transgenes adicionais estão entre a região E4 e a fibra L5 no genoma de adenovírus, por exemplo, em uma posição BY no construto de fórmula (I) ou (Ia), em particular sob o controle de um promotor endógeno, tal como o promotor tardio principal. Isso pode ser adicionalmente à proteína terapêutica ou fragmento ativo da mesma codificada na região BY.

[0143] O transgene, conforme empregado no presente documento, se refere a um gene que foi inserido na sequência de genoma do adenovírus, em que o gene não é natural ao vírus (exógeno) ou não normalmente encontrado naquela localização particular no vírus. Os exemplos de transgenes são dados no presente documento. O transgene, conforme empregado no presente documento, também inclui um fragmento funcional do gene que é uma porção do gene que quando inserida é adequada para realizar a função ou a maior parte da função do gene de comprimento completo, por exemplo, 50% da função ou mais.

[0144] O transgene e sequência de codificação são usados de forma intercambiável no presente documento no contexto de insertos no genoma viral, a não ser que o contexto indique de outro modo. A sequência de codificação, conforme empregado no presente documento, significa, por exemplo, uma sequência de DNA que codifica um RNA funcional, peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Tipicamente, a sequência de codificação é cDNA para o transgene que codifica o RNA funcional, peptídeo, polipeptídeo ou proteína de interesse. O RNA funcional, peptídeos, polipeptídeo ou proteínas de interesse são descritos abaixo.

[0145] Em uma modalidade, transgene, conforme empregado no presente documento, refere-se a um segmento de DNA que contém um gene ou sequência de cDNA que foi isolada de um organismo e introduzida em um organismo diferente, isto é, o vírus da presente revelação. Em uma modalidade, esse segmento não nativo de DNA geralmente reterá a capacidade para produzir RNA funcional, peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os transgenes empregados podem, por exemplo, codificar uma única proteína ou fragmento ativo da mesma, proteína quimérica ou uma proteína de fusão.

[0146] Evidentemente, o genoma de vírus contém sequências de codificação de DNA. Endógenos (genes de ocorrência natural) na sequência genômica do vírus não são considerados um transgene, no contexto do presente relatório descritivo, exceto se os mesmo tiverem sido modificados por técnicas recombinantes, tais como aquelas em que os mesmos estão em uma localização não natural ou em um ambiente não natural.

[0147] Assim, em uma modalidade, o transgene (ou transgenes) inserido codifica uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo humano ou humanizado. O transgene (ou transgenes) pode estar localizado dentro de um cassete de transgene, por exemplo.

[0148] A âncora de GPI, conforme empregado no presente documento, se refere a um glicolipídio que pode ser fixado ao terminal C de uma proteína durante a modificação pós-translacional. A mesma é composta por um grupo fosfatidilinositol ligado através de um ligante contendo carboidrato (glucosamina e manose ligada de modo glicosídico ao resíduo de inositol) e por meio de uma ponte de fosfato de etanolamina (EtNP) ao aminoácido C-terminal de uma proteína madura. Os dois ácidos graxos dentro do grupo inositol-fosfatidil hidrofóbico ancoram a proteína à membrana celular.

[0149] As proteínas glipiadas (ligadas a GPI) geralmente contêm um peptídeo de sinal, o qual direciona as mesmas para o retículo endoplasmático (ER). O terminal C é composto por aminoácidos hidrofóbicos que ficam inseridos na membrana do ER. A extremidade hidrofóbica é, então, clivada e substituída pela âncora de GPI. Conforme a proteína progride pela trajetória de secreção, a mesma é transferida através das vesículas até o aparelho de Golgi e finalmente para o espaço extracelular em que a mesma permanece fixada ao folheto exterior da membrana celular. Visto que a glipiação é o único meio de fixação de tais proteínas à membrana, a clivagem do grupo por fosfolipases resultará na liberação controlada da proteína da membrana. O mecanismo posterior é usado in vitro; isto é, as proteínas de membrana liberadas das membranas no ensaio enzimático são proteínas glipiadas.

[0150] A fosfolipase C (PLC) é uma enzima que é conhecida por clivar a ligação fosfo-glicerol encontrada em proteínas ancoradas em GPI. O tratamento com PLC causará liberação de proteínas ligadas a GPI a partir da membrana celular externa. O marcador de célula T Thy-1 e acetilcolinesterase, assim como fosfatases alcalinas intestinais e placentais, são conhecidos por estarem ligados a GPI e serem liberados pelo tratamento com PLC. Considera-se que as proteínas ligadas a GPI estão, de preferência, localizadas em base de lipídio, sugerindo um alto nível de organização dentro dos microdomínios de membrana plasmática.

[0151] Uma revisão de âncoras de GPI escritas por Ferguson, Kinoshita e Hart está disponível no Capítulo 11 de Essentials of Glycobiology 2a Edição.

VÍRUS

[0152] Competente para replicação no contexto do presente relatório descritivo se refere a um vírus que possui todo o maquinário necessário para se replicar nas células in vitro e in vivo, isto é, sem a assistência de uma linhagem de célula de empacotamento. Um vetor viral, por exemplo, excluído em pelo menos a região E1A, que tem capacidade para se replicar em uma linhagem de célula de empacotamento complementar não é um vírus competente para replicação no presente contexto.

[0153] Um vetor viral é um vírus deficiente para replicação, que exige uma linhagem de célula de empacotamento (que compreende um transgene complementar) para replicar.

[0154] Um vírus com capacidade para replicação, conforme empregado no presente documento, se refere a um vírus competente para replicação ou um vírus cuja replicação é dependente de um fator nas células cancerosas, por exemplo, um fator de regulação ascendente, tal como p53 ou similar.

[0155] Em uma modalidade, o adenovírus é um adenovírus humano. “Adenovírus", "serotipo" ou “serotipo adenoviral", conforme empregado no presente documento, se refere a qualquer adenovírus que pode ser atribuído a qualquer um dos 50 serotipos adenovirais atualmente conhecidos, que são classificados nos subgrupos A a F e, adicionalmente, se estendem a qualquer, e mesmo, serotipos adenovirais não identificados ou não classificados. Consultar, por exemplo, Strauss, "Adenovirus infections in humans", em The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, New York, NY, páginas 451 a 596 (1984) e Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication", em Fields Virology, volume 2, quarta edição, Knipe, 35ea., Lippincott Williams & Wilkins,

páginas 2.265 a 2.267 (2001), conforme mostrado abaixo: Subgrupo Serotipo Adenoviral A 12,18,31 B 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 51 C 1, 2, 5, 6 D 8 a 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22 a 30, 32, 33, 36 a 39, 42- E 4 F 40, 41

[0156] Os adenovírus são agrupados com base em seu capsídeo.

[0157] Em uma modalidade, o adenovírus é um subgrupo B, por exemplo, independentemente selecionado a partir do grupo que compreende ou que consiste em: Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34 e Ad51, tal como Ad11, in particular Ad11p (a cepa Slobitski). Em uma modalidade, o adenovírus da invenção tem o capsídeo, tal como o héxon e/ou fibra de um adenovírus do subgrupo B, tal como Ad11, particularmente Ad11p. Em uma modalidade, o adenovírus é Ad11 ou tem a fibra e/ou héxon e/ou pênton de Ad11, tal como Ad11p.

[0158] Em uma modalidade, o vírus da presente revelação não é um vírus do grupo A.

[0159] Em uma modalidade, o vírus da presente revelação does não compreende uma proteína de morte de adenovírus (ADP).

[0160] Em uma modalidade, o vírus da presente revelação não é um vírus do grupo C.

[0161] Em uma modalidade, o vírus da presente revelação não compreende um ou mais fragmentos de um vírus Ad5.

[0162] Em uma modalidade, o vírus da presente revelação não é Ad5.

[0163] Enadenotucirev (EnAd) é um adenovírus oncolítico quimérico, anteriormente conhecido como ColoAd1 (documento no W02005/118825), com fibra, pênton e héxon de Ad11p, portanto, o mesmo é um vírus do subgrupo B. O mesmo tem uma região E2B quimérica que compreende DNA de Ad11p e Ad3. Quase toda a região E3 e parte da região E4 é excluída no EnAd. Portanto, o mesmo tem espaço significativo no genoma para acomodar material genético adicional ao mesmo tempo que permanece viável. Além disso, devido ao fato de que EnAd é um adenovírus do subgrupo B, a imunidade pré- existente em seres humanos é menos comum do que, por exemplo, Ad5. Outros exemplos de vírus oncolítico quimérico com fibra Ad11, pênton e héxon incluem OvAd1 e 0vAd2 (consultar do documento no W02006/060314).

[0164] EnAd parece infectar, de preferência, células tumorais, replica-se rapidamente nessas células e causa lise celular. Isso, por sua vez, pode gerar respostas imunológicas inflamatórias, estimulando, assim, o corpo também a lutar contra o câncer. Parte do sucesso de EnAd está hipoteticamente relacionado à rápida replicação do vírus in vivo.

[0165] É importante observar que foi demonstrado clinicamente que EnAd pode ser administrado sistematicamente (por exemplo, por injeção intravenosa ou infusão) e depois subsequentemente infectar seletivamente e expressar proteínas nas células tumorais. Essa propriedade de EnAd, que pode ser compartilhada por Ad11p e outros adenovírus do grupo B, em particular aqueles que expressam as proteínas de capsídeo de Ad11p (tais como aquelas descritas no presente documento), torna possível expressar as proteínas codificadas no tumor e/ou no microambiente tumoral.

[0166] Embora EnAd faça a lise seletivamente de células tumorais, pode ser possível introduzir adicionalmente propriedades benéficas, por exemplo, aumentando a atividade terapêutica do vírus ou reduzindo efeitos colaterais do vírus armando o mesmo com transgenes, tais como um transgene que codifica uma proteína de sinalização celular ou um anticorpo, ou um transgene que codifica uma entidade que estimula uma proteína (ou proteínas) de sinalização celular.

[0167] Vantajosamente, munir um vírus de DNA que codifica determinadas proteínas que podem ser expressas dentro das células de câncer pode permitir que as próprias defesas do corpo sejam empregadas para combater as células tumorais de modo mais eficaz, por exemplo, tornando as células mais visíveis ao sistema imunológico ou entregando uma proteína/gene terapêutico, de preferência, às células tumorais alvo.

[0168] Em uma modalidade, o adenovírus oncolítico da presente revelação estimula o sistema imunológico do paciente a combater o tumor, por exemplo, reduzindo a capacidade do câncer de suprimir respostas imunológicas.

[0169] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação codificado pelo vírus da presente revelação tem a capacidade de ativar células imunes, por exemplo, células T, no microambiente tumoral e/ou na proximidade do tumor.

[0170] Em uma modalidade, o vírus oncolítico tem proteínas de fibra, héxon e pênton do mesmo serotipo, por exemplo, Ad11, particularmente Ad11p, por exemplo, encontrado nas posições 30812 a 31789, 18254 a 21100 e 13682 a 15367 da sequência genômica do último em que as posições de nucleotídeo são relativas ao ID de Genbank 217307399 (número de acesso: GC689208).

[0171] Em uma modalidade, o adenovírus é enadenotucirev (também conhecido como EnAd e anteriormente como ColoAd1). Enadenotucirev, conforme empregado no presente documento, se refere a adenovírus quimérico da SEQ ID NO: 21 revelada no documento n o WO2016/174200 e incorporada a título de referência. O mesmo é um adenovírus quimérico oncolítico competente para replicação que tem propriedades terapêuticas intensificadas em comparação com adenovírus do tipo selvagem (consultar o documento no WO2005/118825). EnAd tem uma região E2B quimérica que apresenta DNA de Ad11p e Ad3 e deleções em E3/E4. As alterações estruturais em enadenotucirev resultam em um genoma que é aproximadamente 3,5 kb menor do que Ad11p fornecendo, assim, "espaço" adicional para a inserção de transgenes.

[0172] Em uma modalidade, o cassete de acordo com a presente revelação está localizado entre L5 e a região E4 em um adenovírus, tal como um adenovírus do grupo B, em particular sob o controle do promotor tardio principal.

[0173] Em uma modalidade, o vírus empregado não é EnAd.

[0174] Outros vírus que podem ser empregados na presente invenção incluem vírus herpes simplex, reovírus, vírus do sarampo, vírus da doença de Newcastle, vírus Seneca Valley, vírus da estomatite vesicular, poliovírus, enterovírus ECHO, vírus Coxsackie e vírus vaccinia, em particular um adenovírus, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em talimogene laherparepvec, R1GV1R, Ad5-yCD/mutTKSR39rep- hIL12, Cavatak™, CG0070, DNX-2401, G207, HF10, Imlygic®, JX-594, MG1- MA3, MV-N1S, OBP-301, Reolysin®, Toca 511.

ANTICORPO OU FRAGMENTO DE ANTICORPO

[0175] Em uma modalidade, o vírus da presente revelação codifica um anticorpo anti-CD40 de comprimento completo.

[0176] O termo anticorpo, conforme usado no presente documento, se refere a uma molécula de imunoglobulina com capacidade para ligação específica a um antígeno alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, polipeptídeo, peptídeo, etc., por meio de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno (também denominado um sítio de ligação no presente documento), localizado na região variável da molécula de imunoglobulina.

[0177] Conforme usado no presente documento, a molécula de anticorpo inclui anticorpos e fragmentos de ligação dos mesmos e moléculas que compreende um ou mais dos mesmos.

[0178] O sítio de ligação a antígeno, conforme empregado no presente documento, se refere a uma porção da molécula que compreende um par de regiões variáveis, em particular um par cognato que interage com o antígeno alvo.

[0179] O fragmento de ligação a anticorpo, conforme empregado no presente documento, se refere a menos do que o anticorpo inteiro, que tem ainda capacidade para se ligar especificamente a um antígeno alvo.

[0180] Especificamente, conforme empregado no presente documento, se destina a referir a um sítio de ligação que apenas reconhece o antígeno para o qual é específico ou um sítio de ligação que tem afinidade de ligação significativamente mais alta ao antígeno para o qual é específico em comparação com a afinidade a antígenos para os quais não é específico, por exemplo, afinidade de ligação 5, 6, 7, 8, 9,10 vezes mais alta.

[0181] As moléculas de anticorpo, conforme empregado, podem compreender uma molécula de anticorpo completa que tem cadeias pesada e leve de comprimento completo, formato de anticorpo biespecífico que compreende anticorpos de comprimento completo ou um fragmento de qualquer um dentre os mesmos, o que inclui, porém sem limitação, Fab, Fab modificado, Fab', Fab’ modificado, F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio único (por exemplo, VH ou VL ou VHH), scFv, anticorpos bi, tri ou tetravalentes, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracospos e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dentre os mencionados acima (consultar, por exemplo, Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1.126 a 1.136; Adair e Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209 a 217). Os métodos para criar e fabricar esses fragmentos de anticorpo são bastante conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165 a 181). Outros fragmentos de anticorpo para uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab' descritos nos pedidos de Patente internacional n os WO2005/003169, WO2005/003170 e WO2005/003171. Anticorpos multivalentes podem compreender múltiplas especificidades, por exemplo, biespecífico, ou podem ser monoespecíficos (consultar, por exemplo, os documentos n os WO 92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 e WO2010/035012).

[0182] Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo empregada no vírus da presente revelação é humanizada, quimérica ou não humana.

[0183] Humanizado (que inclui anticorpos enxertados com CDR), conforme empregado no presente documento, se refere a moléculas de anticorpo que têm uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma espécie não humana e um região de framework de uma molécula de imunoglobulina humana (consultar, por exemplo, os documentos no US 5.585.089; WO91/09967). Será observado que pode ser necessário apenas transferir os resíduos de determinação de especificidade das CDRs em vez de toda a CDR (consultar, por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25 a 34). Os anticorpos humanizados podem compreender, ainda, um ou mais dos resíduos de suporte derivados de espécies não humanas das quais as CDRs foram derivadas.

[0184] Quando as CDRs ou resíduos de determinação de especificidade são enxertados, qualquer sequência de framework de região variável de aceitante apropriada pode ser usada considerando a classe/tipo do anticorpo doador a partir do qual as CDRs são derivadas, o que inclui regiões de framework de camundongo, primata e ser humano. Adequadamente, o anticorpo humanizado de acordo com a presente revelação tem um domínio variável que compreende aceitante humano de regiões de framework humano como uma ou mais das CDRs fornecidas no presente documento.

[0185] Os exemplos de frameworks humanos que podem ser usados na presente revelação são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Rabat et al., supra). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usados como a cadeia pesada, REI pode ser usado para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser usados tanto para a cadeia pesada quanto para a cadeia leve. Alternativamente, as sequências de linha germinativa humana podem ser usadas; as mesmas estão disponíveis em: http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/

[0186] Em um anticorpo humanizado da presente revelação, o aceitante de cadeia pesada e leve não precisa necessariamente ser derivado do mesmo anticorpo e pode, se desejado, compreender cadeias compósitas que têm regiões de framework derivadas de diferentes cadeias.

[0187] As regiões de framework não precisam ter exatamente a mesma sequência que aquelas do anticorpo aceitante. Por exemplo, resíduos pouco usuais podem ser alterados para resíduos de ocorrência mais frequente para essa classe ou tipo de cadeia de aceitante. Alternativamente, os resíduos selecionados nas regiões de framework aceitantes podem ser modificados de modo que os mesmos correspondam ao resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo doador (consultar Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323 a 324). Tais alterações devem ser mantidas no mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para selecionar resíduos nas regiões de framework de aceitante que podem precisar ser alteradas é estabelecido no documento no WO91/09967.

[0188] Os anticorpos quiméricos, de modo geral, contêm regiões variáveis não humanas e regiões constantes humanas.

[0189] Em uma modalidade, as moléculas de anticorpo da presente revelação são completamente humanas, em particular um ou mais os domínios variáveis são completamente humanos.

[0190] As moléculas completamente humanas são aquelas em que as regiões variáveis e as regiões constantes (quando presentes) das cadeias tanto pesada quanto leve são todas de origem humana ou substancialmente idênticas às sequências de origem humana, não necessariamente do mesmo anticorpo. Os exemplos de anticorpos completamente humanos podem incluir anticorpos produzidos, por exemplo, pelos métodos de exibição de fago descritos acima e anticorpos produzidos por camundongos, em que a região variável de imunoglobulina murina e, opcionalmente, a região constante foram substituídas por suas contrapartes humanas, por exemplo, conforme descrito em termos gerais nos documentos nos EP0546073, US5.545.806, US5.569.825, US5.625.126, US5.633.425, US5.661.016, US5.770.429, EP0438474 e EP0463151. DEFINIÇÕES RELEVANTES PARA A FÓRMULA (I) E (IA)

[0191] A ligação se refere a uma ligação covalente que conecta uma sequência de DNA à outra sequência de DNA, por exemplo, conectando uma seção do genoma de vírus à outra. Desse modo, quando uma variável na fórmula (I) e (la) no presente documento representa uma ligação, o recurso ou elemento representado pela ligação está ausente, isto é, deletado.

[0192] Visto que a estrutura dos adenovírus, em geral, é similar, os elementos abaixo são discutidos em termos dos elementos estruturais e a nomenclatura comumente usada para se referir aos mesmos, os quais são conhecidos pelo indivíduo versado. Quando um elemento é mencionado no presente documento, depois, faz-se referência à sequência de DNA que codifica o elemento ou uma sequência de DNA que codifica a mesma proteína estrutural do elemento em um adenovírus. O último é relevante devido à redundância do código de DNA. A preferência de vírus para uso de códon pode precisar ser considerada para resultados otimizados.

[0193] Qualquer elemento estrutural de um adenovírus empregado no vírus da presente revelação pode compreender ou consistir na sequência natural ou pode ter similaridade por todo o dado comprimento de pelo menos 95%, tal como 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. A sequência original pode ser alterada ou modificada para omitir 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do material genético. Entretanto, em uma modalidade, a sequência de DNA que é pelo menos 95% similar ou idêntica codifica o mesmo produto de gene, isto é, RNA e/ou proteína. O indivíduo versado está ciente de que, ao fazer mudanças, os quadros de leitura do vírus não devem ser perturbados de modo que a expressão de proteínas estruturais não seja perturbada. A presente revelação também se estende a uma sequência de polinucleotídeos que se hibridiza a uma sequência revelada no presente documento sob condições estringentes.

[0194] Em uma modalidade, o elemento determinado é uma sequência de comprimento completo, isto é, gene de comprimento completo. O gene de comprimento completo, conforme empregado no presente documento, se refere a pelo menos a totalidade da sequência de codificação de um gene, mas pode incluir quaisquer regiões de não codificação associadas, especialmente se as mesmas são relevantes para a função do gene.

[0195] Em uma modalidade, o elemento determinado é menor do que uma sequência de comprimento completo e mantém a mesma função ou função correspondente em relação à sequência de comprimento completo.

[0196] Em uma modalidade, para um elemento determinado que é opcional nos construtos da presente revelação, a sequência de DNA pode ser menor do que um comprimento completo e não ter funcionalidade, por exemplo, a região E3 pode ser total ou parcialmente excluída. Contudo, pode ser útil excluir essencialmente toda a região E3 visto que isso otimiza o espaço disponível para inserir transgenes.

[0197] Os genes estruturais que codificam proteínas estruturais ou funcionais do adenovírus são geralmente ligados às regiões de não codificação de DNA. Desse modo, há alguma flexibilidade em relação a onde “cortar” a sequência genômica do elemento estrutural de interesse (especialmente em regiões de não codificação da mesma) com o propósito de inserir um transgene no vírus da presente revelação. Desse modo, com o propósito do presente relatório descritivo, o elemento será considerado um elemento estrutural de referência até o ponto em que o mesmo atende ao propósito e não codifica material extrínseco. Desse modo, se apropriado, o gene será associado a regiões de não codificação adequadas, por exemplo, conforme encontrado na estrutura natural do vírus.

[0198] Desse modo, em uma modalidade, um inserto, tal como DNA que codifica um transgene, é inserido em uma região de não codificação de DNA de vírus genômico, tal como um íntron ou sequência intergênica. Tendo feito isso, algumas regiões de não codificação de adenovírus podem ter uma função, por exemplo, em splicing alternativo, regulação de transcrição ou regulação de tradução, e isso pode precisar ser levado em consideração.

[0199] Os sítios identificados no presente documento, que estão associados à região L5, são adequados para acomodar uma variedade de sequências de DNA que codificam entidades complexas, tal como RNAi, citocinas, proteínas de multiméricas ou de cadeia única, tais como anticorpos, em particular a SEQ ID NO: 12.

[0200] O gene, conforme empregado no presente documento, se refere a sequências de codificação e quaisquer sequências de não codificação associadas ao mesmo, por exemplo, íntrons e éxons associados. Em uma modalidade, um gene compreende ou consiste em apenas componentes estruturais essenciais, por exemplo, região de codificação.

[0201] Abaixo segue uma discussão relacionada a elementos estruturais específicos de adenovírus.

[0202] As sequências de Replicação de Terminal Invertido (ITR) são comuns para todos os adenovírus conhecidos (denominados desse modo devido à sua simetria) e são as origens cromossômicas virais de replicação. Outra propriedade dessas sequências é sua capacidade para formar uma forma de grampo.

[0203] A 5'ITR, conforme empregado no presente documento, se refere a parte ou toda uma ITR da extremidade 5' de um adenovírus, que mantém a função da ITR quando incorporada em um adenovírus em uma localização apropriada. Em uma modalidade, a 5’ITR compreende ou consiste na sequência de cerca de 1bp a 138bp de bases da SEQ ID NO: 21 do documento no WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência) ou uma sequência 90, 95, 96,97, 98 ou 99% idêntica à mesma ao longo do comprimento inteiro, em particular, a sequência que consiste em de cerca de 1bp a 138bp da SEQ ID NO: 17 revelada no documento no WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência).

[0204] A 3'ITR, conforme empregado no presente documento, se refere a parte ou toda uma ITR da extremidade 3' de um adenovírus que mantém a função da ITR quando incorporada em um adenovírus um uma localização apropriada. Em uma modalidade, a 3’ITR compreende ou consiste na sequência de cerca de 32189bp a 32326bp da SEQ ID NO: 17 revelada no documento no WO2016/174200 ou uma sequência 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à mesma ao longo do comprimento inteiro, em particular, a sequência que consiste em cerca de 32189bp a 32326bp da SEQ ID NO: 17 revelada no documento no WO2016/174200.

[0205] B1, conforme empregado no presente documento, se refere à sequência de DNA que codifica: parte ou toda uma E1A de um adenovírus, parte ou toda a região E1B de um adenovírus e independentemente, parte ou todas as regiões E1A e E1B de um adenovírus.

[0206] Quando B1 é uma ligação, então, as sequências E1A e E1B serão omitidas do vírus. Em uma modalidade, B1 é uma ligação e, desse modo, o vírus é um vetor.

[0207] Em uma modalidade, B1 compreende, ainda, um transgene. É conhecido na técnica que a região E1 pode acomodar um transgene que pode ser inserido de um modo disruptivo na região E1 (isto é, no "meio" da sequência) ou parte ou toda a região E1 pode ser deletada para fornecer mais espaço para acomodar material genético.

[0208] E1A, conforme empregado no presente documento, se refere à sequência de DNA que codifica parte ou toda uma região E1A de adenovírus. O último se refere ao polipeptídeo/proteína E1A. A mesma pode ser modificada de modo que a proteína codificada pelo gene E1A tenha alterações de aminoácido conservadoras ou não conservadoras (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações, adições e/ou deleções de aminoácido ao longo do comprimento inteiro) de modo que a mesma tenha: a mesma função que a do tipo selvagem (isto é, a proteína não modificada correspondente); função aumentada em comparação com a proteína do tipo selvagem; função diminuída, tal como, nenhuma função em comparação com a proteína do tipo selvagem; ou ter uma nova função em comparação com a proteína do tipo selvagem ou uma combinação dos mesmos apropriada.

[0209] E1B, conforme empregado no presente documento, se refere à sequência de DNA que codifica parte ou toda uma região E1b de adenovírus (isto é, polipeptídeo ou proteína), a mesma pode ser modificada de modo que a proteína codificada pelo gene/região E1B tenha alterações de aminoácido conservadoras ou não conservadoras (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações, adições e/ou deleções de aminoácido sobre o comprimento inteiro) de modo que a mesma tenha: a mesma função que o tipo selvagem (isto é, a proteína não modificada correspondente); função aumentada em comparação à proteína do tipo selvagem; função diminuída, tal como, nenhuma função em comparação à proteína do tipo selvagem; ou tem uma nova função em comparação à proteína do tipo selvagem ou uma combinação da mesma conforme apropriado.

[0210] Desse modo, B1 pode ser modificada ou não em relação à região E1 do tipo selvagem, tal como E1A e/ou E1B do tipo selvagem. O indivíduo versado pode facilmente identificar se E1A e/ou E1B estão presentes ou deletadas (parte) ou modificadas.

[0211] Tipo selvagem, conforme empregado no presente documento, se refere a um adenovírus ou uma sequência de um adenovírus conhecido. Um adenovírus conhecido é aquele que foi identificado e nomeado, independentemente se as informações de sequência estão disponíveis.

[0212] Em uma modalidade, B1 tem a sequência de 139bp a 3932bp da SEQ ID NO: 17 revelada no documento n o WO2016/174200.

[0213] BA, conforme empregado no presente documento, refere-se à sequência de DNA que codifica as regiões E2B-L1-L2- L3-E2A-L4, incluindo quaisquer sequências de não codificação, conforme for adequado (em particular correspondente à sequência natural de um adenovírus). De modo geral, essa sequência não compreenderá um transgene. Em uma modalidade, a sequência é substancialmente similar ou idêntica a uma sequência contígua de um adenovírus conhecido, por exemplo, um serotipo mostrado na Tabela 1, particularmente um vírus de grupo B, por exemplo, Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 ou uma combinação dos mesmos, tal como Ad3, Ad11 ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, E2B-L1-L2-L3-E2A-L4 se refere a compreender esses elementos e outros elementos estruturais associados à região, por exemplo, BA incluirá, de modo geral, a sequência que codifica a proteína lV2a, por exemplo, conforme segue: 1V2A lV2a-E2B-Ll-L2-L3-E2A-L4.

[0214] Em uma modalidade, a região E2B é quimérica. Isto é, compreende sequências de DNA de dois ou mais diferentes serotipos adenovirais, por exemplo, de Ad3 e Ad11, tal como Ad11p. Em uma modalidade, a região E2B tem a sequência de 5068bp a 10355bp da SEQ ID NO: 17 revelada no documento no WO2016/174200 ou uma sequência 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à mesma ao longo do comprimento inteiro.

[0215] Em uma modalidade, o E2B no componente BA compreende as sequências mostradas na SEQ ID NO: 18 revelada no documento no WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência).

[0216] Em uma modalidade, BA tem a sequência de 3933bp a 27184bp da SEQ ID NO: 18 revelada no documento n o WO2016/174200.

[0217] E3, conforme empregado no presente documento, se refere à sequência de DNA que codifica parte ou toda de uma região E3 de adenovírus (isto é, proteína/polipeptídeo), a mesma pode ser modificada de modo que a proteína codificada pelo gene E3 tenha alterações de aminoácido conservadoras ou não conservadoras (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações, adições e/ou deleções de aminoácido ao longo do comprimento inteiro), de modo que a mesma tenha a mesma função que a do tipo selvagem (a proteína não modificada correspondente); função aumentada em comparação com o a proteína do tipo selvagem; função diminuída, tal como nenhuma função em comparação com a proteína do tipo selvagem ou tem uma nova função em comparação com a proteína do tipo selvagem ou uma combinação das mesmas, conforme apropriado.

[0218] Em uma modalidade, a região E3 é de um serotipo adenovírus dado na Tabela 1 ou uma combinação do mesmo, particularmente um serotipo de grupo B, por exemplo, Ad3, Ad7, Ad11 (particularmente Ad11p), Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 ou uma combinação dos mesmos, tais como Ad3, Ad11 (particularmente Ad11p) ou uma combinação dos mesmos.

[0219] Em uma modalidade, a região E3 tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 19 revelada no documento no WO2016/174200.

[0220] Em uma modalidade, a região E3 é parcialmente deletada, por exemplo, é 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% deletada.

[0221] Em uma modalidade, B2 é uma ligação, em que o DNA que codifica a região E3 está ausente.

[0222] Em uma modalidade, o DNA que codifica a região E3 pode ser substituído ou interrompido por um transgene. Conforme empregado no presente documento, "região E3 substituída por um transgene”, conforme empregado no presente documento, inclui parte ou toda a região E3 que é substituída por um transgene.

[0223] Em uma modalidade, a região B2 compreende a sequência de 27185bp a 28165bp da SEQ ID NO: 98 revelada no documento no WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência).

[0224] Em uma modalidade, B2 consiste na sequência de 27185bp a 28165bp da SEQ ID NO: 98 revelada no documento n o WO2016/174200.

[0225] ΒX, conforme empregado no presente documento, se refere à sequência de DNA nas proximidades da extremidade 5' do gene L5 em BB. Nas proximidades da extremidade 5' do gene L5, conforme empregado no presente documento, se refere a: adjacente (contíguo) à 5' extremidade do gene L5 ou uma região de não codificação inerentemente associada com a mesma, isto é, em contiguidade à extremidade de acionamento de 5' do gene L5 ou uma região de não codificação inerentemente associada à mesma. Alternativamente, na proximidade de ou próximo a pode se referir a estar perto do gene L5, de modo que não haja sequências de codificação entre a região BX e a extremidade 5’ do gene L5.

[0226] Assim, em uma modalidade, BX é unido diretamente a uma base de L5 que representa, por exemplo, o início de uma sequência de codificação do gene L5.

[0227] Assim, em uma modalidade, BX é unido diretamente a uma base de L5 que representa, por exemplo, o início de uma sequência de não codificação, ou unido diretamente a uma região de não codificação naturalmente associada a L5. A região de não codificação naturalmente associada a L5, conforme empregado no presente documento, se refere a parte de todas as regiões de não codificação que são parte do gene L5 ou contíguas à mesma, mas não parte de outro gene.

[0228] Em uma modalidade, BX compreende a sequência da SEQ ID NO: 98 revelada no documento n o WO2016/174200. Essa sequência é uma sequência de não codificação artificial em que uma sequência de DNA, por exemplo, que compreende um transgene (ou cassete de transgene), um sítio de restrição ou uma combinação dos mesmos pode ser inserida na mesma. Essa sequência é vantajosa devido ao fato de que a mesma atua como um tampão que permite alguma flexibilidade na localização exata do transgene enquanto minimiza os efeitos perturbadores na estabilidade e viabilidade de vírus.

[0229] O inserto (ou insertos) pode ocorrer em qualquer parte dentro da SEQ ID NO: 98 revelada no documento n o WO2016/174200 a partir da extremidade 5’, da extremidade 3’ ou em qualquer ponto entre os pares de bases 1 a 201, por exemplo, entre os pares de bases 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34, 34/35, 35/36, 36/37, 37/38, 38/39, 39/40, 40/41, 41/42, 42/43, 43/44, 44/45, 45/46, 46/47, 47/48, 48/49, 49/50, 50/51, 51/52, 52/53, 53/54, 54/55, 55/56, 56/57, 57/58, 58/59, 59/60, 60/61, 61/62, 62/63, 63/64, 64/65, 65/66, 66/67, 67/68, 68/69, 69/70, 70/71, 71/72, 72/73, 73/74, 74/75, 75/76, 76/77, 77/78, 78/79, 79/80, 80/81, 81/82, 82/83, 83/84, 84/85, 85/86, 86/87, 87/88, 88/89, 89/90, 90/91, 91/92, 92/93, 93/94, 94/95, 95/96, 96/97, 97/98, 98/99, 99/100, 100/101, 101/102, 102/103, 103/104, 104/105, 105/106, 106/107, 107/108, 108/109, 109/110, 110/111, 111/112, 112/113, 113/114, 114/115, 115/116, 116/117, 117/118, 118/119, 119/120, 120/121, 121/122, 122/123, 123/124, 124/125, 125/126, 126/127, 127/128, 128/129, 129/130, 130/131, 131/132, 132/133, 133/134, 134/135, 135/136, 136/137, 137/138, 138/139, 139/140, 140/141, 141/142, 142/143, 143/144, 144/145, 145/146, 146/147, 147/148, 148/149, 150/151, 151/152, 152/153, 153/154, 154/155, 155/156, 156/157, 157/158, 158/159, 159/160, 160/161, 161/162, 162/163, 163/164, 164/165, 165/166, 166/167, 167/168, 168/169, 169/170, 170/171, 171/172, 172/173, 173/174, 174/175, 175/176, 176/177, 177/178, 178/179, 179/180, 180/181, 181/182, 182/183, 183/184, 184/185, 185/186, 186/187, 187/188, 189/190, 190/191, 191/192, 192/193, 193/194, 194/195, 195/196, 196/197, 197/198, 198/199,199/200 ou 200/201.

[0230] Em uma modalidade, BX compreende a SEQ ID NO: 98 revelada no documento n o WO2016/174200 com uma sequência de

DNA inserida entre o par de bases 27 e o par de bases 28 ou um local correspondente entre as posições 28192bp e 28193bp da SEQ ID NO: 98 revelada no documento no WO2016/174200.

[0231] Em uma modalidade, BX tem a sequência de 28166bp a 28366bp da SEQ ID NO: 21 revelada no documento n o WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência). Em uma modalidade, BX é uma ligação.

[0232] BB, conforme empregado no presente documento, refere-se à sequência de DNA que codifica a região L5. Conforme empregado no presente documento, a região L5 refere-se à sequência de DNA que contém o gene que codifica o polipeptídeo/proteína de fibra, conforme adequado no contexto. O gene/região de fibra codifica a proteína de fibra que é um componente de capsídeo principal de adenovírus. A fibra funciona no reconhecimento de receptor e contribui para a capacidade de o adenovírus se ligar seletivamente e infectar células.

[0233] Nos vírus da presente revelação, a fibra pode ser de qualquer serotipo de adenovírus e os adenovírus que são quiméricos como resultado da alteração da fibra por um serotipo diferente são também previstos na presente revelação. Em uma modalidade, a fibra é de um vírus do grupo B, em particular Ad11, tal como Ad11p.

[0234] Em uma modalidade, BB tem a sequência de 28367bp a 29344bp da SEQ ID NO: 17 revelada no documento n o WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência).

[0235] A sequência de DNA em relação a BY, conforme empregado no presente documento, se refere à sequência de DNA na proximidade da extremidade 3’ do gene L5 de B B. Nas proximidades da extremidade 3' do gene L5, conforme empregado no presente documento, se refere a: adjacente (contíguo) à extremidade 3' do gene L5 ou uma região de não codificação inerentemente associada com a mesma, isto é, contígua à extremidade de acionamento de 3' do gene L5 ou uma região de não codificação inerentemente associada com a mesma (isto é, toda ou parte de uma sequência de não codificação endógena a L5). Alternativamente, na proximidade de ou próximo a pode se referir a estar perto do gene L5, de modo que não haja sequências de codificação entre a região BY e a extremidade 3’ do gene L5.

[0236] Assim, em uma modalidade, BY é unido diretamente a uma base de L5 que representa a "extremidade" de uma sequência de codificação.

[0237] Assim, em uma modalidade, BY é unido diretamente a uma base de L5 que representa a “extremidade” de uma sequência de não codificação, ou unido diretamente a uma região de não codificação naturalmente associada a L5.

[0238] Inerente e naturalmente são usados de maneira intercambiável no presente documento. Em uma modalidade, B Y compreende a sequência da SEQ ID NO: 99 revelada no documento n o WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência). Essa sequência é uma sequência de não codificação em que uma sequência de DNA, por exemplo, que compreende um transgene (ou cassete de transgene), um sítio de restrição ou uma combinação da mesma pode ser inserida. Essa sequência é vantajosa devido ao fato de que a mesma atua como um tampão que permite alguma flexibilidade na localização exata do transgene, enquanto minimiza os efeitos perturbadores na estabilidade e viabilidade viral.

[0239] O inserto (ou insertos) pode ocorrer em qualquer parte dentro da SEQ ID NO: 18 revelada no documento n o WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência) da extremidade 5’, da extremidade 3’ ou em qualquer ponto entre o par de bases 1 a 35, por exemplo, entre os pares de bases 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28,

28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34 ou 34/35.

[0240] Em uma modalidade, BY compreende SEQ ID NO: 99 revelada no documento no WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência) com uma sequência de DNA inserida entre as posições de par de bases 12 e 13 ou um local correspondente a 29356bp e 29357bp na SEQ ID NO: 17 revelada no documento no WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência). Em uma modalidade, o inserto é um inserto de sítio de restrição. Em uma modalidade, o inserto de sítio de restrição compreende um ou dois sítios de restrição. Em uma modalidade, o sítio de restrição é um inserto de sítio de restrição com 19 pares de bases que compreende 2 sítios de restrição. Em uma modalidade, o inserto de sítio de restrição é um inserto de sítio de restrição com 9 pares de bases que compreende 1 sítio de restrição. Em uma modalidade, o inserto de sítio de restrição compreende um ou dois sítios de restrição e pelo menos um transgene, por exemplo, um ou dois ou três transgenes, tal como um ou dois transgenes. Em uma modalidade, o sítio de restrição é um inserto de sítio de restrição com 19 pares de bases que compreende 2 sítios de restrição e pelo menos um transgene, por exemplo, um ou dois transgenes. Em uma modalidade, o inserto de sítio de restrição é um inserto de sítio de restrição com 9 pares de bases que compreende 1 sítio de restrição e pelo menos um transgene, por exemplo, um ou dois transgenes. Em uma modalidade, dois sítios de restrição ensanduicham um ou mais, tal como dois, transgenes (por exemplo, em um cassete de transgene). Em uma modalidade, quando BY compreende dois sítios de restrições, os ditos sítios de restrição são diferentes um do outro. Em uma modalidade, o dito um ou mais sítios de restrições em BY são de ocorrência não natural (tal como exclusiva) no genoma de adenovírus particular no qual os mesmos foram inseridos. Em uma modalidade, o dito um ou mais sítios de restrição em BY são diferentes de outros sítios de restrição localizados em outra parte no genoma de adenovírus, por exemplo, diferentes de sítios de restrição de ocorrência natural ou sítios de restrição introduzidos em outras partes do genoma, tal como BX. Assim, em uma modalidade, o sítio ou sítios de restrição permitem que o DNA na seção seja cortado especificamente.

[0241] Em uma modalidade, BY tem a sequência de 29345bp a 29379bp da SEQ ID NO: 17 revelada no documento n o WO2016/174200. Em uma modalidade, BY é uma ligação.

[0242] Em uma modalidade, o inserto está após o par de bases 12 na SEQ ID NO: 99 revelada no documento no WO2016/174200.

[0243] Em uma modalidade, o inserto está próximo à posição 29356bp da SEQ ID NO: 17 revelada no documento n o WO2016/174200.

[0244] Em uma modalidade, o inserto é um cassete de transgene que compreende um ou mais transgenes, por exemplo, 1, 2 ou 3, tal como 1 ou 2.

[0245] E4, conforme empregado no presente documento, se refere à sequência de DNA que codifica parte ou toda uma região E4 de adenovírus (isto é, região de polipeptídeo/proteína), que pode ser modificada de modo que a proteína codificada pelo gene E4 tenha mudanças de aminoácido conservadoras ou não conservadoras (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações, adições e/ou deleções de aminoácido), e tem a mesma função que a do tipo selvagem (a proteína não modificada correspondente); função aumentada em comparação com a da proteína do tipo selvagem; função diminuída, tal como nenhuma função em comparação com a proteína do tipo selvagem ou tem uma nova função em comparação com a proteína do tipo selvagem ou uma combinação da mesma conforme apropriado.

[0246] Em uma modalidade, a região E4 é parcialmente deletada, por exemplo, é 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% deletada. Em uma modalidade, a região E4 tem a sequência de 32188bp a 29380bp da SEQ ID NO: 17 revelada no documento no WO2016/174200.

[0247] Em uma modalidade, E4 está presente exceto pela região E4orf4 que é deletada.

[0248] Em uma modalidade, B3 é uma ligação, isto é, em que E4 está ausente.

[0249] Em uma modalidade, B3 tem a sequência de 32188bp a 29380bp da SEQ ID NO: 17 revelada no documento n o WO2016/174200.

[0250] Conforme empregado no presente documento, as faixas numéricas incluem os pontos de extremidade.

[0251] O indivíduo versado perceberá que os elementos nas fórmulas no presente documento, tais como fórmula (I), (la), são contíguos e podem incorporar sequências de DNA não codificantes, assim como os genes e sequências de DNA codificantes (recursos estruturais) mencionados no presente documento. Em uma ou mais modalidades, as fórmulas da presente revelação tentam descrever uma sequência de ocorrência natural no genoma de adenovírus. Nesse contexto, ficará evidente para o indivíduo versado que a fórmula está se referindo aos elementos principais que caracterizam a seção relevante de genoma e não se destina a ser uma descrição exaustiva do alongamento genômico de DNA.

[0252] E1A, E1B, E3 e E4, conforme empregados no presente documento, se referem, cada um, independentemente, ao tipo selvagem e equivalentes do mesmo, formas modificadas ou parcialmente deletadas de cada região, conforme descrito no presente documento, em particular uma sequência do tipo selvagem de um adenovírus conhecido.

[0253] “Inserto", conforme empregado no presente documento, se refere a uma sequência de DNA que é incorporada na extremidade 5', na extremidade 3' ou dentro de uma dada sequência de referência de sequência de DNA de modo que o mesmo interrompa a sequência de referência. Uma sequência de referência é empregada como um ponto de referência em relação ao qual o inserto está localizado. No contexto da presente revelação, os insertos, de modo geral, ocorrem dentro da SEQ ID NO: 98 ou da

SEQ ID NO: 99, ambas reveladas no documento n o WO2016/174200. Um inserto conterá, de modo geral, um cassete de transgene. Quando a sequência é interrompida, o vírus ainda compreenderá a sequência original, mas geralmente será como dois fragmentos ensanduichando o inserto.

[0254] Em uma modalidade, o transgene ou cassete de transgene não compreende um transpóson de inserção não polarizado, tal como um transpóson TN7 ou parte do mesmo. Transpóson Tn7, conforme empregado no presente documento, se refere a um transpóson de inserção não polarizado conforme descrito no documento no W02008/080003.

[0255] Em uma modalidade, o transgene ou cassete de transgene compreende adicionalmente uma sequência ou elemento regulador.

PROMOTORES

[0256] Promotor, conforme empregado no presente documento, significa uma região do DNA que inicia a transcrição de um gene ou genes particulares. Os promotores estão, de modo geral, localizados próximos aos genes que os mesmos transcrevem, na mesma fita e a montante (isto é, 5') no DNA. Próximo, conforme empregado nesse contexto, significa suficientemente perto para funcionar como um promotor. Em uma modalidade, o promotor está dentro de 100 pares de bases do sítio de início de transcrição. Assim, promotor endógeno, conforme empregado no presente documento, refere-se a um promotor que ocorre naturalmente (isto é, é nativo ao) no adenovírus (ou construto) no qual o transgene está sendo inserido. Em uma ou mais modalidades, o promotor endógeno empregado é o promotor de ocorrência natural no vírus em sua localização original no genoma de vírus, particularmente, o mesmo é o promotor primário ou único empregado na expressão do transgene ou transgenes. Em uma modalidade, o promotor endógeno usado para promover a tradução e opcionalmente a transcrição do transgene é um residente, isto é, é um integrado no genoma do adenovírus e não previamente introduzido por técnicas recombinantes.

[0257] Sob o controle de um promotor endógeno, conforme empregado no presente documento, refere-se a onde o transgene/cassete de transgene é inserido na orientação apropriada para estar sob o controle do dito promotor endógeno. Isto é, quando o promotor está geralmente na fita antissenso, o cassete é inserido, por exemplo, na orientação antissenso.

[0258] Tendo dito isso, os genes podem ser expressos em uma das duas orientações. Entretanto, geralmente uma orientação fornece níveis aumentados de expressão em relação à outra orientação para um determinado transgene (particular).

[0259] Em uma modalidade, o cassete está na orientação senso. Ou seja, é transcrito em uma direção 5' a 3'. Em uma modalidade, o cassete está na orientação antissenso. Ou seja, transcrito na orientação 3' a 5'.

[0260] Os promotores endógenos no vírus podem, por exemplo, ser utilizados empregando-se um gene que codifica um transgene e uma sequência de aceitante de splice. Assim, em uma modalidade, o cassete compreenderá uma sequência de aceitante de splice que facilita que o transgene utilize um promotor endógeno. Assim, em uma modalidade, a sequência de codificação, por exemplo, a sequência que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação de anticorpo compreende adicionalmente uma sequência aceitante de emenda.

[0261] Em uma modalidade, o transgene, transgenes ou cassete de transgene estão sob o controle de um promotor E4 ou um promotor tardio principal, tal como o promotor tardio principal (promotor ML).

[0262] Sob o controle de, conforme empregado no presente documento, significa que o é ativado, isto é, transcrito, quando um promotor particular determinar.

[0263] O promotor tardio principal (promotor ML ou MLP), conforme empregado no presente documento, refere-se ao promotor de adenovírus que controla a expressão dos genes "expressos de modo tardio", tal como o gene L5. O MLP é um promotor de "fita senso". Isto é, o promotor influencia os genes que estão a jusante do promotor na direção 5' a 3'. O promotor tardio principal, conforme empregado no presente documento, refere- se ao promotor tardio principal original localizado no genoma de vírus.

[0264] Promotor E4, conforme empregado no presente documento, refere-se ao promotor de adenovírus da região E4. A região E4 é uma região antissenso; portanto, o promotor é um promotor antissenso. Isto é, o promotor está a montante da região E4 na direção 3' a 5'. Portanto, qualquer cassete de transgene sob o controle do promotor E4 pode precisar ser orientado apropriadamente. Em uma modalidade, o cassete sob o controle do promotor E4 está na orientação antissenso. Em uma modalidade, o cassete está sob o controle do promotor E4 na orientação senso. O promotor E4, conforme empregado no presente documento, refere-se ao promotor E4 original localizado no genoma de vírus.

[0265] Assim, em uma modalidade, é fornecido um serotipo de adenovírus competente em replicação oncolítico 11 (tal como Ad11p) ou derivado de vírus do mesmo em que o fibra, héxon e capsídeo são serotipo 11 (tal como Ad11p), em que o genoma de vírus compreende uma sequência de DNA que codifica um anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação de anticorpo, em que a dita sequência de DNA sob o controle de um promotor endógeno ao adenovírus selecionado a partir do grupo que consiste em E4 e o promotor tardio principal (isto é, o promotor E4 ou o promotor tardio principal), de modo que o transgene não interfira com a replicação de vírus, por exemplo, seja associado à região L5 (isto é, antes ou após a dita região), tal como localizado após L5 no genoma de vírus.

[0266] Em uma modalidade, um promotor endógeno é introduzido no genoma viral em uma localização desejada por técnicas recombinantes, por exemplo, é introduzido no cassete de transgene. Entretanto, no contexto do presente relatório descritivo, essa disposição será geralmente referida como um promotor exógeno.

[0267] Em uma modalidade, o cassete de transgene compreende um promotor exógeno. Promotor exógeno, conforme empregado no presente documento, refere-se a um promotor que é de ocorrência não natural no adenovírus no qual o transgene está sendo inserido. Tipicamente, os promotores exógenos são de outros vírus ou são promotores de mamíferos. Promotor exógeno, conforme empregado no presente documento, significa um elemento de DNA, usualmente localizado a montante do gene de interesse, que regula a transcrição do gene.

[0268] Em uma modalidade, o regulador da expressão de gene é um promotor exógeno, por exemplo, CMV (promotor de citomegalovírus), CBA (promotor de beta actina de galinha) ou PGK (promotor de fosfoglicerato quinase 1), tal como o promotor CMV.

[0269] Em uma modalidade, o promotor exógeno é induzível.

[0270] Em uma modalidade, é fornecido um serotipo de adenovírus competente em replicação oncolítico 11 (tal como Ad11p) ou derivado de vírus do mesmo em que o fibra, héxon e capsídeo são serotipo 11 (tal como Ad11p), em que o genoma de vírus compreende uma sequência de DNA que codifica um anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação de anticorpo localizado em uma parte do genoma de vírus que é expresso de modo tardio no ciclo de replicação de vírus e de modo que o transgene não interfira com a replicação de vírus, em que a dita sequência de DNA está sob o controle de um promotor exógeno ao adenovírus (por exemplo, o promotor CMV). Em uma modalidade, a sequência de DNA que codifica um anticorpo ou fragmento é associada à região L5 conforme descrito em outro lugar no presente documento.

OUTRAS SEQUÊNCIAS REGULADORAS

[0271] "Regulador de expressão genética" (ou elemento regulador/regulatório), conforme empregado no presente documento, se refere a um elemento genético, tal como um promotor, intensificador ou uma sequência de aceitante de junção que tem um papel na expressão genética, tipicamente iniciando ou intensificando a transcrição ou translação.

[0272] "Sequência de aceitante de splice", "aceitante de splice" ou "sítio de splice", conforme empregado no presente documento, se refere a uma sequência reguladora que determina quando uma molécula de mRNA será reconhecida por ribonucleoproteínas nucleares pequenas do complexo de spliceossoma. Uma vez montado, o spliceossoma catalisa o splicing entre o sítio aceitante de splice da molécula de mRNA a um sítio doador de splice a montante que produz uma molécula de mRNA madura que pode ser traduzida para produzir um polipeptídeo ou proteína única.

[0273] Sequências de aceitante de splice de diferentes dimensões podem ser empregadas na presente invenção e a mesmas podem ser descritas como aceitante de splice curta (pequena), aceitante de splice (médio) e aceitante de splice ramificada (grande).

[0274] SSA, conforme empregado no presente documento, se refere a um aceitante de splice curto que compreende tipicamente apenas o sítio de splice, por exemplo, 4 pares de bases. SA, conforme empregado no presente documento, se refere a um aceitante de splice, que compreende tipicamente o aceitante de splice curto e o trato de polipirimidina, por exemplo, 16 pares de bases. bSA, conforme empregado no presente documento, se refere a um aceitante de splice ramificada que compreende tipicamente o aceitante de splice curto, trato de polipirimidina e o ponto de ramificação, por exemplo, 26 pares de bases.

[0275] Em uma modalidade, o aceitante de splice empregado nos construtos da revelação são CAGG ou SEQ ID NO: 15 ou 16 (ambos revelados no documento no WO2016/174200 como SEQ ID NO: 10 e 11, em que as ditas sequências estão incorporadas ao presente documento a título de referência). Em uma modalidade, a SSA tem a sequência de nucleotídeos de CAGG. Em uma modalidade, o SA tem a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 15. Em uma modalidade, a bSA tem a sequência de nucleotídeos de cagg.

Em uma modalidade, a sequência de aceitante de splice é independentemente selecionada a partir do grupo que compreende: gctaatctt cctttctctc ttcagg (SEQ ID NO: 15), tttctctctt cagg (SEQ ID NO: 16) e cagg.

[0276] Em uma modalidade, o sítio de splice é imediatamente seguido (isto é, seguido em uma direção 5' a 3') por uma sequência de Kozak consenso que compreende CCACC. Em uma modalidade, o sítio de splice e a sequência de Kozak são intercaladas (separadas) por até 100 ou menos pares de bases. Em uma modalidade, a sequência de Kozak tem a sequência de nucleotídeos de CCACC.

[0277] Tipicamente, quando sob o controle de um promotor exógeno ou endógeno (tal como um promotor endógeno), a sequência de codificação será imediatamente precedida por uma sequência de Kozak. O início da região de codificação está indicado pelo códon de iniciação (AUG), por exemplo, está no contexto da sequência (gcc)gccRccAUGg (SEQ ID NO: 8), o início das sequências de codificação é indicado pelas bases em negrito. Uma letra minúscula denota bases comuns nessa posição (que pode, no entanto, variar) e as letras maiúsculas indicam bases altamente conservadas, isto é, a sequência 'AUGG' é constante ou raramente, se alguma vez, muda; 'R' indica que uma purina (adenina ou guanina) é usualmente observada nessa posição e a sequência entre parênteses (gcc) é de significância incerta. Assim, em uma modalidade, o códon de iniciação AUG está incorporado em uma sequência de Kozak.

[0278] A Sequência de DNA de Entrada de Ribossomo Interno, conforme empregado no presente documento, se refere a uma sequência de DNA que codifica uma Sequência de Entrada de Ribossomo Interno (IRES). IRES, conforme empregado no presente documento, significa que uma sequência de nucleotídeos que permite iniciação de tradução de uma sequência de RNA mensageiro (mRNA), o que inclui iniciação que começa dentro de uma sequência de mRNA. Isso é particularmente útil quando o cassete codifica mRNA policistrônico. O uso de IRES resulta em um mRNA policistrônico que é traduzido em múltiplas proteínas ou polipeptídeos individuais. Em uma modalidade, a sequência de DNA de Entrada de Ribossomo Interno tem a sequência de nucleotídeos revelada no documento n o WO2016/174200 como a SEQ ID NO: 6 no mesmo (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência). Em uma modalidade, um IRES particular é usado apenas uma vez no genoma. Isso pode ter benefícios em relação à estabilidade do genoma.

[0279] "Peptídeo 2A de alta autoclivagem" ou "peptídeo 2A", conforme empregado no presente documento, se refere a um peptídeo que é eficientemente clivado em após à tradução. Os peptídeos 2A adequados incluem P2A, F2A, E2A e T2A. Os presentes inventores notaram que uma vez que uma sequência de DNA específica que codifica um determinado peptídeo 2A é usada pela primeira vez, a mesma sequência de DNA específica não pode ser usada uma segunda vez. Contudo, a redundância no código de DNA pode ser utilizada para gerar uma sequência de DNA que é traduzida no mesmo peptídeo 2A. O uso de peptídeos 2A é particularmente útil quando o cassete codifica mRNA policistrônico. O uso de peptídeos 2A resulta em uma cadeia de polipeptídeo única que é traduzida, a qual é modificada após a tradução para gerar múltiplas proteínas ou peptídeos individuais.

[0280] Em uma modalidade, o peptídeo P2A codificado empregado tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, o peptídeo F2A codificado empregado tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade, o peptídeo E2A codificado empregado tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em uma modalidade, o peptídeo T2A codificado empregado tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

[0281] Em uma modalidade, um mRNA ou cada mRNA codificado por transgene compreende uma sequência de sinal de poliadenilação, tal como tipicamente na extremidade de uma sequência de mRNA, por exemplo, conforme mostrado na SEQ ID NO: 10, é empregado.

Assim, em uma modalidade, o transgene ou o cassete de transgene compreende pelo menos uma sequência que codifica uma sequência de sinal de poliadenilação.

[0282] "PoliA", "Sinal de poliadenilação" ou "sequência de poliadenilação", conforme empregado no presente documento, significa uma sequência de DNA, que contém geralmente um sítio AATAAA, que uma vez transcrita pode ser reconhecida por um complexo de multiproteínas que cliva e poliadenila a molécula de mRNA nascente.

[0283] Em uma modalidade, a sequência de poliadenilação tem a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6. revelada no documento no WO2016/174200 (a dita sequência está incorporada ao presente documento a título de referência).

[0284] Em uma modalidade, o construto não inclui uma sequência de poliadenilação. Em uma modalidade, o regulador de expressão genética é uma sequência de aceitante de splice.

[0285] Em uma modalidade, a sequência que codifica uma proteína/polipeptídeo/peptídeo, tal como, um anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação, compreende adicionalmente um sinal de poliadenilação.

FORMULAÇÕES

[0286] A presente revelação se refere também à formulação farmacêutica de um vírus conforme descrito no presente documento.

[0287] Em uma modalidade, é fornecido uma formulação parenteral líquida, por exemplo, para infusão ou injeção, de um oncolítico com capacidade de replicação de acordo com a presente revelação em que a formulação fornece uma dose na faixa de 1x10 10 a 1x1014 partículas virais por volume de dose.

[0288] Formulação parenteral significa uma formulação projetada para não ser entregue através do trato Gl. As vias de entrega parenteral típicas incluem injeção, implantação ou infusão. Em uma modalidade, a formulação é fornecida em uma forma para entrega de bolus.

[0289] Em uma modalidade, a formulação parenteral está na forma de uma injeção. A injeção inclui injeção intravenosa, subcutânea, intratumoral ou intramuscular. A injeção, conforme empregado no presente documento, significa a inserção de líquido no corpo através de uma seringa. Em uma modalidade, o método da presente revelação não envolve injeção intratumoral.

[0290] Em uma modalidade, a formulação parenteral está na forma de uma infusão.

[0291] A infusão, conforme empregada no presente documento, significa a administração de fluidos em uma taxa mais lenta por gotejamento, bomba de infusão, acionador de seringa ou dispositivo equivalente. Em uma modalidade, a infusão é administrada ao longo de um período na faixa de 1,5 minuto a 120 minutos, tal como cerca de 3,4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 65, 80, 85, 90, 95,100,105,110 ou 115 minutos.

[0292] Em uma modalidade, uma dose da formulação menor do que 100 ml, por exemplo, 30 ml, tal como administrada por um acionador de seringa.

[0293] Em uma modalidade, a injeção é administrada como uma injeção lenta, por exemplo, por um período de 1,5 a 30 minutos.

[0294] Em uma modalidade, a formulação é para administração intravenosa (i.v.). Essa via é particularmente eficaz para entrega de vírus oncolítico devido ao fato de que a mesma permite acesso rápido à maioria dos órgãos e tecidos e é particularmente útil para o tratamento de metástases, por exemplo, metástases estabelecidas especialmente localizadas em regiões altamente vascularizadas, tais como o fígado e pulmões.

[0295] As formulações terapêuticas tipicamente serão esterilizadas nas condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra formulação parenteral adequada para administração a um ser humano e pode ser formulada como um dispositivo pré-preenchido, tal como uma seringa ou frasco, particularmente, como uma dose única.

[0296] A formulação geralmente compreenderá um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um carreador não tóxico, isotônico que é compatível com o vírus, e um que o vírus é estável para o período de tempo necessário.

[0297] O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e similares) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um dispersante ou tensoativo, tal como lecitina ou um tensoativo não iônico tal como polissorbato 80 ou 40. Em dispersões, a manutenção do tamanho de partícula necessário pode ser assistida pela presença de um tensoativo. Os exemplos de agentes isotônicos incluem açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição.

[0298] Em uma modalidade, as formulações parenterais empregadas podem compreender um ou mais dentre os seguintes: um tampão, por exemplo, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico, um tampão de fosfato e/ou um tampão Tris, um açúcar, por exemplo, dextrose, manose, sacarose ou similar, um sal tal como cloreto de sódio, cloreto de magnésio ou cloreto de potássio, um detergente tal como um tensoativo não iônico tal como brij, PS-80, PS-40 ou similar. A formulação pode também compreender um conservante, tal como EDTA ou etanol, ou uma combinação de EDTA e etanol, que se acredita que impeça uma ou mais trajetórias de possível degradação.

[0299] Em uma modalidade, a formulação compreenderá vírus oncolítico purificado de acordo com a presente revelação, por exemplo, 1x1010 a 1x1014 partículas virais por dose, tal como 1 x1010 a 1x1012 partículas virais por dose. Em uma modalidade, a concentração de vírus na formulação está na faixa de 2x108 a 2x1014 vp/ml, tal como 2 x 1012 vp/ml.

[0300] Em uma modalidade, a formulação parenteral compreende glicerol.

[0301] Em uma modalidade, a formulação compreende adenovírus oncolítico, conforme descrito no presente documento, HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido etanossulfônico), glicerol e tampão.

[0302] Em uma modalidade, a formulação parenteral consiste em vírus da revelação, HEPES por exemplo, 5 mM, glicerol por exemplo, 5 a 20% (v/v), ácido clorídrico, por exemplo, para ajustar o pH na faixa de 7 a 8 e água para injeção.

[0303] Em uma modalidade, 0,7 ml de vírus da revelação a uma concentração de 2 x 1012 vp/ml é formulado em HEPES 5 mM, 20% de glicerol com um pH final de 7,8.

[0304] Uma discussão completa de carreadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

[0305] Em uma modalidade, a formulação é fornecida como uma formulação para administrações tópicas, incluindo inalação.

[0306] As preparações inaláveis adequadas incluem pós inaláveis, aerossóis de medição que contêm propulsores de gases ou soluções inaláveis livre de gases propulsores. Os pós inaláveis de acordo com a revelação, de modo geral, conterão um vírus, conforme descrito no presente documento, com um excipiente fisiologicamente aceitável.

[0307] Esses pós inaláveis podem incluir monossacarídeos (por exemplo, glicose ou arabinose), dissacarídeos (por exemplo, lactose, sacarose, maltose), oligo e polissacarídeos (por exemplo, dextranos), poliálcoois (por exemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sais (por exemplo, cloreto de sódio, carbonato de cálcio) ou misturas desses com outros. Mono ou dissacarídeos são adequadamente usados, tais como lactose ou glicose, particularmente, mas não exclusivamente na forma de seus hidratos.

[0308] As partículas para deposição no pulmão exigem um tamanho de partícula menor do que 10 mícrons, tal como 1 a 9 micra, por exemplo, de 0,1 a 5 μm, particularmente de 1 a 5 μm. O tamanho da partícula que carrega o vírus é de grande importância e, portanto, em uma modalidade, o vírus de acordo com a presente revelação pode ser adsorvido ou absorvido em uma partícula, tal como uma partícula de lactose do tamanho determinado.

[0309] Os gases propulsores que podem ser usados para preparar os aerossóis inaláveis são conhecidos na técnica. Os gases propelentes adequados são selecionados dentre hidrocarbonetos tais como n- propano, n-butano ou isobutano e haloidrocarbonetos tais como derivados clorados e/ou fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano ou ciclobutano. Os gases propulsores mencionados acima podem ser usados sozinhos ou em misturas dos mesmos.

[0310] Os gases propulsores particularmente adequados são derivados de alcano halogenado selecionados dentre TG 11, TG 12, TG 134a e TG227. Dos hidrocarbonetos halogenados mencionados acima, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) e TG227 (1,1,1,2,3,3,3- heptafluoropropano) e misturas dos mesmos são particularmente adequados.

[0311] Os aerossóis inaláveis que contêm gás propulsor podem conter também outros ingredientes, tais como cossolventes, estabilizadores, agentes ativos de superfície (tensoativos), antioxidantes, lubrificantes e meios para ajustar o pH. Todos esses ingredientes são conhecidos na técnica.

[0312] Os aerossóis inaláveis que contêm gás propulsor de acordo com a invenção podem conter até 5% em peso de substância ativa. Os aerossóis de acordo com a invenção contêm, por exemplo, 0,002 a 5% em peso, 0,01 a 3% em peso, 0,015 a 2% em peso, 0,1 a 2% em peso, 0,5 a 2% em peso ou 0,5 a 1% em peso de ingrediente ativo.

[0313] Alternativamente, administrações tópicas ao pulmão podem também ser por administração de uma formulação de solução ou suspensão líquida, por exemplo, que emprega um dispositivo, tal como um nebulizador, por exemplo, um nebulizador conectado a um compressor (por exemplo, o nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a um compressor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

[0314] O vírus da invenção pode ser entregue dispersado em um solvente, por exemplo, na forma de uma solução ou uma suspensão, por exemplo, conforme já descrito acima nas formulações parenterais. O mesmo pode estar suspenso em uma solução fisiológica apropriada, por exemplo, solução salina, ou outro solvente farmacologicamente aceitável ou uma solução tamponada. As soluções tampão conhecidas na técnica podem conter 0,05 mg a 0,15 mg de edetato de sódio, 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, 0,15 mg a 0,25 mg de polissorbato, 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anidro e 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sódio por 1 ml de água, de modo a alcançar um pH de cerca de 4,0 a 5,0.

[0315] As formulações de solução ou suspensões terapêuticas podem também conter um ou mais excipientes. Os excipientes são bem conhecidos na técnica e incluem tampões (por exemplo, tampão de citrato, tampão de fosfato, tampão de acetato e tampão de bicarbonato), aminoácidos, ureia, álcoois, ácido ascórbico, fosfolipídios, proteínas (por exemplo, albumina de soro), EDTA, cloreto de sódio, lipossomos, manitol, sorbitol e glicerol. As soluções ou suspensões podem ser encapsuladas em lipossomos ou microesferas biodegradáveis. A formulação será fornecida, de modo geral, em uma forma substancialmente esterilizada que emprega processos de fabricação estéreis.

[0316] Isso pode incluir produção e esterilização por filtragem do solvente/solução tamponada usada para a formulação, suspensão asséptica do anticorpo na solução de solvente tamponada e distribuição da formulação em receptáculos esterilizados por métodos familiares para aqueles indivíduos versados na técnica.

[0317] A formulação nebulizável de acordo com a presente revelação pode ser fornecida, por exemplo, como unidades de dose única (por exemplo, recipientes ou frascos de plástico vedados) embaladas em envelopes de folha metálica. Cada frasco contém uma dose unitária em um volume, por exemplo, 2 ml de tampão de solvente/solução.

[0318] A presente revelação também se estende a soluções ou suspensões líquidas entregues por via intranasal, por exemplo, empregando um dispositivo conforme revelado nos documentos nos WO2009/068877 e US2004/0153033, ambos incorporados ao presente documento a título de referência.

TRATAMENTO

[0319] Em um aspecto adicional, a presente revelação se estende a um vírus ou uma formulação do mesmo, conforme descrito no presente documento, para uso em tratamento, em particular, para o tratamento de câncer.

[0320] Em uma modalidade, o método de tratamento é para uso no tratamento de um tumor.

[0321] Tumor, conforme empregado no presente documento, se destina a referir a uma massa anormal de tecido que resulta de divisão celular excessiva que é descontrolada e progressiva, também chamado de neoplasma. Os tumores podem ser benignos (não cancerosos) ou malignos. Tumor engloba todas as formas de câncer e metástase. Em uma modalidade, o tumor é canceroso.

[0322] Em uma modalidade, o tumor é um tumor sólido. O tumor sólido pode ser localizado ou em estar em metástase.

[0323] Em uma modalidade, o tumor é de origem epitelial.

[0324] Em uma modalidade, o tumor é uma malignidade, tal como câncer colorretal, hepatoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de tiroide, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e do pescoço ou câncer de pulmão.

[0325] Em uma modalidade, o tumor é uma malignidade colorretal.

[0326] A malignidade, conforme empregado no presente documento, se refere a células cancerosas.

[0327] Em uma modalidade, o adenovírus oncolítico é empregado no tratamento ou prevenção de metástase.

[0328] Em uma modalidade, o método ou formulação no presente documento é empregado no tratamento de cânceres resistentes a fármaco.

[0329] Em uma modalidade, o vírus é administrado em combinação com a administração de um tratamento ou terapia de câncer adicional.

[0330] Em uma modalidade, é fornecido um vírus ou formulação de acordo com a presente revelação para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, por exemplo, um câncer descrito acima.

[0331] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de câncer que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus ou formulação de acordo com a presente revelação a um paciente com necessidade do mesmo, por exemplo, um paciente humano.

[0332] Em uma modalidade, o vírus oncolítico ou formulação no presente documento é administrado em combinação com outra terapia.

[0333] "Em combinação", conforme empregado no presente documento, se destina a englobar quando o vírus oncolítico é administrado antes, simultaneamente e/ou após o tratamento ou terapia de câncer. Entretanto, de modo geral, os regimes de tratamento para a terapia de combinação serão, de modo geral, sobrepostos.

[0334] Uma "terapia de combinação", conforme empregado no presente documento, se refere aos dois produtos farmacêuticos juntos, por exemplo, como um kit, ou coformulados, em particular para uso no tratamento de câncer.

[0335] A terapia de câncer inclui cirurgia, radioterapia, terapia dirigia e/ou quimioterapia.

[0336] Tratamento para câncer, conforme empregado no presente documento, refere-se ao tratamento com um composto terapêutico ou agente biológico, por exemplo, um anticorpo destinado a tratar o câncer e/ou terapia de manutenção do mesmo.

[0337] Em uma modalidade, o tratamento de câncer é selecionado dentre qualquer outra terapia anticâncer que inclui um agente quimioterápico; um agente anticâncer com alvo, tal como um conjugado de fármaco de anticorpo; radioterapia, terapia com radioisótopos ou qualquer combinação das mesmas.

[0338] Em uma modalidade, o vírus da presente revelação tal como um adenovírus oncolítico pode ser usado como um pré- tratamento para uma terapia, tal como uma cirurgia (terapia neoadjuvante), por exemplo, para encolher o tumor, por exemplo, para tratar metástase e/ou impedir a metástase ou metástase adicional. O adenovírus oncolítico pode ser usado após a terapia, tal como uma cirurgia (terapia adjuvante), por exemplo, para manter o câncer em remissão, para tratar metástase e/ou prevenir metástase ou metástase adicional.

[0339] Em uma modalidade, um vírus ou formulação da presente revelação é empregado na terapia de manutenção.

[0340] Concomitantemente, conforme empregado no presente documento, é a administração do tratamento de câncer adicional ao mesmo tempo, ou aproximadamente o mesmo tempo, que a formulação de adenovírus oncolítico. O tratamento pode estar contido dentro da mesma formulação ou administrado como uma formulação separada.

[0341] Em uma modalidade, o vírus é administrado em combinação com a administração de um agente quimioterápico.

[0342] O agente quimioterápico, conforme empregado no presente documento, se refere a agentes químicos antineoplásticos específicos ou fármacos que são seletivamente destrutivos para células e tecidos malignos. Por exemplo, agentes alquilantes, antimetabólitos, antraciclinas, alcaloides de planta, inibidores de topoisomerase e outros agentes antitumor. Os exemplos de agentes quimioterápicos específicos incluem doxorubicina, 5-fluorouracila (5-FU), paclitaxel, capecitabina, irinotecano e platinas, tais como cisplatina e oxaliplatina. A dose pode ser escolhida pelo profissional com base na natureza do câncer que é tratado.

[0343] Em uma modalidade, o agente terapêutico é ganciclovir, que pode auxiliar no controle de respostas imunológicas e/ou vascularização de tumor.

[0344] Em uma modalidade, uma ou mais terapias empregadas no método no presente documento são metronômicas, que é um tratamento contínuo ou frequente com baixas doses de fármacos anticâncer, frequentemente dado concomitante com outros métodos de terapia.

[0345] Os adenovírus oncolíticos de subgrupo B, particularmente Ad11 e aqueles derivados do mesmo tal como EnAd, podem ser particularmente sinérgicos com quimioterápicos porque os mesmos parecem ter um mecanismo de ação que é amplamente independente de apoptose, exterminando as células de câncer por um mecanismo predominantemente necrolítico. Ademais, a imunossupressão que ocorre durante a quimioterapia pode permitir que o vírus oncolítico funcione com maior eficiência.

[0346] A dose terapêutica, conforme empregado no presente documento, se refere à quantidade de vírus, tal como adenovírus oncolítico que é adequada para alcançar o efeito terapêutico pretendido quando empregada em um regime de tratamento adequado, por exemplo, melhora os sintomas ou condições de uma doença, em particular, sem produzir efeitos colaterais limitantes de dose. Uma dose pode ser considerada uma dose terapêutica no tratamento de câncer ou metástases quando o número de partículas virais pode ser suficiente para resultar no seguinte: crescimento de tumor ou metastático se torna mais lento ou é interrompido, ou o tumor ou metástase encolhe em tamanho e/ou a vida do paciente é estendida. As doses terapêuticas adequadas são, de modo geral, um equilíbrio entre efeito terapêutico e toxicidade tolerável, por exemplo, quando o efeito colateral e toxicidade são toleráveis devido ao benefício alcançado pela terapia.

[0347] Em uma modalidade, é fornecida administração sistemática de múltiplas doses de uma formulação parenteral de um adenovírus oncolítico de acordo com a presente revelação em um ciclo de tratamento único, por exemplo, em que a dose total determinada em cada administração está na faixa de 1x1010 a 1x1014 partículas virais por dose.

[0348] Em uma modalidade, uma ou mais doses (por exemplo, cada dose) de vírus ou composição que compreende a mesma é administrada de modo que a taxa de entrega de partícula viral esteja na faixa de 2x1010 partículas por minuto para 2x1012 partícula por minuto.

[0349] Em uma modalidade, um vírus ou construto terapêutico de acordo com a presente revelação (incluindo uma formulação que compreende o mesmo) é administrado semanalmente, por exemplo, uma semana 1 a dose é administrada no dia 1, 3, 5, seguido por uma dose cada semana subsequente.

[0350] Em uma modalidade, um vírus ou construto terapêutico de acordo com a presente revelação (incluindo uma formulação que compreende o mesmo) é administrado a cada duas ou três semanas, por exemplo, é administrada na semana 1 um nos dias 1, 3 e 5 e, na semana 2 ou 3, é também administrada nos dias 1, 3 e 5 das mesmas. Esse regime de dosagem pode ser repetido quantas vezes forem adequadas.

[0351] Em uma modalidade, um vírus ou construto terapêutico de acordo com a presente revelação (incluindo uma formulação que compreende o mesmo) é administrado mensalmente, por exemplo, em um ciclo de tratamento ou como terapia de manutenção.

[0352] Em uma modalidade, o vírus e construtos da presente revelação são preparados por técnicas recombinantes. O indivíduo versado observará que o genoma de adenovírus armado pode ser fabricado por outro meio de técnica, incluindo sintetizar inteiramente o genoma ou um plasmídeo que compreende parte de todo o genoma. O indivíduo versado observará que, no caso de síntese, o genoma da região de inserção pode não compreender os nucleotídeos de sítio de restrição como o último são artefatos após a inserção de genes que usam métodos de clonagem.

[0353] Em uma modalidade, o genoma de adenovírus armado é inteiramente fabricado de modo sintético.

[0354] A revelação no presente documento se estende adicionalmente a um adenovírus de fórmula (I) ou uma subfórmula da mesma obtido ou obtenível a partir da inserção de um transgene ou cassete de transgene.

[0355] “É" conforme, empregado no presente documento, significa que compreende.

[0356] No contexto do presente relatório descritivo "que compreende" deve ser interpretado como "que inclui".

[0357] As modalidades da invenção que compreendem determinados recursos/elementos se destinam também à extensão para modalidades alternativas "que consistem" ou "que consistem essencialmente" nos elementos/recursos relevantes.

[0358] Quando tecnicamente apropriado, as modalidades da invenção podem ser combinadas. As referências técnicas, tais como patentes e pedidos, são incorporadas no presente documento a título de referência.

[0359] Quaisquer modalidades especificas e explicitamente mencionadas no presente documento podem formar a base de uma negativa de parecer sozinha ou em combinação com uma ou mais modalidades adicionais.

[0360] Cabeçalhos, no presente documento, são empregados para dividir o documento em seções, e não se destinam a serem usados para interpretar o significado da revelação fornecida no presente documento.

[0361] A presente revelação também se estende a qualquer sequência viral ou sequência de cassete especificamente revelada no presente documento, composições que compreende os ditos vírus, uso dos ditos cassetes para gerar vírus e uso de vírus de acordo com a revelação na terapia, em particular terapia contra câncer.

[0362] O presente pedido reivindica prioridade aos documentos nos GB1708779.2 e GB1708778.4, ambos depositados em 1 de junho de 2017. A revelação de cada um dos mesmo está incorporada a título de referência, em particular estão incorporadas as sequências de aminoácidos e polinucleotídeos reveladas no presente documento. Os documentos de prioridade podem ser empregados como base para uma correção ao presente relatório descritivo.

[0363] A presente invenção é descrita adicionalmente por meio de ilustração apenas nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: PRODUÇÃO DE VÍRUS ENAD QUE EXPRESSAM ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-CD40 (NG-350).

[0364] O primeiro genoma do vírus enadenotucirev gerado que codifica um anticorpo monoclonal anti-CD40 foi designado NG-350 (SEQ ID NO. 13).

[0365] Para produzir o genoma de NG-350, um plasmídeo, pNG-350, foi gerado por inserção direta de um cassete que codifica: uma sequência de aceitante de splice curta 5’ (CAGG, SEQ ID NO.2); uma sequência líder de cadeia pesada (SEQ ID NO. 3), a cadeia VH anti-CD40 (SEQ ID NO. 4), região constante de cadeia pesada de anticorpo (SEQ ID NO. 5), um peptídeo autoclivável de alta eficiência P2A (SEQ ID NO. 6), uma sequência líder de cadeia leve (SEQ ID NO. 7), a cadeia VL anti-CD40 (SEQ ID NO. 8), uma região constante de cadeia leve de anticorpo (SEQ ID NO. 9) e uma cauda poli (A) de SV40 (SEQ ID NO.10), no plasmídeo pEnAd2.4. Um esquema do cassete de transgene (SEQ ID NO. 11) é mostrado na Figura 1.

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VÍRUS

[0366] O plasmídeo pNG-350 foi linearizado por digestão por restrição com a enzima Ascl para produzir o genoma do vírus NG- 350 (SEQ ID NO: 1). O vírus NG-350 foi amplificado e purificado de acordo com os métodos determinados abaixo.

[0367] O DNA digerido foi purificado por extração de fenol/clorofórmio e precipitado por 16 h,- 20 °C humana em 300 μl > 95% de grau de biologia molecular de etanol e 10p.1 de Acetato de Sódio 3 M. O DNA precipitado foi peletizado por centrifugação a 14.000 rpm, 5 min e foi lavado em 500 μΙ de etanol a 70%, antes de nova centrifugação,14.000 rpm, 5 min. O pélete de DNA limpo foi seco ao ar, ressuspenso em 500 μΙ de OptiMEM contendo 15 μΙ de reagente de transfecção lipofectamina e incubado por 30 min, TA. A mistura de transfecção foi então adicionada por gotejamento a um frasco T-25 contendo 293 células cultivadas com 70% de confluência. Após a incubação das células com a mistura de transfecção por 2 horas a 37 °C, 5% de CO 2, 4 ml de meio celular (DMEM com alto teor de glicose com glutamina suplementado com 2% de FBS) foram adicionados às células, e os frascos foram incubados a 37 °C, 5% de CO2.

[0368] As 293 células transfectadas foram monitoradas a cada 24 h e foram suplementadas com meio adicional a cada 48 a 72 h. A produção de vírus foi monitorada por observação de um efeito citopático significativo (CPE) na monocamada celular. Uma vez que CPE extensivo tenha sido observado, o vírus foi colhido de 293 células por três ciclos de congelamento e descongelamento. Os vírus colhidos foram usados para reinfectar 293 células a fim de amplificar os estoques de vírus. A produção de vírus viável durante a amplificação foi confirmada por observação de CPE significativo na monocamada celular. Uma vez que CPE tenha sido observado, o vírus foi colhido de 293 células por três ciclos de congelamento e descongelamento. O estoque amplificado foi usado para a amplificação adicional antes de o vírus ser purificado pelo bandamento de cloreto de césio duplo par produzir um estoque de vírus NG-350. EXEMPLO 2: ATIVIDADE DO VÍRUS NG-350 E PRODUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD40

[0369] A atividade do vírus NG-350 em termos de rendimento de partícula e produção de anticorpo anti-CD40 secretado foi avaliada em uma linhagem de células de cultura de suspensão HEK293. As células HEK293 foram inoculadas em frascos de agitação a uma densidade de 1x106 vp/ml e infectadas com 50 partículas de vírus NG-350 vírus por célula (ppc). As células HEK293 foram também infectadas com o vírus precursor NG- 350, enadenotucirev (EnAd), como um controle (50 ppc). Em 48 e 72 horas após a infecção, os sobrenadantes celulares foram coletados por centrifugação por 5 minutos, 1.200 rpm. As amostras do sobrenadante clarificado foram usadas para avaliar a concentração de partículas virais por HPLC ou concentração de anticorpos anti-CD40 por ELISA de lgG2 humana.

ANÁLISE POR HPLC

[0370] A concentração de partículas virais nos sobrenadantes foi quantificada por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) com o uso de uma coluna Resource Q (troca de ânions). A eluição viral foi detectada a 260 nm e a concentração viral foi determinada integrando-se o pico de sinal a 260 nm e calculando-se a concentração de uma curva padrão de enadenotucirev. A comparação de produção viral de NG-350 e células enadenotucirev mostrou que a atividade viral de NG-350 em termos de produção total de partículas e produção de partículas virais no sobrenadante celular foi significativamente mais baixa do que enadenotucirev (Figura 2A e 2B). ELISA DE IGG2

[0371] Os sobrenadantes clarificados foram diluídos 1 em 2 em PBS 10% BSA. Uma curva padrão e amostras de controle negativo foram preparadas de acordo com o protocolo do fabricante (kit IgG2 Human SimpleStep ELISA, ab202402, Abcam). As amostras e padrões foram adicionados às placas de ELISA e o ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. A absorbância a 450 nm em cada poço da placa foi medida com o uso de um leitor de placa (BioTek) e as concentrações de anticorpo anti-CD40 lgG2 secretado foram determinadas por interpolação a partir da curva padrão (Figura 2C). Anti-CD40 foi produzido e secretado a partir de NG- 350, mas não células infectadas com enadenotucirev.

[0372] Considerados em conjunto, esses dados indicaram que, embora NG-350 tenha tido capacidade de produzir anticorpo anti- CD40, a atividade viral desse vírus modificado foi significativamente comprometida. A caracterização adicional da partícula viral NG-350 foi, portanto, executada (Exemplo 3). EXEMPLO 3: TESTE DE IDENTIDADE DE VÍRUS NG-350

E ANÁLISE DE GENOMA ANÁLISE DE ENZIMA DE RESTRIÇÃO

[0373] A identidade do material de estoque de vírus NG-350 foi inicialmente investigada analisando-se a identidade de genoma por meio de análise de enzima de restrição. Partículas virais de NG-350 ou enadenotucirev (3,5x1011vp) foram diluídas em PBS até um volume final de 200 µl. DNA foi extraído do vírus com o uso do kit QIAgen Minelute virus spin de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA de controle foi preparado para o ensaio por linearização do plasmídeo pNG-350 com a enzima AscI por 2 horas, 37 °C e, então, purificação do DNA por eletroforese em gel de agarose e extração de gel com um Kit de extração de gel QiaQuick (Qiagen). O controle purificado ou DNA de NG-350 foram digeridos por restrição com o uso de uma combinação de enzimas de restrição, EcoRv/Nhel (Figura 3A) ou enzimas de restrição individuais, Ncol ou Fspl (Figura 3B). O DNA digerido foi separado por eletroforese em gel de agarose e visualizado com o uso de um transiluminador de UV. A digestão com Fspl ou EcoRV/Nhel mostrou uma banda adicional no material de genoma do vírus NG-350, que não foi prevista (Figura 3, setas vermelhas).

ANÁLISE POR PCR

[0374] A identidade de genoma foi, ainda, avaliada por análise por PCR do genoma do vírus com o uso de 8 conjuntos de sondas de iniciador diferentes, mostrado na Tabela 1: Conjunto de Iniciador Direto Iniciador Reverso iniciadores

ACGGAACTTGTTACTACACA D CTTTCACAGTCCAACTGCTGC GC

AGCCGGAGAACAACTACAAG 1 CTTTCACAGTCCAACTGCTGC

AC

CATCCAGATGACCCAGTCTC GGACAAACCACAACTAGAATG 2

C CAG

CATCCAGATGACCCAGTCTC 3 CTTTCACAGTCCAACTGCTGC

C 4 AGCCGGAGAACAACTACAAG GGACAAACCACAACTAGAATG

AC CAG 5 CCTCAGTGAAGGTCTCCTGC CTTTCACAGTCCAACTGCTGC

GGACAAACCACAACTAGAATG 6 CCTCAGTGAAGGTCTCCTGC

CAG

[0375] Essas PCRs foram projetadas para determinar se mais de uma espécie de genoma estava presente no estoque viral NG-350 e se essa espécie continha o cassete de transgene de anticorpo anti-CD40. Partículas virais de NG-350 ou enadenotucirev (2x1010vp) foram diluídas em PBS até um volume final de 200 µl. DNA foi extraído do vírus com o uso do kit QIAgen Minelute virus spin de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA de controle foi preparado como para a análise de enzima de restrição. As reações PCR foram configuradas com o uso de 1µl de DNA (100 ng/µl) em um volume de reação de 50 µl contendo iniciador direto e reverso (2 µM) e mistura mestre de alta fidelidade Phusion (NEB). Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose e visualizados com o uso de um transiluminador de UV (Figura 5A e 5B). A análise com o conjunto de iniciadores D revelou o tamanho de banda esperado de 2.920 pares de bases no DNA de controle positivo e na amostra de teste NG-350. Entretanto, a amostra de teste NG-350 continha adicionalmente um segundo produto de PCR de aproximadamente 800 pares de base, que não foi visto com o DNA de plasmídeo pNG-350-PSl-01 usado para gerar o vírus NG-350. A análise com os conjuntos de iniciadores 1 a 6 também mostrou bandas de contaminante adicionais quando os conjuntos de iniciadores 5 e 6 foram usados. Esses dados indicaram que duas espécies de vírus estavam presentes no estoque de vírus NG-350, um contendo o cassete de transgene anti-CD40 de comprimento completo e um contendo uma versão truncada do cassete. Esse truncamento foi confirmado por sequenciamento do produto de PCR contaminante.

OTIMIZAÇÃO DE CASSETE DE TRANSGENE

[0376] Uma explicação para o truncamento que ocorre durante a amplificação viral foi uma instabilidade inesperada no cassete de transgene que resulta em recombinação entre a região VH e o poliA de SV40 e, portanto, merda da maior parte da região de codificação de anticorpo. A sequência de DNA de cassete de transgene, portanto, precisou ser modificada para superar esse problema. Portanto, a sequência de DNA foi alterada para reduzir a homologia com outras sequências de cassete e vírus e remover repetições diretas e invertidas secundárias (executado pela Oxford Genetics, RU). A sequência de cassete otimizada foi usada para gerar um novo plasmídeo pNG-350A de acordo com o Exemplo 4. EXEMPLO 4: PRODUÇÃO DE VÍRUS ENAD QUE EXPRESSAM UM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD40 (NG-350A).

[0377] Para produzir o genoma de NG-350A, um plasmídeo, pNG-350A, foi gerado por inserção direta de um cassete que codifica: uma sequência de aceitante de splice curta 5’ (CAGG, SEQ ID NO.2); uma sequência líder de cadeia pesada (SEQ ID NO. 3), a cadeia VH anti-CD40 (SEQ ID NO. 4), uma cadeia pesada constante de anticorpo (SEQ ID NO. 5), um peptídeo autoclivável de alta eficiência P2A (SEQ ID NO. 6), uma sequência líder de cadeia leve (SEQ ID NO. 7), a cadeia VL anti-CD40 (SEQ ID NO. 8), uma cadeia leve constante de anticorpo (SEQ ID NO. 9) e uma cauda poli (A) de SV40 (SEQ ID NO.10), no plasmídeo pEnAd2.4. A sequência de aminoácidos do antiestática anti-CD40 codificado por NG-350A foi idêntica àquela codificada no vírus NG-350 e a estrutura do cassete foi a mesma (Figura 1). Entretanto, a sequência de ácidos nucleicos do cassete de transgene foi modificada e significativamente diferente daquela de NG-350 (SEQ ID NO.11).

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VÍRUS

[0378] O plasmídeo pNG-350A foi linearizado por digestão de restrição com a enzima AscI para produzir o genoma de vírus NG- 350A (SEQ ID NO: 1). O vírus NG-350A foi amplificado e purificado de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1. EXEMPLO 5: TESTE DE IDENTIDADE DE VÍRUS NG- 350A POR PCR

[0379] A identidade de genoma de NG-350A foi conformada por análise por PCR com o uso de 2 conjuntos de sonda de iniciador (Tabela 2; D e K), que geram produtos que abrangem o cassete de transgene. DNA de NG-350A e DNA de controle foram preparados de acordo com os métodos detalhados no Exemplo 3. A análise por PCR foi executada com o uso dos Conjuntos de Iniciadores D e K de acordo com os métodos detalhados no Exemplo 3. A visualização dos produtos de PCR mostrou produtos únicos do tamanho previsto (Figura 6). Nenhum produto contaminante foi detectado com qualquer conjunto de iniciadores. TABELA 2 CONJUNTOS DE INICIADORES DE PCR DE

IDENTIDADE

Conjunto de Iniciador Direto Iniciador Reverso iniciadores

ACGGAACTTGTTACTACAC CTTTCACAGTCCAACTGCT D AGC GC AGCCGGAGAACAACTACA CTTTCACAGTCCAACTGCT

K AGAC GC EXEMPLO 6: REPLICAÇÃO E ATIVIDADE ONCOLÍTICA DO VÍRUS NG-350A EM CÉLULAS DE CARCINOMA DE CÓLON

POTÊNCIA ONCOLÍTICA DE VÍRUS

[0380] As células de carcinoma de cólon HT-29 foram inoculadas em placas de 96 poços em uma densidade de célula de 2.5e4 células/poço. As placas foram incubadas por 4 horas, 37 °C, 5% de CO 2, antes de as células terem sido infectadas com partícula de vírus EnAd, ou NG-350A a uma faixa de densidade de infecção de 100-0,39 partículas virais por célula (ppc). A viabilidade de células HT-29 foi avaliada com o uso de Reagente Cell Titre 96 MTS (Promega: G3581) 72 horas após a infecção. A quantificação da % de sobrevivência celular em cada densidade de infecção demonstrou que, similarmente a EnAd, NG-350A mostra forte atividade oncolítica contra células HT-29 (Figura 7A).

REPLICAÇÃO VIRAL

[0381] Células de carcinoma de pulmão (A549) ou células de carcinoma de cólon (HCT-116) foram infectadas por 24, 48, 72 ou 96 horas com 100 ppc de NG-350A ou do vírus precursor de NG-350A, enadenotucirev, ou foram deixadas não infectadas. Células de carcinoma de cólon (HT-29) ou células de carcinoma de bexiga (HTB-5, HT-1197 e HT-1376) forma infectadas por 24, 48, 72, 144 e 168 horas com 100 ppc de NG-350A ou enadenotucirev ou foram deixadas não infectadas. Em cada ponto no tempo, sobrenadantes celulares foram coletados e clarificados por centrifugação por 5 minutos, 1.200 rpm. DNA foi extraído de 10 µl (HT-29, A549 ou HCT-116) ou 50 µl (HTB-5, HT-1197 e HT-1376) de sobrenadante com o uso do kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Uma curva padrão com o uso de partículas virais EnAd (2,5e10 a 2,5e5vp) foi também preparada e extraída com o uso do kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). Cada amostra extraída ou padrão foi analisado por qPCR com o uso de um conjunto de iniciador-sonda com especificidade para gene enadenotucirev E3.

[0382] A quantificação do número de genomas virais detectados por célula demonstrou que a cinética de NG-350A e enadenotucirev de replicação viral foi comparável em todas as linhagens celulares testadas e em todos os pontos no tempo analisados (Figura 7 e Figura 8). Nenhum genoma de vírus pôde ser detectado em células não infectadas (dados não mostrados). EXEMPLO 7: EXPRESSÃO DE ANTICORPO ANTI-CD40

EM LINHAGENS CELULARES DE CARCINOMA DE CÓLON INFECTADAS COM NG-350A ELISA DE IGG2

[0383] Células A549 infectadas por 24, 48 ou 72 horas com 100 ppc de EnAd, dois lotes diferentes de NG-350A (NG-350A B1 ou NG- 350A B2) ou foram deixadas não infectadas foram usadas para análise de expressão de anticorpo anti-CD40 por ELISA de lgG2 (kit IgG2 Human SimpleStep ELISA, aB202402, Abcam). Os sobrenadantes de cultura foram removidos de cada poço e centrifugados por 5 min, 1.200 rpm, para remover detritos de células. Os sobrenadantes clarificados foram diluídos 1 em 2 em PBS 10% BSA. Uma curva padrão e amostras de controle negativo foram preparadas de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras e padrões foram adicionados às placas de ELISA e o ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. A absorbância a 450 nm em cada poço da placa foi medida com o uso de um leitor de placa (BioTek) e as concentrações de anticorpo anti-CD40 lgG2 secretado foram determinadas por interpolação a partir da curva padrão (Figuras 9A e 9B). ELISA DE LIGAÇÃO A CD40

[0384] Células A549 infectadas por 24, 48 ou 72 horas com 100 ppc de EnAd, dois lotes diferentes de NG-350A (NG-350A B1 ou NG- 350A B2) ou foram deixadas não infectadas foram usadas para análise de expressão de anticorpo anti-CD40 por ELISA de ligação a CD40.

[0385] Os sobrenadantes de cultura foram removidos de cada poço e centrifugados por 5 min, 1.200 rpm, para remover detritos de células. As placas de ELISA (uma microplaca com 96 cavidades Nunc Immuno MaxiSorp) foram preparadas por revestimento de um dia para o outro a 4 °C com CD40 humano (100 μg/ml, R and D Systems, 1493-CD) em tampão carbonato/bicarbonato. As placas foram lavadas entre todas as etapas de ligação subsequentes com PBS 0,05% Tween 20. As placas foram bloqueadas por 1 hora à temperatura ambiente com PBS 5% BSA.

[0386] Os sobrenadantes de infecção clarificados foram diluídos em PBS 5% BSA (1 em 2,1 em 10 e 1 em 100). Nesse ensaio, o anticorpo anti-CD40 (BioLegend, 334308) foi usado como um controle positivo para ligação de CD40 à placa de ELISA. O mesmo foi preparado em PBS 5% BSA a uma concentração de 30 ng/ml. Todas as amostras foram adicionadas às placas revestidas com CD40 e incubadas por 1 h à temperatura ambiente. Os anticorpos de detecção, lgG2-Fc anti-humano conjugado a HRP (Abcam, ab97225) para sobrenadantes virais ou Abs IgG anticamundongo (HRP) (Abcam, ab6728), para o anticorpo de controle positivo, então, aplicados por 1 h à temperatura ambiente a todos os poços. A detecção de HRP foi realizada com solução de substrato de HRP 3.3.5.5’-terametiletilenodiamina (TMB, Thermo- Fisher). HCI 1 M foi usado para interromper a reação, e a cor desenvolvida foi medida a 450 nm em um leitor de placa. A absorbância a 450 nm foi plotada para o EnAd, NG-350A e controles positivos (Figura 9C) e demostrou ligação específica a CD40 pelo anticorpo anti-CD40 secretado presente no sobrenadante de células infectadas com NG-350A. EXEMPLO 8: ENSAIO DE REPÓRTER DE SINALIZAÇÃO FUNCIONAL DE CD40

[0387] Células A549 infectadas por 24 ou 48 horas com 10 ppc de EnAd, NG-350A ou por 48 horas com NG-165 (um vírus que expressa um anticorpo de controle [anti-VEGF]) ou deixadas não infectadas foram usadas para análise de atividade funcional de anticorpo anti-CD40 com o uso de células repórter CD40+ HEK-Blue que secretam fosfatase alcalina (Invivogen) em resposta à ativação por meio de suas moléculas de CD40 expressas na membrana. Após a infecção, os sobrenadantes de cultura de células A549 foram removidos de cada cavidade e centrifugados por 5 minutos,

1.500 rpm para remover resíduos celulares.

[0388] 20 µl de sobrenadantes de cultura foram diluídos em 180 µl de meio de cultura e aplicados a células Hek-Blue CD40 por 20 horas. CD40L a uma concentração de 10 ng/ml foi preparado em meio de cultura como um controle positivo. Os sobrenadantes foram, então, coletados das células HEK-Blue CD40 e clarificadas por centrifugação. 40 µl do sobrenadante clarificado foram avaliados quanto á atividade de fosfatase alcalina por incubação por 1 hora a 37 graus com 160 µl de reagente Quanti- Blue. A absorbância a 620 nm foi medida para cada amostra com o uso de um leitor de placa e demonstrou que os sobrenadantes de NG-350A, mas não células infectadas com EnAd ou NG-165, dispararam a produção de SEAP das células repórter HEK-Blue que expressam CD40 (Figura 10). EXEMPLO 9: ATIVIDADE SELETIVA DO VÍRUS NG-3 50A

EM LINHAGENS CELULARES DE CARCINOMA

[0389] Células de carcinoma de pulmão (A549), células de carcinoma de cólon (HCT-116) ou células de fibroblasto de pulmão (MRC-5), que são semipermissivas à atividade de vírus EnAd, foram usadas para demonstrar a seletividade de vírus NG-350A vírus para células cancerosas. As linhagens celulares forma infectadas por 72 horas com 100 ppc de NG-350A ou o vírus precursor de NG-350A, enadenotucirev ou foram deixadas não infectadas.

[0390] Em cada ponto no tempo, o sobrenadante de cultura foi removido de cada poço e usado para análise de replicação de genoma viral por qPCR ou expressão de anticorpo anti-CD40 por ELISA. As células que permaneceram no poço foram analisadas quanto à expressão do gene viral E3 e do transgene por RT-qPCR.

REPLICAÇÃO VIRAL

[0391] Os sobrenadantes celulares foram coletados e clarificados por centrifugação por 5 min, 1.200 rpm. DNA foi extraído de 10 µl (A549, HCT-116) ou 100 µl (MRC-5) de sobrenadante com o uso do kit de extração de DNA Sigma Genelute de acordo com o protocolo do fabricante. Uma curva padrão com o uso de partículas de vírus EnAd (25e10-2.5e5vp) foi também preparada e extraída com o uso do Kit Sigma Genelute. Cada amostra extraída ou padrão foi analisado por qPCR com o uso de um conjunto de iniciador-sonda com especificidade para gene enadenotucirev E3.

[0392] A quantificação do número de genomas virais detectados por células demonstrou que a replicação de vírus NG-350A e enadenotucirev foi detectável em níveis comparáveis em células A549 e HCT- 116, mas a expressão em MRC-5 foi significativamente mais baixa que nas linhagens de células de carcinoma (Figura 11A). Nenhum genoma de vírus pôde ser detectado em células não infectadas (dados não mostrados). EXPRESSÃO DE ANTICORPO IGG2

[0393] A expressão de anticorpo em sobrenadantes celulares foi avaliada por ELISA de lgG2 kit (IgG2 Human SimpleStep ELISA, ab202402, Abcam). Os sobrenadantes de cultura foram removidos de cada poço e centrifugados por 5 min, 1.200 rpm, para remover detritos de células. Os sobrenadantes clarificados foram diluídos 1 em 2 em PBS 10% BSA. Uma curva padrão e amostras de controle negativo foram preparadas de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras e padrões foram adicionados às placas de ELISA e o ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. A absorbância a 450 nm em cada poço da placa foi medida com o uso de um leitor de placa (BioTek) e as concentrações de anticorpo anti-CD40 lgG2 secretado foram determinadas por interpolação a partir da curva padrão (Figura 11B).

EXEMPLO 10: PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO ANTI- CD40 DE CÉLULAS INFECTADAS COM NG-350A

[0394] Células HEK293 em suspensão foram inoculadas a 1x106 células/ml em frasco de Erlenmeyer e infectadas com 100 ppc de NG-350A. Após 72 horas, 5% de coquetel de FBS e inibidor de protease (1:2.000) foram adicionados às células, e a suspensão foi centrifugada por 15 minutos, 4.600 rpm. O sobrenadante foi cuidadosamente removido e filtrado através de uma membrana de fibra oca de corte de peso molecular de 500 kDa para separar as partículas virais NG-350A do anticorpo anti-CD40. O fluxo passante da etapa de filtração, que continha o anticorpo anti-CD40, foi passado através de uma segunda membrana de fibra oca com um corte de peso molecular de 30 kDa. O anticorpo anti-CD40 foi purificado do retentado da segunda etapa de filtração em uma coluna de proteína A com o uso de um AKTA. O anticorpo purificado por esterilizado por filtro e armazenado a -80 °C. A concentração de anticorpo purificado foi determinada por ELISA de lgG2 com o uso do kit ELISA lgG2 Human SimpleStep, um B202402, Abcam de acordo com o protocolo do fabricante (Figura 12). EXEMPLO 11: ATIVIDADE DE ANTICORPO ANTI-CD40 DERIVADO DE NG-350A E SINERGIA COM ATIVIDADE VIRAL EM DCS

DERIVADAS DE MONÓCITO HUMANO PRIMÁRIAS

[0395] PBMCs foram isoladas por centrifugação por gradiente Ficoll-Paque de um cone de leucócito NC24 da unidade NHS Blood and Transplant em Oxford, RU. Monócitos CD 14+ foram isolados com o uso do kit CD 14 MicroBeads (MiltenyiBiotec). Os monócitos foram, então, contados, centrifugados (300xg) e ressuspensos a 5x10 5 células/ml em 10% de meio de cultura RPMI suplementado com GM-CSF (800 U/ml) e IL-4 (500 U/ml). 40 ml de suspensão de monócitos foram transferidos para um frasco T175.

[0396] Após 72 horas de cultura, DCs derivadas de monócito (moDCs) foram inoculadas a uma densidade de 1x10 6 células por poço em placas de 24 poços em 10% de meio de cultura RPMI. As mesmas foram tratadas com 0,5 µg/ml de anticorpo anti-CD40 (purificado de células infectadas com vírus de acordo com o Exemplo 10), EnAd (100 ppc), CD40L humano ou foram deixadas não infectadas. Em paralelo, moDCs foram tratadas com anticorpo anti-CD40 purificado (0,5 µg/ml) e EnAd (100 ppc). As placas foram, então, incubadas por 48 horas antes de os sobrenadantes e células terem sido coletados.

[0397] Os sobrenadantes e células foram removidos de poços de cultura e centrifugados (300xg). O sobrenadante foi diluído 1 em 2 com PBS 5% BSA e armazenado para análise por ELISA. Os péletes celulares foram lavados em 200 µl de PBS, centrifugados, então, ressuspensos em 50 µl de PBS contendo LIVE/DEAD® Fixable Near-IR (Life tech) por 15 minutos à TA. As células foram lavadas uma vez em tampão FACs (1% de FBS/PBS) antes do manchamento com painéis de anticorpos conjugados diretamente: anti-CD86 conjugado a BV421; anti-CD54 conjugado a AF647 e anti-HLA-DR conjugado a PeCy5. Uma amostra de células de cada condição de cocultura foi também manchada com anticorpos de controle de isotipo relevante. Todo manchamento foi executado em tampão FACs em um volume total de 50 µl/poço por 15 minutos, 4 °C. As células foram, então, lavadas duas vezes com tampão FACs (200 µl) antes da ressuspensão em 200 µl de tampão FACs e análise por citometria de fluxo (Attune).

[0398] As amostras de sobrenadante foram descongeladas e analisadas por ELISA (IL-12 Quantikine ELISA, DP400, R&D systems) por diluição e execução do ensaio de acordo com o protocolo do fabricante.

[0399] O tratamento com anticorpo anti-CD40 purificado de células infectadas com vírus levou a um aumento na porcentagem de moDCs que expressa marcadores de ativação de CD86, CD54 e HLA-DR e à secreção de IL12p40 (Figura 13 e Figura 14). Significativamente, o tratamento de combinação de moDCs tanto com o anticorpo anti-CD40 quanto com vírus EnAd vírus resultou em uma ativação de moDC mais forte em comparação com o tratamento com Ab anti-CD40 ou vírus EnAd sozinho. EXEMPLO 12: ATIVIDADE DE ANTICORPO ANTI-CD40 DERIVADO DE NG-350A E SINERGIA COM ATIVIDADE VIRAL EM CÉLULAS

B HUMANAS PRIMÁRIAS

[0400] PBMCs foram isoladas por centrifugação por gradiente Ficoll-Paque de um cone de leucócito NC24 da unidade NHS Blood and Transplant em Oxford, RU. As células B CD19 + foram isoladas com o uso do kit Pan B Cell Isolation (MiltenyiBiotec). As células B foram, então, inoculadas a uma densidade de 1x106 células por poço em placas de 24 poços em 10% de meio de cultura RPMI. As mesmas foram tratadas com concentração crescente de Abs de transgene anti-CD40 purificados, CD40L humano ou foram deixadas não tratadas. As placas foram, então, incubadas por 48 horas antes de os sobrenadantes e células terem sido coletados.

[0401] Os sobrenadantes e células foram removidos de poços de cultura e centrifugados (300xg). O sobrenadante foi cuidadosamente removido, diluído 1 em 2 com PBS 5% BSA e armazenado para análise por ELISA. Os péletes celulares foram lavados em 200 µl de PBS, centrifugados, então, ressuspensos em 50 µl de PBS contendo LIVE/DEAD® Fixable Near-IR (Life tech) por 15 minutos à TA. As células foram lavadas uma vez em tampão FACs antes do manchamento com painéis de anticorpos conjugados diretamente: anti-CD86 conjugado a BV421; anti-CD54 conjugado a AF647; anti-HLA-DR conjugado a PeCy5 e anti-CD80 conjugado a BV605. Uma amostra de células de cada condição de cocultura foi também manchada com anticorpos de controle de isotipo relevante. Todo manchamento foi executado em tampão FACs em um volume total de 50 µl/poço por 15 minutos, 4 °C. As células foram, então, lavadas duas vezes com tampão FACs (200 µl) antes da ressuspensão em 200 µl de tampão FACs e análise por citometria de fluxo (Attune).

[0402] O tratamento de células B com anticorpo anti- CD40 em todas as concentrações testadas resultou em ativação de células B em termos de um aumento na porcentagem de células B que expressam CD86, CD19 e CD80 e um aumento no HLA-DR MFI em células CD19+, em comparação com células B não tratadas ou tratadas com controle de isotipo (Figura 15). O tratamento com anticorpo anti-CD40 também resultou em ativação de célula B em termos de aumentar a porcentagem de células em proliferação (Figura 16). Significativamente, o tratamento de combinação de células B com anticorpo anti-CD40 e vírus EnAd resultou em um aumento na % de células B em proliferação em comparação com o tratamento com anticorpo ou vírus sozinho (Figura 16). EXEMPLO 13: ATIVIDADE DE ANTICORPO ANTI-CD40 DERIVADO DE NG-350A EM DCS DERIVADAS DE MONÓCITO HUMANAS

PRIMÁRIAS

[0403] Células tumorais A549 foram inoculadas em frascos T175 ou Hyperflasks a uma densidade de, respectivamente, 10x10 6 ou 50x106 células por frasco. Após 4 horas, as células foram infectadas com 10 partículas virais EnAd ou NG-350A por célula. Após 72 horas, os sobrenadantes foram coletados e o vírus depletado com o uso de colunas de exclusão de tamanho de corte de 300 kDa. Os sobrenadantes depletados de vírus foram subsequentemente enriquecidos por anticorpos com o uso de colunas de exclusão de tamanho de corte de 50 kDa. Essas frações enriquecidas com Ab depletadas de vírus foram armazenadas a -80 °C. O título de Ab anti-CD40 foi determinado com o uso de ELISA de lgG2, e a funcionalidade confirmada com o uso do ensaio de célula repórter HEK Blue descrito no Exemplo 8.

[0404] Células dendríticas derivadas de monócito (MoDCs) foram preparadas essencialmente conforme apresentado no Exemplo 11 para um conjunto adicional de estudos. PBMCs (doador 177) foram isoladas por centrifugação por gradiente Ficoll-Paque de um cone de leucócito NC24 da unidade NHS Blood and Transplant em Oxford, RU. Monócitos CD14 + foram isolados com o uso do kit CD14 MicroBeads (MiltenyiBiotec). Após 72 horas de cultura com GM-CSF e IL-4, as MoDCs foram inoculadas a uma densidade de

1,25x105 células por poço em placas de 48 poços ou 2,5x10 5 células por poço em placas de 24 poços em 10% de meio de cultura RPMI e incubadas com os sobrenadantes de cultura de NG-350A ou EnAd depletados de vírus descritos no parágrafo acima. As células foram manchadas para análise por citometria de fluxo. Os sobrenadantes foram usados para análise de citocina por arranjos de microesfera e citocina (Legendplex, BioLegend).

[0405] Para demonstrar ligação de Ab anti-CD40 a CD40 na superfície de MoDCs, as células foram tratadas com concentrações crescentes do sobrenadante enriquecido com Ab anti-CD40 depletado de vírus de células infectadas com NG-350A (diferentes diluições usadas para fornecer diferentes quantidades de anticorpo) ou foram deixadas sem tratamento (meio). Como um controle, as mesmas também foram tratadas com sobrenadante de EnAd depletado de vírus (dEnAd), com volumes correspondentes àqueles das amostras contendo Ab anti-CD40 de NG-350A. Após 24 horas e 48 horas, as células forma coletadas e manchadas com anticorpos identificados com fluorescência para CD40 antes da análise por citometria de fluxo ter sido executada. As células foram acionadas em células vivas únicas (FSC-H versus FSC-A) (LIVE/DEAD® Fixable Aqua negativo). A Figura 17A mostra um resultado de citometria de fluxo representativo obtido 24 horas após tratamento com 1.000 ng/ml de Ab, com a Figura 17B mostrando a expressão de CD40 em MoDCs 24 horas e 48 horas após tratamento com diferentes concentrações de sobrenadantes depletados de vírus. Nas concentrações mais altas de anticorpo, o manchamento de CD40 FACS é reduzido ou está ausente, refletindo o bloqueio por ligação do anticorpo anti-CD40 nos sobrenadantes de cultura depletados de vírus NG-350A.

[0406] Os efeitos de tratamento com Ab anti-CD40 Tg (com o uso dos sobrenadantes depletados de vírus) sobre a regulação crescente de marcador de superfície celular em MoDCs foi, então, avaliado. As MoDCs foram tratadas com concentrações crescentes de Ab anti-CD40 Tg purificado ou foram deixadas sem tratamento (meio). As mesmas também foram tratadas com sobrenadante de EnAd depletado de vírus (dEnAd), com volumes correspondentes àqueles de Ab anti-CD40. Após 24 horas e 48 horas, as células foram coletadas e manchados com anticorpos para marcadores de superfície de CD54, CD83 e CD86 antes da análise por citometria de fluxo ter sido executada. As células foram acionadas em células vivas únicas (FSC-H versus FSC-A) (LIVE/DEAD® Fixable Aqua negativo). Um resultado de citometria de fluxo representativo obtido 24 horas após tratamento com 1.000 ng/ml de Ab é mostrado na Figura 18A para MoDCs preparadas com PBMCs do doador 177. A Figura 18B mostra a expressão de marcador de ativação em MoDCs de 4 doadores diferentes 24 horas e 48 horas após tratamento.

[0407] Os efeitos de Ab anti-CD40 Tg na produção de citocinas de MoDC foram, então, avaliados. MoDCs de quatro doadores diferentes foram tratadas com concentrações crescentes de sobrenadante depletado de vírus contendo Ab anti-CD40 ou foram deixadas sem tratamento (meio). As mesmas também foram tratadas com sobrenadante de EnAd depletado de vírus (dEnAd), com volumes correspondentes àqueles de Ab anti- CD40. Após 24 horas e 48 horas, os sobrenadantes foram coletados e analisados quanto à secreção de citocina inflamatória com o uso de um imunoensaio baseado em microesfera LEGENDplex™(BioLegend). A Figura 19 mostra a indução seletiva de TNFα, IL-6 e IL-8. EXEMPLO 14: ATIVIDADE DE VÍRUS NG-350A E

SOBRENADANTES DE CÉLULA TUMORAL INFECTADA COM VÍRUS CONTENDO ANTICORPO ANTI-CD40 DERIVADO SOBRE A ATIVIDADE DE

DCS DERIVADAS DE MONÓCITO HUMANAS PRIMÁRIAS

[0408] Em um estudo similar àquele descrito no Exemplo 13, as células A549 foram inoculadas em frascos T25 a uma densidade de 4x106 células. Após 4 horas, as células foram infectadas com 10 partículas virais EnAd ou NG-350A por célula. Após 72 horas, os sobrenadantes foram coletados e centrifugados a 1.600 rpm por 5 minutos. Nesse estudo, esses sobrenadantes clarificados foram mantidos a 37 °C até o uso (dentro de 1 h) em vez de remover o vírus. Assim, os sobrenadantes contêm os produtos de células tumorais infectadas com NG-350A (ou controle de EnAd), incluindo tanto vírus quanto produto de transgene de anticorpo anti-CD40.

[0409] PBMCs foram isoladas por centrifugação por gradiente Ficoll-Paque de um cone de leucócito NC24 da unidade NHS Blood and Transplant em Oxford, RU. Monócitos CD14 + foram isolados com o uso do kit CD14 MicroBeads (MiltenyiBiotec). Após 72 horas de cultura com GM-CSF e IL-4, MoDCs foram inoculadas a uma densidade de 1,25x10 5 células por poço em placas de 48 poços e tratadas com sobrenadantes de vírus EnAd e NG-350A em diferentes diluições. As placas foram, então, incubadas por 24 horas e 48 horas antes de os sobrenadantes e células terem sido coletados. Os sobrenadantes foram centrifugados e removidos dos péletes celulares e armazenados a -80 °C. As células foram manchadas para análise por citometria de fluxo. Os sobrenadantes foram usados para análise de citocina por CBA.

[0410] Para demonstrar ligação de Ab anti-CD40 a CD40 na superfície de MoDCs, as células foram tratadas com concentrações crescentes dos sobrenadantes de células infectadas com NG-350A ou EnAd (diferentes diluições usadas para fornecer diferentes quantidades de anticorpo) ou foram deixadas sem tratamento (meio). Após 24 horas e 48 horas, as células forma coletadas e manchadas com anticorpos identificados com fluorescência para CD40 antes da análise por citometria de fluxo ter sido executada. As células foram acionadas em células vivas únicas (FSC-H versus FSC-A) (LIVE/DEAD® Fixable Aqua negativo). A Figura 20 mostra a expressão de CD40 em MoDCs 24 horas e 48 horas após tratamento com diferentes concentrações de sobrenadantes. Na diluição de sobrenadante a 1:2 de células tumorais infectadas com NG-350A (mas não EnAd), o manchamento de CD40 FACS é reduzido ou está ausente, refletindo o bloqueio por ligação do anticorpo anti- CD40 nos sobrenadantes de cultura tratados com vírus NG-350A.

[0411] Os efeitos de sobrenadante de célula tumoral tratada com vírus NG-350A sobre a regulação crescente de marcador de superfície celular em MoDCs de dois doadores (177 e 179) foi, então, avaliado. As MoDCs foram tratadas com sobrenadantes de vírus EnAd ou NG-350A diluídos ou foram deixadas sem tratamento (meio). Após 24 horas e 48 horas, as células foram coletadas e manchados com anticorpos para CD86, CD54 e CD83 antes da análise por citometria de fluxo ter sido executada. As células foram acionadas em células vivas únicas (FSC-H versus FSC-A) (LIVE/DEAD® Fixable Aqua negativo). Os resultados na Figura 21 mostram que NG-350A regulou de modo crescente seletivamente todos os marcadores de ativação de MoDC.

[0412] Os efeitos de sobrenadante de vírus NG-350A sobre a produção de citocinas foram, então, avaliados. MoDCs de dois doadores (177 e 179) foram tratadas com sobrenadantes de célula tumoral tratados com vírus EnAd ou NG-350A diluídos ou foram deixadas sem tratamento (meio). Após 24 horas e 48 horas, os sobrenadantes foram coletados e analisados quanto à secreção de citocina inflamatória com o uso de um imunoensaio baseado em microesfera LEGENDplex™(BioLegend). Os resultados na Figura 22 mostram a regulação crescente seletiva de TNFα, IL-6,IL-8,IL-28 e IL-29 por sobrenadantes celulares tratados com NG-350A. EXEMPLO 15: ATIVIDADE DE ANTICORPO ANTI-CD40 DERIVADO DE NG-350A EM CÉLULAS B HUMANAS PRIMÁRIAS

[0413] PBMCs foram isoladas por centrifugação por gradiente Ficoll-Paque de cones de leucócito NC24 da unidade NHS Blood and Transplant em Oxford, RU. As células B foram isoladas com o uso do kit Pan B Cell Isolation (MiltenyiBiotec). As células foram inoculadas a uma densidade de 1,25x105 células por poço em placas de 48 poços em 10% de meio de cultura RPMI. As mesmas foram tratadas com diferentes concentrações do sobrenadante enriquecido com Ab anti-CD40 depletado de vírus de células infectadas com NG-350A descrito no Exemplo 13 ou foram deixadas sem tratamento. As células B foram também tratadas com sobrenadante de vírus EnAd depletado de vírus como um controle. As placas foram, então, incubadas por 24 horas e 48 horas antes de as células terem sido coletadas. As células foram manchadas com anticorpos para CD23, CD54, CD86 e HLA-DR antes de a análise por citometria de fluxo ter sido executada. As células foram acionadas em células vivas únicas (FSC-H versus FSC-A) (LIVE/DEAD® Fixable Aqua negativo). A Figura 23 mostra regulação crescente seletiva de todos os quatro marcadores de superfície (CD23, CD54, CD86 & HLA-DR) em células B de 3 doadores diferentes (177,178,179) pelos sobrenadantes contendo anticorpo anti-CD40 de NG-350A depletados de vírus. EXEMPLO 16: ATIVIDADE DE VÍRUS NG-350A E

CÉLULAS B HUMANAS PRIMÁRIAS

[0414] PBMCs foram isoladas por centrifugação por gradiente Ficoll-Paque de cones de leucócito NC24 da unidade NHS Blood and Transplant em Oxford, RU. As células B foram isoladas com o uso do kit Pan B Cell Isolation (MiltenyiBiotec). As células foram inoculadas a uma densidade de 1,25x105 células por poço em placas de 48 poços e tratadas com diferentes diluições de amostras dos mesmos sobrenadantes de vírus EnAd e NG-350A descritos no Exemplo 14. As placas foram, então, inoculadas por 24 horas e 48 horas antes de as células terem sido coletadas e manchadas com anticorpos para CD23, CD54, CD86 e HLA-DR antes de a análise por citometria de fluxo ter sido executada. As células foram acionadas em células vivas únicas (FSC-H versus FSC-A) (LIVE/DEAD® Fixable Aqua negativo). A Figura 24 mostra regulação crescente seletiva de todos os quatro marcadores (CD23, CD54, CD86 & HLA-DR) em células B de 3 doadores diferentes (177, 178, 179) pelos sobrenadantes contendo anticorpo anti-CD40 e vírus de células tumorais infectadas com NG-350A. EXEMPLO 17:

[0415] Em outro estudo, a atividade de NG-350A foi avaliada contra uma gama de diferentes linhagens celulares tumorais através de seis indicações de câncer (colorretal, próstata, pancreático, mama, ovário e bexiga). As células foram infectadas com 1 ou 100 partículas por célula (ppc) de enadenotucirev (EnAd) ou NG-350A e cultivadas por 3 a 11 dias, avaliando a replicação de genoma viral, oncólise mediada por vírus, expressão de transgene viral (no nível de mRNA e proteína) e expressão de transgene viral funcional em células tumorais infectadas com NG-350A. Em todos os experimentos, a atividade de NG-350A foi comparada àquela de EnAd. Células A549 (carcinoma pulmonar de células não pequenas) foram usadas como um controle positivo e células CT26 (tumor de cólon de camundongo) como um controle negativo.

REPLICAÇÃO DE GENOMA VIRAL

[0416] As linhagens celulares tumorais foram cultivadas em frascos de 175 cm2 em DMEM com alto teor de glicose suplementado com L-glutamina, aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio e 10% de soro bovino fetal (FBS) (meio de crescimento). Antes do uso, as células foram inspecionadas com o uso de um microscópio para garantir 60 a 80% de confluência. As células foram, então, lavadas com PBS e 0,25% de Tripsina- EDTA adicionado para desprender as células do fundo do frasco. As células foram incubadas por 2 a 10 minutos a 37 °C, 5% de CO2 até as células se desprenderem, após o qual a tripsina foi desativada com o uso de meio de crescimento. A suspensão de células foi misturada e centrifugada a 300 g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado, e o pélete celular ressuspenso em 10 ml de meio de ensaio; meio DMEM, conforme descrito acima, suplementado com 2% (em vez de 10%) de FBS. As células foram contadas, e a suspensão de células diluída com o uso do meio de ensaio para atingir uma concentração de 5x105 células/ml, 100 µl dos quais foram inoculados em placas de 96 poços com fundo plano (cada linhagem de células foi inoculada em dois poços por vírus e 2 poços por controle não infectado (U1C) por placa - com uma placa por ponto no tempo). As amostras para EnAd e U1C foram inoculadas (e infectadas) em um conjunto de placas, e as amostras para NG-350A e U1C foram inoculadas (e infectadas) em outro conjunto de placas. As placas foram incubadas a 37 °C, 5%

de CO2 antes da inoculação 4 a 6 horas após a inoculação celular.

[0417] Após esse tempo, os vírus EnAd e NG-350A foram diluídos em meio de ensaio para atingir uma concentração de 5x10 5 partículas virais/ml, 100 µl dos quais foram adicionados a cada poço de células relevante (cada vírus foi adicionado a cada linhagem de células em duplicata em cada placa). Isso resultou em uma inoculação de 1 ppc de EnAd ou 1 ppc de NG-350A. Em vez da adição de vírus, 100 µl de meio de ensaio foram também adicionados a poços duplicados de cada linhagem de células (UIC) em cada placa 20 horas após a inoculação, o meio foi removido das células e substituído por 200 µl de meio de ensaio fresco. As placas foram, então, incubadas a 37 °C, 5% de CO2 por 3, 4, 8 ou 11 dias após a inoculação. Se as células tiverem sido incubadas por 8 ou mais dias, as mesmas foram alimentadas com 50 µl de meio de ensaio 4 dias após a inoculação.

[0418] Coleta de DNA: Após a incubação, o meio foi removido das células e centrifugado em placas de fundo em V com 96 poços. O sobrenadante foi, então, transferido a placas de fundo plano com 96 poços e armazenado a -80 °C. 200 µl de Tampão de Lise Repórter 1 x (RLB) foram, então, adicionados às placas originais de células e armazenados a -80 °C.

[0419] Preparação de curva padrão: EnAd de estoque foi diluído até entre 1,25x10n e 1,25x106 partículas virais/ml antes da extração de RNA com o kit Qiagen DNeasy 96 de acordo com o protocolo do fabricante (200 µl de cada amostra de curva padrão foram extraídos, e o DNA purificado eluído em um volume de 200 µl). O DNA purificado foi, então, dividido em alíquotas e armazenados a -20 °C antes do uso em cada placa de qPCR. 2 µl dessas amostras de curva padrão foram usadas em cada reação qPCR, que se iguala a 2,5x103 a 2,5x108 genomas por poço de qPCR.

[0420] Extração de DNA: Amostras de teste de sobrenadante e lisado foram descongeladas antes da extração de DNA com o kit Qiagen DNeasy 96 de acordo com o protocolo do fabricante (50 µl das amostras de teste foram extraídos e o DNA purificado eluído em um volume de

200 µl). Um controle de extração de 1 x RLB foi extraído em cada placa.

[0421] A replicação de genoma viral foi avaliada por qPCR de lisados e sobrenadantes celulares (S/N) com o uso de um conjunto de iniciador-sonda E3 conforme apresentado no Exemplo 6. Os custos do tempo para amostras tanto de lisado quanto sobrenadante celular de 10 linhagens celulares tumorais de teste, mais células positivas (A549) são plotadas de acordo com o tipo de tumor (Colorretal, HT-29 e HCT-116; Próstata DU145; Pancreático BXPC- 3; mama MBA-MB-453; Ovário PA-1 e Caov-3; Bexiga RT24, T24 e UM- UC-3) na Figura 25 A a F. As células de controle negativo (camundongo CT26) foram negativas e não plotadas. Os genomas virais detectados em células infectadas com EnAd são mostrados com linhas pontilhadas e genomas virais detectados em células infectadas com NG-350A são mostrados com linhas contínuas. Os dados mostram que NG-350A replica seu DNA genômico comparavelmente ao vírus precursor EnAd através de um gama de tipos de células de carcinoma diferentes.

[0422] Para avaliar os efeitos oncolíticos de NG-350A, quatro linhagens celulares tumorais foram inoculadas com 100 ppc de EnAd, 100 ppc de NG-350A, meio de ensaio sozinho (controle não infectado) ou 4% de tween (lisado). O crescimento e a viabilidade das células foram monitorados pelo analisador celular em tempo real xCELLigence (RTCA) até mais de 50% de lise de células inoculadas com vírus terem ocorrido. O Índice de Célula (Cl) através de todos os pontos no tempo foi calculado pelo software xlMT, e a média e desvio padrão das tréplicas não infectadas, EnAd, NG-350A e lisadas foram determinados; a média foi plotada nos gráficos, e o desvio padrão representado por barras de erro. Os traços de xCELLigence para controles não infectados, células inoculadas com EnAd e NG-350A e células lisadas são mostrados na Figura 26. As células foram inoculadas em 0 horas, e infectadas 24 horas após a inoculação (no ponto no tempo indicado pela seta em cada gráfico). As linhagens celulares tumorais são mostradas como uma linhagem celular por gráfico: colorretal (HT-29 e HCT-116), próstata (BXPC-3) e mama (MDA-MB-

453). NG-350A mostrou atividade oncolítica comparável ao vírus precursor EnAd.

[0423] A expressão de mRNA de transgene anti-CD40 foi também avaliada em lisados coletados em diferentes tempos de linhagens celulares tumorais infectadas com NG-350A. As mesmas 10 linhagens celulares tumorais conforme usado para a parte de replicação de genoma desse estudo, mais linhagens celulares de controle positivo (A549) e negativo (CT26), foram inoculadas com 1 ppc de EnAd, 1 ppc de NG-350A ou meio de ensaio sozinho (controle não infectado). Em diferentes tempos (3, 4, 8 e 11 dias) após a inoculação, lisados celulares foram coletados antes de a extração de RNA e limpeza de DNase terem sido executados. RT-qPCR em uma etapa foi, então, executada com o uso de um conjunto de iniciador/sonda específico anti-CD40. Um oligonucleotídeo de RNA sintético correspondente à fita senso de anti-CD40 foi usado para criar uma curva padrão a partir da qual a quantidade de RNA das amostras de teste foi calculada. A quantidade de RNA média para cada tréplica de controle não infectado teve subtração de fundo dos valores de EnAd e NG- 350A individuais correspondentes. As cópias de mRNA anti-CD40 por célula foram, então, calculadas e a média das duas tréplicas de RT-qPCR de EnAd e NG-350A determinada. A média e o desvio padrão desses valores duplicados foram, então, calculados para cada linhagem de células, em cada ponto no tempo (n=2 exceto para a amostra do dia 8 de BXPC-3, em que n=1). A média foi plotada e os gráficos apresentados na Figura 27, com o desvio padrão representado por barras de erro. Células inoculadas com EnAd geraram resposta insignificante de modo que os genomas médios por célula calculados a partir de duplicatas biológicas estivessem na faixa de 0x10 0 a 6,26x100 através de todos os pontos no tempo e linhagens celulares. Desse modo, os dados de EnAd não foram plotados. Para as amostras de controle não infectadas, as cópias anti-CD40 médias por célula calculadas a partir de duplicatas biológicas variaram de 0,00x100 a 9,09x100. Os gráficos representam expressão de transgene anti-CD40 em linhagens celulares de tumor colorretal (A), de próstata,

pancreático e de mama (B), de ovário (C) e de bexiga (D). A infecção por NG- 350A levou à expressão de mRNA de transgene anti-CD40 em todas as linhagens celulares tumorais humanas, com diferenças em cinética observadas para diferentes células.

[0424] Para avaliar a expressão de proteína lgG2 de transgene, a produção de lgG2 humana (o isotipo da cadeia pesada de anticorpo anti-CD40 codificado por NG-350A) por diferentes linhagens celulares tumorais infectadas com NG-350A foi medida. Seis linhagens celulares tumorais de teste, mais linhagens celulares de controle positivo (A549) e negativo (CT26), foram inoculadas com 1 ppc de NG-350A, 1 ppc de EnAd ou meio de ensaio sozinho (controle não infectado). Em diferentes tempos (3, 4, 8 e 11 dias) após a inoculação, o sobrenadante foi coletado e armazenado a -80 °C antes do uso. O sobrenadante de linhagens celulares de teste inoculadas com NG-350A e células A549 foi diluído a 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 e 1:80. O sobrenadante de todas as amostras de controle não infectadas, células infectadas com EnAd e células CT26 infectadas com NG-350A foi diluído a 1:2 apenas. O ELISA SimpleStep in vitro de lgG2 humana (Abcam) foi, então, executado de acordo com o protocolo do fabricante. A proteína purificada lgG2 humana (fornecida com o kit ELISA) foi usada para criar uma curva padrão a partir da qual a concentração de proteína lgG2 nas amostras foi determinada (ng/ml). A quantidade de proteína lgG2 por 1x106 células (ng/1x106 células) foi, então, calculada. A média e o desvio padrão foram determinados a partir das médias das duplicatas de ELISA que estavam dentro da curva padrão. A média foi plotada e os gráficos apresentados na Figura 28, com o desvio padrão representado por barras de erro. A subtração de fundo com o uso de amostras de controle não infectadas não foi executada já que para cada linhagem celular e ponto no tempo essas amostras não geraram resposta (0x100 ng/1x106 células). As células inoculadas com EnAd também não geraram resposta, portanto, os dados de EnAd não foram plotados. A produção de anticorpos lgG2 foi detectada com todas as linhagens celulares infectadas com NG-350A.

[0425] O ensaio de repórter de sinalização de CD40 HEK-Blue descrito no Exemplo 8 foi usado para testar a funcionalidade do anticorpo produzido por linhagens celulares tumorais diferentes infectadas com NG-350A. Seis linhagens celulares tumorais de teste, mais linhagens celulares de controle positivo (A549) e negativo (CT26), foram inoculadas com 1 ppc de EnAd, 1 ppc de NG-348 ou meio de ensaio sozinho (UIC). 8 ou 11 dias após a inoculação, o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi, então, incubado com células HEK-Blue por 20 a 24 horas. O sobrenadante foi, então, removido das células HEK-Blue tratadas, adicionado a Quanti-Blue e incubado por 1 hora antes da leitura da densidade óptica (OD) em um conjunto SpectraMax i3x para ler uma absorbância de 620 nm. A densidade óptica média para cada duplicata de ensaio de UIC foi subtraída dos valores de EnAd e NG-350A individuais correspondentes, gerando uma avaliação de atividade de sinalização de CD40 dos anticorpos nos sobrenadantes de células tumorais infectadas. A média das duplicatas de ensaio de EnAd e NG-350A com subtração de fundo de UIC foi, então, tomada, gerando 2 valores para cada linhagem celular (por condição), correspondendo a cada réplica de inoculação e semeadura. A média e o desvio padrão (SD) dessas réplicas foram, então, determinados e mostrados na Tabela

3.

TABELA 3 ATIVIDADE DE ANTICORPO ANTI-CD40

FUNCIONAL EM SOBRENADANTES DE CÉLULAS TUMORAIS INFECTADAS COM NG-350A (ENSAIO DE REPÓRTER HEK-BLUE) Sumário de transgene de função de NG-350A (anticorpo anti-CD40), detectada pelo ensaio HEK-Blue Atividade de SEAP (Densidade Óptica a 620 nm) Indicação Linhagem NG-350A EnAd de Câncer celular Média Desvio padrão Média Desvio padrão Controle positivo A549 1,0600 0,0933 0,1488 0,0124 Controle negativo CT26 0,0000 0,0103 0,0017 0,0088 Colorretal HT-29 0,7175 0,0212 0,0650 0,0021 Próstata DU145 0,5555 0,0276 0,0910 0,0120 Pâncreas BXPC-3 0,7118 0,2054 0,0428 0,0088 MDA-MB- Mama 453 0,8578 0,1439 0,1033 0,0011 Ovário Caov-3 0,0273 0,0293 0,0198 0,0124 Bexiga RT4 0,3653 0,0209 0,0470 0,0085 EXEMPLO 18

[0426] Em outra série de experimentos, os efeitos mediados por partículas virais in vivo de vírus NG-350A foram monitorados e comparados àqueles de EnAd após doses intravenosas únicas ou múltiplas em camundongos. Camundongos CD-1 fêmeas foram receberão injeção IV com controle de veículo ou 2,2x1010 partículas de EnAd ou NG-350A. os camundongos sofreram sangramento cardíaco 6 horas, 24 horas, 48 horas ou 7 horas após a injeção, e sangue foi coletado em tubos anticoagulantes e processado para recuperar plasma. As amostras de plasma foram testadas por ensaios ELISA para detectar respostas agudas de citocina às partículas virais. Os dados mostrados na Figura 29 representam 3 a 6 camundongos por grupo.

Os níveis de MCP-1 (Figura 29A), IL-6 (Figura 29B) e TNFα (Figura 29C) estimulados por dosagem de NG-350A foram similares àqueles para EnAd. As linhas pretas sólidas representam a média. A linha de base representa a média de grupo de controle de veículo + 3 x SD.

[0427] Outras alíquotas das amostras de plasma foram testadas para níveis de alanina amino transferase (ALT) como uma medida de toxicidade hepática aguda. As amostras de plasma foram analisadas com o uso de um kit de ensaio enzimático de ponto final calorimétrico de ALT. Os dados mostrados na Figura 30 representam 3 a 6 camundongos por grupo. As linhas pretas sólidas representam a média. A linha de base representa a média de grupo de controle de veículo + 3 x SD. Os níveis de ALT foram variáveis entre diferentes camundongos, mas NG-350A e EnAd induziram perfis de resposta similares.

[0428] Outros grupos de camundongos CD-1 fêmeas receberam injeção IV com PBS no dia 1, ou 2,2x10 10 partículas virais de EnAd ou NG-350A nos dias 1, 3 e 5. Os camundongos tratados com PBS sofreram sangramento cardíaco 6 horas após a dosagem. Os camundongos tratados com vírus sofreram sangramento por meio de uma veia caudal e punção cardíaca 6 horas e 24 horas (respectivamente) após a primeira dose ou por meio de punção cardíaca 6 horas, 24 horas ou 7 dias após a terceira dose. As amostras de plasma foram testadas por ensaios ELISA para detectar respostas agudas de citocina às partículas virais. Os dados mostrados na Figura 31 representam 3 a 6 camundongos por grupo. Os níveis de MCP-1 (Figura 31A) e IL-6 (Figura 31B) estimulados por dosagem de NG-350A foram similares àqueles para EnAd. As linhas pretas sólidas representam a média. A linha de base representa a média de grupo de controle de veículo + 3 x SD. EXEMPLO 19

[0429] A farmacocinética sanguínea de NG-350A foi comparada a enadenotucirev (EnAd) após a administração de cada uma das três doses intravenosas (IV) de 2,2x1010 partículas virais nos dias 1, 3 e 5 em camundongos CD-1 imunocompetentes. Camundongos CD-1 fêmeas receberam injeção IV com 2,2x1010 partículas virais de EnAd ou NG-350A nos dias 1, 3 e 5. Após cada dose, um grupo de 4 camundongos tratados com cada vírus foi submetido a sangramento em 1, 2, 3, 5, 7, 10 e 60 minutos após a dosagem. DNA foi extraído e analisado por qPCR que tem como alvo o gene E3 viral comum a EnAd e NG-350A. Os dados mostrados na Figura 32 representam 4 camundongos por grupo + desvio padrão. Quando os valores caíram abaixo do limite de quantificação para o ensaio, os mesmos foram excluídos. Os dados além de 7 minutos não foram plotados já que caíram consistentemente abaixo do limite de quantificação para o ensaio. NG-350A mostrou um perfil farmacocinético comparável àquele de EnAd. EXEMPLO 20

[0430] A biodistribuição viral foi avaliada após camundongos receberem dosagem de NG-350A por medição da recuperação do vírus vivo dos tecidos após uma única dose intravenosa. Camundongos CD- 1 fêmeas foram receberão injeção IV com controle de veículo ou 2,2x10 10 partículas de NG-350A. Os grupos de camundongos foram submetidos a eutanásia em 6 horas, 24 horas, 8 dias ou 28 dias após a dosagem e seus fígados, pulmões e baços foram ressecados e imediatamente congelados em gelo seco. As amostras foram posteriormente descongeladas, homogeneizadas em um tampão de lise de preservação de proteína, e o lisado foi diluído e adicionado a monocamadas de A549 confluentes, com homogenado de tecido com adição de NG-350A para cada órgão como um controle positivo e controles negativos. As monocamadas foram cultivadas por 96 horas antes de serem fixadas e submetidas a um ensaio de imunocoloração que utiliza um anticorpo héxon antiadenovírus. Os dados são representados por fotos de amostra de cada poço na Figura 33. As células positivas para héxon foram manchadas de marrom (mostrado como cinza escuro na figura). Nenhum vírus vivo pôde ser detectado no fígado, pulmão ou baço de camundongos (os sítios primários de biodistribuição viral em camundongos) depois de 24 horas.

EXEMPLO 21

[0431] Nessa série de estudos, a atividade de vírus NG-350A foi avaliada in vivo em camundongos com imunodeficiência portadores de xenoenxerto de tumor humano.

[0432] A replicação viral foi avaliada em tumores da linhagem de células pulmonares A549 subcutâneos após três injeções IV ou uma dose intratumoral (IT) fracionada única. Camundongos SC1D fêmeas receberam implantação subcutânea de células tumorais A549 em seu flanco e receberam injeção IT ou IV de vírus ou controle uma vez que os tumores atingiram pelo menos 50 mm3. Os camundongos que receberam dose IT receberam duas injeções de 10 µl de PBS ou 2,2x10 9 partículas virais de EnAd ou NG-350A em regiões espacialmente separadas do tumor para uma dose total de 20 µl/4,4x10 9 partículas virais. Os camundongos que receberam dose IV receberam injeção de 100 µl de PBS ou 2,2x109 partículas virais de EnAd ou NG-350A nos dias 1, 3 e 5 para uma dose total de 300 µl/6,6x109 partículas virais. Os tumores foram ressecados de camundongos após a eutanásia, 7 ou 21 dias após a dosagem e congelados. Os tumores foram posteriormente homogeneizados, o DNA extraído e analisado por qPCR com o uso de iniciadores e sonda que têm como alvo a região E3 viral comum a EnAd e NG-350A. Os dados mostrados na Figura 34 A e B representam 2 a 4 camundongos por grupo +/- desvio padrão. NG-350A mostrou replicação de genoma comparável nos enxertos de tumor A549 àquela de EnAd após dosagem IT (Figura 34A) ou IV (Figura 34B).

[0433] Esse experimento foi também repetido com o uso de um segundo modelo de xenoenxerto de tumor com o uso da linhagem de células de câncer colorretal HCT-116. Camundongos SC1D fêmeas receberam implantação subcutânea de células tumorais HCT116 em seu flanco e receberam injeção IT ou IV de vírus ou controle uma vez que os tumores atingiram pelo menos 50 mm3. Os camundongos que receberam dose IT receberam duas injeções de 10 µl de PBS ou 2,2x109 partículas virais de EnAd ou NG-350A em regiões espacialmente separadas do tumor para uma dose total de 20 µl/4,4x109 partículas virais. Os camundongos que receberam dose IV receberam injeção de 100 µl de PBS ou 2,2x10 9 partículas virais de EnAd ou NG-350A nos dias 1, 3 e 5 para uma dose total de 300 µl/6,6x10 9 partículas virais. Os tumores foram ressecados de camundongos após a eutanásia, 7 ou 21 dias após a dosagem e congelados. Os tumores foram posteriormente homogeneizados, o DNA extraído e analisado por qPCR com o uso de iniciadores e sonda que têm como alvo a região E3 viral comum a EnAd e NG- 350A. Os dados mostrados na Figura 34 C e D representam 2 a 4 camundongos por grupo +/- desvio padrão. NG-350A mostrou replicação de genoma comparável nos enxertos de tumor HCT-116 àquela de EnAd após dosagem IT (Figura 34C) ou IV (Figura 34D).

[0434] Em experimentos similares com tumores de xenoenxerto subcutâneo tanto A549 quanto HCT-116 em camundongos SC1D, a expressão de RNA viral foi medida nos tumores. Camundongos SC1D fêmeas receberam implantação subcutânea de células tumorais A549 ou HCT-116 em seu flanco e receberam injeção IT ou IV de vírus ou controle uma vez que os tumores atingiram pelo menos 50 mm3. Os camundongos que receberam dose IT receberam duas injeções de 10 µl de PBS ou 2,2x10 9 partículas virais de EnAd ou NG-350A em regiões espacialmente separadas do tumor para uma dose total de 20 µl/4,4x109 partículas virais. Os camundongos que receberam dose IV receberam injeção de 100 µl de PBS ou 2,2x109 partículas virais de EnAd ou NG-350A nos dias 1, 3 e 5 para uma dose total de 300 µl/6,6x10 9 partículas virais. Os tumores foram ressecados de camundongos após a eutanásia, 7 dias após a dosagem e congelados. Os tumores foram posteriormente homogeneizados, o RNA extraído e analisado por RT-qPCR com o uso de iniciadores e sonda que têm como alvo mRNA E3 viral comum a EnAd e NG- 350A. Os dados mostrados na Figura 35 representam 3 a 4 camundongos por grupo. As linhas pretas representam a média. A549 IT (Figura 35A), IV (Figura 35B), HCT-116 IT (Figura 35C) e HCT-116 IV (Figura 35D) mostram a expressão de mRNA de vírus E3 após dosagem de NG-350A ou EnAd.

[0435] Os níveis de expressão de mRNA de transgene de anticorpo anti-CD40 foram também medidos nas mesmas amostras de RNA de tumor de xenoenxerto A549 e HCT-116 subcutâneo. O RNA foi analisado por RT-qPCR com o uso de iniciadores e sondas que têm como alvo mRNA de transgene de anticorpo aCD40. Os dados mostrados na Figura 36 representam 3 a 4 camundongos por grupo. As linhas pretas representam a média. A expressão de mRNA de transgene de anticorpo anti- CD40 foi prontamente detectada apenas em tumores tratados com NG-350A. A549 IT (Figura 36A), IV (Figura 36B), HCT-116 IT (Figura 36C) e HCT-116 IV (Figura 36D).

[0436] Os níveis de proteína de anticorpo anti-CD40 foram também medidos tanto em lisados tumorais quanto soro de camundongos que portam tumores A549 com o uso de uma ELISA de lgG2. Os dados mostrados na Figura 37 mostra a detecção seletiva de anticorpo após a administração de NG-350A, IT (A) ou IV (BJ, com níveis mais altos em tumores que no sangue.

SEQUÊNCIAS

[0437] SEQ ID NO. 4 - sequência de aminoácidos de cadeia VH anti-CD40

[0438] SEQ ID NO. 5 - sequência de aminoácidos de cadeia pesada constante de anticorpo

[0439] SEQ ID NO. 8 - sequência de aminoácidos de cadeia VL anti-CD40

[0440] SEQ ID NO. 9 - sequência de aminoácidos de cadeia leve constante

[0441] SEQ ID NO. 12 - sequência de ácidos nucleicos de cassete de transgene NG-350A

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Vírus oncolítico (por exemplo, um vírus competente para replicação) caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação do mesmo, em que o cassete de transgene compreende uma sequência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 12 ou uma sequência pelo menos 95% idêntica à mesma (tal como 96, 97, 98 ou 99% idêntica à mesma), em particular, um cassete da SEQ ID NO:

12.

2. Vírus oncolítico, de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus é caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre um adenovírus, vírus herpes simplex, reovírus, vírus do sarampo, vírus da doença de Newcastle, vírus Seneca Valley, vírus da estomatite vesicular, poliovírus, enterovírus ECHO, vírus de Coxsackie e vírus vaccinia, em particular um adenovírus.

3. Vírus oncolítico, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o vírus é caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em Enadenotucirev, talimogene laherparepvec, R1GV1R, Ad5- yCD/mutTKSR39rep-hIL12, Cavatak™, CG0070, DNX-2401, G207, HF10, Imlygic®, JX-594, MG1-MA3, MV-N1S, OBP-301, Reolysin®, Toca 511, em particular Enadenotucirev.

4. Vírus oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o vírus é caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência pelo menos 95% idêntica à mesma (tal como 96, 97, 98 ou 99% idêntica à mesma), tal como compreendendo a SEQ ID NO: 1.

5. Vírus oncolítico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que consiste na SEQ ID NO: 1.

6. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

7. Vírus oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato que é para uso em tratamento.

8. Vírus oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer, resistência à insulina, obesidade e/ou imunodeficiência.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o vírus ou a composição é para uso no tratamento de câncer, por exemplo, para o tratamento de câncer que expressa CD40 (tal como câncer com expressão regulada de modo crescente de CD40)

10. Terapia de combinação (por exemplo, para uso no tratamento de câncer) caracterizada pelo fato de que compreende um vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma composição, de acordo com a reivindicação 6, e uma terapia anticâncer adicional.

11. Terapia de combinação, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a terapia anticâncer adicional é quimioterapia.

12. Terapia de combinação, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que a terapia anticâncer adicional é um inibidor de ponto de verificação.

13. Terapia de combinação, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a terapia anticâncer é selecionada a partir do grupo que compreende um inibidor de PD-1, um inibidor de a PD-L1, um inibidor de CTLA-4, um inibidor de TIM-3, um inibidor de LAG-3, um inibidor de TIGIT, um inibidor de B7-H3 (CD276), um inibidor de B7-H4 (B7S1), um inibidor de B7H7 (HHLA2), um inibidor de CD96, um inibidor de VISTA e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

14. Terapia de combinação, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o inibidor é um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo.

15. Terapia de combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizada pelo fato de que a terapia anticâncer adicional é um agonista da trajetória de coestimulação.

16. Terapia de combinação, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a terapia anticâncer adicional é selecionada a partir do grupo que consiste em um agonista de CD27, um agonista de CD28, um agonista de ICOS, um agonista de TMIGD2 [IGPR-1/CD28H], um agonista de CD226, um agonista de OX40, um agonista de 4-1BB e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

17. Terapia de combinação, de acordo com a reivindicação 14, em que a terapia é caracterizada pelo fato de que é um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo.

18. Terapia de combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizada pelo fato de que a terapia anticâncer adicional ativa as respostas imunológicas ou a supressão reversa de respostas imunológicas, por exemplo selecionadas dentre IL-10, TGFβ, inibidores de IDO e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

19. Terapia de combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, caracterizada pelo fato de que a terapia contra câncer adicional é um vírus oncolítico, por exemplo, um vírus oncolítico competente para replicação, tal como um adenovírus, em particular um adenovírus do grupo B.

20. Terapia de combinação, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o vírus oncolítico codifica um gene terapêutico que codifica material selecionado a partir do grupo que consiste em uma sequência de RNAi, um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo, quimiocinas, citocinas, imunomodulador e enzimas.