KR20200026835A - 종양용해성 바이러스 및 방법 - Google Patents

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싸이오서스 테라퓨틱스 엘티디.
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Abstract

항-CD40 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 전이유전자 카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스(예를 들어, 복제 가능 바이러스)(여기서, 전이유전자 카세트는 서열번호 12에 주어진 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한(예컨대, 이것과 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열, 특히 서열번호 12의 카세트를 포함함); 이를 포함하는 약제학적 조성물, 상기 종양용해성 바이러스 및 조성물을 제조하는 방법 및 치료에서의, 특히 암의 치료에서의 종양용해성 바이러스 또는 조성물의 용도. 본 개시내용에 따른 치료에 의해 CD40을 발현하는 암, 특히 CD40을 과발현하는 암을 갖는 것을 특징으로 하는 환자 집단의 치료가 또한 제공된다.

Description

종양용해성 바이러스 및 방법
본 개시내용은 종양용해성 바이러스(oncolytic virus), 예컨대, 아데노바이러스, 본 개시내용의 종양용해성 바이러스를 포함하는 조성물, 상기 종양용해성 바이러스 및 조성물을 제조하는 방법 및 치료에서의, 특히 암의 치료에서의 종양용해성 바이러스 또는 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용에 따른 치료에 의해 CD40을 발현하는 암, 특히 CD40을 과발현하는 암을 갖는 것을 특징으로 하는 환자 집단의 치료가 또한 제공된다.
CD40은 B 및 T 세포에 대한 활성자이고, 예를 들어, 항원 제시 세포에서의 CD40은 T 세포에서의 (CD154로도 공지된) CD40L에 결합하여 이를 활성화한다. CD40은 다수의 종양 세포에 또한 존재하고, 이는 CD40을 사용하여 둘러싼 세포로부터 사이토카인 및 성장 인자를 얻어서 암의 성장 및 확장을 지지한다.
작용제성 항-CD40 항체는 생체내 면역 세포에 대한 작용으로 인해 항종양 면역 반응을 자극할 수 있었다. 이는 CD40이, 예를 들어, 대식세포를 활성화시키고 수지상 세포를 "프리컨디셔닝"하는 능력을 가져서, 이것이 효과적인 세포독성 T 세포 반응을 초회 감작시키게 하기 때문일 수 있다.
요즈음, 면역 종양학 치료 및/또는 종양 연관된 대식세포(tumor associated macrophage: TAM)에 대한 치료에 상당히 관심 있다. 이 종양 연관된 대식세포는 종양을 둘러싸고, 종양 성장 및 발생에 허용적인 미세환경의 생성에 기여한다. 이 미세환경은 대개 저산소성이고, 종양을 부착시키고 제거하도록 보내진 면역 세포를 중화시킬 수 있다. 따라서, 미세환경은 종양을 물리적으로 보호한다. 게다가, 이것은 에너지 및 영양소를 공급하여서 종양 성장을 지지한다.
그러나, 치료가 효과적이 되게 하기 위해서는, 예를 들어, 미세환경에 이미 포획된 면역 세포를 재활력화, 방출, 동원 및 재활성화하도록 이 환경에 용이하게 표적화될 필요가 있다. 미세환경의 표적화는, 때때로 종양이 보호를 위한 발생 기전, 예컨대, 종양 환경 중에서 치료제를 이동시키는 능동 수송 기전을 가지므로, 이렇게 하기 쉽지 않다. 이것은, 예를 들어, 내성에 관여된 기전 중 하나이다.
종양 세포로 귀소하고 선택적으로 암 세포를 감염시키는 종양용해성 바이러스, 예컨대, B 그룹 종양용해성 아데노바이러스는 항-CD40 항체를 종양의 미세환경으로 전달하도록 사용될 수 있다. 종양용해성 바이러스는 암 세포의 사멸 및 상기 세포의 내용물의 방출을 발생시키는 항암 특성을 갖는다. 세포의 내용물은 종양용해성 바이러스에 의해 만들어진 항-CD40 항체를 포함한다. 따라서, 암 세포의 사멸은 항체를 종양의 미세환경으로 방출시킨다. 놀랍게도, 본 발명자들은 항-CD40 항체가 항-CD40 항체를 암호화하는 전이유전자를 이러한 바이러스로 도입함으로써, 예를 들어, 바이러스를 본 개시내용의 전이유전자 카세트에 의해 도입함으로써 다양한 상이한 종양용해성 바이러스에 의해 효율적으로 전달될 수 있다는 것을 발견하였다.
또한, 종양이 보호를 위한 다수의 기전을 발생시키므로, 미래에 가장 효과적인 암 치료가 2개 이상의 생물학적 기전을 통해 암을 공격할 필요가 있다고 앞으로 생각된다.
작용제성 항-CD40 항체를 사용하는 것은, 항체가 적합한 농도에서 종양 미세환경에 일단 있으면, 이것이 CD40L에 결합하는 CD40 발현 암 세포와 경쟁할 수 있다는 추가적인 이익을 가질 수 있다. 이는 궁극적으로 암 세포가 T 세포 상의 CD40L에 결합하는 기회가 더 적을 것이라는 것을 의미한다. 결국, 이것은 종양에 이용 가능한 에너지 및 영양소의 양이 감소될 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
본 발명자들은 안정한 바이러스를 제조하기 위해 사용될 수 있는 항-CD40 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 전이유전자 카세트를 설계하였다.
본 개시내용을 요약하는 문단
본 개시내용은 하기를 제공한다:
1. 항-CD40 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 전이유전자 카세트, 특히 서열번호 12의 카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스(예를 들어, 복제 가능 바이러스(replication competent virus))로서, 전이유전자 카세트는 서열번호 12에 주어진 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한(예컨대, 특히 완전히 서열의 길이에 걸쳐 이것과 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는, 종양용해성 바이러스.
(대안) 문단 1: 항-CD40 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 종양용해성 아데노바이러스(예를 들어, 복제 가능 종양용해성 아데노바이러스)로서, 아데노바이러스는 서열번호 1 또는 이것과 적어도 95% 동일한(예컨대, 이것과 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는, 종양용해성 바이러스.
2. 문단 1에 있어서, 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 레오바이러스(reovirus), 홍역 바이러스(measles virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 소아마비 바이러스(polio virus), ECHO 엔테로바이러스(enterovirus), 콕사키 바이러스(Coxsackie virus) 및 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 특히 아데노바이러스로부터 선택되는, 종양용해성 바이러스.
3. 문단 1 또는 2에 있어서, 바이러스는 에나데노툭시레브(Enadenotucirev), 탈리모겐 라허파렙벡(talimogene laherparepvec), RIGVIR, Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12, 카바탁(Cavatak)(상표명), CG0070, DNX-2401, G207, HF10, 임리직(Imlygic)(등록상표), JX-594, MG1-MA3, MV-NIS, OBP-301, 레올리신(Reolysin)(등록상표), Toca 511, 특히 에나데노툭시레브로 이루어진 군으로부터 선택되는, 종양용해성 바이러스.
4. 문단 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 바이러스는 서열번호 1을 포함하는, 종양용해성 바이러스.
5. 문단 4에 있어서, 서열번호 1로 이루어진, 종양용해성 바이러스.
6. 문단 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 바이러스, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
7. 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 종양용해성 바이러스 또는 문단 6에 따른 약제학적 조성물.
8. 암, 인슐린 내성, 비만 및/또는 면역 결핍의 치료에서 사용하기 위한, 문단 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 종양용해성 바이러스 또는 문단 6에 따른 약제학적 조성물.
9. 문단 6에 있어서, 바이러스 또는 조성물은 암의 치료에서 사용하기 위한, 예를 들어, CD40을 발현하는 암(예컨대, CD40의 상향조절된 발현을 갖는 암)의 치료를 위한, 용도.
10. 문단 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 바이러스 또는 문단 6에 따른 조성물 및 추가의 항암 치료제를 포함하는 (예를 들어, 암의 치료에서 사용하기 위한) 병용 요법.
11. 문단 10에 있어서, 추가의 항암 치료제는 화학요법제인, 병용 요법.
12. 문단 10 또는 11에 있어서, 추가의 항암 치료제는 관문 저해제인, 병용 요법.
13. 문단 12에 있어서, 항암 치료제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제, TIM-3 저해제, LAG-3 저해제, TIGIT 저해제, B7-H3(CD276) 저해제, B7-H4(B7S1) 저해제, B7H7(HHLA2) 저해제, CD96 저해제, VISTA 저해제, 및 이들의 2종 이상의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택되는, 병용 요법.
14. 문단 13에 있어서, 저해제는 항체 또는 이의 결합 단편인, 병용 요법.
15. 문단 10 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 추가의 항암 치료제는 동시자극 경로 작용제인, 병용 요법.
16. 문단 15에 있어서, 추가의 항암 치료제는 CD27 작용제, CD28 작용제, ICOS 작용제, TMIGD2(IGPR-1/CD28H) 작용제, CD226 작용제, OX40 작용제, 4-1BB 작용제, 및 이들의 2종 이상의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택되는, 병용 요법.
17. 문단 16에 있어서, 치료제는 항체 또는 이의 결합 단편인, 병용 요법.
18. 문단 10 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 추가의 항암 치료제는, 예를 들어, IL-10, TGFβ, IDO 저해제, 및 이들의 2종 이상의 조합물로부터 선택된 면역 반응 또는 면역 반응의 반대의 억제를 활성화하는, 병용 요법.
19. 문단 10 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 추가의 암 치료제는 종양용해성 바이러스(추가의 종양용해성 바이러스), 예를 들어, 복제 가능 종양용해성 바이러스, 예컨대, 아데노바이러스, 특히 B 그룹 아데노바이러스인, 병용 요법.
20. 문단 19에 있어서, 종양용해성 바이러스(추가의 종양용해성 바이러스)는 RNAi 서열, 항체 또는 이의 결합 단편, 케모카인, 사이토카인, 면역조절제 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 치료학적 유전자 암호화 재료를 암호화하는, 병용 요법.
21. 문단 20에 있어서, 항체 또는 이의 결합 단편은 OX40, OX40 리간드, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40 리간드, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS, ICOS 리간드, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT, CD160, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD40, CD40 리간드, 및 이들의 2종 이상의 조합물에 특이적인, 병용 요법.
22. 문단 20 또는 21에 있어서, 사이토카인은 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, TGFβ, 림프독소 α(LTA) 및 GM-CSF, 예를 들어, IL-12, IL-18, IL-22, IL-7, IL-15, IL-21, IFNγ, TNFα, TGFβ 및 림프독소 α(LTA), 및 이들의 2종 이상의 조합물을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 병용 요법.
23. 문단 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 케모카인은 IL-8, CCL3, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5 및 CRTH2, 예를 들어, CCL5, CXCL9, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4 및 CXCR4, 이들 중 어느 하나의 수용체, 및 이들의 2종 이상의 조합물을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 병용 요법.
24. 문단 19 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 종양용해성 바이러스(추가의 종양용해성 바이러스)는 B7 단백질의 막관통 앵커링 형태, 예를 들어, B7-1 또는 B7-2를 암호화하는, 병용 요법.
25. 문단 19 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 종양용해성 바이러스(추가의 종양용해성 바이러스)는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제, TIM-3 저해제, LAG-3 저해제, TIGIT 저해제, B7-H3(CD276) 저해제, B7-H4(B7S1) 저해제, B7H7(HHLA2) 저해제, CD96 저해제, VISTA 저해제, 및 이들의 2종 이상의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택된 관문 저해제를 암호화하는, 병용 요법.
26. 문단 25에 있어서, 저해제는 항체 또는 이의 결합 단편인, 병용 요법.
27. 문단 19 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 종양용해성 바이러스(추가의 종양용해성 바이러스)는 동시자극 경로 작용제를 암호화하는, 병용 요법.
28. 문단 27에 있어서, 종양용해성 바이러스(추가의 종양용해성 바이러스)는 CD27 작용제, CD28 작용제, ICOS 작용제, TMIGD2(IGPR-1/CD28H) 작용제, CD226 작용제, OX40 작용제, 4-1BB 작용제, 및 이들의 2종 이상의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택된 동시자극 경로 작용제를 암호화하는, 병용 요법.
29. 문단 19 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 종양용해성 바이러스(추가의 종양용해성 바이러스)는, 예를 들어, IL-10, TGFβ, IDO 저해제, 및 이들의 2종 이상의 조합물로부터 선택된 면역 반응 또는 면역 반응의 반대의 억제를 활성화하는 분자를 암호화하는, 병용 요법.
30. 문단 1 내지 5 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 종양용해성 아데노바이러스를 포함하고, 문단 19 내지 29 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 추가의 종양용해성 바이러스를 포함하는, 약제학적 제제.
31. 치료에서 사용하기 위한, 문단 19 내지 29 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 병용 요법 또는 제30항에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물.
32. 암, 인슐린 내성, 비만, 및/또는 면역 결핍의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한, 문단 1 내지 5 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 종양용해성 바이러스 또는 제6항 또는 제30항에 따른 약제학적 조성물.
33. 문단 32에 있어서, 아데노바이러스 또는 조성물은 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한, 용도.
34. 문단 33에 있어서, 치료에 대한 표적 환자 집단은 CD40을 발현하는 암, 예컨대, CD40이 암에서 상향조절된 집단을 갖는, 용도.
35. 문단 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 바이러스 또는 문단 6 또는 30 중 어느 하나에 따른 조성물 및 추가의 항암 치료제를 포함하는 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 병용 요법으로서, 예를 들어, 치료에 대한 표적 환자 집단은 CD40을 발현하는 암, 예컨대, CD40이 암에서 상향조절된 집단을 갖는, 병용 요법.
36. 문단 35에 있어서, 추가의 항암 치료제는 화학요법제인, 병용 요법.
37. 문단 35 또는 36에 있어서, 추가의 항암 치료제는 관문 저해제인, 병용 요법.
38. 문단 37에 있어서, 항암 치료제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제, TIM-3 저해제, LAG-3 저해제, TIGIT 저해제, B7-H3(CD276) 저해제, B7-H4(B7S1) 저해제, B7H7(HHLA2) 저해제, CD96 저해제, VISTA 저해제, 및 이들의 2종 이상의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택되는, 병용 요법.
39. 문단 35 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 추가의 암 치료제는, 예컨대, 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 종양용해성 바이러스, 예를 들어, 복제 가능 종양용해성 바이러스인, 병용 요법.
40. 치료학적 유효량의 문단 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 종양용해성 아데노바이러스 또는 문단 6 또는 30에 따른 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
41. 문단 40에 있어서, 암, 인슐린 내성, 비만, 및/또는 면역 결핍의 치료를 위한, 치료 방법.
42. 문단 41에 있어서, 암, 예를 들어, CD40을 발현하는 암(예컨대, 상향조절된 CD40 발현을 갖는 암)의 치료를 위한, 치료 방법.
43. 문단 37 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 치료는 추가적인 항암 치료제를 추가로 포함하는, 치료 방법.
44. 문단 43에 있어서, 추가의 항암 치료제는 화학요법제인, 치료 방법.
45. 문단 42 또는 44에 있어서, 추가의 항암 치료제는 관문 저해제인, 치료 방법.
46. 문단 45에 있어서, 항암 치료제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제, TIM-3 저해제, LAG-3 저해제, TIGIT 저해제, B7-H3(CD276) 저해제, B7-H4(B7S1) 저해제, B7H7(HHLA2) 저해제, CD96 저해제, VISTA 저해제, 및 이들의 2종 이상의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택되는, 치료 방법.
47. 문단 42 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 추가의 암 치료제는 종양용해성 바이러스, 예를 들어, 복제 가능 종양용해성 바이러스, 예를 들어, 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 바이러스인, 치료 방법.
도 1 항-CD40 전이유전자 카세트의 도식을 보여준다.
도 2A 및 B 세포 상청액 중의 전체 입자 제조(A) 및 바이러스 입자 제조(B)의 면에서 NG-350 바이러스 활성을 도시한다.
도 2C ELISA를 이용하여 측정된 분비된 IgG2 항-CD40 항체의 농도를 도시한다.
도 3 조합 EcoRv/NheI(A) 또는 개별 효소 NcoI 또는 FspI(B)를 사용한 대조군 대 NG-350 DNA의 제한 분해의 결과를 도시한다.
도 4 프라이머가 결합하는 NG-350 전이유전자 카세트에서의 위치를 도시한다.
도 5 겔 전기영동을 이용한 PCR 생성물의 분리를 도시한다.
도 6 프라이머 세트 D(A) 및 프라이머 세트 K(B)를 사용한 PCR 생성물의 분리를 도시한다.
도 7A EnAd 및 NG-350A(서열번호 1의 바이러스)에 대한 다양한 감염 밀도에서의 세포 생존율(%)의 정량화를 도시한다.
도 7 및 8 NG-350A 및 EnAd에 대한 세포당 검출된 바이러스 게놈의 수의 정량화를 도시한다.
도 9A 및 B 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 측정된 플레이트의 각각의 웰에서의 450㎚에서의 흡광도 및 분비된 IgG2 항-CD40 항체의 농도를 도시한다.
도 9C EnAd, NG-350A 및 양성 대조군에 대한 450㎚에서의 흡광도(도 4C) 및 NG-350A 감염된 세포의 상청액에 존재하는 분비된 항-CD40 항체에 의한 CD40에 대한 특이적 결합을 도시한다.
도 10 NG-350A, EnAd 또는 NG-165 감염된 세포에 대한 플레이트 판독기를 사용한 각각의 샘플에 대해 측정된 620㎚에서의 흡광도를 도시한다.
도 11a 및 b 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 측정된 플레이트의 각각의 웰에서의 450㎚에서의 흡광도 및 분비된 IgG2 항-CD40 항체의 농도를 도시한다.
도 12 ELISA를 사용하여 측정된 분비된 IgG2 항-CD40 항체의 농도를 도시한다.
도 13 CD86(A), CD54(B) 및 HLA-DR(C) 활성화 마커를 발현하는 moDC의 백분율을 도시한다.
도 14 EnAd 바이러스의 존재 또는 부재 하에 NG-350A 감염된 종양 세포에 의해 생성된 정제된 항-CD40 항체와 배양된 moDC, 또는 오로지 EnAd 바이러스에 의한 IL12p40의 분비를 도시한다.
도 15 CD86(a), CD54(b), MFI HLA-DR(c) 및 CD80(d)을 발현하는 CD19+ 세포의 백분율을 도시한다.
도 16 항체 또는 바이러스 치료 단독과 비교하여 함께 NG-350A 감염된 종양 세포 및 EnAd 바이러스에 의해 생성된 정제된 항-CD40 항체에 의한 치료 후 분열하는 B 세포의 백분율을 도시한다.
도 17 NG-350A 감염된 종양 세포에 의해 생성된 바이러스 고갈된 항체 제제가 인간 MoDC의 표면에서 CD40에 결합한다는 것을 도시한다.
도 18 예로서 인간 MoDC에 대한 세포 표면 마커 상향조절에 대한 NG-350A 감염된 종양 세포에 의해 생성된 바이러스 고갈된 항-CD40 Ab의 효과 (a) 및 4개의 상이한 MoDC 도너에 대해 24 및 48시간에서의 용량 반응(b-e)을 도시한다.
도 19 4개의 상이한 MoDC 도너에 대해 24 및 48시간에서의 용량 반응으로서 인간 MoDC에 의한 사이토카인 분비에 대한 NG-350A 감염된 종양 세포에 의해 생성된 바이러스 고갈된 항-CD40 Ab의 효과를 보여준다(b-d).
도 20 NG-350A 감염된 종양 세포에 의해 생성되지만 바이러스가 고갈된 항체 제제가 인간 MoDC의 표면에서 CD40에 결합한다는 것을 도시한다.
도 21 2개의 상이한 도너로부터의 인간 MoDC에서 24 및 48시간에 세포 표면 마커 상향조절에 대한 NG-350A 감염된 종양 세포에 의해 생성되지만 바이러스가 고갈된 항-CD40 Ab의 효과를 도시한다.
도 22 2개의 상이한 도너로부터의 24 및 48시간에 대한 용량 반응으로서 인간 MoDC에 의한 사이토카인 분비에 대한 NG-350A 감염된 종양 세포에 의해 생성되지만 바이러스가 고갈된 항-CD40 Ab의 효과를 도시한다.
도 23 3개의 상이한 B 세포 도너에 대한 24 및 48시간에 대한 용량 반응으로서 인간 B 세포에서 세포 표면 마커 상향조절에 대한 NG-350A 감염된 종양 세포에 의해 생성된 바이러스 고갈된 항-CD40 Ab의 효과를 도시한다.
도 24 3개의 상이한 도너로부터의 인간 B 세포에서 24 및 48시간에 세포 표면 마커 상향조절에 대한 NG-350A 감염된 종양 세포에 의해 생성된 바이러스 고갈된 항-CD40 Ab의 효과를 도시한다.
도 25 EnAd에 대한 것과 비교하여 NG-350A에 의해 감염된 10개의 상이한 종양 세포주에 의한 바이러스 게놈 복제(qPCR)의 시간 과정을 도시한다.
도 26 EnAd에 대한 것과 비교하여 NG-350A에 의해 감염된 4개의 예시적인 종양 세포주에서 바이러스 유도된 종양용해(xCELLigence 검정)의 시간 과정을 도시한다.
도 27 NG-350A에 의해 감염된 10개의 상이한 종양 세포주에 의한 항-CD40 항체 mRNA 발현의 시간 과정을 도시한다.
도 28 상이한 종양 세포주에 의한 IgG2 ELISA에 의한 항-CD40 전이유전자 단백질 발현의 검출을 도시한다.
도 29 EnAd에 대한 것과 비교하여 NG-350A 입자에 의한 IV 투약 이후에 급성 혈장 사이토카인 반응의 시간 과정을 보여준다; MCP-1(a), IL-6(b) 및 TNFα(d).
도 30 EnAd 또는 NG-350A의 단일 정맥내 용량 후 혈장에서의 알라닌 아미노기전이효소(ALT) 농도의 시간 과정을 도시한다.
도 31 EnAd에 대한 것과 비교하여 NG-350A 입자에 의한 반복 IV 투약 섭생의 제1 및 제3 용량 이후에 급성 혈장 사이토카인 반응을 보여준다; MCP-1(a), IL-6(b).
도 32 EnAd 또는 NG-350A의 3개의 정맥내 용량의 각각 후의 말초 혈액에서의 바이러스 약동력학을 도시한다.
도 33 NG-350A 바이러스 입자의 단일 정맥내 용량 후의 쥣과 조직으로부터의 간 바이러스의 회복을 도시한다.
도 34 NG-350A 또는 EnAd의 3개의 IV 주사 또는 단일 분별화 IT 용량 후 피하 A549(A&B) 및 HCT116(C&D) 종양에서의 바이러스 게놈 복제를 도시한다.
도 35 NG-350A 또는 EnAd의 3개의 IV 주사 또는 단일 분별화 IT 용량 후 피하 A549(A&B) 또는 HCT-116(C&D) 종양에서의 바이러스 E3 mRNA 발현을 도시한다.
도 36 NG-350A 또는 EnAd의 3개의 IV 주사 또는 단일 분별화 IT 용량 후 피하 A549(A&B) 및 HCT-116(C&D) 종양에서의 항-CD40 작용제성 항체 전이유전자 mRNA 발현을 보여준다
도 37 NG-350A 또는 EnAd의 3개의 IV 주사 또는 단일 분별화 IT 용량 후 피하 A549 종양에서의 항-CD40 항체 단백질을 도시한다.
CD40은, 예를 들어, 항원 제시 세포에서 발견되는 동시자극 단백질이다. CD40은 Bp50, CDW40, TNFRSF5, p50, CD40 단백질, CD40 분자로도 공지되어 있다. 인간 단백질은 UniProt 번호 P25942를 갖는다. 쥣과 단백질은 UniProt 번호 P27512를 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 암 세포에 대한 선택도를 갖는 종양용해성 바이러스는, 예를 들어, 바이러스가 암 세포를 우선적으로 감염시키고/시키거나 바이러스 생활 주기가 암 세포에서 이상조절된, 예를 들어, 과발현된 유전자, 예컨대, p53에 따라 달라지므로, 암 세포를 우선적으로 사멸하는 바이러스를 의미한다. 일 실시형태에서, 종양용해성 바이러스는 암 세포를 우선적으로 감염시키고, 계속해서 이의 게놈을 복제하고 캡시드 단백질을 생성하여서, 예를 들어, EnAd에 따라 새로운 바이러스 입자를 생성한다.
암 세포에 대한 선택도(치료 지수)는 WO 제2005/118825호(본 명세서에 참고로 원용됨)에 기재된 바대로 시험될 수 있다.
일 실시형태에서, 종양용해성 바이러스는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 레오바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 소아마비 바이러스, ECHO 엔테로바이러스, 콕사키 바이러스, 및 백시니아 바이러스, 특히 아데노바이러스로부터 선택된 바이러스이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 에나데노툭시레브, 탈리모겐 라허파렙벡, RIGVIR, Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12, 카바탁(상표명), CG0070, DNX-2401, G207, HF10, 임리직(등록상표), JX-594, MG1-MA3, MV-NIS, OBP-301, 레올리신(등록상표), Toca 511, 특히 에나데노툭시레브로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 병용 요법에 사용된 종양용해성 아데노바이러스는 복제 가능하다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 조합에서 사용된 종양용해성 아데노바이러스는 복제 결핍이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스는 병용 요법에서 사용된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 또는 본 개시내용의 병용 요법에서 제2 성분으로서 사용된 종양용해성 아데노바이러스는, 예를 들어, 하기 화학식 (I)을 갖는다:
Figure pct00001
(식 중,
B1은 결합이거나 E1A, E1B 또는 E1A-E1B(특히 E1A, E1B 또는 E1A-E1B)를 포함하고;
BA는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4이고;
B2는 결합이거나, 예를 들어, 내인성 또는 외인성 촉진자 하에 E3 또는 전이유전자를 포함하고;
BX는 결합 또는 제한 부위, 하나 이상의 전이유전자 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이고;
BB는 L5를 포함하고;
BY는 치료학적 단백질 또는 이의 활성 단편(특히, 서열번호 12 포함)을 암호화하는 전이유전자 카세트를 포함하고;
B3은 결합이거나, E4를 포함함).
일 실시형태에서, 종양용해성 아데노바이러스는 하기 화학식 ( Ia )를 갖는다:
Figure pct00002
(식 중,
B1은 결합이거나 E1A, E1B 또는 E1A-E1B(특히 E1A, E1B 또는 E1A-E1B)를 포함하고;
BA는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4이고;
B2는 결합이거나, E3을 포함하고;
BB는 L5를 포함하고;
BY는 치료학적 단백질 또는 이의 활성 단편(특히 서열번호 12 포함)을 암호화하는 전이유전자 카세트를 포함하고;
B3은 결합이거나, E4를 포함함).
일 실시형태에서, 화학식 (I) 및/또는 (Ia)의 작제물에서의 바이러스 게놈은 Ad11 또는 EnAd, 특히 EnAd 기원이다.
일 실시형태에서, 전이유전자 카세트는 내인성 촉진자, 예를 들어, 주요 후기 촉진자의 제어 하에 있다.
치료학적 단백질은 항체 또는 결합 단편(예를 들어, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT 또는 CD160, 예를 들어, CTLA-4, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2에 특이적인 항체 또는 단편을 포함하는 군으로부터 선택), B-7 단백질(예컨대, B7-1 및/또는 B7-2), 사이토카인(예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35. 인터류킨-2(IL-2), IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, TGFβ, 림프독소 α(LTA) 및 GM-CSF로부터 선택), 및 케모카인(예를 들어, IL-8, CCL3, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5 및/또는 CRTH2), 및 이들의 2종 이상의 조합물을 포함한다.
본 개시내용의 치료는 2개 이상의 종양용해성 바이러스를 포함할 수 있다.
조절 요소
일 실시형태에서. BY는 본 개시내용에 따른 전이유전자 카세트를 포함하고, 상기 카세트는 관문 저해제, 예를 들어, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1, 및 항-PD-L1 항체 또는 이들 중 어느 하나의 결합 단편 및 조절 요소, 예컨대, 조절 요소의 조합을 암호화하는 전이유전자를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 조절 요소는 스플라이스 억셉터 서열이다.
일 실시형태에서, 조절 요소는 코작(Kozak) 서열이다.
예를 들어, 전이유전자가 폴리시스트론성 RNA 분자를 암호화하는 일 실시형태에서, 조절 요소는 IRES 서열이다.
일 실시형태에서, 조절 서열은 고효율 자가 절단 가능한 펩타이드 서열, 예컨대, P2A, T2A, F2A, E2A이다.
일 실시형태에서, 조절 서열은 polyA 꼬리이다.
일 실시형태에서, 적어도 2개의 조절 서열, 예를 들어, 스플라이스 억셉터 및 코작 서열 또는 스플라이스 억셉터 및 polyA 꼬리, 또는 스플라이스 억셉터 및 IRES 서열, 또는 스플라이스 억셉터 및 P2A 서열이 있다.
일 실시형태에서, 적어도 3개의 조절자 서열, 예를 들어, 스플라이스 억셉터 서열, 코작 서열 및 polyA 꼬리, 또는 스플라이스 억셉터 서열 IRES 또는 2A 서열 및 polyA 꼬리; 또는 스플라이스 억셉터 서열, 코작 서열 및 IRES 또는 2A 서열이 있다.
일 실시형태에서, 순서 스플라이스 억셉터 서열, 코작 서열, IRES 또는 2A 서열 및 polyA 꼬리에서 적어도 4개의 조절 서열, 예를 들어, 스플라이스 억셉터 서열, 코작 서열, IRES 또는 2A 서열 및 polyA 꼬리(특히 L5와 E4 사이에 위치)가 있다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 IRES 및 2A 조절 서열 둘 다를 포함하는 폴리시스트론성 RNA 분자를 암호화한다.
일 실시형태에서, 세포막 발현을 위해 전이유전자 카세트에서 암호화된 단백질 또는 단백질들은 막관통 도메인 또는 GPI 앵커와 세포외 리간드 결합 도메인 사이에 펩타이드 링커 또는 스페이서를 또한 포함할 수 있다. 이러한 링커 또는 스페이서는, 예를 들어, 인접한 세포에서 이의 표적 분자와 상호작용하는 단백질의 능력을 증대시키는 세포 표면 발현된 단백질에 대한 유연성을 추가할 수 있다. 이러한 링커 또는 스페이서는 또한 다이설파이드 결합 형성 또는 단백질-단백질 상호작용을 통해 세포 표면에서 단백질의 이합체화 또는 삽합체화를 촉진하도록 설계되거나 선택될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 분자 또는 CD8의 힌지 영역은 유연성 및 이합체화 둘 다를 증대시키도록 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 전이유전자 카세트에서 암호화된 단백질 또는 단백질들은 펩타이드 태그를 또한 포함할 수 있다.
펩타이드 태그는 c-myc, 폴리-히스티딘, V5 또는 FLAG 태그를 포함할 수 있고, 폴리펩타이드, 예를 들어, 세포내 또는 세포외 폴리펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 위치할 수 있거나, 예를 들어, 세포외 루프에서 또는 막관통 도메인과 세포외 도메인 사이에 단백질 내에 암호화될 수 있다. 펩타이드 태그는 상이한 단백질 도메인, 예를 들어, 막관통 도메인과 세포외 도메인 사이에 스페이서 또는 링커로서 사용될 수 있고, 단백질, 또는 단백질을 발현하는 세포의 검출 또는 정제 또는 검출에 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 예를 들어, 화학식 (I) 또는 (Ia)의 바이러스에서 하나 이상의 추가적인 전이유전자는 외인성 또는 내인성 촉진자, 예를 들어, 내인성 촉진자의 제어 하에 있다. 일 실시형태에서, E3 영역에서의 전이유전자(B2)는 외인성 촉진자의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 전이유전자 유전자는, 특히 외인성 촉진자의 제어 하에, 아데노바이러스 게놈에서의 E3 영역과 섬유 L5 사이에, 예를 들어, 화학식 (I)의 작제물에서 위치 BX에 있다. 따라서, 일 실시형태에서, BX에서의 전이유전자는 외인성 촉진자의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 전이유전자 유전자는 특히 내인성 촉진자, 예컨대, 주요 후기 촉진자의 제어 하에, 아데노바이러스 게놈에서의 E4 영역과 섬유 L5 사이에, 예를 들어, 화학식 (I) 또는 (Ia)의 작제물에서의 위치 BY에 있다. 이는 영역 BY에 암호화된 치료학적 단백질 또는 이의 활성 단편이 아닐 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 전이유전자는 아데노바이러스의 게놈 서열에 삽입된 유전자를 의미하고, 여기서 유전자는 바이러스에 대해서 비천연이거나(외인성), 바이러스에서의 그 특정한 위치에서 통상 발견되지 않는다. 전이유전자의 예는 본 명세서에 주어진다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 전이유전자는 또한, 삽입될 때, 전장 유전자의 기능 또는 기능의 대부분, 예를 들어, 기능의 50% 이상을 수행하기에 적합한 유전자의 일부인 유전자의 기능성 단편을 포함한다.
전이유전자 및 암호화 서열은, 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 바이러스 게놈으로의 삽입의 맥락에서 본 명세서에서 상호 교환되어 사용된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 암호화 서열은, 예를 들어, 기능적 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 통상적으로, 암호화 서열은 관심 대상의 기능적 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 전이유전자에 대한 cDNA이다. 관심 대상의 기능적 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 하기 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 사용된 바와 같은 전이유전자는 유전자를 함유하는 DNA의 분적을 의미하거나, 하나의 유기체로부터 단리된 cDNA 서열은 상이한 유기체, 즉 본 개시내용의 바이러스로 도입된다. 일 실시형태에서, DNA의 이 비네이티브 분절은 일반적으로 기능적 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 생성하는 능력을 보유할 것이다. 사용된 전이유전자는 예를 들어 단일 단백질 또는 이의 활성 단편, 키메라 단백질 또는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.
명확하게, 바이러스 게놈은 DNA의 암호화 서열을 함유한다. 바이러스의 게놈 서열에서의 내인성(천연 발생 유전자)은 본 명세서의 맥락 내에 전이유전자로 생각되지 않고, 다르게는 이후 재조합 기법에 의해 변형되고, 예컨대, 즉 이들은 비천연 위치에 또는 비천연 환경에 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 삽입된 전이유전자(들)는 인간 또는 인간화된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화한다. 전이유전자(들)는, 예를 들어, 전이유전자 카세트 내에 위치할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 GPI 앵커는 번역 후 변형 동안 단백질의 C 말단에 부착될 수 있는 당지질을 의미한다. 이것은 탄수화물 함유 링커(이노시톨 잔기에 글라이코시드 결합된 글루코사민 및 만노스)를 통해 그리고 성숙 단백질의 C 말단 아미노산에 대한 에탄올아민 포스페이트(EtNP) 브리지를 통해 연결된 포스파티딜이노시톨기로 이루어진다. 소수성 포스파티딜-이노시톨기 내의 2개의 지방산은 단백질을 세포막에 앵커링시킨다.
글라이피화된(Glypiated)(GPI 연결된) 단백질은 일반적으로 신호 펩타이드를 함유하여서, 이들을 소포체(endoplasmic reticulum: ER)로 지향시킨다. C 말단은 ER 막에 삽입되어 머무는 소수성 아미노산으로 이루어진다. 소수성 말단은 이후 절단되고, GPI-앵커에 의해 대체된다. 단백질이 분비 경로를 통해 진행하면서, 이것은 수소포를 통해 골지체로 그리고 마지막으로 세포외 공간으로 이동되고, 이 공간에서 이것은 세포막의 외부 엽(leaflet)에 부착된 채 있다. 글라이피화가 막에 대한 이러한 단백질의 부착의 유일한 수단이므로, 포스포리파제에 의한 기의 절단은 막으로부터의 단백질의 방출을 제어할 것이다. 후자의 기전은 시험관내 사용되고, 즉 효소 검정에서 막으로부터 방출된 막 단백질은 글라이피화된 단백질이다.
포스포리파제 C(PLC)는 GPI-앵커링된 단백질에서 발견된 포스포-글리세롤 결합을 절단하는 것으로 공지된 효소이다. PLC에 의한 처리는 외부 세포막으로부터 GPI 연결된 단백질의 방출을 발생시킬 것이다. T 세포 마커 Thy-1 및 아세틸콜린에스테라제, 및 장 및 태반 알칼리 포스파타제 둘 다는 GPI 연결되고 PLC에 의한 처리에 의해 방출된다고 공지되어 있다. GPI 연결된 단백질은 지질 뗏목에 우선적으로 위치한다고 생각되고, 이는 혈장 막 마이크로도메인 내의 높은 수준의 체계화를 제안한다.
퍼거슨(Ferguson), 키노시타(Kinoshita) 및 하르트(Hart)가 작성한 GPI 앵커의 검토는 문헌[Chapter 11 of Essentials of Glycobiology 2nd Edition]에서 이용 가능하다.
바이러스
본 명세서의 맥락에서 복제 가능은 시험관내 및 생체내 세포에서 복제하는 모든 필요한 기계류를 보유하는(즉, 패키징 세포주의 도움 없이) 바이러스를 의미한다. 상보성 패키징 세포주에서 복제할 수 있는, 예를 들어, 적어도 E1A 영역에서 결실된 바이러스 벡터는 본 맥락에서 복제 가능 바이러스가 아니다.
바이러스 벡터는 복제하도록 (상보성 전이유전자를 포함하는) 패키징 세포주를 요하는 복제 결핍 바이러스이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 복제 가능 바이러스는 복제 가능 바이러스 또는 복제가 암 세포에서 인자에 의존적인 바이러스, 예를 들어, 상향조절된 인자, 예컨대, p53 또는 유사물을 의미한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "아데노바이러스", "혈청형" 또는 아데노바이러스 혈청형"은, 하위그룹 A-F로 분류되고, 임의의, 아직까지, 확인되지 않거나 분류되지 않은 아데노바이러스 혈청형으로 추가로 확장되는, 임의의 50개 초과의 현재 공지된 아데노바이러스 혈청형으로 배정될 수 있는 임의의 아데노바이러스를 의미한다. 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 문헌[Strauss, "Adenovirus infections in humans," in The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984) 및 Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication," in Fields Virology, Vol.2, Fourth Edition, Knipe, 35ea, Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001)]을 참조한다.
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아데노바이러스는 이의 캡시드에 기초하여 그룹화된다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는, 예를 들어, Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34 및 Ad51, 예컨대, Ad11, 특히 Ad11p(슬로비트스키(Slobitski) 균주)를 포함하거나 이것으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하위그룹 B이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 아데노바이러스는 B 하위그룹 아데노바이러스, 예컨대, Ad11, 특히 Ad11p의 캡시드, 예컨대, 헥손 및/또는 섬유를 갖는다. 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 Ad11이거나, Ad11, 예컨대, Ad11p의 섬유 및/또는 헥손 및/또는 펩톤을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스는 A 그룹 바이러스가 아니다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스는 아데노 사멸 단백질(adeno death protein: ADP)을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스는 C 그룹 바이러스가 아니다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스는 Ad5 바이러스의 하나 이상의 단편을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스는 Ad5가 아니다.
에나데노툭시레브(EnAd)는 Ad11p로부터의 섬유, 펩톤 및 헥손로 ColoAd1로서 이전에 공지된 키메라 종양용해성 아데노바이러스(WO 제2005/118825호)이고, 그러므로 이것은 B 하위그룹 바이러스이다. 이것은 Ad11p 및 Ad3으로부터의 DNA를 포함하는 키메라 E2B 영역을 갖는다. E3 영역의 거의 모두 및 E4 영역의 일부는 EnAd에서 결실된다. 따라서, 이것은 생존 가능하게 있으면서 추가적인 유전자 재료를 수용하도록 게놈에서 유의미한 공간을 갖는다. 게다가, EnAd가 B 하위그룹 아데노바이러스이므로, 인간에서의 기존의 면역력은, 예를 들어, Ad5보다 덜 흔하다. Ad11 섬유, 펩톤 및 헥손을 갖는 키메라 종양용해성 바이러스의 다른 예는 OvAd1 및 OvAd2를 포함한다(WO 제2006/060314호 참조).
EnAd는 종양 세포를 우선적으로 감염시키는 것 같고, 이들 세포에서 신속히 복제하고 세포 용해를 발생시킨다. 이는 결국 염증성 면역 반응을 생성시켜서 신체가 또한 암과 싸우도록 자극할 수 있다. EnAd의 성공의 부분은 생체내 바이러스의 빠른 복제와 관련된다고 가정된다.
중요하게는, EnAd가 전신으로(예를 들어, 정맥내 또는 복막내 주사 또는 점적주사에 의해) 투여되고, 이후 후속하여 선택적으로 종양 세포 내의 단백질을 감염시키고 발현할 수 있다고 임상적으로 입증되었다. Ad11p 및 다른 B 그룹 아데노바이러스, 특히 Ad11p의 캡시드 단백질을 발현하는 것(예컨대, 본 명세서에 기재된 것)이 공유할 수 있는 EnAd의 이 특성은 종양 및/또는 종양 미세환경에서 암호화된 단백질을 발현하는 것이 가능하게 한다.
EnAd가 종양 세포를 선택적으로 용해시키지만, 전이유전자, 예컨대, 세포 신호전달 단백질 또는 항체를 암호화하는 전이유전자, 또는 세포 신호전달 단백질(들)을 자극하는 집합체를 암호화하는 전이유전자에 의해 이것을 무장시킴으로써 추가의 유리한 특성, 예를 들어, 바이러스의 치료학적 활성의 증가 또는 바이러스의 부작용의 감소를 도입할 수 있다.
암 세포 내부에 발현될 수 있는 소정의 단백질을 암호화하는 DNA로 유리하게 바이러스를 무장시키는 것은 종양 세포를 표적화하도록, 예를 들어, 세포가 면역계에 더 보이도록 만듦으로써 또는 우선적으로 치료학적 유전자/단백질을 전달함으로써, 신체 자체의 방어가 종양 세포와 더 효과적으로 싸우도록 사용되게 할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 종양용해성 아데노바이러스는, 예를 들어, 면역 반응을 억제하는 암의 능력을 감소시킴으로써 종양과 싸우는 환자의 면역계를 자극한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스에 의해 암호화된 항-CD40 항체 또는 결합 단편은 종양 미세환경에서 및/또는 종양의 근처에서 면역 세포, 예를 들어, T 세포를 활성화하는 능력을 갖는다.
일 실시형태에서, 종양용해성 바이러스는, 예를 들어, 후자의 게놈 서열의 30812 내지 31789, 18254 내지 21100 및 13682 내지 15367 위치에서 발견되는 동일한 혈청형, 예를 들어, Ad11, 특히 Ad11p로부터의 섬유, 헥손 및 펩톤 단백질을 갖고, 여기서 뉴클레오타이드 위치는 유전자은행 번호 217307399(수탁 번호: GC689208)에 대한 것이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 에나데노툭시레브(EnAd 및 이전에 ColoAd1로도 공지됨)이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 에나데노툭시레브는 WO 제2016/174200호에 개시되고 참고로 포함된 서열번호 21의 키메라 아데노바이러스를 의미한다. 이것은 야생형 아데노바이러스와 비교하여 증대된 치료학적 특성을 갖는 복제 가능 종양용해성 키메라 아데노바이러스이다(WO 제2005/118825호 참조). EnAd는 Ad11p 및 Ad3으로부터의 DNA, 및 E3/E4에서의 결실을 특징으로 하는 키메라 E2B 영역을 갖는다. 에나데노툭시레브의 구조 변화는 Ad11p보다 대략 3.5kb 더 적어서 전이유전자의 삽입을 위한 추가적인 "공간"을 제공하는 게놈을 생성시킨다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 카세트는 특히 주요 후기 촉진자의 제어 하에 아데노바이러스, 예컨대, B 그룹 아데노바이러스에서 L5와 E4 영역 사이에 위치한다.
일 실시형태에서, 사용된 바이러스는 EnAd가 아니다.
본 발명에서 사용될 수 있는 다른 바이러스는 단순 포진 바이러스, 레오바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 소아마비 바이러스, ECHO 엔테로바이러스, 콕사키 바이러스 및 백시니아 바이러스, 특히 예를 들어 탈리모겐 라허파렙벡, RIGVIR, Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12, 카바탁(상표명), CG0070, DNX-2401, G207, HF10, 임리직(등록상표), JX-594, MG1-MA3, MV-NIS, OBP-301, 레올리신(등록상표), Toca 511로 이루어진 군으로부터 선택된 아데노바이러스를 포함한다.
항체 또는 항체 단편
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스는 전장 항-CD40 항체를 암호화한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 항체는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위(본 명세서에서 결합 부위라고도 불림)를 통해 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자, 예컨대, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 항체 분자는 항체 및 이의 결합 단편 및 이들의 하나 이상을 포함하는 분자를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 항원 결합 부위는 한 쌍의 가변 영역, 특히 표적 항원과 특이적으로 상호작용하는 동족 쌍을 포함하는 분자의 일부를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 항체 결합 단편은 여전히 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 전체보다 적은 항체를 의미한다.
구체적으로, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이것이 특이적인 항원을 오로지 인식하는 결합 부위 또는 이것이 비특이적인 항원에 대한 친화도와 비교하여 특이적인 항원에 유의미하게 더 높은 결합 친화도, 예를 들어, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 더 높은 결합 친화도를 갖는 결합 부위를 의미하는 것으로 의도된다.
사용된 바대로 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자, 전장 항체 또는 이들의 어느 하나의 단편을 포함하는 이중특이적 항체 포맷, 예를 들어, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디 및 임의의 상기의 에피토프-결합 단편(이들로 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 이들 항체 단편을 생성하고 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조). 본 발명에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 WO 제2005/003169호, WO 제2005/003170호 및 WO 제2005/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다수의 특이성, 예를 들어, 이중특이성을 포함할 수 있거나, 단일특이적일 수 있다(예를 들어, WO 제92/22853호, WO 제05/113605호, WO 제2009/040562호 및 WO 제2010/035012호 참조).
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스에서 사용된 항체 분자는 인간화, 키메라 또는 비인간이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 (CDR 그래프팅된 항체를 포함하는) 인간화는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 분자를 의미한다(예를 들어, US 제5,585,089호; WO 제91/09967호 참조). 전체 CDR보다 CDR의 특이성 결정 잔기를 이동시키는 것이 오직 필요할 수 있다고 이해될 것이다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 인간화된 항체는 CDR이 유래된 비인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 그래프팅될 때, 임의의 적절한 억셉터 가변 영역 프레임워크 서열은 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 포함하여 CDR이 유래된 도너 항체의 종류/유형과 관련하여 사용될 수 있다. 적합하게는, 본 개시내용에 따른 인간화된 항체는 인간 억셉터 프레임워크 영역, 및 본 명세서에 제공된 CDR 중 하나 이상을 가변 도메인을 갖는다.
본 개시내용에서 사용될 수 있는 인간 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM(상기 Rabat 등의 문헌)이다. 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 대해 사용될 수 있고, REI는 경쇄에 대해 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대해 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식선 서열을 사용할 수 있다; 이들은 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/에서 이용 가능하다.
본 개시내용의 인간화된 항체에서, 억셉터 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요가 없고, 원하는 경우, 상이한 사슬로부터 유래된 프레임워크 영역을 갖는 복합 사슬을 포함할 수 있다.
프레임워크 영역은 정확히 억셉터 항체의 것과 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 드문 잔기는 그 억셉터 사슬 종류 또는 유형에 더 흔히 발생하는 잔기로 변할 수 있다. 대안적으로, 억셉터 프레임워크 영역에서의 선택된 잔기는 이것이 도너 항체에서 동일한 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 변할 수 있다(문헌[Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324] 참조). 이러한 변화는 도너 항체의 친화도를 회복시키기 위해 필요한 최소로 유지되어야 한다. 변화될 필요가 있을 수 있는 억셉터 프레임워크 영역에서의 잔기를 선택하기 위한 프로토콜은 WO 제91/09967호에 기재되어 있다.
키메라 항체는 일반적으로 비인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 함유한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 분자는 완전 인간이고, 특히 가변 도메인의 하나 이상은 완전 인간이다.
완전 인간 분자는 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역 및 불변 영역(존재하는 경우)이 모두 인간 기원이거나, 반드시 동일한 항체 기원이 아니고 인간 기원의 서열과 실질적으로 동일한 것이다. 완전 인간 항체의 예는 예를 들어 상기 기재된 파지 디스플레이 방법에 의해 제조된 항체 및 쥣과 면역글로불린 가변 및 선택적으로 불변 영역 유전자가, 예를 들어, EP 제0546073호, US 제5,545,806호, US 제5,569,825호, US 제5,625,126호, US 제5,633,425호, US 제5,661,016호, US 제5,770,429호, EP 제0438474호 및 EP 제0463151호에서 일반 용어로 기재된 바와 같은 이의 인간 대응물에 의해 대체되는 마우스에 의해 제조된 항체를 포함할 수 있다.
화학식 (I) 및 ( Ia )와 관련된 정의
결합은 하나의 DNA 서열을 또 다른 DNA 서열에 연결하는, 예를 들어, 바이러스 게놈의 하나의 섹션을 또 다른 섹션에 연결하는 공유 결합을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 화학식 (I) 및 (Ia)에서의 변수는 결합으로 표시된 특징 또는 요소가 부재한, 즉 결실된 결합을 나타낸다.
아데노바이러스의 구조가 일반적으로 유사하므로, 하기 요소는 숙련자에게 공지된 구조 요소 및 이것을 의미하는 흔히 사용되는 명명법을 고려하여 기재된다. 요소가 본 명세서에서 언급될 때, 본 발명자들은 아데노바이러스에서 요소를 암호화하는 DNA 서열 또는 요소의 동일한 구조 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 후자는 DNA 코드의 중복성 때문에 관련된다. 코돈 용법에 대한 바이러스의 우선도는 최적화된 결과에 대해 생각될 필요가 있을 수 있다.
본 개시내용의 바이러스에서 사용된 아데노바이러스로부터의 임의의 구조 요소는 천연 서열을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있거나, 적어도 95%, 예컨대, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 주어진 길이에 걸쳐 유사성을 가질 수 있다. 원래의 서열은 유전자 재료의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%를 생략하도록 변하거나 변형될 수 있다. 그러나, 일 실시형태에서, 적어도 95% 유사하거나 동일한 DNA 서열은 동일한 유전자 생성물, 즉 RNA 및/또는 단백질을 암호화한다. 숙련자는 구조 단백질의 발현이 파괴되도록 변화를 만들 때 바이러스의 리딩 프레임이 파괴되지 않아야 한다는 것을 알고 있다. 본 개시내용은 또한 엄격한 조건 하에 본 명세서에 개시된 서열로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 연장된다.
일 실시형태에서, 주어진 요소는 전장 서열, 즉 전장 유전자이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 전장 유전자는 적어도 유전자의 암호화 서열의 전부를 의미하지만, 특히 이것이 유전자의 기능과 관련되는 경우 임의의 연관된 비암호화 영역을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 주어진 요소는 전장 서열보다 짧고, 전장 서열과 동일한 또는 상응하는 기능을 보유한다.
본 개시내용의 작제물에서 선택적인 주어진 요소에 대한 일 실시형태에서, DNA 서열은 전체 길이보다 짧을 수 있고, 기능성을 갖지 않고, 예를 들어, E3 영역은 전체적으로 또는 부분적으로 결실될 수 있다. 그러나, 전이유전자를 삽입하기에 이용 가능한 공간을 최적화하므로, 본질적으로 모든 E3 영역을 결실시키는 것이 유용할 수 있다.
아데노바이러스의 구조적 또는 기능적 단백질을 암호화하는 구조 유전자는 DNA의 비암호화 영역에 의해 일반적으로 연결된다. 따라서, 본 개시내용의 바이러스로 전이유전자를 삽입시키는 것의 목적을 위해 (특히 이의 비암호화 영역에서) 관심 대상의 구조 요소의 게놈 서열을 "절단"하는 곳의 주위에 약간의 유연성이 존재한다. 따라서, 본 명세서의 목적을 위해, 요소는 이것이 목적에 맞고 외인성 재료를 암호화하지 않는 정도로 기준의 구조 요소인 것으로 생각될 것이다. 따라서, 적절한 경우, 유전자는, 예를 들어, 바이러스의 천연 구조에서 발견되는 바대로 적합한 비암호화 영역과 연관될 것이다.
따라서, 일 실시형태에서 인서트, 예컨대, 전이유전자를 암호화하는 DNA는 게놈 바이러스 DNA의 비암호화 영역, 예컨대, 인트론 또는 유전자간 서열로 삽입된다. 그렇긴 해도, 아데노바이러스의 몇몇 비암호화 영역은, 예를 들어, 대안적인 스플라이싱, 전사 조절 또는 번역 조절에서 기능을 가질 수 있고, 이것은 고려될 필요가 있을 수 있다.
L5 영역과 연관된 본 명세서에서 확인된 부위는 복잡한 집합체, 예컨대, RNAi, 사이토카인, 단일 사슬 또는 다합체 단백질, 예컨대, 항체, 특히 서열번호 12를 암호화하는 다양한 DNA 서열을 수용하기에 적합하다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 유전자는 이와 연관된 암호화 및 임의의 비암호화 서열, 예를 들어, 인트론 및 연관된 엑손을 의미한다. 일 실시형태에서, 유전자는 오직 필수 구조 성분, 예를 들어, 암호화 영역을 포함하거나, 이것으로 이루어진다.
아데노바이러스의 특이적인 구조 요소에 관한 토의가 하기에 있다.
인버티드 말단 반복부(Inverted Terminal Repeat: ITR) 서열은 모든 공지된 아데노바이러스(이의 대칭 때문에 이렇게 명명됨)에 흔하고, 복제의 바이러스 염색체 기원이다. 이들 서열의 또 다른 특성은 헤어핀을 형성하는 이의 능력이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 5'ITR은 적절한 위치에서 아데노바이러스로 삽입될 때 ITR의 기능을 보유하는 아데노바이러스의 5' 말단으로부터의 ITR의 일부 또는 전부를 의미한다. 일 실시형태에서, 5'ITR은 WO 제2016/174200호의 서열번호 21(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)의 약 1bp 내지 138bp의 서열 또는 전체 길이를 따라 이것과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열, 특히 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)의 약 1bp 내지 138bp로 이루어진 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 3'ITR은 적절한 위치에서 아데노바이러스로 삽입될 때 ITR의 기능을 보유하는 아데노바이러스의 3' 말단으로부터의 ITR의 일부 또는 전부를 의미한다. 일 실시형태에서, 3'ITR은 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17의 약 32189bp 내지 32326bp의 서열 또는 전체 길이를 따라 이것과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열, 특히 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17의 약 32189bp 내지 32326bp로 이루어진 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 B1은 아데노바이러스로부터의 EIA의 일부 또는 전부, 아데노바이러스의 E1B 영역의 일부 또는 전부, 및 독립적으로 아데노바이러스의 EIA 및 E1B 영역의 일부 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열을 의미한다.
B1이 결합일 때, E1A 및 E1B 서열은 바이러스로부터 생략될 것이다. 일 실시형태에서, B1은 결합이고, 이에 따라 바이러스는 벡터이다.
일 실시형태에서, B1은 전이유전자를 추가로 포함한다. E1 영역이 E1 영역으로 파괴적인 방식으로(즉, 서열의 "중간"에서) 삽입될 수 있는 전이유전자를 수용할 수 있거나, E1 영역의 일부 또는 전부가 유전자 재료를 수용할 더 많은 여지를 제공하도록 결실될 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 E1A는 아데노바이러스 E1A 영역의 일부 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 여기서 후자는 폴리펩타이드/단백질 E1A를 언급한다. 이것은 돌연변이될 수 있어서, EIA 유전자에 의해 암호화된 단백질은 보존적 또는 비보존적 아미노산 변화(예를 들어, 전체 길이에 걸쳐 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화, 부가 및/또는 결실)를 갖고, 이것은 야생형과 동일한 기능(즉, 상응하는 비돌연변이된 단백질); 야생형 단백질과 비교하여 기능의 증가; 기능의 감소, 예컨대, 야생형 단백질과 비교하여 무기능을 갖거나; 적절하게 야생형 단백질과 비교하여 새로운 기능 또는 이들의 조합을 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 E1B는 아데노바이러스 E1B 영역(즉, 폴리펩타이드 또는 단백질)의 일부 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열을 의미하고, 이것은 돌연변이될 수 있어서, E1B 유전자/영역에 의해 암호화된 단백질은 보존적 또는 비보존적 아미노산 변화(예를 들어, 전체 길이에 걸쳐 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화, 부가 및/또는 결실)를 갖고, 이것은 야생형과 동일한 기능(즉, 상응하는 비돌연변이된 단백질); 야생형 단백질과 비교하여 기능의 증가; 기능의 감소, 예컨대, 야생형 단백질과 비교하여 무기능을 갖거나; 적절하게 야생형 단백질과 비교하여 새로운 기능 또는 이들의 조합을 갖는다.
따라서, B1은 야생형 E1 영역, 예컨대, 야생형 E1A 및/또는 E1B에 비해 변형 또는 비변형될 수 있다. 숙련자는 E1A 및/또는 E1B가 존재하거나, (부분) 결실되거나 돌연변이되는지를 쉽게 확인할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 야생형은 공지된 아데노바이러스 또는 공지된 아데노바이러스로부터의 서열을 의미한다. 공지된 아데노바이러스는 서열 정보가 이용 가능한지와 무관하게 확인되고 명명되는 것이다.
일 실시형태에서, B1은 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17의 139bp 내지 3932bp의 서열을 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 BA는 적절하게(특히 아데노바이러스로부터의 천연 서열에 상응하는) 임의의 비암호화 서열을 포함하는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4 영역을 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 일반적으로, 이 서열은 전이유전자를 포함하지 않을 것이다. 일 실시형태에서, 서열은 공지된 아데노바이러스, 예를 들어, 표 1에 기재된 혈청형, 특히 B형 바이러스, 예를 들어, Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 또는 이들의 조합, 예컨대, Ad3, Ad11 또는 이들의 조합으로부터의 인접 서열과 실질적으로 유사하거나 동일하다. 일 실시형태에서, E2B-L1-L2-L3-E2A-L4는 이들 요소 및 영역과 연관된 다른 구조 요소를 의미하고, 예를 들어, BA는 일반적으로, 예를 들어, 하기와 같이 단백질 IV2A를 암호화하는 서열을 포함할 것이다: IV2A IV2a-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4.
일 실시형태에서, E2B 영역은 키메라이다. 즉, 2개 이상의 상이한 아데노바이러스 혈청형, 예를 들어, Ad3 및 Ad11, 예컨대, Ad11p로부터의 DNA 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, E2B 영역은 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17의 5068bp 내지 10355bp의 서열 또는 전체 길이에 걸쳐 이것과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, 성분 BA에서 E2B는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 18(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)에 기재된 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, BA는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 18의 3933bp 내지 27184bp의 서열을 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 E3은 아데노바이러스 E3 영역(즉, 단백질/폴리펩타이드)의 일부 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열을 의미하고, 이것은 돌연변이될 수 있어서, E3 유전자에 의해 암호화된 단백질은 보존적 또는 비보존적 아미노산 변화(예를 들어, 전체 길이에 걸쳐 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화, 부가 및/또는 결실)를 갖고, 이것은 야생형과 동일한 기능(즉, 상응하는 비돌연변이된 단백질); 야생형 단백질과 비교하여 기능의 증가; 기능의 감소, 예컨대, 야생형 단백질과 비교하여 무기능을 갖거나; 적절하게 야생형 단백질과 비교하여 새로운 기능 또는 이들의 조합을 갖는다.
일 실시형태에서, E3 영역은 표 1에 주어진 아데노바이러스 혈청형 또는 이들의 조합, 특히 B형 혈청형, 예를 들어, Ad3, Ad7, Ad11(특히 Ad11p), Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 또는 이들의 조합, 예컨대, Ad3, Ad11(특히 Ad11p) 또는 이들의 조합이다.
일 실시형태에서, E3 영역은 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 19에 기재된 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, E3 영역은 부분적으로 결실되고, 예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 결실된다.
일 실시형태에서, B2는 결합이고, 여기서 E3 영역을 암호화하는 DNA는 부재한다.
일 실시형태에서, E3 영역을 암호화하는 DNA는 전이유전자에 의해 대체되거나 중단될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "본 명세서에 사용된 바와 같은 전이유전자에 의해 대체된 E3 영역"은 전이유전자에 의해 대체된 E3 영역의 일부 또는 전부를 포함한다.
일 실시형태에서, B2 영역은 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 98(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)의 27185bp 내지 28165bp의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, B2는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 98의 27185bp 내지 28165bp의 서열로 이루어진다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 BX는 BB에서의 L5 유전자의 5' 말단의 근처에서의 DNA 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 L5 유전자의 5' 말단의 근처 또는 인접에서는 L5 유전자의 5' 말단 또는 이와 본래 연관된 비암호화 영역에 인접한(근접한), 즉 L5 유전자의 5' 프라임 말단 또는 이와 본래 연관된 비암호화 영역에 접하거나 인접한 것을 의미한다. 대안적으로, 이에 근처 또는 인접에서는 L5 유전자에 가까운 것을 의미할 수 있어서, BX 영역과 L5 유전자의 5' 말단 사이에 암호화 서열이 없다.
따라서, 일 실시형태에서, BX는, 예를 들어, L5 유전자의 암호화 서열의 시작을 나타내는 L5의 염기에 직접적으로 연결된다.
따라서, 일 실시형태에서, BX는, 예를 들어, 비암호화 서열의 시작을 나타내는 L5의 염기로 직접적으로 연결되거나, 또는 L5와 천연으로 연관된 비암호화 영역에 직접적으로 연결된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 L5와 천연으로 연관된 비암호화 영역은 L5 유전자의 일부이거나, 또는 여기서와 인접하지만 또 다른 유전자의 일부가 아닌 모든 비암호화 영역의 일부를 의미한다.
일 실시형태에서, BX는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 98의 서열을 포함한다. 이 서열은 인공 비암호화 서열이고, 여기서 예를 들어 전이유전자(또는 전이유전자 카세트), 제한 부위 또는 이들의 조합을 포함하는 DNA 서열은 여기에 삽입될 수 있다. 이 서열은, 바이러스 안정성 및 생존능력에 대한 파괴적인 효과를 최소화하면서, 전이유전자의 정확한 위치에 대한 약간의 유연성을 허용한다는 점에서, 완충제로서 작용하므로 유리하다.
인서트(들)는 5' 말단, 3' 말단으로부터 또는 bp 1 내지 201 사이의, 예를 들어, 염기 쌍 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34, 34/35, 35/36, 36/37, 37/38, 38/39, 39/40, 40/41, 41/42, 42/43, 43/44, 44/45, 45/46, 46/47, 47/48, 48/49, 49/50, 50/51, 51/52, 52/53, 53/54, 54/55, 55/56, 56/57, 57/58, 58/59, 59/60, 60/61, 61/62, 62/63, 63/64, 64/65, 65/66, 66/67, 67/68, 68/69, 69/70, 70/71, 71/72, 72/73, 73/74, 74/75, 75/76, 76/77, 77/78, 78/79, 79/80, 80/81, 81/82, 82/83, 83/84, 84/85, 85/86, 86/87, 87/88, 88/89, 89/90, 90/91, 91/92, 92/93, 93/94, 94/95, 95/96, 96/97, 97/98, 98/99, 99/100, 100/101, 101/102, 102/103, 103/104, 104/105, 105/106, 106/107, 107/108, 108/109, 109/110, 110/111, 111/112, 112/113, 113/114, 114/115, 115/116, 116/117, 117/118, 118/119, 119/120, 120/121, 121/122, 122/123, 123/124, 124/125, 125/126, 126/127, 127/128, 128/129, 129/130, 130/131, 131/132, 132/133, 133/134, 134/135, 135/136, 136/137, 137/138, 138/139, 139/140, 140/141, 141/142, 142/143, 143/144, 144/145, 145/146, 146/147, 147/148, 148/149, 150/151, 151/152, 152/153, 153/154, 154/155, 155/156, 156/157, 157/158, 158/159, 159/160, 160/161, 161/162, 162/163, 163/164, 164/165, 165/166, 166/167, 167/168, 168/169, 169/170, 170/171, 171/172, 172/173, 173/174, 174/175, 175/176, 176/177, 177/178, 178/179, 179/180, 180/181, 181/182, 182/183, 183/184, 184/185, 185/186, 186/187, 187/188, 189/190, 190/191, 191/192, 192/193, 193/194, 194/195, 195/196, 196/197, 197/198, 198/199, 199/200 또는 200/201 사이의 임의의 점에서 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 98 내의 어디서든 발생할 수 있다.
일 실시형태에서, BX는 DNA 서열이 bp 27 내지 bp 28 사이에 삽입된 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 98 또는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 98의 위치 28192bp 및 28193bp 사이에 상응하는 위치를 포함한다.
일 실시형태에서, BX는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 21(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)의 28166bp 내지 28366bp의 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, BX는 결합이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 BB는 L5 영역을 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, L5 영역은, 맥락에서 적절하게, 섬유 폴리펩타이드/단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 서열을 의미한다. 섬유 유전자/영역은 아데노바이러스의 주요 캡시드 성분인 섬유 단백질을 암호화한다. 섬유는 수용체 인식에서 기능하고, 세포에 선택적으로 결합하고 감염시키는 아데노바이러스의 능력에 기여한다.
본 개시내용의 바이러스에서, 상이한 혈청형 중 하나에 대해 섬유를 변경하는 것의 결과가 본 개시내용에 또한 고안되면서, 섬유는 임의의 아데노바이러스 혈청형 및 키메라인 아데노바이러스 기원일 수 있다. 일 실시형태에서, 섬유는 B 그룹 바이러스, 특히 Ad11, 예컨대, Ad11p 기원이다.
일 실시형태에서, BB는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)의 28367bp 내지 29344bp의 서열을 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 BY와 관련하여 DNA 서열은 BB의 L5 유전자의 3' 말단의 근처의 DNA 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 L5 유전자의 3' 말단의 근처 또는 인접에서는 L5 유전자의 3' 말단 또는 여기서와 본래 연관된 비암호화 영역에 인접한(근접한), 즉 L5 유전자의 3' 프라임 말단 또는 여기서와 본래 연관된 비암호화 영역에 접하거나 인접하다(즉, L5에 내인성인 비암호화 서열의 전부 또는 일부)는 것을 의미한다. 대안적으로, 이에 근처 또는 인접에서는 L5 유전자에 가까운 것을 의미할 수 있어서, BY 영역과 L5 유전자의 3' 말단 사이에 암호화 서열이 없다.
따라서, 일 실시형태에서, BY는 암호화 서열의 "말단"을 나타내는 L5의 염기로 직접적으로 연결된다.
따라서, 일 실시형태에서, BY는 비암호화 서열의 "말단"을 나타내는 L5의 염기로 직접적으로 연결되거나, 또는 L5와 천연으로 연관된 비암호화 영역에 직접적으로 연결된다.
본래 그리고 자연적으로는 본 명세서에서 상호 교환되어 사용된다. 일 실시형태에서, BY는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 99(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)의 서열을 포함한다. 이 서열은 비암호화 서열이고, 여기서 예를 들어 전이유전자(또는 전이유전자 카세트), 제한 부위 또는 이들의 조합을 포함하는 DNA 서열은 삽입될 수 있다. 이 서열은, 바이러스 안정성 및 생존능력에 대한 파괴적인 효과를 최소화하면서, 전이유전자의 정확한 위치에 대한 약간의 유연성을 허용한다는 점에서, 완충제로서 작용하므로 유리하다.
인서트(들)는 5' 말단, 3' 말단으로부터 또는 bp 1 내지 35 사이의, 예를 들어, 염기 쌍 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34, 또는 34/35 사이의 임의의 점에서 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 18(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨) 내의 어디서든 발생할 수 있다.
일 실시형태에서 BY는 위치 bp 12 및 13 사이에 삽입된 DNA 서열 또는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)에서의 29356bp 및 29357bp에 상응하는 장소를 갖는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 99(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)를 포함한다. 일 실시형태에서, 인서트는 제한 부위 인서트이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 인서트는 1개 또는 2개의 제한 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 제한 부위는 2개의 제한 부위를 포함하는 19bp 제한 부위 인서트이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 인서트는 1개의 제한 부위를 포함하는 9bp 제한 부위 인서트이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 인서트는 1개 또는 2개의 제한 부위 및 적어도 1개의 전이유전자, 예를 들어, 1개 또는 2개 또는 3개의 전이유전자, 예컨대, 1개 또는 2개의 전이유전자를 포함한다. 일 실시형태에서, 제한 부위는 2개의 제한 부위 및 적어도 1개의 전이유전자, 예를 들어, 1개 또는 2개의 전이유전자를 포함하는 19bp 제한 부위 인서트이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 인서트는 1개의 제한 부위 및 적어도 1개의 전이유전자, 예를 들어, 1개 또는 2개의 전이유전자를 포함하는 9bp 제한 부위 인서트이다. 일 실시형태에서, 2개의 제한 부위는 (예를 들어, 전이유전자 카세트에서) 1개 이상, 예컨대, 2개의 전이유전자를 샌드위칭시킨다. 일 실시형태에서, BY가 2개의 제한 부위를 포함할 때, 상기 제한 부위는 서로로부터 상이하다. 일 실시형태에서, BY에서의 상기 하나 이상의 제한 부위는 이들이 삽입된 특정한 아데노바이러스 게놈에서 천연 비발생이다(예컨대, 고유하다). 일 실시형태에서, BY에서의 상기 하나 이상의 제한 부위는 아데노바이러스 게놈에서 그 외 위치한 다른 제한 부위와 상이하고, 예를 들어, 천연 발생 제한 부위 또는 BX와 같은 게놈의 다른 부분으로 도입된 제한 부위와 상이하다. 따라서, 일 실시형태에서, 제한 부위 또는 부위들은 섹션에서의 DNA가 특이적으로 절단되게 한다.
일 실시형태에서, BY는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17의 29345bp 내지 29379bp의 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, BY는 결합이다.
일 실시형태에서, 인서트는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 99에서 bp 12 후이다.
일 실시형태에서, 인서트는 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17의 약 위치 29356bp에 있다.
일 실시형태에서, 인서트는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개 또는 3개, 예컨대, 1개 또는 2개의 전이유전자를 포함하는 전이유전자 카세트이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 E4는 아데노바이러스 E4 영역(즉, 폴리펩타이드/단백질 영역)의 일부 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열을 의미하고, 이것은 돌연변이될 수 있어서, E4 유전자에 의해 암호화된 단백질은 보존적 또는 비보존적 아미노산 변화(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화, 부가 및/또는 결실)를 갖고, 이것은 야생형과 동일한 기능(즉, 상응하는 비돌연변이된 단백질)을 갖거나; 야생형 단백질과 비교하여 증가된 기능을 갖거나; 야생형 단백질과 비교하여 감소된 기능을 갖거나, 예컨대, 기능이 없거나; 야생형 단백질과 비교하여 새로운 기능 또는 적절한 경우 이들의 조합을 갖는다.
일 실시형태에서, E4 영역은 부분적으로 결실되고, 예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 결실된다. 일 실시형태에서, E4 영역은 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17의 32188bp 내지 29380bp의 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, E4는 결실된 E4orf4 영역을 제외하고 존재한다.
일 실시형태에서, B3은 결합이고, 즉 여기서 E4는 부재한다.
일 실시형태에서, B3은 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 17의 32188bp 내지 29380bp로 이루어진 서열을 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 숫자 범위는 종점을 포함한다.
숙련자는 본 명세서에서 화학식, 예컨대, 화학식 (I), (Ia)에서의 요소가 인접하고, 비암호화 DNA 서열, 및 본 명세서에 언급된 유전자 및 암호화 DNA 서열(구조 특징)을 구현할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 하나 이상의 실시형태에서, 본 개시내용의 화학식은 아데노바이러스 게놈에서 천연 발생 서열을 기재하려고 시도한다. 이 맥락에서, 화학식이 게놈의 관련 섹션을 특징으로 하는 주요 요소를 언급하고, DNA의 게놈 스트레치의 배타적인 설명이 되도록 의도되지 않는다는 것이 숙련자에게 명확할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 E1A, E1B, E3 및 E4는 각각 독립적으로 이의 야생형 및 균등물, 본 명세서에 기재된 바와 같은 각각의 영역, 특히 공지된 아데노바이러스로부터의 야생형 서열의 돌연변이된 또는 부분적으로 결실된 형태를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "인서트"는 기준 서열을 중단시키도록 5' 말단, 3' 말단에서 또는 소정의 DNA 서열 기준 분절 내에 도입된 DNA 서열을 의미한다. 기준 서열은 인서트가 위치한 것과 대한 기준점으로서 사용된다. 본 개시내용의 맥락에서 인서트는 일반적으로 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 98 또는 서열번호 99 둘 다 내에 발생한다. 인서트는 일반적으로 전이유전자 카세트를 함유할 것이다. 서열이 중단될 때, 바이러스는 여전히 원래의 서열을 포함하지만, 일반적으로 이것은 인서트를 샌드위칭하는 2개의 단편일 것이다.
일 실시형태에서, 전이유전자 또는 전이유전자 카세트는 비바이어싱된 삽입 트랜스포슨, 예컨대, TN7 트랜스포슨 또는 이의 일부를 포함하지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 Tn7 트랜스포슨은 WO 제2008/080003호에 기재된 바와 같은 비바이어싱된 삽입 트랜스포슨을 의미한다.
일 실시형태에서, 전이유전자 또는 전이유전자 카세트는 조절 요소 또는 서열을 추가로 포함한다.
촉진자
본 명세서에 사용된 바와 같은 촉진자는 특정한 유전자 또는 유전자들의 전사를 개시시키는 DNA의 영역을 의미한다. 촉진자는 일반적으로 이것이 동일한 가닥에서 그리고 DNA에 상류로(즉, 5'로) 전사하는 유전자의 근위에 위치한다. 이 맥락에서 사용된 바와 같은 근위는 촉진자로서 작용하기에 충분히 가까움을 의미한다. 일 실시형태에서, 촉진자는 전사 시작 부위의 100bp 내이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같은 내인성 촉진자는 전이유전자가 삽입되는 아데노바이러스(또는 작제물)에서 천연적으로 발생하는(즉, 이것에 네이티브인) 촉진자를 의미한다. 하나 이상의 실시형태에서, 사용된 내인성 촉진자는 바이러스 게놈에서 이의 원래의 위치에서 바이러스에서 천연 발생 촉진자이고, 특히 이것은 전이유전자 또는 전이유전자들의 발현에서 사용되는 주요한 또는 유일한 촉진자이다. 일 실시형태에서, 전이유전자의 번역 및 선택적으로 전사를 촉진하도록 사용된 내인성 촉진자는 거주하는 것이고, 즉 아데노바이러스의 게놈에서 통합되고 재조합 기법에 의해 이전에 도입되지 않은 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 내인성 촉진자의 제어 하에는 전이유전자/전이유전자 카세트가 상기 내인성 촉진자의 제어 하에 있는 적절한 배향으로 삽입되는 경우를 의미한다. 즉, 촉진자가 일반적으로 안티센스 가닥에 있는 경우, 카세트는, 예를 들어, 안티센스 배향으로 삽입된다.
그렇긴 해도, 유전자는 2개의 배향 중 하나로 발현될 수 있다. 그러나, 일반적으로 하나의 배향은 소정의(특정한) 전이유전자에 대해 다른 배향에 비해 증가한 발현 수준을 제공한다.
일 실시형태에서, 카세트는 센스 방향으로 있다. 이것은 5'→3' 방향으로 전사된다. 일 실시형태에서, 카세트는 안티센스 방향으로 있다. 이것은 3'→5' 방향으로 전사된다.
바이러스에서의 내인성 촉진자는, 예를 들어, 전이유전자 및 스플라이스 억셉터 서열을 암호화하는 유전자를 사용함으로써 사용될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 카세트는 내인성 촉진자를 사용하여 전이유전자를 수월하게 하는 스플라이스 억셉터 서열을 포함할 것이다. 따라서. 일 실시형태에서, 암호화 서열, 예를 들어, 항체 또는 항체 결합 단편을 암호화하는 서열은 스플라이스 억셉터 서열을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 전이유전자, 전이유전자들, 또는 전이유전자 카세트는 E4 촉진자 또는 주요 후기 촉진자, 예컨대, 주요 후기 촉진자(ML 촉진자)의 제어 하에 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 제어 하에는, 특정한 촉진자가 기술할 때, 전이유전자가 활성화된다, 즉 전사된다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 주요 후기 촉진자(ML 촉진자 또는 MLP)는 "후기 발현된" 유전자, 예컨대, L5 유전자의 발현을 제어하는 아데노바이러스 촉진자를 의미한다. MLP는 "센스 가닥" 촉진자이다. 즉, 촉진자는 5'→3' 방향에서 촉진자의 하류인 유전자에 영향을 미친다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 주요 후기 촉진자는 바이러스 게놈에 위치한 원래의 주요 후기 촉진자를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 E4 촉진자는 E4 영역의 아데노바이러스 촉진자를 의미한다. E4 영역은 안티센스 영역이고, 따라서 촉진자는 안티센스 촉진자이다. 즉, 촉진자는 3'→5' 방향에서 E4 영역의 상류이다. 따라서, E4 촉진자의 제어 하의 임의의 전이유전자 카세트는 적절히 배향될 필요가 있을 수 있다. 일 실시형태에서, E4 촉진자의 제어 하의 카세트는 안티센스 배향으로 있다. 일 실시형태에서, 카세트는 센스 배향으로 E4 촉진자의 제어 하에 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 E4 촉진자는 바이러스 게놈에 위치한 원래의 E4 촉진자를 의미한다.
따라서, 일 실시형태에서, 복제 가능 종양용해성 아데노바이러스 혈청형 11(예컨대, Ad11p) 또는 이의 바이러스 유도체가 제공되고, 여기서 섬유, 헥손 및 캡시드는 혈청형 11(예컨대, Ad11p)이고, 바이러스 게놈은 치료학적 항체 또는 항체 결합 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함하고, 상기 DNA 서열은 E4 및 주요 후기 촉진자(즉, E4 촉진자 또는 주요 후기 촉진자)로 이루어진 것으로부터 선택된 아데노바이러스에 내인성인 촉진자의 제어 하에 있고, 전이유전자는 바이러스 복제를 방해하지 않고, 예를 들어, L5 영역과 연관되고(즉, 상기 영역 전에 또는 후에), 예컨대, 바이러스 게놈에서 L5 후에 위치한다.
일 실시형태에서, 내인성 촉진자는 재조합 기법에 의해 원하는 위치에서 바이러스 게놈으로 도입되고, 예를 들어, 전이유전자 카세트에서 도입된다. 그러나, 본 명세서의 맥락에서 이 배열은 일반적으로 외인성 촉진자라 칭해질 것이다.
일 실시형태에서, 전이유전자 카세트는 외인성 촉진자를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 외인성 촉진자는 전이유전자가 삽입되는 아데노바이러스에서 천연 발생이 아닌 촉진자를 의미한다. 통상적으로 외인성 촉진자는 다른 바이러스 기원이거나, 포유류 촉진자이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 외인성 촉진자는 보통 유전자의 전사를 조절하는 관심 대상의 유전자의 상류에 위치한 DNA 요소를 의미한다.
일 실시형태에서, 유전자 발현의 조절자는 외인성 촉진자, 예를 들어, CMV(사이토메갈로바이러스 촉진자), CBA(닭 베타 액틴 촉진자) 또는 PGK(포스포글라이세레이트 키나제 1 촉진자), 예컨대, CMV 촉진자이다.
일 실시형태에서, 외인성 촉진자는 유도성이다.
일 실시형태에서, 복제 가능 종양용해성 아데노바이러스 혈청형 11(예컨대, Ad11p) 또는 이의 바이러스 유도체가 제공되고, 여기서 섬유, 헥손 및 캡시드는 혈청형 11(예컨대, Ad11p)이고, 바이러스 게놈은 바이러스 복제 사이클에서 후기 발현된 바이러스 게놈의 일부에 위치한 치료학적 항체 또는 항체 결합 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함하고, 그래서 전이유전자는 바이러스 복제를 방해하지 않고, 상기 DNA 서열은 아데노바이러스에 외인성인 촉진자(예를 들어, CMV 촉진자)의 제어 하에 있다. 일 실시형태에서, 항체 또는 단편을 암호화하는 DNA 서열은 본 명세서에서 그 외 기재된 바와 같이 L5 영역과 연관된다.
다른 조절 서열
본 명세서에 사용된 바와 같은 "유전자 발현의 조절자"(또는 조절자/조절 요소)는 통상적으로 전사 또는 번역을 개시하거나 증대시킴으로써 유전자 발현에서 역할을 하는 유전자 요소, 예컨대, 촉진자, 인핸서 또는 스플라이스 억셉터 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "스플라이스 억셉터 서열", "스플라이스 억셉터" 또는 "스플라이스 부위"는 mRNA 분자가 스플라이소솜 복합체의 작은 핵 리보핵단백질에 의해 인식될 때를 결정하는 조절 서열을 의미한다. 일단 조립되면, 스플라이소솜은 단일 폴리펩타이드 또는 단백질을 제조하도록 번역될 수 있는 성숙 mRNA 분자를 제조하는 상류 스플라이스 도너 부위에 mRNA 분자의 스플라이스 억셉터 부위 사이의 스플라이싱을 촉매한다.
상이한 크기의 스플라이스 억셉터 서열은 본 발명에서 사용될 수 있고, 이들은 짧은 스플라이스 억셉터(소형), 스플라이스 억셉터(중형) 및 분지된 스플라이스 억셉터(대형)로서 기재될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 SSA는 통상적으로 바로 스플라이스 부위, 예를 들어, 4bp를 포함하는 짧은 스플라이스 억셉터를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 SA는 통상적으로 짧은 스플라이스 억셉터 및 폴리피리미딘 트랙, 예를 들어, 16bp를 포함하는 스플라이스 억셉터를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 bSA는 통상적으로 짧은 스플라이스 억셉터, 폴리피리미딘 트랙 및 분지 점, 예를 들어, 26bp를 포함하는 분지된 스플라이스 억셉터를 의미한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물에서 사용된 스플라이스 억셉터는 CAGG 또는 서열번호 15 또는 16(둘 다 여기서 서열번호 10 및 11로서 WO 제2016/174200호에 개시됨, 상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)이다. 일 실시형태에서, SSA는 CAGG의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, SA는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, bSA는 cagg의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, 스플라이스 억셉터 서열은 tgctaatctt cctttctctc ttcagg(서열번호 15), tttctctctt cagg(서열번호 16) 및 cagg를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시형태에서, 스플라이스 부위는 CCACC를 포함하는 공통 코작 서열에 바로 진행된다(즉, 5'→3' 방향으로 이어진다). 일 실시형태에서, 스플라이스 부위 및 코작 서열은 100bp 이하까지 산재(분리)된다. 일 실시형태에서, 코작 서열은 CCACC의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
통상적으로, 내인성 또는 외인성 촉진자(예컨대, 내인성 촉진자)의 제어 하일 때, 암호화 서열은 코작 서열이 바로 진행될 것이다. 암호화 영역의 시작은 개시 코돈(AUG)으로 표시되고, 예를 들어, 서열 (gcc)gccRccAUGg(서열번호 8)의 맥락에 있고, 암호화 서열의 시작은 볼드체로 염기에 의해 표시된다. 소문자는 이 위치에서 공통 염기(그럼에도 불구하고 변할 수 있음)를 나타내고, 대문자는 고도로 보존된 염기를 나타내고, 즉 'AUGG' 서열은 일정하거나 드물게는, 설령 있어도, 변하고; 'R'은 퓨린(아데닌 또는 구아닌)이 이 위치에서 보통 관찰된다는 것을 나타내고, 괄호 내의 서열(gcc)은 불확실한 유의도를 갖는다. 따라서, 일 실시형태에서, 개시 코돈 AUG는 코작 서열로 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 내부 리보솜 진입(Internal Ribosome Entry) DNA 서열은 내부 리보솜 진입 서열(IRES)을 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 IRES는 mRNA 서열 내에 시작하는 개시를 포함하는 번역의 개시에 대해 메신저 RNA(mRNA) 서열을 허용하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이는 카세트가 폴리시스트론성 mRNA를 암호화할 때 특히 유용하다. IRES의 사용은 다수의 개별 단백질 또는 펩타이드로 번역되는 폴리시스트론성 mRNA를 생성시킨다. 일 실시형태에서, 내부 리보솜 진입 DNA 서열은 여기서 서열번호 6으로서 WO 제2016/174200호에 개시된 뉴클레오타이드 서열(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)을 갖는다. 일 실시형태에서, 특정한 IRES는 게놈에서 한번 사용되는 것이다. 이는 게놈의 안정성과 관련하여 이익을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "높은 자가 절단 가능한 효율 2A 펩타이드" 또는 "2A 펩타이드"는 번역 이후에 효율적으로 절단되는 펩타이드를 의미한다. 적합한 2A 펩타이드는 P2A, F2A, E2A 및 T2A를 포함한다. 본 발명자들은, 소정의 2A 펩타이드를 암호화하는 특이적 DNA 서열이 일단 한번 사용되면, 동일한 특이적 DNA 서열이 재차 사용되지 않을 수 있다는 것에 주목한다. 그러나, DNA 코드의 중복성은 동일한 2A 펩타이드로 번역되는 DNA 서열을 생성하도록 사용될 수 있다. 2A 펩타이드의 사용은 카세트가 폴리시스트론성 mRNA를 암호화할 때 특히 유용하다. 2A 펩타이드의 사용은 다수의 개별 단백질 또는 펩타이드를 생성시키도록 번역 후 변형되는 번역되는 단일 폴리펩타이드 사슬을 생성시킨다.
일 실시형태에서, 사용되는 암호화된 P2A 펩타이드는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, 사용되는 암호화된 F2A 펩타이드는 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, 사용되는 암호화된 E2A 펩타이드는 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, 사용되는 암호화된 T2A 펩타이드는 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, 예를 들어, 서열번호 10에 기재된 바와 같은, 예컨대, 통상적으로 mRNA 서열의 말단에서, 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는, 전이유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 각각의 mRNA를 사용한다. 따라서, 일 실시형태에서, 전이유전자 또는 전이유전자 카세트는 폴리아데닐화 신호 서열을 암호화하는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "polyA", "폴리아데닐화 신호" 또는 "폴리아데닐화 서열"은 일단 전사되면 초기 mRNA 분자를 절단시키고 폴리아데닐화시키는 멀티단백질 복합체에 의해 인식될 수 있는 AATAAA 부위를 보통 함유하는 DNA 서열을 의미한다.
일 실시형태에서, 폴리아데닐화 서열은 WO 제2016/174200호에 개시된 서열번호 6(상기 서열은 본 명세서에 참고로 원용됨)의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, 작제물은 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 유전자 발현의 조절자는 스플라이스 억셉터 서열이다.
일 실시형태에서, 단백질/폴리펩타이드/펩타이드, 예컨대, 항체 또는 항체 결합 단편을 암호화하는 서열은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
제제
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스의 약제학적 제제에 관한 것이고, 또한 이것으로 연장된다.
일 실시형태에서, 예를 들어, 본 개시내용에 따른 복제 가능 종양용해성 바이러스의 점적주사 또는 주사를 위한 액체 비경구 제제가 제공되고, 제제는 용량의 용적당 1×1010 내지 1×1014의 바이러스 입자의 범위의 용량을 제공한다.
비경구 제제는 GI 관을 통해 전달되지 않도록 설계된 제제를 의미한다. 통상적인 비경구 전달 경로는 주사, 이식 또는 점적주사를 포함한다. 일 실시형태에서, 제제는 볼루스 전달을 위한 형태로 제공된다.
일 실시형태에서, 비경구 제제는 주사의 형태이다. 주사는 정맥내, 피하, 종양내 또는 근육내 주사를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 주사는 주사기를 통한 신체로의 액체의 삽입을 의미한다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 종양내 주사를 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 비경구 제제는 점적주사의 형태이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 점적주사는 드립, 점적주사 펌프, 주사기 드라이버 또는 균등한 장치에 의해 더 느린 속도에서의 유체의 투여를 의미한다. 일 실시형태에서, 점적주사는 1.5분 내지 120분의 범위의 기간, 예컨대, 약 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분, 16분, 17분, 18분, 19분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 65분, 80분, 85분, 90분, 95분, 100분, 105분, 110분 또는 115분에 걸쳐 투여된다.
일 실시형태에서, 100ml 미만, 예를 들어, 30㎖의 제제의 일 용량은, 예컨대, 주사기 드라이버에 의해 투여된다.
일 실시형태에서, 주사는, 예를 들어, 1.5 내지 30분의 기간에 걸쳐 느린 주사로서 투여된다.
일 실시형태에서, 제제는 정맥내(i.v.) 투여를 위한 것이다. 이 경로는 종양용해성 바이러스의 전달에 특히 효과적인데, 왜냐하면 이것이 대부분의 기관 및 조직에 신속한 접근을 허용하고, 전이, 예를 들어, 확립된 전이, 특히 고도로 맥관화된 영역, 예컨대, 간 및 폐에서 위치한 것의 치료에 특히 유용하다.
치료학적 제제는 통상적으로 제조 및 저장의 조건 하에 무균이고 안정할 것이다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포솜, 또는 인간에 대한 투여에 적합한 다른 비경구 제제로서 제제화될 수 있고, 프리필드 장치, 예컨대, 주사기 또는 바이알로서, 특정한 단일 용량으로서 제제화될 수 있다.
제제는 일반적으로 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체, 예를 들어, 바이러스와 상용성이고, 바이러스가 필요한 시간 기간 동안 안정한 비독성 등장성 담체를 포함할 것이다.
담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 및 적합한 이들의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 분산제 또는 계면활성제, 예컨대, 레시틴 또는 비이온 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 80 또는 40의 사용에 의해 유지될 수 있다. 분산에서, 필요한 입자 크기의 유지는 계면활성제의 존재에 의해 보조될 수 있다. 등장성 물질의 예는 조성물 중의 당, 다가알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함한다.
일 실시형태에서, 사용되는 비경구 제제는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 완충제, 예를 들어, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, 포스페이트 완충제 및/또는 트리스 완충제, 당, 예를 들어, 덱스트로스, 만노스, 수크로스 또는 유사물, 염, 예컨대, 염화나트륨, 염화마그네슘 또는 염화칼륨, 세제, 예컨대, 비이온 계면활성제, 예컨대, brij, PS-80, PS-40 또는 유사물. 제제는 또한 가능한 분해의 하나 이상의 경로를 막는다고 생각되는 보존제, 예컨대, EDTA 또는 에탄올 또는 EDTA 및 에탄올의 조합을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제제는 본 개시내용에 따른 정제된 종양용해성 바이러스, 예를 들어, 용량당 1×1010 내지 1×1014의 바이러스 입자, 예컨대, 용량당 1×1010 내지 1×1012의 바이러스 입자를 포함할 것이다. 일 실시형태에서, 제제에서의 바이러스의 농도는 2×108 내지 2×1014vp/㎖, 예컨대, 2×1012vp/㎖의 범위이다.
일 실시형태에서, 비경구 제제는 글리세롤을 포함한다.
일 실시형태에서, 제제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양용해성 아데노바이러스, HEPES(N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산), 글리세롤 및 완충제를 포함한다.
일 실시형태에서, 비경구 제제는 본 개시내용의 바이러스, HEPES, 예를 들어, 5mM, 글리세롤, 예를 들어, 5 내지 20%(v/v)의, 예를 들어, pH를 7 내지 8의 범위로 조정하기 위한 염산 및 주사용수로 이루어진다.
일 실시형태에서, 2×1012vp/㎖의 농도에서의 본 개시내용의 바이러스의 0.7㎖는 7.8의 최종 pH로 5mM HEPES, 20% 글리세롤 중에 희석된다.
약제학적으로 허용 가능한 담체의 완전한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 이용 가능하다.
일 실시형태에서, 제제는 흡입을 포함하는 국소 투여를 위한 제제로서 제공된다.
적합한 흡입 가능한 제제는 흡입 가능한 분말, 추진제 가스를 함유하는 계량 에어로졸 또는 추진제 가스가 없는 흡입 가능한 용액을 포함한다. 본 개시내용에 따른 흡입 가능한 분말은 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스와 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 함유할 것이다.
이 흡입 가능한 분말은 단당류(예를 들어, 글루코스 또는 아라비노스), 이당류(예를 들어, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고당 및 다당류(예를 들어, 덱스트란), 다가알코올(예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들어, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이것과 서로의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류, 예컨대, 락토스 또는 글루코스(특히 그러나 배타적으로 이들의 수화물의 형태는 아님)를 적합하게 사용한다.
폐에서의 침착을 위한 입자는 10마이크론 미만, 예컨대, 1 내지 9마이크론, 예를 들어, 0.1 내지 5㎛, 특히 1 내지 5㎛의 입자 크기를 요한다. 바이러스를 보유하는 입자의 크기는 가장 중요하고, 따라서 일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스는 입자, 예컨대, 소정의 크기의 락토스 입자로 흡착되거나 흡수될 수 있다.
흡입 가능한 에어로졸을 제조하기 위해 사용될 수 있는 추진제 가스는 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 추진제 가스는 탄화수소, 예컨대, n-프로판, n-뷰탄 또는 아이소뷰탄 및 염류탄화수소, 예컨대, 메탄, 에탄, 프로판, 뷰탄, 사이클로프로판 또는 사이클로뷰탄의 클로르화 및/또는 불화 유도체 중에서 선택된다. 상기 언급된 추진제 가스는 스스로 또는 이들의 혼합물로 사용될 수 있다.
특히 적합한 추진제 가스는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227 중에서 선택된 할로겐화 알칸 유도체이다. 상기 언급된 할로겐화 탄화수소 중에서, TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이들의 혼합물이 특히 적합하다.
추진제 가스 함유 흡입 가능한 에어로졸은 또한 다른 성분, 예컨대, 공용매, 안정화제, 표면 활성제(계면활성제), 항산화제, 활택제 및 pH를 조정하기 위한 수단을 함유할 수 있다. 모든 이들 성분은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 추진제 가스 함유 흡입 가능한 에어로졸은 5중량% 이하의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은, 예를 들어, 0.002 내지 5중량%, 0.01 내지 3중량%, 0.015 내지 2중량%, 0.1 내지 2중량%, 0.5 내지 2중량% 또는 0.5 내지 1중량%의 활성 성분을 함유한다.
대안적으로, 폐로의 국소 투여는 또한, 예를 들어, 분무기, 예를 들어, 컴프레서에 연결된 분무기(예를 들어, Pari Respiratory Equipment, Inc.(버지니아주 리치몬드)에 의해 제조된 Pari Master(R) 컴프레서에 연결된 Pari LC-Jet Plus(R) 분무기)와 같은 장치를 사용하여 액체 용액 또는 현탁액 제제의 투여에 의할 수 있다.
본 발명의 바이러스는, 예를 들어, 비경구 제제에 대해 이미 상기 기재된 바대로, 예를 들어, 용액 또는 현탁액의 형태로 용매 중에 분산되어 전달될 수 있다. 이것을 적절한 생리학적 용액, 예를 들어, 식염수 또는 다른 약리학적으로 허용 가능한 용매 또는 완충 용액 중에 현탁시킬 수 있다. 당해 분야에 공지된 완충 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하도록 1㎖의 물당 0.05㎎ 내지 0.15㎎의 이나트륨 에데테이트, 8.0㎎ 내지 9.0㎎의 NaCl, 0.15㎎ 내지 0.25㎎의 폴리소르베이트, 0.25㎎ 내지 0.30㎎의 무수 시트르산 및 0.45㎎ 내지 0.55㎎의 시트르산나트륨을 함유할 수 있다.
치료학적 현탁액 또는 용액 제제는 또한 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 완충제(예를 들어, 시트르산염 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제 및 중탄산염 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포솜, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포솜 또는 생체분해성 마이크로구에 캡슐화될 수 있다. 제제는 일반적으로 무균 제조 공정을 이용하여 실질적으로 무균인 형태로 제공될 것이다.
이것은 당업자에게 친숙한 방법에 의해 제조 및 제제에 사용되는 완충 용매/용액의 여과에 의한 살균, 무균 완충 용매 용액 중의 항체의 무균 현탁 및 무균 리셉터클로의 제제의 분산을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따른 분무 가능한 제제는, 예를 들어, 호일 엔벨로프에 패키징된 단일 용량 단위(예를 들어, 밀봉된 플라스틱 컨테이너 또는 바이알)로서 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 용적, 예를 들어, 용매/용액 완충제의 2mL에서 단위 용량을 함유한다.
본 개시내용은 또한, 예를 들어, WO 제2009/068877호 및 US 제2004/0153033호(둘 다 본 명세서에 참고로 원용됨)에 개시된 바와 같은 장치를 사용하여 비강내로 전달되는 액체 용액 또는 현탁액으로 연장된다.
치료
추가의 양태에서, 본 개시내용은 치료에서 사용하기 위한, 특히 암의 치료를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 이의 제제로 연장된다.
일 실시형태에서, 치료의 방법은 종양의 치료에서 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 종양은 신생물이라고도 불리는 제어되지 않고 진행성인 과도한 세포 분열로부터 생긴 비정상 조직 덩어리를 의미하도록 의도된다. 종양은 양성(암성이 아님) 또는 악성일 수 있다. 종양은 암의 모든 형태 및 전이를 포함한다. 일 실시형태에서, 종양은 암성이다.
일 실시형태에서, 종양은 고체 종양이다. 고체 종양은 국소화되거나 전이될 수 있다.
일 실시형태에서, 종양은 상피 기원이다.
일 실시형태에서, 종양은 악성종양, 예컨대, 결장직장암, 간세포암, 전립선암, 췌장암, 유방암, 난소암, 갑상선암, 신장암, 방광암, 두경부암 또는 페암이다.
일 실시형태에서, 종양은 결장직장 악성종양이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 악성종양은 암성 세포를 의미한다.
일 실시형태에서, 종양용해성 아데노바이러스는 전이의 치료 또는 예방에 사용된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 방법 또는 제제는 약물 내성 암의 치료에서 사용된다.
일 실시형태에서, 바이러스는 추가의 암 치료 또는 치료제의 투여와 조합되어 투여된다.
일 실시형태에서, 암, 예를 들어, 상기 기재된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 제제가 제공된다.
추가의 양태에서, 본 개시내용에 따른 치료학적 유효량의 바이러스 또는 제제를 이를 필요로 하는 환자, 예를 들어, 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 종양용해성 바이러스 또는 제제는 또 다른 치료제와 조합되어 투여된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "조합되어"는 종양용해성 바이러스가 암 치료 또는 치료제 전에, 동반하여 및/또는 후에 투여되는 경우를 포함하도록 의도된다. 그러나, 일반적으로, 병용 요법을 위한 치료 섭생은 일반적으로 중첩될 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "병용 치료"는 특히 암의 치료에서 사용하기 위해, 예를 들어, 키트로서, 또는 동시제제화된 함께 2개의 약물 생성물을 의미한다.
암 치료는 수술, 방사선 치료, 표적화된 치료 및/또는 화학요법을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 암 치료는 치료학적 화합물 또는 생물학적 물질, 예를 들어, 암을 치료하도록 의도되는 항체에 의한 치료 및/또는 이의 유지 치료를 의미한다.
일 실시형태에서, 암 치료는 화학치료제; 표적화된 항암제, 예컨대, 항체 약물 접합체; 방사선 치료, 방사성 동위원소 치료 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 임의의 다른 항암 치료제로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스, 예컨대, 종양용해성 아데노바이러스는, 예를 들어, 종양을 수축시키기 위해, 예를 들어, 전이를 치료하기 위해 및/또는 전이 또는 추가의 전이를 방지하기 위해 치료에 대한 전치료, 예컨대, 수술(신보강 치료)로서 사용될 수 있다. 종양용해성 아데노바이러스는, 예를 들어, 암을 관해에서 유지시키도록, 전이를 치료하기 위해 및/또는 전이 또는 추가의 전이를 방지하기 위해 치료, 예컨대, 수술(보강 치료) 후 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 또는 제제는 유지 치료에서 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 동반하여는 종양용해성 아데노바이러스 제제와 동시의 또는 대략 동시의 추가적인 암 치료의 투여이다. 치료는 동일한 제제 내에 함유되거나 별개의 제제로서 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 바이러스는 화학치료제의 투여와 조합되어 투여된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 화학치료제는 악성 세포 및 조직에 선택적으로 파괴적인 구체적인 항종양성 화학 물질 또는 약물을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 알킬화제, 대사길항제, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포아이소머라제 저해제 및 다른 항종양 물질. 구체적인 화학치료제의 예는 독소루비신, 5-플루오로유라실(5-FU), 파클리탁셀, 카펙시타빈, 이리노테칸 및 플라틴류, 예컨대, 시스플라틴 및 옥살리플라틴을 포함한다. 용량은 료되는 암의 성질에 기초하여 의사에 의해 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 치료제는 면역 반응 및/또는 종양 맥관화를 제어하는 데 도울 수 있는 간시클로버이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 방법에 사용되는 하나 이상의 치료는, 대개 치료의 다른 방법과 동반하여 주어지는, 낮은 용량의 항암 약물에 의한 지속적인 또는 빈번한 치료인 메트로놈(metronomic)이다.
B 하위그룹 종양용해성 아데노바이러스, 특히 Ad11 및 이로부터 유래된 것, 예컨대, EnAd는 주로 괴사용해성인 기전에 의한 암 세포의 사멸인 아폽토시스에 대부분 독립적인 작용 기전을 갖는 것으로 보이므로 화학요법과 특히 상승적일 수 있다. 더구나, 화학요법 동안 생기는 면역억제는 더 큰 효율로 종양용해성 바이러스가 작용하게 할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 치료학적 용량은 적합한 치료 섭생에서 사용될 때 의도된 치료학적 효과를 달성하기에 적합한, 예를 들어, 특히 용량 제한 부작용을 유발하지 않으면서 질환의 증상 또는 컨디션을 개선하는 바이러스, 예컨대, 종양용해성 아데노바이러스의 양을 의미한다. 바이러스 입자의 수가 하기를 발생시키기에 충분할 수 있을 때, 용량은 암 또는 전이의 치료에서 치료학적 용량인 것으로 생각될 수 있다: 종양 또는 전이성 성장은 느려지거나 중단되거나, 또는 종양 또는 전이는 크기가 수축하는 것으로 발견되고/되거나, 환자의 수명은 연장된다. 적합한 치료학적 용량은 일반적으로, 예를 들어, 부작용 및 독성이 치료에 의해 달성된 이익을 고려하여 관용적일 때, 치료학적 효과와 관용적인 독성 사이의 균형이다.
일 실시형태에서, 단일 치료 사이클에서 본 개시내용에 따른 종양용해성 아데노바이러스의 비경구 제제의 다수의 용량을 전신으로 투여하는 것이 제공되고, 여기서 예를 들어 각각의 투여에서 주어진 전체 용량은 용량당 1×1010 내지 1×1014개의 바이러스 입자의 범위이다.
일 실시형태에서, 바이러스 또는 이를 포함하는 조성물의 하나 이상의 용량(예를 들어, 각각의 용량)은 바이러스 입자 전달의 속도가 분당 2×1010개의 입자 내지 분당 2×1012개의 입자의 범위가 되도록 투여된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 치료학적 작제물(이를 포함하는 제제를 포함)은 주마다 투여되고, 예를 들어, 1주 1회 용량이 제1일, 제3일, 제5일에 투여된 후, 각각의 후속하는 주에 1회 용량이 투여된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 치료학적 작제물(이를 포함하는 제제를 포함)은 2주마다 또는 3주마다 투여되고, 예를 들어, 제1일, 제3일 및 제5일에 1주 1회 투여되고, 2주 또는 3주에 또한 이의 제1일, 제3일 및 제5일에 투여된다. 이 투약 섭생은 적절하게 수회 반복될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 치료학적 작제물(이를 포함하는 제제를 포함)은 달마다, 예를 들어, 치료 사이클에서 또는 유지 치료로서 투여된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 및 작제물은 재조합 기법에 의해 제조된다. 숙련자는 무장된 아데노바이러스 게놈이 모든 게놈의 일부를 포함하는 게놈 또는 플라스미드를 전부 합성하는 것을 포함하는 다른 기술 수단에 의해 제조될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 숙련자는, 제한 부위 뉴클레오타이드가 클로닝 방법을 이용하여 유전자의 삽입 이후에 인공물이므로, 게놈을 합성하는 경우에 삽입의 영역이 제한 부위 뉴클레오타이드를 포함하지 않을 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일 실시형태에서, 무장된 아데노바이러스 게놈은 전부 합성으로 제조된다.
본 명세서에서 본 개시내용은 전이유전자 또는 전이유전자 카세트를 삽입하는 것으로부터 수득된 또는 수득 가능한 화학식 (I) 또는 이의 하위화학식의 아데노바이러스로 추가로 연장된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "이다"는 포함하다는 의미한다.
본 명세서의 맥락에서 "포함하는"은 "함유하는"으로서 해석되어야 한다.
소정의 특징/요소를 포함하는 본 발명의 실시형태는 또한 관련 특징/요소로 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진" 대안적인 실시형태로 연장되도록 의도된다.
기술적으로 적절한 경우, 본 발명의 실시형태는 조합될 수 있다. 기술적 참고문헌, 예컨대, 특허 및 출원은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 구체적으로 및 명확히 언급된 임의의 실시형태는 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 실시형태와 조합되어 부인의 기초를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 제목은 문헌을 섹션으로 나누도록 사용되고, 본 명세서에 제공된 개시내용의 의미를 해석하도록 사용되도록 의도되지 않는다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 구체적으로 개시된 임의의 바이러스 서열 또는 카세트 서열, 상기 바이러스를 포함하는 조성물, 바이러스를 생성하는 상기 카세트의 용도 및 치료, 특히 암 치료에서 본 개시내용에 따른 바이러스의 용도로 확장된다.
본 출원은 둘 다 2017년 6월 1일자에 제출된 GB 제1708779.2호 및 GB 제1708778.4호에 대한 우선권을 주장한다. 각각의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함되고, 특히 여기서 개시된 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열은 포함된다. 우선권 문헌은 본 명세서에 대한 보정을 위한 기초로서 사용될 수 있다.
본 발명은 오직 하기 실시예에서 예시의 방식으로 추가로 기재된다.
실시예
실시예 1: 항-CD40 단일클론 항체을 발현하는 EnAd 바이러스(NG-350)의 제조.
항-CD40 단일클론 항체를 암호화하는 생성된 제1 에나데노툭시레브 바이러스 게놈은 NG-350(서열번호 13)이라 지칭된다.
플라스미드인 NG-350 게놈을 제조하기 위해, 플라스미드 pEnAd2.4로 5' 짧은 스플라이스 억셉터 서열(CAGG, 서열번호 2); 중쇄 리더 서열(서열번호 3), 항-CD40 VH 사슬(서열번호 4), 항체 중쇄 불변 영역(서열번호 5), P2A 고효율 자가 절단 가능한 펩타이드(서열번호 6), 경쇄 리더 서열(서열번호 7), 항-CD40 VL 사슬(서열번호 8), 항체 경쇄 불변 영역(서열번호 9) 및 SV40 폴리(A) 꼬리(서열번호 10)를 암호화하는 카세트를 직접 삽입하여 pNG-350을 생성하였다. 전이유전자 카세트(서열번호 11)의 도식은 도 1에 도시되어 있다.
바이러스 제조 및 규명
바이러스 게놈 NG-350(서열번호 1)을 제조하도록 효소 AscI에 의해 제한 분해에 의해 플라스미드 pNG-350을 선형화하였다. 바이러스 NG-350을 하기 주어진 방법에 따라 증폭시키고 정제하였다.
분해된 DNA를 페놀/클로로폼 추출에 의해 정제하고, 300㎕ > 95% 분자 생물학 등급 에탄올 및 10㎕의 3M 아세트산나트륨 중에 -20℃에서 16시간 동안 침전시켰다. 침전된 DNA를 14000rpm에서 5분 원심분리하여 펠릿화하고, 500㎕의 70% 에탄올 중에 세척한 후, 다시 14000rpm에서 5분 원심분리하였다. 깨끗한 DNA 펠릿을 공기 건조시키고, 15㎕의 리포펙타민 형질주입 시약을 함유하는 500㎕의 OptiMEM 중에 재현탁시키고, RT에서 30분 동안 항온처리하였다. 이후, 형질주입 혼합물을 70% 포화상태로 성장한 293 세포를 함유하는 T-25 플라스크에 적하하였다. 37℃에서 2시간 동안 형질주입 혼합물에 의한 세포의 항온처리 후, 5% CO2 4㎖의 세포 배지(2% FBS가 보충된 글루타민을 갖는 DMEM 고포도당)를 세포에 첨가하고, 플라스크를 5% CO2 37℃에서 항온처리하였다.
형질주입된 293 세포를 24시간마다 모니터링하고, 48 내지 72시간마다 추가적인 배지로 보충하였다. 세포 단층에서 유의미한 세포변성 효과(cytopathic effect: CPE)의 관찰에 의해 바이러스의 제조를 모니터링하였다. 일단 광범위한 CPE가 관찰되면, 바이러스를 3회의 냉동-해동 사이클에 의해 293 세포로부터 수확하였다. 수확된 바이러스를 사용하여 바이러스 스톡을 증폭시키도록 293 세포를 재감염시켰다. 증폭 동안의 생존가능 바이러스 제조는 세포 단층에서 유의미한 CPE의 관찰에 의해 확인되었다. 일단 CPE가 관찰되면, 바이러스를 3회의 냉동-해동 사이클에 의해 293 세포로부터 수확하였다. 증폭된 스톡을 추가의 증폭에 사용한 후, 바이러스를 이중 염화세슘 밴딩에 의해 정제하여 NG-350 바이러스 스톡을 제조하였다.
실시예 2: NG-350 바이러스 활성 및 항-CD40 항체 제조
HEK293 현탁액 배양 세포주에서 입자 생성 및 분비된 항-CD40 항체 제조의 면에서 NG-350 바이러스 활성을 평가하였다. HEK293 세포를 1×106vp/㎖의 밀도로 진탕 플라스크에서 시딩하고, 세포당 50개의 NG-350 바이러스 입자(ppc)에 의해 감염시켰다. HEK293 세포를 대조군(50ppc)으로서 에나데노툭시레브(EnAd)인 NG-350 모 바이러스에 의해 또한 감염시켰다. 감염 후 48 및 72시간에, 1200rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 세포 상청액을 수집하였다. HPLC에 의해 바이러스 입자 농도 또는 인간 IgG2 ELISA에 의해 항-CD40 항체 농도를 평가하기 위해 청징된 상청액의 샘플을 사용하였다.
HPLC 분석
Resource Q(음이온 교환) 칼럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 상청액 중의 바이러스 입자 농도를 정량화하였다. 바이러스 용리를 260㎚에서 검출하고, 260㎚ 신호 피크를 적분하고 에나데노툭시레브 표준 곡선으로부터의 농도를 계산함으로써 바이러스 농도를 결정하였다. NG-350 및 에나데노툭시레브 세포로부터의 바이러스 제조의 비교는 세포 상청액에서의 전체 입자 제조 및 바이러스 입자 제조의 면에서 NG-350 바이러스 활성은 에나데노툭시레브보다 유의미하게 더 낮다는 것을 보여주었다(도 2A 및 도 2B).
IgG2 ELISA
청징된 상청액을 PBS 10% BSA로 2 중 1 희석하였다. 표준 곡선 및 음성 대조군 샘플을 제조사의 프로토콜(IgG2 Human SimpleStep ELISA 키트, ab202402, Abeam)에 따라 제조하였다. 샘플 및 표준품을 ELISA 플레이트에 첨가하고, 검정을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 플레이트의 각각의 웰에서의 450㎚에서의 흡광도를 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 측정하고, 분비된 IgG2 항-CD40 항체의 농도를 표준 곡선으로부터 외삽함으로써 결정하였다(도 2C). 항-CD40은 제조하고, 에나데노툭시레브 감염된 세포가 아니라 NG-350으로부터 분비되었다.
종합하면, 이 데이터는 NG-350이 항-CD40 항체를 제조할 수 있지만, 이 변형된 바이러스의 바이러스 활성이 유의미하게 손상된다는 것을 나타낸다. 따라서, NG-350 바이러스 입자의 추가의 규명을 수행하였다(실시예 3).
실시예 3: NG-350 바이러스 식별 시험 및 게놈 분석
제한 효소 분석
제한 효소 분석을 통해 게놈 식별을 분석함으로써 NG-350 바이러스 스톡 재료의 식별을 초기에 조사하였다. NG-350 또는 에나데노툭시레브 바이러스 입자(3.5×1011vp)를 200㎕의 최종 용적으로 PBS 중에 희석시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 QIAgen Minelute 바이러스 스핀 키트를 사용하여 바이러스로부터 DNA를 추출하였다. 37℃에서 2시간 동안 효소 AscI에 의해 pNG-350 플라스미드를 선형화하고, 이후 아가로스 겔 전기영동 및 QiaQuick 겔 추출 키트(Qiagen)에 의한 겔 추출에 의해 DNA를 정제함으로써 검정을 위한 대조군 DNA를 제조하였다. 제한 효소, EcoRv/NheI(도 3A) 또는 개별 제한 효소, NcoI 또는 FspI(도 3B)의 조합을 이용하여 정제된 대조군 또는 NG-350 DNA를 제한 분해하였다. 분해된 DNA를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, UV 투과조명기를 사용하여 가시화하였다. FspI 또는 EcoRV/NheI에 의한 분해는 예측되지 않은 NG-350 바이러스 게놈 재료에서의 추가적인 밴드를 보여주었다(도 3, 적색의 화살표).
PCR 분석
표 1에 기재된 8개의 상이한 프라이머 프로브 세트를 사용하여 바이러스 게놈의 PCR 분석에 의해 게놈 식별을 추가로 평가하였다.
Figure pct00004
이 PCR은 하나 초과의 게놈 종이 NG-350 바이러스 스톡에 존재하는지 및 이 종이 항-CD40 항체 전이유전자 카세트를 함유하는지를 결정하도록 설계되었다. NG-350 또는 에나데노툭시레브 바이러스 입자(2×1010vp)를 200㎕의 최종 용적으로 PBS 중에 희석하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 QIAgen Minelute 바이러스 스핀 키트를 사용하여 바이러스로부터 DNA를 추출하였다. 대조군 DNA를 제한 효소 분석에 대한 것처럼 제조하였다. PCR 반응은 정방향 및 역방항 프라이머(2μM) 및 Phusion 고충실도 마스터 믹스(NEB)를 함유하는 50㎕의 반응 용적에서 1㎕의 DNA(100ng/㎕)를 사용하여 설정되었다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, UV 투과조명기를 사용하여 가시화하였다(도 5A 및 도 5B). 프라이머 세트 D에 의한 분석은 양성 대조군 DNA 및 NG-350 시험 샘플에서의 2920bp의 예상된 밴드를 밝혀냈다. 그러나, NG-350 시험 샘플은 추가적으로, NG-350 바이러스를 생성하기 위해 사용된 pNG-350-PSI-01 플라스미드 DNA에 의해 보이지 않은, 약 800bp의 제2 PCR 생성물을 함유하였다. 프라이머 세트 1-6에 의한 분석은 또한 프라이머 세트 5 및 6을 사용할 때 추가적인 오염물질 밴드를 보여주었다. 이 데이터는 2개의 바이러스 종(하나는 전장 항-CD40 전이유전자 카세트를 함유하고, 하나는 카세트의 절두된 버전을 함유)이 NG-350 바이러스 스톡에 존재한다는 것을 나타낸다. 이 절두는 오염물질 PCR 생성물의 서열분석에 의해 확인되었다.
전이유전자 카세트 최적화
바이러스 증폭 동안 발생하는 절두의 설명은 VH 영역과 SV40 polyA 사이의 재조합을 발생시키는 전이유전자 카세트에서의 예상되지 못한 불안정성 및 따라서 대부분의 항체 암호화 영역의 손실이다. 전이유전자 카세트 DNA 서열은 따라서 이 논쟁을 극복하기 위해 변형되는 것이 필요하다. 따라서, DNA 서열은 다른 카세트 및 바이러스 서열과의 상동성을 감소시키고, (Oxford Genetics(영국)에 의해 수행된) 소량 직접 및 도립 반복부를 제거하도록 변했다. 최적화된 카세트 서열은 실시예 4에 따라 새로운 플라스미드 pNG-350A를 사용하도록 사용되었다.
실시예 4: 항-CD40 단일클론 항체를 발현하는 EnAd 바이러스(NG-350A)의 제조
NG-350A 게놈을 제조하기 위해, 플라스미드 pEnAd2.4로 5' 짧은 스플라이스 억셉터 서열(CAGG, 서열번호 2); 중쇄 리더 서열(서열번호 3), 항-CD40 VH 사슬(서열번호 4), 항체 불변 중쇄(서열번호 5), P2A 고효율 자가 절단 가능한 펩타이드(서열번호 6), 경쇄 리더 서열(서열번호 7), 항-CD40 VL 사슬(서열번호 8), 항체 불변 경쇄(서열번호 9) 및 SV40 폴리 (A) 꼬리(서열번호 10)를 암호화하는 카세트를 직접 삽입하여 pNG-350A인 플라스미드를 생성하였다. NG-350A 암호화된 항-CD40 항체의 아미노산 서열은 NG-350 바이러스에 암호화된 것과 동일하고, 카세트 구조는 동일하였다(도 1). 그러나, 전이유전자 카세트의 핵산 서열은 변형되고, NG-350의 것과 유의미하게 다르다(서열번호 11).
바이러스 제조 및 규명
바이러스 게놈 NG-350A(서열번호 1)을 제조하도록 효소 AscI에 의해 제한 분해에 의해 플라스미드 pNG-350A를 선형화하였다. 바이러스 NG-350A를 실시예 1에 기재된 방법에 따라 증폭시키고 정제하였다.
실시예 5: PCR에 의한 NG-350A 바이러스 식별 시험
전이유전자 카세트에 이르는 생성물을 생성하는 2개의 프라이머 프로브 세트(표 2; D 및 K)를 사용하여 PCR 분석에 의해 NG-350A 게놈 식별을 확인하였다. 실시예 3에 기재된 방법에 따라 NG-350A DNA 및 대조군 DNA를 제조하였다. 실시예 3에 기재된 방법에 따라 프라이머 세트 D 및 K를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. PCR 생성물의 가시화는 예측된 크기의 단일 생성물을 보여주었다(도 6). 프라이머 세트 중 어느 것에 의해서도 오염 생성물이 검출되지 않았다.
Figure pct00005
실시예 6: 결장암종 세포에서의 NG-350A 바이러스의 복제 및 종양용해성 활성
바이러스 종양용해성 효력
HT-29 결장암종 세포를 2.5e4개의 세포 밀도로 96웰 플레이트에서 시딩하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 항온처리한 후, 세포를 세포당 100 내지 0.39개의 입자(ppc)의 감염 밀도 범위로 EnAd 또는 NG-350A 바이러스 입자 중 어느 하나에 의해 감염시켰다. 감염 후 72시간에 Cell Titre 96 MTS Reagent(Promega: G3581)를 사용하여 HT-29 세포 생존능력을 평가하였다. 각각의 감염 밀도에서의 % 세포 생존율의 정량화는, EnAd와 유사하게, NG-350A가 HT-29 세포에 대해 강한 종양용해성 활성을 보여준다는 것을 입증하였다(도 7A).
바이러스 복제
폐 암종 세포(A549) 또는 결장암종 세포(HCT-116)를 100ppc의 NG-350A 또는 NG-350A 모 바이러스, 에나데노툭시레브에 의해 24, 48, 72 또는 96시간 동안 감염시키거나, 비감염시킨 채 두었다. 결장암종 세포(HT-29) 또는 방광 암종 세포(HTB-5, HT-1197 및 HT-1376)를 100ppc의 NG-350A 또는 에나데노툭시레브에 의해 24, 48, 72, 144 및 168시간 동안 감염시키거나, 비감염시킨 채 두었다. 각각의 시점에, 세포 상청액을 수집하고, 1200rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 청징하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)를 사용하여 상청액의 10㎕(HT-29, A549 또는 HCT-116) 또는 50㎕(HTB-5, HT-1197 및 HT-1376)로부터 DNA를 추출하였다. DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)를 사용하여 EnAd 바이러스 입자(2.5e10 내지 2.5e5vp)를 사용한 표준 곡선을 또한 제조하고 추출하였다. 에나데노툭시레브 E3 유전자 특이적 프라이머-프로브 세트를 사용하여 qPCR에 의해 각각의 추출된 샘플 또는 표준품을 분석하였다.
세포당 검출된 바이러스 게놈의 수의 정량화는 바이러스 복제의 NG-350A 및 에나데노툭시레브 동역학이 시험된 모든 세포주에서 및 분석된 모든 시점에서 필적 가능하다는 입증하였다(도 7 및 도 8). 비감염된 세포에서 바이러스 게놈은 검출되지 않았다(데이터 비도시).
실시예 7: NG-350A에서의 항-CD40 항체 발현은 결장암종 세포주를 감염시켰다
IgG2 ELISA
IgG2 ELISA(IgG2 Human SimpleStep ELISA 키트, ab202402, Abeam)에 의해 항-CD40 항체 발현의 분석을 위해 NG-350A의 2개의 상이한 배치인 100ppc EnAd(NG-350A B1 또는 NG-350A B2)에 의해 24, 48 또는 72시간 동안 감염되거나 비감염시킨 채 있는 A549 세포를 사용하였다. 배양 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고, 1200rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하였다. 청징된 상청액을 PBS 10% BSA로 2 중 1 희석하였다. 표준 곡선 및 음성 대조군 샘플을 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였다. 샘플 및 표준품을 ELISA 플레이트에 첨가하고, 검정을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 플레이트의 각각의 웰에서의 450㎚에서의 흡광도를 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 측정하고, 분비된 IgG2 항-CD40 항체의 농도를 표준 곡선으로부터 외삽함으로써 결정하였다(도 9A 및 도 9B).
CD40 결합 ELISA
CD40 결합 ELISA에 의해 항-CD40 항체 발현의 분석을 위해 NG-350A의 2개의 상이한 배치인 100ppc의 EnAd(NG-350A B1 또는 NG-350A B2)에 의해 24, 48 또는 72시간 동안 감염되거나 비감염시킨 채 있는 A549 세포를 사용하였다.
배양 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고, 1200rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하였다. ELISA 플레이트(A Nunc Immuno MaxiSorp 96웰 마이크로플레이트)를 탄산염/중탄산염 완충제 중에 인간 CD40(100㎍/㎖, R and D Systems, 1493-CD)에 의해 4℃에서 밤새 코팅에 의해 제조하였다. 플레이트를 PBS 0.05% Tween 20에 의해 모든 후속하는 결합 단계 사이에 세척하였다. 플레이트를 PBS 5% BSA에 의해 실온에서 1시간 동안 차단하였다.
청징된 감염 상청액을 PBS 5% BSA로 희석하였다(2 중의 1, 10 중의 1 및 100 중의 1). 이 검정에서, 항-CD40 항체(BioLegend, 334308)를 ELISA 플레이트에 대한 인간 CD40 결합에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 이것을 30ng/㎖의 농도로 PBS 5% BSA 중에 제조하였다. 모든 샘플을 CD40 코팅된 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이후, 바이러스 상청액에 대한 검출 항체, HRP 접합된 항-인간 IgG2-Fc(Abeam, ab97225) 또는 양성 대조군 항체에 대한 항-마우스 IgG Ab(HRP)(Abeam, ab6728)를 모든 웰에 실온에서 1시간 동안 적용하였다. HRP 기질 용액 3.3.5.5'-테트라메틸에틸렌다이아민(TMB, Thermo-Fisher)에 의해 HRP 검출을 수행하였다. 1M HCl을 반응을 중단시키기 위해 사용하고, 플레이트 판독기에서 450㎚에서 전개된 색상을 측정하였다. 450㎚에서의 흡광도는 EnAd, NG-350A 및 양성 대조군에 대해 작도되고(도 9C), NG-350A 감염된 세포의 상청액에 존재하는 분비된 항-CD40 항체에 의해 CD40에 대한 특이적 결합을 입증하였다.
실시예 8: CD40 기능적 신호전달 리포터 검정
막 발현된 CD40 분자를 통한 활성화에 반응하여 알칼리 포스파타제(Invivogen)를 분비하는 CD40+ HEK-Blue 리포터 세포를 사용하여 항-CD40 항체 기능적 활성의 분석을 위해 1Oppc의 EnAd, NG-350A에 의해 24 또는 48시간 동안 또는 NG-165(대조군 항체[항-VEGF]를 발현하는 바이러스)에 의해 48시간 동안 감염되거나 비감염시킨 채 있는 A549 세포를 사용하였다. 감염 후, A549 세포로부터의 배양 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고, 1500rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하였다.
20㎕의 배양 상청액을 180㎕의 배양 배지 중에 희석시키고, 20시간 동안 Hek-Blue CD40 세포에 적용하였다. 10ng/㎖의 농도에서의 CD40L을 양성 대조군으로서 배양 배지 중에 제조하였다. 이후, 상청액을 HEK-Blue CD40 세포로부터 수집하고, 원심분리에 의해 청징하였다. 37℃에서 1시간 동안 160㎕의 Quanti-Blue 시약과 항온처리함으로써 알칼리 포스파타제 활성에 대해 40㎕의 청징된 상청액을 평가하였다. 620㎚에서의 흡광도는 플레이트 판독기를 사용하여 각각의 샘플에 대해 측정되고, EnAd 또는 NG-165 감염된 세포가 아니라 NG-350A로부터의 상청액이 CD40 발현 HEK-Blue 리포터 세포로부터의 SEAP 제조를 촉발한다는 것을 입증하였다(도 10).
실시예 9: 암종 세포주에서의 NG-350A 바이러스의 선택적 활성
EnAd 바이러스 활성에 반허용적인 폐 암종 세포(A549), 결장암종 세포(HCT-116) 또는 폐 섬유아세포 세포(MRC-5)를 사용하여 암 세포에 대한 NG-350A 바이러스의 선택도를 입증하였다. 세포주를 100ppc의 NG-350A 또는 NG-350A 모 바이러스, 에나데노툭시레브에 의해 72시간 동안 감염시키거나, 비감염시킨 채 두었다. 각각의 시점에, 배양 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고, qPCR에 의한 바이러스 게놈 복제 또는 ELISA에 의한 항-CD40 항체 발현의 분석에 사용하였다. RT-qPCR에 의한 바이러스 유전자 E3 및 전이유전자의 발현에 대해 웰에 남은 세포를 분석하였다.
바이러스 복제
세포 상청액을 수집하고, 1200rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 청징하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 Sigma Genelute DNA 추출 키트를 사용하여 10㎕(A549, HCT-116) 또는 100㎕(MRC-5)의 상청액으로부터 DNA를 추출하였다. Sigma Genelute Kit를 사용하여 EnAd 바이러스 입자(2.5e10 내지 2.5e5vp)를 사용한 표준 곡선을 또한 제조하고 추출하였다. 에나데노툭시레브 E3 유전자 특이적 프라이머-프로브 세트를 사용하여 qPCR에 의해 각각의 추출된 샘플 또는 표준품을 분석하였다.
세포당 검출된 바이러스 게놈의 수의 정량화는 NG-350A 및 에나데노툭시레브 바이러스 복제가 A549 및 HCT-116 세포에서 필적하는 수준에서 검출 가능하지만 MRC-5에서의 발현이 암종 세포주에서보다 유의미하게 더 낮다는 것을 입증하였다(도 11a). 비감염된 세포에서 바이러스 게놈은 검출되지 않았다(데이터 비도시).
IgG2 항체 발현
IgG2 ELISA(IgG2 Human SimpleStep ELISA 키트, ab202402, Abeam)에 의해 세포 상청액 중의 항체 발현을 평가하였다. 배양 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고, 1200rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하였다. 청징된 상청액을 PBS 10% BSA로 2 중 1 희석하였다. 표준 곡선 및 음성 대조군 샘플을 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였다. 샘플 및 표준품을 ELISA 플레이트에 첨가하고, 검정을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 플레이트의 각각의 웰에서의 450㎚에서의 흡광도를 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 측정하고, 분비된 IgG2 항-CD40 항체의 농도를 표준 곡선으로부터 외삽함으로써 결정하였다(도 11b).
실시예 10: NG-350A 감염된 세포로부터의 항-CD40 항체의 정제
현탁액 HEK293 세포를 Erlenmeyer 플라스크에서 1×106개의 세포/㎖로 시딩하고, 100ppc의 NG-350A에 의해 감염시켰다. 72시간 후, 5% FBS 및 프로테아제 저해제 칵테일(1:2000)을 세포에 첨가하고, 현탁액을 4600rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하고, 500kDa 분자량 컷오프 중공 섬유 막을 통해 여과시켜 항-CD40 항체로부터 NG-350A 바이러스 입자를 분리시켰다. 항-CD40 항체를 함유하는 여과 단계로부터의 관통물(flow through)을 30kDa 분자량 컷오프를 갖는 제2 중공 섬유 막을 통해 통과시켰다. 항-CD40 항체를 AKTA를 사용하여 단백질 A 칼럼에서 제2 여과 단계로부터의 보유물로부터 정제하였다. 정제된 항체를 필터 무균화하고, -80℃에서 저장하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 IgG2 Human SimpleStep ELISA 키트(ab202402, Abeam)를 사용하여 IgG2 ELISA에 의해 정제된 항체의 농도를 결정하였다(도 12).
실시예 11: 1차 인간 단핵구 유래된 DC에서의 NG-350A 유래된 항-CD40 항체 활성 및 바이러스 활성과의 시너지
영국 옥스퍼드의 NHS 혈액 이식 단체(Blood and Transplant unit)로부터 소싱된 NC24 백혈구 콘(cone)으로부터 Ficoll-Paque 구배 원심분리에 의해 PBMC를 단리시켰다. CD14 MicroBeads 키트(MiltenyiBiotec)를 사용하여 CD14+ 단핵구를 단리시켰다. 이후, 단핵구를 계수하고, 원심분리하고(300×g), GM-CSF(800U/㎖) 및 IL-4(500U/㎖)에 의해 보충된 10% RPMI 배양 배지 중에 5×105개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 40㎖의 단핵구 현탁액을 1개의 T175 플라스크로 옮겼다.
72시간 배양 후, 단핵구 유래된 DC(moDC)를 10% RPMI 배양 배지 중에 24웰 플레이트에서 웰당 1×106개의 세포의 밀도로 시딩하였다. 이것을 0.5㎍/㎖의 항-CD40 항체(실시예 10에 따라 바이러스 감염된 세포로부터 정제됨), EnAd(100ppc), 인간 CD40L에 의해 치료하거나 비치료하여 두었다. 동시에, moDC를 정제된 항-CD40 항체(O.5㎍/㎖) 및 EnAd(100ppc) 둘 다에 의해 치료하였다. 이후, 플레이트를 48시간 동안 항온처리한 후, 상청액 및 세포를 수확하였다.
상청액 및 세포를 배양 웰로부터 제거하고 원심분리하였다(300×g). 상청액을 PBS 5% BSA에 의해 2 중 1 희석시키고, ELISA 분석을 위해 저장하였다. 세포 펠릿을 200㎕의 PBS 중에 세척하고 원심분리하고, 이후 실온에서 15분 동안 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR(Life tech)을 함유하는 50㎕의 PBS 중에 재현탁시켰다. 세포를 FAC 완충제(1% FBS/PBS) 중에 1회 세척한 후, 직접적으로 접합된 항체의 패널에 의해 염색하였다: BV421에 접합된 항-CD86; AF647에 접합된 항-CD54 및 PeCy5에 접합된 항-HLA-DR. 각각의 동시배양 조건으로부터의 세포의 샘플을 또한 관련 아이소타입 대조군 항체에 의해 염색하였다. 4℃에서 15분 동안 웰당 50㎕의 전체 용적에서 FAC 완충제 중에 모든 염색을 수행하였다. 이후, 세포를 FAC 완충제(200㎕)에 의해 2회 세척한 후, 200㎕의 FAC 완충제 중에 재현탁시키고, 유세포분석법(Attune)에 의해 분석하였다.
상청액 샘플을 해동하고, 제조사의 프로토콜에 따라 희석시키고 검정을 수행함으로써 ELISA(IL-12 Quantikine ELISA, DP400, R&D systems)에 의해 분석하였다.
바이러스 감염된 세포로부터 정제된 항-CD40 항체에 의한 치료는 CD86, CD54 및 HLA-DR 활성화 마커를 발현하는 moDC의 백분율을 증가시키고 IL12p40을 분비시켰다(도 13 및 도 14). 유의미하게, 항-CD40 항체 및 EnAd 바이러스 둘 다에 의한 moDC의 병용 치료는 항-CD40 Ab 또는 EnAd 바이러스 단독에 의한 치료와 비교하여 더 강한 moDC 활성화를 초래하였다.
실시예 12: 1차 인간 B 세포에서의 NG-350A 유래된 항-CD40 항체 활성 및 바이러스 활성과의 시너지
영국 옥스퍼드의 NHS 혈액 이식 단체로부터 소싱된 NC24 백혈구 콘으로부터 Ficoll-Paque 구배 원심분리에 의해 PBMC를 단리시켰다. Pan B Cell Isolation Kit(MiltenyiBiotec)를 사용하여 CD19+ B 세포를 단리시켰다. 이후, B 세포를 10% RPMI 배양 배지 중에 24웰 플레이트에서 웰당 1×106개의 세포의 밀도로 시딩하였다. 이것을 증가하는 농도의 정제된 항-CD40 전이유전자 Ab, 인간 CD40L에 의해 치료하거나 비치료하여 두었다. 이후, 플레이트를 48시간 동안 항온처리한 후, 상청액 및 세포를 수확하였다.
상청액 및 세포를 배양 웰로부터 제거하고 원심분리하였다(300×g). 상청액을 조심스럽게 제거하고, PBS 5% BSA에 의해 2 중 1 희석시키고, ELISA 분석을 위해 저장하였다. 세포 펠릿을 200㎕의 PBS 중에 세척하고 원심분리하고, 이후 실온에서 15분 동안 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR(Life tech)을 함유하는 50㎕의 PBS 중에 재현탁시켰다. 세포를 FAC 완충제 중에 1회 세척한 후, 직접적으로 접합된 항체의 패널에 의해 염색하였다: BV421에 접합된 항-CD86; AF647에 접합된 항-CD54; PeCy5에 접합된 항-HLA-DR 및 BV605에 접합된 항-CD80. 각각의 동시배양 조건으로부터의 세포의 샘플을 또한 관련 아이소타입 대조군 항체에 의해 염색하였다. 4℃에서 15분 동안 웰당 50㎕의 전체 용적에서 FAC 완충제 중에 모든 염색을 수행하였다. 이후, 세포를 FAC 완충제(200㎕)에 의해 2회 세척한 후, 200㎕의 FAC 완충제 중에 재현탁시키고, 유세포분석법(Attune)에 의해 분석하였다.
시험된 모든 농도에서의 항-CD40 항체에 의한 B 세포의 치료는, 비치료된 또는 아이소타입 대조군 치료된 B 세포와 비교하여, CD86, CD19 및 CD80을 발현하는 B 세포의 백분율의 증가 및 CD19+ 세포에서의 HLA-DR MFI의 증가의 면에서 B 세포 활성화를 초래하였다(도 15). 항-CD40 항체에 의한 치료는 또한 증식하는 세포의 백분율의 증가의 면에서 B 세포 활성화를 초래하였다(도 16). 유의미하게, 항-CD40 항체 및 EnAd 바이러스와의 B 세포의 병용 치료는 항체 또는 바이러스 치료 단독과 비교하여 증식하는 B 세포의 %의 증대를 초래하였다(도 16).
실시예 13: 1차 인간 단핵구 유래된 DC에서의 NG -350A 유래된 항-CD40 항체 활성
A549 종양 세포를 플라스크마다 각각 10×106 또는 50×106개의 세포의 밀도로 T175 플라스크 또는 Hyperflask에서 시딩하였다. 4시간 후, 세포를 세포당 10개의 EnAd 또는 NG-350A 바이러스 입자에 의해 감염시켰다. 72시간 후, 상청액을 수확하고, 300kDa 컷오프 크기 배제 칼럼을 사용하여 바이러스를 고갈시켰다. 50kDa 컷오프 크기 배제 칼럼을 사용하여 바이러스 고갈된 상청액을 항체에 대해 농후화시켰다. 이 바이러스 고갈된 Ab 농후화된 분획을 -80℃에서 저장하였다. 항-CD40 Ab 역가는 IgG2 ELISA를 이용하여 결정되고, 기능성은 실시예 8에 기재된 HEK Blue 리포터 세포 검정을 이용하여 확인되었다.
단핵구 유래된 수지상 세포(MoDC)를 연구의 추가의 세트에 대해 본질적으로 실시예 11에 기재된 바대로 제조하였다. 영국 옥스퍼드의 NHS 혈액 이식 단체로부터 소싱된 NC24 백혈구 콘으로부터 Ficoll-Paque 구배 원심분리에 의해 PBMC(도너 177)를 단리시켰다. CD14 MicroBeads 키트(MiltenyiBiotec)를 사용하여 CD14+ 단핵구를 단리시켰다. GM-CSF 및 IL-4에 의한 72시간 배양 후, MoDC를 10% RPMI 배양 배지 중에 48웰 플레이트에서 웰당 1.25×105개의 세포의 밀도로 또는 24웰 플레이트에서 웰당 2.5×105개의 세포의 밀도로 시딩하고, 상기 문단에 기재된 바이러스 고갈된 NG-350A 또는 EnAd 배양 상청액과 항온처리하였다. 세포를 유세포분석법 분석을 위해 염색하였다. 상청액을 사이토카인 비드 검정에 의한 사이토카인 분석을 위해 사용하였다(Legendplex, BioLegend).
MoDC의 표면에서의 CD40에 대한 항-CD40 Ab 결합을 입증하기 위해, 세포를 NG-350A 감염된 세포로부터 증가하는 농도의 바이러스 고갈된, 항-CD40 Ab 농후화된 상청액(상이한 양의 항체를 제공하도록 사용된 상이한 희석액)에 의해 치료하거나, 비치료하여 두었다(배지). 대조군으로서, 이것을 또한 NG-350A 항-CD40 Ab 함유 샘플의 것과 일치하는 용적으로 바이러스 고갈된 EnAd 상청액(dEnAd)에 의해 치료하였다. 24시간 및 48시간 후, 세포를 수확하고, CD40에 대한 형광성 표지된 항체에 의해 염색한 후, 유세포분석법 분석을 수행하였다. 세포를 단일 (FSC-H 대 FSC-A) 간 세포(LIVE/DEAD® Fixable Aqua 네가티브)에서 게이팅하였다. 도 17A는 1000ng/㎖ Ab에 의한 치료 후 24시간에 수득된 대표적인 유세포분석법 결과를 보여주고, 도 17B는 상이한 농도의 바이러스 고갈된 상청액에 의한 치료 후 24시간 및 48시간에 MoDC에 대한 CD40 발현을 도시한다. 더 높은 항체 농도에서, CD40 FACS 염색은 감소하거나 부재하여서, NG-350A 바이러스 고갈된 배양 상청액에서 항-CD40 항체의 결합에 의한 봉쇄를 반영한다.
이후, MoDC에서 세포 표면 마커 상향조절에 대한 (바이러스 고갈된 상청액을 사용한) 항-CD40 Tg Ab 치료의 효과를 평가하였다. MoDC를 증가하는 농도의 정제된 항-CD40 Tg Ab에 의해 치료하거나, 비치료하여 두었다(배지). 이것을 또한 항-CD40 Ab의 것과 일치하는 용적으로 바이러스 고갈된 EnAd 상청액(dEnAd)에 의해 치료하였다. 24시간 및 48시간 후, 세포를 수확하고, CD54, CD83 및 CD86 표면 마커에 대한 항체에 의해 염색한 후, 유세포분석법 분석을 수행하였다. 세포를 단일 (FSC-H 대 FSC-A) 간 세포(LIVE/DEAD® Fixable Aqua 네가티브)에서 게이팅하였다. 1000ng/㎖ Ab에 의한 치료 후 24시간에 수득된 대표적인 유세포분석법 결과는 도너 177로부터 PBMC에 의해 제조된 MoDC에 대해 도 18a에 도시되어 있다. 도 18b는 치료 후 24시간 및 48시간에 4개의 상이한 도너로부터의 MoDC에 대한 활성화 마커 발현을 도시한다.
이후, MoDC 사이토카인 제조에 대한 항-CD40 Tg Ab의 효과를 평가하였다. 4개의 상이한 도너로부터의 MoDC를 증가하는 농도의 항-CD40 Ab 함유 바이러스 고갈된 상청액에 의해 치료하거나, 비치료하여 두었다(배지). 이것을 또한 항-CD40 Ab의 것과 일치하는 용적으로 바이러스 고갈된 EnAd 상청액(dEnAd)에 의해 치료하였다. 24시간 및 48시간 후, 상청액을 수집하고, LEGENDplex(상표명) 비드 기반 면역검정(BioLegend)을 이용하여 염증성 사이토카인 분비에 대해 분석하였다. 도 19는 TNFα, IL-6 및 IL-8의 선택적 유도를 도시한다.
실시예 14: 1차 인간 단핵구 유래된 DC의 활성에 대한 NG-350A 바이러스 및 유래된 항-CD40 항체 함유 바이러스 감염된 종양 세포 상청액의 활성
실시예 13에 기재된 것과 유사한 연구에서, A549 세포를 4×106개의 세포의 밀도로 T25 플라스크에서 시딩하였다. 4시간 후, 세포를 세포당 10개의 EnAd 또는 NG-350A 바이러스 입자에 의해 감염시켰다. 72시간 후, 상청액을 수확하고, 1600rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이 연구에서, 이 청징된 상청액을 바이러스를 제거하기보다는 (1시간 내) 사용까지 37℃에서 유지시켰다. 따라서, 상청액은 바이러스 및 항-CD40 항체 전이유전자 생성물 둘 다를 포함하는 NG-350A(또는 EnAd 대조군) 감염된 종양 세포의 생성물을 함유한다.
영국 옥스퍼드의 NHS 혈액 이식 단체로부터 소싱된 NC24 백혈구 콘으로부터 Ficoll-Paque 구배 원심분리에 의해 PBMC를 단리시켰다. CD14 MicroBeads 키트(MiltenyiBiotec)를 사용하여 CD14+ 단핵구를 단리시켰다. GM-CSF 및 IL-4에 의한 72시간 배양 후, MoDC를 48웰 플레이트에서 웰당 1.25×105개의 세포의 밀도로 시딩하고, 상이한 희석에서의 EnAd 및 NG-350A 바이러스 상청액에 의해 치료하였다. 이후, 플레이트를 24시간 및 48시간 동안 항온처리한 후, 상청액 및 세포를 수확하였다. 상청액을 원심분리하고, 세포 펠릿으로부터 제거하고, -80℃에서 저장하였다. 세포를 유세포분석법 분석을 위해 염색하였다. 상청액을 CBA에 의한 사이토카인 분석을 위해 사용하였다.
MoDC의 표면에서의 CD40에 대한 항-CD40 Ab 결합을 입증하기 위해, 세포를 NG-350A 또는 EnAd 감염된 세포로부터 증가하는 농도의 상청액(상이한 양의 항체를 제공하도록 사용된 상이한 희석액)에 의해 치료하거나, 비치료하여 두었다(배지). 24시간 및 48시간 후, 세포를 수확하고, CD40에 대한 형광성 표지된 항체에 의해 염색한 후, 유세포분석법 분석을 수행하였다. 세포를 단일 (FSC-H 대 FSC-A) 간 세포(LIVE/DEAD® Fixable Aqua 네가티브)에서 게이팅하였다. 도 20은 상이한 농도의 상청액에 의한 치료 후 24시간 및 48시간에 MoDC에 대한 CD40 발현을 도시한다. NG-350A(그러나 EnAd가 아님) 감염된 종양 세포로부터의 1:2 상청액 희석에서, CD40 FACS 염색은 감소하거나 부재하여서, NG-350A 바이러스 치료된 배양 상청액에서 항-CD40 항체의 결합에 의한 봉쇄를 반영한다.
이후, 2개의 도너(177 및 179)로부터의 MoDC에서 세포 표면 마커 상향조절에 대한 NG-350A 바이러스 치료된 종양 세포 상청액의 효과를 평가하였다. MoDC를 희석된 EnAd 또는 NG-350A 바이러스 상청액에 의해 치료하거나, 비치료하여 두었다(배지). 24시간 및 48시간 후, 세포를 수확하고, CD86, CD54 및 CD83에 대한 항체에 의해 염색한 후, 유세포분석법 분석을 수행하였다. 세포를 단일 (FSC-H 대 FSC-A) 간 세포(LIVE/DEAD® Fixable Aqua 네가티브)에서 게이팅하였다. 도 21에서의 결과는 NG-350A가 모든 3개의 MoDC 활성화 마커를 선택적으로 상향조절한다는 것을 도시한다.
이후, MoDC 사이토카인 제조에 대한 NG-350A 바이러스 상청액의 효과를 평가하였다. 2개의 도너(177 및 179)로부터의 MoDC를 희석된 EnAd 또는 NG-350A 바이러스 처리된 종양 세포 상청액에 의해 치료하거나, 비치료하여 두었다(배지). 24시간 및 48시간 후, 상청액을 수집하고, LEGENDplex(상표명) 비드 기반 면역검정(BioLegend)을 이용하여 염증성 사이토카인 분비에 대해 분석하였다. 도 22는 NG-350A 치료된 세포 상청액에 의한 TNFα, IL-6, IL-8, IL-28 및 IL-29의 선택적 유도를 도시한다.
실시예 15: 1차 인간 B 세포에서의 NG-350A 유래된 항-CD40 항체 활성
영국 옥스퍼드의 NHS 혈액 이식 단체로부터 소싱된 NC24 백혈구 콘으로부터 Ficoll-Paque 구배 원심분리에 의해 PBMC를 단리시켰다. Pan B Cell Isolation Kit(MiltenyiBiotec)를 사용하여 B 세포를 단리시켰다. 세포를 10% RPMI 배양 배지 중에 48웰 플레이트에서 웰당 1.25×105개의 세포의 밀도로 시딩하였다. 이것을 실시예 13에 기재된 NG-350A 감염된 세포로부터 상이한 농도의 바이러스 고갈된, 항-CD40 Ab 농후화된 상청액에 의해 치료하거나, 비치료하여 두었다. B 세포를 또한 대조군으로서 바이러스 고갈된 EnAd 바이러스 상청액에 의해 치료하였다. 이후, 플레이트를 24시간 및 48시간 동안 항온처리한 후, 세포를 수확하였다. 세포를 CD23, CD54, CD86 및 HLA-DR에 대한 항체에 의해 염색한 후, 유세포분석법 분석을 수행하였다. 세포를 단일 (FSC-H 대 FSC-A) 간 세포(LIVE/DEAD® Fixable Aqua 네가티브)에서 게이팅하였다. 도 23은 바이러스 고갈된 NG-350A 항-CD40 항체 함유 상청액에 의한 3개의 상이한 도너(177, 178, 179)로부터의 B 세포에 대한 모든 4개의 표면 마커(CD23, CD54, CD86 및 HLA-DR)의 선택적 상향조절을 도시한다.
실시예 16: 1차 인간 B 세포의 활성에 대한 NG-350A 바이러스 및 유래된 항-CD40 항체 함유 바이러스 감염된 종양 세포 상청액의 활성
영국 옥스퍼드의 NHS 혈액 이식 단체로부터 소싱된 NC24 백혈구 콘으로부터 Ficoll-Paque 구배 원심분리에 의해 PBMC를 단리시켰다. Pan B Cell Isolation Kit(MiltenyiBiotec)를 사용하여 B 세포를 단리시켰다. 세포를 48웰 플레이트에서 웰당 1.25×105개의 세포의 밀도로 시딩하고, 실시예 14에 기재된 동일한 EnAd 및 NG-350A 바이러스 상청액의 샘플의 상이한 희석액에 의해 치료하였다. 이후, 플레이트를 24시간 및 48시간 동안 항온처리한 후, 세포를 수확하고, CD23, CD54, CD86 및 HLA-DR에 대한 항체에 의해 염색한 후, 유세포분석법 분석을 수행하였다. 세포를 단일 (FSC-H 대 FSC-A) 간 세포(LIVE/DEAD® Fixable Aqua 네가티브)에서 게이팅하였다. 도 24는 NG-350A 감염된 종양 세포로부터 바이러스 및 항-CD40 항체 함유 상청액에 의한 3개의 상이한 도너(177, 178, 179)로부터의 B 세포에 대한 모든 4개의 표면 마커(CD23, CD54, CD86 및 HLA-DR)의 선택적 상향조절을 도시한다.
실시예 17:
또 다른 연구에서, 6개의 암 적응증(결장직장, 전립선, 췌장, 유방, 난소 및 방광)에 걸쳐 일련의 상이한 종양 세포주에 대해 NG-350A의 활성을 평가하였다. 세포를 세포당 1개 또는 100개의 에나데노툭시레브(EnAd) 또는 NG-350A의 입자(ppc)로 감염시키고, 3일 내지 11일 동안 배양하여서, NG-350A-감염된 종양 세포에서 바이러스 게놈 복제, 바이러스 매개된 종양용해, (mRNA 및 단백질 수준에서의) 바이러스 전이유전자 발현 및 기능적 바이러스 전이유전자 발현을 평가하였다. 모든 실험에서, NG-350A의 활성을 EnAd의 것과 비교하였다. A549(비소세포 폐 암종) 세포를 양성 대조군으로서 사용하고, CT26 (마우스 결장 종양) 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다.
바이러스 게놈 복제
L-글루타민, 비필수 아미노산, 피루브산나트륨 및 10% 소 태아 혈청(FBS)(성장 배지)이 보충된 고글루코스 DMEM에서 175㎠ 플라스크에서 종양 세포주를 배양하였다. 사용 전에, 현미경을 사용하여 세포를 검사하여서, 60% 내지 80% 포화상태를 보장하였다. 이후, 세포를 PBS에 의해 세척하고, 0.25% 트립신-EDTA를 첨가하여 플라스크의 바닥으로부터 세포를 탈착시켰다. 세포를 세포가 탈착될 때까지 37℃, 5% CO2에서 2분 내지 10분 동안 항온처리하고, 이후 트립신을 성장 배지를 사용하여 탈활성화하였다. 세포 현탁액을 혼합하고, 300g에서 5분 동안 스피닝하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 10㎖의 검정 배지 중에 재현탁시켰다; (10% 대신에) 2% FBS에 의해 보충된 상기 기재된 바와 같은 DMEM 배지. 세포를 계수하고, 검정 배지를 사용하여 세포 현탁액을 희석하여 5×105개의 세포/㎖의 농도를 달성하고, 이 중 100㎕를 평평 바닥 96월 플레이트에 시딩하였다(각각의 세포주를 플레이트마다 바이러스마다 2개의 웰 및 비감염 대조군(UIC)마다 2개의 웰로 시딩하였다(시점마다 하나의 플레이트)). EnAd 및 UIC에 대한 샘플을 플레이트의 하나의 세트에서 시딩(및 감염)시키고, NG-350A 및 UIC에 대한 샘플을 플레이트의 또 다른 세트에서 시딩(및 감염)시켰다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 항온처리한 후, 세포 시딩 후 4 내지 6시간 접종하였다.
이 시간 후에, EnAd 및 NG-350A 바이러스를 검정 배지 중에 희석하여 5×105개의 세포/㎖의 농도를 달성하고, 이 중 100㎕를 세포의 각각의 관련된 웰에 첨가하였다(각각의 바이러스를 각각의 플레이트에서 이중으로 각각의 세포주에 첨가하였다). 이는 1ppc의 EnAd 또는 1ppc의 NG-350A의 접종을 초래하였다. 바이러스의 첨가 대신에, 100㎕의 검정 배지를 또한 접종 후 20시간에 각각의 플레이트에서 각각의 세포주(UIC)의 이중 웰에 첨가하고, 배지를 세포로부터 제거하고, 200㎕의 새로운 검정 배지에 의해 대체하였다. 이후, 플레이트를 접종 후 3일, 4일, 8일 또는 11일 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 세포를 8일 이상 동안 항온처리하는 경우, 이것을 접종 후 4일에 50㎕의 검정 배지에 의해 공급하였다.
DNA 수확: 항온처리 후, 배지를 세포로부터 제거하고, 96월 V-바닥 플레이트에서 원심분리하였다. 이후, 상청액을 새로운 96월 평평 바닥 플레이트로 옮기고, -80℃에서 저장하였다. 이후, 200㎕의 1×Reporter Lysis Buffer(RLB)를 세포의 원래의 플레이트에 첨가하고, -80℃에서 저장하였다.
표준 곡선 제조: 스톡 EnAd를 1.25×1011 내지 1.25×106개의 바이러스 입자/㎖로 희석한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen DNeasy 96 키트에 의해 DNA 추출하였다(200㎕의 각각의 표준 곡선 샘플을 추출하고, 정제된 DNA를 200㎕의 용적 중에 용리시킴). 이후, 정제된 DNA를 분취하고, -20℃에서 저장한 후, 각각의 qPCR 플레이트에서 사용하였다. 2㎕의 이 표준 곡선 샘플을 qPCR 웰마다 2.5×103 내지 2.5×108개의 게놈에 해당하는 각각의 qPCR 반응에서 사용하였다.
DNA 추출: 상청액 및 용해물 시험 샘플을 해동한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen DNeasy 96 키트에 의해 DNA 추출하였다(50㎕의 시험 샘플을 추출하고, 정제된 DNA를 200㎕의 용적 중에 용리시킴). 1×RLB의 추출 대조군을 각각의 플레이트에서 추출하였다.
실시예 6에 기재된 바대로 E3 프라이머-프로브 세트를 사용하여 세포 용해물 및 상청액(S/N)의 qPCR에 의해 바이러스 게놈 복제를 평가하였다. 10개의 시험 종양 세포주와, 양성(A549) 세포로부터의 세포 용해물 및 상청액 샘플 둘 다에 대한 시간 과정은 도 25a-f에서 종양 유형(결장직장, HT-29 및 HCT-116; 전립선 DU145; 췌장 BxPC-3; 유방 MBA-MB-453; 난소 PA-1 및 Caov-3; 방광 RT24, T24 및 UM-UC-3)에 따라 작도되었다. 음성 대조군 세포(마우스 CT26)는 음성이고 작도되지 않았다. EnAd 감염된 세포에서 검출된 바이러스 게놈은 점선으로 표시되고, NG-350A 감염된 세포에서 검출된 바이러스 게놈은 실선으로 표시된다. 데이터는 NG-350A가 상이한 암종 세포 유형의 범위에 걸쳐 EnAd 모 바이러스에 필적하게 이의 게놈 DNA를 복제한다는 것을 나타낸다.
NG-350A의 종양용해성 효과를 평가하기 위해, 4개의 종양 세포주를 100ppc의 EnAd, 100ppc의 NG-350A, 검정 배지 단독(비감염 대조군) 또는 4% tween(용해된)에 의해 접종하였다. 바이러스에 의해 접종된 세포의 50% 초과의 용해가 발행할 때까지 xCELLigence Real Time Cell Analzyer(RTCA)에 의해 세포의 성장 및 생존능력을 모니터링하였다. 모든 시점에 걸친 세포 지수(CI)는 xIMT 소프트웨어에 의해 계산되고, 비감염된 EnAd, NG-350A 및 용해된 3회 반복실험의 평균 및 SD를 결정되고; 평균은 그래프에 작도되고, SD는 오차 막대로 표시된다. 비감염 대조군, EnAd 및 NG-350A 접종된 세포, 및 용해된 세포에 대한 xCELLigence 트레이스는 도 26에 도시되어 있다. 세포를 0시간에 시딩하고, (각각의 그래프에서 화살표로 표시된 시점에서) 시딩 후 24시간에 감염시켰다. 종양 세포주는 그래프마다 하나의 세포주로서 도시된다: 결장직장(HT-29 및 HCT-116), 전립선(BxPC-3) 및 유방(MDA-MB-453). NG-350A는 EnAd 모 바이러스에 필적하는 종양용해성 활성을 보여주었다.
NG-350A에 의해 감염된 종양 세포주로부터 상이한 시간에 취한 용해물 중에 항-CD40 전이유전자 mRNA 발현을 또한 평가하였다. 이 연구의 게놈 복제 부분에 사용된 것과 동일한 10개의 시험 종양 세포주와, 양성(A549) 및 음성(CT26) 대조군 세포주를 1ppc의 EnAd, 1ppc의 NG-350A 또는 검정 배지 단독(비감염 대조군)에 의해 접종하였다. 접종 후 상이한 시간(3일, 4일, 8일 및 11일)에, 세포 용해물을 RNA 추출 전에 수확하고, DNase 클린-업을 수행하였다. 이후, 항-CD40 특이적 프라이머/프로브 세트를 사용하여 One-Step RT-qPCR을 실행하였다. 항-CD40의 센스 가닥에 상응하는 합성 RNA 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 시험 샘플의 RNA 분량이 계산되는 표준 곡선을 생성하였다. 각각의 비감염 대조군 3회 반복실험에 대한 평균 RNA 분량은 상응하는 개별 EnAd 및 NG-350A 값으로부터 공제된 배경이었다. 이후, 세포당 항-CD40 mRNA 카피를 계산하고, 2개의 EnAd 및 2개의 NG-350A RT-qPCR 3회 반복실험의 평균을 결정하였다. 이후, 각각의 시점(n=1일 때 BxPC-3 8일 샘플을 제외하고 n=2)에서 각각의 세포주에 대해 이 2회 반복실험 값의 평균 및 SD를 계산하였다. 평균은 작도되고, 그래프는 도 27에 제시되고, SD는 오차 막대로 표시된다. EnAd 접종된 세포는 무시할만한 반응을 생성시키고, 이로써 생물학적 2회 반복실험으로부터 계산된 세포당 평균 게놈은 모든 시점 및 세포주에 걸쳐 0×100 내지 6.26×100의 범위였다. 그러므로, EnAd 데이터는 작도되지 않았다. 비감염 대조군 샘플에 대해, 생물학적 2회 반복실험으로부터 계산된 세포당 평균 항-CD40 카피는 0.00×100 내지 9.09×100의 범위였다. 그래프는 결장직장(a), 전립선, 췌장 및 유방(b), 난소(c) 및 방광(d) 종양 세포주에서의 항-CD40 전이유전자 발현을 도시한다. NG-350A 감염은 모든 인간 종양 세포주에서 항-CD40 전이유전자 mRNA 발현을 발생시키고, 상이한 세포에 대해 동역학의 차이가 관찰되었다.
전이유전자 단백질 IgG2 발현을 평가하기 위해, NG-350A에 의해 감염된 상이한 종양 세포주에 의한 인간 IgG2(NG-350A에 의해 암호화된 항-CD40 항체 중쇄의 아이소타입)의 제조를 측정하였다. 6개의 시험 종양 세포주와, 양성(A549) 및 음성(CT26) 대조군 세포주를 1ppc의 NG-350A, 1ppc의 EnAd 또는 검정 배지 단독(비감염 대조군)에 의해 접종하였다. 접종 후 상이한 시간(3일, 4일, 8일 및 11일)에, 상청액을 수확하고, 사용 전 -80℃에서 저장하였다. NG-350A-접종된 시험 세포주 및 A549 세포로부터의 상청액을 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 및 1:80 희석하였다. 모든 비감염 대조군 샘플, EnAd 감염된 세포 및 NG-350A 감염된 CT26 세포로부터의 상청액을 오직 1:2 희석하였다. 이후, 제조사의 프로토콜에 따라 인간 IgG2 시험관내 SimpleStep ELISA(Abeam)를 수행하였다. (ELISA 키트에 의해 공급된) 인간 IgG2 정제된 단백질을 사용하여 샘플 내의 IgG2 단백질의 농도(ng/㎖)가 결정되는 표준 곡선을 생성하였다. 이후, 1×106개의 세포(ng/1×106개의 세포)마다 IgG2 단백질의 분량을 계산하였다. 표준 곡선 내에 있는 ELISA 2회 반복실험의 평균으로부터 평균 및 SD를 결정하였다. 평균은 작도되고, 그래프는 도 28에 제시되고, SD는 오차 막대로 표시된다. 이 샘플이 반응을 생성하지 않는 각각의 세포주 및 시점(0×100 ng/1×106개의 세포)에 대해서 비감염 대조군 샘플을 사용한 배경 공제를 수행하지 않았다. EnAd 접종된 세포는 또한 반응을 생성시키지 않았고, 따라서 EnAd 데이터가 작도되지 않았다. IgG2 항체 제조는 NG-350A에 의해 감염된 모든 세포주에 의해 검출되었다.
실시예 8에 기재된 HEK-Blue CD40 신호전달 리포터 검정을 이용하여 NG-350A에 의해 감염된 상이한 종양 세포주에 의해 제조된 항체의 기능성을 시험하였다. 6개의 시험 종양 세포주와 양성(A549) 및 음성(CT26) 대조군 세포주를 1ppc의 EnAd, 1ppc의 NG-348 또는 검정 배지 단독(UIC)에 의해 접종하였다. 접종 후 8일 또는 11일에, 상청액을 수확하였다. 이후, 상청액을 20 내지 24시간 동안 HEK-Blue 세포와 항온처리하였다. 이후, 상청액을 치료된 HEK-Blue 세포로부터 제거하고, Quanti-Blue에 첨가하고, 1시간 동안 항온처리한 후, SpectraMax i3x 세트에서 광학 밀도(OD)를 판독하여 620㎚의 흡광도를 판독하였다. 각각의 UIC 검정 2회 반복실험에 대한 평균 광학 밀도는 상응하는 개별 EnAd 및 NG-350A 값으로부터 공제되어, 감염된 종양 세포의 상청액 중의 항체의 CD40 신호전달 활성의 평가를 생성시킨다. 이후, UIC 배경 공제된 EnAd 및 NG-350A 검정 2회 반복실험의 평균을 취해서, 각각의 시딩 및 접종 반복실험에 상응하는, (컨디션마다) 각각의 세포주에 대한 2개의 값을 생성시킨다. 이후, 이 반복실험의 평균 및 표준 편차(SD)는 결정되고, 표 3에 기재된다.
Figure pct00006
실시예 18
실험의 추가의 시리즈에서, 마우스에서의 단일 또는 다수의 정맥내 용량 이후에 NG-350A 바이러스의 생체내 바이러스 입자 매개된 효과를 모니터링하고, EnAd의 것과 비교하였다. 암컷 CD-1 마우스를 비히클 대조군 또는 2.2×1010개의 EnAd 또는 NG-350A의 입자에 의해 IV 주사하였다. 마우스를 주사 후 6시간, 24시간, 48시간 또는 7일에 심장 출혈시키고, 혈액을 항응혈제 관으로 수집하고, 처리하여 혈장을 회수하였다. 혈장 샘플을 ELISA 검정에 의해 시험하여 바이러스 입자에 대한 급성 사이토카인 반응을 검출하였다. 도 29에 제시된 데이터는 그룹마다 3 내지 6마리의 마우스를 나타낸다. NG-350A 투약에 의해 자극된 MCP-1(도 29a), IL-6(도 29b) 및 TNFα(도 29c) 수준은 EnAd에 대한 것과 유사하였다. 검정 실선은 평균을 나타낸다. 기준치는 비히클 대조군 그룹 + 3 × SD의 평균을 나타낸다.
급성 간 독성의 측정치로서 알라닌 아미노기전이효소(ALT) 수준에 대해 혈장 샘플의 다른 분취액을 시험하였다. ALT 비색 종점 효소 검정 키트를 사용하여 혈장 샘플을 분석하였다. 도 30에 제시된 데이터는 그룹마다 3 내지 6마리의 마우스를 나타낸다. 검정 실선은 평균을 나타낸다. 기준치는 비히클 대조군 그룹 + 3 × SD의 평균을 나타낸다. ALT 수준은 상이한 마우스 사이에 가변적이었지만, NG-350A 및 EnAd는 유사한 반응 프로필을 유도하였다.
암컷 CD-1 마우스의 추가의 그룹에 1일에 PBS, 또는 1일, 3일 및 5일에 2.2×l010개의 EnAd 또는 NG-350A의 바이러스 입자에 의해 IV 주사하였다. PBS 치료된 마우스를 투약 후 6시간에 심장 출혈시켰다. 바이러스 치료된 마우스를 제1 용량 후 6시간 및 24시간(각각) 측면 꼬리 정맥 및 심장 천자를 통해, 또는 제3 용량 후 6시간, 24시간 또는 7일 심장 천자를 통해 출혈시켰다. 혈장 샘플을 ELISA 검정에 의해 시험하여 바이러스 입자에 대한 급성 사이토카인 반응을 검출하였다. 도 31에 제시된 데이터는 그룹마다 3 내지 6마리의 마우스를 나타낸다. NG-350A 투약에 의해 자극된 MCP-1(도 31a) 및 IL-6(도 31b) 수준은 EnAd에 대한 것과 유사하였다. 검정 실선은 평균을 나타낸다. 기준치는 비히클 대조군 그룹 + 3 × SD의 평균을 나타낸다.
실시예 19
NG-350A의 혈액 약동력학은 면역유능 CD-1 마우스에서 1일, 3일 및 5일에 2.2×1010개의 바이러스 입자의 3개의 정맥내(IV) 용량의 각각의 투여 후 에나데노툭시레브(EnAd)와 비교되었다. 암컷 CD-1 마우스에 1일, 3일 및 5일에 2.2×1010개의 EnAd 또는 NG-350A의 바이러스 입자에 의해 IV 주사하였다. 각각의 용량 후, 각각의 바이러스에 의해 치료된 4마리의 마우스의 그룹을 투약 후 1분, 2분, 3분, 5분, 7분, 10분 및 60분에 출혈시켰다. DNA를 추출하고, qPCR에 의해 분석하여 EnAd 및 NG-350A 둘 다에 공통인 바이러스 E3 영역을 표적화하였다. 도 32에 제시된 데이터는 그룹마다 4마리의 마우스(±SD)를 나타낸다. 검정에 대해 값이 정량 한계 아래에 해당할 때, 이것을 배제하였다. 이것이 검정에 대해 지속적으로 정량 한계 아래에 해당하면서, 7분을 넘는 데이터는 작도되지 않았다. NG-350A는 EnAd의 것에 필적하는 약동력학적 프로필을 보여주었다.
실시예 20
단일 정맥내 용량 후 조직으로부터의 간 바이러스의 회수를 측정함으로써 NG-350A에 의한 마우스의 투약 이후에 바이러스 생체분포를 평가하였다. 암컷 CD-1 마우스에 비히클 대조군 또는 2.2×1010개의 NG-350A의 입자에 의해 IV 주사하였다. 마우스의 그룹을 투약 후 6시간, 24시간, 8일 또는 28일에 안락사시키고, 이의 간, 폐 및 비장을 절제하고, 드라이아이스에서 즉시 동결시켰다. 샘플을 후에 해동하고, 단백질 보존 용해 완충제 중에 균질화시키고, 용해물을 희석시키고, 포화상태 A549 단층에 첨가하고, NG-350A를 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 각각의 기관에 대해 조직 균질액을 스파이킹하였다. 단층을 96시간 동안 배양한 후, 고정하고 항-아데노바이러스 헥손 항체를 이용하는 면역염색 검정으로 처리하였다. 데이터는 도 33에서 각각의 웰의 샘플 사진으로 표시된다. 헥손 양성 세포를 갈색으로 염색하였다(도면에서 짙은 회색으로 표시됨). 24시간 후에 마우스의 간, 폐 또는 비장(마우스에서의 바이러스 생체분포의 주요 부위)에서 간 바이러스가 검출되지 않았다.
실시예 21
연구의 이 시리즈에서, 인간 종양 이종이식 보유 면역결핍 마우스에서 생체내 NG-350A 바이러스 활성을 평가하였다.
3개의 IV 주사 또는 단일 분별화 종양내(IT) 투약 후 피하 A549 폐 세포주 종양에서 바이러스 복제를 평가하였다. 암컷 SCID 마우스에 옆구리에서 A549 종양 세포를 피하로 이식하고, 종양이 일단 적어도 50㎣에 도달하면 바이러스 또는 대조군에 의해 IT 또는 IV 주사하였다. IT 투약된 마우스에 20㎕/4.4×109개의 바이러스 입자의 전체 용량에 대해 종양의 공간적으로 별개의 영역에 PBS, 또는 2.2×109개의 EnAd 또는 NG-350A의 바이러스 입자의 2개의 10㎕의 주사에 의해 주사하였다. IV 투약된 마우스에 300㎕/6.6×109개의 바이러스 입자의 전체 용량에 대해 1일, 3일 및 5일에 100㎕의 PBS, 또는 2.2×109개의 EnAd 또는 NG-350A의 바이러스 입자에 의해 주사하였다. 종양을 투약 후 7일 또는 21일에 안락사 후 마우스로부터 절제하고 동결시켰다. 종양을 후에 균질화시키고, DNA 추출하고, EnAd 및 NG-350A 둘 다에 공통인 바이러스 E3 영역을 표적화하는 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR에 의해 분석하였다. 도 34A 및 도 34B에 제시된 데이터는 그룹마다 2 내지 4마리의 마우스(±SD)를 나타낸다. NG-350A는 IT(도 34A) 또는 IV(도 34B) 투약 이후에 A549 종양 이종이식에서 EnAd의 것에 필적하는 게놈 복제를 보여주었다.
HCT-116 결장직장암 세포주를 사용하여 제2 종양 이종이식 모델을 이용하여 이 실험을 또한 반복하였다. 암컷 SCID 마우스에 옆구리에서 HCT116 종양 세포를 피하로 이식하고, 종양이 일단 적어도 50㎣에 도달하면 바이러스 또는 대조군에 의해 IT 또는 IV 주사하였다. IT 투약된 마우스에 20㎕/4.4×109개의 바이러스 입자의 전체 용량에 대해 종양의 공간적으로 별개의 영역에 PBS, 또는 2.2×109개의 EnAd 또는 NG-350A의 바이러스 입자의 2개의 10㎕의 주사에 의해 주사하였다. IV 투약된 마우스에 300㎕/6.6×109개의 바이러스 입자의 전체 용량에 대해 1일, 3일 및 5일에 100㎕의 PBS, 또는 2.2×109개의 EnAd 또는 NG-350A의 바이러스 입자에 의해 주사하였다. 종양을 투약 후 7일 또는 21일에 안락사 후 마우스로부터 절제하고 동결시켰다. 종양을 후에 균질화시키고, DNA 추출하고, EnAd 및 NG-350A 둘 다에 공통인 바이러스 E3 영역을 표적화하는 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR에 의해 분석하였다. 도 34C 및 도 34D에 제시된 데이터는 그룹마다 2 내지 4마리의 마우스(±SD)를 나타낸다. NG-350A는 IT(도 34C) 또는 IV(도 34D) 투약 이후에 HCT-116 종양 이종이식에서 EnAd의 것에 필적하는 게놈 복제를 보여주었다. SCID 마우스에서 A549 및 HCT-116 피하 이종이식 종양 둘 다에 의한 유사한 실험에서, 바이러스 RNA 발현을 종양에서 측정하였다. 암컷 SCID 마우스에 옆구리에서 A549 또는 HCT-116 종양 세포에 의해 피하로 이식하고, 종양이 일단 적어도 50㎣에 도달하면 바이러스 또는 대조군에 의해 IT 또는 IV 주사하였다. IT 투약된 마우스에 20㎕/4.4×109개의 바이러스 입자의 전체 용량에 대해 종양의 공간적으로 별개의 영역에 PBS, 또는 2.2×109개의 EnAd 또는 NG-350A의 바이러스 입자의 2개의 10㎕의 주사에 의해 주사하였다. IV 투약된 마우스에 300㎕/6.6×109개의 바이러스 입자의 전체 용량에 대해 1일, 3일 및 5일에 100㎕의 PBS, 또는 2.2×109개의 EnAd 또는 NG-350A의 바이러스 입자에 의해 주사하였다. 종양을 투약 후 7일에 안락사 후 마우스로부터 절제하고 동결시켰다. 종양을 후에 균질화시키고, DNA 추출하고, EnAd 및 NG-350A 둘 다에 공통인 바이러스 E3 mRNA를 표적화하는 프라이머 및 프로브를 사용하여 RT-qPCR에 의해 분석하였다. 도 35에 제시된 데이터는 그룹마다 3 내지 4마리의 마우스를 나타낸다. 검정 실선은 평균을 나타낸다. A549 IT(도 35A), IV(도 35B), HCT-116 IT(도 35C) 및 HCT-116 IV(도 35D)는 NG-350A 또는 EnAd 투약 이후에 필적하는 바이러스 E3 mRNA 발현을 나타낸다.
항-CD40 항체 전이유전자 mRNA 발현의 수준을 또한 동일한 피하 A549 및 HCT-116 이종이식 종양 RNA 샘플에서 측정하였다. αCD40 항체 전이유전자 mRNA를 표적화하는 프라이머 및 프로브를 사용하여 RNA를 RT-qPCR에 의해 분석하였다. 도 36에 제시된 데이터는 그룹마다 3 내지 4마리의 마우스를 나타낸다. 검정 선은 평균을 나타낸다. 오직 NG-350A 치료된 종양에서 항-CD40 항체 전이유전자 mRNA 발현을 용이하게 검출하였다. A549 IT(도 36A), IV(도 36B), HCT-116 IT(도 36C) 및 HCT-116 IV(도 36D)
항-CD40 항체 단백질의 수준을 또한 종양 용해물 및 IgG2 ELISA를 이용하여 A549 종양을 보유하는 마우스의 혈청 둘 다에서 측정하였다. 도 37에 제시된 데이터는 혈액 중보다 종양 중에 더 높은 수준으로 IT(A) 또는 IV(B)의 NG-350A 투여 이후의 항체의 선택적 검출을 나타낸다.
서열
서열번호 4 - 항-CD40 VH 사슬 아미노산 서열
Figure pct00007
서열번호 5 - 항체 불변 중쇄 아미노산 서열
Figure pct00008
서열번호 8 - 항-CD40 VL 사슬 아미노산 서열
Figure pct00009
서열번호 9 - 불변 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00010
서열번호 12 - NG-350A 전이유전자 카세트 핵산 서열
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> PsiOxus Therapeutics Limited <120> ONCOLYTIC VIRUS AND METHOD <130> WO2018/220207 <140> PCT/EP2018/064524 <141> 2018-06-01 <150> GB1708779.2 <151> 2017-06-01 <150> GB1708778.4 <151> 2017-06-01 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34794 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-350A genome sequence <400> 1 tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60 aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120 ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180 gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240 aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300 tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360 ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420 ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480 tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540 tctgcgccgg 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aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200 attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260 atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320 caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380 cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440 agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500 ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560 taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620 gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680 tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740 aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800 ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160 gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220 taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280 gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340 agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400 tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460 acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520 ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580 gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640 tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700 ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760 tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820 atgcatattt 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cctgcaacct gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacattt tcccgctcac 31200 tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat 31260 cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa 31320 taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg 31380 taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag 31440 caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac 31500 ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaggctag 31560 cttgactgac tgagatacag cgtaccttca gctcacagac atgataagat acattgatga 31620 gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga 31680 tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg 31740 cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa 31800 cctctacaaa tgtggtcctg caggaacttg tttatttgaa aatcaattca caaaatccga 31860 gtagttattt tgcctccccc ttcccattta acagaataca ccaatctctc cccacgcaca 31920 gctttaaaca tttggatacc attagatata gacatggttt tagattccac 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tgactctcca acctctccac aatatatata tacacaagcc 34500 ctaaactgac gtaatgggag taaagtgtaa aaaatcccgc caaacccaac acacaccccg 34560 aaactgcgtc accagggaaa agtacagttt cacttccgca atcccaacag gcgtaacttc 34620 ctctttctca cggtacgtga tatcccacta acttgcaacg tcattttccc acggtcgcac 34680 cgcccctttt agccgttaac cccacagcca atcaccacac gatccacact ttttaaaatc 34740 acctcattta catattggca ccattccatc tataaggtat attatataga taga 34794 <210> 14 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> R is purine, adenine or guanine <400> 14 gccgccrcca ugg 13 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> splice acceptor sequence <400> 15 tgctaatctt cctttctctc ttcagg 26 <210> 16 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> splice acceptor sequence <400> 16 tttctctctt cagg 14 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 17 acggaacttg ttactacaca gc 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> 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F2A peptide sequence <400> 25 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> High efficiency self-cleavable E2A peptide sequence <400> 26 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> High efficiency self-cleavable T2A peptide sequence <400> 27 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25

Claims (20)

  1. 항-CD40 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 전이유전자 카세트, 특히 서열번호 12의 카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스(oncolytic virus)(예를 들어, 복제 가능 바이러스(replication competent virus))로서, 상기 전이유전자 카세트는 서열번호 12에 주어진 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한(예컨대, 이것과 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는, 종양용해성 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 레오바이러스(reovirus), 홍역 바이러스(measles virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 소아마비 바이러스(polio virus), ECHO 엔테로바이러스(enterovirus), 콕사키 바이러스(Coxsackie virus) 및 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 특히 아데노바이러스로부터 선택되는, 종양용해성 바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스는 에나데노툭시레브(Enadenotucirev), 탈리모겐 라허파렙벡(talimogene laherparepvec), RIGVIR, Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12, 카바탁(Cavatak)(상표명), CG0070, DNX-2401, G207, HF10, 임리직(Imlygic)(등록상표), JX-594, MG1-MA3, MV-NIS, OBP-301, 레올리신(Reolysin)(등록상표), Toca 511, 특히 에나데노툭시레브로 이루어진 군으로부터 선택되는, 종양용해성 바이러스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 서열번호 1 또는, 예컨대, 서열번호 1을 포함하는, 이것과 적어도 95% 동일한(예컨대, 이것과 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는, 종양용해성 바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 1로 이루어진, 종양용해성 바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 종양용해성 바이러스 또는 제6항에 따른 약제학적 조성물.
  8. 암, 인슐린 내성, 비만 및/또는 면역 결핍의 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 종양용해성 바이러스 또는 제6항에 따른 약제학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 바이러스 또는 조성물은 암의 치료에서 사용하기 위한, 예를 들어, CD40을 발현하는 암(예컨대, CD40의 상향조절된 발현을 갖는 암)의 치료를 위한, 용도.
  10. (예를 들어, 암의 치료에서 사용하기 위한) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 또는 제6항에 따른 조성물 및 추가의 항암 치료제를 포함하는 병용 요법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 추가의 항암 치료제는 화학요법제인, 병용 요법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 추가의 항암 치료제는 관문 저해제인, 병용 요법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항암 치료제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제, TIM-3 저해제, LAG -3 저해제, TIGIT 저해제, B7-H3(CD276) 저해제, B7-H4(B7S1) 저해제, B7H7(HHLA2) 저해제, CD96 저해제, VISTA 저해제 및 상기의 2개 이상의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 병용 요법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 저해제는 항체 또는 이의 결합 단편인, 병용 요법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가의 항암 치료제는 동시자극 경로 작용제인, 병용 요법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 추가의 항암 치료제는 CD27 작용제, CD28 작용제, ICOS 작용제, TMIGD2(IGPR-1/CD28H) 작용제, CD226 작용제, 0X40 작용제, 4-1BB 작용제, 및 상기의 2개 이상의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 병용 요법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 치료체는 항체 또는 이의 결합 단편인, 병용 요법.
  18. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가의 항암 치료제는, 예를 들어, IL-10, TGFβ, IDO 저해제, 및 상기의 2개 이상의 조합으로부터 선택된 면역 반응 또는 면역 반응의 반대의 억제를 활성화하는, 병용 요법.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가의 암 치료제는 종양용해성 바이러스, 예를 들어, 복제 가능 종양용해성 바이러스, 예컨대, 아데노바이러스, 특히 B 그룹 아데노바이러스인, 병용 요법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스는 RNAi 서열, 항체 또는 이의 결합 단편, 케모카인, 사이토카인, 면역조절제 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 치료학적 유전자 암호화 재료를 암호화하는, 병용 요법.
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