KR20200130410A

KR20200130410A - 면역-엑소좀 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20200130410A
Application number: KR1020207029067A
Authority: KR
Inventors: 라구 칼루리; 발레리 르블루
Original assignee: 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Priority date: 2018-03-12
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2020-11-18
Also published as: WO2019178113A1; JP2021517811A; EP3765485A1; JP7378413B2; US20210007988A1; EP3765485A4; CA3093856A1; CN112424219A; JP2024012438A; AU2019234654A1

Abstract

표면에 면역조절 분자, 예를 들어, ICOSL 또는 OX40L을 포함하는 엑소좀을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 또한, 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환과 같은 면역조절을 필요로 하는 질환의 치료를 위해 이러한 엑소좀을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

면역-엑소좀 및 이의 사용 방법

관련 출원에 대한 참조

본 출원은 2018년 3월 12일자로 출원된 미국 가출원 제62/641,523호의 우선권 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.

기술분야

본 발명은 일반적으로 생물학, 의학, 종양학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 면역조절 엑소좀 및 이의 치료 용도에 관한 것이다.

엑소좀을 포함한 세포외 소포(extracellular vesicle; EV)는 여러 생리적 과정에 참여하며 DNA, RNA 및 단백질을 포함하는 나노 크기의 세포내 소통 수단이다. 많은 표면 단백질이 다양한 빈도로 엑소좀에서 식별되었지만 대체로 이들은 면역조절성이 아니다. 수지상 세포-유래 엑소좀은 경미한 면역조절 활성을 갖는 것으로 식별되었지만 T-세포 반응은 미미하다. 상피 세포 및 중간엽 세포에서 단리된 엑소좀은 일반적으로 면역조절성이 아니지만 다른 세포에 효율적으로 결합하고 들어간다. 이와 같이, T 세포의 활성화를 가능하게 하는 특정 능력이 있는 엑소좀-기반 면역조절 약물의 개발이 필요하다.

이와 같이, 표면에 면역조절 분자, 예를 들어, ICOSL 및/또는 OX40L을 갖는 엑소좀이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 엑소좀을 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 엑소좀은 이의 표면에 페이로드를 포함하고, 상기 페이로드는 면역조절 분자이다. 일부 측면에서, 면역조절 분자는 CD80, CD86, PD-L1, PD-L2, HVEM, GAL9, CTLA-4, PD-1, PD-1H, CD160, BTLA, TIM3, KIR, LAG3, A2aR, OX40L, CD27L, CD137L, BAFF, APRIL, CD70, CD40, B7H3, ICOSL, OX40, CD40L, BMCA, TACI, GITR, BAFFR, CD27, CD137, ICOS, 및/또는 CD28이다. 일부 측면에서, 엑소좀은 이의 표면에 OX40L을 포함한다. 일부 측면에서, 엑소좀은 이의 표면에 ICOSL을 포함한다. 다양한 측면에서, 엑소좀은 이의 표면에 CD47을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 엑소좀의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함한다. 특정 측면에서, 엑소좀은 면역조절 분자를 과발현시키는 세포로부터 단리된다. 일부 측면에서, 엑소좀은 치료를 필요로 하는 환자로부터 단리된다.

일부 측면에서, 엑소좀은 소포내(intravesicular) 페이로드로서 치료제를 추가로 포함한다. 다양한 측면에서, 치료제는 치료 단백질, 항체(예를 들어, 전장 항체, 모노클로날 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 또는 미니바디(minibody), 억제 RNA, CRISPR 시스템 또는 저분자 약물이다. 일부 측면에서, 치료 단백질은 손실 또는 불활성화가, 예를 들어, 종양 억제 인자, 키나제, 포스파타제 또는 전사 인자와 같은 치료될 질환과 관련된 것으로 알려진 단백질이다. 일부 측면에서, 항체는 세포내 항원에 결합한다. 이러한 세포내 항원은 종양유전자와 같이 세포 증식 및/또는 생존을 위해 활성이 필요한 단백질일 수 있다. 일부 경우에, 항체는 항원의 기능을 방지한다. 일부 경우에, 항체는 단백질-단백질 상호작용을 방해한다. 일부 측면에서, 억제 RNA는 siRNA, shRNA, miRNA 또는 pre-miRNA이다. 다양한 측면에서, 억제 RNA는, 예를 들어, 종양유전자와 같은 특정 질환 상태의 유지를 위해 활성이 필요한 단백질의 발현을 방지한다. 종양유전자가 돌연변이된 형태의 유전자인 경우, 억제 RNA는 우선적으로 야생형 단백질이 아닌 돌연변이 종양유전자의 발현을 방지할 수 있다. 일부 측면에서, CRISPR 시스템은 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제, 예를 들어 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 측면에서, 소분자 약물은 영상화제(imaging agent)이다. 일부 측면에서, 소분자 약물은 화학요법제이다.

일 구현예에서, 본 구현예 중 어느 하나의 엑소좀 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 비경구 투여를 위해 제형화된다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사를 위해 제형화된다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 항미생물제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 항미생물제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 브로노폴, 센트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알코올, 글리세린, 엑세티딘(exetidine), 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은(phenlymercuric nitrate), 프로필렌 글리콜, 또는 티메로살이다.

일 구현예에서, 질환의 치료를 필요로 하는 환자의 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 본 구현예 중 어느 하나의 조성물을 상기 환자에게 투여하여 환자의 질환을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 투여는 환자에게 면역조절을 일으킨다. 일부 측면에서, 상기 질환은 면역 질환, 암, 감염성 질환, 또는 자가면역 질환이다. 일부 측면에서, 상기 질환은 암이다. 일부 측면에서, 상기 투여는 전신 투여이다. 특정 측면에서, 상기 전신 투여는 정맥내 투여이다. 일부 측면에서, 상기 방법은 환자에게 적어도 제2 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 측면에서, 상기 제2 요법은 외과적 요법, 화학요법, 방사선 요법, 한냉요법, 호르몬 요법, 면역요법, 면역 체크포인트 차단(blockade) 또는 사이토카인 요법을 포함한다. 일부 측면에서, 제2 항암 요법은 입양 T 세포 요법, 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 환자는 인간이다. 일부 측면에서, 상기 엑소좀은 환자에게 자가이다.

일 구현예에서, 리포좀 또는 엑소좀을 치료제(예를 들어, 단백질 페이로드)로 전기천공하고 이러한 전기천공된 리포좀 엑소좀을 환자에게 제공하여 환자의 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 질환의 치료를 필요로 하는 환자의 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 상기 리포좀 또는 엑소좀은 이의 표면에 면역조절 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 질환은 면역 질환, 암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환이다. 일부 측면에서, 상기 질환은 암이다. 일부 측면에서, 상기 단백질 페이로드는 세포내 항원에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체이다.

일 구현예에서, 표면에 면역조절 분자를 포함하는 엑소좀을 치료 단백질(예를 들어, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 인코딩하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)으로 형질감염시키는 단계, 엑소좀 내에서 치료 단백질의 발현을 허용하는 조건하에 형질감염된 엑소좀을 항온배양하는 단계, 및 항온배양된 엑소좀을 환자에게 제공함으로써 치료 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법이 제공된다.

일 구현예에서, 환자의 질환 치료에 사용하기 위해 엑소좀을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 엑소좀은 이의 표면에 페이로드를 포함하고, 상기 페이로드는 면역조절 분자이다. 일부 측면에서, 면역조절 분자는 CD86, PD-L1, PD-L2, HVEM, GAL9, CTLA-4, PD-1, PD-1H, CD160, CD80, BTLA, TIM3, KIR, LAG3, A2aR, OX40L, CD27L, CD137L, BAFF, APRIL, CD70, CD40, B7H3, ICOSL, OX40, CD40L, BMCA, TACI, GITR, BAFFR, CD27, CD137, ICOS 및/또는 CD28이다. 일부 측면에서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 OX40L을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 ICOSL을 포함한다. 다양한 측면에서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 CD47을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 엑소좀의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 엑소좀은 소포내 단백질 페이로드를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 질환은 면역 질환, 암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환이다. 일부 측면에서, 상기 질환은 암이다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 비경구 또는 전신 투여를 위해 제형화된다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사를 위해 제형화된다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 항미생물제를 추가로 포함한다. 특정 측면에서, 상기 항미생물제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 브로노폴, 센트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알코올, 글리세린, 엑세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은, 프로필렌 글리콜 또는 티메로살이다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 적어도 제2 요법을 추가로 포함한다. 특정 측면에서, 상기 제2 요법은 외과적 요법, 화학요법, 방사선 요법, 한냉요법, 호르몬 요법 또는 면역요법을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 환자는 인간이다. 일부 측면에서, 상기 엑소좀은 환자에게 자가이다.

일 구현예에서, 질환 치료를 위한 약제의 제조시의 엑소좀의 용도가 본원에 제공되며, 여기서 엑소좀은 이의 표면에 페이로드를 포함하고, 상기 페이로드는 면역조절 분자이다. 일부 측면에서, 상기 면역조절 분자는 CD86, PD-L1, PD-L2, HVEM, GAL9, CTLA-4, PD-1, PD-1H, CD160, CD80, BTLA, TIM3, KIR, LAG3, A2aR, OX40L, CD27L, CD137L, BAFF, APRIL, CD70, CD40, B7H3, ICOSL, OX40, CD40L, BMCA, TACI, GITR, BAFFR, CD27, CD137, ICOS 및/또는 CD28이다. 일부 측면에서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 OX40L을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 ICOSL을 포함한다. 다양한 측면에서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 CD47을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 엑소좀의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 엑소좀은 소포내 단백질 페이로드를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 질환은 면역 질환, 암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환이다. 일부 측면에서, 상기 질환은 암이다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 비경구 또는 전신 투여를 위해 제형화된다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사를 위해 제형화된다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 항미생물제를 추가로 포함한다. 특정 측면에서, 상기 항미생물제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 브로노폴, 센트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알코올, 글리세린, 엑세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은, 프로필렌 글리콜 또는 티메로살이다.

본원에 사용된 바와 같이, 특정 성분과 관련하여 "본질적으로 없는"은 특정 성분 중 어느 것도 의도적으로 조성물로 제형화되지 않았고/않았거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 따라서 조성물의 의도하지 않은 임의의 오염으로 인한 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 특정 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 청구범위(들)에서 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)"이라는 단어와 함께 사용될 때, 단어 "a" 또는 "an"은 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.

청구범위에서 용어 "또는"의 사용은, 본 개시내용이 오직 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지하더라도, 대안만을 지칭하는 것으로 명시적으로 표시되거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이 "또 다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 장치에 대한 오류의 고유한 변동, 값을 결정하기 위해 사용되는 방법, 또는 연구 대상 사이에 존재하는 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 본 발명의 사상 및 범주 내에서 이 상세한 설명으로부터 다양한 변경 및 수정이 당업자에게 명백할 것이므로 단지 예시로서 제공되는 것으로 이해되어야 한다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이러한 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1. ICOSLG 및 OX40L 발현 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 293T 세포의 실시간 PCR 분석.
도 2a 내지 2b. ICOSLG 및 OX40L 발현 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 293T 세포, 및 이로부터 단리된 엑소좀의 웨스턴 블롯 분석. 도 2a는 ICOSLG의 발현을 나타낸다. 도 2b는 대조군 빈쿨린(vinculin)의 발현을 나타낸다.
도 3. ICOSLG 및 OX40L 발현 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 293T 세포, 및 이로부터 단리된 엑소좀의 유세포 분석.
도 4. ICOSLG⁺ 및 OX40L⁺ 엑소좀의 활성을 결정하기 위한 실험의 도식적 표현.
도 5. 나이브 T 세포를 사용하여 T 세포 증식에 미치는 ICOSLG⁺ 엑소좀의 영향에 대한 유세포 분석.
도 6. 종양 보유 마우스의 비장 T 세포를 사용하여 T 세포 증식에 대한 ICOSLG⁺ 엑소좀의 효과에 대한 유세포 분석.
도 7a 내지 7j. ICOSLG⁺ 엑소좀 및 OX40L⁺ 엑소좀을 단독으로 및 항-CTLA-4와 함께 사용한 다양한 치료 요법이 마우스의 종양 용적에 미치는 영향 분석. 도 7a는 이식 후 9, 11, 13 및 15일에 각 처리 그룹의 마우스의 종양 용적을 보여준다. 도 7b는 최대 19일까지 시간 경과에 따른 처리 그룹 G1 및 G7의 마우스의 종양 용적을 보여준다. 도 7c는 최대 19일까지 시간 경과에 따른 처리 그룹 G2 및 G7의 마우스의 종양 용적을 보여준다. 도 7d는 최대 19일까지 시간 경과에 따른 처리 그룹 G3 및 G7의 마우스의 종양 용적을 보여준다. 도 7e는 최대 19일까지 시간 경과에 따른 처리 그룹 G4 및 G7의 마우스의 종양 용적을 보여준다. 도 7f는 최대 19일까지 시간 경과에 따른 처리 그룹 G5 및 G7의 마우스의 종양 용적을 보여준다. 도 7g는 최대 19일까지 시간 경과에 따른 처리 그룹 G6 및 G7의 마우스의 종양 용적을 보여준다. 도 7h는 최대 19일까지 시간 경과에 따른 처리 그룹 G3 및 G6의 마우스의 종양 용적을 보여준다. 도 7i는 최대 19일까지 시간 경과에 따른 처리 그룹 G1 및 G5의 마우스의 종양 용적을 보여준다. 도 7j는 최대 19일까지 시간 경과에 따른 처리 그룹 G4 및 G6의 마우스의 종양 용적을 보여준다.

본원에서는 암 및 기타 질환에 적용하여 적응 면역계를 조절하는 능력을 갖는 엑소좀을 생성하는 새롭고 효율적인 방법이 제공된다. 개념의 증거로서 ICOSL 또는 OX40L을 발현시키는 239T-유래 엑소좀이 생성되었다. 엑소좀은 T 세포 활성화 특성 및 항종양 면역을 강조하는 시험관내 및 생체내 활성을 입증하는 데 사용되었다. 이러한 im엑소좀(imExosome)은 종양 면역을 조절하는 작용제 및 길항제 항체, 및 면역계를 조절하는 잠재적인 소분자와 유사하거나 이보다 더 나은 특성으로 기능할 수 있는 차세대 면역조절 약물을 나타낸다. im엑소좀^ICOSL 및 im엑소좀^OX40L로 종양-보유 마우스의 나이브 T 세포 및 비장 T 세포를 치료하면 T 세포가 활성화되고 INF-γ 및 IL-2가 생성된다. im엑소좀^ICOSL 및 im엑소좀^OX40의 주사는 항-CTLA4와 함께 그리고 그 자체로 B16F10 흑색종 종양을 억제한다. 이러한 im엑소좀 플랫폼은 면역계를 조절하기 위해 표면 및 관내 단백질 페이로드가 있는 엑소좀을 생성하는 능력을 갖는다.

I. 지질-기반 나노입자

일부 구현예에서, 지질-기반 나노입자는 리포좀, 엑소좀, 지질 제제, 또는 또 다른 지질-기반 나노입자, 예를 들어 지질-기반 소포(예를 들어, DOTAP:콜레스테롤 소포)이다. 지질-기반 나노입자는 양전하, 음전하 또는 중성일 수 있다.

B. 리포좀

"리포좀"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포좀은 일반적으로 인지질을 포함하는 이중층 막, 및 일반적으로 수성 조성물을 포함하는 내부 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것으로 특성화될 수 있다. 본원에 제공된 리포좀은 단층 리포좀, 다층 리포좀 및 다소포성 리포좀을 포함한다. 본원에 제공된 리포좀은 양전하, 음전하 또는 중성 전하를 띨 수 있다. 특정 구현예에서, 리포좀은 중성 전하이다.

다층 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이러한 리포좀은 인지질을 포함하는 지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조가 형성되기 전에 자가-재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다. 친유성 분자 또는 친유성 영역을 갖는 분자는 또한 지질 이중층에 용해되거나 이와 결합될 수 있다.

특정 측면에서, 폴리펩티드, 핵산 또는 소분자 약물은, 예를 들어, 리포좀의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포좀 및 폴리펩티드/핵산 둘 다와 결합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀에 포획되거나, 리포좀과 복합체화되거나 할 수 있다.

본 구현예에 따라 사용되는 리포좀은 당업자에게 공지된 바와 같이 상이한 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 인지질, 예를 들어 중성 인지질 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)은 3급-부탄올에 용해된다. 이어서 지질(들)은 폴리펩티드, 핵산 및/또는 다른 성분(들)과 혼합된다. 트윈(Tween) 20이 조성물 중량의 약 5%가 되도록 지질 혼합물에 트윈 20을 첨가한다. 3급-부탄올의 용적이 적어도 95%가 되도록 과량의 3급-부탄올을 이 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 와동하고, 드라이 아이스/아세톤 욕에서 냉동시키고, 밤새 동결건조한다. 동결건조된 제제는 -20℃에 보관되며 최대 3개월까지 사용될 수 있다. 필요한 경우 동결건조된 리포좀은 0.9% 염수로 재구성된다.

대안적으로, 리포좀은 용기, 예를 들어 복숭아형 유리 플라스크 내에서 용매에 지질을 혼합하여 제조될 수 있다. 용기는 예상되는 리포좀 현탁액의 용적보다 10배 더 큰 용적을 가져야 한다. 회전 증발기를 사용하여 용매를 약 40℃에서 음압(negative pressure)하에 제거한다. 용매는 일반적으로 리포좀의 원하는 용적에 따라 약 5분에서 2시간 이내에 제거된다. 조성물은 진공하에 데시케이터에서 추가로 건조될 수 있다. 건조된 지질은 일반적으로 시간이 지남에 따라 열화되는 경향 때문에 약 1주 후에 폐기된다.

건조된 지질은, 모든 지질 필름이 재현탁될 때까지 진탕시켜 멸균된 발열원이 없는 물에서 대략 25 내지 50mM 인지질로 수화될 수 있다. 이어서 수성 리포좀을 분취액으로 분리하고, 각각 바이알에 넣고, 동결건조하고 진공하에 밀봉한다.

상기 기재된 바와 같이 제조된 건조된 지질 또는 동결건조된 리포좀은 단백질 또는 펩티드 용액에서 탈수 및 재구성될 수 있으며, 적절한 용매, 예를 들어, DPBS를 사용하여 적절한 농도로 희석될 수 있다. 이어서 혼합물을 볼텍스 믹서에서 격렬하게 진탕시킨다. 호르몬, 약물, 핵산 작제물 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 작용제(agent)와 같은 캡슐화되지 않은 추가 물질은 29,000×g에서 원심분리하여 제거되고, 리포좀 펠렛은 세척된다. 세척된 리포좀은 적절한 총 인지질 농도, 예를 들어, 약 50 내지 200mM로 재현탁된다. 캡슐화된 추가 물질 또는 활성제의 양은 표준 방법에 따라 결정될 수 있다. 리포좀 제제에 캡슐화된 추가 물질 또는 활성제의 양을 결정한 후 리포좀을 적절한 농도로 희석하고 사용할 때까지 4℃에서 보관할 수 있다. 리포좀을 포함하는 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균된 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제, 예를 들어 물 또는 염수 용액을 포함할 것이다.

본 구현예에 유용할 수 있는 추가 리포좀은 양이온성 리포좀, 예를 들어 WO 02/100435A1, 미국 특허 5,962,016, 미국 출원 2004/0208921, WO 03/015757A1, WO 04029213A2, 미국 특허 5,030,453, 및 미국 특허 6,680,068(이들 모두는 면책 조항 없이 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 양이온성 리포좀을 포함한다.

이러한 리포좀을 제조할 때, 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 임의의 프로토콜이 사용될 수 있다. 리포좀을 제조하는 추가의 비제한적 예는 미국 특허 4,728,578, 4,728,575, 4,737,323, 4,533,254, 4,162,282, 4,310,505, 및 4,921,706; 국제 출원 PCT/US85/01161 및 PCT/US89/05040(각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

특정 구현예에서, 지질-기반 나노입자는 중성 리포좀(예를 들어, DOPC 리포좀)이다. 본원에 사용된 "중성 리포좀" 또는 "비-하전 리포좀"은 본질적으로 중성, 순전하(실질적으로 비-하전)를 생성하는 하나 이상의 지질 성분을 갖는 리포좀으로 정의된다. "본질적으로 중성" 또는 "본질적으로 하전되지 않은"은 주어진 집단(예를 들어, 리포좀 집단) 내의 지질 성분이 존재한다면 극히 일부가 또 다른 성분의 반대 전하에 의해 상쇄되지 않는 전하를 포함함을 의미한다(즉, 10% 미만, 더 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만의 성분은 상쇄되지 않은 전하를 포함한다). 특정 구현예에서, 중성 리포좀은 주로 생리적 조건하에(즉, 약 pH 7에서) 자체로 중성인 지질 및/또는 인지질을 포함할 수 있다.

본 구현예의 리포좀 및/또는 지질-기반 나노입자는 인지질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 종류의 인지질이 리포좀 생성에 사용될 수 있다(예를 들어, DOPC와 같은 중성 인지질이 중성 리포좀을 생성하는 데 사용될 수 있음). 다른 구현예에서, 한 종류 이상의 인지질을 사용하여 리포솜을 생성할 수 있다. 인지질은 천연 또는 합성 공급원에서 유래할 수 있다. 인지질은, 예를 들어, 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하고; 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린은 생리적 조건하에(즉, 약 pH 7에서) 하전되지 않기 때문에, 이러한 화합물은 중성 리포좀 생성에 특히 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 인지질 DOPC는 하전되지 않은 리포좀을 생성하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 인지질이 아닌 지질(예를 들어, 콜레스테롤)이 사용될 수 있다.

인지질은 글리세로인지질 및 특정 스핑고지질을 포함한다. 인지질은 디올레오일포스파티딜콜린("DOPC"), 에그 포스파티딜콜린("EPC"), 디라우릴오일포스파티딜콜린("DLPC"), 디미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"), 디팔미토일포스파티딜콜린("DPPC"), 디스테아로일포스파티딜콜린("DSPC"), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린("MPPC"), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린("PMPC"), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린("PSPC"), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린("SPPC"), 디라우릴오일포스파티딜글리세롤("DLPG"), 디미리스토일포스파티딜글리세롤("DMPG"), 디팔미토일포스파티딜글리세롤("DPPG"), 디스테아로일포스파티딜글리세롤("DSPG"), 디스테아로일 스핑고미엘린("DSSP"), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민("DSPE"), 디올레오일포스파티딜글리세롤("DOPG"), 디미리스토일 포스파티드산("DMPA"), 디팔미토일 포스파티드산("DPPA"), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민("DMPE"), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민("DPPE"), 디미리스토일 포스파티딜세린("DMPS"), 디팔미토일 포스파티딜세린("DPPS"), 뇌 포스파티딜세린("BPS"), 뇌 스핑고미엘린("BSP"), 디팔미토일 스핑고미엘린("DPSP"), 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC"), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DAPC"), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DBPC"), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DEPC"), 디올레오일포스파티딜에탄올아민("DOPE"), 팔미토일로에오일(palmitoyloeoyl) 포스파티딜콜린("POPC"), 팔미토일로에오일 포스파티딜에탄올아민("POPE"), 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

C. 엑소좀

"세포외 소포" 및 "EV"는, 한 부류로서, 엑소좀, 엑소좀-유사 소포, 엑토좀(이는 원형질막에서 직접 소포의 발아로부터 생성됨), 미세입자, 미세소포, 쉐딩 미세소포(shedding microvesicle; SMV), 나노입자 및 심지어 (대형) 아폽토시스 수포(bleb) 또는 소체(body)(세포 사멸로부터 기인함) 또는 막 입자를 포함하는, 세포-유래 및 세포-분비 미세소포이다.

본원에 사용된 용어 "미세소포" 및 "엑소좀"은 직경(또는 입자가 회전타원체가 아닌 경우 가장 긴 치수)이 약 10nm 내지 약 5000nm, 더 통상적으로 30nm 내지 1000nm, 가장 통상적으로 약 50nm 내지 750nm인 막 입자를 나타내며, 여기서 엑소좀 막의 적어도 일부는 세포로부터 직접 얻어진다. 가장 일반적으로, 엑소좀은 공여 세포 크기의 최대 5% 크기(평균 직경)를 가질 것이다. 따라서, 특히 고려되는 엑소좀은 세포로부터 흘러나온 엑소좀이 포함된다.

엑소좀은, 예를 들어, 체액과 같은 임의의 적합한 샘플 유형에서 검출되거나 이로부터 단리될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 자연 환경으로부터의 분리를 나타내고, 적어도 부분적인 정제를 포함하는 것을 의미하며, 실질적인 정제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "샘플"은 본 발명에 의해 제공되는 방법에 적합한 임의의 샘플을 나타낸다. 샘플은 검출 또는 단리에 적합한 엑소좀을 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 샘플 공급원으로는 혈액, 골수, 흉수, 복막액, 뇌척수액, 소변, 타액, 양수, 악성복수, 기관지-폐포 세척 유체, 활액, 모유, 땀, 누액, 관절액, 및 기관지 세척액이 포함된다. 일 측면에서, 샘플은 예를 들어 전혈 또는 이의 임의의 분획 또는 성분을 포함하는 혈액 샘플이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 혈액 샘플은 정맥, 동맥, 말초, 조직, 탯줄 등과 같은 혈액 세포 또는 이의 성분을 포함하는 임의의 알려진 공급원으로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 잘 알려진 일상적인 임상 방법(예를 들어, 전혈 채취 및 처리 절차)을 사용하여 샘플을 얻고 처리할 수 있다. 일 측면에서, 예시적인 샘플은 암에 걸린 대상체로부터 채취한 말초 혈액일 수 있다.

엑소좀은 또한 수술 샘플, 생검 샘플, 조직, 대변 및 배양된 세포와 같은 조직 샘플로부터 단리될 수 있다. 조직 공급원에서 엑소좀을 단리할 때 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 조직을 균질화한 다음 세포를 용해시켜 엑소좀을 방출하는 것이 필요할 수 있다. 조직 샘플에서 엑소좀을 단리할 때 엑소좀을 파괴하지 않는 균질화 및 용해 절차를 선택하는 것이 중요하다. 본원에서 고려되는 엑소좀은 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 용액, 예를 들어, 완충 염수, 성장 배지, 다양한 수성 배지 등에서 체액으로부터 단리된다.

엑소좀은 새로 수집된 샘플 또는 동결 또는 냉동 보관된 샘플에서 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 세포 배양 배지에서 단리될 수 있다. 필수적이지는 않지만, 샘플에서 임의의 잔해물을 제거하기 위해 용적-제외 중합체로 침전시키기 전에 유체 샘플을 정화하면 더 높은 순도의 엑소좀을 얻을 수 있다. 정화 방법으로는 원심분리, 초원심분리, 여과 또는 한외여과가 포함된다. 가장 통상적으로, 엑소좀은 당해 분야에 잘 알려진 수많은 방법에 의해 단리될 수 있다. 한 가지 바람직한 방법은 체액 또는 세포 배양 상청액으로부터의 분별 원심분리이다. 엑소좀의 예시적인 단리 방법은 문헌(참조: Losche et al., 2004; Mesri and Altieri, 1998; Morel et al., 2004)에 기재되어 있다. 대안적으로, 엑소좀은 문헌(참조: Combes et al., 1997)에 기재된 대로 유세포 분석을 통해 단리될 수 있다.

엑소좀의 단리를 위해 허용되는 한 가지 프로토콜은 종종 상대적으로 저밀도인 엑소좀을 부유시키기 위해 수크로스 밀도 구배 또는 수크로스 쿠션과 조합된 초원심분리를 포함한다. 순차적 분별 원심분리에 의한 엑소좀의 단리는 다른 미세소포 또는 거대분자 복합체와 크기 분포가 겹칠 가능성으로 인해 복잡하다. 또한, 원심분리는 이의 크기에 따라 소포를 분리하는 수단으로 불충분할 수 있다. 그러나, 순차적 원심분리는, 수크로스 구배 초원심분리와 조합될 때, 높은 엑소좀 농축을 제공할 수 있다.

초원심분리 경로에 대한 대안을 사용한 크기에 따른 엑소좀의 분리는 또 다른 선택사항이다. 초원심분리보다 시간이 덜 걸리고 특수 장비를 사용할 필요가 없는 한외여과 절차를 사용한 엑소좀의 성공적인 정제가 보고되었다. 마찬가지로, 하나의 마이크로필터에서 세포, 혈소판 및 세포 잔해물을 제거하고 양압을 사용하여 유체를 구동시키는 두 번째 마이크로필터에서 30nm보다 큰 소포를 포획할 수 있는 상용 키트(엑소미르(EXOMIR)™, 비오 사이언티픽(Bioo Scientific))가 이용 가능하다. 그러나, 이 과정에서 엑소좀은 회수되지 않고, 두 번째 마이크로필터에서 포착된 물질에서 RNA 내용물을 직접 추출하여 PCR 분석에 사용할 수 있다. HPLC-기반 프로토콜을 사용하면 잠재적으로 고순도 엑소좀을 얻을 수 있지만, 이러한 과정은 전용 장비가 필요하고 확장이 어렵다. 중요한 문제는 혈액 및 세포 배양 배지 모두 엑소좀과 동일한 크기 범위의 많은 수의 나노입자(일부 비-소포성)를 포함한다는 것이다. 예를 들어, 일부 miRNA는 엑소좀이 아닌 세포외 단백질 복합체 내에 포함될 수 있지만; 프로테아제(예를 들어, 프로테이나제 K)를 사용한 처리는 "엑스트라엑소좀" 단백질에 의한 모든 가능한 오염을 제거하기 위해 수행될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 암세포 유래 엑소좀은 면역특이적 상호작용(예를 들어, 면역자기 포획)을 포함하는 것과 같이, 엑소좀에 대해 샘플을 농축시키기 위해 일반적으로 사용되는 기술에 의해 포획될 수 있다. 면역자기 세포 분리라고도 알려진 면역자기 포획은 통상적으로 특정 세포 유형에서 발견되는 단백질에 대한 항체를 작은 상자성 비드에 부착하는 것을 포함한다. 항체-코팅된 비드가 혈액과 같은 샘플과 혼합되면, 이는 특정 세포에 부착되어 주변을 둘러싼다. 이어서 샘플을 강한 자기장에 배치하여 비드가 한쪽으로 펠렛화되도록 한다. 혈액을 제거한 후 포획된 세포는 비드와 함께 유지된다. 이러한 일반적인 방법의 많은 변형은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 엑소좀을 단리하는 데 사용하기에 적합하다. 일례로, 엑소좀은 자기 비드(예를 들어, 알데하이드/설페이트 비드)에 부착될 수 있고, 이어서 항체가 혼합물에 첨가되어 비드에 부착된 엑소좀의 표면상의 에피토프를 인식한다. 암세포 유래 엑소좀에서 발견되는 것으로 알려진 단백질의 예는 ATP-결합 카세트 서브-패밀리 A 구성원 6(ABCA6), 테트라스파닌-4(TSPAN4), SLIT 및 NTRK-유사 단백질 4(SLITRK4), 추정 프로토카드헤린 베타-18(PCDHB18), 골수 세포 표면 항원 CD33(CD33) 및 글리피칸-1(GPC1)을 포함한다. 예를 들어, 이들 단백질 중 하나 이상에 대한 항체 또는 압타머를 사용하여 암세포 유래 엑소좀을 단리할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 분석은 엑소좀의 직접 또는 간접 시각화를 허용하는 모든 방법이 포함되며, 생체내 또는 생체외일 수 있다. 예를 들어, 분석은 고체 기질에 결합된 엑소좀의 생체외 현미경 또는 혈구 계측 검출 및 시각화, 유세포 분석, 형광 이미징 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 측면에서, 암세포 유래 엑소좀은 ATP-결합 카세트 서브-패밀리 A 구성원 6(ABCA6), 테트라스파닌-4(TSPAN4), SLIT 및 NTRK-유사 단백질 4(SLITRK4), 추정 프로토카드헤린 베타-18(PCDHB18), 골수 세포 표면 항원 CD33(CD33), 글리피칸-1(GPC1), 히스톤 H2A 유형 2-A(HIST1H2AA), 히스톤 H2A 유형 1-A(HIST1H1AA), 히스톤 H3.3(H3F3A), 히스톤 H3.1(HIST1H3A), 아연 핑거 단백질 37 동족체(ZFP37), 라미닌 서브유닛 베타-1(LAMB1), 요세관간질성신염 항원-유사(TINAGL1), 페록시레데옥신(Peroxiredeoxin)-4(PRDX4), 콜라겐 알파-2(IV) 사슬(COL4A2), 추정 단백질 C3P1(C3P1), 헤미센틴-1(HMCN1), 추정 로필린-2-유사 단백질(RHPN2P1), 안키린 반복 도메인-함유 단백질 62(ANKRD62), 트리파타이트 모티프-함유 단백질 42(Tripartite motif-containing protein 42; TRIM42), 결합 플라코글로빈(Junction plakoglobin; JUP), 튜불린 베타-2B 사슬(TUBB2B), 엔도리보뉴클레아제 다이서(DICER1), E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 TRIM71(TRIM71), 카타닌 p60 ATPase-함유 서브유닛 A-유사 2(KATNAL2), 단백질 S100-A6(S100A6), 5'-뉴클레오티다아제 도메인-함유 단백질 3(NT5DC3), 발린-tRNA 리가아제(VARS), 카즈린(KAZN), ELAV-유사 단백질 4(ELAVL4), RING 핑거 단백질 166(RNF166), FERM 및 PDZ 도메인-함유 단백질 1(FRMPD1), 78 kDa 글루코스-조절 단백질(HSPA5), 트래피킹 단백질 입자 복합체 서브유닛 6A(Trafficking protein particle complex subunit 6A; TRAPPC6A), 스쿠알렌 모노옥시게나아제(SQLE), 종양 감수성 유전자 101 단백질(TSG101), 공포 단백질 분류 28 동족체(Vacuolar protein sorting 28 homolog; VPS28), 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자(PTGFRN), 이소부티릴-CoA 데하이드로게나아제, 미토콘드리아(ACAD8), 26S 프로테아제 조절 서브유닛 6B(PSMC4), 연장 인자 1-감마(EEF1G), 티틴(TTN), 티로신-단백질 포스파타아제 유형 13(PTPN13), 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI1), 또는 카복시펩티다아제 E(CPE) 중 하나 이상에 대한 항체를 사용하여 검출되고, 이어서 고체 기질에 결합되고/되거나 현미경 또는 혈구 계측 검출을 사용하여 시각화된다.

세포에서 발현되는 모든 단백질이 그 세포에 의해 분비되는 엑소좀에서 발견되는 것은 아니라는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 칼넥신, GM130 및 LAMP-2는 모두 MCF-7 세포에서 발현되는 단백질이지만 MCF-7 세포에서 분비되는 엑소좀에서는 발견되지 않는다(참조: Baietti et al., 2012). 또 다른 예로서, 한 연구에서는 190/190 췌관 선암 환자가 건강한 대조군보다 GPC1+ 엑소좀 수치가 더 높았음을 발견하였다(참조: Melo et al., 2015, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 특히 건강한 대조군의 평균 2.3%만이 GPC1+ 엑소좀을 가졌다.

2. 세포 배양으로부터 엑소좀을 수집하기 위한 예시적인 프로토콜

1일에, 10% FBS를 함유하는 배지 중에서 T225 플라스크에 충분한 세포(예를 들어, 약 5백만개의 세포)를 접종하여 다음날 세포가 약 70% 융합될 수 있도록 한다. 2일에, 세포 상의 배지를 흡인하고, PBS로 세포를 2회 세척한 다음 25 내지 30mL 기본 배지(즉, PenStrep 또는 FBS 없음)를 세포에 첨가한다. 세포를 24 내지 48시간 동안 항온배양한다. 48시간 항온배양이 선호되지만, 일부 세포주는 무혈청 배지에 더 민감하므로 항온배양 시간을 24시간으로 줄여야 한다. FBS에는 나노사이트(NanoSight) 결과를 크게 왜곡할 수 있는 엑소좀이 포함되어 있다는 점에 유의한다.

3/4일에, 800×g에서 5분 동안 실온에서 배지와 원심분리기를 수집하여 사멸된 세포와 큰 잔해물을 펠렛화한다. 상청액을 새로운 코니칼 튜브로 옮기고 배지를 다시 2000×g에서 10분 동안 원심분리하여 다른 큰 잔해물과 큰 소포를 제거한다. 0.2㎛ 필터를 통해 배지를 통과시킨 다음 튜브당 35mL를 사용하여 초원심분리기 튜브(예를 들어, 25×89mm 벡크만 울트라-클리어(Beckman Ultra-Clear))에 분취한다. 튜브당 배지의 용적이 35mL 미만인 경우, 35mL에 도달하도록 튜브의 나머지 부분을 PBS로 채운다. SW 32 Ti 로터(k-인자 266.7, RCF 최대 133,907)를 사용하여 4℃에서 28,000rpm으로 2 내지 4시간 동안 배지를 초원심분리한다. 약 1인치의 액체가 남을 때까지 상청액을 조심스럽게 흡인한다. 튜브를 기울이고 나머지 매질이 흡인기 피펫에 천천히 들어갈 수 있게 한다. 원하는 경우, 엑소좀 펠렛을 PBS에 재현탁시키고 28,000rpm에서 1 내지 2시간 동안 초원심분리를 반복하여 엑소좀 집단을 추가로 정제할 수 있다.

마지막으로, 210㎕ PBS에서 엑소좀 펠렛을 재현탁시킨다. 각 샘플에 대해 여러 개의 초원심분리기 튜브가 있는 경우, 동일한 210㎕ PBS를 사용하여 각 엑소좀 펠렛을 연속적으로 재현탁시킨다. 각 샘플에 대해, 10㎕를 취하고 990㎕ H₂O에 첨가하여 나노입자 추적 분석에 사용한다. 나머지 200㎕ 엑소좀-함유 현탁액을 다운스트림 공정에 사용하거나 즉시 -80℃에 보관한다.

3. 혈청 샘플로부터 엑소좀을 추출하기 위한 예시적인 프로토콜

먼저, 혈청 샘플을 얼음에서 해동시킨다. 이어서, 11mL PBS에 250㎕의 무세포 혈청 샘플을 희석하고; 0.2㎛ 기공 필터를 통해 여과한다. 희석된 샘플을 150,000×g에서 밤새 4℃에서 초원심분리한다. 다음날, 조심스럽게 상청액을 버리고 11mL PBS에서 엑소좀 펠렛을 세척한다. 2시간 동안 4℃에서 150,000×g에서 두 번째 초원심분리를 수행한다. 마지막으로, 상청액을 조심스럽게 버리고 분석을 위해 100㎕ PBS에 엑소좀 펠렛을 재현탁한다.

D. 엑소좀 및 리포좀의 전기천공을 위한 예시적인 프로토콜

400㎕의 전기천공 완충액(1.15mM 인산칼륨, pH 7.2, 25mM 염화칼륨, 21% 옵티프렙(Optiprep))에서 1×10⁸ 엑소좀(나노사이트 분석으로 측정) 또는 100nm 리포좀(예를 들어, 엔캡슐라 나노 사이언시즈(Encapsula Nano Sciences)에서 구입함) 및 siRNA(퀴아젠(Qiagen)) 또는 shRNA 1㎍을 혼합한다. 4mm 큐벳을 사용하여 엑소좀 또는 리포좀을 전기천공한다(예를 들어, Alvarez-Erviti et al., 2011; El-Andaloussi et al., 2012 참조). 전기천공 후, 엑소좀 또는 리포좀을 프로테아제가 없는 RNAse로 처리한 다음 10배 농축된 RNase 억제제를 첨가한다. 마지막으로, 상기 기재된 초원심분리 방법으로 엑소좀 또는 리포좀을 PBS로 세척한다.

II. 면역조절 분자

본원에서는 암 및 기타 질환에 적용하여 적응 면역계를 조절하는 능력을 갖는 엑소좀을 생성하는 새롭고 효율적인 방법이 제공된다. 이를 위해, 표면에 면역조절 분자를 갖는 엑소좀이 생성된다. 개념의 증거로서 ICOSL 또는 OX40L을 발현시키는 239T-유래 엑소좀이 생성되었다. 엑소좀은 T 세포 활성화 특성 및 항종양 면역을 강조하는 시험관내 및 생체내 활성을 입증하는 데 사용되었다. 이러한 im엑소좀 플랫폼은 면역계를 조절하기 위해 표면 및 관내 단백질 페이로드가 있는 엑소좀을 생성하는 능력을 갖는다. 면역조절 분자는 면역 반응을 향상시키거나 억제할 수 있다. 면역 체크포인트 조절 및 다양한 리간드:수용체 쌍을 논의하는 다음의 참조문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: Pardoll (2014); Wykes & Lewin (2018); Pico de Coana et al. (2015).

예를 들어, 이론에 구속되지 않고, 면역 세포 표면에 존재하는 억제 수용체를 통해 시그널링을 직접 자극하기 위해 면역 억제 수용체에 대한 리간드를 포함하는 엑소좀을 사용하여 억제 분자를 통한 시그널링을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 엑소좀 페이로드로 전달될 수 있는 억제-수용체 리간드의 예로는, 제한 없이, CD80, CD86, PD-L1, PD-L2, HVEM 및 GAL9가 포함된다. 대안적으로, 엑소좀 페이로드는 하기 논의된 바와 같이 면역 억제 수용체에 대한 작용제로서 작용하는 항체를 포함할 수 있다.

예를 들어, 이론에 구속되지 않고, 수용체의 리간드에 대한 스펀지로서 작용하고, 면역 세포 표면에 존재하는 억제 수용체와의 리간드 결합을 방지하기 위해 면역 억제 수용체를 포함하는 엑소좀을 사용하여 억제 분자를 통한 시그널링을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 엑소좀 페이로드로서 전달될 수 있는 억제 수용체의 예로는, 제한 없이, CTLA-4, PD-1, PD-1H, CD160, CD80, BTLA, TIM3, KIR, LAG3, 및 A2aR이 포함된다. 대안적으로, 엑소좀 페이로드는 하기 논의된 바와 같이, 면역 억제 수용체에 대한 길항제로서 작용하는 항체, 또는 리간드에 결합하여 리간드가 이의 수용체와 결합하는 것을 방지하는 항체를 포함할 수 있다.

예를 들어, 이론에 구속되지 않고, 면역 세포 표면에 존재하는 자극 수용체를 통해 시그널링을 직접 자극하기 위해 면역 자극 수용체에 대한 리간드를 포함하는 엑소좀을 사용하여 자극 분자를 통한 시그널링을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 엑소좀 페이로드로서 전달될 수 있는 자극-수용체 리간드의 예로는, 제한 없이, OX40L, CD27L, CD137L, BAFF, APRIL, CD70, CD40, B7H3, ICOSL, CD80, 및 CD86이 포함된다. 대안적으로, 엑소좀 페이로드는 하기 논의된 바와 같이, 면역 자극 수용체에 대한 작용제로서 작용하는 항체를 포함할 수 있다.

예를 들어, 이론에 구속되지 않고, 수용체의 리간드에 대한 스펀지로서 작용하여 리간드가 면역 세포 표면에 존재하는 자극 수용체와 결합하는 것을 방지하기 위해 면역 자극 수용체를 포함하는 엑소좀을 사용하여 자극 분자를 통한 시그널링을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 엑소좀 페이로드로서 전달될 수 있는 자극 수용체의 예로는, 제한 없이, OX40, CD40L, BMCA, TACI, GITR, BAFFR, CD27, CD137, ICOS, 및 CD28이 포함된다. 대안적으로, 엑소좀 페이로드는 하기 논의된 바와 같이, 면역 자극 수용체에 대한 길항제로서 작용하는 항체, 또는 리간드에 결합하여 리간드가 이의 수용체와 결합하는 것을 방지하는 항체를 포함할 수 있다.

II. 질환의 치료

본 발명의 특정 측면은, 표면에 면역조절 분자, 예를 들어, OX40L 또는 ICOSL을 포함하는 엑소좀으로 면역조절이 필요한 환자를 치료하는 것을 제공한다. 면역조절 분자는 막 결합될 수 있다. 엑소좀은 환자에서 면역조절을 유도할 수 있으며, 즉, 엑소좀은 필요에 따라 면역 반응을 향상시키거나 억제할 수 있다. 이와 같이, 면역 반응의 조절이 바람직한 임의의 질환의 치료가 고려된다. 예를 들어, 제한 없이, 상기 질환은 면역 질환, 암, 감염성 질환, 또는 자가면역 질환일 수 있다.

엑소좀의 표면에 있는 면역조절 분자에 더하여, 엑소좀은 mRNA 전사 및 단백질 번역을 완료하는 데 필요한 기구를 포함하는 것으로 알려져 있으므로(PCT/US2014/068630 참조, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 치료 단백질을 인코딩하는 mRNA 또는 DNA 핵산은 엑소좀으로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 치료 단백질 자체는 엑소좀으로 전기천공되거나 리포솜에 직접 통합될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "대상체"는 본 방법이 수행되는 임의의 개인 또는 환자를 나타낸다. 일반적으로 대상체는 인간이지만, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 대상체는 동물일 수 있다. 따라서 설치류(마우스, 랫트, 햄스터 및 기니피그 포함), 고양이, 개, 토끼, 농장 동물(소, 말, 염소, 양, 돼지 등 포함) 및 영장류(원숭이, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라 포함)와 같은 포유류를 포함한 다른 동물이 대상체의 정의 내에 포함된다.

"치료" 및 "치료하는"은 질환 또는 건강-관련 상태의 치료적 이점을 얻기 위한 목적으로 대상체에 치료제의 투여 또는 적용, 또는 대상체에 대한 시술 또는 양식(modality)의 수행을 나타낸다. 예를 들어, 치료는 표면에 OX40L 또는 ICOSL을 포함하는 엑소좀의 투여, 화학요법, 면역요법 또는 방사선 요법, 수술의 수행, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료적 이점" 또는 "치료적으로 효과적인"은 이 상태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 웰빙을 촉진하거나 향상시키는 모든 것을 나타낸다. 여기에는 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도 감소가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 암 치료는, 예를 들어, 종양 침습성 감소, 암 성장률 감소 또는 전이 예방을 포함할 수 있다. 암 치료는 또한 암에 걸린 대상체의 생존을 연장하는 것을 나타낼 수 있다. 자가면역 질환의 치료는, 예를 들어, 원하지 않는 면역 반응이 있는 자가-항원의 내성을 유도하거나 자가-항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 감염성 질환의 치료는, 예를 들어, 감염원 제거, 감염원 수준 감소, 또는 특정 수준으로의 감염원 수준 유지를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "암"은 고형 종양, 전이성 암 또는 비-전이성 암을 기재하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 직장, 항문, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁에서 비롯될 수 있다.

암은 구체적으로 다음과 같은 조직학적 유형일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두모양 암종; 편평세포 암종; 림프상피성 암종; 기저세포 암종; 모발기질 암종; 이행세포 암종; 유두모양 이행세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 복합 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종(trabecular adenocarcinoma); 샘낭암종; 선종폴립 내 선암종; 선암종, 가족성 대장폴립증; 고형 암종; 카르시노이드 종양, 악성; 세기관지-폐포 선암종; 유두모양 선암종; 혐색소성 암종; 호산성 암종; 호산세포 선암종; 호염기 암종; 투명세포 선암종; 과립상세포 암종; 여포상 선암종; 유두모양 및 여포상 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신피질 암종; 자궁내막양 암종; 피부 부속기관 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점막표피모양 암종; 낭샘암종; 유두모양 낭샘암종; 유두모양 장액 낭샘암종; 점액 낭샘암종; 점액 선암종; 인환세포 암종; 침윤성 관상 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증형 암종; 파제트병, 유방; 샘꽈리세포 암종; 샘평편상피 암종; 선암종 w/편평상피화생; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 협막세포종, 악성; 과립막세포종양, 악성; 남성아세포종, 악성; 세르톨리세포 암종; 라이디히세포종양, 악성; 지질세포종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외 부신경절종, 악성; 갈색세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 멜라닌결핍 흑색종; 표재확산 흑색종; 거대색소 모반 내 악성 흑색종; 유상피세포 흑색종; 청색모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유성 조직구증, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 포상 횡문근육종; 간질 육종; 혼합 종양, 악성; 뮐러 혼합 종양; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 중간엽종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활막 육종; 중피종, 악성; 난소고환종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소갑상선종, 악성; 융모막암종; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 뼈막 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 연골아세포종, 악성; 간엽성 연골육종; 골거대세포종양; 유잉 육종; 치원성 종양, 악성; 법랑아세포성 치아육종; 법랑모세포종, 악성; 법랑아세포성 섬유육종; 송과체부종양, 악성; 척삭종; 신경교종, 악성; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 성아세포종; 교모세포종; 핍지교종; 희소돌기아교모세포종; 원시신경외배엽; 소뇌육종; 신경절아세포종; 신경아세포종; 망막모세포종; 후신경원성 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경집종, 악성; 과립상세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨; 파라육아종; 악성 림프종, 소형림프구성; 악성 림프종, 대세포, 미만성; 악성 림프종, 여포상; 균상식육종; 다른 특정된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만세포 백혈병; 거대모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모발세포 백혈병. 그럼에도, 본 발명은 또한 비-암성 질환(예를 들어, 진균 감염, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 신경퇴행성 질환, 자가면역 질환 및/또는 유전적 장애)을 치료하는 데 사용될 수 있음이 인식된다.

자가면역 질환에는 대상체 자신의 항체가 숙주 조직과 반응하거나 면역 효과기 T 세포가 내인성 자가 펩티드에 대해 자가반응하여 조직 파괴를 일으키는 질환이 포함된다. 본 치료 방법이 유용한 자가면역 질환에는, 제한 없이, 애디슨병, 알츠하이머병 근위축성 축삭경화증, 강직성 척추염, 죽상동맥경화증, 자가면역 당뇨병(예를 들어, 1형 당뇨병; 인슐린-의존성 당뇨병), 자가면역 뇌척수염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간질환, 자가면역 혈소판감소성자반병, 자가면역 갑상선질환, 수포성 유천포창, 셀리악병, 크론병, 사구체신염(예를 들어, 반월형 사구체신염, 증식성 사구체신염), 굿파스쳐증후군, 이식편대숙주 질환, 그레이브병, 숙주대이식편 질환, 특발성 자가면역-관련 불임, 염증성 장 질환, 인슐린 저항성, 과민성 대장질환, 관절염(예를 들어, 조기 관절염, 장병성 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 바이러스성 관절염), 가족성 지중해열, 하시모토 갑상선염, 혼합결합조직병, 다발성 경화증, 중증근무력증(MG), 천포창(예를 들어, 심상성천포창), 악성빈혈, 다발근염, 건선, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 항-콜라겐 항체가 있는 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 척추관절증, 전신홍반루푸스(SLE), 이식거부, 및 궤양성 대장염이 포함된다. 이러한 질환의 진단과 치료는 문헌에 잘 기록되어 있다.

본 치료 방법이 유용한 감염성 질환에는, 제한 없이, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 기생충 감염 및 패혈증이 포함된다. 예시적인 바이러스 감염에는 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 면역결핍 바이러스 2, 인간 유두종 바이러스, 단순 포진 바이러스 1, 단순 포진 바이러스 2, 대상포진, 수두대상포진, 콕사키바이러스 A16, 거대세포바이러스, 에볼라 바이러스, 엔테로바이러스, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 한타 바이러스, 헨드라 바이러스, 바이러스성 수막염, 호흡기 세포융합 바이러스, 로타바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 아데노바이러스 및 인플루엔자 바이러스 감염이 포함된다. 예시적인 박테리아 감염에는 클라미디아 트라코마티 스(Chlamydia trachomatis ), 리스테리아 모노사이토게네스 ( Listeria monocytogenes), 헬리코박터 파일로리 ( Helicobacter pylori), 에스케리키아 콜 리(Escherichia coli ), 보렐리아 버그도르페리 ( Borelia burgdorferi ), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia ), 마이코박테리아 ( Mycobacteria ) 종(예를 들어, 엠. 투버쿨로시스 (M. tuberculosis), 엠. 아비움 (M. avium ), 엠. 인트라셀리우이아레(M. intraceliuiar e), 엠. 칸사이( M. kansaii ), 엠. 고르도나에(M. gordonae)), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝기티데스(Neisseria meningitides), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(그룹 A 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae)(그룹 B 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스(비리단스(viridans) 그룹), 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 보비스 ( Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스(혐기성 종), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터(Campylobacter) 종, 엔테로코쿠스(Enterococcus) 종, 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코리네박테리움 디 프테리아에( Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종, 에리시펠로트릭스 루시오파티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 퍼프링거스(Clostridium perfringers), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니아에( Klebsiella pneumoniae ), 파스투렐라 물토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스(Bacteroides) 종, 푸소박테리움 누 클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트레포네마 페르테뉴(Treponema pertenue), 렙토스피라(Leptospira), 리케치아(Rickettsia), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelli), 시겔라(Shigella) 종(예를 들어, 에스. 플렉스네리(S.flexneri), 에스. 손네이(S. sonnei), 에스. 디센테리아에(S. dysenteriae)), 및 살모넬라(Salmonella) 종 감염이 포함된다. 예시적인 진균 감염에는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아스퍼길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 및 클라미디아 이라코마티스(Chlamydia irachomatis) 감염이 포함된다.

세포에 적용될 때 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 본원에서 치료제가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와 직접 병치되는 과정을 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 세포 사멸을 달성하기 위해, 하나 이상의 작용제는 세포를 사멸시키거나 세포 분열을 방지하는 데 효과적인 양으로 세포에 전달된다.

치료에 대한 환자의 효과적인 반응 또는 환자의 "반응성"은 질환 또는 장애에 걸릴 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자에게 부여되는 임상적 또는 치료적 이점을 나타낸다. 이러한 이점에는 세포 또는 생물학적 반응, 완전 반응, 부분 반응, 안정한 질환(진행 또는 재발 없음) 또는 나중에 재발하는 반응이 포함될 수 있다. 예를 들어, 효과적인 반응은 암 진단을 받은 환자의 종양 크기 감소 또는 무진행 생존일 수 있다.

치료 결과를 예측하고 모니터링할 수 있고/있거나 이러한 치료로부터 이익을 얻는 환자가 본원에 기재된 방법을 통해 식별되거나 선택될 수 있다.

신생물 상태(neoplastic condition) 치료와 관련하여, 신생물 상태의 단계에 따라, 신생물 상태 치료는 다음 요법 중 하나 또는 조합을 포함한다: 신생물 조직 제거 수술, 방사선 요법 및 화학요법. 다른 치료 요법은 항암제, 예를 들어, 치료 조성물 및 화학요법제의 투여와 조합될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료될 환자는 또한 방사선 요법을 받을 수 있고/있거나 수술을 받을 수 있다.

질환의 치료를 위해, 치료 조성물의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 환자의 임상 이력 및 작용제에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 작용제는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.

치료 및 예방 방법 및 조성물은 원하는 효과를 달성하는 데 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 조직, 종양 또는 세포는 하나 이상의 작용제를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)과 접촉되거나, 조직, 종양 및/또는 세포를 2개 이상의 별개의 조성물 또는 제형과 접촉시킴으로써 접촉될 수 있다. 또한, 이러한 병용 요법은 화학요법, 방사선 요법, 외과적 요법 또는 면역 요법과 함께 사용될 수 있음이 고려된다.

병용 투여는 동일한 투여형으로 2개 이상의 작용제의 동시 투여, 별도의 투여형으로 동시 투여 및 개별 투여를 포함할 수 있다. 즉, 본 치료 조성물 및 또 다른 치료제는 동일한 투여형으로 함께 제형화되고 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 치료 조성물 및 또 다른 치료제가 동시에 투여될 수 있으며, 여기서 두 작용제는 별개의 제형으로 존재한다. 또 다른 대안으로, 치료제는 다른 치료제가 바로 이어서 투여되거나 또는 그 반대로 투여될 수 있다. 별도의 투여 프로토콜에서, 본 치료 조성물 및 또 다른 치료제는 몇 분 간격으로, 또는 몇 시간 간격으로, 또는 며칠 간격으로 투여될 수 있다.

제1 항암 치료(예를 들어, 표면에 OX40L 또는 ICOSL을 포함하는 엑소좀)는 제2 항암 치료 전에, 제2 항암 치료 동안, 제2 항암 치료 후에, 또는 이들의 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시 투여로부터 수 분 내지 수 일 내지 수 주의 간격으로 이루어질 수 있다. 제1 치료가 제2 치료와 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 일반적으로 두 화합물이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 각 전달 시간 사이에 상당한 기간이 만료되지 않도록 보장할 것이다. 이러한 예에서, 환자에게 제1 요법 및 제2 요법을 서로 약 12 내지 24 또는 72시간 내에, 더 구체적으로는 서로 약 6 내지 12시간 내에 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서는 각 투여 사이에 수 일(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일) 내지 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주)가 경과하는 경우 치료 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있다.

특정 구현예에서, 치료 과정은 1 내지 90일 이상 지속될 것이다(이러한 범위는 중간 일을 포함함). 하나의 작용제가 1일 내지 90일 중 임의의 날(이러한 범위는 중간 일을 포함함) 또는 이들의 임의의 조합에 제공될 수 있고, 또 다른 작용제가 1일 내지 90일 중 임의의 날(이러한 범위는 중간 일을 포함함) 또는 이들의 임의의 조합에 제공될 수 있음이 고려된다. 하루(24시간) 내에 환자에게 작용제(들)를 한 번 또는 여러 번 투여할 수 있다. 더욱이, 치료 과정 후에, 항암 치료가 투여되지 않는 기간이 있는 것으로 고려된다. 이 기간은 환자의 상태, 예를 들어 예후, 힘(strength), 건강 등에 따라 1 내지 7일 및/또는 1 내지 5주 및/또는 1 내지 12개월 이상(이러한 범위는 중간 일을 포함함) 지속될 수 있다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 것으로 예상된다.

다양한 조합이 사용될 수 있다. 아래의 예에서 제1 항암 요법은 "A"이고 제2 항암 요법은 "B"이다:

환자에게 본 발명의 임의의 화합물 또는 요법을 투여하는 것은, 존재한다면, 작용제의 독성을 고려하여, 이러한 화합물의 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 구현예에서는 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.

1. 화학요법

본 발명에 따라 매우 다양한 화학요법제가 사용될 수 있다. 용어 "화학요법"은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 나타낸다. "화학요법제"는 암 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 의미하기 위해 사용된다. 이러한 작용제 또는 약물은 세포 내 활동 모드, 예를 들어, 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지 여부 및 어느 단계에서 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지에 따라 분류된다. 대안적으로, 작용제는 DNA를 직접 교차 결합하거나, DNA에 삽입되거나, 핵산 합성에 영향을 줌으로써 염색체 및 유사분열 이상을 유도하는 능력에 따라 특성화될 수 있다.

화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사물질 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사물질 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신(합성 유사물질, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인(sarcodictyin); 스퐁기스타틴; 질소 머스터드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스터드; 니트로스우레아, 예를 들어 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴(ranimnustine); 항생제, 예를 들어 에네디인(enediyne) 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마lI 및 칼리케아미신 오메가I1); 디네마이신(dynemicin) A를 포함하는 디네마이신; 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신, 오트라르나이신(authrarnycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르치노필린, 크로모미시니스(chromomycinis), 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르나이신(nogalarnycin), 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신(quelamycin), 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 대사길항물질, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사물질, 예를 들어 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모퍼(carmofur), 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스토락톤; 항-부신(anti-adrenals), 예를 들어 미토탄 및 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프로린산(frolinic acid); 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트랙세이트(edatraxate); 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온(diaziquone); 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌(lonidainine); 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰(mopidanmol); 니트라에린(nitraerine); 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로소산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안가이딘(anguidine)); 우레탄; 빈데신; 데카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신(gacytosine); 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예를 들어 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예를 들어, CPT-11); 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 젬시타빈(gemcitabien), 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스페라아제 억제제, 트랜스플라티넘, 및 상기 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체가 포함된다.

2. 방사선 요법

DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되는 다른 요인으로는 일반적으로 γ-선, X-선, 및/또는 종양 세포로의 방사성 동위원소의 직접 전달이라고 알려진 것이 포함된다. 마이크로파, 양성자 빔 조사(미국 특허 5,760,395 및 4,870,287) 및 UV-조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 요인도 고려된다. 이러한 모든 요인은 DNA, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 복구, 및 염색체의 조립 및 유지에 대한 광범위한 손상에 영향을 미칠 가능성이 높다. X-선의 투여 범위는 장기간(3 내지 4주) 동안 50 내지 200 뢴트겐의 1일 선량부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량에 이르기까지 다양하다. 방사성 동위원소의 투여 범위는 매우 다양하며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 신생물 세포의 흡수에 따라 달라진다.

3. 면역요법

숙련가는 추가적인 면역요법이 본 발명의 방법과 병용하여 또는 함께 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료의 맥락에서, 면역요법은 일반적으로 암세포를 표적으로 하고 파괴하기 위해 면역 효과기 세포와 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙(Rituximab)(리툭산(Rituxan)®)이 이러한 예이다. 면역 효과기는, 예를 들어, 종양 세포 표면상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 치료 효과기 역할을 할 수 있거나 다른 세포를 동원하여 실제로 세포 사멸에 영향을 미칠 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학요법, 방사성 핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수 있으며, 단지 표적화제로 작용할 수 있다. 대안적으로, 효과기는 종양 세포 표적과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 효과기 세포에는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 포함된다.

면역요법의 한 측면에서, 종양 세포는 표적화 가능한, 즉, 대부분의 다른 세포에 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 많은 종양 마커가 존재하며 이들 중 임의의 마커는 본 발명의 맥락에서 표적화에 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커에는 CD20, 암배아 항원, 티로시나아제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155가 포함된다. 면역요법의 대안적인 측면은 항암 효과와 면역 자극 효과를 결합하는 것이다. 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 예를 들어 MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어 FLT3 리간드를 포함하는 면역 자극 분자도 존재한다.

현재 연구중이거나 사용중인 면역요법의 예로는 면역 보조제, 예를 들어, 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis ), 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물(미국 특허 5,801,005 및 5,739,169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); 사이토카인 요법, 예를 들어, 인터페론 α, β, 및 γ, IL-1, GM-CSF, 및 TNF(참조: Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); 유전자 요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2, 및 p53(참조: Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 미국 특허 5,830,880 및 5,846,945); 모노클로날 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오사이드 GM2, 및 항-p185(참조: Hollander, 2013; Hanibuchi et al., 1998; 미국 특허 5,824,311)가 있다. 하나 이상의 항암 요법이 본원에 기재된 항체 요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

일부 구현예에서, 면역요법은 면역 체크포인트 억제제일 수 있다. 면역 체크포인트는 신호(예를 들어, 공-자극 분자)를 높이거나 신호를 낮춘다. 면역 체크포인트 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제 면역 체크포인트로는 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3(CD276으로도 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠물(BTLA), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4, CD152로도 공지됨), 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO), 살해-세포 면역글로불린(KIR), 림프구 활성화 유전자-3(LAG3), 예정된 사멸 1(PD-1), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제 인자(VISTA)가 포함된다. 특히, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다.

면역 체크포인트 억제제는 약물 예를 들어 소분자, 리간드 또는 수용체의 재조합 형태일 수 있거나, 특히 항체, 예를 들어 인간 항체이다(예를 들어, 국제 특허 공보 WO 2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012; 둘 다 본원에 참조로 포함됨). 면역 체크포인트 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제가 사용될 수 있으며, 특히 키메라화, 인간화 또는 인간 형태의 항체가 사용될 수 있다. 숙련가가 알고 있는 바와 같이, 본 개시내용에 언급된 특정 항체에 대한 대안적인 및/또는 동등한 명칭이 사용될 수 있다. 이러한 대안적 및/또는 동등한 명칭은 본 개시내용의 맥락에서 상호교환 가능하다. 예를 들어, 람브롤리주맙(lambrolizumab)은 MK-3475 및 펨브롤리주맙의 대안적인 및 동등한 명칭으로도 공지되어 있음이 알려져 있다.

일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 이의 리간드 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 구체적인 측면에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 PDL1이 이의 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 구체적인 측면에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 구현예에서, PDL2 결합 길항제는 PDL2가 이의 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 구체적인 측면에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역접합체(immunoadhesin), 융합 단백질 또는 올리고펩티드일 수 있다. 예시적인 항체는 미국 특허 제8,735,553호, 제8,354,509호 및 제8,008,449호에 기재되어 있으며, 모두 본원에 참조로 포함되어 있다. 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 다른 PD-1 축 길항제는 미국 특허 공보 제20140294898호, 제2014022021호 및 제20110008369호(모두 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있다.

일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체(예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체)이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 CT-011로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 면역접합체(예를 들어, 불변 영역(예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역접합체)이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 AMP- 224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO^®로도 공지된 니볼루맙은 WO 2006/121168에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, 머크(Merck) 3475, 람브롤리주맙, 키트루다(KEYTRUDA)^®, 및 SCH-900475로도 공지된 펨브롤리주맙은 WO 2009/114335에 기재된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로도 공지된 CT-011은 WO 2009/101611에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로도 공지된 AMP-224는 WO 2010/027827 및 WO 2011/066342에 기재된 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.

본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트는 CD152로도 공지된 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4)이다. 인간 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 젠뱅크(Genbank) 수탁 번호가 L15006이다. CTLA-4는 T 세포의 표면에서 발견되며, 항원-제시 세포의 표면에서 CD80 또는 CD86에 결합될 때 "오프(off)" 스위치 역할을 한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면에서 발현되고 억제 신호를 T 세포에 전송하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 일원이다. CTLA4는 T-세포 공-자극 단백질인 CD28과 유사하며, 두 분자 모두 항원-제시 세포에서 각각 B7-1 및 B7-2라고도 하는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA4는 T 세포에 억제 신호를 전송하는 반면, CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4는 또한 조절 T 세포에서 발견되며, 이의 기능에 중요할 수 있다. T 세포 수용체와 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제 수용체인, CTLA-4의 발현을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질, 또는 올리고펩티드이다.

본 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-CTLA-4 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 분야에 익히 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당해 분야에서 인정된 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,119,129호, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504(CP675,206, 트레멜리무맙으로도 공지됨; 이전에 티실리무맙(ticilimumab)), 미국 특허 제6,207,156호; 문헌(참조: urwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206); 및 Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304)에 개시된 항-CTLA-4 항체가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 각각의 상기 언급된 간행물의 교시는 본원에 참조로 포함된다. CTLA-4와의 결합에 대해 이러한 당해 분야에서 인정된 임의의 항체와 경쟁하는 항체도 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간화 CTLA-4 항체는 국제 특허 출원 제WO 2001014424호, 제WO 2000037504호, 및 미국 특허 제8,017,114호에 기재되어 있으며; 모두 본원에 참조로 포함되어 있다.

예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(10D1, MDX- 010, MDX- 101, 및 여보이(Yervoy)®로도 공지됨) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체이다(예를 들어, WO 01/14424 참조). 다른 구현예에서, 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인, 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 동일한 CTLA-4 상의 에피토프와 결합에 대해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 90% 가변 영역 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 가변 영역 동일성)을 갖는다.

CTLA-4를 조절하기 위한 다른 분자로는 미국 특허 제5844905호, 제5885796호 및 국제 특허 출원 제WO 1995001994호 및 제WO 1998042752호(모두 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 CTLA-4 리간드 및 수용체; 및 미국 특허 제8329867호(본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 면역접합체가 포함된다.

일부 구현예에서, 면역 요법은 생체외에서 생성된 자가 항원-특이적 T 세포의 전달을 포함하는 입양 면역요법일 수 있다. 입양 면역요법에 사용된 T 세포는 항원 특이적인 T 세포의 확장 또는 유전 공학을 통한 T 세포의 방향변경(redirection)에 의해 생성될 수 있다(참조: Park, Rosenberg et al. 2011). 종양 특이적 T 세포의 단리 및 전달은 흑색종 치료에 성공적인 것으로 나타났다. T 세포의 새로운 특이성은 형질전환 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)의 유전적 전달을 통해 성공적으로 생성되었다(Jena, Dotti et al. 2010). CAR은 단일 융합 분자로 하나 이상의 시그널링 도메인과 결합된 표적화 모이어티로 구성된 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 가요성 링커에 의해 결합된 모노클로날 항체의 가벼운 및 가변 단편을 포함하는 단일-사슬 항체(scFv)의 항원-결합 도메인으로 구성된다. 수용체 또는 리간드 도메인에 기반한 결합 모이어티도 성공적으로 사용되었다. 1세대 CAR에 대한 시그널링 도메인은 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마 사슬의 세포질 영역에서 유래한다. CAR은 림프종 및 고형 종양을 포함하는 다양한 악성 종양의 종양 세포 표면에서 발현되는 항원에 대해 T 세포가 성공적으로 방향변경되도록 하였다(참조: Jena, Dotti et al. 2010).

일 구현예에서, 본 출원은 암 치료를 위한 병용 요법을 제공하며, 여기서 병용 요법은 입양 T-세포 요법 및 체크포인트 억제제를 포함한다. 일 측면에서, 입양 T-세포 요법은 자가 및/또는 동종 T 세포를 포함한다. 또 다른 측면에서, 자가 및/또는 동종 T 세포는 종양 항원에 대해 표적화된다.

4. 수술

암 환자의 대략 60%는 예방, 진단 또는 병기결정, 치유 및 완화 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 받게 될 것이다. 치유 수술은 암 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거, 절제 및/또는 파괴되는 절제술을 포함하며, 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 나타낸다. 종양 절제술 외에도, 수술 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경-제어 수술(모스 수술(Mohs' surgery))을 포함한다.

암 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부를 절제하면, 체내에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사, 또는 추가 항암 요법으로 부위의 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월마다 반복될 수 있다. 이러한 치료는 투여량도 다양할 수 있다.

5. 기타 작용제

치료의 치료 효능을 개선하기 위해 본 발명의 특정 측면과 조합하여 다른 작용제를 사용할 수 있음이 고려된다. 이러한 추가 작용제로는 세포 표면 수용체 및 GAP 접합의 상향조절에 영향을 미치는 작용제, 세포증식 억제제 및 분화제, 세포 부착 억제제, 아폽토시스 유도제에 대한 과증식 세포의 민감도를 증가시키는 작용제, 또는 기타 생물 작용제가 포함된다. GAP 접합의 수를 증가시킴으로써 세포간 시그널링의 증가는 인접한 과증식 세포 집단에 대한 항-과증식 효과를 증가시킬 것이다. 다른 구현예에서, 세포증식 억제제 또는 분화제는 치료의 항-과증식 효능을 개선하기 위해 본 발명의 특정 측면과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 효능을 개선하기 위해 세포 부착 억제제가 고려된다. 세포 부착 억제제의 예로는 초점 부착 키나아제(FAK) 억제제 및 로바스타틴이 있다. 치료 효능을 개선하기 위해 항체 c225와 같은 아폽토시스에 대한 과증식 세포의 민감도를 증가시키는 다른 작용제가 본 발명의 특정 측면과 조합하여 사용될 수 있다는 것이 추가로 고려된다.

IV. 약제학적 조성물

표면에 OX40L 또는 ICOSL을 포함하는 엑소좀은 종양 세포 성장을 억제하고, 가장 바람직하게는 국소 진행성 또는 전이성 암을 앓고 있는 암 환자의 암세포를 죽이기 위해 전신 또는 국소 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 상기 엑소좀은 정맥내, 경막내 및/또는 복강내 투여될 수 있다. 상기 엑소좀은 단독으로 또는 항-증식 약물과 함께 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 엑소좀은 수술 또는 다른 시술 전에 환자의 암 부하를 줄이기 위해 투여된다. 대안적으로, 상기 엑소좀은 남은 모든 암(예를 들어, 수술로 제거하지 못한 암)이 생존하지 않도록 하기 위해 수술 후에 투여될 수 있다.

본 발명은 치료 제제의 특정 성질에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 이러한 조성물은 생리적으로 허용되는 액체, 겔, 고체 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 치료 제제는 다른 치료제와 유사한 방식으로 가축에서의 사용과 같은 수의학적 용도, 및 인간의 임상 용도를 위해 포유동물에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능에 필요한 투여량은 사용 유형 및 투여 방식, 뿐만 아니라 개별 대상체의 특정 요구사항에 따라 달라질 것이다.

임상 적용이 고려되는 경우, 의도된 적용에 적합한 형태로 재조합 단백질 및/또는 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 비경구 제형일 수 있는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 유효량의 하나 이상의 재조합 단백질 및/또는 엑소좀 및/또는 추가 작용제를 포함할 수 있다. "약제학적 또는 약리적으로 허용되는"이라는 어구는 동물, 예를 들어, 적절한 경우 인간에게 투여될 때 유해한, 알레르기성 또는 기타 불리한 반응을 일으키지 않는 분자 엔티티(entity) 및 조성물을 나타낸다. 본원에 개시된 바와 같은 재조합 단백질 및/또는 엑소좀, 또는 추가 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 제조는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990)에 예시된 바와 같다. 더욱이, 동물(예를 들어, 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물 표준 사무국(FDA Office of Biological Standards)에서 요구하는 무균성, 발열원성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다는 것이 이해될 것이다.

추가로 본 발명의 특정 측면에 따르면, 투여에 적합한 조성물은 불활성 희석제와 함께 또는 불활성 희석제 없이 약제학적으로 허용되는 담체로 제공될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는, 당업자에게 알려진 바와 같이, 임의의 및 모든 수성 용매(예를 들어, 물, 알코올/수성 용액, 에탄올, 염수 용액, 비경구 비히클, 예를 들어 염화나트륨, 링거의 덱스트로스 등), 비-수성 용매(예를 들어, 지방, 오일, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸올레에이트), 지질, 리포좀, 분산 매질, 코팅물(예를 들어, 레시틴), 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들어, 항박테리아제 또는 항진균제, 항-산화제, 킬레이트제, 불활성 기체, 파라벤(예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합), 등장화제(예를 들어, 당 및 염화나트륨), 흡수 지연제(예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴), 염, 약물, 약물 안정화제, 겔, 수지, 충전제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 액체 및 영양 보충제, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함한다. 담체는 동화될 수 있어야 하며 액체, 반고체, 즉, 페이스트 또는 고체 캐리어를 포함한다. 또한, 원하는 경우, 조성물은 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제와 같은 보조 물질을 소량 포함할 수 있다. 약제학적 조성물에서 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 잘 알려진 파라미터에 따라 조정된다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅물의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 특히 인간에게 투여되도록 제형화되지만, 특정 구현예에서는 비-인간 동물에게 투여되도록 제형화되지만 인간에게 투여하는 데 허용되지 않을(예를 들어, 정부 규제로 인해) 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립될 수 없는(예를 들어, 수용자 또는 그 안에 함유된 조성물의 치료 효과에 해로운) 경우를 제외하고, 치료 또는 약제학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 본 발명의 특정 측면에 따르면, 조성물은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로, 즉, 용해, 현탁, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 배합된다. 이러한 절차는 당업자에게 일상적이다.

본 발명의 특정 구현예는 그것이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되어야 하는지, 및 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균되어야 하는지에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 조성물은 정맥내, 피내, 경피, 경막내, 동맥내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 점막, 경구, 국소, 국부, 흡입(예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입에 의해, 지질 조성물(예를 들어, 리포좀)에서 카테터를 통해, 세척을 통해 표적 세포를 직접 국소 관류 배싱(bathing)함에 의해, 또는 다른 방법 또는 전술한 것의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있으며, 이는 예를 들어, 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, 참조로 본원에 포함됨)에 기재되어 있다.

활성 화합물은 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있으며, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사를 위해 제형화될 수 있다. 이와 같이, 구현예는 비경구 제형을 포함한다. 통상적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있으며; 주사 전에 액체를 첨가하여 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 사용하기에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있으며; 제제는 또한 유화될 수 있다.

본 구현예에 따르면, 비경구 제형은 하나 이상의 용질 및/또는 용매, 하나 이상의 완충제 및/또는 하나 이상의 항미생물제, 또는 이들의 임의의 조합과 함께 본원에 개시된 엑소좀을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 용매는 물, 수-혼화성 용매, 예를 들어, 에틸 알코올, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 프로필렌 글리콜, 및/또는 물-비혼화성 용매, 예를 들어 옥수수유, 면실유, 낙화생유 및/또는 참깨유를 포함하는 고정유를 포함할 수 있다. 특정 버전에서, 용질은 하나 이상의 항미생물제, 완충제, 산화방지제, 장성제(tonicity agent), 동결방지제 및/또는 동결건조 보호제(lyoprotectant)를 포함할 수 있다.

본 개시내용에 따른 항미생물제는 벤질 알코올, 페놀, 수은제(mercurial) 및/또는 파라벤 뿐만 아니라 본 개시내용의 다른 곳에 제공된 것들을 포함할 수 있다. 항미생물제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 브로노폴, 센트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알코올, 글리세린, 엑세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은, 프로필렌 글리콜, 및/또는 티메로살, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 항미생물제는, 다양한 측면에서, 약제에 필요한 무균성을 보장하는 데 필요한 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 작용제는 제제, 예를 들어, 다회 용량 용기에 함유된 제제에서 정균 또는 정진균 농도로 존재할 수 있다. 작용제는, 다양한 구현예에서, 보존제일 수 있고/있거나 사용시에 적절한 농도로 존재할 수 있어, 예를 들어, 내용물의 일부를 피하주사 바늘과 주사기로 회수하면서 제제에 부주의로 도입된 미생물과 같은 미생물의 증식을 방지할 수 있다. 다양한 측면에서, 작용제는 최대 용적 및/또는 농도 한계(예를 들어, 질산페닐수은 및 티메로살 0.01%, 벤즈에토늄 클로라이드 및 벤즈알코늄 클로라이드 0.01%, 페놀 또는 크레졸 0.5%, 및 클로로부탄올 0.5%)가 있다. 다양한 예에서, 질산페닐수은과 같은 작용제는 0.002%의 농도로 사용된다. 메틸 p-하이드록시벤조에이트 0.18% 및 프로필 p-하이드록시벤조에이트 0.02% 조합, 및 벤질 알코올 2%를 또한 구현예에 따라 적용할 수 있다. 항미생물제는 또한 헥실레조르시놀 0.5%, 페닐수은 벤조에이트 0.1% 및/또는 치료 화합물을 포함할 수 있다.

본 개시내용에 따른 산화방지제는 아스코르브산 및/또는 이의 염, 및/또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)의 나트륨염을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 장성제는 전해질 및/또는 단당류 또는 이당류를 포함할 수 있다. 동결방지제 및/또는 동결건조 보호제는 동결건조 공정 중 제품의 동결 및/또는 건조로 인한 유해한 영향으로부터 바이오의약품(biopharmaceutical)을 보호하는 첨가제이다. 동결방지제 및/또는 동결건조 보호제는 당(비환원) 예를 들어 수크로스 또는 트레할로스, 아미노산 예를 들어 글리신 또는 리신, 중합체 예를 들어 액체 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란, 및 폴리올 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨을 포함할 수 있고, 모두 가능한 동결방지제 및/또는 동결건조 보호제이다. 본 구현예는 또한 항진균제 예를 들어 부틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 칼륨 소르베이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 프로피오네이트 및/또는 소르브산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 추가 용질 및 항미생물제, 완충제, 산화방지제, 장성제, 동결방지제 및/또는 동결건조 보호제 및 이들의 특징, 및 본 비경구 제형을 제조하는 방법의 측면은, 예를 들어, 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Ed., 2005, e.g., Chapter 41, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

주사 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산액; 참깨유, 낙화생유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 형태는 멸균되어야 하며, 쉽게 주사될 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 또한, 제조 및 보관 조건하에 안정적이어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.

치료제는 유리 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가 염, 예를 들어, 단백질성 조성물의 유리 아미노 그룹으로 형성된 염, 또는 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 염을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철; 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화되면, 용액은 투여 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 주사용 용액, 또는 폐로 전달하기 위한 에어로졸과 같은 비경구 투여를 위해 제형화되거나, 약물 방출 캡슐 등과 같이 소화기 투여를 위해 제형화되는 것과 같이 다양한 투여형으로 쉽게 투여된다.

본 발명의 특정 구현예에서, 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 완전히 배합되거나 혼합된다. 혼합은 분쇄와 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 치료 활성의 손실, 즉, 위 내에서의 변성으로부터 조성물을 보호하기 위해 안정화제를 혼합 공정에 첨가할 수도 있다. 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예로는 완충액, 아미노산, 예를 들어 글리신 및 리신, 탄수화물, 예를 들어 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 소르비톨, 만니톨 등이 포함된다.

추가 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 지질 및 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물의 사용에 관한 것일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "지질"은 특징적으로 물에 불용성이고 유기 용매로 추출할 수 있는 임의의 광범위한 물질을 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이러한 광범위한 종류의 화합물은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 용어 "지질"이 본원에 사용된 바와 같이, 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예로는 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체를 포함하는 화합물이 포함된다. 지질은 자연적으로 발생하거나 합성될 수 있다(즉, 사람에 의해 설계되고 생산됨). 그러나, 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 리소지질(lysolipid), 글리코스핑고지질, 당지질, 설파타이드, 에테르- 및 에스테르-결합 지방산을 갖는 지질, 중합성 지질, 및 이들의 조합을 포함한다. 물론, 지질로 당업자에 의해 이해되는 본원에 구체적으로 기재된 화합물 이외의 화합물도 조성물 및 방법에 포함된다.

당업자는 지질 비히클에 조성물을 분산시키기 위해 사용될 수 있는 다양한 기술에 익숙할 것이다. 예를 들어, 치료제는 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 함께 용해되거나, 지질과 함께 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 배합되거나, 지질에 공유 결합되거나, 지질에 현탁액으로 함유되거나, 미셀 또는 리포솜에 함유되거나 이와 복합체화되거나, 또는 달리 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조와 결합될 수 있다. 분산액은 리포솜의 형성을 초래할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.

용어 "단위 용량" 또는 "투여량"은 대상체에서 사용하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 나타내며, 각각의 단위는 이의 투여, 즉, 적절한 경로 및 치료 요법과 관련하여 상기 논의된 원하는 반응을 초래하도록 계산된 치료 조성물의 미리 결정된 양을 포함한다. 치료 횟수와 단위 용량에 따라, 투여될 양은 원하는 효과에 좌우된다. 환자 또는 대상체에게 투여되는 본 발명의 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리적 요인, 예를 들어 대상체의 체중, 연령, 건강 및 성별, 치료할 질환의 유형, 질환 침투 정도, 이전 또는 동시 치료적 개입, 환자의 특발증, 투여 경로, 특정 치료 물질의 효능, 안정성 및 독성에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 또한 투여당 약 1㎍/kg/체중 내지 약 1000mg/kg/체중(이러한 범위는 중간 용량을 포함함) 이상, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유도 가능한 범위의 비제한적인 예로, 약 5㎍/kg/체중 내지 약 100mg/kg/체중, 약 5㎍/kg/체중 내지 약 500mg/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 투여 담당 의사는 어떠한 경우에도 개별 대상체에 대한 조성물 내 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 용량(들)을 결정할 수 있다.

동물 환자에게 투여되는 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리적 요인, 예를 들어 체중, 상태의 중증도, 치료할 질환의 유형, 이전 또는 동시 치료적 개입, 환자의 특발증, 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여량 및 투여 경로에 따라, 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여 담당 의사는 어떠한 경우에도 개별 대상체에 대한 조성물 내 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 용량(들)을 결정할 수 있다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 예를 들어, 약 25% 내지 약 60%, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 당연히, 각각의 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물(들)의 양은 적절한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량으로 얻어질 수 있는 방식으로 준비될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 수명과 같은 인자, 및 기타 약리학적 고려사항은 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이며, 따라서, 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.

다른 비제한적인 예로, 용량은 또한 투여당 약 1㎍/kg/체중, 약 5㎍/kg/체중, 약 10㎍/kg/체중, 약 50㎍/kg/체중, 약 100㎍/kg/체중, 약 200㎍/kg/체중, 약 350㎍/kg/체중, 약 500㎍/kg/체중, 약 1mg/kg/체중, 약 5mg/kg/체중, 약 10mg/kg/체중, 약 50mg/kg/체중, 약 100mg/kg/체중, 약 200mg/kg/체중, 약 350mg/kg/체중, 약 500mg/kg/체중에서부터 약 1000mg/kg/체중 이상까지, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유도 가능한 범위의 비제한적인 예로, 상기 기재된 수치에 기초하여, 약 5mg/kg/체중 내지 약 100mg/kg/체중, 약 5㎍/kg/체중 내지 약 500mg/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다.

V. 핵산 및 벡터

본 발명의 특정 측면에서, 치료 단백질 또는 치료 단백질을 함유하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 개시될 수 있다. 사용되는 발현 시스템에 따라 핵산 서열은 통상적인 방법에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 각각의 유전자 또는 이의 변이체는 특정 시스템에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 관심 단백질을 발현시키기 위해 다양한 벡터가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 벡터로는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포존(transposon) 또는 리포솜-기반 벡터가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

VI. 재조합 단백질 및 억제 RNA

일부 구현예는 재조합 단백질 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가 측면에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 혈청 안정성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 본 출원이 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드"의 기능 또는 활성을 지칭할 때, 당업자는 이것이, 예를 들어, 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드에 비해 추가적인 이점을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다는 것을 이해할 것이다. "변형된 단백질"에 관한 구현예는 "변형된 폴리펩티드"와 관련하여 구현될 수 있고, 그 반대의 경우도 가능한 것으로 구체적으로 고려된다.

재조합 단백질은 아미노산의 결실 및/또는 치환을 가질 수 있으며; 따라서, 결실이 있는 단백질, 치환이 있는 단백질, 및 결실 및 치환이 있는 단백질이 변형된 단백질이다. 일부 구현예에서, 이들 단백질은, 예를 들어, 융합 단백질 또는 링커를 갖는 단백질과 같이, 삽입 또는 첨가된 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 천연 단백질의 하나 이상의 잔기가 결핍되어 있지만, 천연 단백질의 특이성 및/또는 활성을 가질 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 또한 감소된 면역원성 또는 항원성을 가질 수 있다. 변형된 결실 단백질의 예는 적어도 하나의 항원성 영역, 즉 변형된 단백질이 투여될 수 있는 유기체 유형과 같이 특정 유기체에서 항원성으로 결정된 단백질 영역으로부터 결실된 아미노산 잔기를 갖는 것이다.

치환 또는 대체 변이체는 통상적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 한 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 교환을 포함하고, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성, 특히 이의 효과기 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있고, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 형상 및 전하 중 하나로 대체된다. 보존적 치환은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 다음의 변화를 포함한다: 알라닌에서 세린; 아르기닌에서 리신; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘; 아스파르테이트에서 글루타메이트; 시스테인에서 세린; 글루타민에서 아스파라긴; 글루타메이트에서 아스파르테이트; 글리신에서 프롤린; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민; 이소류신에서 류신 또는 발린; 류신에서 발린 또는 이소류신; 리신에서 아르기닌; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신; 페닐알라닌에서 티로신, 류신, 또는 메티오닌; 세린에서 트레오닌; 트레오닌에서 세린; 트립토판에서 티로신; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌; 및 발린에서 이소류신 또는 류신.

결실 또는 치환에 더하여, 변형된 단백질은 통상적으로 폴리펩티드 내에 적어도 하나의 잔기의 첨가를 포함하는 잔기의 삽입을 가질 수 있다. 여기에는 표적화 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단순히 단일 잔기의 삽입이 포함될 수 있다. 융합 단백질이라고 하는 말단 첨가는 아래에서 논의된다.

용어 "생물학적으로 기능적 등가물"은 당해 분야에서 잘 이해되고 본원에 추가로 상세하게 정의된다. 따라서, 대조 폴리펩티드의 아미노산과 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산의 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 81% 내지 약 90%, 또는 심지어 약 91% 내지 약 99%를 갖는 서열이, 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 경우, 포함된다. 재조합 단백질은 특정 측면에서 이의 천연 단백질과 생물학적으로 기능적으로 동등할 수 있다.

또한, 아미노산 및 핵산 서열은 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열과 같은 추가 잔기를 포함할 수 있지만, 여전히 단백질 발현과 관련된 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하여, 서열이 상기 제시된 기준을 충족하는 한, 본원에 개시된 서열 중 하나에 기재된 바와 같음을 이해할 것이다. 말단 서열의 첨가는 특히, 예를 들어, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분 중 하나에 인접하는 다양한 비-코딩 서열을 포함할 수 있거나 유전자 내에서 발생하는 것으로 알려진 다양한 내부 서열, 즉, 인트론을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 펩티드는 일반적으로 유전자로부터 번역된 전장 서열까지 약 200개 이상의 아미노산으로 구성된 단백질; 약 100개 이상의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드; 및/또는 약 3개 내지 약 100개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 지칭하지만, 이에 제한되지 않는다. 편의상, 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 임의의 자연 발생 아미노산, 임의의 아미노산 유도체, 또는 당해 분야에 공지된 임의의 아미노산 모방체를 나타낸다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기는 아미노산 잔기의 서열을 방해하는 임의의 비-아미노산 없이 순차적이다. 다른 구현예에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티에 의해 중단될 수 있다.

따라서, 용어 "단백질 또는 펩티드"는 자연 발생 단백질에서 발견되는 20개의 공통 아미노산 중 적어도 하나, 또는 적어도 하나의 변형되거나 통상적이지 않은 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 특정 구현예는 융합 단백질에 관한 것이다. 이러한 분자는 N- 또는 C-말단에서 이종 도메인에 연결된 치료 단백질을 가질 수 있다. 예를 들어, 융합물은 또한 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용하기 위해 다른 종의 리더 서열을 사용할 수 있다. 또 다른 유용한 융합물은 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해, 바람직하게는 절단 가능한, 단백질 친화성 태그, 예를 들어 혈청 알부민 친화성 태그 또는 6개의 히스티딘 잔기, 또는 면역학적 활성 도메인, 예를 들어 항체 에피토프의 첨가를 포함한다. 비제한적인 친화성 태그에는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST)가 포함된다.

융합 단백질을 생성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 완전한 융합 단백질의 새로운 합성에 의해, 또는 이종 도메인을 인코딩하는 DNA 서열의 부착에 이어서 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 생성될 수 있다.

모 단백질의 기능적 활성을 회복하는 융합 단백질의 생산은 나란히 연결된 폴리펩티드 사이에 스플라이싱되는 펩티드 링커를 인코딩하는 브리징 DNA 절편과 유전자를 연결함으로써 촉진될 수 있다. 링커는 생성된 융합 단백질의 적절한 폴딩을 허용하기에 충분한 길이일 것이다.

VII. 키트 및 진단법

본 발명의 다양한 측면에서, 체액 또는 조직 배양 배지에서 엑소좀을 정제하는 데 필요한 성분을 함유하는 키트가 구상된다. 다른 측면에서, 표면에 OX40L 또는 ICOSL을 포함하는 엑소좀을 단리하는 데 필요한 성분을 함유하는 키트가 구상된다. 키트는 이러한 성분 중 어느 것을 함유하는 하나 이상의 밀봉된 바이알을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 또한 에펜도르프 튜브, 검정 플레이트, 주사기, 병 또는 튜브와 같은 키트의 구성 요소와 반응하지 않을 용기인 적절한 용기 수단을 포함할 수 있다. 용기는 플라스틱 또는 유리와 같은 멸균 가능한 재료로 만들어질 수 있다.

키트는 본원에 기재된 방법의 절차 단계를 개괄적으로 설명하는 지침 시트를 추가로 포함할 수 있으며, 본원에 기재되거나 숙련가에게 알려진 것과 실질적으로 동일한 절차를 따를 것이다. 지침 정보는, 컴퓨터를 사용하여 실행될 때, 샘플에서 엑소좀을 정제하는 실제 또는 가상 절차를 표시하는 기계-판독 가능한 명령을 함유하는 컴퓨터 판독 가능한 매체에 있을 수 있다.

VIII. 실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 다음 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실행에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 이의 실행을 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당업자는 인식해야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 볼 때, 개시된 특정 구현예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 여전히 같거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.

실시예 1 - ICOSL ⁺ 및 OX40L ⁺ 엑소좀의 단리 및 정제

HEK293T 세포를 72시간 동안 리포펙타민으로 처리하여 OX40L 또는 ICOSLG 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 이어서 10일 동안 1㎍/ml 푸로마이신으로 세포를 선택하여 안정하게 형질감염된 세포를 얻었다. 안정한 세포를 선별 배지를 함유하는 1㎍/ml 푸로마이신과 함께 배양하였다.

엑소좀은 형질감염되지 않은 HEK293T 세포뿐만 아니라 안정한 HEK293T ICSOLG 및 HEK293T OX40L 세포로부터 수집되었다. 엑소좀은 이전에 기재된 바와 같이 분별 원심분리 공정에 의해 정제되었다(참조: Alvarez-Erviti et al., 2011; El-Andaloussi et al., 2012). 엑소좀이 고갈된 FBS를 함유한 배지에서 48시간 동안 배양한 세포에서 상청액을 수집한 후 800g에서 5분, 2000g에서 10분 동안 순차적으로 원심분리하였다. 이어서, 이 생성된 상청액을 배양 병에서 0.2㎛ 필터를 사용하여 여과하고, 2시간의 초원심분리(벡크만(Beckman)) 후 SW 32 Ti 로터에서 펠렛을 28,000g에서 회수하였다. 상청액을 흡인하고, 펠렛을 PBS에 재현탁한 다음 2시간 더 초원심분리하였다. 이어서 정제된 엑소좀을 분석하고 실험 절차에 사용하였다.

안정하게 형질감염된 293T 세포에서 ICOSL 및 OX40L 전사체의 수준을 결정하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 트리졸(TRIzol)®(인비트로겐(Invitrogen))을 사용한 총 RNA 정제 후 멀티스크라이브 역전사효소(MultiScribe Reverse Transcriptase)(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 및 올리고-d(T) 프라이머를 사용하여 RNA를 역전사하였다. 실시간 PCR 분석은 SYBR® 그린 마스터 믹스(SYBR® Green Master Mix)(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 ABI 프리즘(ABI PRISM)® 7300HT 시퀀스 검출 시스템 기기에서 수행되었다. 관심 전사체는 18S 전사체 수준으로 정규화되었다. 각 측정은 세 번 수행되었다. 증폭된 표적의 양이 고정된 역치에 도달한 부분 사이클 수(fractional cycle number)인, 역치 사이클을 결정하고, 2^- ^ΔCt 공식을 사용하여 발현을 측정하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 야생형 293T 세포는 ICOSLG 및 OX40L 전사체의 낮은 기저 수준을 나타낸 반면 OX40L 과발현 세포는 약 10,000배 더 높은 수준을 나타냈고 ICOSLG 과발현 세포는 약 2,500배 더 높은 수준을 나타냈다.

세포 및 엑소좀의 단백질 발현을 평가하기 위해, 세포 및 엑소좀을 RIPA 완충액에서 수거하고, 단백질 용해물을 브래드포드(Bradford) 정량화를 사용하여 정규화하였다. 변성 조건하에 단백질의 전기영동 분리를 위해 40㎍의 용해물을 아크릴아미드 겔에 로딩하고, 습식 전기영동 이동에 의해 PVDF 막(이모빌론P(ImmobilonP))으로 옮겼다. 이어서 막을 PBS/0.05% 트윈®-20 중의 5% 탈지 분유를 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단하고, 적절한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 항체 항온배양 후 세척은 1×PBS 0.05% 트윈®-20을 사용하여 15분 간격으로 3회 오비탈 진탕기에서 수행되었다. 막은 제조업체의 지침 및 필름에 포획된 화학발광에 따라 피어스(Pierce)의 화학발광 시약으로 현상되었다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 안전하게 형질감염된 ICOSLG 293T 세포, 및 이로부터 단리된 엑소좀은 둘 다 ICOSLG의 발현을 증가시킨다. 빈쿨린의 발현을 대조군으로 측정하였다(도 2b). 마지막으로, OX40L 또는 ICOSLG를 발현시키는 세포 및 엑소좀은 유세포 분석을 사용하여 검출되었다(도 3).

실시예 2 - 엑소좀으로 T 세포 처리

HEK293T 블랭크 세포 및 HEK293T ICOSLG에서 수집된 엑소좀을 사용하여 C57BI/6 마우스의 나이브 T 세포 또는 689KPC GEMM 종양을 보유한 C57BI/6 마우스의 비장 T 세포를 치료하였다. 도 4에 개괄된 바와 같이, 세포를 각 마우스의 비장으로부터 단리하고 T 세포를 농축시키기 위해 음성적으로 선택하였다. 단리된 세포를 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CSFE)로 표지하고 CD3/CD28로 자극하였다. 또한, 세포를 대조군 엑소좀, ICOSLG⁺ 엑소좀, 또는 OX40L⁺ 엑소좀으로 자극하였다. 자극 후, 증식, INF-γ 생산 및 IL-2 생산을 측정하였다. 도 5는 대조군 엑소좀에 비해 ICOSLG⁺ 엑소좀으로 자극한 후 IL-2 및 IFN-γ 생산 나이브 T 세포 수의 증가를 보여준다. 도 6은 대조군 엑소좀에 비해 ICOSLG⁺ 엑소좀으로 자극한 후 종양-보유 마우스로부터 IL-2 및 IFN-γ 생산 비장 T 세포 수의 증가를 보여준다.

실시예 3 - 생체내 이식된 B16F10 종양의 치료

B16F10 세포를 각 마우스의 등에 피하 이식하였다. 마우스는 7개의 그룹으로 나뉘었다. 그룹 1은 야생형 HEK293T 세포에서 단리된 엑소좀으로 처리되었다. 그룹 2는 야생형 HEK293T 세포로부터 단리된 엑소좀 및 항-CTLA-4로 처리되었다. 그룹 3은 ICOSL 과발현 HEK293T 세포로부터 단리된 엑소좀 및 항-CTLA-4로 처리되었다. 그룹 4는 OX40L 과발현 HEK293T 세포로부터 단리된 엑소좀 및 항-CTLA4로 처리되었다. 그룹 5는 ICOSL 과발현 HEK293T 세포로부터 단리된 엑소좀으로 처리되었다. 그룹 6은 항-CTLA-4 단독으로 처리되었다. 그룹 7은 PBS로 처리되었다. 2주 동안 매일 각 그룹의 마우스에게 정맥내(I.V.) 주사하였다. 종양 용적을 측정하였다. 도 7a 내지 7j에 도시된 바와 같이, 가장 작은 종양 용적은 ICOSL 과발현 HEK293T 세포로부터 단리된 엑소좀 및 항-CTLA-4로 처리된 마우스에서 관찰되었다.

본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 관점에서 설명되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 작용제가 본원에 기재된 작용제를 대체할 수 있는 한편 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상, 범주 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

참조문헌

하기 참조문헌은 본원에 기재된 것들에 보충적인 예시적인 절차적 또는 다른 세부사항을 제공하는 범위 내에서 구체적으로 본원에 참조로 포함된다.

미국 특허 4,870,287

미국 특허 5,739,169

미국 특허 5,760,395

미국 특허 5,801,005

미국 특허 5,824,311

미국 특허 5,830,880

미국 특허 5,846,945

Claims

엑소좀을 포함하는 조성물로서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 페이로드를 포함하고, 상기 페이로드는 면역조절 분자인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 CD86, PD-L1, PD-L2, HVEM, GAL9, CTLA-4, PD-1, PD-1H, CD160, CD80, BTLA, TIM3, KIR, LAG3, A2aR, OX40L, CD27L, CD137L, BAFF, APRIL, CD70, CD40, B7H3, ICOSL, OX40, CD40L, BMCA, TACI, GITR, BAFFR, CD27, CD137, ICOS, 또는 CD28인, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 OX40L인, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 ICOSL인, 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 CD47을 추가로 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 50%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 조성물.
제6항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 60%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 조성물.
제7항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 70%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 조성물.
제8항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 80%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 90%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 소포내(intravesicular) 단백질 페이로드를 추가로 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 엑소좀 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 투여를 위해 제형화되는, 조성물.
제13항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사를 위해 제형화되는, 조성물.
제13항에 있어서, 항미생물제를 추가로 포함하는, 조성물.
제15항에 있어서, 상기 항미생물제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 브로노폴, 센트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알코올, 글리세린, 엑세티딘(exetidine), 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은, 프로필렌 글리콜, 또는 티메로살인, 조성물.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 환자에게 투여하여 상기 환자의 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 질환의 치료를 필요로 하는 환자의 질환을 치료하는 방법.
제17항에 있어서, 투여는 환자에게 면역조절을 일으키는, 방법.
제17항에 있어서, 상기 질환은 면역 질환, 암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환인, 방법.
제19항에 있어서, 상기 질환은 암인, 방법.
제17항에 있어서, 상기 투여는 전신 투여인, 방법.
제21항에 있어서, 상기 전신 투여는 정맥내 투여인, 방법.
제17항에 있어서, 상기 환자에게 적어도 제2 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 제2 요법은 외과적 요법, 화학요법, 방사선 요법, 한냉요법, 호르몬 요법, 면역요법, 또는 사이토카인 요법을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서, 상기 제2 항암 요법은 입양 T 세포 요법, 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 및/또는 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 상기 환자는 인간인, 방법.
제17항에 있어서, 상기 엑소좀은 환자에게 자가인, 방법.
환자에서 질환의 치료에 사용하기 위한 엑소좀을 포함하는 조성물로서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 페이로드를 포함하고, 상기 페이로드는 면역조절 분자인, 조성물.
제28항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 CD86, PD-L1, PD-L2, HVEM, GAL9, CTLA-4, PD-1, PD-1H, CD160, CD80, BTLA, TIM3, KIR, LAG3, A2aR, OX40L, CD27L, CD137L, BAFF, APRIL, CD70, CD40, B7H3, ICOSL, OX40, CD40L, BMCA, TACI, GITR, BAFFR, CD27, CD137, ICOS, 또는 CD28인, 조성물.
제29항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 OX40L인, 조성물.
제29항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 ICOSL인, 조성물.
제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 CD47을 추가로 포함하는, 조성물.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 50%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 조성물.
제33항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 60%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 조성물.
제34항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 70%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 조성물.
제35항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 80%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 조성물.
제36항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 90%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 조성물.
제28항에 있어서, 상기 질환은 면역 질환, 암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환인, 조성물.
제38항에 있어서, 상기 질환은 암인, 조성물.
제28항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 투여를 위해 제형화되는, 조성물.
제40항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사를 위해 제형화되는, 조성물.
제40항에 있어서, 항미생물제를 추가로 포함하는, 조성물.
제42항에 있어서, 상기 항미생물제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 브로노폴, 센트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알코올, 글리세린, 엑세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은, 프로필렌 글리콜, 또는 티메로살인, 조성물.
제28항에 있어서, 적어도 제2 요법을 추가로 포함하는, 조성물.
제44항에 있어서, 상기 제2 요법은 외과적 요법, 화학요법, 방사선 요법, 한냉요법, 호르몬 요법, 또는 면역요법을 포함하는, 조성물.
제28항에 있어서, 상기 환자는 인간인, 조성물.
제28항에 있어서, 상기 엑소좀은 환자에게 자가인, 조성물.
질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 엑소좀의 용도로서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 페이로드를 포함하고, 상기 페이로드는 면역조절 분자인, 용도.
제48항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 CD86, PD-L1, PD-L2, HVEM, GAL9, CTLA-4, PD-1, PD-1H, CD160, CD80, BTLA, TIM3, KIR, LAG3, A2aR, OX40L, CD27L, CD137L, BAFF, APRIL, CD70, CD40, B7H3, ICOSL, OX40, CD40L, BMCA, TACI, GITR, BAFFR, CD27, CD137, ICOS, 또는 CD28인, 용도.
제49항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 OX40L인, 용도.
제49항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 ICOSL인, 용도.
제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 CD47을 추가로 포함하는, 용도.
제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 50%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 용도.
제53항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 60%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 용도.
제54항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 70%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 용도.
제55항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 80%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 용도.
제56항에 있어서, 상기 엑소좀의 적어도 90%는 이의 표면에 면역조절 분자를 포함하는, 용도.
제48항에 있어서, 상기 질환은 면역 질환, 암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환인, 용도.
제58항에 있어서, 상기 질환은 암인, 용도.
제48항에 있어서, 상기 약제는 비경구 투여를 위해 제형화되는, 용도.
제48항에 있어서, 상기 약제는 전신 투여를 위해 제형화되는, 용도.
제60항에 있어서, 상기 약제는 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사를 위해 제형화되는, 용도.
제48항에 있어서, 상기 약제는 항미생물제를 포함하는, 용도.
제63항에 있어서, 상기 항미생물제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 브로노폴, 센트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알코올, 글리세린, 엑세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은, 프로필렌 글리콜, 또는 티메로살인, 용도.