JP2023531721A - 免疫モジュレーターを有する細胞外小胞 - Google Patents

免疫モジュレーターを有する細胞外小胞 Download PDF

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Abstract

本明細書において、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む細胞外小胞（ＥＶ）を提供する。同様に、本明細書において、本明細書に記載されるＥＶを使用して、ＡＡＶなどの治療剤に対する寛容を誘導する方法も提供する。一部の態様では、本発明は、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導するための細胞外小胞（ＥＶ）であって、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含むＥＶを提供する。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年６月２４日に出願された米国特許仮出願第６３／０４３，５８７号の優先権の利益を主張するものであり、これらの開示全体は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルにおける配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルにおける次の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピューター可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：７７４３９２０００２４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０２１年６月２２日、サイズ：２１ＫＢ）。
発明の分野
本開示は、全般的には、個体において免疫寛容を誘導するための免疫モジュレーターを有する細胞外小胞（ＥＶ）に関する。
背景
望ましくない免疫応答は、抗薬物応答および移植の拒絶に関与する。薬物、特に生物製剤、細胞治療、および遺伝子治療に対する免疫応答は、有効性に影響を及ぼし、再投与を妨げ得る。レシピエント生物におけるドナー臓器の移植後の病原性免疫応答は、移植の拒絶および患者の生存の低下をもたらし得る。したがって、抗原に対する免疫寛容を確立するアプローチは、集中的な治療開発の焦点である。
遺伝子治療の観点から、ウイルスベクターに対する宿主免疫応答は、主にカプシド特異的適応免疫応答により、産物の第２の用量の投与を妨げる。その上、治療タンパク質の新規発現に対するＴ細胞応答は、遺伝子療法産物の有効性を低下させ得る（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｂｌｏｏｄ， １２２（１）：２３－３６）。
抗薬物応答および移植の拒絶を低減させる方法がなおも必要である。
免疫調節剤を有するエキソソームは、ＷＯ第２０１９／１３３９３４号、ＷＯ第２０１９／１７８１１３号、ＷＯ第２０２１／００３４４５号、ＷＯ第２０１８／２０８６７０号、ＷＯ第２０１９／０２７８４７号、およびＷＯ第２０２０／２５７７１０号に記載されており、それらは全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特許出願および刊行物を含む、本明細書に引用されているあらゆる参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
国際公開第２０１９／１３３９３４号 国際公開第２０１９／１７８１１３号 国際公開第２０２１／００３４４５号 国際公開第２０１８／２０８６７０号 国際公開第２０１９／０２７８４７号 国際公開第２０２０／２５７７１０号
Ｍｉｎｇｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｂｌｏｏｄ， １２２（１）：２３－３６
発明の簡単な概要
一部の態様では、本発明は、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導するための細胞外小胞（ＥＶ）であって、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含むＥＶを提供する。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である。一部の実施形態では、脂質二重層は、２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子を含む、または２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なるチェックポイントタンパク質を含む。一部の実施形態では、脂質二重層は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ－４およびＴＩＭ－３、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＴＩＭ－３、ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＴＩＭ－３；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＴＩＭ－３；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＴＩＭ－３；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＴＩＭ－３；またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡおよびＴＩＭ－３を含む。一部の実施形態では、免疫抑制分子のうち１種または複数は、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤＧＲ膜貫通ドメインである。
さらなる実施形態では、本発明のＥＶの脂質二重層は、標的化分子をさらに含む。一部の実施形態では、標的化分子は、細胞または組織特異性をＥＶに付与する。一部の実施形態では、標的化分子は、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する特異性をＥＶに付与する。一部の実施形態では、標的化分子は、ドナー組織と個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする。一部の実施形態では、標的化分子は抗体である。一部の実施形態では、１種または複数の標的化分子は、膜貫通ドメインを含む。
さらなる実施形態では、本発明のＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、抗ＣＤ４０抗体、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、産生細胞は、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない。
一部の実施形態では、本発明は、本発明のＥＶ（例えば、上記の通り）と１種または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は作用因子をさらに含む。一部の実施形態では、作用因子は治療剤である。一部の実施形態では、作用因子は、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、または移植された細胞もしくは組織である。一部の実施形態では、作用因子がＥＶと会合する。一部の実施形態では、作用因子は、ＥＶの外部表面と会合する。
一部の態様では、本発明は、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導する方法であって、作用因子を個体に投与することと併せてＥＶの有効量を個体に投与するステップを含み、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である。一部の実施形態では、脂質二重層は、２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子を含む、または２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なるチェックポイントタンパク質を含む。一部の実施形態では、脂質二重層は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ－４およびＴＩＭ－３、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＴＩＭ－３、ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＴＩＭ－３；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＴＩＭ－３；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＴＩＭ－３；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＴＩＭ－３；またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡおよびＴＩＭ－３を含む。一部の実施形態では、免疫抑制分子のうち１種または複数は、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである。
本発明の方法のさらなる実施形態では、脂質二重層は、標的化分子をさらに含む。一部の実施形態では、標的化分子は、ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する。一部の実施形態では、標的化分子は、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する方法の特異性を付与する。一部の実施形態では、標的化分子は、ドナー組織と個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする。一部の実施形態では、標的化分子は、抗体である。一部の実施形態では、１種または複数の標的化分子は、膜貫通ドメインを含む。
本発明の方法の一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、抗ＣＤ４０抗体、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、産生細胞は、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない。
本発明の方法の一部の実施形態では、ＥＶは、作用因子の投与前、投与と同時、または投与後に個体に投与される。一部の実施形態では、ＥＶは、作用因子の投与と同時に個体に投与される。一部の実施形態では、ＥＶおよび作用因子は、異なる製剤に存在する。一部の実施形態では、ＥＶおよび作用因子は、同じ製剤に存在する。一部の実施形態では、作用因子がＥＶと会合する。一部の実施形態では、作用因子は、ＥＶの外部表面と会合する。
本発明の方法の一部の実施形態では、免疫寛容の刺激は、作用因子の個体への反復投与を容易にする。一部の実施形態では、反復投与は、作用因子の約２回よりも多くの投与、３回よりも多くの投与、４回よりも多くの投与、５回よりも多くの投与、６回よりも多くの投与、７回よりも多くの投与、８回よりも多くの投与、９回よりも多くの投与、または１０回よりも多くの投与を含む。
本発明の方法の一部の実施形態では、作用因子は治療剤である。一部の実施形態では、作用因子は、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、または移植された細胞もしくは組織である。一部の実施形態では、作用因子は、治療ポリペプチドである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、酵素、ホルモン、抗体、抗体断片、凝固因子、成長因子、受容体、またはその機能的誘導体である。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチュブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、コロイデレミアタンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルボミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、または副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）である。一部の実施形態では、作用因子は、治療ポリペプチドをコードする核酸または治療核酸である。一部の実施形態では、核酸は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチューブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、全脈絡膜萎縮タンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたは副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）をコードする。一部の実施形態では、治療核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡザイム、またはＤＮＡザイムである。一部の実施形態では、核酸は、１種または複数の遺伝子編集産物をコードする。一部の実施形態では、ポリペプチド－核酸複合体は、遺伝子編集複合体である。一部の実施形態では、作用因子は、ウイルスベクターまたはそのカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターである。本発明の方法の一部の実施形態では、個体はヒトである。
本発明の一部の実施形態では、作用因子は、細胞治療に使用される細胞である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、または分化細胞である。一部の実施形態では、細胞は、多能性細胞または複能性細胞である。一部の実施形態では、細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、心筋幹細胞、神経幹細胞、骨幹細胞、間葉幹細胞、または脂肪幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、血液細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、膵細胞、膵島細胞、眼細胞、神経細胞、アストロサイト、希突起膠細胞、内耳有毛細胞、軟骨細胞、または骨芽細胞である。一部の実施形態では、細胞は、個体に対して同種である。
一部の態様では、本発明は、個体における疾患または障害を処置する方法であって、ＥＶの有効量を個体に投与するステップを含み、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、疾患または障害が自己免疫疾患または障害である。一部の実施形態では、ＥＶは、組織移植または細胞生着と併せて投与される。
一部の態様では、本発明は、個体における疾患または障害を処置する方法であって、作用因子を個体に投与することと併せてＥＶの有効量を個体に投与するステップを含み、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含み、作用因子が疾患または障害を処置する、方法を提供する。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である。一部の実施形態では、脂質二重層は、２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子を含む、または２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なるチェックポイントタンパク質を含む。一部の実施形態では、脂質二重層は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを含む。一部の実施形態では、免疫抑制分子のうち１種または複数は、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである。
本発明の処置の方法の一部の実施形態では、脂質二重層は、標的化分子をさらに含む。一部の実施形態では、標的化分子は、ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する。一部の実施形態では、標的化分子は、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する方法の特異性を付与する。一部の実施形態では、標的化分子は、ドナー組織と個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする。一部の実施形態では、標的化分子は、抗体である。一部の実施形態では、１種または複数の標的化分子は、膜貫通ドメインを含む。
本発明の処置の方法の一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、抗ＣＤ４０抗体、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、産生細胞は、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない。
本発明の処置の方法の一部の実施形態では、ＥＶは、作用因子の投与前、投与と同時、または投与後に個体に投与される。一部の実施形態では、ＥＶは、作用因子の投与と同時に個体に投与される。一部の実施形態では、ＥＶおよび作用因子は、異なる製剤に存在する。一部の実施形態では、ＥＶおよび作用因子は、同じ製剤に存在する。一部の実施形態では、作用因子は、ＥＶと会合する。一部の実施形態では、作用因子は、ＥＶの外部表面と会合する。一部の実施形態では、免疫寛容の刺激は、作用因子の個体への反復投与を容易にする。一部の実施形態では、反復投与は、作用因子の約２回よりも多くの投与、３回よりも多くの投与、４回よりも多くの投与、５回よりも多くの投与、６回よりも多くの投与、７回よりも多くの投与、８回よりも多くの投与、９回よりも多くの投与、または１０回よりも多くの投与を含む。
本発明の処置の方法の一部の実施形態では、作用因子は治療剤である。一部の実施形態では、作用因子は、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、または移植された細胞もしくは組織である。一部の実施形態では、作用因子は、治療ポリペプチドである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、酵素、ホルモン、抗体、抗体断片、凝固因子、成長因子、受容体、またはその機能的誘導体である。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチュブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、コロイデレミアタンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルボミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、または副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）である。一部の実施形態では、作用因子は、治療ポリペプチドをコードする核酸または治療核酸である。一部の実施形態では、核酸は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチューブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、全脈絡膜萎縮タンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたは副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）をコードする。一部の実施形態では、治療核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡザイム、またはＤＮＡザイムである。一部の実施形態では、核酸は、１種または複数の遺伝子編集産物をコードする。一部の実施形態では、ポリペプチド－核酸複合体は、遺伝子編集複合体である。一部の実施形態では、作用因子は、ウイルスベクターまたはそのカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターである。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の態様では、本発明は、本発明のＥＶを産生するための方法であって、１種または複数の１種または複数の膜結合免疫抑制分子をコードする核酸を含むＥＶ産生細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＶを生成する条件下で培養するステップ、およびＥＶを収集するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＥＶ産生細胞は、膜結合免疫抑制分子をコードする外因性の核酸を含む、実施形態１２６に記載の方法。一部の実施形態では、膜結合免疫抑制分子は、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である。一部の実施形態では、免疫抑制分子のうち１種または複数は、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである。
本発明のＥＶを産生する方法の一部の実施形態では、脂質二重層は、標的化分子をさらに含む。一部の実施形態では、標的化分子は、ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する。一部の実施形態では、標的化分子は、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対するＥＶの特異性を付与する。一部の実施形態では、標的化分子は、ドナー組織と個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする。一部の実施形態では、標的化分子は、抗体である。一部の実施形態では、１種または複数の標的化分子は、膜貫通ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される。一部の実施形態では、産生細胞は、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない。
一部の実施形態では、本発明は、免疫抑制ＥＶを生産するための生産細胞であって、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含み、１種または複数の免疫抑制分子が膜に結合している、生産細胞を提供する。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作されている。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を発現するように操作されている。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である。一部の実施形態では、免疫抑制分子のうち１種または複数は、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである。
本発明の生産細胞の一部の実施形態では、脂質二重層は、標的化分子をさらに含む。一部の実施形態では、標的化分子は、ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する。一部の実施形態では、標的化分子は、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対するＥＶの特異性を付与する。一部の実施形態では、標的化分子は、ドナー組織と個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする。一部の実施形態では、標的化分子は、抗体である。一部の実施形態では、１種または複数の標的化分子は、膜貫通ドメインを含む。
本発明の生産細胞の一部の実施形態では、１種もしくは複数の免疫抑制分子および／または１種もしくは複数の標的化分子をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、１種もしくは複数の免疫抑制分子および／または１種もしくは複数の標的化分子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれる。
一部の実施形態では、生産細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、生産細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、生産細胞はヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である。一部の実施形態では、生産細胞は１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない。
図１は、脂質二重層に取り込まれた膜貫通ドメインタンパク質ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１を有する免疫寛容化細胞外小胞の機能的構成成分の例を示す。
詳細な説明
一部の態様では、本発明は、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導するための細胞外小胞（ＥＶ）であって、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含むＥＶを提供する。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む。
一部の態様では、本発明は、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導する方法であって、作用因子を個体に投与することと併せてＥＶの有効量を個体に投与するステップを含み、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む方法を提供する。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む。
一部の態様では、本発明は、個体における疾患または障害を処置する方法であって、作用因子を個体に投与することと併せてＥＶの有効量を個体に投与するステップを含み、ＥＶが１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含み、作用因子が疾患または障害を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、１種または複数の免疫抑制分子は、１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む。
一部の態様では、本発明は、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導するためのＥＶを産生する方法であって、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含み、１種または複数の１種または複数の膜結合免疫抑制分子をコードする核酸を含むＥＶ産生細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＶを生成する条件下で培養するステップと、ＥＶを収集するステップとを含む方法を提供する。
一部の態様では、本発明は、免疫抑制性ＥＶを産生するための産生細胞であって、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含み、１種または複数の免疫抑制分子が膜に結合している、産生細胞を提供する。
一部の態様では、本発明は、組換え抗体、タンパク質、核酸、細胞、またはウイルスカプシド（例えば、操作されたまたは野生型ウイルスカプシド）を含むがこれらに限定されない作用因子（例えば治療産物）と共に製剤化して、作用因子に対する免疫寛容を誘導することができる寛容化細胞外小胞を提供する。
一部の態様では、本発明は、産生細胞上清中のＥＶと会合するようになる分泌剤を同時に産生する同じ産生細胞によって産生された寛容化ＥＶを提供する。一部の実施形態では、作用因子は、ＥＶの外部表面と会合する。
全般的技術
本明細書に記載または参照されている技法および手順は、一般に十分に理解されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ４ｔｈ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， ２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， ２００３）； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．， １９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ．， １９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ６ｔｈ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ， ｅｄ．， １９８４）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ （Ｊ．Ｅ． Ｃｅｌｌｉｓ， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｊ．Ｐ． Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ． Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ （Ａ． Ｄｏｙｌｅ， Ｊ．Ｂ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， ａｎｄ Ｄ．Ｇ． Ｎｅｗｅｌｌ， ｅｄｓ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９３－８）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ．， １９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （Ｊ．Ｍ． Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ， ｅｄｓ．， １９８７）；ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ， （Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ （Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （Ｐ． Ｆｉｎｃｈ， １９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ． Ｃａｔｔｙ．， ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｐ． Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ． Ｄｅａｎ， ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （Ｍ． Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ． Ｄ． Ｃａｐｒａ， ｅｄｓ．， Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９５）；およびＣａｎｃｅｒ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ （Ｖ．Ｔ． ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ， ２０１１）に記載されている広く利用されている方法論等、従来の方法論を使用して当業者によって一般的に用いられている。
定義
本明細書を解釈する目的のため、他に断りがなければ次の定義が適用される。適切な場合は常に、単数形で使用されている用語は、複数形も含み、逆もまた同じである。下に表記されるいずれかの定義が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書と矛盾する場合、表記されている定義が優先するものとする。
本明細書で使用される場合、単数形形態「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、他に指示がなければ複数形の参照を含む。
１つまたは複数の項目のリストがその後に続く用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「ＡおよびＢのうち少なくとも１つ」）は、本明細書で他に指示がなければまたは文脈によって明らかに相反しない限り、列挙されている項目から選択される１つの項目（ＡまたはＢ）または列挙されている項目のうち２つもしくはそれよりも多くのいずれかの組合せ（ＡおよびＢ）を意味するものと解釈されるべきである。
本明細書に記載されている本開示の態様および実施形態は、斯かる態様および実施形態「を含む」、「からなる」および「から本質的になる」ものを含むことが理解される。
本明細書に記載されているあらゆる組成物、および本明細書に記載されている組成物を使用したあらゆる方法のため、組成物は、列挙されている構成成分もしくはステップを含むことができる、または列挙されている構成成分もしくはステップ「から本質的になる」もしくは「からなる」ことができる。組成物が、列挙されている構成成分「から本質的になる」と記載される場合、組成物は、列挙されている構成成分を含有し、開示されている方法に実質的に影響を与えない他の構成成分を含有することができるが、明確に列挙されている構成成分以外の、開示されている方法に実質的に影響を与えるいかなる他の構成成分も含有しない；または、組成物が、開示されている方法に実質的に影響を与える、列挙されているもの以外の余分な構成成分を含有する場合、組成物は、開示されている方法に実質的に影響を与えるのに十分な濃度もしくは量の余分な構成成分を含有しない。方法が、列挙されているステップ「から本質的になる」と記載される場合、方法は、列挙されているステップを含有し、開示されている方法に実質的に影響を与えない他のステップを含有することができるが、方法は、明確に列挙されているステップ以外の、開示されている方法に実質的に影響を与えるいかなる他のステップも含有しない。非限定的な具体例として、組成物が、構成成分「から本質的になる」と記載される場合、組成物は、開示されている組成物または方法の特性に実質的に影響を与えない、いずれかの量の薬学的に許容される担体、媒体または希釈剤および他の斯かる構成成分をその上含有することができる。
用語「約」は、本明細書で使用される場合、本技術分野の当業者であれば容易に公知となる、それぞれの値に関する通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」ある値またはパラメーターの参照は、当該の値またはパラメーターそれ自体を対象にする実施形態を含む（および記載する）。
本明細書で使用される場合、用語「細胞外小胞」は、エンドソーム系に由来するまたは細胞膜から脱落したＥＶおよび微小小胞体をそれぞれ含む不均一な細胞由来膜構造群を指す。例えば、ｖａｎ Ｎｉｅｌ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１８ Ａｐｒ；１９（４）：２１３－２２８を参照されたい。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、いずれかの長さのポリマー形態のヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらの組合せを指す。よって、この用語として、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（ＲＮＡまたはＤＮＡに典型的に見出すことができるような）、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。その代わりに、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）等、合成サブユニットのポリマーを含むことができ、よって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ－ＮＨ２）または混合ホスホロアミデート－ホスホジエステルオリゴマーとなることができる。加えて、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖をアニーリングすることにより、またはＤＮＡポリメラーゼと適切なプライマーを使用して相補鎖をｄｅ ｎｏｖｏ合成することにより、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用されており、いずれか特定の最小または最大の長さに限定されるものではない。アミノ酸残基の斯かるポリマーは、天然または非天然アミノ酸残基を含有することができ、そのようなものとして、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体および多量体が挙げられるがこれらに限定されない。全長タンパク質およびその断片の両方が、この定義によって包含される。この用語は、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的のため、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限りにおいて、ネイティブ配列に対し、欠失、付加および置換（一般に、保存的な性質）等の改変を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発による等、計画的である場合がある、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅による誤りによる等、偶発的である場合がある。
「ウイルスベクター」は、少なくとも１または２個の反復配列（例えば、ＡＡＶのための逆位末端反復配列（ＩＴＲ）またはレンチウイルスのための長鎖末端反復配列（ＬＴＲ））によって挟まれる、１個または複数の異種配列（すなわち、ウイルス起源でない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。異種核酸は、「カセット」として送達されるべき「ペイロード」と称することができ、多くの場合、少なくとも１または２個の反復配列（例えば、ＡＡＶのための逆位末端反復配列（ＩＴＲ）またはレンチウイルスのための長鎖末端反復配列（ＬＴＲ））によって挟まれる。斯かるウイルスベクターは、宿主細胞中に存在する場合、宿主細胞が必須機能をもたらす限り、複製され、感染性ウイルス粒子へとパッケージングされ得る。ウイルスベクターが、より大型のポリヌクレオチド（例えば、染色体中、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミド等の別のベクター中）に取り込まれる場合、ウイルスベクターは、ウイルス複製およびパッケージング機能の存在下で複製およびカプシド形成によって「レスキュー」され得る「プロベクター」と称することができる。ウイルスベクターは、ウイルスカプシドへとパッケージングされて、「ウイルス粒子」を生成することができる。ある観点では、ウイルス粒子は、ウイルスゲノムおよび異種核酸ペイロードと合わせたウイルスカプシドを指す。
「異種」は、これが比較されるまたはこれが導入もしくは取り込まれる実体の残りとは遺伝子型的に別個の実体に由来することを意味する。例えば、異なる細胞型へと遺伝子操作技法によって導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして、発現される場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに取り込まれる細胞の配列（例えば、遺伝子またはその部分）は、ベクターに関して異種ヌクレオチド配列である。異種核酸は、これが比較されるまたはこれが導入もしくは取り込まれる実体の残りとは遺伝子型的に別個の実体に由来する核酸を指すことができる。異種を使用して、これが導入される種にとって非ネイティブである他の生物学的構成成分（例えば、タンパク質）を指すこともできる。例えば、異種核酸から細胞において発現されるタンパク質は、細胞に関して異種タンパク質となる。遺伝子操作技法によって細胞または生物に導入される核酸は、細胞または生物にとって異種または相同であるかに関係なく、細胞または生物にとって「外因性」とみなすことができる。よって、例えば、ベクターを使用して、ヒト遺伝子の追加的なコピーをヒト細胞に導入することができる。細胞に導入される遺伝子は、相同（ネイティブ）核酸配列を含有する場合があるとしても、細胞にとって外因性であろう。
「単離された」分子（例えば、核酸またはタンパク質）または細胞は、その天然環境の構成成分から同定され分離された、および／または回収されたことを意味する。
「操作された」または「遺伝子操作された」などの用語は、人為的に遺伝子改変された（例えば、研究室技法を使用して）または斯かる遺伝子改変に起因する、生物学的材料を指すように使用されている。
本明細書で使用される場合、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のため、有益なまたは所望の臨床結果として、検出可能であれ検出不能であれ、症状の軽減、疾患の程度の縮小、安定化された（例えば、悪化していない）疾患状態、疾患の拡散（例えば、転移）の防止、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の寛解または緩和、および軽快（部分的であれ完全であれ）が挙げられるがこれらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比較した、生存期間の延長を意味することもできる。
本明細書で使用される場合、用語「予防的処置」は、個体が、障害を有するまたは有するリスクがあることが公知であるまたはそうであると疑われるが、障害の症状を呈していないまたは最小の症状を呈した場合の、処置を指す。予防的処置を受けている個体は、症状の開始に先立ち処置することができる。
「有効量」は、臨床結果（例えば、症状の寛解、および臨床エンドポイントの達成など）を含む有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数の投与において投与することができる。疾患状態の観点から、有効量は、疾患の寛解、安定化、または発症遅延に十分な量である。
本明細書で使用される場合、「併用療法」とは、第１の作用因子が別の作用因子と併せて投与されることを意味する。「と併せて」は、別の処置モダリティに加えて１つの処置モダリティの投与、例えば本明細書に記載の作用因子（例えば、治療剤）の同じ個体への投与に加えて本明細書に記載されるＥＶの構成成分の投与を指す。そのため、「と併せて」は、個体への他の処置モダリティの送達の前、間、または後の１つの処置モダリティの投与を指す。
用語「同時投与」は、本明細書で使用される場合、併用療法における第１の治療および第２の治療が、約１５分以下、例えば約１０分以下、５分以下、または１分以下のいずれかの時間間隔で投与されることを意味する。第１および第２の治療が同時に投与される場合、第１および第２の治療は同じ組成物に含有されてもよく（例えば、第１および第２の治療の両方を含む組成物）、または別々の組成物（例えば、１つの組成物中に第１の治療および別の組成物中に第２の治療が含有される）に含有されてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「逐次投与」は、併用療法における第１の治療および第２の治療が、約１５分より長い時間間隔で、例えば約２０分、３０分、４０分、５０分、６０分のいずれかよりも長い、またはそれよりも長い時間間隔で投与されることを意味する。第１の治療および第２の治療のいずれを先に投与してもよい。第１および第２の治療は別々の組成物に含有され、これは同じまたは異なるパッケージまたはキットに含有されてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「並行（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）投与」は、併用療法中の第１の治療の投与と第２の治療の投与が互いに重複することを意味する。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるがこれらに限定されない。特に、個体または対象は、ヒトである。
用語「医薬組成物」は、含有される有効成分の生物活性が有効となるような形態にある調製物、および組成物が投与されるであろう対象に対して許容できないほど毒性である追加的な構成成分を含有しない調製物を指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」、または「薬理学的に適合する」とは、生物学的にまたは別段望ましくないことはない材料を意味し、例えば材料は、それが任意の有意な望ましくない生物効果を引き起こすことなくまたはそれが含有される組成物の他の構成成分のいずれとも有害に相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物に組み込まれ得る。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは必要な毒性および製造試験基準を満たしているか、ならびに／または米国食品医薬品局によって調製された不有効成分ガイド（Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ）に含まれる。
本明細書に記載される構造的特徴および機能的特徴のいずれに関しても、これらの特徴を決定する方法は当技術分野で公知である。
免疫抑制分子で操作されたＥＶ
本明細書に提供されるＥＶは、１種または複数の免疫調節分子（例えば、免疫抑制分子または免疫刺激分子）を含む脂質二重層を含む。本明細書に提供されるウイルスベクターのエンベロープは、ウイルス粒子を部分的にまたは完全に囲む脂質二重層を含む。天然に存在するまたは合成（人工）の脂質二重層を含む、いかなる脂質二重層を使用することもできる。合成脂質二重層は、例えば、リポソームを含む。天然に存在する脂質二重層は、エキソソーム、微小小胞体（例えば、脱落小胞（ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｖｅｓｉｃｌｅ）またはエクトソーム）などを含む、当技術分野で公知の細胞外小胞（ＥＶ）の様々な型のいずれかを含む。例えば、ＥＶの脂質二重層の脂質二重層は、産生細胞、特に、同じ型の操作されていない産生細胞と比較して１種または複数の免疫抑制分子を過剰発現するように操作された産生細胞から「出芽」した細胞膜の部分によってもたらされ得る。斯かる脂質二重層は、これが脱落した箇所の細胞膜の部分を含む。一部の実施形態では、脂質二重層は、エンドソーム関連タンパク質（Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１およびＲａｂタンパク質）；テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５３およびＣＤ３７）；脂質ラフト関連タンパク質（グリコシルホスファチジルイシトールおよびフロチリン）、および／またはコレステロール、スフィンゴミエリンおよび／またはグリセロリン脂質を含む脂質を含む。一部の実施形態では、脂質二重層は、エキソソーム脂質二重層（例えば、脂質二重層は、エキソソームである）、特に、本明細書に記載されている１種または複数の免疫抑制分子を過剰発現するように操作された産生細胞のエキソソーム脂質二重層である（すなわち、産生細胞から脱落した、別段、産生細胞に由来するもしくは産生細胞によって産生された）。
いかなる細胞型も、ＥＶをもたらすことができるが、腫瘍細胞の不死化に寄与する作用因子（例えば、遺伝要素）による混入の可能性のため、また、発癌性もしくは他の面で対象にとって有害となり得るため、時に、本発明の文脈において、産生細胞としての腫瘍細胞の使用を避けることが有利である。よって、一部の実施形態では、脂質二重層は、非腫瘍エキソソーム脂質二重層等、非腫瘍ＥＶ脂質二重層である（例えば、脂質二重層は、ＥＶまたはエキソソームが、腫瘍細胞に起源を持たないことを意味する、非腫瘍エキソソーム等、非腫瘍ＥＶに由来する）。他の実施形態では、脂質二重層は、２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ）由来のＥＶ脂質二重層（例えば、エキソソーム脂質二重層またはエキソソーム）、特に、本明細書に記載されている１種または複数の免疫抑制分子を発現（例えば、過剰発現）するように操作された２９３細胞等、非腫瘍産生細胞由来のＥＶ脂質二重層（例えば、エキソソーム脂質二重層またはエキソソーム）である（すなわち、産生細胞から脱落した、別段、産生細胞に由来するもしくは産生細胞によって産生された）。
脂質二重層はまた、免疫調節分子（例えば、免疫抑制分子または免疫刺激分子）も含む。一部の実施形態では、脂質二重層は免疫抑制分子を含む。免疫抑制分子は、いずれかの様式で、脂質二重層と会合することができる。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、脂質二重層内にまたはその表面に包埋される。例えば、免疫抑制分子は、天然または合成のいずれかにより、脂質二重層に組み込む膜貫通ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、脂質二重層に埋もれており、免疫抑制分子の少なくとも一部（例えば、機能的部分）が、ＥＶの外部に表示される。一部の実施形態では、膜貫通部分は、脂質二重層にわたり、免疫抑制分子の少なくとも一部（例えば、機能的部分）がＥＶの外部に表示される。膜貫通ドメインは、当技術分野で公知であり、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、免疫抑制分子および／または標的化分子を産生細胞の細胞膜に効率的に輸送する任意のドメインである。膜貫通ドメインを取り込む方法（例えば、融合タンパク質を生成することにより）は、当技術分野で公知である。
免疫抑制分子は、ＥＶの共投与がない、または免疫抑制分子を含有するように操作されていないＥＶを有する同じ作用因子と比較して、治療剤に対する宿主免疫応答を低下させるいずれかの分子であり得る。免疫抑制分子として、免疫インヒビターを刺激もしくは上方調節することによる、または免疫刺激分子および／または活性化因子を阻害もしくは下方調節することによる等、いずれかの機構によって宿主の免疫機能を下方調節する分子（例えば、タンパク質）が挙げられるがこれらに限定されない。免疫抑制分子として、免疫チェックポイント受容体およびリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。免疫抑制分子の非限定的な例として、例えば、ＣＴＬＡ－４およびそのリガンド（例えば、Ｂ７－１およびＢ７－２）、ＰＤ－１およびそのリガンド（例えば、ＰＤＬ－１およびＰＤＬ－２）、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３およびそのリガンド（例えば、ＧＡＬ９）、ＴＩＧＩＴおよびそのリガンド（例えば、ＣＤ１５５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ならびにＢＴＬＡおよびそのリガンド（例えば、ＨＶＥＭ）が挙げられる。前述のチェックポイント分子のいずれかの活性断片および誘導体；前述のチェックポイント分子のいずれかに対するアゴニスト抗体等、前述のチェックポイント分子のいずれかのアゴニスト；抗ＣＤ２８抗体等、免疫刺激受容体（共刺激受容体）もしくはそのリガンドを遮断する抗体；または免疫チェックポイント分子の免疫機能を模倣するペプチドも含まれる。所望の免疫抑制分子が、膜貫通ドメインをネイティブに含まない程度まで、キメラ分子発現およびそのリガンドまたは受容体への結合の維持に必要となり得る、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、必要に応じて、全長細胞内ドメインまたはいずれかの最小細胞間ドメインのいずれかとを含むキメラ分子を作製することにより、免疫抑制分子は、脂質二重層に包埋するように操作することができる。エフェクター分子の膜貫通ドメインおよび細胞間ドメインは、免疫グロブリンＦｃ受容体ドメイン（またはその膜貫通領域）または発現およびリガンド結合活性の維持に必要な他のいずれかの機能的ドメインを含むことができる。
一部の実施形態では、免疫抑制分子は、Ｂ細胞の機能を阻害する。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはそのリガンドであるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４としても知られる）のアンタゴニストである。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、ＣＤ４０またはそのリガンドであるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４としても知られる）に特異的に結合する抗体である。
脂質二重層は、いずれか１種または複数の異なる型の免疫抑制分子を含むことができる；しかし、一部の実施形態では、脂質二重層は、２種またはそれよりも多い異なる免疫抑制分子（例えば、３種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子、４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子、またはさらには５種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子）の組合せを含む。よって、例えば、一部の実施形態では、脂質二重層は、２種またはそれよりも多い異なる免疫チェックポイント分子（例えば、３種もしくはそれよりも多い異なる免疫チェックポイント分子、４種もしくはそれよりも多い異なる免疫チェックポイント分子、またはさらには５種もしくはそれよりも多い異なる免疫チェックポイント分子）、必要に応じて、ＣＴＬＡ－４およびそのリガンド（例えば、Ｂ７－１およびＢ７－２）、ＰＤ－１およびそのリガンド（例えば、ＰＤＬ－１およびＰＤＬ－２）、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３およびそのリガンド（例えば、ＧＡＬ９）、ＴＩＧＩＴおよびそのリガンド（例えば、ＣＤ１５５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡならびにＢＴＬＡおよびそのリガンド（例えば、ＨＶＥＭ）；前述のチェックポイント分子のいずれかの活性断片および誘導体；前述のチェックポイント分子のいずれかに対するアゴニスト抗体等、前述のチェックポイント分子のいずれかのアゴニスト；抗ＣＤ２８抗体等、免疫刺激受容体（共刺激受容体）もしくはそのリガンドを遮断する抗体；または免疫チェックポイント分子の免疫機能を模倣するペプチドから選択される、２種またはそれよりも多い（例えば、３種もしくはそれよりも多い、４種もしくはそれよりも多い、またはさらには５種もしくはそれよりも多い）分子の組合せを含む。一部の実施形態では、脂質二重層は、単独で、または最大４種の異なる分子の組合せで、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ、またはこれらのいずれかの組合せ、または他の免疫抑制性分子を含む。一部の実施形態では、脂質二重層は、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ、ＣＴＬＡ－４および抗ＣＤ２８、ＰＤ－１およびＶＩＳＴＡ、Ｂ７－１およびＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－１およびＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－１およびＰＤ－１、Ｂ７－１およびＶＩＳＴＡ、Ｂ７－１および抗ＣＤ２８、Ｂ７－２およびＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－２およびＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－２およびＰＤ－１、Ｂ７－２およびＶＩＳＴＡ、Ｂ７－２および抗ＣＤ２８、ＰＤ－１およびＶＩＳＴＡ、ＰＤ－１および抗ＣＤ－２８、ＶＩＳＴＡおよび抗ＣＤ２８、ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ、ＰＤ－Ｌ１および抗ＣＤ－２８、ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ、ＰＤ－Ｌ２および抗ＣＤ－２８、またはＶＩＳＴＡおよび抗ＣＤ２８を含む。一部の実施形態では、脂質二重層は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ、ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ、またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを含む。
一部の実施形態では、免疫抑制分子は、膜貫通ドメインを含むように操作されている。ベクターにおいて使用される免疫抑制分子は、ベクターが投与されるべき哺乳動物の種のものとなるべきである。よって、ヒトにおける使用のため、免疫抑制分子のヒトオルソログを使用するべきであり、このタンパク質は、本分野で周知である。特定の実施形態では、脂質二重層に含まれる免疫抑制分子は、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５２０５．２によって同定されるタンパク質によって、ヒトＣＴＬＡ－４が提供され、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０５４８６２．１によって同定されるタンパク質によってＰＤ－Ｌ１が提供される。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ－４分子である（またはこれに由来する）。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、配列番号１のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ－４分子である（またはこれに由来する）。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＰＤＬ－１分子である（またはこれに由来する）。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、配列番号２のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＤＬ－１分子である（またはこれに由来する）。
脂質二重層は、免疫抑制分子をコードする外因性の核酸の導入の非存在下で産生細胞によって産生されるよりも機能的により多くの任意の適した量または濃度の免疫抑制分子を含み得る。一部の実施形態では、脂質二重層は、免疫抑制分子を含有するように操作されたＥＶと併せて投与されていない同じベクターと比較して、操作されたウイルスベクターによってコードされる導入遺伝子の送達および発現を改善するために十分な量の免疫抑制分子を含む。ＥＶーを産生する方法に関連してさらに詳細に説明される通り、ネイティブ宿主細胞と比較して免疫抑制分子を過剰発現するように宿主（産生株）細胞を操作することにより、脂質二重層に十分な濃度の免疫抑制分子を含む、ＥＶを提供することができる。よって、一部の実施形態では、本明細書に提供されるＥＶの脂質二重層は、免疫抑制分子を過剰発現するように操作されていない同じ宿主細胞から産生される同じＥＶよりも多い量で、免疫抑制分子のうち１種または複数（または全種）を含む。例えば、本明細書に提供される脂質二重層は、免疫抑制分子を過剰発現するように操作されていない同じ宿主細胞から産生される同じＥＶよりも多い、約２倍もしくはそれよりも多く、約３倍もしくはそれよりも多く、約５倍もしくはそれよりも多く、約１０倍もしくはそれよりも多く、約２０倍もしくはそれよりも多く、約５０倍もしくはそれよりも多く、またはさらには約１００倍もしくはそれよりも多く（例えば、約１０００倍またはそれよりも多く）の量で、免疫抑制分子のうち１種または複数（または全種）を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、免疫抑制分子を過剰発現するように操作されていない同じ宿主細胞よりも約２倍もしくはそれよりも多く、約３倍もしくはそれよりも多く、約５倍もしくはそれよりも多く、約１０倍もしくはそれよりも多く、約２０倍もしくはそれよりも多く、約５０倍もしくはそれよりも多く、またはさらには約１００倍もしくはそれよりも多く（例えば、約１０００倍またはそれよりも多く）、免疫抑制分子のうち１種または複数（または全種）を過剰発現するように操作される。上に説明されている通り、一部の実施形態では、宿主細胞は、免疫抑制分子を過剰発現するように操作された非腫瘍宿主細胞であり、脂質二重層は、免疫抑制分子を過剰発現するように操作された非腫瘍細胞由来の非腫瘍エキソソーム脂質二重層等、非腫瘍ＥＶ脂質二重層である。特定の実施形態では、脂質二重層は、免疫抑制分子を過剰発現するように操作された２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、またはＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｔ等、そのいずれかの変形形態、等）由来のＥＶ脂質二重層（例えば、エキソソーム脂質二重層またはＥＶ）である。ＥＶ表面（例えば、ＥＶの脂質二重層中）における免疫抑制分子の量は、当技術分野で公知の様々な技法のいずれかを使用して決定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、ベクターの表面における斯かる分子の量を測定し、異なるベクターにおける斯かる分子の相対量を決定することができる。
本明細書に提供されるＥＶは、いずれか適した粒径を有することができる。典型的に、ＥＶは、製造業者のプロトコールに従ってＮＡＮＯＳＩＧＨＴ（商標）ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して測定される場合、約８０～１２０ｎｍ（例えば、約９０～１１５ｎｍ）等、約７５～１５０ｎｍの範囲内の平均粒径を有し、約５０～３００ｎｍ等、約３０～６００ｎｍの範囲内のサイズを有する。
他の脂質二重層部分
本明細書に提供されるＥＶは、異なる機能をもたらすために、所望の通り脂質二重層に追加的な部分をさらに含むことができる。例えば、脂質二重層は、ベクターを所望の細胞型または組織型に向ける膜表面タンパク質、例えば、所望の細胞型上のリガンドまたは受容体に特異的に結合する分子を含有するように操作することができる。所望の細胞型上のリガンドまたは受容体に結合する脂質二重層会合標的化部分（例えば、標的化タンパク質）を含有するように本明細書に提供されるＥＶを操作することにより、ＥＶは、免疫寛容性の環境、例えば、肝臓、脾臓または甲状腺へのより正確な標的化を可能にする。一部の実施形態では、ＥＶの脂質二重層は、肝臓細胞表面に特異的にまたは優先的に発現された表面タンパク質に特異的にまたは優先的に結合する部分を含むように操作することができる（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）に特異的に結合する膜結合型抗原結合ドメイン（例えば、クローン８Ｄ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのドメイン）等のタンパク質）。一部の実施形態では、標的化分子は、抗体またはその抗原結合性断片、例えばｓｃＦｖ（免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合体で構成される一本鎖可変断片）、またはＦａｂ（抗体の各々の重鎖および軽鎖からの１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインで構成される抗原結合性断片）である。一部の実施形態では、標的化分子は、ナノボディ、すなわち特定のタンパク質または細胞型を標的とする単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。一部の実施形態では、標的化分子は、所望の標的または標的細胞に特異的に結合するタンパク質、ポリペプチド、または多糖である。
一部の実施形態では、標的化分子は、ドナー組織とレシピエントとの間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする。そのような標的化は、組織拒絶または移植片対宿主病を処置または防止する目的で使用され得る。
ＥＶを産生する方法に関連してさらに詳細に説明される通り、高レベルの膜結合型標的化部分を発現するように宿主細胞（産生細胞）を操作することにより、斯かる脂質二重層を提供することができる。よって、一部の実施形態では、本発明は、脂質二重層を含むＥＶであって、脂質二重層が、免疫抑制分子および標的化分子を含む、ＥＶを提供する。
ＥＶは、ＥＶの有効性もしくは効率を改善する、または産生を改善する追加的なエレメントをさらに含むことができる。例えば、産生細胞におけるテトラスパニンＣＤ９の外因性発現は、ベクター性能を劣化させることなく、ベクター産生を改善することができる（Ｓｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ， （２０１８） ９：２７８－２８７）。よって、ＥＶは、脂質二重層にＣＤ９を含むことができる。しかし、一部の実施形態では、ＥＶは、個体における免疫寛容を誘導するＥＶの効率もしくは有効性を有意に損なう、ベクターをヒトにおける使用（例えば、ＦＤＡ規制下での）に不適なものとする、またはＥＶ産生を実質的に損なう、エレメントを実質的にまたは完全に含まない。
一部の実施形態では、ＥＶは「空」であり、このことはＥＶの内部が、本明細書に記載される免疫抑制分子および標的化部分以外の、それが作製される細胞に対して異種であるいかなる分子も含有しないことを意味する。当業者は、ＥＶが、産生細胞からのサイトゾルなどの細胞エレメントを含有することを認識するであろう。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない。一部の実施形態では、本発明のＥＶは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ、ＨＳＶ、またはレンチウイルス）を封入しない。
治療剤
本発明は、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導する方法であって、その脂質二重層に１種または複数の免疫抑制分子を含むように操作されたＥＶの有効量が作用因子と併せて投与される方法を提供する。一部の実施形態では、作用因子は、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、細胞（例えば、細胞治療剤）または移植された細胞もしくは組織である。一部の実施形態では、治療剤と併せて本発明のＥＶを個体に投与するステップは、個体において治療剤に対する免疫寛容を誘導し、初回投与後の反復投与（すなわち、１種または複数の追加的な投与を可能にする。
一部の実施形態では、作用因子は治療ポリペプチドである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、酵素、ホルモン、抗体、抗体断片、凝固因子、成長因子、受容体、またはその機能的誘導体である。治療ポリペプチドの例としては、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチュブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、コロイデレミアタンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルボミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、および副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、作用因子は、治療ポリペプチドをコードする核酸または治療核酸である。治療ポリペプチドコードする核酸の例としては、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチューブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、全脈絡膜萎縮タンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼおよび副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。治療核酸の例としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡザイム、およびＤＮＡザイムが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、核酸は、１種または複数の遺伝子編集産物をコードし、例えば、１種または複数のＣＲＩＳＰＲエレメントをコードする核酸である。
一部の実施形態では、ポリペプチド－核酸複合体は、遺伝子編集複合体、例えば遺伝子編集にとって適切なＲＮＡエレメントと会合したＣａｓ９タンパク質である。
一部の実施形態では、作用因子はウイルスベクター、例えば遺伝子治療で使用するためのウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターである。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶは、パルボウイルス科のメンバーである。導入遺伝子を送達するために適した任意のＡＡＶベクターを、本発明の免疫抑制性ＥＶと併せて使用することができる。ＡＡＶ粒子は、いずれかの血清型由来のＡＡＶカプシドタンパク質およびＡＡＶウイルスゲノムを含むことができる。ＡＡＶ血清型として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、同じ血清型由来のＡＡＶウイルスカプシドおよびＡＡＶウイルスゲノムを含む。他の実施形態では、ＡＡＶウイルスゲノムおよびＡＡＶカプシドは、異なる血清型のものである。例えば、ＡＡＶウイルスカプシドは、ＡＡＶ６ウイルスカプシドであってよく、ＡＡＶウイルスゲノムは、ＡＡＶ２ウイルスゲノムであってよい。一部の実施形態では、ＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８ベクター、特に、ｓｃＡＡＶ８またはｓｃＡＡＶ２／８）である。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルス粒子を含む。ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルスおよびネコ免疫不全ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない、導入遺伝子送達に適したいずれかのレンチウイルスを使用することができる。典型的に、レンチウイルスベクターは、非複製型である。レンチウイルスベクターは、組込み型または非組込み型レンチウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、レンチウイルスゲノムは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ遺伝子を欠く。一部の実施形態では、レンチウイルスゲノムは、異種導入遺伝子、５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、および３’ＬＴＲを含み、３’ＬＴＲのＵ３領域の全体または一部は、除去される、または異種調節エレメントによって置き換えられる。
一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数のウイルスカプシドタンパク質またはその断片を投与することと併せて個体に導入される。一部の実施形態では、ＥＶは、個体においてウイルスベクターに対する免疫寛容を誘導するために、１種または複数のウイルスカプシドタンパク質またはその断片を投与することと併せて個体に導入される。一部の実施形態では、１種または複数のウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ ＶＰ２カプシドタンパク質、および／またはＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質、またはその断片である。一部の実施形態では、１種または複数のウイルスカプシドタンパク質は、アデノウイルスヘキソンタンパク質、アデノウイルスペントンタンパク質、アデノウイルス線維タンパク質、アデノウイルスノブタンパク質、またはその断片である。一部の実施形態では、ＥＶは、１種または複数のウイルスベクターエンベロープタンパク質またはその断片を投与することと併せて個体に導入される。一部の実施形態では、ＥＶは、個体においてウイルスベクターに対する免疫寛容を誘導するために、１種または複数のウイルスベクターエンベロープタンパク質またはその断片を投与することと併せて個体に導入される。一部の実施形態では、ＥＶは、レンチウイルスｇｐ１２０タンパク質、レンチウイルスｇｐ４１タンパク質、および／またはシュードタイプレンチウイルスベクターに関連するタンパク質と併せて個体に導入される。一部の実施形態では、ＥＶは、ＨＳＶ ｇＤタンパク質、ＨＳＶ ｇＢタンパク質、および／またはシュードタイプＨＳＶベクターに関連するタンパク質と併せて個体に導入される。
ウイルス粒子、特に、ウイルスゲノムは、送達されるべき異種核酸（例えば、導入遺伝子）を含む（「ペイロード」）、または空ベクターとなることができる。送達されるべき核酸の特定の性質は、所望の最終使用に依存し、本発明のベクターは、いずれか特定の使用またはペイロードに限定されない。一部の実施形態では、ペイロード核酸は、生物学的タンパク質、例えば、第ＶＩＩＩ因子（例えば、ヒトＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ２ＶＦ４５）、Ｂ－ドメイン欠失（ＢＤＤ）ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子のＳＱ－ＦＶＩＩＩバリアント（Ｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｕｇ １５；２３２（１）：１９－２７））または他の公知バリアント）、第ＩＸ因子（例えば、ヒト第ＩＸ因子ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ００７４０；またはヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）「Ｐａｄｕａ」（Ｍｏｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ２６（２）： ６９－８１、または他の公知バリアント）、ミオチューブラリン、ＳＭＮ、ＲＰＥ６５、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、ＣＨＭ、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたはＡＬＤを発現する。他の実施形態では、ペイロード核酸は、レポーター分子、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼまたはベータ－ガラクトシダーゼをコードする。また他の実施形態では、ペイロード核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡザイムまたはＤＮＡザイム等、治療核酸をコードする。また他の実施形態では、ペイロード核酸は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ＣＰＦ１等）、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼのためのガイド核酸、ドナー核酸、またはこれらの一部の組合せ等、１種または複数の遺伝子編集遺伝子産物をコードする。
異種核酸は、組織特異的プロモーターとなり得る、適したプロモーターの制御下に置くことができる。例えば、ベクターが、肝臓に送達されるべきである場合、肝臓特異的プロモーター（例えば、肝臓特異的ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター）。所与の適用に適切となり得るような他の調節因子エレメントが含まれていてもよい。
一部の実施形態では、治療剤は細胞または組織である。例えば、細胞は、幹細胞の生着が有益である治療において使用される幹細胞であり得る。幹細胞の例としては、体の任意の組織に由来する成体幹細胞（例えば、造血幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、心筋前駆細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、脂肪幹細胞、骨幹細胞等）が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞に由来する。一部の実施形態では、細胞は多能性幹細胞または複能性幹細胞である。一部の実施形態では、幹細胞は操作された幹細胞であり、例えば幹細胞は、１種または複数の特定のポリペプチドを発現するように操作される。
一部の実施形態では、治療剤は分化細胞である。分化細胞の例としては、血液細胞（例えば、ＰＢＭＣ）、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、膵細胞（例えば、膵島細胞）、眼細胞（例えば、網膜細胞および／または角膜細胞）、内耳有毛細胞、ニューロン、アストロサイト、希突起膠細胞、軟骨細胞、および骨細胞（例えば、骨芽細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、分化細胞は操作された分化細胞であり、例えば細胞は、１種または複数の特定のポリペプチドを発現するように操作される。例えば、細胞は、治療タンパク質、例えば第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を発現するように操作された肝細胞であり得る。
他の実施形態では、細胞は、レシピエントに生着させるためにドナーの組織から得られ、例えば肝細胞、血液細胞、骨髄細胞等である。
一部の実施形態では、作用因子はＥＶと会合し、例えば作用因子はＥＶの外部表面と会合する。一部の実施形態では、作用因子はＥＶに結合する。一部の実施形態では、作用因子は、ＥＶの内部に存在しない。一部の実施形態では、ＥＶおよび作用因子は、投与前に混合される。一部の実施形態では、ＥＶおよび作用因子は、作用因子をＥＶと会合させるために投与前に混合される。一部の実施形態では、作用因子は、ＥＶと同じ産生細胞において産生され、作用因子は、細胞培養上清中でＥＶと会合する。一部の実施形態では、作用因子は、作用因子をＥＶと会合させるために、ＥＶ産生細胞の培養上清に添加される。
組成物
一部の態様では、本発明は、本明細書に記載される脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、ＥＶおよび適切な担体、例えば薬学的に許容される担体、例えば食塩水を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＥＶおよび作用因子（例えば、治療剤）を含む。一部の実施形態では、作用因子は、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、細胞（例えば、細胞治療に使用するため）または移植された細胞もしくは組織である。一部の実施形態では、組成物は、ＥＶと会合した作用因子を含み、例えば作用因子は、ＥＶの外部表面と会合する。一部の実施形態では、作用因子はＥＶに結合する。一部の実施形態では、作用因子は、ＥＶの内部に存在しない。一部の実施形態では、本発明のＥＶおよび本発明の作用因子は、別々の組成物で提供される。一部の実施形態では、組成物は医薬組成物である。ＥＶの製剤化のための適した担体、製剤緩衝液、および他の賦形剤は、当技術分野で公知であり、本明細書に提供される組成物に適用可能である。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体中で製剤化されたＥＶの治療有効量を含む。語句「薬学的または薬理学的に許容される」とは、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して一般的に非毒性である、すなわち適宜、例えばヒトなどの動物に投与した場合に有害反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。イムノコンジュゲートを含有し、必要に応じて追加的な有効成分を含有する医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者に公知であり、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０に例証されている。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤または水性液剤である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知であるように、ありとあらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、香味料、色素、そのような材料およびそれらの組合せを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０， ｐｐ．１２８９－１３２９を参照されたい）。いかなる通常の担体も有効成分と不適合でない限り、治療組成物または医薬組成物におけるその使用が企図される。
適用および使用方法
一部の態様では、本発明は、個体における疾患または障害を処置する方法であって、ＥＶの有効量を個体に投与するステップを含み、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＥＶは、別の作用因子と併せて投与されない。一部の実施形態では、ＥＶは、一般的に個体の免疫系を抑制するために投与される。一部の実施形態では、疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。一部の実施形態では、ＥＶは、組織移植または細胞生着と併せて投与される。一部の実施形態では、ＥＶは、自己免疫疾患または移植片対宿主病を処置するために使用されない。
一部の態様では、本明細書に提供されるＥＶは、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導するために有用である。一部の態様では、本発明は、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導する方法であって、作用因子を個体に投与することと併せてＥＶの有効量を個体に投与するステップを含み、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導する方法であって、ＥＶの有効量および治療剤を含む組成物を個体に投与するステップを含み、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導する方法であって、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含むＥＶの有効量を含む組成物を投与するステップ、および治療剤の有効量を個体に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、治療剤と併せて本発明のＥＶを、適した時間間隔によって隔てられたＥＶおよび治療剤の２回またはそれよりも多い別々の投与（例えば、少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間もしくは１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはさらに少なくとも１年間もしくはそれよりも長い期間によって隔てられた、治療剤の用量の２回またはそれよりも多い投与）を含む反復投与スケジュールで、個体に投与するステップを含む。
一部の実施形態では、脂質二重層に免疫抑制分子を含むＥＶは、ＥＶを投与するステップの非存在下でまたは免疫抑制分子を含むように操作されていないＥＶと併せて作用因子を個体に投与する場合より有効または効率的に、個体に投与される作用因子に対する免疫寛容を誘導することができる。一部の実施形態では、治療剤と併せて免疫抑制分子を含むＥＶを投与するステップは、治療剤の有効性を増強する。例えば、治療剤と併せてその脂質二重層に免疫抑制分子を含むＥＶを投与するステップは、治療剤に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を低減することができる。一部の実施形態では、その脂質二重層に免疫抑制分子を含むＥＶは、治療剤に対する宿主免疫応答、または核酸に基づく治療のための導入遺伝子の送達および／もしくは発現に及ぼす宿主免疫応答の影響を低減すると考えられる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるＥＶは、治療剤の反復投与、および／または所定の治療剤に対する既存の免疫を有する対象の投与を可能にする。
本発明の一態様では、方法は、例えば遺伝子治療に使用するために、ウイルスベクターと併せてＥＶを個体に投与するステップを含む。一部の実施形態では、個体は、ウイルスに以前に曝露されている（天然のウイルスに対する自然の曝露によって、またはウイルスベクターの以前の投与によって）、または個体は別段、ウイルスに対する既存の免疫を有する（例えば、ウイルスに対する既存の抗体を有する患者）。よって、方法は、適した時間間隔によって隔てられたＥＶおよびウイルスベクターの２回またはそれよりも多い別々の投与（例えば、少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間もしくは１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはさらには少なくとも１年間もしくはそれよりも長い期間によって隔てられた、ウイルスベクターの用量の２回またはそれよりも多い投与）を含む反復投与スケジュールで、個体にウイルスベクターと併せて本発明のＥＶを投与するステップを含むことができる。
本発明の一態様では、方法は、例えば細胞治療で使用するために、細胞と併せてＥＶを個体に投与するステップを含む。一部の実施形態では、細胞治療で使用するための細胞は、同種細胞である。一部の実施形態では、細胞治療で使用するための細胞は、自己細胞、例えば免疫応答を誘導し得るようにドナーに戻される前に操作されている自己細胞である。一部の実施形態では、方法は、細胞治療と併せて本発明のＥＶを、適した時間間隔によって隔てられたＥＶおよび細胞治療の２回またはそれよりも多い別々の投与（例えば、少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間もしくは１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはさらに少なくとも１年間もしくはそれよりも長い期間によって隔てられた、ウイルスベクターの用量の２回またはそれよりも多い投与）を含む反復投与スケジュールで、個体に投与するステップを含み得る。
典型的には、脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶの用量における免疫抑制分子の総量は、可溶性免疫抑制剤として投与される場合に使用されるであろう免疫抑制分子の用量未満となる。よって、例えば、ＣＴＬＡ４／Ｉｇは、１０ｍｇ／ｋｇの用量で免疫抑制剤として使用することができる。しかし、一部の実施形態では、ＥＶの単回用量は、約５ｍｇ／ｋｇ未満、約２ｍｇ／ｋｇ未満、約１ｍｇ／ｋｇ未満またはさらには約０．５ｍｇ／ｋｇ未満（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ未満）等、はるかに少ない免疫抑制剤（例えば、膜結合型ＣＴＬＡ４）を有する。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供される脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、可溶性免疫抑制剤（例えば、ＣＴＬＡ４／Ｉｇ、アバタセプト）の投与に起因する全体的免疫抑制を最小化する。一部の実施形態では、全体的免疫抑制は、循環する総抗ＩｇＧ抗体の増加、または抗原特異的抗体または投与される治療剤に由来する抗原以外の抗原によって刺激される活性化ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増加に従って、投与後２～３週間以内に測定される。
一部の実施形態では、ＥＶは、治療剤の投与と併せて個体に投与される。治療剤は、任意の最終目的のために個体に投与され得る。一部の実施形態では、治療剤は、個体における疾患または障害を処置するためにＥＶと併せて投与される。一部の実施形態では、疾患または障害は、単一遺伝子疾患である。一部の実施形態では、疾患または障害は、リソソーム蓄積症である。一部の実施形態では、疾患または障害は、糖原病である。一部の実施形態では、疾患または障害は、ヘモグロビン障害である。一部の実施形態では、疾患または障害は、筋骨格障害である。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＣＮＳ疾患または障害である。一部の実施形態では、疾患または障害は、心臓疾患または脳卒中を含む心血管障害である。一部の実施形態では、疾患は、がんである。一部の実施形態では、疾患または障害は、自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または障害は、組織移植または細胞生着（例えば、幹細胞生着）によって処置される。
疾患のより具体的な、説明的だが非限定的な例として、ミオチューブラリンミオパチー、脊髄性筋萎縮症、レーバー先天黒内障、血友病ＡおよびＢ、ニーマン・ピック病（例えば、ニーマン・ピックＡ、ニーマン・ピックＢ、ニーマン・ピックＣ）、全脈絡膜萎縮、ハンチントン病、バッテン病、レーバー遺伝性視神経症、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠乏症、糖原病、ポンペ病、ウィルソン病、シトルリン血症１型、ＰＫＵ（フェニルケトン尿症）、副腎白質ジストロフィー、鎌状赤血球症、ベータサラセミアを含むヘモグロビン障害、中枢神経系障害、ならびに筋骨格障害が挙げられる。
一部の実施形態では、治療剤は治療ポリペプチドである。治療ポリペプチドの例としては、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチュブラリン、ＳＭＮ、ＲＰＥ６５、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、ＣＨＭ、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルボミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、またはＡＬＤが挙げられるがこれらに限定されない。
方法の一部の実施形態では、治療剤は、斯かる疾患もしくは障害を有する、または疾患もしくは障害を発症するリスクがある（例えば、疾患もしくは障害に関する変異を有する、または疾患もしくは障害の家族歴を有する）対象に投与される核酸である。さらに、疾患または障害の処置に使用される場合、核酸は、その発現が対象の疾患を処置する治療ポリペプチドを発現する。非限定的な例として、核酸は、次のうち１種または複数をコードすることができる：第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチューブラリン、ＳＭＮ、ＲＰＥ６５、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、ＣＨＭ、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたはＡＬＤ。
一部の実施形態では、作用因子は、核酸（導入遺伝子）の細胞または個体への送達およびその発現にとって有用なウイルスベクターである。よって、本発明は、脂質二重層と会合した免疫抑制分子を含むＥＶを細胞または個体に投与することと併せてウイルスベクターを投与するステップによって、核酸（導入遺伝子）を細胞または個体に送達する方法を提供する。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスである。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＥＶと併せて、免疫抑制分子を含むように操作されたＥＶを投与しないウイルスベクターよりも有効にまたは効率的に、細胞または対象に核酸（導入遺伝子）を送達することができる。一部の実施形態では、より有効なまたは効率的な送達は、細胞または対象における、標的細胞当たりのより多いウイルスゲノムコピー、および／または導入遺伝子産物のより高い発現（適用できる場合は）をもたらす。例えば、一部の実施形態では、ＥＶとウイルスベクターの組合せは、同じ条件下にあるウイルスベクターのみの投与（例えば、同じ導入遺伝子、同じ対象、同じ用量、および投与経路等であり、唯一の差がＥＶである）によって生じるレベルと比較して、対象に投与した３週間後、約５０％またはそれよりも多く（約７５％もしくはそれよりも多く、約１００％もしくはそれよりも多く、約１２５％もしくはそれよりも多く、約１５０％もしくはそれよりも多く、約１７５％もしくはそれよりも多く、またはさらに約２００％もしくはそれよりも多く）増加した導入遺伝子発現レベルを提供する。一部の実施形態では、ＥＶとウイルスベクターの組合せは、対象に投与してから３週間後の導入遺伝子発現レベルを、同じ条件下におけるウイルスベクター単独（例えば、同じ導入遺伝子、同じ対象、同じ用量および投与経路等であり、唯一の差がＥＶである）の投与によって生じるレベルと比較して、約２０％またはそれよりも多く（約５０％またはそれよりも多く、約７５％もしくはそれよりも多く、約１００％もしくはそれよりも多く、約１２５％もしくはそれよりも多く、約１５０％もしくはそれよりも多く、約１７５％もしくはそれよりも多く、またはさらには約２００％もしくはそれよりも多く）増加させる導入遺伝子を提供する。
ウイルスベクターは、任意の最終目的のために核酸（導入遺伝子）を細胞または対象に送達するために、脂質二重層と会合した免疫抑制分子を含むＥＶの投与と併せて投与することができる。一部の実施形態では、この最終目的は、研究目的のため、またはタンパク質の産生もしくは他の生物学的産生プロセスのため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞において導入遺伝子を発現させることとし得る。他の実施形態では、ウイルスベクターは、個体における疾患または障害の処置に使用される。疾患または障害は、核酸または導入遺伝子の送達および（該当する場合）発現による処置に対して感受性があるいずれかの疾患または障害となることができる。一部の実施形態では、疾患または障害は、単一遺伝子疾患である。一部の実施形態では、疾患または障害は、リソソーム蓄積症である。一部の実施形態では、疾患または障害は、糖原病である。一部の実施形態では、疾患または障害は、ヘモグロビン障害である。一部の実施形態では、疾患または障害は、筋骨格障害である。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＣＮＳ疾患または障害である。一部の実施形態では、疾患または障害は、心臓疾患または脳卒中を含む心血管障害である。一部の実施形態では、疾患は、がんである。
疾患のより具体的な、説明的だが非限定的な例として、ミオチューブラリンミオパチー、脊髄性筋萎縮症、レーバー先天黒内障、血友病ＡおよびＢ、ニーマン・ピック病（例えば、ニーマン・ピックＡ、ニーマン・ピックＢ、ニーマン・ピックＣ）、全脈絡膜萎縮、ハンチントン病、バッテン病、レーバー遺伝性視神経症、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠乏症、糖原病、ポンペ病、ウィルソン病、シトルリン血症１型、ＰＫＵ（フェニルケトン尿症）、副腎白質ジストロフィー、鎌状赤血球症、ベータサラセミアを含むヘモグロビン障害、中枢神経系障害、ならびに筋骨格障害が挙げられる。よって、方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、斯かる疾患もしくは障害を有する、または疾患もしくは障害を発症するリスクがある（例えば、疾患もしくは障害に関する変異を有する、または疾患もしくは障害の家族歴を有する）個体に脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶと併せて投与される。さらに、疾患または障害の処置に使用される場合、ウイルスベクターは、その発現が対象の疾患を処置する、ペイロード核酸を含む。非限定的な例として、核酸は、次のうち１種または複数をコードすることができる：第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチューブラリン、ＳＭＮ、ＲＰＥ６５、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、ＣＨＭ、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたはＡＬＤ。
一部の実施形態では、治療剤は、疾患の処置または他のいずれかの目的のための治療核酸である。一部の実施形態では、治療核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡザイムまたはＤＮＡザイムである。一部の実施形態では、治療核酸は、ウイルスベクターにおいてコードされる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスである。
一部の実施形態では、治療剤は、遺伝子編集剤である。一部の実施形態では、治療剤は、遺伝子編集エレメントをコードする核酸またはウイルスベクターである。一部の実施形態では、遺伝子編集剤は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼのための１種もしくは複数のガイド配列、および／または１種もしくは複数のドナー配列である。一部の実施形態では、遺伝子編集エレメントをコードする核酸は、ウイルスベクターにおいてコードされる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスである。
一部の実施形態では、治療剤は、細胞治療で使用するための細胞である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞または分化細胞である。幹細胞の例としては、体の任意の組織に由来する成体幹細胞（例えば、造血幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、心筋前駆細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、脂肪幹細胞、骨幹細胞等）が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞に由来する。一部の実施形態では、細胞は多能性幹細胞または複能性幹細胞である。一部の実施形態では、幹細胞は操作された幹細胞であり、例えば幹細胞は、１種または複数の特定のポリペプチドを発現するように操作される。
一部の実施形態では、治療剤は分化細胞である。分化細胞の例としては、血液細胞（例えば、ＰＢＭＣ）、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、膵細胞（例えば、膵島細胞）、眼細胞（例えば、網膜細胞および／または角膜細胞）、ニューロン、アストロサイト、希突起膠細胞、骨細胞（例えば、骨芽細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、分化細胞は操作された分化細胞であり、例えば細胞は、１種または複数の特定のポリペプチドを発現するように操作される。例えば、細胞は、治療タンパク質、例えば第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を発現するように操作された肝細胞であり得る。
一部の実施形態では、脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、細胞に基づくまたは組織に基づく治療、例えば幹細胞治療または組織もしくは臓器移植治療と併せて投与される。一部の実施形態では、脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を改善または防止するために、細胞に基づく治療または組織に基づく治療と併せて投与される。一部の実施形態では、脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を改善または防止するために、細胞に基づく治療または組織に基づく治療と併せて使用されない。
一部の実施形態では、脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、自己免疫疾患を有する個体に投与される。一部の実施形態では、脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、別の治療剤と併せて自己免疫疾患を有する個体に投与される。一部の実施形態では、脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、自己免疫疾患を処置するために、別の治療剤の投与なしで自己免疫疾患を有する個体に投与される。自己免疫疾患の例としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、１型真性糖尿病、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、乾癬、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、および血管炎が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、自己免疫疾患を有する個体に使用するためではない。
一部の実施形態では、脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、免疫応答の抑制が有益である個体、例えば、しかしこれらに限定されないが、全身性炎症反応症候群、例えばサイトカインストーム症候群に罹患している個体に投与される。全身性炎症反応は、感染（例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染）またはある特定の薬物、例えば抗体、遺伝子治療、細胞に基づく治療（例えば、ＣＡＲ－Ｔ治療）を含む生物製剤によって誘発され得る。一部の実施形態では、脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、敗血症に罹患している個体に投与される。
前述の方法のいずれかにおいて、個体は、ヒト、非ヒト霊長類、または齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジを含む他の哺乳動物、カエル、または鳥類等、任意の個体であってよい。
前述の処置方法のいずれかにおいて、治療有効量のＥＶおよび／または作用因子が、いずれか適した投与経路によって個体に投与される。有効な用量および投与経路は、適応症に依存し、開業医によって決定することができる。一部の実施形態では、ＥＶおよび／または作用因子は、全身性に；例えば、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、皮下に、経口にまたは吸入によって送達される。他の実施形態では、ＥＶおよび／または作用因子は、組織（例えば、臓器、腫瘍等）に直接的に送達される、またはＣＮＳ（例えば、くも膜下腔内に、脊髄へと、脳室、視床下部、下垂体、大脳、小脳等、脳の特異的な部分に、等）に投与される。
本発明の一部の実施形態では、ＥＶは、作用因子の投与前、投与と同時、または投与後に個体に投与される。一部の実施形態では、ＥＶは、作用因子と同時に個体に投与される。一部の実施形態では、作用因子と併せたＥＶの投与は反復される。一部の実施形態では、作用因子と併せたＥＶの投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回よりも多く反復される。一部の実施形態では、ＥＶは、作用因子と併せて１回投与され、その後ＥＶの投与なしで作用因子が反復投与される。
脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶは、ＥＶと、適切な担体、例えば薬学的に許容される担体、例えば食塩水とを含む組成物の一部として使用される。一部の実施形態では、ＥＶおよび作用因子（例えば、治療剤）は、同じ組成物の一部として共に使用される。一部の実施形態では、作用因子は、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、細胞、または移植された細胞もしくは組織である。一部の実施形態では、組成物は、ＥＶと会合した作用因子を含み、例えば作用因子はＥＶの外部表面と会合する。一部の実施形態では、作用因子はＥＶに結合する。一部の実施形態では、作用因子は、ＥＶの内部にある。一部の実施形態では、作用因子は、ＥＶの内部にない。一部の実施形態では、ＥＶおよび作用因子（例えば、治療剤）は、別々の組成物として共に使用される。ＥＶの製剤化のための適した担体、製剤緩衝液、および他の賦形剤は、当技術分野で公知であり、本明細書に提供される組成物に適用可能である。
例示的な処置は、血友病Ｂを処置する方法であって、ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質（例えば、ヒト第ＩＸ因子ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ００７４０；ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）「Ｐａｄｕａ」（Ｍｏｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， （２０１５） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ２６（２）：６９－８１、または他の公知のバリアント）をコードする異種導入遺伝子を含むウイルスベクターと併せて本明細書に提供されるＥＶを、処置を必要とする個体に投与するステップを含み、ＥＶがＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１を含む操作された脂質二重層である方法である。より特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８、またはｓｃＡＡＶ８またはｓｃＡＡＶ２／８）である。一部の実施形態では、ＥＶは、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１を含むように操作されている（例えば、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１を過剰発現するように操作された生産細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）由来のＥＶ）。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡを含む、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号１のアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、または９９％のいずれかより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡを含む、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号５のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ－４を含むまたはこれに由来する。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号７のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ－４を含むまたはこれに由来する。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号９のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＤＬ－１は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＰＤＬ－１を含むまたはこれに由来する。一部の実施形態では、ＰＤＬ－１は、配列番号２のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＤＬ－１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＰＤＬ－１を含むまたはこれに由来する。一部の実施形態では、ＰＤＬ－１は、配列番号１３のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＥＶおよび／またはウイルスベクターは、肝臓に送達され、異種導入遺伝子は、肝臓特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、ＥＶおよびは、静脈内に、必要に応じて、肝動脈へと投与される。一部の実施形態では、ベクターは、対象の体重１キログラム当たり２×１０１１～２×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）（例えば、対象の体重１キログラム当たり２×１０１１～８×１０１１または３×１０１１～６×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ））の用量で投与される。一部の実施形態では、方法は、ＥＶおよびウイルスベクターまたはウイルスベクター単独の２またはそれよりも多い用量（例えば、３もしくはそれよりも多い用量、４もしくはそれよりも多い用量、または５もしくはそれよりも多い用量）を、用量の間が少なくとも１日間（少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間もしくは１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはさらには少なくとも１年間もしくはそれよりも長い期間）の間隔で投与するステップを含む。
別の特定の実施形態では、血友病Ａを処置する方法であって、ＥＶと、ヒト第ＶＩＩＩ因子（例えば、ヒトＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ２ＶＦ４５）、Ｂ－ドメイン枯渇（ＢＤＤ）ヒトＦ８遺伝子のＳＱ－ＦＶＩＩＩバリアント（Ｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｕｇ １５；２３２（１）：１９－２７）、または他の公知のバリアント）をコードする異種導入遺伝子を含むウイルスベクターとを、処置を必要とする対象に投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＥＶは、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１を含む操作された脂質二重層を含む。より特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８またはｓｃＡＡＶ８、またはｓｃＡＡＶ８またはｓｃＡＡＶ２／８）である。一部の実施形態では、ＥＶは、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１を過剰発現するように操作された宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から産生される。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡを含む、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号１のアミノ酸配列と約８０％、８５％、９０％、または９９％のいずれかより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡを含む、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号５のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ－４を含むまたはこれに由来する。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号７のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ－４を含むまたはこれに由来する。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、配列番号９のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＤＬ－１は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＰＤＬ－１を含むまたはこれに由来する。一部の実施形態では、ＰＤＬ－１は、配列番号２のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＤＬ－１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＰＤＬ－１を含むまたはこれに由来する。一部の実施形態では、ＰＤＬ－１は、配列番号１３のアミノ酸配列に対し約８０％、８５％、９０％または９９％のいずれかよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＥＶおよび／またはウイルスベクターは、肝臓に送達され、異種導入遺伝子は、肝臓特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、ＥＶおよび／またはベクターは、静脈内に、必要に応じて、肝動脈へと投与される。一部の実施形態では、ベクターは、対象の体重１キログラム当たり２×１０１１～２×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）（例えば、対象の体重１キログラム当たり２×１０１１～８×１０１１または３×１０１１～６×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ））の用量で投与される。一部の実施形態では、方法は、ＥＶおよびウイルスベクターまたはウイルスベクター単独の２またはそれよりも多い用量（例えば、３もしくはそれよりも多い用量、４もしくはそれよりも多い用量、または５もしくはそれよりも多い用量）を、用量の間が少なくとも１日間（少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間もしくは１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはさらには少なくとも１年間もしくはそれよりも長い期間）の間隔で投与するステップを含む。
製造
本明細書に提供されるＥＶは、任意の適した方法によって産生することができる。非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第９８２９４８３Ｂ２号および米国特許出願公開第２０１３／０２０２５５９号に提供される。
特に有利な一方法は、ＥＶの脂質二重層に含まれることが所望される免疫抑制分子を過剰発現するように操作された産生細胞系からＥＶを産生するステップが関与する。よって、（ａ）ＥＶを生成する条件下で、産生細胞を培養するステップであって、産生細胞が、１種または複数の膜結合型免疫抑制分子をコードする核酸を含む、ステップと、（ｂ）ＥＶを収集するステップとによって、本明細書に記載されている通り、免疫抑制分子を含む脂質二重層を有するＥＶを調製する方法が本明細書に提供される。
産生細胞操作
ＥＶの従来の産生に適したいずれかの産生細胞を使用して、本発明のＥＶを産生することができる。一部の実施形態では、産生細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、産生細胞はヒト細胞である。適した産生細胞として、２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｔなど）、Ｈｅｌａ細胞およびＰｅｒ．Ｃ６が挙げられるがこれらに限定されない。産生細胞は、いずれか適した方法によって、所望の免疫抑制分子を発現するように操作することができる。本発明の一部の実施形態では、免疫抑制分子は、安定にまたは一過性に、産生細胞への免疫抑制分子をコードする外因性核酸（例えば、プラスミドまたは他のベクター）のトランスフェクションによって発現される。斯かる外因性核酸の発現によって、産生細胞は、免疫抑制分子をコードする外因性核酸をトランスフェクトされていない同じ産生細胞と比較して、免疫抑制分子を過剰発現し、ひいては、産生細胞から出芽するＥＶは、免疫抑制分子を過剰発現するように操作されていない同じ産生細胞から出芽するＥＶと比較して、増加した量の免疫抑制分子を有する。一部の実施形態では、免疫抑制分子を過剰発現するように操作されていない同じ宿主細胞よりも約２倍もしくはそれよりも多く、約３倍もしくはそれよりも多く、約５倍もしくはそれよりも多く、約１０倍もしくはそれよりも多く、約２０倍もしくはそれよりも多く、約５０倍もしくはそれよりも多く、またはさらには約１００倍もしくはそれよりも多く免疫抑制分子を過剰発現するように操作された宿主細胞。
免疫抑制分子の発現は、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）等のプロモーターによって駆動され得る。一部の実施形態では、エフェクター分子をコードする遺伝子の後に、エフェクター分子コード領域下流のポリアデニル化シグナル（例えば、ヘモグロビンポリアデニル化シグナル）が続く。一部の実施形態では、イントロンが、プロモーターの下流に挿入される。例えば、プロモーターの下流のヘモグロビン由来人工イントロンを用いて、エフェクター分子産生を増加させることができる。一過性トランスフェクションのための方法として、リン酸カルシウムトランスフェクションが挙げられるがこれに限定されない。単一のまたは組み合わせた免疫モジュレーターを発現する安定した細胞系を産生するための方法として、レトロウイルス遺伝子移入またはコンカテマートランスフェクションと、それに続く選択が挙げられるがこれらに限定されない（Ｔｈｒｏｍ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｂｌｏｏｄ， １１３（２１）： ５１０４－５１１０）。産生細胞は、ＥＶにおいて所望され得る通り、個々の免疫抑制分子を発現するように、または免疫抑制分子の異なる組合せを発現するように、この仕方で操作される。産生細胞は、生産性を増加させるように、当技術分野で公知の他の仕方で操作することもできる。例えば、産生細胞は、テトラスパニンＣＤ９を過剰発現するように操作して、ベクター産生を改善することができる（Ｓｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２０１８） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ， ９：２７８－２８７）。
脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶの産生
本明細書に記載されるＥＶは、任意の適した技術によって操作された産生細胞から産生され得る。例えば、産生細胞からの培地を収集し、ＥＶを精製する。一部の実施形態では、５０～２００ｎｍの直径のＥＶを、クロマトグラフィー精製方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーによって、使用するために産生細胞の培地から優先的に単離する。一部の実施形態では、約２５～約５００ｎｍの直径のＥＶが単離される。一部の実施形態では、約１５～約５０ｎｍ、約５０～約７５ｎｍ、約７５～約１００ｎｍ、約１００～約１５０ｎｍ、約１５０～約２００ｎｍ、約２００～約２５０ｎｍ、約２５０～約３００ｎｍ、約３００～約３５０ｎｍ、約３５０～約４００ｎｍ、約４００～約４５０ｎｍ、または約４５０～約５００ｎｍの間の直径のＥＶ。一部の実施形態では、培地中のＥＶは、細胞および細胞デブリおよびコロイド状粒子を除去するために、デプス濾過を使用しておよび／または０．４４もしくは０．２μＭ滅菌フィルターを組み合わせて清澄化または濾過することができる。あるいは、産生細胞からの培地を、残存不純物を除去するために接線流濾過を使用して清澄化することができる。
本明細書に記載されているＥＶは、いずれか適した技法によって、操作された産生細胞から産生することができる。同様に、免疫抑制分子を、単離／精製を助けるためのアフィニティリガンドとして使用してもよい。
ＥＶは、経験的に決定される期間の後に収集され、次いで、当技術分野で公知の様々な技法のいずれかを使用して精製される。精製技法として、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよび接線流濾過を挙げることができるがこれらに限定されない。連続的超遠心分離を含む超遠心分離を使用して、ＥＶを精製することができる。
産生細胞１リットル当たりの産生されるＥＶの量は、様々な方法を使用して増加させることができる。そのような方法として、発酵中の産生細胞への、アポトーシスを抑制するまたは細胞分裂を中断する分子の添加を挙げることができるがこれらに限定されない。産生細胞膜の脂質組成を変更する分子または化合物を使用して、１リットル当たりのＥＶ産生を増加させることもできる。その上、ＥＶ産生を増加させる化合物または分子は、膜融合性分子（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｇｅｎｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む。
よって、一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているＥＶを産生する方法であって、（ａ）ＥＶを生成する条件下で、産生細胞を培養するステップであって、産生細胞が、１種または複数の膜結合型免疫抑制分子をコードする核酸を含む、ステップと、（ｂ）ＥＶを収集するステップとを含む方法を提供する。ＥＶは、本発明のＥＶに関する、本明細書に記載されている特色およびエレメントのいずれかを有することができる。さらに、産生細胞は、以前のセクションに記載されている特色およびエレメントのいずれかを有することができ、ＥＶを産生する方法は、例えば、１種または複数の膜結合型免疫抑制分子をコードする核酸で産生細胞を形質転換することにより、産生細胞を提供するステップをさらに含むことができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、免疫抑制分子を過剰発現するように操作されていない同じ宿主細胞よりも約２倍もしくはそれよりも多く、約３倍もしくはそれよりも多く、約５倍もしくはそれよりも多く、約１０倍もしくはそれよりも多く、約２０倍もしくはそれよりも多く、約５０倍もしくはそれよりも多く、またはさらには約１００倍もしくはそれよりも多く、免疫抑制分子を過剰発現するように操作される（例えば、免疫抑制分子をコードする１種または複数の外因性核酸を含む）。一部の実施形態では、宿主細胞は、２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ等）またはＰｅｒ．Ｃ６等、非腫瘍細胞である。
ＥＶの収集は、培養されたウイルス産生細胞の培養液からＥＶを単離するステップを含むことができる。一部の実施形態では、ＥＶは、超遠心分離または他の適した方法による、細胞培養物からのＥＶの分離によって収集される。方法は、好ましくは、洗浄剤の使用を避ける。さらに、産生細胞の溶解は、培養物中に宿主細胞タンパク質および核酸を放出するため、方法は、好ましくは、ＥＶの収集に先立つ産生細胞の溶解を最小化するまたは避ける。
キット
本発明はまた、本発明の方法に従って、本明細書に記載される作用因子（例えば、治療剤）の細胞または対象への投与と併せて脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶを投与するためのキットも提供する。キットは、本発明の任意のＥＶを含み得る。
一部の実施形態では、キットは、ＥＶのための指示をさらに含む。本明細書に記載されているキットは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載されているいずれかの方法を行うための指示を備える添付文書を含む、商業的および利用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。適した包装材料が含まれていてもよく、これは、例えば、バイアル（密閉されたバイアル等）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、可撓性包装（例えば、密閉されたＭｙｌａｒまたはビニール袋）などを含む、当技術分野で公知のいずれかの包装材料であってよい。このような製造品は、さらに滅菌および／または密閉することができる。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されている方法および／またはＥＶのいずれかを使用して、本明細書に記載されている疾患または障害（ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を処置するための指示を含む。キットは、個体への注射に適した薬学的に許容される担体、ならびに緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および哺乳動物に注射を行うための指示を備える添付文書のうち１種または複数を含むことができる。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されている緩衝剤および／または薬学的に許容される賦形剤のうち１種または複数をさらに含有する（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ． １９９１に記載されている通り）。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されている１種または複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、溶液および／または追加的な成分を含む。本明細書に記載されているキットは、単回単位投薬量または複数回剤形（ｍｕｌｔｉｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）において包装することができる。キットの内容物は一般に、無菌として製剤化され、凍結乾燥することができる、または実質的に等張の溶液として提供することができる。
例示的な実施形態
実施形態１． 個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導する方法であって、前記作用因子を前記個体に投与することと併せてＥＶの有効量を前記個体に投与するステップを含み、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む、方法。
実施形態２． 前記１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む、実施形態２に記載の方法。
実施形態３． 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む、実施形態１または２に記載の方法。
実施形態４． 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、実施形態１または２に記載の方法。
実施形態５． 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、実施形態４に記載の方法。
実施形態６． 前記脂質二重層が、２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子を含む、または２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なるチェックポイントタンパク質を含む、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７． 前記脂質二重層が、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを含む、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８． 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態９． 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０． 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１１． 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２． 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記方法の特異性を付与する、実施形態１０または１１に記載の方法。
実施形態１３． 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、実施形態１０または１１に記載の方法。
実施形態１４． 前記標的化分子が、抗体である、実施形態１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１５． 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、実施形態１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１７． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１８． 前記ＥＶが、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、抗ＣＤ４０抗体、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１９． 前記産生細胞が、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２０． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２１． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２２． 前記ＥＶが、前記作用因子の投与前、投与と同時、または投与後に前記個体に投与される、実施形態１～２１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２３． 前記ＥＶが、前記作用因子の投与と同時に前記個体に投与される、実施形態１～２２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２４． 前記ＥＶおよび前記作用因子が、異なる製剤に存在する、実施形態１～２３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２５． 前記ＥＶおよび前記作用因子が、同じ製剤に存在する、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２６． 前記作用因子が前記ＥＶと会合する、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７． 前記作用因子が、前記ＥＶの外部表面と会合する、実施形態２５または２６に記載の方法。
実施形態２８． 免疫寛容の刺激が、前記作用因子の前記個体への反復投与を容易にする、実施形態２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２９． 前記反復投与が、前記作用因子の約２回よりも多くの投与、３回よりも多くの投与、４回よりも多くの投与、５回よりも多くの投与、６回よりも多くの投与、７回よりも多くの投与、８回よりも多くの投与、９回よりも多くの投与、または１０回よりも多くの投与を含む、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３０． 前記作用因子が治療剤である、実施形態１～２９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３１． 前記作用因子が、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、細胞、または移植された細胞もしくは組織である、実施形態１～３０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３２． 前記作用因子が、治療ポリペプチドである、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３３． 前記治療ポリペプチドが、酵素、ホルモン、抗体、抗体断片、凝固因子、成長因子、受容体、またはその機能的誘導体である、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４． 前記治療ポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチュブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、コロイデレミアタンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルボミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）、ジストロフィン、切断型ジストロフィン、ニーマンピックＣタンパク質（ＮＰＣ－１）、抗ＶＥＧＦ剤、またはその機能的バリアントである、実施形態３２または３３に記載の方法。
実施形態３５． 前記作用因子が、治療ポリペプチドをコードする核酸または治療核酸である、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３６． 前記核酸が、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチューブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、全脈絡膜萎縮タンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたは副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）をコードする、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７． 前記治療核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡザイム、またはＤＮＡザイムである、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３８． 前記核酸が、１種または複数の遺伝子編集産物をコードする、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９． 前記ポリペプチド－核酸複合体が、遺伝子編集複合体である、実施形態３１に記載の方法。
実施形態４０． 前記作用因子が、ウイルスベクターまたはそのカプシドタンパク質である、実施形態３１に記載の方法。
実施形態４１． 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターである、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２． 前記作用因子が、細胞治療に使用される細胞である、実施形態３１に記載の方法。
実施形態４３． 前記細胞が、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、または分化細胞である、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４． 前記細胞が、多能性細胞または複能性細胞である、実施形態４２または４３に記載の方法。
実施形態４５． 前記細胞が、胚性幹細胞または成体幹細胞である、実施形態４３または４４に記載の方法。
実施形態４６． 前記細胞が、造血幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、心筋幹細胞、神経幹細胞、骨幹細胞、間葉幹細胞、または脂肪幹細胞である、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４７． 前記細胞が、血液細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、膵細胞、膵島細胞、眼細胞、神経細胞、アストロサイト、希突起膠細胞、内耳有毛細胞、軟骨細胞、または骨芽細胞である、実施形態４２または４３に記載の方法。
実施形態４８． 前記細胞が、前記個体に対して同種である、実施形態４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４９． 前記個体がヒトである、実施形態１～４８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５０． 個体における疾患または障害を処置する方法であって、ＥＶの有効量を前記個体に投与するステップを含み、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む、方法。
実施形態５１． 前記疾患または障害が自己免疫疾患または障害である、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２． 前記ＥＶが、組織移植または細胞生着と併せて投与される、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５３． 個体における疾患または障害を処置する方法であって、作用因子を前記個体に投与することと併せてＥＶの有効量を前記個体に投与するステップを含み、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含み、前記作用因子が前記疾患または障害を処置する、方法。
実施形態５４． 前記１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む、実施形態５０～５３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５５． 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む、実施形態５０～５４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５６． 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、実施形態５０～５４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５７． 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８． 前記脂質二重層が、２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子を含む、または２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なるチェックポイントタンパク質を含む、実施形態５０～５７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５９． 前記脂質二重層が、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを含む、実施形態５０～５８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６０． 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、実施形態５０～５９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６１． 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２． 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、実施形態５０～６１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６３． 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４． 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記方法の特異性を付与する、実施形態６２または６３に記載の方法。
実施形態６５． 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、実施形態６２または６３に記載の方法。
実施形態６６． 前記標的化分子が、抗体である、実施形態６２～６５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６７． 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、実施形態６２～６６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６８． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態５０～６７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６９． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態５０～６８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７０． 前記ＥＶが、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、抗ＣＤ４０抗体、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態５０～６９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７１． 前記産生細胞が、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、実施形態５０～７０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７２． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される、実施形態５０～７１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７３． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない、実施形態５０～７２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７４． 前記ＥＶが、前記作用因子の投与前、投与と同時、または投与後に前記個体に投与される、実施形態９２または９３に記載の方法。
実施形態７５． 前記ＥＶが、前記作用因子の投与と同時に前記個体に投与される、実施形態５２～７４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７６． 前記ＥＶおよび前記作用因子が、異なる製剤に存在する、実施形態５２～７５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７７． 前記ＥＶおよび前記作用因子が、同じ製剤に存在する、実施形態５２～７５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７８． 前記作用因子が前記ＥＶと会合する、実施形態７７に記載の方法。
実施形態７９． 前記作用因子が、前記ＥＶの外部表面と会合する、実施形態７７または７８に記載の方法。
実施形態８０． 免疫寛容の刺激が、前記作用因子の前記個体への反復投与を容易にする、実施形態５２～７９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８１． 前記反復投与が、前記作用因子の約２回よりも多くの投与、３回よりも多くの投与、４回よりも多くの投与、５回よりも多くの投与、６回よりも多くの投与、７回よりも多くの投与、８回よりも多くの投与、９回よりも多くの投与、または１０回よりも多くの投与を含む、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２． 前記作用因子が治療剤である、実施形態５２～８１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８３． 前記作用因子が、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、または移植された細胞もしくは組織である、実施形態５２～８２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８４． 前記作用因子が、治療ポリペプチドである、実施形態８３に記載の方法。
実施形態８５． 前記治療ポリペプチドが、酵素、ホルモン、抗体、抗体断片、凝固因子、成長因子、受容体、またはその機能的誘導体である、実施形態８４に記載の方法。
実施形態８６． 前記治療ポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチュブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、コロイデレミアタンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルボミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、または副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）である、実施形態８４または８５に記載の方法。
実施形態８７． 前記作用因子が、治療ポリペプチドをコードする核酸または治療核酸である、実施形態８３に記載の方法。
実施形態８８． 前記核酸が、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチューブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、全脈絡膜萎縮タンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたは副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）をコードする、実施形態８７に記載の方法。
実施形態８９． 前記治療核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡザイム、またはＤＮＡザイムである、実施形態８８に記載の方法。
実施形態９０． 前記核酸が、１種または複数の遺伝子編集産物をコードする、実施形態８３に記載の方法。
実施形態９１． 前記ポリペプチド－核酸複合体が、遺伝子編集複合体である、実施形態９０に記載の方法。
実施形態９２． 前記作用因子が、ウイルスベクターまたはそのカプシドタンパク質である、実施形態８３に記載の方法。
実施形態９３． 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターである、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９４． 前記作用因子が、細胞治療に使用される細胞である、実施形態８３に記載の方法。
実施形態９５． 前記細胞が、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、または分化細胞である、実施形態９４に記載の方法。
実施形態９６． 前記細胞が、多能性細胞または複能性細胞である、実施形態９４または９５に記載の方法。
実施形態９７． 前記細胞が、胚性幹細胞または成体幹細胞である、実施形態９５または９６に記載の方法。
実施形態９８． 前記細胞が、造血幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、心筋幹細胞、神経幹細胞、骨幹細胞、間葉幹細胞、または脂肪幹細胞である、実施形態９７に記載の方法。
実施形態９９． 前記細胞が、血液細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、膵細胞、膵島細胞、眼細胞、神経細胞、アストロサイト、希突起膠細胞、内耳有毛細胞、軟骨細胞、または骨芽細胞である、実施形態９４または９５に記載の方法。
実施形態１００． 前記細胞が、前記個体に対して同種である、実施形態９４～９９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１０１． 前記個体がヒトである、実施形態５０～１００のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１０２． 個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導するための細胞外小胞（ＥＶ）と、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物であって、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層と治療剤とを含む、組成物。
実施形態１０３． 前記作用因子が、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、細胞、または移植された細胞もしくは組織である、実施形態１０２に記載の組成物。
実施形態１０４． 前記作用因子が前記ＥＶと会合する、実施形態１０２または１０３に記載の組成物。
実施形態１０５． 前記作用因子が前記ＥＶの外表面と会合する、実施形態１０２～１０４のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１０６． 前記１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む、実施形態１０２～１０５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１０７． 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む、実施形態１０２～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１０８． 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、実施形態１０２～１０７のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１０９． 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、実施形態１０８に記載の組成物。
実施形態１１０． 前記脂質二重層が、２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子を含む、または２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なるチェックポイントタンパク質を含む、実施形態１０２～１０９のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１１１． 前記脂質二重層が、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを含む、実施形態１０２～１１０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１１２． 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、実施形態１０２～１１１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１１３． 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、実施形態１１２に記載の組成物。
実施形態１１４． 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、実施形態１０２～１１３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１１５． 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、実施形態１１４に記載の組成物。
実施形態１１６． 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記ＥＶの特異性を付与する、実施形態１１４または１１５に記載の組成物。
実施形態１１７． 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、実施形態１１４～１１６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１１８． 前記標的化分子が、抗体である、実施形態１１４～１１７のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１１９． 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、実施形態１１４～１１８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２０． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１０２～１１９のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２１． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１０２～１２０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２２． 前記ＥＶが、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、抗ＣＤ４０抗体、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１０２～１２１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２３． 前記産生細胞が、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、実施形態１０２～１２２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２４． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される、実施形態１０２～１２３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２５． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない、実施形態１０２～１２４のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２６． 実施形態１０２～１２５のいずれかに記載の組成物を産生する方法であって、ａ）ＥＶ産生細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＶを生成する条件下で培養するステップであって、前記ＥＶ産生細胞が、１種または複数の１種または複数の膜結合免疫抑制分子をコードする核酸を含むステップ、ｂ）前記ＥＶを収集するステップ、およびｃ）前記ＥＶを前記作用因子と共に製剤化するステップを含む方法。
実施形態１２７． 前記ＥＶ産生細胞が、前記膜結合免疫抑制分子をコードする外因性の核酸を含む、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１２８． 前記膜結合免疫抑制分子が、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む、実施形態１２６または１２７に記載の方法。
実施形態１２９． 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、実施形態１２６または１２７に記載の方法。
実施形態１３０． 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、実施形態１２９に記載の方法。
実施形態１３１． 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、実施形態１２６～１３０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３２． 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、実施形態１３１に記載の方法。
実施形態１３３． 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、実施形態１２６～１３２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３４． 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、実施形態１３３に記載の方法。
実施形態１３５． 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記ＥＶの特異性を付与する、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１３６． 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１３７． 前記標的化分子が、抗体である、実施形態１３３～１３６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３８． 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、実施形態１３３～１３７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３９． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１２６～１３８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１４０． 前記ＥＶが、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１２６～１３９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１４１． 前記産生細胞が、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、実施形態１４０に記載の方法。
実施形態１４２． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される、実施形態１２６～１４１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１４３． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない、実施形態１２６～１４２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１４４． 免疫抑制ＥＶを生産するための生産細胞であって、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含み、前記１種または複数の免疫抑制分子が膜に結合している、生産細胞。
実施形態１４５． 前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作されている、実施形態１４４に記載の生産細胞。
実施形態１４６． ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を発現するように操作されている、実施形態１４４または１４５に記載の生産細胞。
実施形態１４７． 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、実施形態１４４または１４５に記載の生産細胞。
実施形態１４８． 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、実施形態１４７に記載の生産細胞。
実施形態１４９． 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、実施形態１４４～１４８のいずれか一項に記載の生産細胞。
実施形態１５０． 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、実施形態１４９に記載の生産細胞。
実施形態１５１． 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、実施形態１４４～１５０のいずれか一項に記載の生産細胞。
実施形態１５２． 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、実施形態１５１に記載の生産細胞。
実施形態１５３． 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記ＥＶの特異性を付与する、実施形態１５１または１５２に記載の生産細胞。
実施形態１５４． 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、実施形態１５２または１５３に記載の生産細胞。
実施形態１５５． 前記標的化分子が、抗体である、実施形態１５１～１５４のいずれか一項に記載の生産細胞。
実施形態１５６． 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、実施形態１５１～１５５のいずれか一項に記載の生産細胞。
実施形態１５７． 前記１種もしくは複数の免疫抑制分子および／または前記１種もしくは複数の標的化分子をコードする核酸を含む、実施形態１５１～１５６のいずれか一項に記載の産生細胞。
実施形態１５８． 前記１種もしくは複数の免疫抑制分子および／または前記１種もしくは複数の標的化分子をコードする前記核酸が、前記細胞のゲノムに安定に組み込まれる、実施形態１５７に記載の産生細胞。
実施形態１５９． 哺乳動物細胞である、実施形態１４４～１５８のいずれか一項に記載の産生細胞。
実施形態１６０． ヒト細胞である、実施形態１４４～１５９のいずれか一項に記載の産生細胞。
実施形態１６１． ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、実施形態１４４～１６０のいずれか一項に記載の産生細胞。
実施形態１６２． 前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない、実施形態１４４～１６１のいずれか一項に記載の産生細胞。
実施形態１６３． 個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導するための細胞外小胞（ＥＶ）であって、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含むＥＶ。
実施形態１６４． 前記１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む、実施形態１６３に記載のＥＶ。
実施形態１６５． 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む、実施形態１６３または１６４に記載のＥＶ。
実施形態１６６． 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、実施形態１６３または１６４に記載のＥＶ。
実施形態１６７． 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、実施形態１６６に記載のＥＶ。
実施形態１６８． 前記脂質二重層が、２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子を含む、または２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なるチェックポイントタンパク質を含む、実施形態１６２～１６７のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１６９． 前記脂質二重層が、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを含む、実施形態１６３～１６５のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１７０． 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、実施形態１６３～１６９のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１７１． 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、実施形態１７０に記載のＥＶ。
実施形態１７２． 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、実施形態１６３～１７１のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１７３． 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、実施形態１７２に記載のＥＶ。
実施形態１７４． 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記方法の特異性を付与する、実施形態１７２または１７３に記載のＥＶ。
実施形態１７５． 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、実施形態１７２または１７３に記載のＥＶ。
実施形態１７６． 前記標的化分子が、抗体である、実施形態１７２～１７５のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１７７． 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、実施形態１７２～１７６のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１７８． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１６３～１７７のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１７９． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１６３～１７８のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１８０． 前記ＥＶが、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、抗ＣＤ４０抗体、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される、実施形態１６３～１７９のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１８１． 前記産生細胞が、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、実施形態１６３～１８０のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１８２． 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される、実施形態１６３～１８１のいずれか一項に記載のＥＶ。
実施形態１８３． １種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種の追加的な分子を含有しない、実施形態１６３～１８２のいずれか１つに記載のＥＶ。
実施形態１８４． 実施形態１６３～１８３のいずれか１つに記載のＥＶと、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
（実施例１）
ＥＶの産生
脂質二重層会合ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＥＶを、産生細胞を使用して産生する。ＨＥＫ２９３Ｔ産生細胞に、ｐＣＭＶ．ｍＣＴＬＡ－４およびｐＣＭＶ．ｍＰＤＬ－１発現ベクターを共トランスフェクトさせた。ｐＣＭＶ．ｍＣＴＬＡ－４は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるマウスＣＴＬＡ－４ ｃＤＮＡ配列（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号ＭＧ５０５０３－ＵＴ）を含有する。ｐＣＭＶ．ｍＰＤＬ－１は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるマウスＰＤＬ－１ ｃＤＮＡ配列（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号ＭＧ５００１０－Ｍ）を含有する。
ＥＶは、細胞膜（脂質二重層）の一部と共に培養培地中に放出され、培養培地から収集される。産生細胞培養物を遠心分離し、産生細胞を上清から分離する。ＥＶを、２－ステップ超遠心分離を使用して上清から単離および精製し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、約１００ｎｍの平均粒径を有するＥＶ集団を得る。
ＥＶにおけるマウスＣＴＬＡ－４およびＰＤＬ－１レベルを、蛍光標識抗体：抗マウスＣＴＬＡ－４（抗ＣＴＬＡ－４ ＰＥＣｙ７、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ１３４０９０）および抗マウスＰＤＬ－１（抗ＰＤＬ－１－ ＰＥ－Ａ、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ２１３４８０）を使用して、ビーズに基づくＦＡＣＳ解析を使用して定量する。
（実施例２）
マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子移入
以下の実施例は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子移入のための実施例１において産生されたベクターの使用を説明する。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１４匹の雄および１４匹の雌）に、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１（Ｅｘｏ－ｍＩＳＭ）を発現するように操作された１×１０１０ベクターゲノムおよび１～２００μｇ／ｋｇのＥＶを皮下注射した。投与群は、１）ＰＢＳのみ（ビヒクル対照）、２）ＡＡＶ８－ｈＦＩＸ、３）ＡＡＶ８－ｈＦＩＸ＋Ｅｘｏ－ｍＩＳＭ、および４）Ｅｘｏ－ｍＩＳＭを含んだ。
投与後３週目に、マウスを出血させ、（ａ）ヒトＦＩＸレベル（ＶｉｓｕＬｉｚｅ（商標）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）抗原キット、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、（ｂ）抗ＡＡＶ８ ＩｇＧを使用したＥＬＩＳＡによるＡＡＶ８結合抗体（ＢＡｂ）、および（ｃ）中和抗体アッセイ（Ｍｅｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２６：４５－５３）を使用したＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）に関して解析する。ｉｎ－ｖｉｔｒｏ中和アッセイを使用して、検査ＡＡＶベクターが標的細胞に感染するのを防止する抗体の力価を測定する。簡潔に説明すると、アッセイは、最適化された感染多重度（ＭＯＩ）の、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を含有する検査ベクターを、検査抗体の系列希釈物と共にインキュベートし、次いで、ベクターを許容標的細胞に感染させるステップを伴う。２４時間後に感染細胞由来の蛍光の量を測定し、中和抗体の力価を示す。試料の中和力価は、ルシフェラーゼ発現の５０％またはそれを超える阻害が測定される最初の希釈度として決定される。
投与後３週目に、各群から２匹の雄および２匹の雌マウスを屠殺し、ｑＰＣＲにより細胞当たりのベクターゲノムコピー数（ＶＧＣＮ）に関して動物の肝臓を解析する。製造業者の指示に従ってＭａｇｎａ Ｐｕｒｅ ９６ ＤＮＡおよびウイルスＤＮＡ小体積キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）を使用して、臓器全体から組織ＤＮＡを抽出する。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ ＨＴ配列検出器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によるＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲによって、ベクターゲノムコピー数を定量する。正規化群（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ）としてマウスＲＰＰ３０遺伝子を使用する。
次に、残っている動物（投与３週間後）に、１×１０１０ｖｇの、用量群毎に最初に投与した同じＡＡＶベクターを投与する。６週目に、マウスを再度出血させ、同じプロトコールによって、ヒトＦＩＸレベル、ＡＡＶ８結合抗体（ＢＡｂ）およびＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）に関して解析する。次に、残っている全動物を屠殺し、先のプロトコールを使用して、ｑＰＣＲにより細胞当たりのベクターゲノムに関して動物の肝臓を解析する。ＡＡＶに対するおよびヒトＦＩＸに対する免疫寛容の誘導を示すＡＡＶおよびヒトＦＩＸに対する免疫応答の低減。
対照動物と比較した第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の血中レベルの増加は、遺伝子の移入および発現が成功したことを示している。ＡＡＶ＋空のＥｘｏ－ＩＳＭ動物におけるＡＡＶの第２の送達後のＦＩＸの発現の増加は、ＡＡＶと脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶとの組合せによる免疫寛容の誘導および／または有効性の増強を示している。
チャレンジ実験。投与群は、上記と同一であるが、これらの投与群、５）１×１０９ＶＧ ＡＡＶ８－ヒト第ＩＸ因子（ＡＡＶ８－ＦＩＸ）ベクター＋１～２００μｇ／ｍＬの空のＥｘｏ－ｍＩＳＭ＋１～４００μｇ／用量／マウスで腹腔内投与された抗マウスＰＤＬ－１抗体、例えばＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ１）モノクローナル抗体（ｍＩＨ５）、機能的グレード、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２４１．００、６）抗ＰＤＬ－１抗体のみ、７）１×１０９ＶＧ ＡＡＶ８－ヒト第ＩＸ因子ベクター＋１～２００μｇ／ｍＬの空のＥｘｏ－ｍＩＳＭ 空のＥｘｏ－ｈＩＳＭ＋１～４００μｇ／用量／マウスで腹腔内投与された抗マウスＣＴＬＡ－４抗体、例えばＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）モノクローナル抗体（１４Ｄ３）、機能的グレード、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、８）抗ＣＴＬＡ－４抗体のみ、を追加する。解析は上記と同一である。
養子移入例の実験は、マウスにおけるＥｘｏ－ｍＩＳＭｓによって誘導される導入遺伝子ＦＩＸ寛容が、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介されるか、または脾細胞において見出される異なる免疫細胞によって媒介されるかを決定する。実験を、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００３， １１１（９）：１３４７－５６に記載される実験と類似のように設計する。
簡単に説明すると、Ｃ５６Ｂｌ／６マウス（１４匹の雄および１４匹の雌）に、マウスＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１（ｍＩＳＭ）を発現するように操作された１～２００μｇ／ｋｇのＥＶを静脈内に注射する。投与群は、１）ＰＢＳのみ（ビヒクル対照）、２）ＡＡＶ８ ＦＩＸ、３）ＡＡＶ８ ＦＩＸ＋空のＥｘｏ－ｍＩＳＭ、４）ＡＡＶ－８ ＦＩＸ＋空のＥｘｏ（ｍＩＳＭを有しない）を含んだ。
脾細胞を、全ての試験群から収集および精製した後、収集および精製した各動物からの５×１０７個の脾細胞を、対応するレシピエントナイーブＣ５７ｂ／６マウスに静脈内注射する。レシピエントマウスに、ｈＦＩＸの皮下注射でチャレンジする。チャレンジ後２週目に、レシピエントマウスから採血し、抗ＦＩＸ抗体に関してＥＬＩＳＡによって解析する。ＡＡＶ＋空のＥｘｏ－ｍＩＳＭを投与されたレシピエント群３のマウスは、用量群２および４の脾細胞のレシピエントによって産生されたレベルより有意に低い抗ＦＩＸ抗体レベルをもたらす場合、寛容の誘導が示される。
どの免疫細胞が寛容を引き起こすかを決定するために、ＣＤ４＋、または脾細胞を枯渇させた寛容を誘導することが疑われる他の免疫細胞を使用して養子移入を行ったことを除き、上記と同じ養子移入実験を再度繰り返す。枯渇させた細胞型が寛容を引き起こす場合、用量群３は、もはや群２および４より（ｔｈｅｎ ｇｒｏｕｐｓ ２ ａｎｄ ４）有意に低い抗ＦＩＸ抗体レベルを示さないであろう。
（実施例３）
ＥＶ＋生物治療
以下の実施例は、治療剤に対する寛容を誘導するための実施例１において産生されたベクターの使用を説明する。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１４匹の雄および１４匹の雌）に、マウスＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１（ｍＩＳＭ）を発現するように操作された１～２００μｇ／ｋｇのＥＶを静脈内注射する。投与群は、１）ＰＢＳのみ（ビヒクル対照）、２）ｈＦＩＸ、３）ｈＦＩＸ＋空のＥｘｏ－ｍＩＳＭ、４）ｈＦＩＸ＋空のＥｘｏ（ｍＩＳＭを有しない）を含む。
マウスから毎週採血し、抗ｈＦＩＸ抗体応答の（ｏｒ）存在または非存在；ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ１０ＡまたはＩＬ１０Ｂのレベル；ならびにＴ細胞およびＢ細胞プロファイル（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｉｍ３＋、ＦｏｘＰ３＋、Ｔｒｅｇｓ）を含む寛容の指標に関して解析する。
チャレンジ実験。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１４匹の雄および１４匹の雌）に、マウスＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１（ｍＩＳＭ）を発現するように操作された１～２００μｇ／ｋｇのＥＶを静脈内注射する。投与群は、１）ＰＢＳのみ（ビヒクル対照）、２）ｈＦＩＸ、３）ｈＦＩＸ＋空のＥｘｏ－ｍＩＳＭ、４）ｈＦＩＸ＋空のＥｘｏ（ｍＩＳＭを有しない）、５）ｈＦＩＸ＋空のＥｘｏ－ｍＩＳＭ＋１～４００μｇ／用量／マウスで腹腔内投与された抗マウスＰＤＬ－１抗体、例えばＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ１）モノクローナル抗体（ｍＩＨ５）、機能的グレード、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２４１．００、６）抗ＰＤＬ－１抗体のみ、７）ｈＦＩＸベクター＋空のＥｘｏ－ｈＩＳＭ＋１～４００μｇ／用量／マウスで腹腔内に投与された抗マウスＣＴＬＡ－４抗体、例えばＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）モノクローナル抗体（１４Ｄ３）、機能的グレード、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、８）抗ＣＴＬＡ－４抗体のみ、を含んだ。解析は最初の実験と同一である。
養子移入の例としての実験は、マウスにおけるＥｘｏ－ｍＩＳＭによって誘導されたｈＦＩＸ寛容が、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介されるか、または脾細胞において（ｉｎ ｉｎ）見出される異なる免疫細胞によって媒介されるかどうかを決定する。実験は、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００３， １１１（９）：１３４７－５６に記載される実験と類似のように設計する。
簡単に述べると、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１４匹の雄および１４匹の雌）に、マウスＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１（ｍＩＳＭ）を発現するように操作された１～２００μｇ／ｋｇのＥＶを静脈内注射する。投与群は、１）ＰＢＳのみ（ビヒクル対照）、２）ｈＦＩＸ、３）ｈＦＩＸ＋空のＥｘｏ－ｍＩＳＭ、４）ｈＦＩＸ＋空のＥｘｏ（ｍＩＳＭを有しない）を含んだ。
脾細胞を、全ての試験群のマウスから収集した後、５×１０７個を精製し、対応するレシピエントナイーブＣ５７ｂ／６マウスに静脈内注射する。レシピエントマウスに、ｈＦＩＸの皮下注射でチャレンジする。チャレンジの２週間後に、レシピエントマウスから採血し、抗ＦＩＸ抗体に関してＥＬＩＳＡによって解析する。ＡＡＶ＋空のＥｘｏ－ｍＩＳＭを投与されたレシピエント群３のマウスが、用量群２および４からの脾細胞のレシピエントによって産生されたレベルより有意に低い抗ＦＩＸ抗体レベルをもたらす場合、寛容の誘導が示される。
免疫細胞が寛容を引き起こしていることを決定するために、ＣＤ４＋、または脾細胞を枯渇させた寛容を誘導することが疑われる他の免疫細胞型を使用して養子移入を行うことを除き、上記と同じ養子移入実験を再度繰り返す。枯渇させた細胞型が寛容を引き起こす場合、用量群３は、もはや群２および４より（ｔｈｅｎ ｇｒｏｕｐｓ ２ ａｎｄ ４）有意に低い抗ＦＩＸ抗体レベルを示さないであろう。
（実施例４）
ＥＶ＋ＡＡＶ－ＯＶＡ
以下の実施例は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで骨格筋への遺伝子移入のためにオボアルブミン導入遺伝子を使用することを除き、実施例１で産生されたＡＡＶ８カプシド－オボアルブミン（ＡＡＶ８ Ｏｖａ）ベクターの使用を説明する。Ｏｖａ導入遺伝子プラスミドの記載は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２００５， １０５（１１）：４２２６－３４に見出される。この実験は、空のＥｘｏ－ｍＩＳＭを、１×１０１１または１×１０１２ＶＧ／用量でＣ５７Ｂ／６の腓腹筋に注射されたＡＡＶ８ Ｏｖａベクターと共投与すると、オボアルブミン導入遺伝子に対して寛容をもたらすことを示す。Ｏｖａ血清タンパク質、注射部位でのＶＧＣＮ、および注射部位近くの筋細胞におけるｍＲＮＡが、ベクター＋空のＥｘｏ－ｍＩＳＭを投与される動物においてベクターのみを投与される動物より有意に高い場合、寛容が認められる。
血清中Ｏｖａの定量、抗Ｏｖａ ＩｇＧ抗体の定量、細胞あたりのＶＣＧＮおよびＯｖａ ｍＲＮＡ、ならびに血中で見出されるＯｖａ特異的Ｔ細胞の定量を、Ａｄｒｉｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１１， ２（１９９）に記載されるように解析する。
対照動物と比較して、オボアルブミン（Ｏｖａ）の血中レベル、またはＯｖａ ｍＲＮＡレベルの増加は、遺伝子の移入および発現の成功を示している。ＡＡＶ＋空のＥｘｏ－ｍＩＳＭ動物におけるＡＡＶの第２の送達後のＯｖａの発現の増加は、ＡＡＶと脂質二重層会合免疫抑制分子を含むＥＶとの組合せによる免疫寛容の誘導および／または有効性の増強を示している。
（実施例５）
ＥＶ＋細胞治療
以下は、Ｉ型糖尿病モデルのマウスにおける同種膵島細胞の移植の時点に投与された空のＥｘｏ－ｍＩＳＭの使用を説明する。
１１匹の雄のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび移植実験のために使用する。投与群は、１）６００個の同種の膵島を移植＋１～２００μｇ／ｍＬの空のＥｘｏ－ｍＩＳＭ、２）１～２００μｇ／ｍＬの空のＥｘｏ（ｍＩＳＭなし）と共に６００個の同種膵島移植膵島（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｉｓｌｅｔｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｉｓｌｅｔｓ）、３）膵島のみ、４）ＰＢＳ、である。膵島の生存率および機能を、同種の膵島に対する寛容の生成の成功を評価するために測定する。方法は全て、Ｙａｍａｎｅ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ １０， １２０８６ （２０２０）に記載される。
簡単に説明すると：
・ Ｃ５７Ｂ／６マウスは膵島のドナーであり、ＢａｌｂＣマウスはレシピエントであり、同種移植のみを実施する。
・ 膵島は、前処置されず、代わりに投与群は上記の通りである。
・ 空のＥｘｏ－ＡＡＶ ｍＩＳＭと共に膵島移植を受けた動物の移植片炎症の低減、すなわち空のＥｘｏ（ｍＩＳＭなし）と共に膵島を投与された動物における移植片の炎症より統計学的に低いことは、空のＥｘｏ－ｍＩＳＭが、膵島細胞の門脈同種移植片における炎症を低減させて、移植片の寛容を生成し、より良好な膵島移植生着および機能をもたらすことを示している。
・ 膵島＋空のＥｘｏ－ｍＩＳＭによって処置した動物において血中グルコースレベルが有意に持続して低減されたが、膵島＋空のＥｘｏ（ｍＩＳＭなし）を投与された動物では低減されなかったことは、移植手術の時点に投与した空のＥｘｏ－ｍＩＳＭがこのＩ型糖尿病マウスモデルにおいて血中グルコースレベルのより良好な制御をもたらすことを示す。
・ 膵島＋空のＥｘｏ－ｍＩＳによって処置された動物におけるマウスにおいて生存率が有意に延長されたが、膵島＋空のＥｘｏ（ｍＩＳＭなし）を投与された動物では延長されなかったことは、移植手術の時点に投与した空のＥｘｏ－ｍＩＳＭがより長い移植片の生存をもたらすことを示す。
・ ストレプトゾトシンの１５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量での１回腹腔内注射を、Ｃ５７／Ｂ６マウスに投与して糖尿病を誘導する。
炎症を以下のように測定する：炎症性のＩＦＮγタンパク質レベルを、肝臓からの組織試料中で測定する；ＦＡＣＳ解析による肝リンパ系組織の特徴付け、ヘマトキシリン－エオジンによる免疫組織化学染色を使用する肝臓におけるＴ細胞浸潤。膵島のｉｎ ｖｉｖｏ機能を、腹腔内耐糖能試験を使用して測定する。
作業の最良の形態を含む実施形態が本明細書に記載されている。このような実施形態の変形形態は、当業者であれば、前述の記載を読むことにより明らかとなることができ、斯かる変形形態は、出願人によって企図される。したがって、開示は、適用法令によって許容される、本明細書に添付されている特許請求の範囲に列挙されている主題のあらゆる改変形態および均等物を含む。さらに、そのあらゆる可能な変形形態における上述のエレメントのいずれかの組合せが、本明細書で他に指示がなければまたは文脈によって明らかに相反しなければ、本開示によって包含される。
配列
ヒトＣＴＬＡ－４：ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５２０５．２
Figure 2023531721000002
 ヒトＰＤ－Ｌ１：ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０５４８６２．１
Figure 2023531721000003
 ヒトＣＴＬＡ－４核酸
Figure 2023531721000004
 ヒトＰＤ－Ｌ１核酸
Figure 2023531721000005
 Ｙ２０１Ａ点変異を有するｈＣＴＬＡ－４
Figure 2023531721000006
 Ｃ末端を有しないｈＣＴＬＡ－４
Figure 2023531721000007
 Ｙ２０１Ａ点変異およびマウス膜貫通ドメインを有するｈＣＴＬＡ－４
Ａ１６８Ｖ、Ｓ１７２Ｌ、およびＬ１８１Ｖ変異を有するマウス膜貫通ドメイン
Figure 2023531721000008
 Ｃ末端のないマウス膜貫通ドメインを有するｈＣＴＬＡ－４
Ａ１６８、Ｓ１７２Ｌ、およびＬ１８１Ｖ変異を有するマウス膜貫通ドメイン
Figure 2023531721000009
 ｈＰＤＬ－１ Ｄ２７６Ｈ ＋ Ｋ２８０Ｎ変異
Figure 2023531721000010

Claims (162)

  1. 個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導する方法であって、前記作用因子を前記個体に投与することと併せてＥＶの有効量を前記個体に投与するステップを含み、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む、方法。
  2. 前記１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む、請求項２に記載の方法。
  3. 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記脂質二重層が、２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子を含む、または２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なるチェックポイントタンパク質を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記脂質二重層が、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記方法の特異性を付与する、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、請求項１０または１１に記載の方法。
  14. 前記標的化分子が、抗体である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ＥＶが、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、抗ＣＤ４０抗体、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記産生細胞が、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ＥＶが、前記作用因子の投与前、投与と同時、または投与後に前記個体に投与される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記ＥＶが、前記作用因子の投与と同時に前記個体に投与される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ＥＶおよび前記作用因子が、異なる製剤に存在する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ＥＶおよび前記作用因子が、同じ製剤に存在する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記作用因子が前記ＥＶと会合する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記作用因子が、前記ＥＶの外部表面と会合する、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 免疫寛容の刺激が、前記作用因子の前記個体への反復投与を容易にする、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記反復投与が、前記作用因子の約２回よりも多くの投与、３回よりも多くの投与、４回よりも多くの投与、５回よりも多くの投与、６回よりも多くの投与、７回よりも多くの投与、８回よりも多くの投与、９回よりも多くの投与、または１０回よりも多くの投与を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記作用因子が治療剤である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記作用因子が、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、細胞、または移植された細胞もしくは組織である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記作用因子が、治療ポリペプチドである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記治療ポリペプチドが、酵素、ホルモン、抗体、抗体断片、凝固因子、成長因子、受容体、またはその機能的誘導体である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記治療ポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチュブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、コロイデレミアタンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルボミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）、ジストロフィン、切断型ジストロフィン、ニーマンピックＣタンパク質（ＮＰＣ－１）、抗ＶＥＧＦ剤、またはその機能的バリアントである、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 前記作用因子が、治療ポリペプチドをコードする核酸または治療核酸である、請求項３１に記載の方法。
  36. 前記核酸が、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチューブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、全脈絡膜萎縮タンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたは副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）をコードする、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記治療核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡザイム、またはＤＮＡザイムである、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記核酸が、１種または複数の遺伝子編集産物をコードする、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ポリペプチド－核酸複合体が、遺伝子編集複合体である、請求項３１に記載の方法。
  40. 前記作用因子が、ウイルスベクターまたはそのカプシドタンパク質である、請求項３１に記載の方法。
  41. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記作用因子が、細胞治療に使用される細胞である、請求項３１に記載の方法。
  43. 前記細胞が、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、または分化細胞である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記細胞が、多能性細胞または複能性細胞である、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. 前記細胞が、胚性幹細胞または成体幹細胞である、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. 前記細胞が、造血幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、心筋幹細胞、神経幹細胞、骨幹細胞、間葉幹細胞、または脂肪幹細胞である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記細胞が、血液細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、膵細胞、膵島細胞、眼細胞、神経細胞、アストロサイト、希突起膠細胞、内耳有毛細胞、軟骨細胞、または骨芽細胞である、請求項４２または４３に記載の方法。
  48. 前記細胞が、前記個体に対して同種である、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記個体がヒトである、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 個体における疾患または障害を処置する方法であって、ＥＶの有効量を前記個体に投与するステップを含み、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含む、方法。
  51. 前記疾患または障害が自己免疫疾患または障害である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ＥＶが、組織移植または細胞生着と併せて投与される、請求項５０に記載の方法。
  53. 個体における疾患または障害を処置する方法であって、作用因子を前記個体に投与することと併せてＥＶの有効量を前記個体に投与するステップを含み、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含み、前記作用因子が前記疾患または障害を処置する、方法。
  54. 前記１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記脂質二重層が、２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子を含む、または２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なるチェックポイントタンパク質を含む、請求項５０～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記脂質二重層が、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを含む、請求項５０～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、請求項５０～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、請求項５０～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記方法の特異性を付与する、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、請求項６２または６３に記載の方法。
  66. 前記標的化分子が、抗体である、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、請求項６２～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項５０～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項５０～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記ＥＶが、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、抗ＣＤ４０抗体、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項５０～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記産生細胞が、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、請求項５０～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される、請求項５０～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない、請求項５０～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記ＥＶが、前記作用因子の投与前、投与と同時、または投与後に前記個体に投与される、請求項５０または７３に記載の方法。
  75. 前記ＥＶが、前記作用因子の投与と同時に前記個体に投与される、請求項５２～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記ＥＶおよび前記作用因子が、異なる製剤に存在する、請求項５２～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ＥＶおよび前記作用因子が、同じ製剤に存在する、請求項５２～７５のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記作用因子が前記ＥＶと会合する、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記作用因子が、前記ＥＶの外部表面と会合する、請求項７７または７８に記載の方法。
  80. 免疫寛容の刺激が、前記作用因子の前記個体への反復投与を容易にする、請求項５２～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記反復投与が、前記作用因子の約２回よりも多くの投与、３回よりも多くの投与、４回よりも多くの投与、５回よりも多くの投与、６回よりも多くの投与、７回よりも多くの投与、８回よりも多くの投与、９回よりも多くの投与、または１０回よりも多くの投与を含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記作用因子が治療剤である、請求項５２～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記作用因子が、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、または移植された細胞もしくは組織である、請求項５２～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記作用因子が、治療ポリペプチドである、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記治療ポリペプチドが、酵素、ホルモン、抗体、抗体断片、凝固因子、成長因子、受容体、またはその機能的誘導体である、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記治療ポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチュブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、コロイデレミアタンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルボミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、または副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）である、請求項８４または８５に記載の方法。
  87. 前記作用因子が、治療ポリペプチドをコードする核酸または治療核酸である、請求項８３に記載の方法。
  88. 前記核酸が、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ミオチューブラリン、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４、全脈絡膜萎縮タンパク質（ＣＨＭ）、ハンチンチン、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、β－グロビン、γ－グロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたは副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤ）をコードする、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記治療核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡザイム、またはＤＮＡザイムである、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記核酸が、１種または複数の遺伝子編集産物をコードする、請求項８３に記載の方法。
  91. 前記ポリペプチド－核酸複合体が、遺伝子編集複合体である、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記作用因子が、ウイルスベクターまたはそのカプシドタンパク質である、請求項８３に記載の方法。
  93. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターである、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記作用因子が、細胞治療に使用される細胞である、請求項８３に記載の方法。
  95. 前記細胞が、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、または分化細胞である、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記細胞が、多能性細胞または複能性細胞である、請求項９４または９５に記載の方法。
  97. 前記細胞が、胚性幹細胞または成体幹細胞である、請求項９５または９６に記載の方法。
  98. 前記細胞が、造血幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、心筋幹細胞、神経幹細胞、骨幹細胞、間葉幹細胞、または脂肪幹細胞である、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記細胞が、血液細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、膵細胞、膵島細胞、眼細胞、神経細胞、アストロサイト、希突起膠細胞、内耳有毛細胞、軟骨細胞、または骨芽細胞である、請求項９４または９５に記載の方法。
  100. 前記細胞が、前記個体に対して同種である、請求項９４～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記個体がヒトである、請求項５０～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 個体において作用因子に対する免疫寛容を誘導するための細胞外小胞（ＥＶ）と、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物であって、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層と治療剤とを含む、組成物。
  103. 前記作用因子が、ポリペプチド、核酸、ポリペプチド－核酸複合体、ウイルスベクター、リポソーム、細胞、または移植された細胞もしくは組織である、請求項１０２に記載の組成物。
  104. 前記作用因子が前記ＥＶと会合する、請求項１０２または１０３に記載の組成物。
  105. 前記作用因子が前記ＥＶの外表面と会合する、請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載の組成物。
  106. 前記１種または複数の免疫抑制分子が１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を含む、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載の組成物。
  107. 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む、請求項１０２～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  108. 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、請求項１０２～１０７のいずれか一項に記載の組成物。
  109. 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、請求項１０８に記載の組成物。
  110. 前記脂質二重層が、２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なる免疫抑制分子を含む、または２種もしくはそれよりも多い、３種もしくはそれよりも多い、または４種もしくはそれよりも多い異なるチェックポイントタンパク質を含む、請求項１０２～１０９のいずれか一項に記載の組成物。
  111. 前記脂質二重層が、ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡおよびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ－４およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ；ＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２およびＶＩＳＴＡ；またはＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを含む、請求項１０２～１１０のいずれか一項に記載の組成物。
  112. 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、請求項１０２～１１１のいずれか一項に記載の組成物。
  113. 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、請求項１１２に記載の組成物。
  114. 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、請求項１０２～１１３のいずれか一項に記載の組成物。
  115. 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、請求項１１４に記載の組成物。
  116. 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記ＥＶの特異性を付与する、請求項１１４または１１５に記載の組成物。
  117. 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載の組成物。
  118. 前記標的化分子が、抗体である、請求項１１４～１１７のいずれか一項に記載の組成物。
  119. 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、請求項１１４～１１８のいずれか一項に記載の組成物。
  120. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項１０２～１１９のいずれか一項に記載の組成物。
  121. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項１０２～１２０のいずれか一項に記載の組成物。
  122. 前記ＥＶが、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、抗ＣＤ４０抗体、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項１０２～１２１のいずれか一項に記載の組成物。
  123. 前記産生細胞が、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、請求項１０２～１２２のいずれか一項に記載の組成物。
  124. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される、請求項１０２～１２３のいずれか一項に記載の組成物。
  125. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない、請求項１０２～１２４のいずれか一項に記載の組成物。
  126. 請求項１０２～１２５のいずれかに記載の組成物を産生する方法であって、
    ａ）ＥＶ産生細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＶを生成する条件下で培養するステップであって、前記ＥＶ産生細胞が、１種または複数の１種または複数の膜結合免疫抑制分子をコードする核酸を含むステップ、
    ｂ）前記ＥＶを収集するステップ、および
    ｃ）前記ＥＶを前記作用因子と共に製剤化するステップ
    を含む方法。
  127. 前記ＥＶ産生細胞が、前記膜結合免疫抑制分子をコードする外因性の核酸を含む、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記膜結合免疫抑制分子が、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を含む、請求項１２６または１２７に記載の方法。
  129. 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、請求項１２６または１２７に記載の方法。
  130. 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、請求項１２６～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、請求項１２６～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記ＥＶの特異性を付与する、請求項１３３または１３４に記載の方法。
  136. 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、請求項１３３または１３４に記載の方法。
  137. 前記標的化分子が、抗体である、請求項１３３～１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、請求項１３３～１３７のいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項１２６～１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 前記ＥＶが、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を発現するように操作された産生細胞から産生される、請求項１２６～１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. 前記産生細胞が、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない産生細胞から産生される、請求項１２６～１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. 前記ＥＶが、前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の、それが由来する細胞に対して異種である追加的な分子を含有しない、請求項１２６～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 免疫抑制ＥＶを生産するための生産細胞であって、ＥＶが、１種または複数の免疫抑制分子を含む脂質二重層を含み、前記１種または複数の免疫抑制分子が膜に結合している、生産細胞。
  145. 前記１種または複数の免疫抑制分子を発現するように操作されている、請求項１４４に記載の生産細胞。
  146. ＣＴＬＡ４、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、またはＨＶＥＭの１種または複数を発現するように操作されている、請求項１４４または１４５に記載の生産細胞。
  147. 前記１種または複数の免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを標的とする、請求項１４４または１４５に記載の生産細胞。
  148. 前記免疫抑制分子が、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体である、請求項１４７に記載の生産細胞。
  149. 前記免疫抑制分子のうち１種または複数が、膜貫通ドメインを含む、請求項１４４～１４８のいずれか一項に記載の生産細胞。
  150. 前記膜貫通ドメインが、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、またはマウスＣＴＬＡ４膜貫通ドメインである、請求項１４９に記載の生産細胞。
  151. 前記脂質二重層が、標的化分子をさらに含む、請求項１４４～１５０のいずれか一項に記載の生産細胞。
  152. 前記標的化分子が、前記ＥＶに細胞特異性または組織特異性を付与する、請求項１５１に記載の生産細胞。
  153. 前記標的化分子が、肝臓、脾臓、および／または胸腺に対する前記ＥＶの特異性を付与する、請求項１５１または１５２に記載の生産細胞。
  154. 前記標的化分子が、ドナー組織と前記個体との間のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩミスマッチを標的とする、請求項１５２または１５３に記載の生産細胞。
  155. 前記標的化分子が、抗体である、請求項１５１～１５４のいずれか一項に記載の生産細胞。
  156. 前記１種または複数の標的化分子が、膜貫通ドメインを含む、請求項１５１～１５５のいずれか一項に記載の生産細胞。
  157. 前記１種もしくは複数の免疫抑制分子および／または前記１種もしくは複数の標的化分子をコードする核酸を含む、請求項１５１～１５６のいずれか一項に記載の産生細胞。
  158. 前記１種もしくは複数の免疫抑制分子および／または前記１種もしくは複数の標的化分子をコードする前記核酸が、前記細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項１５７に記載の産生細胞。
  159. 哺乳動物細胞である、請求項１４４～１５８のいずれか一項に記載の産生細胞。
  160. ヒト細胞である、請求項１４４～１５９のいずれか一項に記載の産生細胞。
  161. ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒ．Ｃ６細胞である、請求項１４４～１６０のいずれか一項に記載の産生細胞。
  162. 前記１種または複数の免疫抑制分子および標的化分子以外の追加的な異種分子を含有しない、請求項１４４～１６１のいずれか一項に記載の産生細胞。
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