JP2021512056A - 細胞活性状態を調節することにより免疫細胞の炎症状態をインビボで変更すること - Google Patents

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Abstract

免疫細胞の活性状態をインビボで調節するシステム及び方法が記載されている。このシステム及び方法を使用すれば、がん成長及び転移を支援する免疫抑制性マクロファージを高度に活性化された殺腫瘍性マクロファージに変換することができる。

Description

本出願は、２０１８年１月１８日提出の米国特許仮出願第６２／６１８，９０８号の優先権の利益を主張し、前記特許文献はこれによって参照によりその全体をあたかも本明細書で完全に記述されるかのように組み込む。
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表はハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、これにより参照によって本明細書に組み込む。配列表を含有するテキストファイルの名称は、１８−０７３−ＷＯ−ＰＣＴ配列表＿ＳＴ２５．ｔｘｔ．である。テキストファイルは１４５ｋｂで、２０１９年１月１４日に作成され、ＥＦＳ−ウェブを経て電子的に提出されている。
本開示は、免疫細胞の活性状態（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ）をインビボで調節するシステム及び方法を提供する。このシステム及び方法を使用すれば、がん成長及び転移を支援する免疫抑制マクロファージを高度に活性化された殺腫瘍性マクロファージに変換することができる。
いくつかの有害な生理的条件が免疫系活性化（例えば、自己免疫障害）又は免疫系抑制（例えば、がん）と関連している。例えば、マクロファージはがん組織に多数浸潤する重要な免疫エフェクター細胞である。しかし、腫瘍微小環境において、マクロファージは活性化殺腫瘍性状態から、実際に腫瘍成長及び転移を促進する免疫抑制表現型への切り替えを受ける。Ｐｏｌｌａｒｄ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４、７１〜７８頁（２００４）；Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１７）。
腫瘍微小環境内の免疫抑制されたマクロファージががん成長及び転移を促進することを理解すると、免疫抑制腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を標的にする療法を開発することに多くの努力が捧げられてきた。ＴＡＭに取り組む数多くの努力は、ＴＡＭを殺滅して腫瘍微小環境において免疫抑制を緩和することに焦点を合わせてきた。しかし、このアプローチを用いると、ＴＡＭは腫瘍微小環境において新たに到着したマクロファージに取って代わられるだけである。さらに、一部のＴＡＭを殺滅することに成功した場合でも、現在までに開発された大半の治療薬は、腫瘍微小環境中に十分に浸透することができずにいた。一部の小分子薬物及び抗体はある程度の成功を見せてきたが、これらのアプローチは、危険な副作用を含めて身体においてすべてのマクロファージを抑制してきた。Ｂｏｗｍａｎ＆Ｊｏｙｃｅ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ６、６６３〜６６６頁（２０１４）。したがって、がんに冒されたすべての人が理解しているように、副作用がより少ないより効果的な処置戦略が大いに必要とされている。
Ｐｏｌｌａｒｄ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４、７１〜７８頁（２００４） Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１７） Ｂｏｗｍａｎ＆Ｊｏｙｃｅ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ６、６６３〜６６６頁（２０１４）
本開示は免疫細胞の機能をインビボで調節するシステム及び方法を提供する。特定の実施形態において、このシステム及び方法を使用して、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の免疫抑制腫瘍支援状態を逆転させて、これらのＴＡＭを高度に活性化された腫瘍細胞を殺滅するマクロファージに変える。したがって、本明細書で開示されるシステム及び方法は、単にＴＡＭを殺滅することを狙いとするのではなく、代わりにその活性を腫瘍促進から腫瘍破壊に向け直すことである。特定の実施形態において、このシステム及び方法は、がん細胞の殺滅を誘導し及び／又は新しいがん細胞の成長若しくは発生を減少する若しくは予防するための治療法として使用される。本明細書に開示されるデータから、これらのシステム及び方法が、制御するのが悪名高いほど困難であるがんタイプである卵巣がんを完全に根絶し抑制することができることが明らかにされる。
本明細書に開示されるシステム及び方法を使用すれば、腫瘍における免疫抑制状態を変更し、腫瘍微小環境を再構築する機構を提供することができる。これらの実施形態において、再構築された腫瘍微小環境は、腫瘍を、ワクチン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、及び／又は化学療法などの、コンパニオン処置にさらに感受性にすることができる。
重要なことに、本明細書に開示されるシステム及び方法は、腫瘍微小環境で局所的に使用して、免疫系ホメオスタシスを全体的に破壊する全身処置に頼る必要性をなくすことができる。さらに、特定の実施形態は、腫瘍微小環境に成功裏に浸潤するように最適化されてきた。
特定の実施形態は、転写因子などの活性化制御因子をコードするヌクレオチドを送達する粒子を利用することにより免疫細胞の活性状態をインビボで変更する。特定の有用な粒子は、正電荷の核及び中性又は負電荷表面を有し、転写因子インターフェロン制御因子（ＩＲＦ５）をキナーゼＩＫＫβと組み合わせてコードするヌクレオチドを送達する。＜１３０ｎｍの特定のサイズは腫瘍浸潤を保証する。さらに、粒子は、ＴＡＭによる粒子のさらに選択的な取込みを指示するＴＡＭターゲティングリガンドを含むことができる。一例として、ＴＡＭは細胞表面受容体であるＣＤ２０６を発現しており、この受容体を粒子の表面上にマンノースを含むことにより標的にすることができる。
本明細書に提出される図の多くはカラーであればよりよく理解される。出願は元の提出物の一部として図のカラー版を検討し、後の手続きにおいて図のカラー画像を提示する権利を保留する。
標的化されたｍＲＮＡナノ粒子を使用して腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を殺腫瘍性細胞に遺伝的に変換する模式図。（図１Ａ）全身毒性を引き起こすことなく治療目的でＴＡＭを合理的に再プログラムする新しい方法としてＭ１極性化転写因子をコードするインビトロで転写されたｍＲＮＡを送達するための注射可能なナノ粒子が開発された。ｍＲＮＡナノ粒子の繰り返される腹腔内注入を用いて卵巣がん患者を処置するように設計され、初めて計画された臨床適用が図解されている。 標的化されたｍＲＮＡナノ粒子を使用して腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を殺腫瘍性細胞に遺伝的に変換する模式図。（図１Ｂ）標的化されたｍＲＮＡナノ粒子を使用して脳内ＴＡＭを殺腫瘍性マクロファージに遺伝的に再プログラムする模式図。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ａ）マクロファージ極性化の重要な制御因子をコードするｍＲＮＡを用いて組み立てられたマクロファージ標的化ポリマーＮＰの設計。粒子は、ＰＧＡ−ジマンノースの層で被覆されたＰｂＡＥ−ｍＲＮＡポリプレックスコアからなり、ＰＧＡ−ジマンノースは粒子をＭ２様マクロファージにより発現される標的マンノース受容体（ＣＤ２０６）に向ける。ＮＰにカプセル化された合成ｍＲＮＡも描かれており、この合成ｍＲＮＡは再プログラミング転写因子をコードするように操作されている。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ｂ）ＮＰの集団（スケールバー２００ｎｍ）及び単一ＮＰ（挿入図、スケールバー５０ｎｍ）の透過型電子顕微鏡。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ｃ）ＮＰのサイズ分布、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００装置を使用して測定。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ｄ）ＮＰは、１時間曝露後骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の高トランスフェクション（４６％）を示した。 ナＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ｅ）ノ粒子トランスフェクションの２４時間後フローサイトメトリーにより測定された骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）中への遺伝子移入効率。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ｆ）ＮＰトランスフェクトされた及び非トラスフェクトマクロファージの相対的生存率（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＰＩを用いて染色することにより評価した）。Ｎ．ｓ．；有意でない。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ｇ）ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定したコドン最適化ＩＲＦ５ ｍＲＮＡ（青色、左Ｙ軸）及び内在性ＩＲＦ５ ｍＲＮＡ（黒色、右Ｙ軸）の発現動態。時点ごとにｎ＝３。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ｈ）ＮＰトランスフェクションプロトコール及び図２Ｉ〜２Ｋで使用されるＢＭＤＭの培養条件を描くタイムライン。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ｉ）Ｔｏｌｌ様受容体６アゴニストＭＰＬＡで刺激されたシグネチャーＭ１細胞と比べたＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ−トランスフェクトされたマクロファージの遺伝子発現プロファイル。結果は、遺伝子発現における倍率変化の分布を示す火山プロットとして描かれている。Ｍ１シグネチャー遺伝子が示されている。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ−トランスフェクトされたマクロファージとＭ１シグネチャー遺伝子セットの間の重複のＰ値はＧＳＥＡにより決定した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ｊ）ＩＬ−４において培養されたマクロファージ対ＩＬ−４において培養されＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰをトランスフェクトされた細胞でのＭ１シグネチャー遺伝子発現のヒートマップ。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図２Ｋ）指示された遺伝子についての平均カウント及びＳ．Ｅ．Ｍを示す箱ひげ図。 マウスマクロファージの表現型に対するインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）ファミリーの異なるメンバー（その活性化キナーゼと組み合わせて又はなしで送達される）の効果のインビトロスクリーニング。Ｃ５７ＢＬ／６由来のＢＭＤＭをＭ−ＣＳＦ条件付け培地でインキュベートし、（１）対照ＧＦＰ、（２）マウスＩＲＦ５、（３）ＩＲＦ５をリン酸化するマウスＩＲＦ５及びＩＫＫβキナーゼ、（４）マウスＩＲＦ８及びＩＫＫβキナーゼ、（５）Ｌｙｓ−３１０からＡｒｇ（Ｋ３１０Ｒ）変換したＩＲＦ８の突然変異体であるマウスＩＲＦ８ Ｋ３１０Ｒ（Ｗｈｉｔｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１６年６月２４日）、又は（６）マウスＩＲＦ７／３（５Ｄ）をコードする、合成ｍＲＮＡを担持するｍＲＮＡ−ＰＢＡＥ ＮＰで、トランスフェクトした。この融合タンパク質は、ＩＲＦ−７のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び構成的活性ドメイン（ＣＡＤ）並びにＩＲＦ３の核外移行シグナル（ＮＥＳ）及びＩＲＦ会合ドメインを含む（Ｌｉｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１８．５、１９９８年）。ＮＰトランスフェクションの２日後、細胞を、ＴＡＭ関連マクロファージマーカーＥｇｒ２及び活性化マクロファージマーカーＣＤ３８についてのフローサイトメトリー分析のために収集した。このインビトロスクリーニングに基づいて、ｍＩＲＦ５及びＩＫＫβキナーゼをコードするｍＲＮＡを同時送達するＮＰを、本明細書に記載される残りのインビトロ及び治療インビボ実験のために選択した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図４Ａ）タイムライン及び投与計画。矢印は、Ｉ．Ｐ．注射の時間を示している。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図４Ｂ）対照及び処置マウスにおける腫瘍成長の連続生物発光イメージング。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図４Ｃ）処置対対照マウスについてのカプラン・マイヤー生存曲線。統計解析は対数順位検定を使用して実施した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図４Ｄ）対照としてＧＦＰ ｍＲＮＡを担持するＤ−マンノース被覆ＮＰの単回ｉ．ｐ．投与の４８時間後、異なる免疫細胞亜集団におけるインビボトランスフェクション率のフローサイトメトリー定量化：マクロファージ（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ−、Ｌｙ６Ｃ−／ｌｏｗ、Ｌｙ６Ｇ−）、単球（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ−、Ｌｙ６Ｃ＋、Ｌｙ６Ｇ−）、好中球（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ−、Ｌｙ６Ｇ＋）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋、ＴＣＲ−β鎖＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋、ＴＣＲ−β鎖＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋）、及びナチュラルキラー細胞（ＣＤ４５＋、ＴＣＲ−β鎖−、ＣＤ４９ｂ＋）を測定した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図４Ｅ）播種性ＩＤ８卵巣がんを抱えたマウスの腹膜におけるマクロファージ表現型のフローサイトメトリー分析。動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの４回投与又はＰＢＳで処置した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図４Ｆ）Ｌｙ６Ｃ−、Ｆ４／８０＋、及びＣＤ２０６＋（Ｍ２様）マクロファージの相対的パーセント（左パネル）及び絶対数（右パネル）をまとめる箱ひげ図。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図４Ｇ）Ｌｙ６Ｃ−、Ｆ４／８０＋、及びＣＤ２０６−（Ｍ１様）マクロファージについての対応する数。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図４Ｈ）ＰＢＳ対照（上パネル）又はＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置動物（下パネル；スケールバー１００μｍ）から単離した卵巣腫瘍浸潤腸間膜の代表的ヘマトキシリン及びエオシン染色切片。代表的悪性病変の１０倍拡大図が右側に示されている（スケールバー５０μｍ）。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図４Ｉ）それぞれの処置群から単離した腹膜マクロファージにより産生されたサイトカインを測定するＬｕｍｉｎｅｘアッセイ。ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージは蛍光活性化細胞選別により単離し、エクスビボで培養した。２４時間後、細胞培養上澄みを収集した。パラレル実験において、ＦＡＣＳ選別ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージはｐＲＴ−ＰＣＲにより直接分析して、マクロファージ表現型の４つの主要制御因子（セルピンＢ２、Ｒｅｔｎｌａ、Ｃｃｌ１１、及びＣｃｌ５）の発現レベルを決定した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図４Ｉ）それぞれの処置群から単離した腹膜マクロファージにより産生されたサイトカインを測定するＬｕｍｉｎｅｘアッセイ。ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージは蛍光活性化細胞選別により単離し、エクスビボで培養した。２４時間後、細胞培養上澄みを収集した。パラレル実験において、ＦＡＣＳ選別ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージはｐＲＴ−ＰＣＲにより直接分析して、マクロファージ表現型の４つの主要制御因子（セルピンＢ２、Ｒｅｔｎｌａ、Ｃｃｌ１１、及びＣｃｌ５）の発現レベルを決定した。その結果を、図４Ｊに箱ひげ図としてまとめている。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図５Ａ）ｉ．ｐ．投与に続くマクロファージ標的化ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰのインビボ生体内分布。ＮＰ−送達された（コドン最適化）ｍＲＮＡは、５０μｇのｍＲＮＡを含有する粒子の単回注射の２４時間後ｑＰＣＲにより検出した。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図５Ｂ）実験タイムラインの模式図。最後の投与の＊２４時間後、マウスはＣＯ２吸入により安楽死させた。血液は、血清化学及び全血球計算のために後眼窩出血を通じてヘパリン被覆チューブ中に収集した。死体解剖は、肝臓、脾臓、膵臓、腸間膜及び網、胃、並びに膀胱の組織学的分析のために実施した。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図５Ｃ）対照又はＮＰ処置動物から単離された種々の臓器の代表的なヘマトキシリン及びエオシン染色切片。スケールバー、１００μｍ。ＮＰ処置動物において見出された病変は比較病理医による分析に基づいて示されここに記載されている。番号が付いた画像ごとに関連する所見は、［１］少数の顆粒球と混ざり合った単核細胞で大部分構成された細胞浸潤物の別々の病巣；軽い骨髄外造血発生。［２］少数の局所的広い領域において、肝細胞は軽度から中等度に腫大している。［３］赤色髄内の中等度の骨髄性（優勢な）、赤血球及び巨大核細胞過形成。［４］白色髄の軽い低細胞性。［５］腸間膜内において、マクロファージ、リンパ球、血漿細胞及び顆粒球の中等度の多巣性浸潤物が存在する。［６］リンパ球、血漿細胞及び顆粒球と混ざり合ったマクロファージの軽度から中等度浸潤物；腺房の軽度の解離及び腺房消失；腺房細胞からのチモーゲン顆粒の軽度のびまん性消失。［７］脂肪組織周辺のマクロファージと混ざり合ったリンパ球の濃い凝集体。［８］胃粘膜内の主及び壁細胞の軽度の多巣性空胞変性。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図５Ｄ）血清化学及び血球数。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図５Ｅ）ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの単回ｉ．ｐ．注射の４又は８日後の血清ＩＬ−６サイトカインのＬｕｍｉｎｅｘアッセイ測定。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図５Ｆ）ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの単回ｉ．ｐ．注射の４又は８日後の血清ＴＮＦ−αサイトカインのＬｕｍｉｎｅｘアッセイ測定。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。（図６Ａ）ｉ．ｖ．投与に続くマクロファージ標的化ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰのインビボ生体内分布。コドン最適化ｍＲＮＡは、５０μｇのｍＲＮＡを含有する粒子の単回ｉ．ｖ．注射の２４時間後にｑＰＣＲにより測定した。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図６Ｂ）タイムライン及び投与計画。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図６Ｃ）健康な肺（左パネル）及びＢ１６Ｆ１０腫瘍浸潤肺（右パネル）の共焦点顕微鏡。浸潤性マクロファージ集団は緑色の蛍光を発する。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図６Ｄ）連続生物発光腫瘍イメージング。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図６Ｅ）処置群ごとのカプラン・マイヤー生存曲線。ｍｓは生存期間中央値を示す。統計解析は対数順位検定を使用して実施し、Ｐ＜０．０５は有意と見なした。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図６Ｆ）２週間の処置に続くそれぞれの群を表すＢ１６Ｆ１０メラノーマ転移を含有する肺の代表的写真（上の列）及び顕微鏡写真。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図６Ｇ）肺腫瘍病巣の数。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図６Ｈ）それぞれの処置群由来の気管支肺胞洗浄中の単球／マクロファージ集団の表現型特徴付け。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。（図６Ｉ）抑制性及び活性化されたマクロファージの相対的パーセンテージのまとめ。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図７Ａ）誘導後２１日目のＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−Ｂ／Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−；Ｐｔｅｎ−／−トランスジェニックマウスにおけるＰＤＧＦβ駆動神経膠腫の開始に続くＴ２ ＭＲＩスキャン、及び組織学的染色。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図７Ｂ）神経膠腫縁を浸潤するＣＤ６８＋ＴＡＭの共焦点顕微鏡。スケールバー、３００μｍ。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図７Ｃ）健康な脳組織対神経膠腫におけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋）集団のフローサイトメトリー分析。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図７Ｄ）単独療法としてＩＲＦ５／ＩＫＫβ処置を受けた、確立した神経膠腫を抱えたマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。タイムライン及び投与計画は上に示されている。ｍｓ、生存期間中央値。統計解析は対数順位検定を使用して実施し、Ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なした。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図７Ｅ）脳腫瘍放射線療法と組み合わせたＩＲＦ５／ＩＫＫβ処置を受けた、確立した神経膠腫を抱えたマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。タイムライン及び投与計画は上に示されている。ｍｓ、生存期間中央値。統計解析は対数順位検定を使用して実施し、Ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なした。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図７Ｆ）腫瘍進行の連続生物発光イメージング。 ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。（図８Ａ）ヒトＴＨＰ−１単核球細胞株を抑制性Ｍ２様マクロファージに分化させるタイムライン及び培養条件。 ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。（図８Ｂ）２４ウェルにおいて培養され、ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡ対対照ＧＦＰ ｍＲＮＡを担持するＮＰの指示された濃度をトランスフェクトされたＭ２−分化ＴＨＰ１−Ｌｕｃｉａ細胞の生物発光イメージング。ＩＲＦ誘導Ｌｕｃｉａルシフェラーゼのレベルは、Ｑｕａｎｔｉ−Ｌｕｃを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。 ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。（図８Ｃ）生物発光数のまとめ。 ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。（図８Ｄ）ＩＬ−１βサイトカイン分泌におけるＭ１−マクロファージマーカーＣＤ８０の差。 ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。（図８Ｅ）表面発現（図８Ｅ）Ｍ１−マクロファージマーカーＣＤ８０の差。 実施例１に記載される骨髄及びリンパ球免疫表現型パネルにおいて使用される抗体の一覧表。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０及び１１１）を提供する。配列番号１〜４４、１１０及び１１１の正体は図１１に記載されている。特に配列番号１５に関しては、融合タンパク質は、マウスＩＲＦ７のＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）及びＣＡＤ（構成的活性ドメイン）並びにマウスＩＲＦ３のＮＥＳ（核外移行シグナル）及びＩＲＦ会合ドメインを含む。ＩＲＦ会合ドメインは、Ｎ末端領域において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照）。特に配列番号１７に関しては、マウスＩＲＦ８におけるＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）結合部位は、リジン（Ｋ）３１０である。ＳＵＭＯ２／３の結合は、ＩＲＦ−８がＩＲＦ８応答性遺伝子に結合して活性化するのを妨げる。Ｋ３１０残基の突然変異はＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げ、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写を２〜５倍増加させる（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１８９（７）：３５４８〜３５５６頁）。 例示的なタンパク質配列及びコードヌクレオチド配列の配列番号の一覧表を提供する。 例示的なタンパク質配列及びコードヌクレオチド配列の配列番号の一覧表を提供する。
いくつかの有害な生理的条件が、免疫系活性化（例えば、自己免疫障害）又は免疫系抑制（例えば、がん）と関連している。例えば、マクロファージは、がん組織に多数浸潤する重要な免疫エフェクター細胞である。しかし、免疫抑制性腫瘍環境において、マクロファージは活性化殺腫瘍性状態から、腫瘍成長及び転移を促進する免疫抑制表現型への切り替えを受ける。これらの腫瘍関連免疫抑制されたマクロファージ（ＴＡＭ）は予後不良と関連している（Ｋｏｍｏｈａｒａ Ｙら、（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ １０５（１）：１〜８頁）。ＴＡＭは、血管新生、リンパ球新生、及び間質リモデリングを誘導する。ＴＡＭは、酵素プラスミン、ｕＰＡ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びカテプシンＢの分泌を通じて腫瘍浸潤及び転移を促進するのに重要な役割も果たしている（Ｋｏｍｏｈａｒａ、Ｙら、（２０１６）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ９９：１８０〜１８５頁；Ｇｏｃｈｅｖａ Ｖら、（２０１０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２４：２４１〜２５５頁；Ｗａｎｇ Ｒら、（２０１１）Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ７４：１８８〜１９６頁）。腫瘍成長及び進行を媒介することとは別に、ＴＡＭは他の免疫細胞と相互作用をして自然及び適応抗腫瘍免疫応答を抑制することができる。
いくつかの小分子薬物は、細胞動員又は増殖に関与する経路を標的にすることにより、ＴＡＭ前駆体細胞の腫瘍への局在化を遮断することに焦点を合わせている（すなわち、ＣＳＦ−１／ＣＳＦ−１Ｒ経路（Ｐｙｏｎ；ｔｅｃｋら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １９、１２６４〜１２７２頁（２０１３）；Ｔａｐら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７３、４２８〜４３７頁（２０１５））又はＣＣＬ２経路（Ｎｙｗｅｎｉｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １７、６５１〜６６２頁（２０１６））の阻害剤）。これらのアプローチには、小分子薬物の高用量への繰り返し全身曝露が必要である。さらに、これらの薬物の臨床試験は、細胞減少療法と組み合わされていなければ、示す応答は低かった。Ｎｙｗｅｎｉｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １７、６５１〜６６２頁（２０１６）；Ｂｕｔｏｗｓｋｉら、Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ １８、５５７〜５６４頁（２０１６）。さらに、これらの小分子アプローチは、マクロファージ抗腫瘍活性を活発に促進しない。
リポソームなどの従来のナノ担体は、ビスホスホネート又は腫瘍内のマクロファージを全身的に破壊する他の抗増殖剤（すなわち、リポソームクロドロネート）で処方されてきた（Ｆｒｉｔｚら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５、５８７（２０１４））。腫瘍溶解性ウイルスも、ｓｉＲＮＡを送達し、腫瘍内の免疫回避経路を発現停止させＴＡＭの食作用を間接的に促進するのに使用されてきた（Ｃｈａｏら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４、２２５〜２３２頁（２０１２））。しかし、これらのアプローチを使用して破壊されるマクロファージは、新たに到着するマクロファージで自然に取って代わられ、これは同様に免疫抑制性になる。
ＴＡＭの機能的活性化を誘導する抗体が、開発されている。これらのアプローチは、腫瘍内の限定された抗原タイプを標的にする抗体を利用する。Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１７）。しかし、これらの抗体の成功は、その低い腫瘍浸透及び不均質な分布により制限される。Ｔｈｕｒｂｅｒら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６０、１４２１〜１４３４頁（２００８）。彼らはまた、抗体により標的にされる抗原を欠く腫瘍エスケープ変異体にも取り組んでいない。
記載されたアプローチのどれも、本明細書で開示されるようには、ＴＡＭを活性化された殺腫瘍性マクロファージになるように直接、効果的に再プログラムしない。本明細書に開示されるシステム及び方法は、著しく革新的である。なぜならば、本明細書に開示されるシステム及び方法は、腫瘍促進ＴＡＭ負荷を同時に減らしつつ、ＴＡＭを腫瘍除去マクロファージになるように再プログラムするのを可能にするからである。現在、医師が、これらの治療目的のためにＴＡＭを合理的に再プログラムすることを、可能にする他の方法は、存在しない。Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１７）；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ＆Ｎａｇａｒａｊ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９、１６２〜１７４頁（２００９）。本方法は、本方法自体においてかつ本方法自体が、腫瘍の処置において治療効果を与えることができる。腫瘍微小環境を調節し構成し直すことにより、本開示は腫瘍を、ワクチン、免疫療法（例えば、ＣＡＲ）、及び／又は化学療法などの他の処置タイプにもさらに感受性にする。
特定の実施形態は、転写因子（例えば、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ））及び／又はキナーゼ（例えば、ＩＫＫβ）などの活性化制御因子をコードする遺伝子をコードするヌクレオチドを、細胞に提供する粒子を利用する。これらの活性化制御因子は、マクロファージ極性化を調節する（図１）。マクロファージ極性化は、マクロファージの生理的活性が変化する際に通過する、高度に動的なプロセスである。示されるように、大半の腫瘍において、ＴＡＭは、「Ｍ２」表現型が可能である免疫抑制された表現型を示す。これとは対照的に、活性化されたマクロファージは、腫瘍細胞の殺滅をもたらす「Ｍ１」表現型を示すことができる。本明細書で開示される特定の実施形態は、腫瘍促進ＴＡＭの極性化を、腫瘍を殺滅するマクロファージへと逆転する。この効果は、炎症性サイトカインを誘導し、他の免疫細胞を活性化し、腫瘍細胞を貪食することにより腫瘍内の免疫抑制性環境を寛解する。
「マクロファージ活性化（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」とは、マクロファージの表現型又は機能を（ｉ）不活性化状態（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）から活性化状態（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）へ；（ｉｉ）非活性化状態から活性化状態へ；（ｉｉｉ）活性化状態からさらに活性化された状態へ；又は（ｉｖ）不活性化状態から非活性化状態へ変更するプロセスのことである。不活性化状態とは、腫瘍成長及び転移を促進する免疫抑制された表現型を意味する。非活性化状態とは、マクロファージが腫瘍成長又は転移を促進せず、腫瘍細胞の殺滅を促進もしないことを意味する。活性化状態は、マクロファージが殺腫瘍活性を示すことを意味する。特定の実施形態において、活性化状態により、下でより完全に説明されるＭ１表現型が生じる。特定の実施形態において、不活性化状態によりＭ２表現型が生じ、これも下でより完全に説明される。
「マクロファージ不活性化（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」とは、マクロファージの表現型又は機能を（ｉ）活性化状態から活性化がより低い状態へ；（ｉｉ）活性化状態から非活性化状態へ；（ｉｉｉ）活性化状態から不活性化状態へ；又は（ｉｖ）非活性化状態から不活性化状態へ変更するプロセスのことである。特定の実施形態において、不活性化状態はＭ２である。特定の実施形態において、活性化状態はＭ１である。
特定の実施形態において、開示されたシステム及び方法の１つの利点は、処置により誘導される炎症が処置部位に局在化したままになるがゆえに、患者を全身的毒性から救うことである。この利点を達成するため、局所的に注入された粒子は、腫瘍環境中のＴＡＭを標的にし、（２）マクロファージ極性化を制御するシグナル伝達経路を選択的に再プログラムするヌクレオチドを送達し、（３）局所的に生理的経路により完全に分解可能になる（Ｓａｈｉｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １３、７５９〜７８０頁（２０１４））。
固形腫瘍中で外因性ヌクレオチドの高発現を達成するのは、インビボにおいて難問である。本開示以前、ウイルス又はリポソームなどの従来のナノ担体に基づくヌクレオチド送達システムは、腫瘍組織内においてその制限された拡散により限定された、Ｊａｉｎ＆Ｓｔｙｌｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ７、６５３〜６６４頁（２０１０）。この障壁を回避するため、特定の実施形態は、ＮＰが腫瘍内のＴＡＭの大集団にヌクレオチドを送達するように、増強された拡散率を有するナノ粒子（ＮＰ）を利用する。特定の実施形態は、中性表面電荷を担うサイズが＜１３０ｎｍのＮＰを利用する。特定の実施形態は、ＮＰの表面に結合されたターゲティングリガンドをさらに含むことができる。例えば、ジマンノースをＮＰ表面に結合させて、ＴＡＭ細胞表面上で発現されるマンノース受容体（ＣＤ２０６）へのさらに選択的なターゲティングを可能にすることができる。標的にすることができる他のＴＡＭ細胞表面受容体は、初期増殖応答タンパク質２（Ｅｇｒ２）、ＣＤ１６３、ＣＤ２３、インターロイキン（ＩＬ）２７ＲＡ、ＣＬＥＣ４Ａ、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ９３、ＣＤ２２６、ＩＬ１３−Ｒａ１、ＩＬ−４ｒ、ＩＬ−１Ｒ ＩＩ型、デコイＩＬ−１Ｒ ＩＩ型、ＩＬ−１０ｒ、マクロファージスカベンジャー受容体Ａ及びＢ、Ｙｍ−１、Ｙｍ−２、低密度受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、ＩＬ−６ｒ、ＣＸＣＲ１／２、及びＰＤ−Ｌ１を含む。
特定の実施形態において、本明細書に開示されるシステム及び方法は、粒子の投与を必要とする対象に粒子を投与することを含む。粒子は対象の腫瘍に存在するマクロファージに向けられ、マクロファージにより内部移行されるように設計される。内部移行された後、粒子は、ＩＲＦ５とＩＫＫβをコードする配列を有する１つ以上のヌクレオチドをさらに送達する。１つ以上のヌクレオチドは、ＩＲＦ５とＩＫＫβを発現するようにマクロファージを改変する。理論に縛られることはなく、ＩＫＫβキナーゼはリン酸化によりＩＲＦ５転写因子を活性化する。次に、活性化されたＩＲＦ５は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３を含む炎症性サイトカイン、並びに、腫瘍抑制因子の発現を引き起こす。ＩＲＦ５とＩＫＫβをコードする１つ以上のヌクレオチドを内部移行させたＭ２マクロファージにおいて、ＩＲＦ５作用を通じた前述の遺伝子の発現は、マクロファージのＭ２表現型からＭ１表現型への表現型又は機能的転換をもたらし、これによりマクロファージが腫瘍細胞を殺滅する又は腫瘍細胞の破壊を他の方法でトリガーさせ、それによって、がんを処置することが可能になる。特定の実施形態において、粒子は食作用によりマクロファージに内部移行される。特定の実施形態において、粒子は、リガンド媒介エンドサイトーシス（例えば、ＣＤ−２０６媒介エンドサイトーシス）によりマクロファージに内部移行される。特定の実施形態において、ＩＲＦ５とＩＫＫβ遺伝子を含む粒子のマクロファージ中への送達は、例えば、（１）マクロファージへの結合、（２）マクロファージによる粒子の内部移行、（３）内部移行後の細胞内小胞から細胞質中への逃避、（４）１つ以上のヌクレオチドの放出、（５）このヌクレオチドはマクロファージの核中に輸送することができ、（６）転写されてＩＲＦ５とＩＫＫβを発現するための遺伝子を送達する。
本開示の態様は今や以下の通りにさらに詳細に説明される：（１）マクロファージ及びマクロファージ表現型；（２）マクロファージ極性化に影響を及ぼす細胞経路；（３）活性化制御因子をコードするヌクレオチド；（４）ヌクレオチドを送達する粒子；（５）さらに選択的にヌクレオチドを送達するターゲティングリガンド；（６）粒子を含む医薬組成物；（７）使用方法；並びに（８）実験的実施例。
（１）マクロファージ及びマクロファージ表現型。「マクロファージ」とは、骨髄由来単球から分化した免疫系の白血球のことである。マクロファージは、その食細胞活動及びその抗原提示能力により特徴付けられる。マクロファージは、自然及び適応免疫応答の両方において重要な役割を担う。表現型的には、マクロファージは表面マーカーＦ４／８０（Ｌｙ７１）を発現し、ＣＤｌｌｂ（Ｍａｃｌ）、ＣＤｌｌｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４０又はＣＤ６８などの他の表面マーカーを発現することもある。
マクロファージは、Ｔリンパ球を活性化することにより、自然及び適応免疫の両方において重要な役割を果たす。がんにおいて、マクロファージは、固体腫瘍に関連する浸潤性白血球の大集団の１つである（Ｇｏｒｄｏｎ Ｓ＆Ｔａｙｌｏｒ ＰＲ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（１２）：９５３〜９６４頁）。マクロファージは、周辺組織から又は走化性分子の分泌を通じて腫瘍そのものにより腫瘍部位へ動員することができる。マクロファージは、その表現型に応じて、極性化した様式で腫瘍に対する免疫応答に関与する。「表現型」は、遺伝子型と環境の相互作用の結果としての細胞の物理的属性又は生化学的特徴を指すのに本明細書において使用され、細胞の機能を含むことができる。
Ｔｈ１ Ｔリンパ球を活性化するマクロファージは、炎症応答を与え、Ｍ１極性化又は「古典的活性化」表現型を有するとして表されることが多い。活性化状態のマクロファージ（すなわち、Ｍ１マクロファージ又はＭ１表現型を有するマクロファージ）は、「キラーマクロファージ」とも呼ばれるが、細胞増殖を阻害し、組織損傷を引き起こし、病原体に対する抵抗を媒介し、強力な殺腫瘍活性を有する。これらのマクロファージは、抗原提示及び同時刺激の原因であるメディエーターの発現を増加することができ；腫瘍領域への好中球の浸潤が促進されると、好中球標的化腫瘍退縮がもたらされる。Ｍ１表現型は、適切な対照状態と比べると抗原提示の増加により証明することもできる。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、活性酸素種（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）のＭ１マクロファージ生成により証明することができる。ＮＯは、病原体及び腫瘍細胞のような異常な細胞に対する防御に不可欠な抗増殖効果を有する。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、ＩＬ−１２などのサイトカインの産生を通じてＴｈ１免疫を誘導する炎症誘発性状態により証明することができる。特定の実施形態において、活性化状態のマクロファージは、古典的には、病原体を貪食することができる活性化マクロファージである。
機能以外に、Ｍ１表現型は、マクロファージにより発現される表面マーカー；極性化によりマクロファージにより産生される因子、タンパク質、若しくは化合物；又は極性化の時にマクロファージにより誘導される遺伝子により証明することもできる。Ｍ１極性化は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ｉＮＯＳ、サイトカインシグナル伝達抑制因子３（ＳＯＣＳ３）、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、Ｉ型ＩＦＮ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０の発現により証明される表現型をもたらすことができる。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、ＣＤ８０の発現の増加を含む。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、ＣＤ２０６−、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ−、及びＣＤ１１ｂ＋を含む。
一方、Ｔｈ２ Ｔリンパ球を活性化するマクロファージは抗炎症応答を与え、「Ｍ２」表現型を有すると示されることが多い。不活性化状態であるマクロファージ（すなわち、Ｍ２マクロファージ又はＭ２表現型を有するマクロファージ）は、「修復マクロファージ」とも呼ばれるが、メタゾア寄生体封じ込め、細胞増殖、組織修復、腫瘍進行、抗炎症経路、及び免疫抑制に関与している。Ｍ２表現型は、適切な対照状態と比べると抗原提示を減らし、食作用を減少することができる。Ｍ２表現型は、例えば、アルギナーゼ１（Ａｒｇ１（アルギナーゼ活性は増殖促進性効果及び組織修復応答に関連している）、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＰＰＡｒγ、ＫＬＦ４、ＣＤ２０６（ＭＲＣ１）、デクチン−１（シグナル伝達非ＴＬＲパターン認識受容体）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（Ｃ型レクチン）、スカベンジャー受容体Ａ、スカベンジャー受容体Ｂ−１、ＣＤ１６３（ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体に対する高親和性スカベンジャー受容体）、ケモカイン受容体ＣＣＲ２、ＣＸＣＲ１、及びＣＸＣＲ２、ＹＭ１（キチナーゼ３様３）、及びＦｉｚｚ１の１種以上の発現；並びに、ケモカインＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４の分泌により証明することもできる。特定の実施形態において、不活性化状態のマクロファージは転移及び／又は化学療法に対する抵抗を促進する。特定の実施形態において、Ｍ２表現型は、ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ−、ＣＤ１１ｃ＋、及びＣＤ１１ｂｌｏｗを含む。
表１は、Ｍ１表現型とＭ２表現型（Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ及びＭ２ｄと命名されるサブ表現型を含む）を区別するのに使用することができる基準の特定の組合せを提供する。
Figure 2021512056
マクロファージ表現型を評価するためのアッセイは、Ｍ１又はＭ２表現型に特有の異なる分子シグネチャーを利用することができる。Ｍ１マクロファージについて一般的に認められたマーカープロファイルはＣＤ８０＋であり、Ｍ２−マクロファージはＣＤ１６３＋と見なすことができる。したがって、フローサイトメトリーを実施すれば、これらのマーカーについて評価することができる。マクロファージをＭ１タイプの方に近づけＭ２タイプから遠ざけることは、ＩＬ−１２／ＩＬ−１０比又はＣＤ１６３−／ＣＤ１６３＋マクロファージ比の増加を測定することにより、評価することもできる。特定の実施形態において、Ｍ１対Ｍ２形態は、光学顕微鏡により評価することができる。特定の実施形態において、食作用アッセイは、マクロファージがＭ１タイプなのかＭ２表現型なのかを評価する他のアッセイと併せて使用してもよい。異なるマクロファージ集団の食作用アッセイは、貪食される実体をマクロファージと一緒に細胞あたりの正規化された全表面積と一致する濃度でインキュベートすることにより実施してもよい。貪食される実体をマクロファージ培養物に添加してもよい。貪食される実体は、例えば、蛍光ラベルで標識してもよい。食作用インデックスは、マクロファージあたり測定された全蛍光強度中央値により決定してもよい。食作用の定量化は、例えば、フローサイトメトリーによって行ってもよい。腫瘍細胞殺滅アッセイを利用してもよい。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、セルピンＢ２（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の阻害剤）、ＣＣＬ２（Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２）、ＣＣＬ１１（Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１）、及びＲｅｔｎｌａ（レジスチン様アルファ；Ｆｉｚｚ１）を含むシグネチャーＭ２マクロファージ遺伝子の発現の減少を含む。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、ＣＣＬ５（Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド５）を含むＭ１分化遺伝子の発現の増加を含む。
遺伝子発現（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６及び／又は上記の他の遺伝子のＭ１発現）は当業者には周知であるアッセイによって測定することができる。遺伝子発現を測定する方法は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）発現アッセイ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む。遺伝子発現産物、例えば、タンパク質レベルを測定する方法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチアッセイ、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織染色、免疫電気泳動、免疫沈澱、及び抗体又はタンパク質結合剤などの検出試薬を使用する免疫蛍光を含む。
（２）マクロファージ極性化に影響を及ぼす細胞経路。活性化又は不活性化表現型に向かうマクロファージの極性化は、マクロファージといくつかの異なる分子又は環境との相互作用から生じる。例えば、Ｍ１マクロファージ極性化は、トール様受容体（ＴＬＲ）リガンド（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド、リポテイコ酸、イミキモド、ＣｐＧ）、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む刺激によりトリガーされる。Ｍ２極性化マクロファージは、極性化を惹起する刺激に応じて、サブセットに分割することができ：Ｍ２ａサブセットはＩＬ−４、ＩＬ−１３又は真菌及び蠕虫感染により誘発され；Ｍ２ｂはＩＬ−１受容体リガンド、免疫複合体及びＬＰＳにより誘発され；Ｍ２ｃはＩＬ−１０、ＴＧＦ−β及びグルココルチコイドにより誘発され；Ｍ２ｄはＩＬ−６及びアデノシンにより誘発される。Ｍ２マクロファージ極性化は、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、補体成分、及びアポトーシス細胞によりトリガーされる場合もある。マクロファージ極性化は、低酸素などの局所的微小環境状態によっても調節される。
前述の分子及び環境は、転写因子を含む異なる細胞内シグナル伝達経路をトリガーさせることによりマクロファージ極性化に影響を及ぼす。Ｍ１とＭ２極性化の両方に関与している転写因子は、ＩＲＦ、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）、ＳＯＣＳ３タンパク質、及び活性化Ｂ細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦκＢ）を含む。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）も、マクロファージ機能をＭ１又はＭ２表現型の方に向けるのに役割を果たしている。
ＩＲＦ／ＳＴＡＴ経路は、上で考察したＩＦＮ及びＴＬＲシグナル伝達などの刺激により活性化されるが、マクロファージを、ＳＴＡＴ１を経てＭ１活性状態に極性化する。一方、ＩＬ−４及びＩＬ−１３などの刺激は、マクロファージを、ＳＴＡＴ６を経てＭ２活性状態の方にそらす（Ｓｉｃａ Ａ＆Ｂｒｏｎｔｅ Ｖ（２００７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：１１５５〜１１６６頁）。したがって、これらのシグナル伝達イベントは、Ｍ１マクロファージ極性化の場合、炎症性免疫応答及び殺腫瘍活性を促進する、又はＭ２マクロファージ極性化の場合、免疫抑制性腫瘍促進応答を促進する。
Ｍ１表現型の誘導に関係するいくつかの細胞内分子は、Ｇタンパク質共役型受容体、Ｐ２Ｙ（２）Ｒ、これはＮＯＳ２を経てＮＯを誘導するのに役割を果たし（Ｅｕｎ ＳＹら、（２０１４）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ １８：２７０〜２７６頁）；ＳＯＣＳ３、これはＮＦκＢ／ＰＩ−３キナーゼ経路を活性化してＮＯを生成し（Ａｒｎｏｌｄ ＣＥら、（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４１：９６〜１１０頁）；並びに成長及び分化因子アクチビンＡ、これはＭ１マーカーを促進しＩＬ−１０を下方調節する（Ｓｉｅｒｒａ−Ｆｉｌａｒｄｉ Ｅら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７：５０９２〜５１０１頁）、を含む。
Ｍ１表現型の誘導に関与する他の細胞内分子はＩＲＦを含む。ＩＲＦは、ＩＦＮのウイルス媒介活性化、並びに細胞成長、分化、アポトーシス、及び免疫系活性の調節を含む、多様な役割を有する転写因子のグループである。ＩＲＦファミリーのメンバーは、トリプトファン（Ｗ）リピートを含有する保存されたＮ末端ＤＮＡ結合ドメインを特徴とする。
ＩＲＦ５は、ヘリックスターンヘリックスＤＮＡ結合モチーフを有しウイルス−及びＩＦＮ誘導シグナル伝達経路を媒介する転写因子である。ＩＲＦ５は、マクロファージが炎症を促進する又は阻害するかを制御する分子スイッチとして作用する。ＩＲＦ５は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２及びＩＬ−２を含む炎症性サイトカイン、及び腫瘍抑制因子、並びにＴｈ１及びＴｈ１７応答を活性化する。ＩＲＦ５は、染色体７ｑ３２に位置するヒトＩＲＦ５遺伝子（ＯＭＩＭ ＩＤ ６０７２１８）によりコードされている。ＩＲＦ５のいくつかのアイソフォーム／転写変異体が存在することが認識されている。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ５のアイソフォームは、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８−１、配列番号１）、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８−２、配列番号２）、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８−３、配列番号３）、アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８−４、配列番号４）、アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８−５、配列番号５）及びアイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８−６、配列番号６）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ５のアイソフォームは、配列番号２３に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム１、配列番号２４に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム２、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム３、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム４、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム５、及び配列番号２８に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム６を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ５は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ５は配列番号２９に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。Ｍ１マクロファージはＩＲＦ５を上方調節することが明らかにされている。
ＩＲＦ１及びＩＲＦ８も、ＩＦＮγなどの炎症誘発性シグナルによるマクロファージの活性化を含む、骨髄系細胞の発生及び機能に極めて重要な役割を果たす、Ｄｒｏｒ Ｎら、（２００７）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４（４）：３３８〜３４６頁。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ１は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ１は、配列番号３０に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ１は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ１は、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ８は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ８は、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ８は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ８は、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
ＩＲＦ３はＩＲＦ１及びＩＲＦ２の相同体である。ＩＲＦ３は、ＮＥＳ、ＤＢＤ、Ｃ末端ＩＲＦ会合ドメイン及びいくつかの調節リン酸化部位を含む、いくつかの機能的ドメインを含有する。ＩＲＦ３は、セリン／スレオニンリン酸化すると、転写共役因子であるＣＲＥＢ結合タンパク質と複合体を形成する不活性細胞質形態で見出される。この複合体は核に移動し、ＩＦＮ−α及び−β、並びに他のインターフェロン誘導遺伝子の転写を活性化する。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ３のアイソフォームは、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３−１）、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３−２）、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３−３）、アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３−４）、及びアイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３−５）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１は、配列番号３１に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ３は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ３は、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
ＩＲＦ７は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の転写活性化において役割を果たすことが明らかにされている。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ７のアイソフォーム１は、アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５−１）、アイソフォームＢ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５−２）、アイソフォームＣ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５−３）、及びアイソフォームＤ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５−４）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡは、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ７は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ７は、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
ＩＲＦ活性化に寄与する１つ以上のＩＲＦ突然変異体も使用してもよい。例えば、アミノ酸残基Ｓ４２５、Ｓ４２７、Ｓ４３０、Ｓ４３６をアスパラギン酸残基などのリン酸化を模倣する残基で置換するＩＲＦ５（アイソフォーム４、配列番号４）のヒト変異体３／変異体４のリン酸化模倣突然変異体（Ｃｈｅｎ Ｗら、（２００８）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１５（１１）：１２１３〜１２２０頁）；アミノ酸残基Ｔ１０、Ｓ１５８、Ｓ３０９、Ｓ３１７、Ｓ４５１、及び／又はＳ４６２をアスパラギン酸残基などのリン酸化を模倣する残基で置換するＩＲＦ５（アイソフォーム２、配列番号２）のヒト変異体５のリン酸化模倣突然変異体（Ｃｈａｎｇ Ｆｏｒｅｍａｎ Ｈ−Ｃら、上記参照）；ＩＲＦ５の構成的核集積のための、ヒトＩＲＦ５アイソフォームａ（変異体１、アイソフォーム３、配列番号３）及びアイソフォームｂ（変異体２、アイソフォーム１、配列番号１）残基Ｓ１５６、Ｓ１５８及びＴ１６０からアスパラギン酸残基などのリン酸化を模倣する残基への突然変異（Ｌｉｎ Ｒら、（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（４）：３０８８〜３０９５頁）；並びにＩＲＦ３のアミノ酸残基Ｓ３９６をアスパラギン酸などのリン酸化を模倣する残基で置換するＩＲＦ３リン酸化模倣突然変異体（Ｃｈｅｎ Ｗら、上記参照）。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ７／ＩＲＦ３の融合タンパク質は、ＩＲＦ３会合ドメイン（配列番号１５）において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ（Ｄ）突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位置を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照；Ｌｉｎら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：６３４２〜６３５３頁）。特定の実施形態において、ＩＲＦ３会合ドメインにおいて４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＤ突然変異を含むマウスＩＲＦ７／ＩＲＦ３の融合タンパク質は、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列によりコードされている。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ８突然変異体は、アミノ酸残基３１０のリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）での置換を含む（配列番号１７）。特定の実施形態において、アミノ酸残基３１０のＫのＲでの置換を含むマウスＩＲＦ８突然変異体は、配列番号３９に示されるヌクレオチド配列によりコードされている。主にＫ３１０でＩＲＦ８に結合している低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）は、ＩＲＦ８応答性遺伝子の活性化を阻害する。セントリン特異的プロテアーゼ１（ＳＥＮＰ１）はＳＵＭＯ２／３を標的にする。ＳＥＮＰ１の活性は、ＩＲＦ８（及び他のタンパク質）を「脱ＳＵＭＯ化し」、ＩＲＦ８にＭ１マクロファージ分化の抑制因子から活性化因子に（直接的に及びトランスアクチベーション活性を通じて）進ませる。Ｋ３１０残基の突然変異によりＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げると、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写が２〜５倍増加する（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、（２０１２）上記参照）。
本開示の特定の実施形態は、操作されたＩＲＦ転写因子を含む。特定の実施形態において、操作されたＩＲＦ転写因子は、機能する自己抑制的ドメインを欠き、したがって、フィードバック不活性化に非感受性であるＩＲＦを含む（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：２６２２頁）。例えば、活性の増加が２〜３倍であるヒトＩＲＦ５は、ヒトＩＲＦ５タンパク質のアミノ酸４８９〜５３９を欠失させることにより得ることができる（Ｂａｒｎｅｓら、（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２：５７２１〜５７４０頁）。特定の実施形態において、Ｍ２表現型を促進する転写因子である、ＩＲＦ４の自己抑制的ドメインを欠失させる又は突然変異させると、自己免疫疾患を処置するという文脈においてさらに活性なＩＲＦ４を作成することができる。特定の実施形態において、ＩＲＦの自己抑制的ドメインは、ＩＲＦタンパク質のカルボキシ末端で見出せる。特定の実施形態において、操作されたＩＲＦ転写因子は、核においてＩＲＦを捕捉し、したがって、転写を増強する１つ以上の機能する核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠くＩＲＦを含む。例えば、ヒトＩＲＦ５の核集積は、２つのロイシン残基をアラニンで置き換える（Ｌ１５７Ａ／Ｌ１５９Ａ）ことによってヒトＩＲＦ５のＮＥＳを突然変異することにより達成可能である（Ｌｉｎら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：６３４２〜６３５３頁）。特定の実施形態において、操作されたＩＲＦ転写因子は、１つ以上のＩＲＦの融合体、１つ以上のＩＲＦの断片の融合体、及び突然変異したＩＲＦの融合体を含む。
ＮＦκＢも、マクロファージＭ１活性化に関係する重要な転写因子である。ＮＦκＢは、ＴＮＦα、ＩＬ１Ｂ、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）、ＩＬ−６、及びＩＬ１２ｐ４０を含む多数の炎症性遺伝子の発現を調節する。ＮＦκＢ活性は、カッパＢキナーゼ（ＩＫＫ）三量体複合体（２つのキナーゼ、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、及び調節タンパク質、ＩＫＫγ）の阻害因子の活性化を経て調節される。上流シグナルがＩＫＫ複合体で収束すると、これらのシグナルは先ずリン酸化を経てＩＫＫβキナーゼを活性化し、活性化されたＩＫＫβはカッパＢの阻害因子（Ｉ−κＢ）である、阻害性分子をさらにリン酸化する。これにより、Ｉ−κＢがプロテアソーム分解され、ＮＦκＢ／Ｉ−κＢ複合体からＮＦκＢ ｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体が放出される。次に、ＮＦκＢ ｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体は核に移動されて、炎症性遺伝子のプロモーターに結合する。
ＩＫＫβは、ＮＦκＢ並びにＩＲＦ５などの他の転写因子に対する活性化キナーゼである。ＩＫＫβは同様に、ＦＯＸＯ３、ＮＣＯＡ３、ＢＣＬ１０、ＩＲＳ１、ＮＥＭＯ／ＩＫＢＫＧ、ＮＦκＢサブユニットＲＥＬＡ及びＮＦＫＢ１を含む他のいくつかのシグナル伝達経路成分、並びにＩＫＫ関連キナーゼＴＢＫ１及びＩＫＢＫＥをリン酸化する。特定の実施形態において、ヒトＩＫＫβのアイソフォームは、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｏ１４９２０−１、配列番号１８）、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｏ１４９２０−２、配列番号１９）、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｏ１４９２０−３、配列番号２０）、アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｏ１４９２０−４、配列番号２１）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＫＫβのアイソフォームは、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム１、配列番号４１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム２、配列番号４２に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム３、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム４を含む。特定の実施形態において、マウスＩＫＫβは配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＫＫβは配列番号４４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
本開示は、ＩＲＦを活性化して、腫瘍殺滅のための活性化状態へのＴＡＭ再プログラミングをもたらすことができる１種以上の分子と一緒のＩＲＦ転写因子の共発現を提供する。特定の実施形態において、共発現戦略は、ＩＲＦ５とＩＫＫβの共発現；ＩＲＦ５とＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ−１）、ＴＮＦ受容体会合因子６（ＴＲＡＦ６）アダプター、受容体相互作用タンパク質２（ＲＩＰ２）キナーゼ、及び／又はＮＦκＢキナーゼε（ＩＫＫε）の共発現（Ｃｈａｎｇ Ｆｏｒｅｍａｎ Ｈ−Ｃら、（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（３）：ｅ３３０９８）；ＩＲＦ５とタンパク質キナーゼＤＮＡ−ＰＫの共発現（Ｒｙｚｈａｋｏｖ Ｇら、（２０１５）Ｊ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ＆Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ３５（２）：７１〜７８頁）；ＩＲＦ５とタンパク質キナーゼチロシンキナーゼＢＣＲ−ＡＢＬの共発現（Ｍａｓｓｉｍｏ Ｍら、（２０１４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３５（５）：１１３２〜１１４３頁）；並びにＩＲＦ５又はＩＲＦ８とＣＯＰ９シグナロソームの１つ以上の成分の共発現（Ｋｏｒｃｚｅｎｉｅｗｓｋａ Ｊら、（２０１３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３３（６）：１１２４〜１１３８頁；Ｃｏｈｅｎ Ｈら、（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（５０）：３９０８１〜３９０８９頁）を含む。
特定の実施形態において、本開示の教えは、過免疫活性化（例えば、自己免疫疾患）によりトリガーされる状態の管理に適用することができる。マクロファージは、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、及びシェーグレン症候群などの自己免疫疾患において重要な役割を果たしている（Ｕｓｈｉｏら、Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７；７（１）：１〜８頁）。したがって、免疫抑制性Ｍ２表現型を支援する細胞経路も説明される。
Ｍ２表現型の誘導に関係している活性化制御因子は、クルッペル様因子４（ＫＬＦ−４）である。ＫＬＦ−４はＳＴＡＴ６と協調して、Ａｒｇ−１、ＣＤ２０６（Ｍｒｃ１、マンノース受容体）、Ｆｉｚｚ１（レジスチン様α）及びペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡｒγ）などのＭ２遺伝子を誘導し、ＴＮＦα、Ｃｏｘ−２、ＣＣＬ５及びｉＮＯＳなどのＭ１遺伝子を阻害する。核内受容体ＰＰＡＲγは、Ｍ２表現型の酸化的代謝及び活性化に関与している遺伝子を調節することが明らかにされている（Ｏｄｅｇａａｒｄ ＪＩら、（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４７：１１１６〜１１２０頁）。
サイトカインＩＬ−２１は、ＮＯＳ２発現を減らしＳＴＡＴ３リン酸化を増やすことによりＭ２極性化を媒介する（Ｌｉ ＳＮら、（２０１３）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ ２０１３年、５４８０７３頁）。
ＩＲＦ４はＴＬＲシグナル伝達をＭｙＤ８８非依存的様式で負に調節してＭ２表現型を駆動する（Ｓａｔｏｈ Ｔら、（２０１０）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１、９３６〜９４４頁）。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ４はＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１５３０６である。ＢＭＰ−７も、ＳＭＡＤ−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ経路の活性化を経てＭ２極性化をインビトロで誘導する（Ｒｏｃｈｅｒ Ｃら、（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８：ｅ８４００９）。
転写因子グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）。ＧＩＬＺは、種々の細胞型においてグルココルチコイド（ＧＣ）作用を媒介するデキサメタゾン誘導性遺伝子であり、この遺伝子は抑制性Ｍ２マクロファージ表現型を誘導することができる。ＧＩＬＺ発現はＧＣにより急速に遍在的に誘導され、タンパク質産物は、ＮＦ−κＢ、Ｒａｆ−１、ＴＯＲＣ２、ＡＰ−１、Ｒａｓ、及びＣ／ＥＢＰなどの既知の転写因子と相互作用して、炎症誘発性遺伝子の発現を阻害する。したがって、ＧＩＬＺは、有害な効果を回避しつつ、ＧＣの治療的抗炎症効果を模倣することができると考えられる（Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ， Ｓ．ら、Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）２０１５年；６：１７０）。特定の実施形態において、ＧＩＬＺは、配列番号１１０に示されるアミノ酸配列のヒトＧＩＬＺである。特定の実施形態において、ＧＩＬＺは、配列番号１１１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるヒトＧＩＬＺである。
示されるように、低酸素も、低酸素誘導性因子ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２αを通じてマクロファージ極性化に影響を及ぼす。ＨＩＦ−１αは、ＮＯＳ２発現を調節しＭ１表現型の出現を支援し、ＨＩＦ−２αはＡｒｇ１発現を調節してＭ２表現型の出現を支援する（Ｔａｋｅｄａ Ｎら、（２０１０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２４：４９１〜５０１頁）。
Figure 2021512056
（３）ヌクレオチド。本開示内において、活性状態を調節する遺伝子をコードするヌクレオチドは免疫細胞に送達される。「遺伝子」とは、活性化制御因子をコードするヌクレオチド配列のことである。この定義は、種々の配列多型、突然変異、及び／又は配列変異体を含み、そのような変更は活性化制御因子の機能に影響を及ぼさない。用語「遺伝子」は、コード配列だけでなく、プロモーター、エンハンサー、及び終結領域などの調節領域も含んでいてよい。この用語は、ｍＲＮＡ転写物からスプライスされたすべてのイントロン及び他のＤＮＡ配列を、選択的スプライシング部位から生じる変異体と共にさらに含むことができる。活性化制御因子をコードするヌクレオチド配列は、活性化制御因子の発現を指示するＲＮＡが可能である。これらのヌクレオチド配列は、特定の実施形態で、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列を含む。特定の実施形態において、当業者であれば、チミン（Ｔ）塩基を含むＤＮＡ配列は、Ｔ塩基がウラシル（Ｕ）塩基で置き換えられることを除いて、同じ配列を有するｍＲＮＡ配列と等価であることが可能であることを認識できる。ヌクレオチド配列は、完全長ヌクレオチド配列並びに完全長タンパク質に由来する非完全長配列の両方を含む。配列は、特定の免疫細胞においてコドン選択を提供するように導入しうる天然の配列（単数又は複数）の縮重コドンも含むことができる。本明細書に記載される活性化制御因子をコードする遺伝子配列は一般に公開されているデータベース及び出版物において入手可能である。「コードする」とは、活性化制御因子の合成のために鋳型の役割をするプラスミド、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのヌクレオチドの配列の特性のことである。
特定の実施形態において、ヌクレオチドは合成ｍＲＮＡを含む。特定の実施形態において、合成ｍＲＮＡは、５’−キャッピングを使用して細胞内安定性を増やすように操作される。複数の異なる５’−キャップ構造を使用すれば、合成ｍＲＮＡ分子の５’−キャップを作成することができる。例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは５’−５’−三リン酸グアニン−グアニン結合を含有し、そこでは１つのグアニンがＮ７メチル基並びに３’−Ｏ−メチル基を含有する。合成ｍＲＮＡ分子は、５’−キャップ構造を作成する原因となる酵素を使用して転写後にキャップしてもよい。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの最も５’側の末端ヌクレオチドとグアニンヌクレオチドの間に標準的な５’−５’−三リン酸結合を生み出すことができ、そこにおいてグアニンはＮ７メチル化を含有し最後の５’−ヌクレオチドはＣａｐ１構造を生み出す２’−Ｏ−メチルを含有する。これにより、さらに高い翻訳能力及び細胞安定性を有するキャップが生じ、並びに細胞炎症性サイトカインの活性化が低下する。
特定の実施形態において、免疫原性を減し、ｍＲＮＡの安定性を促進し、及び／又はｍＲＮＡの翻訳を促進するための合成ｍＲＮＡの他の改変は、５’−及び３’−末端非翻訳領域（ＵＴＲ）、５’ＵＴＲにおけるコザック翻訳開始配列、改変されたリボヌクレオシド、及び／又はポリＡテイルを含むことができる。特定の実施形態において、改変されたリボヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、２−チオウリジン（２ｓＵ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、及びＮ−１−メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含むことができる。特定の実施形態において、ＵＴＲはアルファ−及び／又はベータグロビンＵＴＲを含むことができる。合成ｍＲＮＡを作成する特定の実施形態は、対応するＤＮＡプラスミドからＰＣＲ増幅により５’Ｔ１００〜２５０オーバーハングを有する所望のタンパク質のコードＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ鋳型を作成することを含む。次に、ＤＮＡ鋳型を使用すれば、インビトロ転写反応によりｍＲＮＡを作成することができる。インビトロ転写中、５’キャップ構造（例えば、ＡＲＣＡ）、改変されたリボヌクレオシド、及び／又は３’ポリ（Ａ）テイルを組み込むことができる。例えば、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（商標） Ｓｙｓｔｅｍ Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標） Ｔ７高収率転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、及びＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標） Ｔ７インビトロ転写キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）からを含むいくつかのインビトロ転写システムが市販されている。特定の実施形態において、合成ｍＲＮＡは、核酸を合成している企業（例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が合成可能である。
合成ｍＲＮＡ又は他のヌクレオチドは環状にしてもよい。そのようなヌクレオチドは環状化する又はコンカテマー化して、ポリＡ結合タンパク質と５’−末端結合タンパク質の間の相互作用を支援する翻訳能力のある分子を作成してもよい。環状化又はコンカテマー化の機構は、少なくとも３つの異なる経路：１）化学的、２）酵素的、又は３）リボザイム触媒された、を通じて起こりうる。新たに形成された５’−／３’−結合は、分子内でも分子間でもよい。
第１の経路において、ヌクレオチドの５’−末端及び３’−末端は、互いに接近すると分子の５’−末端と３’−末端の間に新たな共有結合を形成する化学反応性基を含有してよい。有機溶媒中でヌクレオチド分子の３’−末端の３’−アミノ末端ヌクレオチドが５’−ＮＨＳエステル部分に求核攻撃を受け新たな５’−／３’−アミド結合を形成するように、５’−末端はＮＨＳエステル反応性基を含有してよく、３’−末端は３’−アミノ末端ヌクレオチドを含有してよい。
第２の経路において、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用して５’−リン酸化ヌクレオチド分子を核酸の３’−ヒドロキシル基に酵素的に連結させて新たなホスホジエステル結合を形成してもよい。例となる反応では、１μｇの核酸分子を、１〜１０ユニットのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）と製造業者のプロトコールに従って３７℃で１時間インキュベートすることができる。ライゲーション反応は、並置した５’−と３’−領域の両方と塩基対合して酵素的ライゲーション反応を支援することができるスプリットオリゴヌクレオチドの存在下で起こりうる。
第３の経路において、ｃＤＮＡ鋳型の５’−又は３’−末端は、インビトロ転写中に、得られるヌクレオチド分子が、核酸分子の５’−末端を核酸分子の３’−末端にライゲートすることができる活性なリボザイム配列を含有できるように、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイム由来でもよく、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化）により選択してもよい。リボザイムリガーゼ反応は０〜３７℃の温度で１〜２４時間かかる可能性がある。
特定の実施形態において、ヌクレオチドは、例えば、活性化制御因子を発現するための配列（例えば、遺伝子）を含むことができるプラスミド、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを含む。適切なプラスミドは、標準プラスミドベクター及び遺伝子をリンパ球に移送するのに使用することができるミニサークルプラスミドを含む。ヌクレオチド（例えば、ミニサークルプラスミド）は、改変された細胞における一過性発現を促進するための任意の追加的配列情報をさらに含むことができる。例えば、ヌクレオチドは、ジェネラルプロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、及び／又は細胞質に特異的なプロモーターなどのプロモーターを含むことができる。示されるように、プロモーター及びプラスミド（例えば、ミニサークルプラスミド）は、当技術分野において一般に周知であり、従来の技法を使用して調製することができる。
特定の実施形態において、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、他のＩＲＦをコードする１つ以上の追加のヌクレオチドと組み合わせて使用される。特定の実施形態において、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、他のＩＲＦをコードする１つ以上の追加のヌクレオチドと及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドと組み合わせて使用される。特定の実施形態において、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドと、０．５対１、１対１、２対１、３対１、４対１、５対１の比で組み合わせて使用される。特定の実施形態において、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドと、３対１の比で組み合わせて使用される。
特定の実施形態は、遺伝子編集システム内にヌクレオチドを送達することができる。遺伝子編集システムは、細胞の内在性ゲノムの特定の配列を改変する又はこれに影響を及ぼす。ゲノム編集システムは、標的化ゲノム編集、例えば、遺伝子破壊、相同組換えによる遺伝子編集、及びヒトゲノム内の適切な染色体標的部位に治療遺伝子を挿入する遺伝子療法に有用である。
特定の実施形態は、遺伝子編集システムとして転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を利用する。ＴＡＬＥＮとは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインを含む融合タンパク質のことである。ＴＡＬＥＮを使用して、ＤＮＡ中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することにより遺伝子及びゲノムを編集し、この切断により細胞において修復機構が誘導される。一般的に、２つのＴＡＬＥＮは、二量体化してＤＳＢを誘導するためにＤＮＡ切断ドメインのための標的ＤＮＡ部位のそれぞれの側に結合して隣接しなければならない。ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により又は外来性二本鎖ドナーＤＮＡ断片との相同組換え（ＨＲ）により細胞内で修復される。
示されるように、ＴＡＬＥＮは、例えば、内在性ゲノムの標的配列に結合し、標的配列の位置でＤＮＡを切断するように操作されてきた。ＴＡＬＥＮのＴＡＬＥは、サンドモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌により分泌されるＤＮＡ結合タンパク質である。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、高度に保存された３３又は３４個のアミノ酸リピートを含み、それぞれのリピートの１２番目及び１３番目位には多様な残基を抱えている。これら２つの位置は、リピート可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）と呼ばれるが、特定のヌクレオチド認識と強い相関関係を示す。したがって、ターゲティング特異性は、ＲＶＤにおいてアミノ酸を変え従来にないＲＶＤアミノ酸を組み込むことにより改善することができる。
ＴＡＬＥＮ融合体において使用可能なＤＮＡ切断ドメインの例は、野生型及び変異Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼである。Ｆｏｋｌドメインは、標的配列上の部位のための独特のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする二量体として機能する。Ｆｏｋｌ切断ドメインは、２つの逆位半部位を分離する５つ又は６つの塩基対スペーサー配列内で切断する。
特定の実施形態は、遺伝子編集システムとしてＭｅｇａＴＡＬを利用する。ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥがメガヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインと融合している一本鎖希少切断ヌクレアーゼ構造を有する。メガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られるが、同じドメインにおいてＤＮＡ認識とヌクレアーゼ機能の両方を有する単一ペプチド鎖である。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｍｅｇａＴＡＬは機能的活性のために単一ペプチド鎖の送達だけを必要とする。
特定の実施形態は、遺伝子編集システムとして亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を利用する。ＺＦＮは、特定の位置でＤＮＡに結合して切断するように操作された部位特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＺＦＮは、ＺＦＮが種々の異なる細胞においてゲノム内の独特の配列を標的にすることを可能にするＤＮＡ配列中の特定の部位にＤＳＢを導入するのに使用される。さらに、二本鎖切断に続いて、相同組換え又は非相同末端結合が起きてＤＳＢを修復し、こうしてゲノム編集を可能にする。
ＺＦＮは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより合成される。ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子である３〜６つの亜鉛フィンガータンパク質を含む。ＤＮＡ切断ドメインは、例えば、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含む。
ガイドＲＮＡは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムなどの遺伝子編集システムと一緒に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲリピート及びＣＲＩＳＰＲ会合遺伝子（Ｃａｓ）のセットを含む。
一般に、送達されたヌクレオチドの機能的発現をもたらすことができるいかなるシステムも、本開示内で使用することができる。しかし、特定の実施形態において、ウイルスベクターを利用する送達は排除される。
（４）粒子。本明細書で開示されるシステム及び方法内で使用される粒子は、凝縮してヌクレオチドを酵素分解から保護するように機能することができる。この目的のために粒子内で使用するのに特に有用な材料は、正電荷脂質及び／又はポリ（βアミノエステル）（ＰｂＡＥ）を含むポリマーを含む。
正電荷脂質の例は、ジパルミトイルホスファチジル酸又はジステアロイリホスファチジル酸とヒドロキシエチレンジアミンのエステルなどの、ホスファチジル酸とアミノアルコールのエステルを含む。正電荷脂質のさらに詳細な例は、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）；Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）；Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルアンモニウムクロライド（ＤＤＡＣ）；１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＲＩ）；１，２−ジオレオイルオキシ−３−［トリメチルアンモニオ］−プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；１，２−ジオクタデシルオキシ−３−［トリメチルアンモニオ］−プロパン（ＤＳＴＡＰ）；及び、例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ２００５年、１１、３７５〜３９４頁に記載されるカチオン性脂質を含む。
本開示の粒子内で使用可能な正電荷ポリマーの例は、ポリアミン；ポリ有機アミン（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレンイミンセルロース）；ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）；ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン）；多糖（例えば、セルロース、デキストラン、ＤＥＡＥデキストラン、デンプン）；スペルミン、スペルミジン、ポリ（ビニルベンジルトリアルキルアンモニウム）、ポリ（４−ビニル−Ｎ−アルキル−ピリジニウム）、ポリ（アクリロイル−トリアルキルアンモニウム）、及びＴａｔタンパク質を含む。
脂質とポリマーの混合物も、いかなる濃度でも及びいかなる比でも使用可能である。種々の等級を使用して異なるポリマータイプを異なる比で混合すると、寄与ポリマーのそれぞれから借りてくる特徴をもたらすことができる。種々の末端基化学も採用することができる。
本明細書で開示される特定の実施形態は、多孔質網を形成することができるいかなる材料から構築される多孔質粒子も利用可能である。例示的な材料は、金属、遷移金属及びメタロイドを含む。例示的な金属、遷移金属及びメタロイドは、リチウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム及びシリカを含む。特定の実施形態において、多孔質粒子はシリカを含む。メソ多孔質シリカの並外れた高表面積（１，０００ｍ２／ｇを上回る）により、リポソームなどの従来のＤＮＡ担体を上回るレベルでのヌクレオチド積載が可能になる。
粒子は、楕円体の、立方状の、ピラミッド形の、長方形の、円柱状の、ドーナツ形の、及び同類の物を含む、種々の異なる形状で形成することができる。ヌクレオチドは、種々のやり方で粒子の孔に含むことができる。例えば、ヌクレオチドは多孔質粒子にカプセル化することができる。他の態様において、ヌクレオチドは、多孔質粒子の表面又は表面のすぐ下付近と会合する（例えば、共有結合的に及び／又は非共有結合的に）ことができる。特定の実施形態において、ヌクレオチドは、例えば、多孔質粒子の材料に組み込んで多孔質粒子に取り込むことができる。例えば、ヌクレオチドは、ポリマー粒子のポリマーマトリックス中に取り込むことができる。
特定の実施形態において、本明細書に開示される粒子はコーティングを含む。コーティングはカプセル化されたヌクレオチドを遮蔽する及び／又はオフターゲット結合を減らす若しくは妨げる働きをすることができる。オフターゲット結合は、粒子の表面電荷を中性又は負に下げることにより減らされる又は妨げられる。本明細書の別の場所でさらに詳細に開示されているように、コーティングは、中性又は負電荷ポリマー−及び／又はリポソームベースのコーティングを含むことができる。特定の実施形態において、コーティングは、カプセル化されたヌクレオチドが免疫細胞中に放出される前に環境に曝露されることを防ぐのに十分に親水性の及び／又は中性電荷親水性ポリマーの高密度表面コーティングである。特定の実施形態において、コーティングは、粒子の表面の少なくとも８０％又は少なくとも９０％を覆う。特定の実施形態において、コーティングは、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む。特定の実施形態において、ＰＧＡは、ターゲティングリガンドを粒子に結合させるリンカーとしての役割を果たす。特定の実施形態において、ＰＧＡは、ジマンノースを粒子に結合させるリンカーとしての役割を果たす。特定の実施形態において、コーティングはヒアルロン酸を含む。
本開示の実施形態内でコーティングとして使用可能な中性電荷ポリマーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリ（プロピレングリコール）；及びポリアルキレンオキシド共重合体（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ、ＮＪ）を含む。
中性電荷ポリマーは双性イオンポリマーも含む。双性イオンとは、正電荷と負電荷の両方を有しつつ全体的な電荷的中性という特性のことである。双性イオンポリマーは、細胞及びタンパク質接着に抵抗する細胞膜の領域のような振る舞いができる。
双性イオンポリマーは、ペンダント基（すなわち、ポリマー骨格から垂れ下がった基）を双性イオン基と一緒に含む双性イオン構成単位を含む。例示的な双性イオンペンダント基は、カルボキシベタイン基（例えば、−Ｒａ−Ｎ＋（Ｒｂ）（Ｒｃ）−Ｒｄ−ＣＯ２−、Ｒａはポリマー骨格をカルボキシベタイン基のカチオン窒素中心に共有結合的に連結させるリンカー基であり、Ｒｂ及びＲｃは窒素置換基であり、Ｒｄはカチオン窒素中心をカルボキシベタイン基のカルボキシ基に共有結合的に連結させるリンカー基である）。
負電荷ポリマーの例は、アルギン酸類；カルボン酸多糖類；カルボキシメチルセルロース；カルボキシメチルセルロースシステイン；カラゲナン（例えば、ＧＥＬＣＡＲＩＮ（登録商標）２０９、ＧＥＬＣＡＲＩＮ（登録商標）３７９、ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；コンドロイチン硫酸；グリコサミノグリカン；ムコ多糖類；負電荷多糖類（例えば、デキストラン硫酸）；ポリ（アクリル酸）；ポリ（Ｄ−アスパラギン酸）；ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）；ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）ナトリウム塩；ポリ（Ｄ−グルタミン酸）；ポリ（Ｌ−グルタミン酸）；ポリ（Ｌ−グルタミン酸）ナトリウム塩；ポリ（メタクリル酸）；アルギン酸ナトリウム（例えば、ＰＲＯＴＡＮＡＬ（商標）ＬＦ １２０Ｍ、ＰＲＯＴＡＮＡＬ（商標）ＬＦ ２００Ｍ、ＰＲＯＴＡＮＡＬ（商標）ＬＦ ２００Ｄ、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｄｒａｍｍｅｎ、Ｎｏｒｗａｙ）；カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）；硫酸化多糖類（ヘパリン、アガロペクチン）；ペクチン、ゼラチン及びヒアルロン酸を含む。
特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリマーは、「星型ポリマー」を含むことができ、これは２つ以上のポリマー枝がコアから伸びている分岐ポリマーのことである。コアは、２つ以上の官能基を有する原子団であり、そこから分岐鎖を重合により伸ばすことができる。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子は星型ポリマーを含む。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子は星型ポリマー及びコーティングを含む。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子は星型ポリマー及びＰＧＡを含むコーティングを含む。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子は星型ポリマー及びヒアルロン酸を含むコーティングを含む。
特定の実施形態において、分岐鎖は双性イオン又は負電荷ポリマー分岐鎖である。星型ポリマーは、分岐鎖前駆体を、加水分解、紫外線照射、又は熱により双性イオン又は負電荷ポリマーに変換することができる。ポリマーも、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、光重合、開環重合（ＲＯＰ）、濃縮、マイケル付加、分岐生成／成長反応、又は他の反応を含む、不飽和単量体の重合に効果的ないかなる重合法によって得てもよい。
リポソームは、少なくとも１つの同心脂質二重層を含む微細小嚢である。小嚢形成脂質は、最終複合体の流動性又は強剛性の指定度を達成するように選択される。特定の実施形態において、リポソームは、多孔質粒子を取り囲む外層である脂質組成物を提供する。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子はリポソームナノ粒子を含む。
リポソームは、中性（コレステロール）又は双極性が可能であり、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）などのリン脂質、並びに炭化水素鎖長が１４〜２２の範囲であり、飽和している、又は１つ以上の二重Ｃ＝Ｃ結合を有するジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む他のタイプの双極性脂質を含む。単独で、又は他の脂質成分と組み合わせて安定なリポソームを作成することができる脂質の例は、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及び、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）などのリン脂質である。リポソーム中に組み込むことができる追加のリンを含有しない脂質は、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ミリスチン酸イソプロピル、トリエタノールアミンラウリル硫酸、アルキルアリール硫酸、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステアレート、両性アクリルポリマー、ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ＤＤＡＢ、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ＤＯＰＧ、及びリン酸ジセチルを含む。特定の実施形態において、本明細書に開示されるリポソームを作り出すのに使用される脂質は、コレステロール、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及び誘導体化小嚢形成脂質ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含む。
リポソームを形成する方法は、例えば、米国特許第４，２２９，３６０号、米国特許第４，２２４，１７９号、米国特許第４，２４１，０４６号、米国特許第４，７３７，３２３号、米国特許第４，０７８，０５２号、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号、及び米国特許第４，８３７，０２８号に、並びにＳｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７頁（１９８０）及びＨｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９頁（１９８６）に記載されている。
粒子のサイズは、広範囲にわたって変動することがあり、異なる方法で測定可能である。好ましい実施形態において、粒子はサイズがＮＰ＜１３０ｎｍである。しかし、本開示のＮＰは、５００ｎｍに等しい若しくはそれ未満、１５０ｎｍ未満、１４０ｎｍ未満、１２０ｎｍ未満、１１０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、又は１０ｎｍ未満の最小寸法を有することも可能である。特定の実施形態において、粒子はサイズがＮＰ９０〜１３０ｎｍである。
特定の実施形態において、ＮＰは、５ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜９０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ、及び４０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲に及ぶ最小寸法を持つことができる。特定の実施形態において、寸法は、ＮＰ又は被覆ＮＰの径である。特定の実施形態において、本開示の粒子の集団は、５００ｎｍに等しい若しくはそれ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、又は１０ｎｍ未満の平均最小寸法を有することも可能である。特定の実施形態において、本開示の組成物中のＮＰの集団は、５ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜９０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ、及び４０ｎｍ〜６０ｎｍ、７０ｎｍ〜１３０ｎｍ又は７５ｎｍ〜１２５ｎｍの範囲に及ぶ平均径を持つことができる。粒子の寸法は、例えば、動的光散乱及び／又は電子顕微鏡などの従来の技法を使用して決定することができる。好ましくはないが、特定の実施形態において、微小粒子も使用できると考えられる。
特定の実施形態において、ＰｂＡＥポリマーは、ヌクレオチド（例えば、インビトロ転写されたｍＲＮＡ）と、２０対１、３０対１、４０対１、５０対１、６０対１、７０対１、８０対１、９０対１、１００対１、又はそれよりも多い比で混合させ、ＰｂＡＥ−ヌクレオチドポリプレックスを作成する。特定の実施形態において、ＰｂＡＥポリマーは、ヌクレオチド（例えば、インビトロ転写されたｍＲＮＡ）と６０対１の比で混合させ、ＰｂＡＥ−ヌクレオチドポリプレックスを作成する。特定の実施形態において、ＰｂＡＥ−ヌクレオチドポリプレックスはＰＧＡ／Ｄｉ−マンノースと組み合わせて最終ＮＰを形成することができる。
（５）ターゲティングリガンド。ターゲティングリガンドは粒子の表面上で使用可能であり、異種細胞集団内で目的の免疫細胞のより選択的な結合をもたらすことができる。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、細胞マーカーリガンド、受容体リガンド、抗体、ペプチド、ペプチドアプタマー、核酸、核酸アプタマー、スピーゲルマー又はこれらの組合せに由来する結合ドメインを含む。特定の実施形態において、細胞ターゲティングリガンドという文脈内において、結合ドメインは、別の物質に結合してエンドサイトーシスを媒介することができる複合体を形成する任意の物質を含む。
特定の実施形態において、結合ドメインは抗体に由来する。抗体に由来する結合ドメインは、全抗体を含むことができる、又は抗体の結合断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、及び一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又は免疫細胞により発現される標的化モチーフに特異的に結合する免疫グロブリンの任意の生物学的に効果的な断片を含むことができる。抗体又は抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニ抗体、及び線形抗体のすべて又は一部を含む。
ヒト起源由来の抗体又はヒト化抗体はヒトでの免疫原性が低くなっている又はなく、非ヒト抗体と比べて非免疫原性エピトープの数が少ない。抗体及びこれらの断片は一般に、ヒト対象において抗原性のレベルが低下する又はないように選択される。
免疫細胞により発現されるモチーフに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイの方法、ヒト若しくはヒト化抗体を作成する方法、又は当業者には公知である抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物若しくは植物を使用する方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号、米国特許第６，２９１，１５８号参照）を使用して調製することができる。部分又は完全合成抗体のファージディスプレイライブラリーが入手可能であり、これを免疫細胞モチーフに結合することができる抗体又はこの断片を求めてスクリーニングすることができる。例えば、結合ドメインは、目的の標的に特異的に結合するＦａｂ断片を求めてＦａｂファージライブラリーをスクリーニングすることにより同定しうる（Ｈｏｅｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４頁、２００５年参照）。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーも利用可能である。さらに、便利な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウス（商標）、ＫＭマウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ、等）において免疫原として目的の標的を使用するハイブリドーマ開発のための従来の戦略を使用すれば、結合ドメインを開発することができる。特定の実施形態において、抗体は選択された免疫細胞により発現されるモチーフに特異的に結合し、非特異的成分にも無関係な標的にも交差反応しない。同定された後は、抗体をコードするアミノ酸配列又はヌクレオチド配列は、単離する及び／又は決定することができる。
無傷の抗体は、ジスルフィド結合により相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むことができる。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨ又はＶＨと略記される）と重鎖定常領域で構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬ又はＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域で構成されている。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域により分散された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高頻度可変性の領域にさらに細分化することができる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置されている。重及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。特定の実施形態において、抗体は、無傷の抗体のうち結合能力を保持する抗原結合部分を含む。結合能力を保持する断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを含む一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを含むＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインを含む、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６頁（１９８９））；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
所与のＣＤＲ又はＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７〜９４８頁（Ｃｈｏｔｈｉａ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）；Ｍａｃｃａｌｌｕｍら、（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２：７３２〜７４５頁（Ｃｏｎｔａｃｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）；Ｍａｒｔｉｎら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６：９２６８〜９２７２頁（ＡｂＭ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）；Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐら、（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７（１）：５５〜７７頁（ＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）；及びＨｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９（３）：６５７〜６７０頁（「Ａｈｏ」ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）により記載される方式を含む、いくつかの周知の方式のいずれかを使用して容易に決定することができる。所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、同定のために使用される方式に応じて変動することがある。例えば、Ｋａｂａｔ方式は構造アライメントに基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａ方式は構造情報に基づいている。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ方式両方の番号付けは、最も一般的な抗体領域配列長に基づいており、挿入は、挿入文字、例えば、「３０ａ」により順応され、欠失は一部の抗体に現れる。２つの方式は、ある特定の挿入と欠失（「ｉｎｄｅｌ」）を異なる位置に置き、異なる番号付けが生じる。Ｃｏｎｔａｃｔ方式は、複合体結晶構造の分析に基づいており、多くの点でＣｈｏｔｈｉａ番号付け方式に類似している。特定の実施形態において、本明細書に開示される抗体ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けに従っている。特定の実施形態において、ＣＤＲ領域は、以下の通り、軽鎖において、ＣＤＲＬ１はアミノ酸２４〜３４であり；ＣＤＲＬ２はアミノ酸５０〜５６であり；ＣＤＲＬ３はアミノ酸８９〜９７であり、重鎖において、ＣＤＲＨ１はアミノ酸３１〜３５であり；ＣＤＲＨ２はアミノ酸５０〜６５であり；ＣＤＲＨ３はアミノ酸９５〜１０２である、Ｋａｂａｔにより番号付けされた抗体領域内に見出される。
ペプチドアプタマーは、両末端でタンパク質スキャフォールドに結合しているペプチドループ（標的タンパク質に特異的である）を含む。この二重の構造上の制約は、ペプチドアプタマーの結合親和性を抗体に匹敵するレベルにまで大いに増やす。可変性のループ長は典型的には、８〜２０アミノ酸（例えば、８〜１２アミノ酸）であり、スキャフォールドは、安定で、可溶性で、小型で、非毒性のいかなるタンパク質（例えば、チオレドキシン−Ａ、ステフィンＡ三重変異体、緑色蛍光タンパク質、エグリンＣ、及び細胞転写因子Ｓｐｌ）でもよい。ペプチドアプタマー選択は、酵母ツーハイブリッド法（例えば、Ｇａｌ４酵母ツーハイブリッド法）又はＬｅｘＡインターラクショントラップシステムなどの異なるシステムを使用して行うことができる。
核酸アプタマーは、Ｏｓｂｏｒｎｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５〜９頁、１９９７年；及びＣｅｒｃｈｉａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５２８：１２〜１６頁、２００２年により記載されるように、標的タンパク質又は他の分子への高親和性で及び特異性での結合を指示する特定の球状構造に折り畳まることにより機能する一本鎖ヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。特定の実施形態において、アプタマーは小さい（１５ｋＤ；又は１５〜８０ヌクレオチド若しくは２０〜５０ヌクレオチド）。アプタマーは一般には、ＳＥＬＥＸ（例えば、Ｔｕｅｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：５０５〜５１０頁、１９９０年；Ｇｒｅｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．７５〜８６頁、１９９１年；及びＧｏｌｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４：７６３〜７９７頁、１９９５年参照）と呼ばれる手順により１０１４〜１０１５ランダムオリゴヌクレオチド配列を含むライブラリーから単離される。アプタマーを作成するさらなる方法は、例えば、米国特許第６，３４４，３１８号、米国特許第６，３３１，３９８号、米国特許第６，１１０，９００号、米国特許第５，８１７，７８５号、米国特許第５，７５６，２９１号、米国特許第５，６９６，２４９号、米国特許第５，６７０，６３７号、米国特許第５，６３７，４６１号、米国特許第５，５９５，８７７号、米国特許第５，５２７，８９４号、米国特許第５，４９６，９３８号、米国特許第５，４７５，０９６号、及び米国特許第５，２７０，１６号に記載されている。スピーゲルマーは、少なくとも１つのβ−リボースユニットがβ−Ｄ−デオキシリボース、又は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−リボース、β−Ｌ−リボースから選択される改変糖ユニットにより置き換えられていることを除いて、核酸アプタマーに類似している。
特定の実施形態において、標的化細胞はＴＡＭである。標的化細胞は、制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）も含むことができると考えられる。ＴＲＥＧはＴ細胞の亜集団であり、Ｔ細胞は免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を抑制する。ＴＲＥＧは、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ及びＬＡＰを発現する。本明細書に開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ及び／又はＬＡＰに結合して、ナイーブＴＲＥＧへのヌクレオチドの選択的送達を達成することができる。標的にすることができる他の細胞型は、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性樹状細胞（ＤＣｒｅｇ）、好中球、ヘルパーＴ１７細胞（Ｔｈ１７）、制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）、及び／又は間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を含む。当業者であれば、本明細書に開示されるターゲティングリガンドを利用してこれらの細胞型を標的にするのに適切な細胞マーカーを同定することができる。
Ｍ２結合ドメイン。特定の実施形態において、Ｅｇｒ２はＭ２マクロファージ上で標的にされる。Ｅｇｒ２についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；ａｎｄ Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。抗Ｅｇｒ２抗体の産生は、例えば、Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｋら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８（６）：１５５９〜１５６６頁で考察されている。抗Ｅｇｒ２抗体は：ウサギモノクローナル抗Ｅｇｒ２抗体クローンＥＰＲ４００４；マウスモノクローナル抗Ｅｇｒ２抗体クローン１Ｇ５；マウスモノクローナル抗Ｅｇｒ２抗体クローンＯＴＩ１Ｂ１２；ヒトＥｇｒ２のＡＡ残基２００〜３００を認識するウサギポリクローナル抗Ｅｇｒ２抗体；ヒトＥｇｒ２のＡＡ残基３４０〜４２０を認識するウサギポリクローナル抗Ｅｇｒ２抗体；及びヒトＥｇｒ２のＡＡ残基３７０〜４２０を認識するウサギポリクローナル抗Ｅｇｒ２抗体を含む。結合ドメインはこれらの抗体及び本明細書に開示される他の抗体由来が可能である。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＳＧＮＩＦＳＩＮＡＩＧ（配列番号４５）を含むＣＤＲＨ１配列、ＴＩＴＬＳＧＳＴＮ（配列番号４６）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＮＴＹＳＤＳＤＶＹＧＹ（配列番号４７）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ナノボディ）を含む。これらは、ＣＤ２０６に結合するＣＤＲ配列を反映している。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＰＧＦＫＬＤＹＹＡＩＡ（配列番号４８）を含むＣＤＲＨ１配列、ＳＩＮＳＳＧＧＳＴ（配列番号４９）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＬＲＲＹＹＧＬＮＬＤＰＧＳＹＤＹ（配列番号５０）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ナノボディ）を含む。これらは、ＣＤ２０６に結合するＣＤＲ配列を反映している。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＦＰＦＮＩＹＰＭＳ（配列番号５１）を含むＣＤＲＨ１配列、ＹＩＳＨＧＧＴＴＴ（配列番号５２）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＧＹＡＲＬＭＴＤＳＥＬＶ（配列番号５３）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ナノボディ）を含む。これらは、ＣＤ２０６に結合するＣＤＲ配列を反映している。
ＣＤ２０６に特異的ないくつかの追加の抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際特許第２０１４／１４０３７６号パンフレット、国際特許第２０１３／１７４５３７号パンフレット、米国特許第７，５６０，５３４号を参照されたい。ＣＤ２０６についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｒｏｓｅｍｏｎｔ、ＩＬ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ；及びＢｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０６抗体は、ラットモノクローナル抗マウスＣＤ２０６モノクローナル抗体クローンＣ０６８Ｃ２（カタログ＃１４１７３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＡＳＱＳＶＳＨＤＶ（配列番号５４）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＴＳを含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＤＹＳＳＰＲＴ（配列番号５６）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＹＳＩＴＳＤＹ（配列番号５７）を含むＣＤＲＨ１配列、ＹＳＧを含むＣＤＲＨ２配列、及びＣＶＳＧＴＹＹＦＤＹＷＧ（配列番号５９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ１６３に結合するＭａｃ２−４８抗体のＣＤＲ配列を反映している。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＡＳＱＳＶＳＳＤＶ（配列番号６０）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＡＳを含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＤＹＴＳＰＲＴ（配列番号６２）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＹＳＩＴＳＤＹ（配列番号６３）を含むＣＤＲＨ１配列、ＹＳＧを含むＣＤＲＨ２配列、及びＣＶＳＧＴＹＹＦＤＹＷＧ（配列番号６５）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ１６３に結合するＭａｃ２−１５８抗体のＣＤＲ配列を反映している。
ＣＤ１６３に特異的ないくつかの追加の抗体又は結合ドメインは当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際特許第２０１１／０３９５１０号パンフレット、国際特許第２００２／０３２９４１号パンフレット、国際特許第２００２／０７６５０１号パンフレット、及び米国特許出願公開第２００５／０２１４８７１号参照を参照されたい。ＣＤ１６３についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；及びＲＤＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ１６３抗体は、マウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローン３Ｄ４；マウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローンＢｅｒ−Ｍａｃ３；マウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローンＥＤＨｕ−１；及びマウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローンＧＨＩ／６１を含むことができる。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＲＳＳＫＳＬＬＹＫＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号６６）を含むＣＤＲＬ１配列、ＬＭＳＴＲＡＳ（配列番号６７）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＱＬＶＥＹＰＦＴ（配列番号６８）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＹＷＭＳ（配列番号６９）を含むＣＤＲＨ１配列、ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号７０）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＦＩＤを含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ２３に結合するＣＤＲ配列を反映している。
ＣＤ２３に特異的ないくつかの追加の抗体又は結合ドメインは当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、米国特許第７，００８，６２３号、米国特許第６，０１１，１３８号（５Ｅ８、６Ｇ５、２Ｃ８、Ｂ３Ｂ１及び３Ｇ１２を含む抗体）、及び米国特許出願公開第２００９／０２５２７２５号、Ｒｅｃｔｏｒら、（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４８１〜４８８頁；Ｆｌｏｒｅｓ−Ｒｕｍｅｏら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０３８〜１０４６頁；Ｓｈｅｒｒら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：４８１〜４８９頁；及びＰｅｎｅら、（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：６８２０〜６８２４頁を参照されたい。ＣＤ２３についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｂｉｏｓｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；及びＢｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ２３抗体は、マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＴｕ１；ウサギモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＳＰ２３；ウサギモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＥＰＲ３６１７；マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローン５Ｂ５；マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローン１Ｂ１２；マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＭ−Ｌ２３．４；及びマウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローン３Ａ２を含むことができる。
Ｍ１結合ドメイン。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＳＳＮＩＧＤＮＹ（配列番号７２）を含むＣＤＲＬ１配列、ＲＤＳを含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳ（配列番号７４）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＦＴＦＤＤＹＧ（配列番号７５）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＳＷＮＧＧＫＴ（配列番号７６）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＡＲＧＳＬＦＨＤＳＳＧＦＹＦＧＨ（配列番号７７）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ３８に結合するＡｂ７９抗体のＣＤＲ配列を反映している。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＮＳＮＩＧＳＮＴ（配列番号７８）を含むＣＤＲＬ１配列、ＳＤＳを含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＲ（配列番号８０）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＦＴＦＮＮＹＧ（配列番号８１）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＳＹＤＧＳＤＫ（配列番号８２）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＡＲＶＹＹＹＧＦＳＧＰＳＭＤＶ（配列番号８３）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ３８に結合するＡｂ１９抗体のＣＤＲ配列を反映している。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号８４）を含むＣＤＲＬ１配列、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号８５）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦ（配列番号８６）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＳＦＡＭＳ（配列番号８７）を含むＣＤＲＨ１配列、ＡＩＳＧＳＧＧＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８８）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＤＫＩＬＷＦＧＥＰＶＦＤＹ（配列番号８９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、米国特許第７，８２９，６９３号に記載されるＣＤ３８に結合するダラツムマブ抗体のＣＤＲ配列を反映している。
ＣＤ３８に特異的ないくつかの抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際公開第２００５／１０３０８３号パンフレット、国際公開第２００６／１２５６４０号パンフレット、国際公開第２００７／０４２３０９号パンフレット、国際公開第２００８／０４７２４２号パンフレット、国際公開第２０１２／０９２６１２号パンフレット、国際公開第２００６／０９９８７５号パンフレット、国際公開第２０１１／１５４４５３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３０７２８号パンフレット、米国特許第７，８２９，６９３号、及び米国特許出願公開第２０１６／０２００８２８号を参照されたい。ＣＤ３８についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ２３抗体は、ウサギモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＧＡＤ−３；マウスモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＨＩＴ２；マウスモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＡＴ１；マウスモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＡＴ１３／５；ラットモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＮＩＭＲ−５；及びラットモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗ＣＤ３８抗体クローン９０／ＣＤ３８（カタログ＃ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を含むことができる。
特定の実施形態において、Ｇタンパク質共役受容体１８（Ｇｐｒ１８）はＭ１マクロファージ上で標的にされる。Ｇｐｒ１８についての市販の抗体は、Ａｓｓａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ；及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。特定の実施形態において、抗Ｇｐｒ１８抗体は、ヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１〜５０の一部を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体；ヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１６０〜２４０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体；ヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１００〜１８０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体；ウサギモノクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体クローンＥＰＲ１２３５９；及びヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１４０〜１９０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体を含む。
特定の実施形態において、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）はＭ１マクロファージ上で標的にされる。Ｆｐｒ２についての市販の抗体は、Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ；Ｂｉｏｒｂｙｔ、ＬＬＣ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．、Ｋａｔｙ、ＴＸ；ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｌｅｍ、ＭＡ；及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。特定の実施形態において、抗ｆｐｒ２抗体は、マウスモノクローナル抗ｆｐｒ２抗体クローンＧＭ１Ｄ６；マウスモノクローナル抗ｆｐｒ２抗体クローン３０４４０５；組換え抗ｆｐｒ２抗体クローンＲＥＡ６６３；及びｆｐｒ２のアミノ酸３００〜３５０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗ｆｐｒ２抗体を含む。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号９０）を含むＣＤＲＬ１配列、ＤＡＳＳＲＡＴ（配列番号９１）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＬＲＳＮＷＰＰＹＴ（配列番号９２）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＹＧＭＨ（配列番号９３）を含むＣＤＲＨ１配列、ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９４）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＤＴＧＤＲＦＦＤＹ（配列番号９５）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ６４に結合するＣＤＲ配列を反映している。
ＣＤ６４に特異的ないくつかの抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、米国特許第７，３７８，５０４号、国際公開第２００６／１３１９５３号パンフレット、及び国際公開第２００８／０７４８６７号パンフレットを参照されたい。ＣＤ６４についての市販の抗体は、Ａｎｃｅｌｌ、Ｂａｙｐｏｒｔ、ＭＮ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ６４抗体は、マウスモノクローナル抗ＣＤ６４抗体クローン３２−２；マウスモノクローナル抗ＣＤ６４抗体クローンＵＭＡＢ７４；ラットモノクローナル抗ＣＤ６４抗体クローン２９０３２２；マウスモノクローナル抗ＣＤ６４抗体クローン１０．１；及びマウスモノクローナル抗ＣＤ６４抗体クローン１Ｄ３を含む。
特定の実施形態において、ＣＤ８６はＭ１マクロファージ上で標的にされる。ＣＤ８６に特異的ないくつかの抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際公開第２００４／０７６４８８号パンフレット、米国特許第８，３７８，０８２号（ｍＡｂ ２Ｄ４）、及び米国特許第６，３４６，２４８号（ＩＧ１０Ｈ６Ｄ１０）を参照されたい。ＣＤ８６についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ；及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ８６抗体は、マウスモノクローナル抗ＣＤ８６抗体クローンＢＵ６３；ヒトＣＤ８６のＡｌａ２３〜Ｈｉｓ２４４を含む領域を認識するポリクローナルヤギ抗ＣＤ８６抗体；マウスモノクローナル抗ＣＤ８６抗体クローンＩＴ２．２；ウサギモノクローナル抗ＣＤ８６抗体クローンＢＦＦ−３；及びマウスモノクローナル抗ＣＤ８６抗体クローンＣ８６／１１４６を含む。
ポリ（エチレンイミン）／ＤＮＡ（ＰＥＩ／ＤＮＡ）複合体などの、リンパ球及び／又はリンパ球のトランスフェクションによる内部移行を促進することができる他の薬剤も使用することができる。
（６）組成物。本明細書に開示される粒子は、対象への投与のために処方される組成物の一部として提供することができる。組成物は、本明細書に開示される粒子及び薬学的に許容される担体を含む。
例示的な一般に使用される薬学的に許容される担体は、ありとあらゆる充填剤若しくはフィラー、溶媒若しくは共溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、保存剤、等張化剤、吸収遅延剤、塩、安定化剤、緩衝剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、ゲル、結合剤、崩壊剤、及び／又は潤滑剤を含む。
例示的な緩衝剤は、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、グルコン酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤及び／又はトリメチルアミン塩を含む。
例示的な保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハロゲン化物、塩化ヘキサメトニウム、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールを含む。
例示的な等張剤は、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトールなどの三価又は高級糖アルコールを含む多価糖アルコールを含む。
例示的な安定化剤は、有機糖、多価糖アルコール、ポリエチレングリコール、硫黄含有還元剤、アミノ酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、免疫グロブリン、親水性ポリマー又は多糖を含む。
特定の実施形態において、組成物は、腹腔内、静脈内、又は頭蓋内注射用に処方される。本明細書に開示される組成物は、さらに動脈内、リンパ節内、リンパ内、腫瘍内、筋肉内、経口、及び／又は皮下投与用に処方することができ、さらに詳細には、動脈内、リンパ節内、リンパ内、腫瘍内、筋肉内、及び／又は皮下注射による。本明細書に開示される組成物は、注入、灌流、又は経口摂取による投与用に処方することができる。
注射に関して、組成物は、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水を含む緩衝液などの水溶液として処方可能である。水溶液は、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。あるいは、製剤は、使用前に、適切な溶媒、例えば、減菌発熱性物質除去水で構成するための凍結乾燥及び／又は粉末形態が可能である。
組成物はデポ製剤としても処方することができる。デポ製剤は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中の乳剤として）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として処方することができる。
さらに、組成物は、粒子を含有する固体ポリマーの半透性マトリックスを利用して徐放性製剤として処方することができる。種々の徐放性材料が確立されており、当業者には周知である。徐放性製剤は、その化学的性質に応じて、投与に続いて数週間から１００日を超えるまでの間粒子を放出しうる。
経口投与に関して、組成物は、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液及び同類の物として処方することができる。
がんを処置するために処方される場合、開示された組成物は、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ−２、ＭＤＲ−１、ｐ２１、ｐ１６、ｂａｘ、ｂｃｌ−ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ−Ｉ ＶＥＧＦ、アンジオスタチン、オンコスタチン、エンドスタチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／又はＨＳＶ−ｔｋから選択される１種以上の抗がん遺伝子を担持するヌクレオチドも含むことができる。
本明細書に開示されるいかなる組成物製剤も、研究のためであれ、予防的処置であれ、及び／又は治療的処置であれ、投与の効果を凌ぐ著しく有害な、アレルギー性の又は他の都合の悪い反応を生じない担体を含む他のいかなる薬学的に許容される担体でも有利に含むことができる。例示的な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年に開示されている。さらに、製剤は、米国食品医薬品局生物製剤基準局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）及び／又は他の関連する外国規制当局により要求される無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度基準を満たすように調製することができる。
特定の実施形態において、粒子は、例えば、少なくとも０．１％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも１％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも１０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも２０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも３０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも４０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも５０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも６０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも７０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも８０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも９０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；少なくとも９５％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子；又は少なくとも９９％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗ粒子を含むことができる組成物の一部として提供される。
使用方法。本明細書に開示される方法は、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子をマクロファージ中に導入することにより、マクロファージの活性状態を不活性化状態から活性化状態に変更することを含む。特定の実施形態において、変更により、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で処置したマクロファージの集団において不活性化状態のマクロファージ（例えば、Ｍ２マクロファージ）のパーセンテージは、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で処置されたことがない不活性化状態のマクロファージのパーセンテージと比べて、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く減少する。特定の実施形態において、変更により、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で処置したマクロファージの集団において不活性化状態のマクロファージ（例えば、Ｍ２マクロファージ）の数は、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で処置されたことがない不活性化状態のマクロファージの数と比べて、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く減少する。特定の実施形態において、変更により、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で処置したマクロファージの集団において活性化状態のマクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）のパーセンテージは、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で処置されたことがない活性化状態のマクロファージのパーセンテージと比べて、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く増加する。特定の実施形態において、変更により、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で処置したマクロファージの集団において活性化状態のマクロファージの数は、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で処置されたことがない活性化状態のマクロファージの数と比べて、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く増加する。
特定の実施形態において、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子をマクロファージ中に導入することにより、マクロファージの活性状態を不活性化状態から活性化状態に変更すれば、固体腫瘍中へのリンパ球遊走及び浸潤を回復させる；ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、及び／又はＴＮＦαを含む炎症促進性（抗腫瘍）サイトカインの放出を１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く増加する；ＩＬ−６を含むＭ２マクロファージ表現型に関連するサイトカインの放出を１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く減少する。
特定の実施形態において、マクロファージの活性状態を不活性化状態から活性化状態に変更することは、ＩＲＦ５及びＩＲＦ８をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子をマクロファージ中に導入することを含む。特定の実施形態において、マクロファージの活性状態を不活性化状態から活性化状態に変更することは、構成的に活性である又はその野生型の対応物ＩＲＦよりも活性である突然変異ＩＲＦをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子をマクロファージ中に導入することを含む。
本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される組成物で対象（ヒト、獣医動物、家畜及び研究動物）を処置することを含む。対象を処置することは、治療有効量を送達することを含む。治療有効量は、有効量、予防的処置及び／又は治療的処置を提供することができる。
「有効量」は、対象において所望の生理的変化を生じるのに必要な化合物の量である。有効量は、研究目的で投与されることも多い。本明細書に開示される有効量は、対象において細胞を免疫調節する。特定の実施形態において、免疫調節される細胞は免疫抑制された細胞である。特定の実施形態において、免疫調節される細胞はマクロファージである。特定の実施形態において、マクロファージの免疫調節は、免疫抑制されたマクロファージを活性化マクロファージに切り替えることを含む。特定の実施形態において、マクロファージの免疫調節は、Ｍ２マクロファージをＭ１マクロファージに切り替えることを含む。特定の実施形態において、免疫調節される細胞は、ＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ、ＤＣｒｅｇ、好中球、Ｔｈ１７、Ｂｒｅｇ、及び／又はＭＳＣを含む免疫抑制された細胞を含む。特定の実施形態において、免疫抑制された細胞の免疫調節は、腫瘍促進性（ｐｒｏｔｕｍｏｒ）から抗腫瘍への免疫抑制された細胞の表現型的及び／又は機能的切り替えを含む。
「予防的処置」は、疾患又は状態をさらに発症するリスクを縮小する、予防する、又は減少する目的で処置が施されるように、疾患若しくは状態の徴候若しくは症状を示さない又は疾患若しくは状態の初期徴候若しくは症状のみを示す対象に施される処置を含む。したがって、予防的処置は、疾患又は障害に対する予防処置として機能する。特定の実施形態において、予防的処置は、再発の発生を低減する又は遅らせる目的で処置が施されるように、がんを抱えていたが軽快状態である対象への本明細書に開示される組成物の投与を含む。
「治療的処置」は、疾患又は状態の症状又は徴候を示す対象に施される処置を含み、疾患又は状態の徴候又は症状を縮小する又は取り除く目的で対象に施される。特定の実施形態において、治療的処置は、腫瘍及び／又は転移を縮小する又は取り除くためにがんを抱えた対象に本明細書に開示される組成物を投与することを含む。
特定の実施形態において、治療有効量は、対象において抗ガン効果を提供する。がん（医学用語：悪性新生物）とは、細胞の群が制御されない成長（正常な限界を超えた分裂）、浸潤（隣接する組織への侵入及びこの破壊）、及び時に転移を示す疾患のクラスのことである。「転移」とは、その最初の増殖部位から身体の別の部分へのがん細胞の広がりのことである。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外マトリックスの侵襲、内皮基底膜を貫入し体腔及び血管への進入、次に、血液により運ばれた後、標的臓器への浸潤に依存する。最終的に、標的部位での新しい腫瘍、すなわち、二次腫瘍又は転移腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍転移は原発腫瘍を切除後でさえ起こることが多い。なぜならば、腫瘍細胞又は成分が残っていて転移能を身に着けることがあるからである。
特定の実施形態において、治療有効量は対象において抗腫瘍効果を提供する。「腫瘍」とは、細胞の異常な成長により形成される腫脹又は病変（新生細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる）である。「腫瘍細胞」は、急速な制御されない細胞増殖により分裂し、新たな分裂を開始させた刺激が止んだ後分裂し続ける異常な細胞である。腫瘍は、構造組織及び正常細胞との機能的な協調の部分的又は完全な欠如を示し、通常は、異なった組織塊を形成するが、これは良性、前悪性又は悪性の場合がある。
抗腫瘍効果とは生物学的効果のことであり、これは、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、腫瘍量の減少、平均寿命の増加、がん細胞のアポトーシスの誘導、がん細胞死の誘導、がん細胞の化学受容性又は放射線感受性の誘導、がん細胞近辺の血管新世の阻害、がん細胞増殖の阻害、腫瘍成長の阻害、転移の防止、対象の寿命の延長、がんに伴う疼痛の減少、転移の数の縮小、及び／又は処置に続くがんのぶり返し若しくは再発の減少により明らかにすることができる。したがって、本明細書に開示される組成物は、種々のがんを処置するのに使用することができ、転移を予防する若しくは著しく遅延させることができ、及び／又は再発を予防する若しくは著しく遅延させることができる。特定の実施形態において、がんを本明細書に開示されるナノ粒子組成物で処置した対象の全生存期間は、同じがんがナノ粒子で処置されていない対照の対象と比べた場合、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、又はそれよりも多く改善される。特定の実施形態において、がんを本明細書に開示されるナノ粒子組成物で処置した対象の転移の数は、同じがんがナノ粒子で処置されていない対照の対象と比べた場合、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれよりも多く減少する。
特定の実施形態において、治療的処置は、腫瘍を縮小する又は取り除くために、がんを抱えた対象への本明細書に開示される組成物の他の療法と組み合わせての投与を含む。特定の実施形態において、本明細書に開示される組成物と組み合わせて使用する療法は、がんワクチン、ＣＡＲ免疫療法（例えば、ＣＡＲ−Ｔ免疫療法）、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、シグナル伝達阻害剤、遺伝子発現調節剤、アポトーシス誘導剤、血管新生阻害剤、及び毒性分子を送達するモノクローナル抗体を含む。特定の実施形態において、がんを抱えた対象への本明細書に開示されるナノ粒子組成物の放射線療法と組み合わせての投与により、全生存期間は、同じがんが放射線療法と組み合わせてナノ粒子組成物を投与されていない対照の対象と比べた場合、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、又はそれよりも多く改善される。
本明細書に開示されるシステム及び方法で処置することができるがんは、卵巣がん、乳がん、脳がん、黒色腫、肺転移、精上皮腫、奇形腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、副腎がん、甲状腺がん、皮膚がん、子宮頸がん、腸がん、肝臓がん、結腸がん、胃がん、頭頚部がん、胃腸がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵臓がん、耳、鼻及び喉（ＥＮＴ）がん、前立腺がん、子宮のがん、肺がん、並びにこれらの転移を含む。
示されるように、本開示の教えは、自己免疫疾患などの状態において免疫細胞の活性状態を調節して免疫系を不活性化する方法でも使用することができる。特定の実施形態において、自己免疫疾患においてマクロファージの活性状態を活性化状態から不活性化状態へ変更することは、Ｍ２表現型を誘導するＩＲＦをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子をマクロファージに導入することを含む。Ｍ２表現型を誘導するＩＲＦの特定の実施形態は、ＩＲＦ３及び／又はＩＲＦ４を含む。特定の実施形態において、自己免疫疾患においてマクロファージの活性状態を活性化状態から不活性化状態へ変更することは、グルココルチコイド抗炎症効果を媒介しＭ２表現型を誘導することができるＧＩＬＺ（グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー）転写因子をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子をマクロファージに導入することを含む。特定の実施形態において、自己免疫疾患においてマクロファージの活性状態を活性化状態から不活性化状態へ変更することは、ＧＩＬＺ及びＩＲＦ４をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子をマクロファージに導入することを含む。例示的な自己免疫疾患は、急性壊死性出血性脳疾患、アレルギー性喘息、円形脱毛症、貧血症、アフタ性潰瘍、関節炎（関節炎リウマチ、若年性関節炎リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、喘息、自己免疫性甲状腺炎、結膜炎、クローン病、皮膚エリテマトーデス、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、糖尿病、真性糖尿病、らい性結節性紅斑、角結膜炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群に続く乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、膣炎及びウェゲナー肉芽腫症を含む。
投与に関して、治療有効量（本明細書において用量とも呼ばれる）は、インビトロアッセイ及び／又は動物モデル研究からの結果に基づいて最初に評価することができる。例えば、用量は、特定の標的に対する細胞培養において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報を使用すれば、目的の対象における有用な用量をより的確に決定することができる。
特定の対象に投与される実際の服用量は、医師、獣医師又は研究者により、標的、体重、状態の重症度、疾患の種類、以前の又は同時の治療介入、対象の特発性及び投与経路を含む身体的及び生理的要因などのパラメータを考慮に入れて決定することができる。
有用な用量は、０．１〜５μｇ／ｋｇ又は０．５〜１μｇ／ｋｇの範囲に及ぶことが多い。特定の実施形態において、用量は、１μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ又は０．５〜１ｍｇ／ｋｇを含むことができる。特定の実施形態において、用量は、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍμｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ又はそれよりも多く含むことができる。
治療有効量は、処置計画の進行中に単回又は複数回用量を投与することにより達成することができる（例えば、毎日、１日おき、３日毎に、４日毎に、５日毎に、６日毎に、毎週、２週間毎に、３週間毎に、毎月、２カ月毎に、３カ月毎に、４カ月毎に、５カ月毎に、６カ月毎に、７カ月毎に、８カ月毎に、９カ月毎に、１０カ月毎に、１１カ月毎に、１年毎に）。特定の実施形態において、治療有効量は、処置計画の進行中に反復用量を投与することにより達成することができる。
本明細書に記載されるナノ粒子組成物は、注射、吸入、注入、灌流、洗浄又は経口摂取により投与することができる。投与経路は、静脈内、皮内、動脈内、非経口内、鼻腔内、リンパ節内、リンパ内、腹腔内、頭蓋内、病巣内、前立腺内、膣内、直腸内、局所的、くも膜下腔内、腫瘍内、筋肉内、小胞内、経口、皮下、及び／又は舌下投与、さらに詳細には、静脈内、腫瘍内、腹腔内、及び／又は頭蓋内注射によりを含むことができる。局所投与は、本明細書に開示される組成物の治療有効量を身体の特定の領域、器官、又は腔に投与することを含む。例えば、腹腔内注射を使用すれば、卵巣がんを処置する治療薬を送達することができる、又は頭蓋内注射を使用すれば、神経膠腫を処置する治療薬を送達することができる。腫瘍部位での治療薬の投与は、上記のターゲティングリガンドを使用する腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞への治療薬（例えば、ナノ粒子組成物）のリガンド媒介ターゲティングを含むことができ、この治療薬は健康な組織には向かわない。腫瘍部位での治療薬の投与は、腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞への治療薬（例えば、ナノ粒子組成物）の受動的ターゲティングを含むことができ、この治療薬は健康な組織には向かわない。受動的ターゲティングの特定の実施形態は、ナノ粒子のサイズ範囲並びに腫瘍組織の漏れ穴のある脈管構造及びリンパ排出障害に基づく亢進された浸透性及び保持（ＥＰＲ）現象を含むことができる。これとは対照的に、全身投与は全身に及び、典型的には、循環中への組成物又は治療薬の静脈内注射により達成される。治療薬の全身投与は、転移してしまったがんなどの局在性の少ない形態のがんに有用であることが可能である。
図５は、本開示を支持する例示的な配列（配列番号１〜４４、１１０、及び１１１）を提供する。ＣＤＲ配列も本明細書に記載されている。本開示は、これらの配列の変異体を含む。タンパク質配列の変異体は、１つ以上の保存的アミノ酸置換又はタンパク質の機能に有害な影響を及ぼさない１つ以上の非保存的置換を有する配列を含むことができる。「保存的置換」は、以下の保存的置換グループ：グループ１：アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）；グループ２：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グループ３：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；グループ４：アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）；グループ５：イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）；及びグループ６：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）のうちの１つに見られる置換を含む。
さらに、アミノ酸は、類似する機能又は化学構造若しくは組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄含有）により保存的置換グループに分類することができる。例えば、脂肪族分類は、置換目的で、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅを含みうる。互いに保存的置換と見なされるアミノ酸を含有する他のグループは、硫黄含有：Ｍｅｔ及びシステイン（Ｃｙｓ）；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ；小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；極性、負電荷残基及びそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ；極性、正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ；並びに大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐを含む。追加の情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに見られる。
タンパク質の断片は、対応するタンパク質の完全アミノ酸配列未満からなるが、完全長タンパク質の機能を保持する。
ヌクレオチド配列の変異体は、そのような変更がコードされた活性化制御因子の機能に影響を及ぼさず、コードされた活性化制御因子の機能に実質的な影響も及ぼさない縮重コドン、配列多型、及び突然変異のうちの１つ以上を含むことができる。
特定の実施形態、配列の変異体は、本明細書に記載される又は開示される配列に少なくとも７０％配列同一性、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含む。
「％配列同一性」とは、配列を比較することにより決定される場合、２つ以上の配列間の関係のことである。当技術分野において、「同一性」は、そのような配列のストリング間の適合により決定される配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」（「類似性」と呼ばれることも多い）は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、Ｇ．、ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９２）に記載されている方法を含む、既知の方法により容易に計算することができる。
％配列同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間の最良の適合を与えるように設計される。％配列同一性及び類似性を決定する方法は、一般公開されているコンピュータプログラムに集成されている。配列アライメント及び％配列同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して実施することもできる。配列のマルチプルアライメントは、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いるアライメントのクラスタル法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ、５、１５１〜１５３頁（１９８９））を使用して実施することもできる。関連するプログラムは、プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んでいるＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２年、１１１〜２０頁．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ、Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹも含む。本開示の文脈内において、解析に配列解析ソフトウェアが使用される場合、解析の結果は参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解される。「デフォルト値」は、値又はパラメータの任意のセットを意味し、最初に初期化される場合、もともとソフトウェアにロードされている。
下の例示的な実施形態及び実施例は、本開示の特定の実施形態を実証するために含まれている。当業者であれば、本開示に照らして、本明細書に開示される特定の実施形態には多くの変更を加えることが可能であり、それでも本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、同様の又は類似の結果を得られることは認識するべきである。
例示的な実施形態。
１．免疫細胞の活性状態をインビボで変更する方法であって、
１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を投与することを含み、それによって、免疫細胞の活性状態をインビボで変更する、方法。
２．免疫細胞が、マクロファージ、制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）、骨髄系由来抑制性細胞（ＭＤＳＣ）、調節性樹状細胞（ＤＣｒｅｇ）、好中球、ヘルパーＴ１７細胞（Ｔｈ１７）、制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）、及び／又は間葉系間質細胞（ＭＳＣ）である、実施形態１の方法。
３．ナノ粒子が、正電荷コア、ポリ（β）アミノエステルコア、星型ポリマー、ポリグルタミン酸コーティング、ヒアルロン酸コーティング、中性電荷コーティング、及び／又はリポソームナノ粒子を含む、実施形態１又は２の方法。
４．ナノ粒子が＜１３０ｎｍである、実施形態１〜３のいずれか１つの方法。
５．ヌクレオチドがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、実施形態１〜４のいずれか１つの方法。
６．ヌクレオチドがコア内にカプセル化されている、実施形態１〜５のいずれか１つの方法。
７．コードされた１つ以上のＩＲＦが機能的自己阻害ドメインを欠く、実施形態１〜６のいずれか１つの方法。
８．コードされた１つ以上のＩＲＦが機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、実施形態１〜７のいずれか１つの方法。
９．投与が局所的投与である、実施形態１〜８のいずれか１つの方法。
１０．局所的投与が腹腔内又は頭蓋内である、実施形態９の方法。
１１．投与が全身投与である、実施形態１〜９のいずれか１つの方法。
１２．ナノ粒子がターゲティングリガンドをさらに含む、実施形態１〜１１のいずれか１つの方法。
１３．ターゲティングリガンドがコーティングに連結されている、実施形態１２の方法。
１４．活性状態が不活性化状態から活性化状態に変更される、実施形態１〜１３のいずれか１つの方法。
１５．免疫細胞がマクロファージを含む、実施形態１〜１４のいずれか１つの方法。
１６．マクロファージが腫瘍内にある、実施形態１５の方法。
１７．腫瘍が、卵巣がん腫瘍、神経膠芽腫腫瘍、又は転移性肺がん腫瘍である、実施形態１６の方法。
１８．コードされた１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合体から選択される、実施形態１〜１７のいずれか１つの方法。
１９．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜１７に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態１〜１８のいずれか１つの方法。
２０．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜７から選択されるＩＲＦ５である、実施形態１〜１９のいずれか１つの方法。
２１．ＩＲＦ５が配列番号１である、実施形態２０の方法。
２２．ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号１又は配列番号３である、実施形態２０又は２１の方法。
２３．ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ、及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２である、実施形態２０〜２２のいずれか１つの方法。
２４．ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ、及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号４である、実施形態２０〜２３のいずれか１つの方法。
２５．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号８及び１２から選択されるＩＲＦ１である、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法。
２６．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１１、１６及び１７から選択されるＩＲＦ８である、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法。
２７．ＩＲＦ８がＫ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号１１である、実施形態２６の方法。
２８．コードされた１つ以上のＩＲＦが、Ｎ末端ＩＲＦ７ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び構成的活性ドメイン（ＣＡＤ）並びにＣ末端ＩＲＦ３ ＮＥＳ（核外移行シグナル）及び会合ドメインを含むＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質を含む、実施形態１〜２７のいずれか１つの方法。
２９．ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が、ＩＲＦ３会合ドメインにリン酸化を模倣する突然変異を含む、実施形態２８の方法。
３０．ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が配列番号１５に示されている、実施形態２８又は２９の方法。
３１．ナノ粒子が、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドをさらに含む、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法。
３２．コードされたＩＫＫβが、配列番号１８〜２２に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態３１の方法。
３３．コードされたＩＫＫβが配列番号１８〜２２から選択される、実施形態３１又は３２の方法。
３４．ヌクレオチドが、配列番号２３〜４４から選択される配列を含む、実施形態１〜３３のいずれか１つの方法。
３５．ターゲティングリガンドがＣＤ２０６、ＣＤ１６３、又はＣＤ２３に結合する、実施形態１２〜３４のいずれか１つの方法。
３６．ターゲティングリガンドがジマンノースである、実施形態１２〜３５のいずれか１つの方法。
３７．１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子にカプセル化されている、実施形態３１〜３６のいずれか１つの方法。
３８．１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが異なるナノ粒子にカプセル化されている、実施形態３１〜３７のいずれか１つの方法。
３９．免疫細胞の活性状態を変更することが、免疫細胞の集団において不活性化状態の免疫細胞のパーセンテージを５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く減少させることを含む、実施形態１〜３８のいずれか１つの方法。
４０．免疫細胞の活性状態を変更することが、免疫細胞の集団において不活性化状態の免疫細胞の数を５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く減少させることを含む、実施形態１〜３９のいずれか１つの方法。
４１．免疫細胞の活性状態を変更することが、免疫細胞の集団において活性化状態の免疫細胞のパーセンテージを５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く増やすことを含む、実施形態１〜４０のいずれか１つの方法。
４２．免疫細胞の活性状態を変更することが、免疫細胞の集団において活性化状態の免疫細胞の数を５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く増やすことを含む、実施形態１〜４１のいずれか１つの方法。
４３．活性状態が、活性化状態から不活性化状態に変更される、実施形態１〜１３のいずれか１つの方法。
４４．免疫細胞がマクロファージを含む、実施形態１〜１３、及び４３のいずれか１つの方法。
４５．コードされた１つ以上のＩＲＦがＩＲＦ４である、実施形態１〜１３、４３及び４４のいずれか１つの方法。
４６．ナノ粒子が、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）をコードするヌクレオチドをさらに含む、実施形態１〜１３、及び４３〜４５のいずれか１つの方法。
４７．ターゲティングリガンドが、ＣＤ３８、Ｇタンパク質共役型受容体１８（Ｇｐｒ１８）、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）、ＣＤ６４、又はＣＤ６８に結合する、実施形態１２、及び４３〜４６のいずれか１つの方法。
４８．免疫細胞の活性状態を変更することが、免疫細胞の集団において活性化状態の免疫細胞のパーセンテージを５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く減少させることを含む、実施形態１〜１３、及び４３〜４７のいずれか１つの方法。
４９．免疫細胞の活性状態を変更することが、免疫細胞の集団において活性化状態の免疫細胞の数を５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く減少させることを含む、実施形態１〜１３、及び４３〜４８のいずれか１つの方法。
５０．免疫細胞の活性状態を変更することが、免疫細胞の集団において不活性化状態の免疫細胞のパーセンテージを５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く増やすことを含む、実施形態１〜１３、及び４３〜４９のいずれか１つの方法。
５１．免疫細胞の活性状態を変更することが、免疫細胞の集団において不活性化状態の免疫細胞の数を５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く増やすことを含む、実施形態１〜１３、及び４３〜５０のいずれか１つの方法。
５２．がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象内の腫瘍において腫瘍関連マクロファージの活性状態を不活性化から活性化に変更し、それによってがんの処置を必要とする対象においてがんを処置することを含む方法。
５３．腫瘍が、卵巣がん腫瘍、神経膠芽腫腫瘍、又は転移性肺がん腫瘍である、実施形態５２の方法。
５４．変更は、腫瘍関連マクロファージの活性状態を不活性化から活性化に変更する１つ以上の転写因子をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子の治療有効量の投与に続いて起こる、実施形態５２又は５３の方法。
５５．ナノ粒子が、正電荷コア、ポリ（β）アミノエステルコア、星型ポリマー、ポリグルタミン酸コーティング、ヒアルロン酸コーティング、中性電荷コーティング、及び／又はリポソームナノ粒子を含む、実施形態５４の方法。
５６．ナノ粒子が＜１３０ｎｍである、実施形態５４又は５５の方法。
５７．ヌクレオチドがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、実施形態５４〜５６のいずれか１つの方法。
５８．ヌクレオチドがコア内にカプセル化されている、実施形態５４〜５７のいずれか１つの方法。
５９．投与が局所投与である、実施形態５４〜５８のいずれか１つの方法。
６０．局所投与が腹腔内又は頭蓋内である、実施形態５９の方法。
６１．投与が全身投与である、実施形態５４〜５９のいずれか１つの方法。
６２．コードされた１つ以上の転写因子が、１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）を含む、実施形態５４〜６１のいずれか１つの方法。
６３．コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的自己阻害ドメインを欠く、実施形態６２の方法。
６４．コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、実施形態６２又は６３の方法。
６５．コードされた１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合体から選択される、実施形態６２〜６４のいずれか１つの方法。
６６．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜１７に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態６２〜６５のいずれか１つの方法。
６７．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜７から選択されるＩＲＦ５である、実施形態６２〜６６のいずれか１つの方法。
６８．ＩＲＦ５が配列番号１である、実施形態６７の方法。
６９．ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号１又は配列番号３である、実施形態６７又は６８の方法。
７０．ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ、及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２である、実施形態６７〜６９のいずれか１つの方法。
７１．ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ、及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号４である、実施形態６７〜７０のいずれか１つの方法。
７２．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号８及び１２から選択されるＩＲＦ１である、実施形態６２〜７１のいずれか１つの方法。
７３．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１１、１６及び１７から選択されるＩＲＦ８である、実施形態６２〜７２のいずれか１つの方法。
７４．ＩＲＦ８がＫ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号１１である、実施形態７３の方法。
７５．コードされた１つ以上のＩＲＦが、Ｎ末端ＩＲＦ７ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び構成的活性ドメイン（ＣＡＤ）並びにＣ末端ＩＲＦ３ ＮＥＳ（核外移行シグナル）及び会合ドメインを含むＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質を含む、実施形態６２〜７４のいずれか１つの方法。
７６．ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が、ＩＲＦ３会合ドメインにおいてリン酸化を模倣する突然変異をさらに含む、実施形態７５の方法。
７７．ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が配列番号１５に示されている、実施形態７５又は７６の方法。
７８．ナノ粒子が、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドをさらに含む、実施形態５４〜７７のいずれか１つの方法。
７９．コードされたＩＫＫβが、配列番号１８〜２２に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態７８の方法。
８０．コードされたＩＫＫβが配列番号１８〜２２から選択される、実施形態７８又は７９の方法。
８１．ヌクレオチドが、配列番号２３〜４４から選択される配列を含む、実施形態５４〜７９のいずれか１つの方法。
８２．ナノ粒子がターゲティングリガンドをさらに含む、実施形態５４〜８１のいずれか１つの方法。
８３．ターゲティングリガンドがコーティングに連結されている、実施形態８２の方法。
８４．ターゲティングリガンドがＣＤ２０６、ＣＤ１６３、又はＣＤ２３に結合する、実施形態８２又は８３の方法。
８５．ターゲティングリガンドがジマンノースである、実施形態８２〜８４のいずれか１つの方法。
８６．１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子にカプセル化されている、実施形態５４〜８５のいずれか１つの方法。
８７．１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが異なるナノ粒子にカプセル化されている、実施形態５４〜８６のいずれか１つの方法。
８８．マクロファージの活性状態を変更することが、腫瘍内のマクロファージの集団において不活性化状態のマクロファージのパーセンテージを５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く減少させることを含む、実施形態５４〜８７のいずれか１つの方法。
８９．マクロファージの活性状態を変更することが、腫瘍内のマクロファージの集団において不活性化状態のマクロファージの数を５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く減少させることを含む、実施形態５４〜８８のいずれか１つの方法。
９０．マクロファージの活性状態を変更することが、腫瘍内のマクロファージの集団において活性化状態のマクロファージのパーセンテージを５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く増やすことを含む、実施形態５４〜８９のいずれか１つの方法。
９１．マクロファージの活性状態を変更することが、腫瘍内のマクロファージの集団において活性化状態のマクロファージの数を５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く増やすことを含む、実施形態５４〜９０のいずれか１つの方法。
９２．がんワクチン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）免疫療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、シグナル伝達阻害剤、遺伝子発現調節剤、アポトーシス誘導剤、血管新生阻害剤、及び毒性分子を送達するモノクローナル抗体から選択される療法を、治療有効量のナノ粒子と組み合わせて施すことをさらに含む、実施形態５４〜９１のいずれか１つの方法。
９３．自己免疫疾患の処置を必要とする対象において自己免疫疾患を処置する方法であって、対象内のマクロファージの活性状態を活性化から不活性化に変更し、それによって自己免疫疾患の処置を必要とする対象において自己免疫疾患を処置することを含む方法。
９４．自己免疫疾患が、急性壊死性出血性脳疾患、アレルギー性喘息、円形脱毛症、貧血症、アフタ性潰瘍、関節炎（関節炎リウマチ、若年性関節炎リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、喘息、自己免疫性甲状腺炎、結膜炎、クローン病、皮膚エリテマトーデス、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、糖尿病、真性糖尿病、らい性結節性紅斑、角結膜炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群に続く乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、膣炎及びウェゲナー肉芽腫症を含む、実施形態９３の方法。
９５．変更は、マクロファージの活性状態を活性化から不活性化に変更する１つ以上の転写因子をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子の治療有効量の投与に続いて起こる、実施形態９３又は９４の方法。
９６．ナノ粒子が、正電荷コア、ポリ（β）アミノエステルコア、星型ポリマー、ポリグルタミン酸コーティング、ヒアルロン酸コーティング、中性電荷コーティング、及び／又はリポソームナノ粒子を含む、実施形態９４の方法。
９７．ナノ粒子が＜１３０ｎｍである、実施形態９４又は９５の方法。
９８．ヌクレオチドがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、実施形態９５〜９７のいずれか１つの方法。
９９．ヌクレオチドがコア内にカプセル化されている、実施形態９５〜９８のいずれか１つの方法。
１００．投与が局所投与である、実施形態９５〜９９のいずれか１つの方法。
１０１．局所投与が腹腔内又は頭蓋内である、実施形態１００の方法。
１０２．投与が全身投与である、実施形態９２〜９９のいずれか１つの方法。
１０３．コードされた１つ以上の転写因子が、１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）を含む、実施形態９５〜１０２のいずれか１つの方法。
１０４．コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的自己阻害ドメインを欠く、実施形態１０３の方法。
１０５．コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、実施形態１０３又は１０４の方法。
１０６．コードされた１つ以上のＩＲＦがＩＲＦ４である、実施形態１０３〜１０５のいずれか１つの方法。
１０７．ナノ粒子が、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）をコードするヌクレオチドをさらに含む、実施形態９５〜１０６のいずれか１つの方法。
１０８．ナノ粒子がターゲティングリガンドをさらに含む、実施形態８５〜１０７のいずれか１つの方法。
１０９．ターゲティングリガンドが、コーティングに連結されている、実施形態１０８の方法。
１１０．ターゲティングリガンドが、ＣＤ３８、Ｇタンパク質共役型受容体１８（Ｇｐｒ１８）、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）、ＣＤ６４、又はＣＤ６８に結合する、実施形態１０８又は１０９の方法。
１１１．マクロファージの活性状態を変更することが、マクロファージの集団において活性化状態のマクロファージのパーセンテージを５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く減少させることを含む、実施形態９３〜１１０のいずれか１つの方法。
１１２．マクロファージの活性状態を変更することが、マクロファージの集団において活性化状態のマクロファージの数を５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く減少させることを含む、実施形態９３〜１１１のいずれか１つの方法。
１１３．マクロファージの活性状態を変更することが、マクロファージの集団において不活性化状態のマクロファージのパーセンテージを５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く増やすことを含む、実施形態９５〜１１２のいずれか１つの方法。
１１４．マクロファージの活性状態を変更することが、マクロファージの集団において不活性化状態のマクロファージの数を５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く増やすことを含む、実施形態９５〜１１３のいずれか１つの方法。
１１５．１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を含む組成物。
１１６．薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態１１５の組成物。
１１７．ナノ粒子が、正電荷コア、ポリ（β）アミノエステルコア、星型ポリマー、ポリグルタミン酸コーティング、ヒアルロン酸コーティング、中性電荷コーティング、及び／又はリポソームナノ粒子を含む、実施形態１１５又は１１６の組成物。
１１８．ナノ粒子が＜１３０ｎｍである、実施形態１１５〜１１７のいずれか１つの組成物。
１１９．ヌクレオチドがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、実施形態１１５〜１１８のいずれか１つの組成物。
１２０．ヌクレオチドがコア内にカプセル化されている、実施形態１１５〜１１９のいずれか１つの組成物。
１２１．コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的自己阻害ドメインを欠く、実施形態１１５〜１２０のいずれか１つの組成物。
１２２．コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、実施形態１１５又は１２１の組成物。
１２３．コードされた１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合体から選択される、実施形態１１５〜１２２のいずれか１つの組成物。
１２４．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜１７に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態１１５〜１２３のいずれか１つの組成物。
１２５．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜７から選択されるＩＲＦ５である、実施形態１１５〜１２４のいずれか１つの組成物。
１２６．ＩＲＦ５が配列番号１である、実施形態１２５の組成物。
１２７．ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号１又は配列番号３である、実施形態１２５又は１２６の組成物。
１２８．ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ、及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２である、実施形態１２５〜１２７のいずれか１つの組成物。
１２９．ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ、及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号４である、実施形態１２５〜１２８のいずれか１つの組成物。
１３０．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号８及び１２から選択されるＩＲＦ１である、実施形態１１５〜１２９のいずれか１つの組成物。
１３１．コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１１、１６及び１７から選択されるＩＲＦ８である、実施形態１１５〜１３０のいずれか１つの組成物。
１３２．ＩＲＦ８がＫ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号１１である、実施形態１３１の組成物。
１３３．コードされた１つ以上のＩＲＦが、Ｎ末端ＩＲＦ７ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び構成的活性ドメイン（ＣＡＤ）並びにＣ末端ＩＲＦ３ ＮＥＳ（核外移行シグナル）及び会合ドメインを含むＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質を含む、実施形態１１５〜１３２のいずれか１つの組成物。
１３４．ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が、ＩＲＦ３会合ドメインにおいてリン酸化を模倣する突然変異をさらに含む、実施例１３３の組成物。
１３５．ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が配列番号１５に示されている、実施形態１３３又は１３４の組成物。
１３６．ナノ粒子が、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドをさらに含む、実施形態１１５〜１３５のいずれか１つの組成物。
１３７．コードされたＩＫＫβが、配列番号１８〜２２に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態１３６の組成物。
１３８．コードされたＩＫＫβが配列番号１８〜２２から選択される、実施形態１３６又は１３７の組成物。
１３９．ヌクレオチドが、配列番号２３〜４４から選択される配列を含む、実施形態１１５〜１３８のいずれか１つの組成物。
１４０．ナノ粒子が、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ−２、ＭＤＲ−１、ｐ２１、ｐ１６、ｂａｘ、ｂｃｌ−ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ−Ｉ ＶＥＧＦ、アンジオスタチン、オンコスタチン、エンドスタチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／又はＨＳＶ−ｔｋから選択される１種以上の抗がん遺伝子を担持するヌクレオチドをさらに含む、実施形態１１５〜１３９のいずれか１つの組成物。
１４１．コードされた１つ以上のＩＲＦがＩＲＦ４である、実施形態１１５〜１２２のいずれか１つの組成物。
１４２．ナノ粒子が、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）をコードするヌクレオチドをさらに含む、実施形態１１５〜１２２、及び１４１のいずれか１つの組成物。
１４３．ナノ粒子がターゲティングリガンドをさらに含む、実施形態１１５〜１４２のいずれか１つの組成物。
１４４．ターゲティングリガンドがコーティングに連結されている、実施形態１４３の組成物。
１４５．ターゲティングリガンドがＣＤ２０６、ＣＤ１６３、又はＣＤ２３に結合する、実施形態１４３又は１４４の組成物。
１４６．ターゲティングリガンドがジマンノースである、実施形態１４５の組成物。
１４７．ターゲティングリガンドが、ＣＤ３８、Ｇタンパク質共役型受容体１８（Ｇｐｒ１８）、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）、ＣＤ６４、又はＣＤ６８に結合する、実施形態１４３又は１４４の組成物。
１４８．１つ以上のＩＲＦ、ＩＫＫβ、及び／又はＧＩＬＺをコードするヌクレオチドが、同じナノ粒子中にカプセル化されている、実施形態１１５〜１４７のいずれか１つの組成物。
１４９．１つ以上のＩＲＦ、ＩＫＫβ、及び／又はＧＩＬＺをコードするヌクレオチドが、異なるナノ粒子中にカプセル化されている、実施形態１１５〜１４８のいずれか１つの組成物。
［実施例１］ 材料及び方法。ＰｂＡＥ合成。ポリマーを合成するのに使用する方法はすでに記載されていた（Ｍａｎｇｒａｖｉｔｉ Ａら、（２０１５）ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９：１２３６〜１２４９頁）。１，４−ブタンジオールジアクリレートは、ジアクリレート対アミン単量体の１対１モル比で４−アミノ−１−ブタノールと組み合わせた。アクリレート端末ポリ（４−アミノ−１−ブタノール−１，４−ブタンジオールジアクリレート共重合体）は、混合物を２４時間攪拌しながら９０℃まで加熱することにより形成した。このポリマーの２．３ｇを２ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。ピペラジンキャップド４４７ポリマーを形成するため、１３ｍＬのＴＨＦ中７８６ｇの１−（３−アミノプロピル）−４−メチルピペラジンをポリマー／ＴＨＦ溶液に添加し、室温（ＲＴ）で２時間攪拌した。キャップドポリマーは５容積のジエチルエーテルで沈澱させ、２容積の新しいエーテルで洗浄し、１日真空下で乾燥させた。純ポリマーはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１００ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解し、−２０℃で保存した。
ジマンノースへのＰＧＡコンジュゲーション．α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノース（Ｄｉ−ｍａｎｎｏｓｅ、Ｏｍｉｃｒｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）をポリグルタミン酸（ＰＧＡ）にコンジュゲートする前にグルコシルアミンに改変した。先ず、ジマンノース（１５７ｍｇ）を１０．５ｍＬの飽和水性炭酸アンモニウムに溶解し、室温で２４時間攪拌した。２日目、さらに多くの固体炭酸アンモニウムを、ジマンノースが反応液から沈澱するまで添加した。混合物はＴＬＣにより測定した場合、完了するまで攪拌し、続いて凍結乾燥して過剰な炭酸アンモニウムを取り除いた。揮発性塩の完全な除去は、固体をメタノールに再溶解することにより達成した。これらの手順により、今後のＰＧＡとのコンジュゲーションのためにアノマー炭素上にアミンが作り出された。
アミノ化ジマンノースをＰＧＡにコンジュゲートするため、基質を３０ｍｇ／ｍＬまで水に溶解し、次に１０分間超音波処理した。水中エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ＨＣＬ（４ｍｇ／ｍＬ、３０当量）を、室温で４分間混合しながら添加した。水中Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（３０ｍｇ／ｍＬ、３５当量）を、ＰＧＡ／ＥＤＣ液と一緒に１分間インキュベートした。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中アミノ化ジマンノースは、得られた活性化ＰＧＡと４４対１のモル比で組み合わせ、室温で６時間混合した。過剰な試薬は、２４時間水に対して透析することにより取り除いた。
ｍＲＮＡ合成．ｅＧＦＰ、ＩＲＦ５、及びＩＫＫ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）についてのコドン最適化ｍＲＮＡは、アンチリバースキャップアナログ３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＡＲＣＡ）でキャップし、修飾リボヌクレオチドプソイドウリジン（ψ）及び５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で完全に置換した。
ナノ粒子調製。ＩＲＦ５及びＩＫＫβ ｍＲＮＡは３対１（ｗ対ｗ）比で組み合わせ、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）バッファー（ｐＨ＝５．２）中１００μｇ／ｍＬまで希釈した。ＤＭＳＯ（上記の通り調製）中ポリ（β−アミノアステル）−４４７（ＰｂＡＥ−４４７）ポリマーを、やはりＮａＯＡｃバッファー中１００μｇ／μＬから６μｇ／μＬまで希釈した。ナノ粒子を形成するため、ＰｂＡＥ−４４７ポリマーを６０対１（ｗ対ｗ）の比でｍＲＮＡに添加し、直ちに中速度で１５秒間ボルテックスし、次に混合物は室温で５分間インキュベートして、ＰｂＡＥ−ｍＲＮＡポリプレックスを形成させた。次のステップにおいて、ＮａＯＡｃバッファー中１００μｇ／ｍＬのＰＧＡ／ジマンノースをポリプレックス溶液に添加し、中速度で１５秒間ボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。この工程において、ＰＧＡ／ジマンノースがＰｂＡＥ−ｍＲＮＡポリプレックスの表面を被覆して最終ＮＰを形成した。長期貯蔵のため、Ｄ−スクロース（６０ｍｇ／ｍＬ）を凍結保護物質としてＮＰ溶液に添加した。ナノ粒子はドライアイスで瞬間凍結し、次に凍結乾燥した。乾燥ＮＰは使用するまで−２０℃又は−８０℃で貯蔵した。インビボ実験において、凍結乾燥したＮＰは１対２０（ｗ対ｖ）比で水に再懸濁した。
ナノ粒子サイズ分布及びζ電位の特徴付け。ＮＰの物理化学的特性（流体力学半径、多分散、ζ電位及び安定性を含む）は、２５℃でＺｅｔａｐａｌｓ器具（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して特徴付けた。動的光散乱に基づいて流体力学半径及び多分散を測定するため、ＮＰを２５ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５．２）中に５倍希釈した。ζ電位を測定するため、ＮＰを１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）に１０倍希釈した。ＮＰの安定性を評価するため、新たに調製した粒子を１０ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）に希釈した。ＮＰの流体力学半径及び多分散は１０分ごとに５時間測定し、そのサイズ及び粒子濃度は、Ｎａｎｏｓｉｔｅ ３００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して粒子トラッキング解析から導き出した。透過型電子顕微鏡を使用してＮＰを特徴付けるため、以前記載されたプロトコールに従った（Ｓｍｉｔｈ ＴＴら、（２０１７）Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １２：８１３〜８２０頁）。新たに作成したＮＰ（０．８３μｇのｍＲＮＡを含有する２５μＬ）を、グロー放電処理２００メッシュ炭素／Ｆｏｒｍｖａｒ被覆銅グリッド上に沈着させた。３０秒後、グリッドは、５０％のＫａｒｎｏｖｓｋｙ定着液、０．１Ｍのカコジル酸バッファー、ｄＨ２Ｏ、次に１％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルで順次処理した。試料は、１２０ｋＶで作動するＪＥＯＬ ＪＥＭ−１４００透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ）で撮像した。
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）及び他の細胞株。ＢＭＤＭを調製するため、確立したプロトコール（Ｚｈａｎｇ Ｘら、（２００８）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １４：Ｕｎｉｔ １４ １１）に従って骨髄前駆細胞をマウス大腿骨から収集した。これらの細胞は完全培地［４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、Ｌ−グルタミン、１０％の熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを補充したＤＭＥＭ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ＃３１５−０２）を補充した、１００μｇ／ｍＬ、Ｇｌｕｔａｍａｘ５０ｍＬ／５００ｍＬ］において播種密度０．５〜１．０ ｅ６／ｍｌで培養した。細胞は、エクスビボで７日間、５％ＣＯ２下、３７℃でＢＭＤＭ中に分化させておいた。次に、細胞は、マクロファージ条件付け培地［２０ｎｇ／ｍＬのＭＰＬＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｌ６８９５）又は２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ４（ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ、カタログ＃３４−８０４１）を補充したマクロファージ完全培地］で条件付けした。ＢＭＤＭはエクスビボで７〜２１日間使用した。マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８は、Ｄｒ．Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｒｏｂｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＫＳ）からの寄贈であるが、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、５μｇ／ｍＬのインスリン、５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、及び５ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭにおいて培養した。より侵襲性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現ＩＤ８株を作成するため、ＩＤ８腫瘍細胞に、マウスＶＥＧＦをブラストサイジン耐性遺伝子と一緒にコードするｐＵＮＯ１プラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを得るため、腫瘍細胞は、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を含有する完全培地において３週間培養した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞株（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関）を、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、２ｍＭ／Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールを有する完全ＲＰＭＩ １６４０培地において培養した。インビボ生物発光イメージングにおいて、ＩＤ８−ＶＥＧＦとＢ１６Ｆ１０細胞株の両方にホタルルシフェラーゼをレトロウイルス性に形質導入した。ＲＡＣＳ−ＰＤＧＦβ又はＲＣＡＳ−ｃｒｅレトロウイルスを担持するＤＦ−１細胞株は、１０％のＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを補充した完全培地において５％のＣＯ２下、３９℃で培養した。
ＢＭＤＭのｍＲＮＡトランスフェクション。トランスフェクションに１日先立って、ＢＭＤＭは、マクロファージ完全培地において２４ウェルプレート上に２５０，０００／ウェルの濃度で再播種した。トランスフェクション前、完全培地は３００μＬの非補充ＤＭＥＭで置き換えた。これらの細胞にトランスフェクトするため、２μｇのｍＲＮＡを含有するＮＰを基本培地中に添加し、３７℃でＢＭＤＭと共培養した。１時間後、ＮＰを含有する培地は取り除き、細胞は、トランスフェクション効率及び細胞生存率を評価する前にさらに２４時間培養した。
マクロファージシグネチャー遺伝子分析のためのＢＭＤＭのトランスフェクション。ＢＭＤＭはトランスフェクション２４時間前に条件付け培地で２４ウェルプレート上に再播種し、細胞をその表現型に形質転換させておいた。次に、上記のトランスフェクションプロトコールに従って、Ｍ２様マクロファージを、レポーターとして２５％のｅＧＦＰ ｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ又は２μｇのｍＲＮＡを担持するｅＧＦＰ ＮＰ（対照）に曝露した。２４時間後、高度にトランスフェクトしたＢＭＤＭの上から１０％（ｅＧＦＰ発現により測定した）をトランスフェクション後２４時間で選別し、ＲＮＡ単離前さらに４８時間、低用量（１０ｎｇ／ｍＬ）ＩＬ４培地において再チャレンジした。これらの細胞から抽出されたＲＮＡは、ＩＲＦ５−ＮＰ処置に関連するシグネチャー遺伝子を同定できるように、標準Ｍ１又はＭ２様マクロファージ由来のＲＮＡと比較した。
ＲＮＡ単離及び調製。ＲＮＡを収集するため、ＢＭＤＭはＴｒｉｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）に溶解し、全ＲＮＡを抽出して、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。試料ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して定量化し、次にＡｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ）でＦＨＣＲＣゲノム共用資源により実施される品質管理を受けさせた。
ナノストリング技術によるマクロファージシグネチャー遺伝子分析。刺激を受けたＢＭＤＭ培養物からの遺伝子発現値は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）骨髄自然免疫パネル（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して測定し、この装置は１９の異なる経路に存在する７７０の遺伝子を分析し、７つの異なる骨髄細胞型にわたり遺伝子を処理する。試料は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して試験した。生データは、Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＱＣＰｒｏソフトウェアパッケージ（Ｎｉｃｋｌｅｓ Ｄ、Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｔ、Ｚｉｍａｎ Ｒ ａｎｄ Ｂｏｕｒｇｏｎ Ｒ（２０１８）ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＱＣＰｒｏ：Ｑｕａｌｉｔｙ ｍｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｄａｔａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ．Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．１０．０．）を使用して処理し、品質について点検した。発現値は、ハウスキーピング遺伝子の幾何平均に正規化され、ｎＳｏｌｖｅｒ ４．０ソフトウェア（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用してｌｏｇ２変換した。比例データについての偽陽性率は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｙｅｋｕｔｉｅｌｉ法を使用するｔ−検定により戻されたｐ値から計算した。
フローサイトメトリー及び細胞選別。脾臓、血液、腹膜灌流、及び気管支肺胞洗浄から得た細胞は、図９に収載されている抗マウス抗体プローブを使用して骨髄及びリンパ系免疫表現型検査パネルでフローサイトメトリーにより分析した。データは、ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を実行するＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ分析器を使用して収集した。ＣＤ１１ｂ＋及びＦ４／８０＋腹腔マクロファージは、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ ＩＩを使用して選別した。収集したデータはすべてＦｌｏｗＪｏ １０．０ソフトウェアを使用して解析した。
サイトカイン分析。サイトカインレベルは、ＦＨＣＲＣ免疫モニタリング共用資源センターでＬｕｍｉｎｅｘ ２００システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して評価した。エクスビボ研究において、細胞培養上澄みを、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＮＦγ、及びＴＮＦα濃度の測定のために収集した。インビボ研究において、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＴＮＦαの血漿濃度を測定した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。遺伝子発現レベルはｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。選択されたマクロファージシグネチャー遺伝子（セルピンＢ２、Ｒｅｔｎｌａ、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ１１、コドン最適化ＩＲＦ５、内在性ＩＲＦ５、及びハウスキーピングＧＡＰＤ遺伝子）を測定するため、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ−ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用いて単離した。ｃＤＮＡは、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ）を使用して合成した。試料ごとに、ＲｏｃｈｅのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＵＰＬ）由来の遺伝子特異的プローブ及びＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）により最適化されたＰＣＲプライマーを使用するＰｅｒｆｅＣＴａ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｌｏｗ ＲＯＸ（Ｑｕａｎｔａ）を経て３通りに実施した：セルピンＢ２、ＵＰＬ−０４９、Ｆ−ＡＣＴＧＧＧＧＣＡＧＴＴＡＴＧＡＣＡＧＧ（配列番号９６）、Ｒ−ＧＡＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＴＧ（配列番号９７）；Ｒｅｔｎｌａ、ＵＰＬ−０７８、Ｆ−ＴＴＧＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＴ（配列番号９８）、Ｒ−ＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡ（配列番号９９）；Ｃｃｌ５、ＵＰＬ−１０５、Ｆ−ＣＣＴＡＣＴＣＣＣＡＣＴＣＧＧＴＣＣＴ（配列番号１００）、Ｒ−ＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧＣＴＧＴ（配列番号１０１）；Ｃｃｌ１１、ＵＰＬ−０１８、Ｆ−ＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧＣＧＣＴＴＣ（配列番号１０２）、Ｒ−ＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＡ（配列番号１０３）；コドン最適化ＩＲＦ５、ＵＰＬ−０２２、Ｆ−ＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＡＧＡＡＣＡＧＴ（配列番号１０４）、Ｒ−ＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＣ（配列番号１０５）；内在性ＩＲＦ５、ＵＰＬ−０１１、Ｆ−ＧＣＴＧＴＧＣＣＣＴＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣ（配列番号１０６）、Ｒ−ＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＣＡＴＧＴＣＴ（配列番号１０７）。シグネチャー遺伝子ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤ、ＵＰＬ−０６０、Ｆ−ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ（配列番号１０８）及びＲ−ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ（配列番号１０９）の増幅に基づいて正規化した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応はすべて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を実行するＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５ ＲＴ−ＰＣＲ装置を使用して実施した。増幅プロットが閾値を通過せずＣｔ値が得られない（「未決定の」）場合、アッセイでの最高のサイクル数（４０サイクル）に等しいＣｔ値を相対的発現の比較のために使用した。
マウス及びインビボ腫瘍モデル。脳腫瘍モデル関連の実験を除いて、これらの実験で使用するマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、その他のマウスはＦＨＣＲＣ動物施設で繁殖させ収容した。マウスはすべて、センターの動物実験委員会が承認したプロトコールに照らして使用した。卵巣腫瘍をモデル化するため、５×１０６の血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦＰ）発現ＩＤ８細胞を、生後４〜６週間のメスのアルビノＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒ＜ｃ−２Ｊ＞）マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、２週間確立させておいた。生存研究に関して、動物は、５０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５ ＮＰ／ｅＧＦＰ ＮＰでｉ．ｐ．処置した（９週間の間、週当たり２用量で、又は健康な状態が安楽死要件に達するまで）。機序研究に関して、１、２、又は３週間の処置を使用し、続いて、最後の用量に続く４８時間で安楽死させた。腹膜灌流を実施して腹腔細胞を収集した。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰと現状のマクロファージターゲティング療法の効率を比べるため、マウスの１つの群は、週当たり２用量で３週間の間、５０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰでの処置を受け、第２の群は、３週間毎日、溶媒（ポリエチレングリコール４００中５％の１−メチル−２−ピロリジノン）で処方した１５ｍｇ／ｋｇのＰＩ３Ｋγ阻害剤ＩＰＩ−５９４（ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）の経口投与を受け；第３の群は、３週間毎日、同じ溶媒で処方した３０ｍｇ／ｋｇのＣＳＦ１Ｒ阻害剤ペキシダルチニブ（ＰＬＸ３３９７、ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）のｉ．ｐ．注射を受けた。
転移性肺がんをモデル化するため、Ｆ−ｌｕｃを形質導入し２００μＬのＲＰＭＩ培養液に懸濁された２．５×１０４の１６Ｆ１０細胞を、生後４〜６週間のメスのアルビノＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒ＜ｃ−２Ｊ＞）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に注射し、１週間確立させておいた。生存研究に関して、マウスは、ＰＢＳ中に懸濁された３０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ又はｅＧＦＰ ＮＰで（又はなしで）後眼窩に処置した。マウスは、３週間の間、週当たり３用量で、又は健康な状態が安楽死要件に達するまで処置した。機序研究に関して、マウスは２週間、同じ処置を受けた。気管支肺胞洗浄を実施して分析のために肺胞細胞を収集した。
神経膠腫を抱えたマウスを、公表されているプロトコール（Ｕｈｒｂｏｍ Ｌら、（２００４）Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：１２５７〜１２６０頁）に従って作成した。ＲＣＡＳ−ＰＤＧＦβ及びＲＣＡＳ−ｃｒｅレトロウイルスを産出しているトリＤＦ−１細胞を、生後４〜６週間でＮｅｓｔｉｎ−ｔｖ−ａ／Ｉｎｋ４ａ−ａｒｆ−／−；Ｐｔｅｎ−／−マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の両方の脳半球（座標：前頂から１ｍｍ尾側、２ｍｍ側部、硬膜表面から２ｍｍの深さ）の頭蓋内に注射した。腫瘍は２週間確立させておいた。１５日目、マウスは１つの半球に１０Ｇｙの放射線を受け、その間未照射半球は鉛で遮蔽した。次の日、マウスは、３０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの後眼窩注射を受ける（３週間の間、週当たり３用量）、又はＰＢＳ対照群に割り当てられた。
インビボ生物発光イメージング。ＰＢＳ中Ｄ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）（１５ｍｇ／ｍＬ）を、ホタルルシフェラーゼイメージングのための基質として使用した。生物発光画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で収集した。マウスは、イメージング前及び最中に２％のイソフルラン（Ｆｏｒａｎｅ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で麻酔にかけた。ＩＤ８−ＶＥＧＦ卵巣腫瘍に関して、それぞれのマウスは、３００μｇのＤ−ルシフェリンをｉ．ｐ．注射し、画像は１０分後に収集した。Ｂ１６Ｆ１０肺転移性腫瘍に関して、マウスは、３ｍｇのＤ−ルシフェリンをｉ．ｐ．注射し、画像は１５分後に収集した。脳腫瘍モデルに関して、マウスは、７５ｍｇ／体重ｋｇのＤ−ルシフェリンの後眼窩注射を受け、画像は４分後に収集した。捕捉時間は１０秒〜５分の範囲に及んだ。
体内分布分析。ＩＤ８−ＶＥＧＦ卵巣腫瘍モデルにおけるＩＲＦ５ ＮＰの体内分布を決定するため、７〜８群のマウスが、５０μｇのｍＲＮＡを担持するＮＰのｉ．ｐ．又は後眼窩用量を受けた。注射２４時間後、全血を収集し、マウスはＣＯ２で安楽死させ、臓器（肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、腸、膵臓、及び横隔膜）を回収した。すべての組織はＲＮＡｌａｔｅｒで安定化し、次に、ドライアイス上で凍結した。それぞれの臓器におけるコドン最適化ＩＲＦ５ ｍＲＮＡレベルはＲＴ−ｑＰＣＲを使用して測定した。
毒性分析。繰り返し注入マクロファージターゲティングＮＰの潜在的なインビボ毒性を測定するため、３週間の経過にわたり５０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ又はｅＧＦＰ ＮＰの６連続用量をマウス（５／群）の静脈内に注射した。対照は処置を受けなかった。最終注入の２４時間後、マウスに麻酔をかけ、血液を後眼窩出血により収集し、全血球数を決定した。血液は、血清化学及びサイトカインプロファイル分析のためにも収集した（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｕｋｉｌｔｅｏ、ＷＡにより実施した）。次に、動物はＣＯ２で安楽死させ、臓器を回収し、４％のパラホルムアルデヒドに固定する前に脱イオン水で洗浄した。組織はルーチン処理し、切片はヘマトキシリン−エオジンで染色した。検体は、委員会認定の局員病理学者のＤｒ．Ｓｍｉｔｈａ Ｐｉｌｌａｉ ＭＶＳｃ、ＰｈＤ、ＤＡＣＶＰにより、盲検様式で解釈された。
サイトカインアッセイ。サイトカインレベルは、ＦＨＣＲＣ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓにおいてルミネックス２００システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して評価した。エクスビボ研究に関して、細胞培養上澄みを、ＩＬ−６、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＮＦγ、及びＴＮＦαの濃度の測定のために収集した。インビボ研究に関して、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＴＮＦαの血漿濃度を測定した。
統計解析。観察された相違の統計的有意は、独立両側一元配置分散分析検定を使用して分析した。測定ごとのＰ値は、図又は図説明文に収載されている。生存データは、対数順位検定を使用して特徴付けた。統計解析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０又はＲソフトウェアを使用して実施した。
結果。ＴＡＭのＩＶＴ ｍＲＮＡトランスフェクションを構成するためにＮＰを設計する．陽イオンポリ（βアミノエステル）（ＰｂＡＥ）ポリマーと陰イオンｍＲＮＡの間の静電相互作用を利用することにより、標的化細胞における頑強な遺伝子発現を導入することができる標的化ｍＲＮＡ送達システムを開発した（図２Ａ）。得られたナノ担体にカプセル化されたｍＲＮＡの安定性及び翻訳を改善するため、改変リボヌクレオチドプソイドウリジン（ψ）（Ｋａｒｉｋｏ Ｋら、（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６：１８３３〜１８４０頁）及び５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を組み込み、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）（Ｑｕａｂｉｕｓ ＥＳら、（２０１５）Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２：２２９〜２３５頁）でキャップされたメッセージの合成バージョンを使用した。ｍＲＮＡは、ＰｂＡＥ骨格においてエステル結合の加水切断により細胞内でｍＲＮＡ−ＰｂＡＥ複合体から放出される。効率的なインビボＴ細胞トランスフェクションは、このシステムを使用して以前実証されていた（Ｓｍｉｔｈ ＴＴら、（２０１７）Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）。ナノ粒子を標的のＴＡＭに向け並びにナノ粒子が含有するｍＲＮＡ−ＰｂＡＥ複合体をさらに安定化するため、ジマンノース部分は、リンカーとしてポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を使用してその表面上に操作した（図２Ａ）。ＮＰは、単純な２ステップ電荷駆動自己組織化工程を利用して製造した。第１に、合成ｍＲＮＡは正電荷ＰｂＡＥポリマーと複合体化し、これによりｍＲＮＡはナノサイズ複合体中に凝縮される。このステップに続いて、ジマンノース官能基を持たされたＰＧＡを添加し、これは正電荷のＰｂＡＥ−ｍＲＮＡ粒子を遮蔽して、マクロファージ−ターゲティングを与える。得られたｍＲＮＡナノ担体は、９９．８±２４．５ｎｍのサイズ、０．１８３の多分散性、及び中性表面電荷（３．４０±２．１５ｍＶのζ電位、図２Ｂ〜２Ｃ）有していた。トランスフェクション効率は、先ず、緑色蛍光タンパク質コードｍＲＮＡで処方されたＮＰ（ＧＦＰ−ＮＰ）を使用してマウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）において試験した。手短に言えば、５０，０００のＢＭＤＭを１μｇのｍＲＮＡを含有するＮＰに１時間曝露し、続いて次の日、ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー測定を行った。単一ＮＰ適用に続いて、我々は、これら初代マクロファージの３１．９％（±８．５％）をそれらの生存率を減らすことなくルーチンにトランスフェクトした（図２Ｅ〜２Ｆ）。ジマンノースを用いた粒子の表面修飾は適切であった。なぜならば、非標的化（しかし、ＰＧＡ被覆された）ナノ担体でのトランスフェクション率はこの固有の食作用性細胞型において平均で２５％（±２．１％）まで低下したからであった。ＮＰは、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋マクロファージ集団を選択的に標的にし、マクロファージの４６％がトランスフェクトされ高レベルのｅＧＦＰを発現した（図２Ｄ）。この高度なトランスフェクション効率は、ＴＡＭへのｍＲＮＡの標的化送達において開示されたシステム及び方法の効力を実証している。マクロファージ極性化を誘導する転写因子候補を求めてのインビトロスクリーニングの結果に基づいて、ＮＰに包含するための２つのｍＲＮＡを選択し：第１のｍＲＮＡは、Ｍ１表現型に向かうマクロファージの極性化に有利に働くＩＲＦファミリーのキーとなるメンバーである、ＩＲＦ５をコードし、第２のｍＲＮＡはＩＲＦ５をリン酸化し活性化するキナーゼである、ＩＫＫβをコードする。
免疫抑制性マクロファージを炎症促進性表現型にプログラムする。マクロファージ極性化を誘導するため、ＮＰに包含するための２つのｍＲＮＡを選択し：第１のｍＲＮＡは、Ｍ１表現型に向かうマクロファージの極性化に有利に働くインターフェロン制御因子ファミリーのキーとなるメンバーである、ＩＲＦ５をコードし（Ｋｒａｕｓｇｒｕｂｅｒ Ｔら、（２０１１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：２３１〜２３８頁）；第２のｍＲＮＡは、ＩＲＦ５をリン酸化し活性化するキナーゼである、ＩＫＫβをコードする（Ｒｅｎ Ｊら、（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１：１７４３８〜１７４４３頁）。３ ＩＲＦ５ ｍＲＮＡ対１ ＩＫＫβ ｍＲＮＡの比を使用した。ＮＰ送達（及びコドン最適化）ＩＲＦ５ ｍＲＮＡに特異的なリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して、マクロファージにおけるｍＲＮＡ発現は１日目が最大であり、内在性因子レベルと比べてＩＲＦ５の１５００倍の増加がもたらされることが見出された（図２Ａ）。予想通り、遺伝子発現は一過性であるが、ＩＲＦ５レベルは、ベースラインに戻る前、３日目（５８１倍の増加）から５日目（８７倍の増加）を通じて強く上方調節されたままであった。
ＩＲＦ５／ＩＫＫβコードＮＰがＭ２マクロファージを治療的に望ましい抗がんＭ１表現型に再プログラムできるかどうかを判定するため、ナノストリング遺伝子発現分析を使用した。ＢＭＤＭは、先ず、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下で培養して、抑制性Ｍ２表現型を誘導した（図２Ｈ）。対照ＧＦＰ−ｍＲＮＡナノ粒子又はＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡ含有ＮＰでのトランスフェクションに続いて、遺伝子発現プロファイルを分析し炎症性マクロファージと比較した。この炎症性マクロファージは、ＢＭＤＭをＴＬＲ４アゴニストモノホスホリスリピドＡに曝露することにより別々に作成した。抑制性ＩＬ−４含有培地で培養されたが、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡ ＮＰをトランスフェクトされたマクロファージは、炎症性マクロファージに類似する遺伝子発現プロファイルを示す（図２Ｉ）。セルピンｂ２及びＣｃｌ２などのシグネチャーＭ２マクロファージ遺伝子（Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ Ｋら、（２０１５）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １０：ｅ０１４５３４２；Ｖａｒｇａ Ｔら、（２０１６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：４７７１〜４７８２頁）は、強く下方調節されており、Ｃｃｌ５などのキーとなるＭ１分化遺伝子（Ｓｉｃａ Ａら、（２０１２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２２：７８７〜７９５頁）は上方調節されていた（図２Ｊ、２Ｋ）。これらのデータにより、ＩＲＦ５及びそのキナーゼのＮＰ媒介発現は抑制性マクロファージを炎症促進性表現型のほうに歪めることが立証される。
［実施例２］ 播種性卵巣がんに対するＮＰ送達ｐｒｏ−Ｍ１遺伝子の治療効果。臨床関連インビボ試験システムにおいてこの処置アプローチを評価するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて後期切除不能卵巣腫瘍を再現するモデルを使用し；これらの動物には、腫瘍成長の連続生物発光イメージングを可能にするようにルシフェラーゼでタグ付けされたＩＤ８卵巣がん細胞を注射する（Ｌｉａｏ ＪＢら、（２０１５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ３：１６頁；Ｓｔｅｐｈａｎ ＳＢら、（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３：９７〜１０１頁）。腫瘍は２週間確立させておいた。この段階まで、マウスは腹膜壁全体に及び腸の腸間膜に小結節を発症していた。動物は、９週間の間１００μｇのｍＲＮＡ／マウス／週のｉ．ｐ．用量での、ＰＢＳ（対照）、ＧＦＰＮＰ（ニセ）、又はＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置を受ける３つの群に分けた（図４Ａ）。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群において、疾患が退行しており、最後には動物の４０％で除去されていることが観察された（全体で１４２日生存期間中央値対６０日対照；図４Ｂ〜４Ｃ）。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ媒介抗腫瘍効果の下にある機序を理解するため、マンノース受容体ターゲティングがＮＰ相互作用をどのようにして排他的に食細胞に限定するのかを先ず調べた。ジマンノースで標的化されたＮＰの最初の投与の２４時間後に収集された腹膜灌流液のフローサイトメトリーにより、マクロファージ及び単球中への優先的遺伝子移入（それぞれ、平均３７．１％及び１５．３％、図４Ｄ）が明らかにされ、オフターゲット細胞中へのトランスフェクションは低い又は検出されなかった。３週間にわたる（毎週２回注射）ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子又はＰＢＳを用いた処置に続く確立した卵巣がんを抱えたマウスの腹膜におけるマクロファージ／単球集団の詳細な表現型及び機能分析を次に行った。フローサイトメトリー分析によれば、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰは免疫抑制性マクロファージの集団（Ｌｙ６Ｃ−、Ｆ４／８０＋、ＣＤ２０６＋）を平均２．６％±２．１％対対照においては４３％±１５．６％まで減少させることが明らかになった（図４Ｅ〜４Ｆ）。反対に、Ｍ１様マクロファージの割合は０．５％±０．２％から１０．２％±４．１％まで増えた（図４Ｅ、４Ｇ）。ＩＲＦ５遺伝子療法は他の免疫細胞の集団にも影響を及ぼした。特に、炎症性単球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｃ＋、Ｌｙ６Ｇ−）がより豊富であった（非処置マウスでの４．５％±１．９％と比べて７３．４％±３．６％）。すべてのＩＲＦ５ ＮＰ処置マウスにおける１つの興味深い所見は、新生物内又は周辺に存在するリンパ球の多巣性密集クラスターであり（図４Ｈ）、免疫刺激性マクロファージの遺伝的プログラミングが固体腫瘍中へのリンパ球遊走及び浸潤を復活させる可能性があることを示している。
腹膜マクロファージは蛍光活性化細胞選別により単離して、それらのサイトカイン分泌を分析し、炎症促進性（抗腫瘍）サイトカインＩＬ−１２（３．４倍高い）、ＩＦＮ−ｇ（８．４倍高い）、及びＴＮＦ−α（１．５倍高い）の放出の頑強な増加を検出し、一方、選択的に活性化される（Ｍ２様）マクロファージへの分化に関連する制御サイトカインであるＩＬ−６のレベルは９７倍減少した；図４Ｉ）。ゲノム発現プロファイリングにより、ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子処置マウスにおいてＭ１様マクロファージ表現型の方に向かう分化が確認された。ＭＰＬＡ又はＩＬ−４においてエクスビボで培養されたマクロファージの遺伝子発現レベルは、それぞれ古典的Ｍ１様又はＭ２様マクロファージについての参照値を提供するために含まれた（図４Ｊ）。
生体分布及び安全性。ナノ粒子送達（コドン最適化）ＩＲＦ５のみを検出するように設計されたＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用して腹腔内注射の２４時間後に種々の臓器におけるナノ粒子の分布を次に定量化した。ＩＶＴ ｍＲＮＡの最高濃度は、肝臓、脾臓、腸、膵臓、及び横隔膜を含む、腹膜に位置する臓器において見出された（図５Ａ）。腹膜の外側に位置する臓器（心臓、肺、腎臓）における粒子送達ｍＲＮＡは少量が検出され、ｉ．ｐ．注射されたナノ担体の一部が全身循環に入ったことが示唆される。分布データに導かれて、次に我々は、これらのナノ試薬が生体適合性であり、繰り返し投与は安全であるかどうかを評価した。マウスに、全部で８用量のＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰを注射した（４週間の間、２回の５０μｇのｍＲＮＡ用量／週、図５Ｂ）。マウスは最終用量の２４時間後に安楽死させ、体重を記録し、血清化学のために血液を後眼窩出血により収集し、完全肉眼部検を実施した。群間には体重差はなかった。以下の組織：肝臓、脾臓、腸間膜、膵臓、胃、腎臓、心臓、及び肺は、委員会認定の局員病理学者により評価された。病理組織学的評価により、すべての症例で、腫瘍病変内又は周辺に存在するリンパ球の多巣性密集クラスターが明らかにされたが、炎症又は明らかな壊死の証拠は、新生物細胞が存在しない組織において観察されなかった（図５Ｃ）。その上、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置マウスの血清化学は、ＰＢＳ対照の血清化学と匹敵しており、全身的な毒性は起きていないことを示していた（図５Ｄ）。生体分布研究において少量のＩＲＦ５−ｍＲＮＡが全身的に検出されたので、末梢血中の炎症性サイトカインを定量化するための並列実験を設計した。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの単回ｉ．ｐ．注射に続いて、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の平均２６．８ｐｇ／ｍＬまでの（図５Ｅ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の平均９４．７ｐｇ／ｍＬまでの（図５Ｆ）血清レベルの中程度で一過性の増加が測定された。以前の報告に基づいて、これらのレベルは、病理学的所見に関連するレベルの５００分の１であり、したがって安全と見なすことができる（Ｔａｒｒａｎｔ Ｊ．Ｍ．（２０１０）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ １１７：４〜１６頁；Ｃｏｐｅｌａｎｄ Ｓら、（２００５）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：６０〜６７頁）。
ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子の静脈内注入で全身性腫瘍転移を制御する。腹膜全体に広がった腫瘍病変を処置するために腹膜腔中に直接投与されたＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰにより達成された治療応答に基づいて、問われた次の問題は、静脈内注入ｍＲＮＡナノ担体が伝播した疾患を制御するようにマクロファージを全身的にプログラムすることができるかどうかであった。ＲＴ−ｑＰＣＲ生体分布研究によれば、ｉ．ｖ．注入ナノ担体はそれらのｍＲＮＡカーゴを高レベルの常在性マクロファージ／食細胞のある臓器、大部分が脾臓、肝臓、及び肺に優先的に送達することが明らかにされた（図６Ａ）。臨床関連インビボ試験システムにおいて抗腫瘍応答を測定するため、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡを含有する粒子を、播種性肺黒色腫転移のあるマウス中に投与した（図６Ｂ）。最近の研究は、この疾患により引き起こされる転移を確立する際の単球及びマクロファージの基本的役割を記載しており（Ｂｕｔｌｅｒ ＫＬら、（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：４５５９３頁；Ｎｉｅｌｓｅｎ ＳＲら、（２０１７）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ ２０１７年：９６２４７６０頁）、腫瘍移植は肺における食細胞蓄積と同調していることが共焦点顕微鏡により確かめられた（図６Ｃ）。腫瘍量は生物発光イメージングにより決定し、検出可能な腫瘍のあるマウスは適合するレベルを有する群に選別された。次に、群は無作為に、治療を受けない（ＰＢＳ）、又はＧＦＰ−若しくはＩＲＦ５／ＩＫＫβカプセル化ナノ粒子の静脈内注射を受ける処置条件を割り当てられた。ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子療法のみが肺において腫瘍量を実質的に減らし；実際、ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子療法は全生存を平均で１．３倍改善した（図６Ｄ〜６Ｅ）。並列実験において、マウスは腫瘍接種２２日後に屠殺されて、肺転移のカウントで生物発光腫瘍シグナルを確認し、フローサイトメトリーによりマクロファージ極性化を評価した。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置動物の肺における全転移数は、ＰＢＳ対照（平均４１９±１３９転移；図６Ｆ〜６Ｇ）と比べて８．７倍減少した（平均４０±１６転移）。気管支肺胞洗浄液細胞のフローサイトメトリーにより、免疫抑制性（ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ−、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂｌｏｗ）マクロファージから活性化（ＣＤ２０６−、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１１ｂ＋）食細胞への強い移行が明らかにされた（図６Ｈ〜６Ｉ）。
神経膠腫を処置するために腫瘍抑制食細胞をプログラムする。第３のインビボ試験システムに関して、神経膠腫を調べたが、これは、Ｍ２様マクロファージが非新生物細胞の大多数を表し腫瘍成長及び侵襲を促進する管理するのが困難ながんタイプである（Ｈａｍｂａｒｄｚｕｍｙａｎ Ｄら、（２０１６）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９：２０〜２７頁）。現在、この疾患の標準治療は放射線療法であり、この療法は不運なことに、症状の一時的な安定化及び減少のみを提供し、生存期間中央値を３カ月延ばす（Ｍａｎｎ Ｊら、（２０１７）Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｌ ８：７４８頁）。この疾患の遺伝的事象及びそれに続く分子進化を再現するため、ＰＤＧＦβ駆動神経膠腫のＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−Ｂ／Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−；Ｐｔｅｎ−／−トランスジェニックマウスモデル（ＰＤＧマウス（Ｈａｍｂａｒｄｚｕｍｙａｎ Ｄら、（２００９）Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｃｏｌ ２：８９〜９５頁；Ｑｕａｉｌ ＤＦら、（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２：ａａｄ３０１８））を使用した。脳組織は、ＲＣＡＳ−ＰＤＧＦβ又はＲＣＡＳ−ｃｒｅレトロウイルスをトランスフェクトしたＤＦ−１細胞の混合物（１対１混合物、２μＬ）を定位的に注射した。神経膠腫前駆細胞におけるＰＤＧＦβがん遺伝子の過剰発現及び腫瘍抑制遺伝子Ｉｎｋ４ａ−ａｒｆ及びＰｔｅｎの非存在のせいで、２１日以内にほぼ完全な浸透率を有する４〜５ｍｍ直径の腫瘍が形成された（図７Ａ）（以前確立された通りに（Ｈａｍｂａｒｄｚｕｍｙａｎ Ｄら、（２００９）Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｃｏｌ ２：８９〜９５）。免疫蛍光を使用して、腫瘍浸潤（ＣＤ６８＋）マクロファージの存在（図７Ｂ、左から３番目のパネルに示されている）が確立した神経膠腫（左から２番目のパネルに示されている）において確かめられた。フローサイトメトリーにより、Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージ集団が腫瘍中の全細胞の３２．８％を占めており、この数字は同年齢の健康な対照マウス（３．７％）に見られる９倍高いことが明らかにされている（図７Ｃ）。実験におけるＰＤＧマウスは、キーとなるがん遺伝子プロモーターに連結されたホタルルシフェラーゼを発現する。このレポーター由来の生物発光は、腫瘍悪性度と正の相関関係があることが実証されており（Ｕｈｒｂｏｍ Ｌら、（２００４）Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：１２５７〜１２６０頁）、したがって、この生物発光を使用して、処置開始後４日毎に腫瘍成長をモニターした。単独療法としてのＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰを先ず試験し：ＰＤＧマウスは、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡを積載したＮＰ、又は対照群においてＰＢＳの９用量の静脈内注入を受けた（３週間の間、３用量／週）。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置は腫瘍進行をわずかに抑制した（非処置の対照と比べて平均で５日の生存優位性を生じただけであった；図７Ｄ）。しかし、標準治療としての放射線療法とＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ注射を組み合わせると、ＰＢＳ対照群と比べて処置マウスの腫瘍成長を実質的に減らし生存期間を２倍以上にした（それぞれ、５２日対２５日、図７Ｅ〜７Ｆ）。
結論として、３つの前臨床固体腫瘍モデルからのインビボ結果によれば、ナノ粒子は、局所的に又は全身的に投与されるが、マクロファージ極性化のマスター制御因子をコードする遺伝子を送達して免疫抑制性マクロファージを腫瘍除去表現型に再プログラムすることができることが実証されている。
マウスからヒトマクロファージへの置き換え。マウスで得られたデータがヒト疾患を処置することに適用可能性があることを確かめるため、ヒトＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡを送達するＮＰ（ｈｕＩＲＦ５ ＮＰ）を製作した。ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１を確立したＭ１及びＭ２マクロファージ極性化モデルとして使用して、これらのナノ担体を試験した（Ｌｉ Ｃら、（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２１０４４頁；Ｓｕｒｄｚｉｅｌ Ｅら、（２０１７）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １２：ｅ０１８３６７９）。Ｍ２タイプのマクロファージは、ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡで処置し、ＩＬ−４及びＩＬ−１３で極性化することにより作成した（図８Ａ）。ｈｕＩＲＥ５ ＮＰが機能的でありＩＲＦ経路を活性化することを確かめるため、ＴＨＰ１−Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ細胞に、ｈｕＩＲＦ５／ＩＫＫβ又はＧＦＰ対照ｍＲＮＡを積載したナノ粒子をトランスフェクトした。ＴＨＰ１−Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ細胞は、ＩＲＦ誘導性プロモーターの制御下で蛍光Ｌｕｃｉａレポーターを分泌する。この複合プロモーターは、ＩＳＧ５４ミニマルプロモーターに融合された５つのＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）を含み、このミニマルプロモーターはＮＦ−κＢ又はＡＰ−１経路の活性化因子に無応答性である。その結果、ＴＨＰ１−Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ細胞は、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼの活性を決定することによりＩＲＦ経路のモニタリングを可能にする。ｈｕＩＲＦ５ ＮＰは、Ｍ２極性化ＴＨＰ−１細胞においてルシフェラーゼ発現を強く上方調節することが見出され、ｍＲＮＡ構築物がヒト細胞において機能的であることが示される（図８Ｂ〜８Ｃ）。ＩＲＦ５経路活性化がＭ２極性化ＴＨＰ−１細胞をＭ１様表現型の方に再プログラムできるかどうかを判定するため、ＮＰトランスフェクションに続く炎症促進性サイトカインＩＬ−１βの分泌を測定した。ＩＬ−１βの産生は、ｈｕＩＲＦ５ ＮＰをトランスフェクトしたＴＨＰ−１細胞対非トランスフェクト対照において有意に増加しており（平均２１倍；Ｐ＜０．０００１、図８Ｄ）、Ｍ１マクロファージ細胞表面マーカーＣＤ８０の頑強な上方調節（１０．９倍に増加したＭＦＩ、Ｐ＜０．０００１）と相関していた（図８Ｅ）。
配列番号の一覧表
本明細書に記載される核酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基についての標準文字省略形を使用して示されている。それぞれの核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、適切であると考えられる実施形態には含まれると理解されている。配列番号５５、５８、６１、６４、７１、７３及び７９はこの配列表には使用されていない。添付の配列表は以下の配列を示している。
Figure 2021512056
Figure 2021512056
Figure 2021512056
Figure 2021512056
当業者であれば理解するように、本明細書に開示されるそれぞれの実施形態は、その特定の述べられた要素、ステップ、成分又は構成要素を含む、本質的にからなる又はからなることが可能である。したがって、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「を含む、からなる、又は本質的にからなる」を復唱すると解釈されるべきである。転換語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味するが、これに限定されず、明示されていない要素、ステップ、成分、又は構成要素、大きな量でも包含することが可能である。移行句「からなる」は、明記されていないいかなる要素、ステップ、成分又は構成要素も排除する。移行句「本質的にからなる」は、実施形態の範囲を明記された要素、ステップ、成分、又は構成要素に、及び実施形態に物理的に影響を及ぼさない要素、ステップ、成分、又は構成要素に限定する。物理的効果は、実施例２に記載される卵巣がんのマウスモデルを処置する能力の統計的に有意な減少を引き起こすと考えられる。
別段示されなければ、明細書及び特許請求の範囲で使用されている分子量、反応条件、その他などの成分の量、特性を表す数字はすべて、すべての例において「約」により修飾されていると理解するべきである。したがって、反対だと示されていなければ、明細書及び添付の特許請求の範囲で表明される数のパラメータは、本発明が得ようとしている所望の特性に応じて変動することがある近似値である。最低でも、及び特許請求の範囲の等価物の学説の適用を限定しようとする試みとしてではなく、それぞれの数のパラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、及び普通の四捨五入法を適用することにより解釈するべきである。さらなる明快さが求められる場合、「約」は、記述されている数値又は範囲と併せて使用される場合に当業者がその用語が持つと合理的に考える意味を有し、すなわち、記述されている値又は範囲よりもいくぶん多い又はいくぶん少ない、記述されている値の±２０％；記述されている値の±１９％；記述されている値の±１８％；記述されている値の±１７％；記述されている値の±１６％；記述されている値の±１５％；記述されている値の±１４％；記述されている値の±１３％；記述されている値の±１２％；記述されている値の±１１％；記述されている値の±１０％；記述されている値の±％９；記述されている値の±８％；記述されている値の±７％；記述されている値の±６％；記述されている値の±５％；記述されている値の±４％；記述されている値の±３％；記述されている値の±２％；又は記述されている値の±１％の範囲内までを表す。
本発明の広い範囲を示している数の範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例で示されている数値はできる限り正確に報告されている。しかし、いかなる数値も、それぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含有する。
本発明を説明するという文脈で（特に、以下の特許請求の範囲という文脈で）使用される「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、及び類似の指示対象は、本明細書で別段指示されなければ又は文脈とはっきり矛盾しなければ、単数及び複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書での値の範囲の列挙は、その範囲内に収まるそれぞれ別々の値に個別に言及するという簡単な方法としての働きをすることだけを意図されている。本明細書において別段指示されなければ、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書において個別に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で別段指示されなければ又は別段文脈とはっきり矛盾しなければ、任意の適切な順番で実施することができる。ありとあらゆる実施例の使用、又は本明細書で提供される例示的言語（例えば、「などの」）は、本発明をよりよく明らかにすることだけを意図されており、別の方法で請求される本発明の範囲を限定しない。明細書のいかなる言語も、本発明の実行に不可欠な任意の請求されていない要素も指示していると解釈されるべきである。
本明細書に開示される本発明の別の要素又は実施形態のグループ分けは限定と解釈されるべきではない。それぞれのグループのメンバーは、個別に又はそのグループの他のメンバー若しくは本明細書に見出される他の要素との任意の組合せで言及され請求されてもよい。グループの１つ以上のメンバーは、都合上及び／又は特許性という理由でグループに含まれる又はグループから削除される場合があることは予想されている。いかなるそのような包含又は削除が起きた場合でも、明細書は、修正され、したがって、添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュグループの書面による記述を満たすグループを含有すると見なされる。
本発明を実行するために発明者らに知られている最良の態様を含む、本発明のある特定の実施形態は本明細書に記載されている。当然のことながら、これらの記載されている実施形態の変形は、前の記述を読めば当業者には明らかになる。本発明者は、当業者がそのような変形を必要に応じて用いると予想しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載される以外の方法で実行されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法によって許されるように、ここに添付される特許請求の範囲に列挙される主題のすべての修正物及び等価物を含む。さらに、この考えられるあらゆる変形における上記要素のいかなる組み合わせも、本明細書で別段指示されなければ又は別段文脈とはっきり矛盾しなければ、本発明に包含される。
さらに、本明細書全体で、特許、出版物、雑誌論文及び他の文書が数多く参照されてきた（本明細書の参照材料）。参照材料のそれぞれが個々に、その参照される教えのために参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
最後にあたって、本明細書に開示される本発明の実施形態が本発明の原理を例証していることは理解されるべきである。用いることができる他の修正物は本発明の範囲内である。したがって、例として、しかし限定ではなく、本発明の別の構成を本明細書の教えに従って利用してもよい。したがって、本発明は示され記載されている通りの発明に限定されない。
本明細書に示される特色は、例としてであり、本発明の好ましい実施形態を実証的に考察することのみを目的とするものであり、本発明の種々の実施形態の原理及び概念面の最も有用ですぐに理解される記述であると考えられるものを提供するために示されている。これに関して、本発明の構造的詳細を本発明の基本的理解に必要である以上に詳細に示そうとは試みておらず、説明は、本発明のいくつかの形態を実際にどのようにして用いればよいのかを当業者が明らかにする図面及び／又は実施例と一緒に行われている。
以下の実施例において明白に明確に修正されていなければ将来のいかなる解釈においても、又は意味の適用がいかなる解釈も無意味にする若しくは本質的に無意味にする場合、本開示において使用される定義及び説明が支配的であることが意味され意図されている。用語の解釈がその用語を無意味にする若しくは本質的に無意味にすると考えられる場合、定義は、ウェブスター辞典第３版又は生化学及び分子生物学のオックスフォード辞典（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００４年）などの当業者には公知である辞書から採用するべきである。

Claims (131)

  1. 腫瘍内のマクロファージの活性状態をインビボで変更する方法であって、
    （ｉ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）及び（ｉｉ）ＩＫＫβをコードするインビトロ転写されたｍＲＮＡがコアにカプセル化されている、ポリ（β）アミノエステルコア及びポリグルタミン酸コーティングを含むナノ粒子を、腫瘍部位に投与することを含み、マクロファージの活性状態が不活性化状態から活性化状態に変更される、方法。
  2. 腫瘍が、卵巣がん腫瘍、神経膠芽腫腫瘍、又は転移性肺がん腫瘍である、請求項１に記載の方法。
  3. コードされた１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ５、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＩＲＦ８から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. ナノ粒子が、コーティングに連結されたターゲティングリガンドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. ターゲティングリガンドがジマンノースである、請求項１に記載の方法。
  6. 免疫細胞の活性状態をインビボで変更する方法であって、
    １つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を投与することを含み、それによって、免疫細胞の活性状態をインビボで変更する、方法。
  7. 免疫細胞が、マクロファージ、制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）、骨髄系由来抑制性細胞（ＭＤＳＣ）、調節性樹状細胞（ＤＣｒｅｇ）、好中球、ヘルパーＴ１７細胞（Ｔｈ１７）、制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）、及び／又は間葉系間質細胞（ＭＳＣ）である、請求項７に記載の方法。
  8. ナノ粒子が、正電荷コア、ポリ（β）アミノエステルコア、星型ポリマー、ポリグルタミン酸コーティング、ヒアルロン酸コーティング、中性電荷コーティング、及び／又はリポソームナノ粒子を含む、請求項７又は８に記載の方法。
  9. ナノ粒子が＜１３０ｎｍである、請求項７に記載の方法。
  10. ヌクレオチドがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
  11. ヌクレオチドがコア内にカプセル化されている、請求項７に記載の方法。
  12. コードされた１つ以上のＩＲＦが機能的自己阻害ドメインを欠く、請求項７に記載の方法。
  13. コードされた１つ以上のＩＲＦが機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、請求項７に記載の方法。
  14. 投与が局所的投与である、請求項７に記載の方法。
  15. 局所的投与が腹腔内又は頭蓋内である、請求項１５に記載の方法。
  16. 投与が全身投与である、請求項７に記載の方法。
  17. ナノ粒子がターゲティングリガンドをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  18. ターゲティングリガンドがコーティングに連結されている、請求項１８に記載の方法。
  19. 活性状態が不活性化状態から活性化状態に変更される、請求項７に記載の方法。
  20. 免疫細胞がマクロファージを含む、請求項７に記載の方法。
  21. マクロファージが腫瘍内にある、請求項２１に記載の方法。
  22. 腫瘍が、卵巣がん腫瘍、神経膠芽腫腫瘍、又は転移性肺がん腫瘍である、請求項２２に記載の方法。
  23. コードされた１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合体から選択される、請求項７に記載の方法。
  24. コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜１７に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、請求項７に記載の方法。
  25. コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜７から選択されるＩＲＦ５である、請求項７に記載の方法。
  26. ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号１又は配列番号３である、請求項２６に記載の方法。
  27. ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ、及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２である、請求項２６に記載の方法。
  28. ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ、及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号４である、請求項２６に記載の方法。
  29. コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号８及び１２から選択されるＩＲＦ１である、請求項７に記載の方法。
  30. コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１１、１６及び１７から選択されるＩＲＦ８である、請求項７に記載の方法。
  31. ＩＲＦ８がＫ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号１１である、請求項３１に記載の方法。
  32. コードされた１つ以上のＩＲＦが、Ｎ端末ＩＲＦ７ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び構成的活性ドメイン（ＣＡＤ）並びにＣ端末ＩＲＦ３ ＮＥＳ（核外移行シグナル）及び会合ドメインを含むＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質を含む、請求項７に記載の方法。
  33. ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が、ＩＲＦ３会合ドメインにリン酸化を模倣する突然変異をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  34. ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が配列番号１５に示されている、請求項３３に記載の方法。
  35. ナノ粒子が、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  36. コードされたＩＫＫβが、配列番号１８〜２２に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、請求項３６に記載の方法。
  37. コードされたＩＫＫβが配列番号１８〜２２から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. ヌクレオチドが、配列番号２３〜４４から選択される配列を含む、請求項７に記載の方法。
  39. ターゲティングリガンドがＣＤ２０６、ＣＤ１６３、又はＣＤ２３に結合する、請求項１８に記載の方法。
  40. ターゲティングリガンドがジマンノースである、請求項１８に記載の方法。
  41. １つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子にカプセル化されている、請求項３６に記載の方法。
  42. １つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが異なるナノ粒子にカプセル化されている、請求項３６に記載の方法。
  43. 活性状態が活性化状態から不活性化状態に変更される、請求項７に記載の方法。
  44. 免疫細胞がマクロファージを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. コードされた１つ以上のＩＲＦがＩＲＦ４である、請求項７に記載の方法。
  46. ナノ粒子が、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）をコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  47. ターゲティングリガンドが、ＣＤ３８、Ｇタンパク質共役型受容体１８（Ｇｐｒ１８）、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）、ＣＤ６４、又はＣＤ６８に結合する、請求項１８に記載の方法。
  48. がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象内の腫瘍において腫瘍関連マクロファージの活性状態を不活性化から活性化に変更し、それによってがんの処置を必要とする対象においてがんを処置することを含む、方法。
  49. 腫瘍が、卵巣がん腫瘍、神経膠芽腫腫瘍、又は転移性肺がん腫瘍である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記変更は、腫瘍関連マクロファージの活性状態を不活性化から活性化に変更する１つ以上の転写因子をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子の治療有効量の投与に続いて起こる、請求項４８に記載の方法。
  51. ナノ粒子が、正電荷コア、ポリ（β）アミノエステルコア、星型ポリマー、ポリグルタミン酸コーティング、ヒアルロン酸コーティング、中性電荷コーティング、及び／又はリポソームナノ粒子を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. ナノ粒子が＜１３０ｎｍである、請求項５０に記載の方法。
  53. ヌクレオチドがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、請求項５０に記載の方法。
  54. ヌクレオチドがコア内にカプセル化されている、請求項５０に記載の方法。
  55. 投与が局所投与である、請求項５０に記載の方法。
  56. 局所投与が腹腔内又は頭蓋内である、請求項５５に記載の方法。
  57. 投与が全身投与である、請求項５０に記載の方法。
  58. コードされた１つ以上の転写因子が、１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）を含む、請求項５０に記載の方法。
  59. コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的自己阻害ドメインを欠く、請求項５８に記載の方法。
  60. コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、請求項５８に記載の方法。
  61. コードされた１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合体から選択される、請求項５８に記載の方法。
  62. コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜１７に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、請求項５８に記載の方法。
  63. コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜７から選択されるＩＲＦ５である、請求項５８に記載の方法。
  64. ＩＲＦ５が配列番号１である、請求項６３に記載の方法。
  65. ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号１又は配列番号３である、請求項６３に記載の方法。
  66. ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ、及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２である、請求項６３に記載の方法。
  67. ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ、及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号４である、請求項６３に記載の方法。
  68. ナノ粒子が、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
  69. コードされたＩＫＫβが、配列番号１８〜２２に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、請求項６８に記載の方法。
  70. コードされたＩＫＫβが配列番号１８〜２２から選択される、請求項６８に記載の方法。
  71. ヌクレオチドが、配列番号２３〜４４から選択される配列を含む、請求項５０に記載の方法。
  72. ナノ粒子がターゲティングリガンドをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
  73. ターゲティングリガンドがコーティングに連結されている、請求項７２に記載の方法。
  74. ターゲティングリガンドがＣＤ２０６、ＣＤ１６３、又はＣＤ２３に結合する、請求項７２に記載の方法。
  75. ターゲティングリガンドがジマンノースである、請求項７２に記載の方法。
  76. １つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子にカプセル化されている、請求項６８に記載の方法。
  77. １つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが異なるナノ粒子にカプセル化されている、請求項６８に記載の方法。
  78. がんワクチン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）免疫療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、シグナル伝達阻害剤、遺伝子発現調節剤、アポトーシス誘導剤、血管新生阻害剤、及び毒性分子を送達するモノクローナル抗体から選択される療法を、治療有効量のナノ粒子と組み合わせて施すことをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
  79. 自己免疫疾患の処置を必要とする対象において自己免疫疾患を処置する方法であって、対象内のマクロファージの活性状態を活性化から不活性化に変更し、それによって自己免疫疾患の処置を必要とする対象において自己免疫疾患を処置することを含む、方法。
  80. 自己免疫疾患が、急性壊死性出血性脳疾患、アレルギー性喘息、円形脱毛症、貧血症、アフタ性潰瘍、関節炎（関節炎リウマチ、若年性関節炎リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、喘息、自己免疫性甲状腺炎、結膜炎、クローン病、皮膚エリテマトーデス、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、糖尿病、真性糖尿病、らい性結節性紅斑、角結膜炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群に続く乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、膣炎及びウェゲナー肉芽腫症を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記変更は、マクロファージの活性状態を活性化から不活性化に変更する１つ以上の転写因子をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子の治療有効量の投与に続いて起こる、請求項７９に記載の方法。
  82. ナノ粒子が、正電荷コア、ポリ（β）アミノエステルコア、星型ポリマー、ポリグルタミン酸コーティング、ヒアルロン酸コーティング、中性電荷コーティング、及び／又はリポソームナノ粒子を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. ナノ粒子が＜１３０ｎｍである、請求項８１に記載の方法。
  84. ヌクレオチドがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、請求項８１に記載の方法。
  85. ヌクレオチドがコア内にカプセル化されている、請求項８１に記載の方法。
  86. 投与が局所投与である、請求項８１に記載の方法。
  87. 局所投与が腹腔内又は頭蓋内である、請求項８６に記載の方法。
  88. 投与が全身投与である、請求項８１に記載の方法。
  89. コードされた１つ以上の転写因子が、１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）を含む、請求項８１に記載の方法。
  90. コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的自己阻害ドメインを欠く、請求項８９に記載の方法。
  91. コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、請求項８９に記載の方法。
  92. コードされた１つ以上のＩＲＦがＩＲＦ４である、請求項８９に記載の方法。
  93. ナノ粒子が、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）をコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
  94. ナノ粒子がターゲティングリガンドをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
  95. ターゲティングリガンドがコーティングに連結されている、請求項９４に記載の方法。
  96. ターゲティングリガンドが、ＣＤ３８、Ｇタンパク質共役型受容体１８（Ｇｐｒ１８）、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）、ＣＤ６４、又はＣＤ６８に結合する、請求項９４に記載の方法。
  97. １つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を含む組成物。
  98. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項９７に記載の組成物。
  99. ナノ粒子が、正電荷コア、ポリ（β）アミノエステルコア、星型ポリマー、ポリグルタミン酸コーティング、ヒアルロン酸コーティング、中性電荷コーティング、及び／又はリポソームナノ粒子を含む、請求項９７に記載の組成物。
  100. ナノ粒子が＜１３０ｎｍである、請求項９７に記載の組成物。
  101. ヌクレオチドがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、請求項９７に記載の組成物。
  102. ヌクレオチドがコア内にカプセル化されている、請求項９７に記載の組成物。
  103. コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的自己阻害ドメインを欠く、請求項９７に記載の組成物。
  104. コードされた１つ以上のＩＲＦが、機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、請求項９７に記載の組成物。
  105. コードされた１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合体から選択される、請求項９７に記載の組成物。
  106. コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜１７に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、請求項９７に記載の組成物。
  107. コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１〜７から選択されるＩＲＦ５である、請求項９７に記載の組成物。
  108. ＩＲＦ５が配列番号１である、請求項１０７に記載の組成物。
  109. ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号１又は配列番号３である、請求項１０７に記載の組成物。
  110. ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ、及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２である、請求項１０７に記載の組成物。
  111. ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ、及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号４である、請求項１０７に記載の組成物。
  112. コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号８及び１２から選択されるＩＲＦ１である、請求項９７に記載の組成物。
  113. コードされた１つ以上のＩＲＦが、配列番号１１、１６及び１７から選択されるＩＲＦ８である、請求項９７に記載の組成物。
  114. ＩＲＦ８がＫ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号１１である、請求項１１３に記載の組成物。
  115. コードされた１つ以上のＩＲＦが、Ｎ端末ＩＲＦ７ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び構成的活性ドメイン（ＣＡＤ）並びにＣ端末ＩＲＦ３ ＮＥＳ（核外移行シグナル）及び会合ドメインを含むＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質を含む、請求項９７に記載の組成物。
  116. ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が、ＩＲＦ３会合ドメインにおいてリン酸化を模倣する突然変異をさらに含む、請求項１１５に記載の組成物。
  117. ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が配列番号１５に示されている、請求項１１５に記載の組成物。
  118. ナノ粒子が、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項９７に記載の組成物。
  119. コードされたＩＫＫβが、配列番号１８〜２２に＞９０％、＞９５％、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、請求項１１８に記載の組成物。
  120. コードされたＩＫＫβが配列番号１８〜２２から選択される、請求項１１８に記載の組成物。
  121. ヌクレオチドが、配列番号２３〜４４から選択される配列を含む、請求項９７に記載の組成物。
  122. ナノ粒子が、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ−２、ＭＤＲ−１、ｐ２１、ｐ１６、ｂａｘ、ｂｃｌ−ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ−Ｉ ＶＥＧＦ、アンジオスタチン、オンコスタチン、エンドスタチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／又はＨＳＶ−ｔｋから選択される１種以上の抗がん遺伝子を担持するヌクレオチドをさらに含む、請求項９７に記載の組成物。
  123. コードされた１つ以上のＩＲＦがＩＲＦ４である、請求項９７に記載の組成物。
  124. ナノ粒子が、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）をコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項９７に記載の組成物。
  125. ナノ粒子がターゲティングリガンドをさらに含む、請求項９７に記載の組成物。
  126. ターゲティングリガンドがコーティングに連結されている、請求項１２５に記載の組成物。
  127. ターゲティングリガンドがＣＤ２０６、ＣＤ１６３、又はＣＤ２３に結合する、請求項１２５に記載の組成物。
  128. ターゲティングリガンドがジマンノースである、請求項１２５に記載の組成物。
  129. ターゲティングリガンドが、ＣＤ３８、Ｇタンパク質共役型受容体１８（Ｇｐｒ１８）、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）、ＣＤ６４、又はＣＤ６８に結合する、請求項１２５に記載の組成物。
  130. １つ以上のＩＲＦ、ＩＫＫβ、及び／又はＧＩＬＺをコードするヌクレオチドが、同じナノ粒子中にカプセル化されている、請求項１２４に記載の組成物。
  131. １つ以上のＩＲＦ、ＩＫＫβ、及び／又はＧＩＬＺをコードするヌクレオチドが、異なるナノ粒子中にカプセル化されている、請求項１２４に記載の組成物。
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