CN111479557A - 用于使用外排体相关基因编辑来治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

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瓦莱丽·勒布勒
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Abstract

本文中提供了包含外排体的组合物，所述外排体在其表面上包含CD47并且还包含CRISPR系统。还提供了使用外排体进行基因编辑和通过基因编辑治疗癌症的方法。

Description

用于使用外排体相关基因编辑来治疗癌症的方法和组合物
相关申请的参考
本申请要求于2017年12月15日提交的美国临时申请号62/599,340的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
1.技术领域
本发明总体上涉及医学和肿瘤学领域。更特别地，其涉及外排体用于体内递送核酸酶复合物以进行基因编辑的用途。
2.相关技术描述
基因编辑是一种允许在活细胞内修饰靶基因的技术。最近，利用CRISPR的细菌免疫系统根据需求执行基因编辑，彻底改变了科学家进行基因组编辑的方式。CRISPR系统的Cas9蛋白是一种RNA指导的DNA内切核酸酶，可通过改变其指导RNA序列而相对容易地被工程化为靶向新位点。该发现使得序列特异性基因编辑功能上有效。当前的CRISPR/Cas9技术提供了可靠的在体外编辑培养的细胞中的基因的方法；然而，需要靶向体内不同器官中特定细胞的新方法。
发明概述
因此，提供了被工程化以高效地将CRISPR-Cas9携带至不同器官和肿瘤从而使得能够进行治疗性基因编辑以控制癌症和其他遗传性疾病的外排体。在一个实施方案中，提供了包含外排体的组合物，其中所述外排体在其表面上包含CD47，并且其中所述外排体包含CRISPR系统。在一些方面中，CRISPR系统包含内切核酸酶和指导RNA(gRNA)。在一些方面中，内切核酸酶是Cas内切核酸酶。在一些方面中，内切核酸酶是Cas9内切核酸酶。在另一些方面中，内切核酸酶是Cpfl内切核酸酶。在一些方面中，指导RNA是单gRNA。在一些方面中，单gRNA是CRISPR-RNA(crRNA)。在一些方面中，单gRNA包含crRNA和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的融合体(fusion)。在一些方面中，指导RNA包含crRNA和tracrRNA。在一些方面中，内切核酸酶和gRNA在外排体内的单个核酸分子上编码。在一些方面中，内切核酸酶和gRNA在外排体内的独立的核酸分子上编码。
在一些方面中，CRISPR系统靶向致病突变。在一些方面中，致病突变是致癌突变。在一些方面中，致癌突变是癌基因中的激活突变。在一些方面中，致癌突变是肿瘤抑制基因中的抑制性突变。在一些方面中，CRISPR系统靶向无成药性基因。在一些方面中，致癌突变是KrasG12D。在一些方面中，外排体的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％(或其中可导出的任何值)包含内切核酸酶和gRNA。
在一个实施方案中，提供了包含外排体和可药用赋形剂的药物组合物，其中所述外排体在其表面上包含CD47，并且其中所述外排体包含CRISPR系统。在一些方面中，CRISPR系统包含内切核酸酶和指导RNA(gRNA)。在一些方面中，内切核酸酶是Cas内切核酸酶。在一些方面中，内切核酸酶是Cas9内切核酸酶。在另一些方面中，内切核酸酶是Cpfl内切核酸酶。在一些方面中，指导RNA是单gRNA。在一些方面中，单gRNA是CRISPR-RNA(crRNA)。在一些方面中，单gRNA包含crRNA和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的融合体。在一些方面中，指导RNA包含crRNA和tracrRNA。在一些方面中，内切核酸酶和gRNA在外排体内的单个核酸分子上编码。在一些方面中，内切核酸酶和gRNA在外排体内的独立的核酸分子上编码。在一些方面中，CRISPR系统靶向致病突变。在一些方面中，致病突变是致癌突变。在一些方面中，致癌突变是癌基因中的激活突变。在一些方面中，致癌突变是肿瘤抑制基因中的抑制性突变。在一些方面中，CRISPR系统靶向无成药性基因。在一些方面中，致癌突变是KrasG12D。在一些方面中，外排体的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％(或其中可导出的任何值)包含内切核酸酶和gRNA。在一些方面中，组合物被配制用于肠胃外施用。在一些方面中，组合物被配制用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内注射。在另一些方面中，组合物还包含抗菌剂。在一些方面中，抗菌剂是苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、布罗波尔(bronopol)、西曲溴铵(centrimide)、十六烷基氯化吡啶
Figure BDA0002539456870000021
氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚(chloroxylenol)、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(exetidine)、咪唑烷脲(imidurea)、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇或硫柳汞。
在一个实施方案中，提供了在有此需要的患者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用包含药物组合物的组合物，从而在所述患者中治疗疾病，所述药物组合物包含外排体和可药用赋形剂，其中所述外排体在其表面上包含CD47并且其中所述外排体包含CRISPR系统。在一些方面中，施用引起患者的患病细胞中的基因编辑。在一些方面中，所述疾病是癌症。在一些方面中，所述癌症是胰腺导管腺癌。在一些方面中，施用是全身性施用。在一些方面中，全身性施用是静脉内或动脉内施用。在一些方面中，所述方法还包括向所述患者施用至少第二治疗。在一些方面中，第二治疗包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗或免疫治疗。在一些方面中，患者是人。在一些方面中，外排体对于患者是自体的。在一些方面中，相对于无外排体的CRISPR系统的施用，所述药物组合物的施用提供了优异的治疗益处。在一些方面中，药物组合物仅一次地施用于患者。在一些方面中，药物组合物多于一次地施用于患者。在一些方面中，药物组合物有限次地施用于患者。在一些方面中，药物组合物持续地施用于患者。在一些方面中，药物组合物至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、21、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50(或其中可导出的任何值)次地施用于患者。
在一个实施方案中，提供了包含外排体的组合物，其用于在患者中治疗疾病，其中所述外排体在其表面上包含CD47，并且其中所述外排体包含CRISPR系统。在一些方面中，CRISPR系统包含内切核酸酶和指导RNA(gRNA)。在一些方面中，内切核酸酶是Cas内切核酸酶。在一些方面中，内切核酸酶是Cas9内切核酸酶。在另一些方面中，内切核酸酶是Cpf1内切核酸酶。在一些方面中，指导RNA是单gRNA。在一些方面中，单gRNA是CRISPR-RNA(crRNA)。在一些方面中，单gRNA包含crRNA和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的融合体。在一些方面中，指导RNA包含crRNA和tracrRNA。在一些方面中，内切核酸酶和gRNA在外排体内的单个核酸分子上编码。在一些方面中，内切核酸酶和gRNA在外排体内的独立的核酸分子上编码。在一些方面中，CRISPR系统靶向致病突变。在一些方面中，致病突变是致癌突变。在一些方面中，致癌突变是癌基因中的激活突变。在一些方面中，致癌突变是肿瘤抑制基因中的抑制性突变。在一些方面中，CRISPR系统靶向无成药性基因。在一些方面中，其中致癌突变是KrasG12D。在一些方面中，外排体的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％(或其中可导出的任何值)包含内切核酸酶和gRNA。在一些方面中，施用引起患者的患病细胞中的基因编辑。在一些方面中，所述疾病是癌症。在一些方面中，所述癌症是胰腺导管腺癌。在一些方面中，组合物被配制用于肠胃外施用。在一些方面中，组合物被配制用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内注射。在另一些方面中，组合物还包含抗菌剂。在一些方面中，抗菌剂是苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、布罗波尔、西曲溴铵、十六烷基氯化吡啶
Figure BDA0002539456870000041
氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪唑烷脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇或硫柳汞。在另一方面中，组合物包含至少第二治疗。在一些方面中，第二治疗包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗或免疫治疗。在一些方面中，患者是人。在一些方面中，外排体对于患者是自体的。
在一个实施方案中，提供了外排体在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述外排体在其表面上包含CD47，并且其中所述外排体包含CRISPR系统。在一些方面中，CRISPR系统包含内切核酸酶和指导RNA(gRNA)。在一些方面中，内切核酸酶是Cas内切核酸酶。在一些方面中，内切核酸酶是Cas9内切核酸酶。在另一些方面中，内切核酸酶是Cpf1内切核酸酶。在一些方面中，指导RNA是单gRNA。在一些方面中，单gRNA是CRISPR-RNA(crRNA)。在一些方面中，单gRNA包含crRNA和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的融合体。在一些方面中，指导RNA包含crRNA和tracrRNA。在一些方面中，内切核酸酶和gRNA在外排体内的单个核酸分子上编码。在一些方面中，内切核酸酶和gRNA在外排体内的独立的核酸分子上编码。在一些方面中，CRISPR系统靶向致病突变。在一些方面中，致病突变是致癌突变。在一些方面中，致癌突变是癌基因中的激活突变。在一些方面中，致癌突变是肿瘤抑制基因中的抑制性突变。在一些方面中，CRISPR系统靶向无成药性基因。在一些方面中，致癌突变是KrasG12D。在一些方面中，外排体的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％(或其中可导出的任何值)包含内切核酸酶和gRNA。在一些方面中，所述疾病是癌症。在一些方面中，所述癌症是胰腺导管腺癌。在一些方面中，药物被配制用于肠胃外施用。在一些方面中，药物被配制用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内注射。在一些方面中，药物包含抗菌剂。在一些方面中，抗菌剂是苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、布罗波尔、西曲溴铵、十六烷基氯化吡啶
Figure BDA0002539456870000042
氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪唑烷脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇或硫柳汞。
本文中使用的就指定组分而言的“基本上不含”在本文中用于意指没有指定组分被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期的污染导致的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分的量的组合物。
如本文在说明书中所使用的，没有数量词修饰的名词可以意指一个/种或更多个/种。如本文在权利要求书中所使用的，当与词语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词可以意指一个/种或多于一个/种。
除非明确指出仅指代替代方案或替代方案是互相排斥的，否则在权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，尽管本公开内容支持仅指代替代方案和“和/或”的限定。本文中使用的“另外的”可以意指至少第二或更多。
在本申请通篇，术语“约”用于表示这样的值，其包括用于确定该值之采用的装置、方法的误差的固有变化，或者存在于研究对象之间的变化。从以下详细描述中，本发明的其他目标、特征和优点将变得明显。然而，应理解，虽然详细描述和具体实例指示了本发明的某些实施方案，但是其仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，本发明的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个可以更好地理解本发明。
图1a至1h：将HEK293T细胞使用lipofectamine用CRISPR-Cas9载体对照和CRISPR-Cas9-sgRab27a-2转染72小时，然后用1μg/ml嘌呤霉素选择10天，以获得稳定的HEK293TCRISPR-Cas9载体对照和CRISPR-Cas9-sgRab27a-2细胞。用含有1pg/ml嘌呤霉素的选择培养基培养稳定的细胞。(图1a)从上述细胞中提取DNA和RNA，并使用定量实时PCR(qPCR)测定Cas9水平。(图1b)从HEK293T空白细胞以及稳定的HEK293T CRISPR-Cas9载体对照和CRISPR-Cas9-sgRab27a-2细胞中收集外排体，然后进行Nanosight验证。(图1c)提取外排体DNA和RNA，并进行qPCR以检测外排体中的Cas9水平以及针对Rab27a-2的sgRNA。(图1d)使用抗-Flag抗体或Cas9抗体，分别以黏着斑蛋白或CD9作为对照，通过Western印迹评估细胞和外排体二者中的Cas9蛋白水平。(图le)和(图1f)使用T7/SURVEYOR测定来确定细胞(图le)和外排体(图1f)二者中的DNA编辑。(图1g)和(图1h)将从HEK293T空白细胞、HEK293TCRISPR-Cas9载体对照和CRISPR-Cas9-sgRab27a-2稳定细胞中收集的3E10外排体每24小时处理到BxPC-3中，+处理一次，++处理两次。从接受体细胞中提取DNA和RNA。以DNA(g)和mRNA(h)二者水平检测Cas9水平。每个时间点的条从左到右表示“空白对照”、“CRISPR-Cas9载体对照”和“CRISPR-Cas9-sgRab27a-2”。
图2a至2c：将从HEK293T空白细胞、HEK293T CRISPR-Cas9载体对照和CRISPR-Cas9-sgRab27a-2稳定细胞中收集的3E10外排体每24小时处理到BxPC-3中，进行两次。从接受体细胞中提取DNA和RNA。(图2a)和(图2c)通过PCR以DNA(图2a)和mRNA(图2c)水平检测针对Rab27a-2的sgRNA。(图2b)使用T7/SURVEYOR测定来确定接受体BxPC-3细胞中的DNA编辑。
图3a至3d：从BJ细胞中收集外排体。(图3a)Nanosight用于验证外排体。(图3b)通过Western印迹检测外排体标志物CD9、CD81、筏蛋白和TSG101以进一步确认外排体。(图3c)1E10BJ外排体用15ug CRISPR-Cas9-GFP质粒进行电穿孔，并随后用或不用DNase处理。提取外排体DNA，并通过qPCR评价Cas9水平。进一步通过绝对qPCR以CRISPR-Cas9-GFP质粒作为标准计算拷贝数。(图3d)将用DNase电穿孔的外排体处理到BJ细胞中持续24小时。以DNA和mRNA二者水平检测Cas9水平。
图4a至4b：使用包装质粒以及CRISPR-Cas9 Rab27b-1/2或空对照质粒通过lipofectamine 2000转染HEK293T细胞。收获含有慢病毒的介质，然后将其转导到BxPC-3细胞中。进一步用0.4μg/mL的嘌呤霉素选择转导的细胞，并通过Western印迹和T7/SURVEYOR测定二者对BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b细胞的单克隆进行挑选、扩增和验证。(图4a)以β-肌动蛋白作为加载对照评价了所有单克隆中的Rab27b和Rab27a蛋白水平。代表性的Western印迹结果示于(图4a)中。(图4b)T7/SURVEYOR测定还用于进一步验证所有克隆。代表性的Western印迹结果示于(图4b)中。BxPC-3/CRIPSR-Cas9-sgRab27b-1克隆3(C3)和BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2克隆6(C6)用于进一步实验。
图5a至5f：用含有0.4μg/ml嘌呤霉素的选择培养基培养BxPC-3/CRISPR-Cas9载体对照稳定细胞和单克隆BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1C3、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2C6。(图5a)从上述细胞中提取DNA和RNA，并使用qPCR确定Cas9水平。(图5b)从上述细胞中收集外排体，然后进行Nanosight验证。通过Nanosight分析并比较分泌的外排体数目。(图5c)提取外排体DNA和RNA，并进行qPCR以检测外排体中的Cas9水平以及针对Rab27b-1/2的sgRNA。(图5d)通过Western印迹，分别以β-肌动蛋白或CD9作为对照，评估细胞和外排体二者中的Cas9和Rab27b蛋白水平。(图5e)和(图5f)使用两种不同的引物组，使用T7/SURVEYOR测定来确定细胞(图5e)和外排体(图5f)二者中的DNA编辑。
图6a至6b：(图6a)裂解从BxPC-3/CRISPR-Cas9载体对照稳定细胞和单克隆BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1C3、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2C6中收集的外排体，并进一步通过BCA试剂盒根据制造商的说明检测蛋白质含量。(图6b)将100μL BxPC-3空白、BxPC-3/CRISPR-Cas9空对照、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1C3和BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2C6细胞以1E5个细胞/ml的浓度接种在96孔板中。使用MTT测定在不同时间点评价细胞增殖。每个时间点的条从左到右表示“空白对照”、“CRISPR-Cas9载体对照”、“CRISPR-Cas9-sgRab27b-1-C3”和“CRISPR-Cas9-sgRab27b-2-C6”。
图7a至7g：(图7a)为了产生体外转录的sgRab27b，首先通过PCR扩增sgRab27b-1/2，然后使用
Figure BDA0002539456870000071
PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。使用MEGAshortscriptTM试剂盒根据制造商的说明，在体外转录sgRab27-1/2的经纯化PCR产物。进一步通过8M脲聚丙烯酰胺凝胶评价RNA品质。(图7b)为了产生体外转录的Cas9，通过PCR扩增Cas9，其中进一步使用
Figure BDA0002539456870000072
PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。使用mMESSAGE m
Figure BDA0002539456870000073
T7 Ultra试剂盒在体外转录经纯化Cas9 PCR产物。甲醛凝胶用于检测Cas9 RNA品质。(图7c至7e)使用lipofectamine 2000(图7c)、Exo-Fect/外排体转染试剂(图7d)或电穿孔的外排体(图7e)用1pg IVT-sgRab27b RNA处理HEK293T/CRISPR-Cas9载体对照细胞72小时。提取DNA，并进行T7/SURVEYOR测定以检查基因编辑。将HEK293T细胞(图7f)和BxPC-3细胞(图7g)使用lipofectamine 2000、Exo-Fect/外排体转染试剂用Cas9 mRNA转染，或用经Cas9 mRNA电穿孔的1E9MSC外排体处理，持续48小时。进行Western印迹以检测Cas9蛋白水平。
图8a至8c：从HEK293T/CRISPRCas9载体对照和BxPC-3/CRISPR-Cas9载体对照细胞中提取RNA。通过qPCR测定相对Cas9表达水平(图8a)和1/Ct值(图8b)。(图8c)将1μg Cas9RNA与来自HEK293T/CRISPRCas9载体对照和BxPC-3/CRISPR-Cas9载体对照细胞的RNA一起用于逆转录。进行qPCR以检测1/Ct值。
图9a至9g：使用Exo-Fect/外排体转染试剂用10pg质粒(CRISPR-Cas9-lenti-V2载体对照、CRISPR-Cas9-lenti-V2-sgRab27b-1、CRISPR-Cas9-GFP载体对照)每24小时处理HEK293T细胞，进行4次(第1、2、3、4天)。在第5天收集细胞。提取DNA、RNA和蛋白质。(图9a)示出在第5天获取的照片以表示通过使用CRISPR-Cas9-GFP载体对照质粒作为对照的Exo-Fect/外排体转染试剂的转染效力。(图9b)通过qPCR确定相对Cas9表达水平和1/Ct值。(图9c)使用Western印迹评价Cas9蛋白水平。(图9d)进行T7/SURVEYOR测定以检查在用CRISPR-Cas9-1enti-V2-sgRab27b-1质粒处理之后HEK293T细胞中的基因编辑。在BxPC-3细胞中进行相同的实验。使用Exo-Fect/外排体转染试剂用10pg质粒(CRISPRCas9-lenti-V2载体对照、CRISPR-Cas9-lenti-V2-sgRab27b-1)每24小时处理BxPC-3细胞，进行4次(第1、2、3、4天)。在第5天收集细胞。(图9e)通过qPCR确定相对Cas9表达水平。(图9f)使用Western印迹评价Cas9蛋白水平。(图9g)进行T7/SURVEYOR测定以检查BxPC-3细胞中的基因编辑。
图10a至10h：用5pg质粒(具有lenti-V2、GFP、嘌呤霉素骨架的CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D，和载体对照)通过lipofectamine 2000转染KPC689细胞48小时。提取DNA、RNA和蛋白质。(图10a)通过使用CRISPR-Cas9-GFP载体对照质粒作为对照，在转染48小时之后获取照片以表示lipofectamine的转染效力。通过qPCR确定相对Cas9表达水平(图10b)和mKrasG12D水平(图10c)。(图10d)进行T7/SURVEYOR测定以检查在通过lipofectamine转染之后KPC689细胞中的基因编辑。用10pg质粒(具有GFP骨架的CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D及其载体对照)使用Exo-Fect/外排体转染试剂每24小时处理KPC689细胞，进行3次(第1、2、3天)。在第4天收集细胞。提取DNA、RNA和蛋白质。(图10e)示出在第5天获取的照片以表示Exo-Fect/外排体转染试剂的转染效力。通过qPCR确定相对Cas9表达水平(图10f)和mKrasG12D水平(图10g)。(图10h)进行T7/SURVEYOUR测定以检查在用CRISPR-Cas9-GFP-mKrasG12D质粒处理之后KPC689细胞中的基因编辑。
图11a至11f：(图11a)和(图11b)使用包装质粒以及CRISPR-Cas9多西环素诱导型质粒通过lipofectamine 2000转染HEK293T细胞。收获含有慢病毒的介质，并随后将其转导到Panc1细胞中。进一步用1pg/ml嘌呤霉素选择转导的细胞。使用1pg/ml多西环素维持Pancl诱导型Cas9稳定细胞。从用或未用多西环素处理的Pancl诱导型细胞中收集外排体。Western印迹用于检查细胞(图11a)和外排体(图11b)中的Cas9蛋白水平。(图11c)通过lipofectamine、Fugene或Exo-Fect用2pg针对hKrasG12D的IVT-sgRNA、1pg hKrasG12D质粒处理Pancl诱导型细胞72小时。进行T7/SURVEYOR测定以检查Panc1诱导型细胞中的基因编辑。(图11d)使用基于慢病毒的方法建立Panc1 Cas9稳定细胞。通过Western印迹测定Cas9蛋白水平。(图11e)使用lipofectamine、Exo-Fect或经电穿孔的外排体用具有lenti-V2、GFP、嘌呤霉素骨架的CRISPR-Cas9-sghKrasG12D处理Panc1细胞。使用lipofectamine、Exo-Fect或经电穿孔的外排体用sghKrasG12D质粒处理Panc1 Cas9稳定细胞。进行T7/SURVEYOR测定以检查Pancl细胞和Pancl Cas9稳定细胞中的基因编辑。(图11f)使用基于慢病毒的方法建立Panc1 sghKrasG12D T1稳定细胞。将Panc1 sghKrasG12D T1稳定细胞用10pg或20pg具有GFP或嘌呤霉素骨架的Cas9质粒转染24小时。进行T7/SURVEYOR测定以检查Pancl sghKrasG12D T1稳定细胞中的基因编辑。
图12a至12b：将KPC689细胞皮下植入到小鼠背部中。将小鼠分为4组，每组1或2只小鼠。第1组：用1E9外排体和10μl Exo-Fect处理(n＝1，K504)；第2组：用10pg Cas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1质粒处理(n＝1，K509)；第3组：用1E9外排体、10pg Cas9-GFP-载体对照质粒和10ul Exo-Fect处理(n＝2，#1：K501，#2：K510。加入K5103天之后，与所有其他小鼠进行比较)；第4组：用1E9外排体、10μgCas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1质粒和10μl Exo-Fect处理(n＝2，#1：K502，#2：K505)。每组中的小鼠每天静脉内(I.V.)和瘤内(I.T.)注射，持续两周。测量(图12a)肿瘤长度(a，mm)和宽度(b，mm)以及体重(图12b)。肿瘤体积(图12a)计算为V(mm3)＝0.52*a*b^2。
发明详述
本文中提供了具有并入的CRISPR/Cas9系统的外排体(例如，iExosomesCRIsPR/Cas9)，其使用不同的指导RNA分子，具有靶向癌细胞并诱导基因编辑程序以改变癌细胞的基因组的能力。基因编辑测定已用于显示基因编辑有效地在外排体自身中发生，提供了用于效率以及随后的iExosomesCRIsPR/Cas9的以下用途的快速验证方法：靶向具有突变(例如KrasG12D)的癌细胞以编辑除去突变的基因并将其用野生型KRAS基因替代，或去除显性突变基因并由正常基因接管功能。使用iExosomesCRIsPR/Cas9可编辑如下的任何基因以提供治疗性益处或改变癌细胞和肿瘤的生物学：其通常为癌细胞和肿瘤基因组DNA的一部分，所述癌细胞和肿瘤有助于引发、进展和/或转移。该技术克服了目前用于癌症相关基因编辑的CRISPR/Cas9技术的体内应用的缺乏，具有治疗性益处。使用在表面上具有CD47的外排体，iExosomesCRISPR /Cas9可成功地递送至肿瘤，得到治疗性益处。
I.基于脂质的纳米颗粒
在一些实施方案中，基于脂质的纳米颗粒是脂质体、外排体、脂质制品或另外的基于脂质的纳米颗粒，例如基于脂质的囊泡(例如，DOTAP：胆固醇囊泡)。基于脂质的纳米颗粒可以是带正电荷、带负电荷或中性的。
A.脂质体
“脂质体”是通用术语，包括通过产生封闭的脂双层或脂质聚集体形成的多种单层和多层脂质载体。脂质体可表征为具有囊泡结构，所述囊泡结构具有通常包含磷脂的双层膜，和通常包含水性组合物的内部介质。本文中提供的脂质体包括单层脂质体，多层脂质体和多囊脂质体。本文中提供的脂质体可带正电荷、带负电荷或带中性电荷。在某些实施方案中，脂质体是电荷中性的。
多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。这样的脂质体在包含磷脂的脂质悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自身重排并包载脂双层之间的水和溶解的溶质。亲脂性分子或具有亲脂性区域的分子也可溶解在脂双层中或与脂双层缔合。
在一些具体方面中，多肽、核酸或小分子药物可例如包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂双层内、通过与脂质体和多肽/核酸二者缔合的连接分子与脂质体连接、包埋在脂质体中、与脂质体复合等。
如本领域普通技术人员已知的，根据本发明实施方案使用的脂质体可以通过不同方法制备。例如，将磷脂，例如如中性磷脂二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine，DOPC)溶解在叔丁醇中。然后将脂质与多肽、核酸和/或其他组分混合。将吐温20添加到脂质混合物，以使得吐温20为组合物重量的约5％。向该混合物添加过量的叔丁醇，以使得叔丁醇的体积为至少95％。涡旋混合物，在干冰/丙酮浴中冷冻并冻干过夜。冻干制剂被储存在-20℃，并可以使用长达三个月。当需要时，将冻干脂质体在0.9％盐水中重构。
或者，脂质体可以通过将脂质在容器(例如玻璃、梨形烧瓶)中的溶剂中混合来制备。容器的体积应比预期的脂质体混悬液的体积大十倍。使用旋转蒸发器，在负压下在约40℃下去除溶剂。溶剂通常在约5分钟至2小时内去除，取决于所期望的脂质体体积。组合物可以在真空下的干燥器中进一步干燥。干燥的脂质通常由于随着时间的推移趋于恶化而在约1周后丢弃。
干燥的脂质可以在无菌且无热原的水中在约25mM至50mM磷脂下通过摇动直至所有脂质膜重新悬浮而水合。然后可将水性脂质体分成等分试样，将每个放置于小瓶中，冻干并在真空下密封。
如上所述制备的干燥脂质或冻干脂质体可脱水并在蛋白质或肽的溶液中重构，并用合适的溶剂(例如DPBS)稀释至合适的浓度。然后将混合物在涡旋混合器中剧烈摇动。通过在29,000×g下离心去除未包封的其他材料(例如包括但不限于激素、药物、核酸构建体等的试剂)，并洗涤脂质体颗粒。将经洗涤的脂质体以合适的总磷脂浓度重新悬浮，例如约50mM至200mM。包封的其他材料或活性剂的量可以根据标准方法确定。在确定包封在脂质体制剂中的其他材料或活性剂的量之后，可将脂质体稀释至合适的浓度并储存在4℃直至使用。包含脂质体的药物组合物通常包含无菌可药用载体或稀释剂，例如水或盐水溶液。
可与本发明实施方案一起使用的其他脂质体包括阳离子脂质体，例如，如W002/100435A1、美国专利5,962,016、美国申请2004/0208921、W003/015757A1、WO04029213A2、美国专利5,030,453和美国专利6,680,068中所述，其所有均在没有放弃权利要求的情况下通过引用整体并入本文。
在制备这样的脂质体中，可以使用本文所述的，或者如本领域普通技术人员已知的任何方案。制备脂质体的另外的非限制性实例描述于美国专利4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706；W01986/000238和WO1990/004943中，其各自通过引用并入本文。
在某些实施方案中，基于脂质的纳米颗粒是中性脂质体(例如，DOPC脂质体)。本文中使用的“中性脂质体”或“不带电荷的脂质体”被限定为具有一种或更多种脂质组分的脂质体，所述脂质组分产生基本上中性的净电荷(基本上不带电荷)。“基本上中性”或“基本上不带电荷”意指给定群体(例如，脂质体群体)中的少数(如果有的话)脂质组分包含未被另一组分的相反电荷消除的电荷(即，少于10％的组分包含未消除的电荷，更优选少于5％，且最优选少于1％)。在某些实施方案中，中性脂质体可以主要包含在生理条件下(即，在约pH7下)本身是中性的脂质和/或磷脂。
本发明实施方案的脂质体和/或基于脂质的纳米颗粒可包含磷脂。在某些实施方案中，单种磷脂可用于产生脂质体(例如，中性磷脂(例如DOPC)，可用于产生中性脂质体)。在另外的实施方案中，可使用多于一种的磷脂来产生脂质体。磷脂可来自天然或合成来源。磷脂包括，例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺；因为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱在生理条件下(即，在约pH 7下)是不带电荷的，所以这些化合物可特别用于产生中性脂质体。在某些实施方案中，磷脂DOPC用于产生不带电荷的脂质体。在某些实施方案中，可使用非磷脂(例如胆固醇)的脂质。
磷脂包括甘油磷脂和某些鞘脂。磷脂包括但不限于二油酰基磷脂酰胆碱(“DOPC”)、卵磷脂酰胆碱(“EPC”)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(“DLPC”)、二豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(“DPPC”)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(“DSPC”)、1-豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(“MPPC”)、1-棕榈酰基-2-豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“PMPC”)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(“PSPC”)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(“SPPC”)、二月桂酰基磷脂酰甘油(“DLPG”)、二豆蔻酰基磷脂酰甘油(“DMPG”)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(“DPPG”)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(“DSPG”)、二硬脂酰基鞘磷脂(“DSSP”)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)、二油酰基磷脂酰甘油(“DOPG”)、二豆蔻酰基磷脂酸(“DMPA”)、二棕榈酰基磷脂酸(“DPPA”)、二豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(“DMPE”)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、二豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(“DMPS”)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(“DPPS”)、脑磷脂酰丝氨酸(“BPS”)、脑鞘磷脂(“BSP”)、二棕榈酰基鞘磷脂(“DPSP”)、二豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(“DAPC”)、1，2-二花生酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(“DBPC”)、1，2-二十二碳烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(“DEPC”)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)、棕榈酰氧基磷脂酰胆碱(“POPC”)、棕榈酰氧基磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺和二亚油酰基磷脂酰胆碱。
B.外排体
“胞外囊泡”和“EV”是细胞来源的和细胞分泌的微囊泡，其作为一类，包括外排体、外排体样囊泡、核外粒体(其是直接来自质膜的囊泡发芽产生的)、微粒、微囊泡、脱落的微囊泡(shedding microvesicle，SMV)、纳米颗粒以及均匀的(大的)凋亡小泡或小体(由于细胞死亡而导致)或膜颗粒。
本文中使用的术语“微囊泡”和“外排体”是指具有约10nm至约5000nm，更通常30nm至1000nm，并且最通常约50nm至750nm的直径(或当颗粒不是球形时的最大尺寸)的膜性颗粒，其中外排体膜的至少一部分直接从细胞获得。最常见的是，外排体的尺寸(平均直径)达供体细胞尺寸的5％。因此，特别考虑的外排体包括从细胞脱落的外排体。
外排体可在任何合适的样品类型例如如体液中被检测到或从其中分离。本文中使用的术语“分离的”是指从其天然环境中分离出来，并且意指包括至少部分纯化，并且可包括大量纯化。本文中使用的术语“样品”是指适合于本发明提供的方法的任何样品。样品可以是包含适合于检测或分离的外排体的任何样品。样品的来源包括血液、骨髓、胸膜液、腹膜液、脑脊液、尿、唾液、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、滑液、乳汁、汗、眼泪、关节液和支气管清洗液(bronchial wash)。在一个方面中，样品是血液样品，包括例如全血或其任何级分或组分。适用于本发明的血液样品可从已知的任何来源(包括血细胞或其组分，例如静脉的、动脉的、外周的、组织、带，等等)提取。例如，可使用公知和常规的临床方法(例如，用于抽取和处理全血的方法)获得和处理样品。在一个方面中，示例性样品可以是从患有癌症的对象抽取的外周血。
外排体还可从组织样品，例如手术样品、活检样品、组织、粪便和培养的细胞中分离。当从组织来源分离外排体时，可需要使组织均质化以获得单一细胞悬浮液，然后裂解细胞以释放外排体。当从组织样品中分离外排体时，选择不导致外排体破坏的均质化和裂解方法是重要的。本文中考虑的外排体优选从在生理上可接受的溶液例如缓冲盐水、生长培养基、多种水性培养基等中的体液中分离。
可从新鲜收集的样品或从已经冷冻或冷藏储存的样品中分离外排体。在一些实施方案中，外排体可从细胞培养基中分离。尽管不是必需的，但如果在用体积排除聚合物进行沉淀之前澄清流体样品以除去来自样品的任何碎屑，则可获得更高纯度的外排体。澄清方法包括离心、超速离心、过滤或超滤。最典型地，外排体可通过本领域公知的多种方法分离。一种优选的方法是从体液或细胞培养上清液中进行差速离心。分离外排体的示例性方法描述于(Losche et al.，2004；Mesri和Altieri，1998；Morel et al.，2004)中。或者，外排体也可如(Combes et al.，1997)中所述通过流式细胞术分离。
用于分离外排体的一种被接受的方法包括超速离心，其通常与蔗糖密度梯度或蔗糖垫层(cushion)结合以使相对低密度的外排体漂浮。由于与其他微囊泡或大分子复合物尺寸分布重叠的可能性，通过连续差速离心分离外排体是复杂的。此外，离心可无法提供足够的方式来根据囊泡的尺寸分离囊泡。然而，连续离心当与蔗糖梯度超速离心结合时，可提供高的外排体富集。
使用超速离心途径的替代物，基于尺寸分离外排体是另一种选择。已经报道了使用超滤方法成功纯化外排体，超滤方法比超速离心耗时少，并且不需要使用特殊设备。类似地，可获得商业试剂盒(EXOMIRTM，Bioo Scientific)，其允许在一个微滤器上去除细胞、血小板和细胞碎片，并使用正压驱动流体在第二微滤器上捕获大于30nm的囊泡。但是，对于该过程，外排体未被回收，其RNA含量直接从捕获在第二微滤器上的物质中提取，随后可用于PCR分析。基于HPLC的方法可使人们获得高纯度的外排体，尽管这些方法需要专用设备且难以扩大规模。一个重要的问题是血液和细胞培养基二者均包含大量与外排体尺寸范围相同的纳米颗粒(一些非囊泡)。例如，一些miRNA可包含在胞外蛋白质复合物中，而不是外排体中；然而，可进行蛋白酶(例如蛋白酶K)处理以消除“外排体”蛋白质的任何可能的污染。
在另一个实施方案中，可通过通常用于富集外排体样品的技术，例如涉及免疫特异性相互作用的技术(例如免疫磁捕获)来捕获癌细胞来源的外排体。免疫磁捕获，也称为免疫磁细胞分离，通常涉及将针对特定细胞类型上发现的蛋白质的抗体附着于小的顺磁性珠上。当抗体包被的珠与样品(例如血液)混合时，它们附着于并包围特定的细胞。然后将样品置于强磁场中，使得珠沉淀至一侧。去除血液之后，捕获的细胞与珠一起保留。该通用方法的许多变型形式在本领域中是公知的，并且适用于分离外排体。在一个实例中，外排体可附着于磁珠(例如，醛/硫酸盐珠)，然后将抗体添加至混合物以识别附着于珠的外排体表面上的表位。已知在癌细胞来源的外排体上发现的示例性蛋白质包括ATP结合盒亚家族A成员6(ABCA6)、四次穿膜蛋白-4(TSPAN4)、SLIT和NTRK样蛋白4(SLITRK4)、推定的原钙黏着蛋白β-18(PCDHB18)、髓样细胞表面抗原CD33(CD33)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)。癌细胞来源的外排体可使用例如针对这些蛋白质的一种或更多种的抗体或适配体来分离。
本文中使用的分析包括允许直接或间接观察外排体的任何方法，并且可以是体内的或离体的。例如，分析可包括但不限于：与固体基底结合的外排体的离体显微镜或细胞计数检测和可视化、流式细胞术、荧光成像等。在一个示例性方面，癌细胞来源的外排体使用针对以下的一种或更多种的抗体来检测并随后与固体基底结合和/或使用显微镜或细胞计数检测方法来可视化：ATP结合盒亚家族A成员6(ABCA6)、四次穿膜蛋白-4(TSPAN4)、SLIT和NTRK-样蛋白4(SLITRK4)、推定的原钙黏着蛋白β-18(PCDHB18)、髓样细胞表面抗原CD33(CD33)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)、组蛋白H2A 2-A型(HIST1H2AA)、组蛋白H2A 1-A型(HIST1H1AA)、组蛋白H3.3(H3F3A)、组蛋白H3.1(HIST1H3A)、锌指蛋白37同源物(ZFP37)、层黏连蛋白亚基β-1(LAMB1)、肾小管间质性肾炎抗原样(TINAGL1)、过氧化物氧化还原酶4(PRDX4)、胶原蛋白α-2(IV)链(COL4A2)、推定的蛋白C3P1(C3P1)、Hemicentin-1(HMCN1)、推定的Rho结合蛋白-2样蛋白(RHPN2P1)、含锚蛋白重复结构域的蛋白62(ANKRD62)、含三联基序的蛋白42(TRIM42)、连接斑珠蛋白(JUP)、微管蛋白β-2B链(TUBB2B)、内切核糖核酸酶切酶(DICER1)、E3泛素蛋白连接酶TRIM71(TRIM71)、含剑蛋白p60 ATPase的亚基A样2(KATNAL2)、蛋白S100-A6(S100A6)、含5’核苷酸酶结构域的蛋白3(NT5DC3)、缬氨酸-tRNA连接酶(VARS)、Kazrin(KAZN)、ELAV样蛋白4(ELAVL4)、环指蛋白166(RNF166)、含FERM和PDZ结构域的蛋白1(FRMPD1)、78kDa的葡萄糖调节蛋白(HSPA5)、运输蛋白颗粒复合物亚基6A(TRAPPC6A)、鲨烯单加氧酶(SQLE)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、膜泡分拣蛋白28同源物(VPS28)、前列腺素F2受体负调节子(PTGFRN)、异丁酰基辅酶A脱氢酶、线粒体的(ACAD8)、26S蛋白酶调节亚基6B(PSMC4)、延伸因子1-γ(EEF1G)、肌巨蛋白(TTN)、酪氨酸蛋白磷酸酶13型(PTPN13)、丙糖磷酸异构酶(TPI1)或羧肽酶E(CPE)。
应注意，并非在细胞中表达的所有蛋白质均在由该细胞分泌的外排体中被发现。例如，钙连蛋白、GM130和LAMP-2都是在MCF-7细胞中表达但未在由MCF-7细胞分泌的外排体中被发现的蛋白质(Baietti et al.，2012)。作为另一个实例，一项研究发现，190/190胰腺导管腺癌患者具有比健康对照高的GPC1+外排体水平(Melo et al.，2015，其通过引用整体并入本文)。值得注意的是，平均仅2.3％的健康对照具有GPC1+外排体。
1.用于从细胞培养物中收集外排体的示例性方案
在第1天，在T225烧瓶中在含有10％FBS的培养基中接种足够的细胞(例如，约500万个细胞)以使得在第二天细胞为约70％汇合(confluent)。在第2天，吸出细胞上的培养基，用PBS洗涤细胞两次，然后向细胞添加25至30mL基本培养基(即无PenStrep或FBS)。将细胞孵育24至48小时。优选48小时孵育，但是某些细胞系对无血清培养基更敏感，因此孵育时间应减少到24小时。请注意，FBS包含将严重影响(skew)NanoSight结果的外排体。
在第3/4天，收集培养基并在室温下以800×g离心5分钟以使死细胞和大碎片沉淀。将上清液转移至新的锥形管，并将培养基以2000×g再次离心10分钟以去除其他大碎片和大囊泡。使培养基通过0.2μm过滤器，并且然后将其等分至超速离心管(例如25×89mmBeckman Ultra-Clear)，每管使用35mL。如果每个管的培养基体积小于35mL，则用PBS填充管的其余部分以达到35mL。使用SW 32Ti转子(k因子266.7，RCF最大133,907)在4℃下以28,000rpm将培养基超速离心2至4小时。小心吸出上清液，直至剩余约1英寸的液体。将管倾斜，并且允许剩余的培养基缓慢进入抽吸液管。如果期望的话，可将外排体沉淀重悬于PBS中，并于28,000rpm下超速离心，重复1至2小时，以进一步纯化外排体群体。
最后，将外排体沉淀重悬于210pL PBS中。如果每个样品存在多个超速离心管，则使用相同的210pL PBS连续重悬每个外排体沉淀。对于每个样品，取10pL，并且将其添加至990pL H2O，以用于纳米粒跟踪分析。将剩余的200pL含外排体的悬浮液用于下游过程，或立即在-80℃下储存。
2.用于从血清样品中提取外排体的示例性方案
首先，使血清样品在冰上解冻。然后，将250μL的无细胞血清样品在11mL PBS中进行稀释；通过0.2μm孔过滤器进行过滤。将经稀释的样品在4℃下以150,000×g超速离心过夜。第二天，小心弃去上清液，并用11mL PBS洗涤外排体沉淀。在4℃下以150,000×g进行第二轮的超速离心，持续2小时。最后，小心弃去上清液，并将外排体沉淀重悬于100pL PBS中以进行分析。
C.用于外排体和脂质体的电穿孔的示例性方案
将1×108外排体(通过NanoSight分析测量)或100nm脂质体(例如，从EncapsulaNano Sciences购买)和1μg的siRNA(Qiagen)或shRNA在400μL的电穿孔缓冲液(1.15mM磷酸钾，pH 7.2，25mM氯化钾，21％Optiprep)中混合。使用4mm比色皿对外排体或脂质体进行电穿孔(参见，例如Alvarez-Erviti et al.，2011；El-Andaloussiet al.，2012)。在电穿孔之后，将外排体或脂质体用不含蛋白酶的RNAse进行处理，随后添加10×浓缩的RNase抑制剂。最后，将外排体或脂质体用PBS根据超速离心方法洗涤，如上所述。
II.CRISPR/Cas系统
一般而言，“CRISPR系统”总体上是指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或对其活性进行指导的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr伴侣(tracr-mate)序列(包括“直接重复”，以及在内源性CRISPR系统背景下经tracrRNA处理的部分直接重复)、指导序列(在内源性CRISPR系统的背景下也称为“间隔区”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可包含非编码RNA分子(指导)RNA，其序列与DNA特异性地结合；以及Cas蛋白(例如，Cas9)，其具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)。CRISPR系统的一个或更多个元件可来源于I型、II型或III型CRISPR系统，例如来源于包含内源性CRISPR系统的特定生物体，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
在一些方面中，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列具有特异性的crRNA与固定的tracrRNA的融合体)引入细胞中。一般而言，使用互补碱基配对，gRNA的5’端处的靶位点将Cas核酸酶靶向至靶位点，例如基因。靶位点可基于其紧邻原间隔区邻近基序(protospaceradjacent motif，PAM)序列(例如通常为NGG或NAG)的5’的位置来选择。在该方面中，通过对指导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10个核苷酸进行修饰以对应于靶DNA序列，将gRNA靶向到所期望序列。一般而言，CRISPR系统的特征在于促进靶序列位点处CRISPR复合体形成的元件。通常来说，“靶序列”通常是指指导序列被设计为具有互补性的序列，其中靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合体的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合体的形成，则并非必须需要完全互补性。
CRISPR系统可在靶位点诱导双链断裂(double stranded break，DSB)，随后如本文中所述进行破坏。在另一些实施方案中，被认为是“切口酶”的Cas9变体用于在靶位点使单链产生切口。可使用成对的切口酶，例如以提高特异性，每种酶均由不同的gRNA靶向序列对来指导，以使得在同时引入切口时，引入5’突出端。在另一些实施方案中，将无催化活性的Cas9与异源效应物结构域，例如转录阻遏物或激活物融合，以影响基因表达。
靶序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可位于细胞的胞核或胞质中，例如在细胞的细胞器内。通常，可用于重组为包含靶序列的靶基因座的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面中，外源模板多核苷酸可被称为编辑模板。在一些方面中，重组是同源重组。
通常来说，在内源性CRISPR系统的背景下，CRISPR复合体(包含与靶序列杂交并与一种或更多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致靶序列中或其附近(例如，距靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)的一条或两条链的切割。可包含野生型tracr序列的全部或一部分(例如，野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多个核苷酸)或者由其组成的tracr序列也可形成CRISPR复合体的一部分，例如通过沿tracr序列的至少一部分与可操作地连接至指导序列的tracr伴侣序列的全部或一部分进行杂交。tracr序列与tracr伴侣序列具有足够的互补性以进行杂交并参与CRISPR复合体的形成，例如当进行最佳比对时，沿tracr伴侣序列的长度至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。
可将驱动CRISPR系统的一个或更多个元件表达的一个或更多个载体引入细胞中，以使得CRISPR系统的元件表达指导一个或更多个靶位点处形成CRISPR复合体。组件也可作为蛋白质和/或RNA递送至细胞。例如，Cas酶、与tracr伴侣序列连接的指导序列和tracr序列可各自可操作地连接至单独载体上的单独调节元件。或者，可将由相同或不同调节元件表达的两个或更多个元件组合在单一载体中，同时一个或更多个另外的载体提供不包含在第一载体中的CRISPR系统的任何组件。载体可包含一个或更多个插入位点，例如限制性内切核酸酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或更多个插入位点位于一个或更多个载体的一个或更多个序列元件的上游和/或下游。当使用多个不同的指导序列时，可使用单一表达构建体以将CRISPR活性靶向到细胞内的多个不同的相应靶序列。
载体可包含可操作地连接至编码CRISPR酶(例如Cas蛋白)的酶编码序列的调节元件。Cas蛋白的一些非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4，其同源物或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白的氨基酸序列可见于SwissProt数据库于登录号Q99ZW2下。
CRISPR酶可以是Cas9(例如来自酿脓链球菌或肺炎链球菌(S.pneumonia))。CRISPR酶可指导在靶序列的位置，例如在靶序列内和/或在靶序列的互补物内一条或两条链的切割。载体可编码相对于相应的野生型酶突变的CRISPR酶，以使得突变的CRISPR酶缺乏切割包含靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸的替换(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转换为切口酶(切割单链)。在一些实施方案中，Cas9切口酶可与指导序列，例如两个指导序列组合使用，所述指导序列分别靶向DNA靶标的有义和反义链。该组合允许两条链均被切成切口并用于诱导NHEJ或HDR。
在一些实施方案中，对编码CRISPR酶的酶编码序列进行密码子优化以在特定细胞，例如真核细胞中表达。真核细胞可以是特定生物体的那些或者来源于所述特定生物体，所述生物体例如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类。一般而言，密码子优化是指在维持天然氨基酸序列的同时，通过用该宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子来修饰核酸序列以在目的宿主细胞中增强表达的过程。多种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子选用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率继而被认为尤其取决于待翻译密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选择tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最频繁使用的密码子。因此，可基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中进行最佳基因表达。
一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且将CRISPR复合体与靶序列直接序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其对应的靶序列之间的互补性程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。
最佳比对可使用用于比对序列的任何合适的算法来确定，其一些非限制性实例包括史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)；内德勒曼-温施算法(Needleman-Wunsch algorithm)；基于伯劳斯-惠勒变换(Burrows-Wheeler Transform)的算法(例如，伯劳斯-惠勒比对器(Burrows Wheeler Aligner))；Clustal W；Clustal X；BLAT；Novoalign(Novocraft Technologies，ELAND(Illumina，San Diego，Calif.))；SOAP(可在soap.genomics.org.cn上获得)以及Maq(可在maq.sourceforge.net上获得)。
CRISPR酶可以是包含一个或更多个异源蛋白质结构域的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可包含任何另外的蛋白质序列，以及任选地在任何两个结构域之间的接头序列。可与CRISPR酶融合的蛋白质结构域的一些实例包括但不限于表位标签、报道基因序列和具有以下活性中的一种或更多种的蛋白质结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的一些非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(influenza hemagglutinin，HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)标签。报道基因的一些实例包括但不限于谷胱甘肽5转移酶(glutathione-5-transferase，GST)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)β半乳糖苷酶、β葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(cyanfluorescent protein，CFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)以及自发荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein，BFP)。CRISPR酶可与编码结合DNA分子或结合其他细胞分子的蛋白质或蛋白质片段的基因序列融合，所述蛋白质或蛋白质片段包括但不限于麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP)、S标签、Lex A DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD)融合体、GAL4A DNA结合结构域融合体以及单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)BP16蛋白质融合体。可形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外结构域描述于US 20110059502，其通过引用并入本文。
III.CRISPR系统的递送
在一些方面中，将编码CRISPR-Cas9靶向分子、复合体，或组合的核酸施用或引入细胞。在一些方面中，该系统可能已经存在于细胞中或细胞中的外排体中。所述核酸通常以表达载体，例如病毒表达载体的形式施用。在一些方面中，表达载体是逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、DNA质粒表达载体或AAV表达载体。在一些方面中，将编码破坏分子或复合体，例如DNA靶向分子的一个或更多个多核苷酸递送至细胞。在一些方面中，将通过递送一个或更多个载体，其一个或更多个转录物和/或从其转录的一个或更多个蛋白质来进行的递送递送至细胞。
在一些实施方案中，由于将编码多肽的多核苷酸引入细胞中，因此多肽在细胞中原位合成。在一些方面中，多肽可在细胞外产生，并且然后将其引入到细胞内。用于将多核苷酸构建体引入动物细胞中的方法是已知的，并且作为非限制性实例，包括其中将多核苷酸构建体整合到细胞基因组中的稳定转化方法，其中未将多核苷酸构建体整合到细胞基因组中的瞬时转化方法，以及病毒介导的方法。在一些实施方案中，可通过例如重组病毒载体(例如，逆转录病毒、腺病毒)，脂质体等将多核苷酸引入细胞中。例如，在一些方面中，瞬时转化方法包括显微注射、电穿孔或粒子轰击。在一些实施方案中，鉴于在细胞中表达，可将多核苷酸包含在载体，更特别地在质粒或病毒中。
在一些实施方案中，可使用基于病毒和非病毒的基因转移方法以将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。可使用这样的方法以向培养物中或宿主生物体中的细胞施用编码CRISPR系统的组件的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，本文中所述载体的转录物)、裸核酸以及与递送载剂，例如脂质体复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，它们在递送至细胞之后具有游离基因组或整合的基因组。对于基因治疗操作的综述，参见Anderson，1992；Nabel&Feigner，1993；Mitani&Caskey，1993；Dillon，1993；Miller，1992；Van Brunt，1988；Vigne，1995；Kremer&Perricaudet，1995；Haddada et al.，1995；和Yu et al.，1994。
核酸的非病毒递送的方法包括外排体、lipofection、核转染、显微注射、基因枪法、病毒微体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体以及DNA的经试剂增强的摄取。lipofection描述于(例如，美国专利No.5,049,386、4,946,787和4,897,355)，并且lipofection试剂商业上销售(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适合于多核苷酸的高效受体识别lipofection的阳离子脂质和中性脂质包括Feigner，WO91117424；WO 91116024的那些。可递送至细胞(例如，体外或离体施用)或者靶组织(例如，体内施用)。
在一些实施方案中，递送是通过使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送核酸。在一些方面中，病毒载体可直接施用于患者(体内)，或者可使用它们以体外或离体处理细胞，并且然后施用于患者。在一些实施方案中，基于病毒的系统包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
在一些方面中，可将报道基因引入细胞中以编码用作标志物的基因产物，通过所述标志物测量基因产物表达的改变或修饰，所述报道基因包括但不限于谷胱甘肽5转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)β半乳糖苷酶、β葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)以及自发荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(BFP)。在另一个实施方案中，可通过载体将编码基因产物的DNA分子引入细胞中。在一些实施方案中，基因产物是萤光素酶。
如本领域技术人员将理解的，在装载货物(cargo)之前或之后，可通过包含靶向部分来进一步改变本发明的外排体，以增强其作为递送货物的载剂的效用。在这方面中，外排体可被工程化以并入将特定细胞特异性靶向至组织类型的实体。该靶标特异性实体，例如对靶细胞或组织上的受体或配体具有亲和力的肽可例如通过使用本领域中公认的方法与外排体膜标志物融合而整合在外排体膜内。
IV.疾病的治疗
本发明的某些方面提供了用表达或包含基因编辑系统，例如CRISPR系统的外排体来治疗患者。CRISPR系统可在患者中的癌细胞内诱导基因编辑。因为已知外排体包含完成mRNA转录和蛋白质翻译所必需的机制(参见WO2015/085096，通过引用其整体并入本文)，可将编码治疗性蛋白质的mRNA或DNA核酸转染到外排体中。或者，可将治疗性蛋白质本身电穿孔到外排体中或直接并入脂质体中。
本文中使用的术语“对象”是指对其进行主题方法的任何个体或患者。通常，对象是人，尽管本领域技术人员将理解，对象可以是动物。因此，另一些动物，包括哺乳动物，例如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)，猫，狗，兔，农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪等)以及灵长类(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)均包括在对象的定义之内。
“治疗”及其变化形式是指出于获得疾病或健康相关病症的治疗益处的目的而向对象施用或应用治疗剂或者对对象进行程序或模式(modality)。例如，治疗可包括施用包含CRISPR系统的外排体、化学治疗、免疫治疗或放射治疗，进行手术，或其任何组合。
本文中使用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指对于该病症的医学治疗而言促进或增强对象的福祉的任何事物。这包括但不限于降低疾病体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可涉及例如降低肿瘤的侵袭力、降低癌症的生长速率或预防转移。癌症的治疗还可指延长患有癌症的对象的存活。
本文中使用的术语“癌症”可用于描述实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施方案中，癌症可起源于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈(gum)、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。
癌症可具体地是以下组织学类型，尽管其不限于这些：肿瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌肿瘤，恶性；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌(endometroid carcinoma)；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病(paget’s disease)，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌w/鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；男性细胞瘤，恶性；Sertoli细胞癌；莱迪希细胞瘤(leydig cell tumor)，恶性；脂质细胞瘤，恶性；神经节细胞瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；皮肤丝球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横紋肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒管混合瘤(mullerian mixedtumor)；肾胚细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦纳瘤(brenner tumor)，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤(kaposi’ssarcoma)；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；成软骨细胞瘤，恶性；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(ewing’s sarcoma)；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病(hodgkin’s disease)；霍奇金副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样霉菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。尽管如此，还认识到本发明也可用于治疗非癌性疾病(例如，真菌感染、细菌感染、病毒感染、神经退行性疾病和/或遗传紊乱)。
本文中使用术语“接触的”和“暴露的”当应用于细胞时用于描述将治疗剂递送至靶细胞或将其置于与靶细胞直接并置的过程。为了实现细胞杀伤，例如，将一种或更多种试剂以有效杀伤细胞或防止其分裂的量递送至细胞。
针对治疗患者的有效响应或患者的“响应性”是指给予处于患病或障碍的风险或者患有疾病或障碍的患者的临床或治疗性益处。这样的益处可包括细胞或生物学响应，完全响应，部分响应，稳定的疾病(无进展或复发)或者伴有之后复发的响应。例如，有效响应可在被诊断患有癌症的患者中降低肿瘤尺寸或无进展存活。
可预测和监测治疗结果，和/或可通过本文中所述的方法鉴定或选择受益于这样的治疗的患者。
关于肿瘤性病症治疗，取决于肿瘤性病症阶段，肿瘤性病症治疗涉及以下治疗中的一种或组合：去除肿瘤组织的手术、放射治疗以及化学治疗。其他治疗方案可与抗癌剂，例如治疗组合物和化学治疗剂的施用组合。例如，待用这样的抗癌剂治疗的患者也可接受放射治疗和/或可经受手术。
对于疾病的治疗，治疗组合物的合适剂量将取决于如上所定义的待治疗的疾病类型，疾病的严重程度和病程，患者的临床史和对药剂的响应，以及主治医师的酌处权。该药剂适合一次或系列治疗中施用于患者。
可以以有效地实现所期望效果的组合量提供治疗性和预防性方法和组合物。可使组织、肿瘤或细胞与包含一种或更多种药剂的一种或更多种组合物或药理制剂接触，或者通过使组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种独特的组合物或制剂接触。同样，预期可将这样的组合治疗与化学治疗、放射治疗、手术治疗或免疫治疗结合使用。
组合施用可包括以同一剂型同时施用两种或更多种药剂，以分开的剂型同时施用，以及分开的施用。即，可将主题治疗组合物和另一治疗剂一起配制在同一剂型中并同时施用。或者，可同时施用主题治疗组合物和另一治疗剂，其中两种药剂存在于分开的制剂中。在另一替代方案中，可在施用所述治疗剂之后紧接着施用另一治疗剂，或者反之亦然。在分开的施用方案中，主题治疗组合物和另一治疗剂可相距数分钟，或相距数小时或相距数天施用。
相对于第二抗癌治疗，第一抗癌治疗(例如，表达重组蛋白或与从外排体分离的重组蛋白的外排体)可在其之前、期间、之后或以多种组合施用。施用可以以同时至数分钟至数天至数周这样的间隔进行。在其中将第一治疗与第二治疗分开提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间无终止的显著的时段，使得两种化合物仍将能够对患者发挥有利的组合效果。在这样的情况下，预期可在彼此约12至24或72小时内，并且更特别地在彼此约6至12小时内为患者提供第一治疗和第二治疗。在一些情况下，可能期望将治疗时期显著延长，其中分开施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在某些实施方案中，疗程将持续1至90天或更长(该这样的范围包括中间天数)。预期可在第1天至第90天(该这样的范围包括中间天数)的任意天或其任何组合给予一个药剂，以及在第1天至第90天(该这样的范围包括中间天数)的任意天或其任何组合给予另一药剂。在单日(24小时时期)内，可给予患者一次或多次施用药剂。此外，在疗程之后，预期存在未施用抗癌治疗的时段。该时期可持续1至7天，和/或1至5周，和/或1至12个月或更长(该这样的范围包括中间天数)，取决于患者的状况，例如其预后、体力(strength)、健康等。期望可根据需要重复治疗周期。
可采用多种组合。对于下面的实例，第一抗癌治疗是“A”，以及第二种抗癌治疗是“B”：
Figure BDA0002539456870000261
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本发明的任何化合物或治疗将遵循施用这样的化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测归因于组合治疗的毒性的步骤。
1.化学治疗
根据本发明，可使用多种化学治疗剂。术语“化学治疗”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物按其在细胞内的活性方式进行分类，例如它们是否影响细胞周期以及在什么阶段影响细胞周期。或者，药剂可基于其直接交联DNA，嵌入DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。
化学治疗剂的一些实例包括烷化剂类，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三甲蜜胺；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱类(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓虫素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇类；海绵抑制素；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1)；达因霉素，包括达因霉素A；二膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素类；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类(例如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺类，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素类；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合体；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨、卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法尼基-蛋白质转移酶抑制剂、反铂，以及上述任意一种的可药用的盐、酸或衍生物。
2.放射治疗
导致DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常被称为γ射线、X射线的那些和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素。还预期了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)以及UV辐照。很可能所有这些因素均对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。X射线的剂量范围以50至200伦琴日剂量持续一段长时间(3至4周)至2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，且取决于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
3.免疫治疗
技术人员将理解，可将另外的免疫治疗与本发明的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0002539456870000281
是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可用作治疗的效应物或者其可募集其他细胞以实际上影响细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且仅用作靶向剂。或者，效应物可以是直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的携带表面分子的淋巴细胞。多种效应物细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在免疫治疗的一个方面中，肿瘤细胞必须具有适用于靶向(即，不存在于大多数其他细胞上)的一些标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些肿瘤标志物中的任何一种可能适于本发明的上下文中的靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和p155。免疫治疗的另一个方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，例如MIP-1、MCP-1、IL-8，以及生长因子，例如FLT3配体。
目前正在研究或应用的免疫治疗的一些实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium向lciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides et al.，1998)；细胞因子治疗，例如α、β和γ干扰素，IL-1，GM-CSF和TNF(Bukowski et al.，1998；Davidson et al.，1998；Hellstrand et al.，1998)；基因治疗，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin et al.，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander，2013；Hanibuchi etal.，1998；美国专利5,824,311)。预期可将一种或更多种抗癌治疗与本文中所述的抗体治疗一起使用。
在一些实施方案中，免疫治疗可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点或调高信号(例如，共刺激分子)或调低信号。可被免疫检查点阻断而靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(adenosine A2A receptor，A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞弱化子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein，CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(killer-cellimmunoglobulin，KIR)、淋巴细胞激活基因3(lymphocyte activation gene-3，LAG3)、程序性死亡1(programmed death 1，PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(T-cellimmunoglobulin domain and mucin domain 3，TIM-3)以及T细胞活化V结构域Ig抑制剂(V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体、或者特别是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公布WO2015016718；Pardoll，Nat Rev Cancer，12(4)：252-64，2012；二者均通过引用并入本文)。可使用免疫检查点蛋白的已知抑制剂或其类似物，特别地，可使用嵌合的、人源化或人形式的抗体。如技术人员将知道的，替代和/或等同的名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同的名称是可互换的。例如，已知拉立珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等同的名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)而为人所知。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，PD-1配体结合伴侣是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，PDL1结合伴侣是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拈抗剂是抑制PDL2与其结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，PDL2结合伴侣是PD-1。拈抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利No.8,735,553、8,354,509和8,008,449，其全部通过引用并入本文。用于本文中提供的方法的另一些PD-1轴拈抗剂在本领域中是已知的，所述拈抗剂例如描述于美国专利公布No.20140294898、2014022021和20110008369中，其全部通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拈抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拈抗剂是免疫黏附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的胞外部分或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拈抗剂是AMP-224。纳武单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0002539456870000301
是描述于WO2006/121168中的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck 3475、拉立珠单抗、
Figure BDA0002539456870000302
和SCH-900475，是描述于WO2009/114335.CT-011中的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是描述于WO2009/101611中的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是描述于WO2010/027827和WO2011/066342中的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可在本文中提供的方法中靶向的另一免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4存在于T细胞表面上，并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时，用作“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，该超家族在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28相似，并且两个分子均与抗原呈递细胞上的CD80和CD86结合，分别还称为B7-1和B7-2。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28则传递刺激信号。胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中，并且可能对于调节性T细胞功能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4的表达提高，CTLA-4是B7分子的抑制性受体。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)，其抗原结合片段，免疫黏附素，融合蛋白或寡肽。
适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域中公知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，公开于以下中的抗CTLA-4抗体可用于本文中公开的方法中：美国专利No.8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为替西木单抗(tremelimumab)；原名西木单抗(ticilimumab))，美国专利No.6,207,156；Hurwitz et al.(1998)Proc Natl Acad SciUSA 95(17)：10067-10071；Camacho et al.(2004)J Clin Oncology 22(145)：摘要No.2505(抗体CP-675206)；和Mokyr et al.(1998)Cancer Res58：5301-5304。每个前述出版物的教导均通过引用并入于此。也可使用与这些本领域公认的抗体中任一者竞争与CTLA-4结合的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请No.WO2001014424、WO2000037504和美国专利No.8,017,114；其全部通过引用并入本文。
示例性抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
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)或其抗原结合片段以及变体(参见，例如，WO 01/14424)。在另一些实施方案中，所述抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体与如上所述的抗体竞争结合CTLA-4上的同一表位和/或与之结合。在另一个实施方案中，所述抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的另一些分子包括CTLA-4配体和受体，所述CTLA-4配体和受体例如描述于美国专利No.5844905、5885796和国际专利申请No.WO1995001994和WO1998042752中，其全部通过引用并入本文；以及免疫黏附素，所述免疫黏附素例如描述于美国专利No.8329867中，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，免疫治疗可以是过继免疫治疗，其涉及转移离体产生的自体抗原特异性T细胞。用于过继免疫治疗的T细胞可通过抗原特异性T细胞的扩增或通过遗传工程进行的T细胞的重定向来产生(Park，Rosenberg et al.2011)。已表明肿瘤特异性T细胞的分离和转移成功治疗黑素瘤。通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，CAR)的遗传转移，已成功地在T细胞中产生了新的特异性(Jena，Dottiet al.2010)。CAR是由与单一融合分子中的一个或更多个信号传导结构域缔合的靶向部分组成的合成受体。一般而言，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，该结构域包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻片段和可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。第一代CAR的信号传导结构域来源于CD3ζ的胞质区或Fc受体γ链。CAR已成功地使T细胞针对来自多种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原重定向(Jena，Dotti et al.2010)。
在一个实施方案中，本申请提供了用于治疗癌症的组合治疗，其中所述组合治疗包含过继T细胞治疗和检查点抑制剂。在一个方面中，过继T细胞治疗包含自体和/或同种异体T细胞。在另一个方面中，自体和/或同种异体T细胞靶向肿瘤抗原。
4.手术
约60％的患有癌症的人将经受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或阶段性、治疗性和姑息性手术。治疗性手术包括其中将所有或部分的癌组织物理地去除、切除和/或破坏，并且可与另一些治疗，例如本发明的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗结合使用的切除术。肿瘤切除是指物理去除至少一部分的肿瘤。除肿瘤切除术之外，通过手术的治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。
在切除部分或全部的癌细胞、组织或肿瘤之后，可在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或在该区域局部施用另外的抗癌治疗来完成。可重复这样的治疗，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4周和5周或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以是不同的剂量。
5.其他药剂
预期可将其他药剂与本发明的某些方面组合使用以提高治疗的治疗效力。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对凋亡诱导剂敏感性的药剂或其他生物药剂。通过升高GAP连接数提高胞间信号传导，将提高对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在另一些实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可与本发明的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。预期细胞黏附抑制剂提高本发明的效力。细胞黏附抑制剂的一些实例是黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。还预期可将提高过度增殖细胞对凋亡的敏感性的另一些药剂，例如抗体c225，与本发明的某些方面组合使用以提高治疗效力。
V.药物组合物
预期表达或包含CRISPR系统的外排体可全身或局部地施用以抑制肿瘤细胞生长，并且最优选地，在患有局部晚期或转移性癌症的癌症患者中杀伤癌细胞。它们可静脉内、鞘内和/或腹膜内施用。它们可单独地或与抗增殖药物组合施用。在一个实施方案中，在手术或其他操作之前施用它们以降低患者中的癌症负荷。或者，可在手术之后施用它们以确保任何剩余的癌症(例如，手术未能消除的癌症)不能存活。
无意于本发明受到治疗制剂的特定性质的限制。例如，这样的组合物可与生理上可耐受的液体、凝胶、固体载体、稀释剂或赋形剂一起提供于制剂中。可将这些治疗制剂以类似于其他治疗剂的方式施用于哺乳动物，例如家养动物以用于兽医用途，以及人中以用于临床用途。一般而言，治疗效力所需的剂量将根据用途类型和施用方式以及个体对象的特定需求而变化。
在预期临床应用的情况下，可能有必要以适于旨在应用的形式制备包含重组蛋白和/或外排体的药物组合物。通常，可以是肠胃外制剂的药物组合物可包含有效量的溶解或分散在可药用载体中的一种或更多种重组蛋白和/或外排体和/或另外的药剂。词组“可药用或药理学上可接受的”是指当施用(视情况而定)于动物，例如如人时，不产生不良、变应性或其他不良反应的分子实体和组合物。包含如本文中公开的重组蛋白和/或外排体或者另外的活性成分的药物组合物的制备如由Remington’s Pharmaceutical Sciences，18thEd.，1990所例示，出于所有目的将其通过引用其整体并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解，制剂应符合如由FDA生物标准办公室(FDA Office ofBiologicalStandards)所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
进一步根据本发明的某些方面，适合于施用的组合物可在具有或不具有惰性稀释剂的可药用载体中提供。本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有水溶剂(例如，水、醇/水溶液、乙醇、盐溶液、肠胃外载剂，例如氯化钠、林格右旋糖(Ringer’s dextrose)等)；非水溶剂(例如，脂肪、油剂、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，植物油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯)；脂质；脂质体；分散介质；包衣(例如，卵磷脂)；表面活性剂；抗氧化剂；防腐剂(例如，抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体、对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，或其组合)；等张剂(例如，糖和氯化钠)；吸收延迟剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)；盐；药物；药物稳定剂；凝胶剂；树脂；填充剂；结合剂；赋形剂；崩解剂；润滑剂；甜味剂；矫味剂；染料；流体和营养补充剂；例如材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的。载体应是可吸收的，并且包括液体、半固体即糊剂，或固体载体。另外，如果期望的话，该组合物可包含少量的助剂物质，例如润湿剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂。根据公知的参数调节药物组合物中多种组分的pH和确切浓度。可例如通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。
可药用载体特别地被配制用于向人施用，尽管在某些实施方案中可能期望使用被配制用于向非人动物施用但对于向人施用是不可接受的(例如，由于政府法规)的可药用载体。除非任何常规载体与活性成分不相容(例如，不利于接受体或其中所含组合物的治疗效力)，否则考虑将其用于治疗或药物组合物中。根据本发明的某些方面，以任何方便和实用的方式，即通过溶液剂、混悬剂、乳化、混合、包封、吸收等将组合物与载体组合。这样的操作对于本领域技术人员而言是常规的。
本发明的某些实施方案可包括不同类型的载体，这取决于其是以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及施用途径(例如注射)是否需要无菌。所述组合物可如下施用：静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、黏膜、经口、表面、局部、通过吸入(例如，气雾剂吸入)、通过注射、通过输注、通过持续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在脂质组合物(例如，脂质体)中、或者通过其他方法或前述方法的任意组合，例如，在Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，1990中描述的，其通过引用并入本文。
活性化合物可配制成用于肠胃外施用，例如配制成用于通过静脉内、动脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。因此，实施方案包括肠胃外制剂。通常来说，这样的组合物可制备成液体溶液或混悬剂；也可制备适用于在注射之前添加液体之后制备溶液或混悬剂的固体形式；并且制剂还可被乳化。
根据主题实施方案，肠胃外制剂可包含如本文中公开的外排体以及一种或更多种溶质和/或溶剂、一种或更多种缓冲剂和/或一种或更多种抗菌剂，或其任意组合。在一些方面，溶剂可包含水、与水混溶的溶剂(例如，乙醇、液体聚乙二醇和/或丙二醇)和/或与水不混溶的溶剂(例如，固定油类，包括例如，玉米油、棉籽油、花生油和/或芝麻油)。在某些形式中，溶质可包含一种或更多种抗菌剂、缓冲剂、抗氧化剂、张度剂、冷冻保护剂和/或冻干保护剂。
根据主题公开内容的抗菌剂可包括在主题公开内容的其他地方提供的那些以及苄醇、苯酚、汞和/或对羟基苯甲酸酯。抗菌剂可包括：苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、溴苯酚、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、依西替丁、咪唑烷脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞，或其任意组合。在多个方面，抗菌剂可以以确保药物试剂所需的无菌性所必需的浓度存在。例如，试剂可以以抑菌或抑真菌浓度存在于制剂中，例如，装在多剂量容器中的制剂。在多个实施方案中，试剂可以是防腐剂和/或可在使用时以足够的浓度存在，以防止微生物繁殖，例如，在例如用皮下注射针和注射器抽出一部分内容物的同时无意中引入制剂中的微生物。在多个方面，试剂具有最大的体积和/或浓度限制(例如，硝酸苯汞和硫柳汞0.01％、苄索氯铵和苯扎氯铵0.01％、苯酚或甲酚0.5％以及氯丁醇0.5％)。在多种情况下，试剂(例如硝酸苯汞)以0.002％的浓度使用。根据实施方案，也可应用对羟基苯甲酸甲酯0.18％和对羟基苯甲酸丙酯0.02％的组合，以及苯甲醇2％。抗菌剂还可包含己基间苯二酚0.5％、苯甲酸苯汞0.1％和/或治疗化合物。
根据主题公开内容的抗氧化剂可包括抗坏血酸和/或其盐，和/或乙二胺四乙酸(EDTA)的钠盐。如本文中所述的张度剂可包括电解质和/或单糖或二糖。冷冻保护剂和/或冻干保护剂是保护生物药物免受由于冷冻干燥过程期间产品的冷冻和/或干燥的有害影响的添加剂。冷冻保护剂和/或冻干保护剂可包括糖(非还原性的)，例如，蔗糖或海藻糖；氨基酸(例如甘氨酸或赖氨酸)；聚合物(例如液体聚乙二醇或葡聚糖)；以及多元醇(例如甘露醇或山梨醇)，所有均可能是冷冻或冻干保护剂。主题实施方案还可包括抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸，或其任意组合。根据主题公开内容可使用的另外的溶质和抗菌剂、缓冲剂、抗氧化剂、张度剂、冷冻保护剂和/或冻干保护剂及其特性，以及制备主题肠胃外制剂的方法的方面，例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，21st Ed.，2005，例如第41章中描述，出于所有目的，其通过引用以其整体并入本文。
适用于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂；包括芝麻油、花生油、或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌散剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是达到其可容易地注射之程度的流体。其在制造和储存条件下也应该是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。
可将治疗剂以游离碱、中性或盐形式配制成组合物。可药用盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的那些，或与无机酸例如如盐酸或磷酸或者有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱，例如如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，或者有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因等。配制之后，溶液将以与剂量制剂相容的方式并以例如治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，例如，配制成用于肠胃外施用，例如，可注射溶液，或用于递送至肺的气雾剂、或者配制成用于消化施用，例如药物释放胶囊等。
在本发明的一个具体实施方案中，组合物与半固体或固体载体充分组合或混合。混合可以以任意方便的方式进行，例如，研磨。也可在混合过程中添加稳定剂，以保护组合物免于损失治疗活性，即在胃中变性。用于组合物的稳定剂的一些实例包括缓冲剂、氨基酸(例如甘氨酸和赖氨酸)、碳水化合物(例如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等)。
在另一些实施方案中，本发明可涉及包含一种或更多种脂质和水性溶剂的药物脂质载剂组合物的用途。本文中使用的，术语“脂质”将被定义为包括特征性地不溶于水并且可用有机溶剂提取的宽范围物质中的任一种。这种宽泛类别的化合物是本领域技术人员公知的，并且在本文中使用术语“脂质”时，其不限于任何特定的结构。一些实例包括含有长链脂族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即，由人设计或产生)。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质在本领域中是公知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂(lysolipid)、鞘糖脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质，可聚合的脂质，及其组合。当然，除本文中具体描述的那些之外的被本领域技术人员理解为脂质的化合物也被所述组合物和方法涵盖。
本领域普通技术人员将熟悉可用于将组合物分散在脂质载剂中的一系列技术。例如，通过本领域普通技术人员已知的任何方式，治疗剂可分散在包含脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，与脂质共价结合，作为混悬剂包含在脂质中，与胶束或脂质体包含或复合，或其他方法与脂质或脂质结构缔合。分散可以或可以不导致形成脂质体。
术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于对象的物理上离散的单元，每个单位含有预定量的治疗性组合物，所述预定量经计算产生与其施用(即，合适的途径和治疗方案)相关的以上讨论的期望响应。根据治疗数量和单位剂量二者，待施用的量取决于所期望的效果。施用于患者或对象的本发明的组合物的实际剂量量可通过物理和生理因素(例如对象的体重、年龄、健康状况和性别、被治疗疾病的类型、疾病渗透程度、先前或同时的治疗干预、患者的特发病、施用途径、以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性)来确定。例如，剂量还可包含每次施用约1pg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该这样的范围包括干预剂量)或更多，以及其中可推论出的任何范围。在从本文中所列数字可推论出的范围的一些非限制性实例中，可施用约5pg/kg/体重至约100mg/kg/体重，约5pg/kg/体重至约500mg/kg/体重等的范围。在任何事件下，负责施用的医疗人员将确定组合物中活性成分的浓度和个体对象的合适剂量。
施用于动物患者的组合物的实际剂量量可通过物理和生理因素来确定，例如体重、病症严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发病、以及施用途径。取决于剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可根据对象的响应而变化。在任何事件下，负责施用的医疗人员将确定组合物中活性成分的浓度和个体对象的合适剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在另一些实施方案中，活性化合物可包含单位重量的约2％至约75％，或例如约25％至约60％，以及其中可推论出的任何范围。自然地，每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以以这样的方式制备：在任何给定的单位剂量的化合物中将获得合适的剂量。制备这样的药物制剂的本领域技术人员将考虑以下因素，例如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保存期限以及其他药理学考虑因素，并因此，可期望多种剂量和治疗方案。
在另一些非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约1000毫克/kg/体重或更多，以及其中可推论出的任何范围。在从本文中所列数字可推论出的范围的一些非限制性实例中，基于上述数字，可施用约5毫克/kg/体重至约100毫克/kg/体重，约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。
VI.核酸和载体
在本发明的某些方面，可公开编码治疗蛋白或含有治疗蛋白的融合蛋白的核酸序列。根据所使用的表达系统，可基于常规方法选择核酸序列。例如，可针对在某个系统中表达对各个基因或其变体进行密码子优化。多种载体也可用于表达目的蛋白质。示例性载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子或基于脂质体的载体。
VII.重组蛋白质和抑制性RNA
一些实施方案涉及重组蛋白质和多肽。一些具体实施方案涉及具有RNA指导的内切核酸酶活性的重组蛋白质或多肽。在另一些方面，可修饰蛋白质或多肽以提高血清稳定性。因此，当本申请提及“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”的功能或活性时，本领域普通技术人员将理解，这包括例如，相对于未经修饰的蛋白质或多肽具有另外的优势的蛋白质或多肽。特别考虑了关于“经修饰的蛋白质”的实施方案可相对于“经修饰的多肽”来实施，反之亦然。
重组蛋白质可具有氨基酸的缺失和/或替换；因此，具有缺失的蛋白质、具有替换的蛋白质以及具有缺失和替换的蛋白质是经修饰的蛋白质。在一些实施方案中，这些蛋白质还可包含插入或添加的氨基酸，例如如具有融合蛋白或具有接头的蛋白质。“经修饰的缺失蛋白质”缺少天然蛋白质的一个或更多个残基，但是可具有天然蛋白质的特异性和/或活性。“经修饰的缺失蛋白质”也可能具有降低的免疫原性或抗原性。经修饰的缺失蛋白质的一个实例是具有从至少一个抗原区域(即，在特定生物体中，例如可施用经修饰的蛋白质的生物体类型中被确定为具有抗原性的蛋白质区域)缺失氨基酸残基的蛋白质。
替换或取代变体通常包含在蛋白质内一个或更多个位点处的一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可被设计为调节多肽的一个或更多个特性，特别是其效应物功能和/或生物利用度。替换可以是或可以不是保守的，即一种氨基酸被类似形状和电荷的一种取代。保守的替换是本领域中公知的并且包括，例如，以下改变：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。
除缺失或替换之外，经修饰的蛋白质可具有残基的插入，其通常涉及在多肽中添加至少一个残基。这可包括插入靶向肽或多肽或仅单个残基。下面讨论被称为融合蛋白的末端添加。
术语“生物学功能等同”在本领域中是公知的，并且在本文中进一步详细定义。因此，包括了约70％至约80％、或约81％至约90％、或甚至约91％至约99％的氨基酸与对照多肽的氨基酸相同或功能等同的序列，条件是维持蛋白质的生物活性。在某些方面，重组蛋白质可与其天然对应物是生物学功能上等同的。
还将理解的是，氨基酸和核酸序列可包含另外的残基，例如另外的N-或C-末端氨基酸，或5’或3’序列，并且仍然基本上如本文中公开的一个序列所示，只要序列符合以上提出的标准即可，所述标准包括在涉及蛋白质表达的情况下，维持生物学蛋白质活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列，其可例如包含位于编码区的5’或3’部分侧翼的多种非编码序列，或者可包含已知在基因内存在的多种内部序列，即内含子。
本文中使用的，蛋白质或肽通常是指但不限于大于约200个氨基酸至从基因翻译的全长序列的蛋白质；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3至约100个氨基酸的肽。为了方便起见，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用。
本文中使用的，“氨基酸残基”是指本领域已知的任何天然存在的氨基酸，任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质或肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸中断氨基酸残基的序列。在另一些实施方案中，该序列可包含一个或更多个非氨基酸部分。在一些具体实施方案中，蛋白质或肽的残基序列可被一个或更多个非氨基酸部分打断。
因此，术语“蛋白质或肽”涵盖包含天然存在的蛋白质中发现的20种常见氨基酸中的至少一种或至少一种经修饰或异常氨基酸的氨基酸序列。
本发明的某些实施方案涉及融合蛋白。这些分子可具有在N-或C-末端与异源结构域连接的治疗性蛋白质。例如，融合还可使用来自其他物种的前导序列来允许蛋白质在异源宿主中的重组表达。另一种有用的融合包括添加蛋白质亲和标签，例如，血清白蛋白亲和标签或六个组氨酸残基，或免疫活性结构域，例如，抗体表位，优选可切割，以促进融合蛋白的纯化。非限制性亲和标签包括聚组氨酸、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
产生融合蛋白的方法是本领域技术人员公知的。这样的蛋白可例如，通过完整融合蛋白的从头合成，或通过附着编码异源结构域的DNA序列，然后通过表达完整的融合蛋白来产生。
通过将基因与编码肽接头的桥接DNA片段(在串联连接的多肽之间进行剪接)连接，可促进恢复亲本蛋白质的功能活性的融合蛋白的产生。接头将具有足够的长度以允许所得融合蛋白的正确折叠。
VIII.试剂盒和诊断
在本发明的多个方面，设想了包含从体液或组织培养基中纯化外排体所必需组分的试剂盒。在另一些方面，设想了包含分离外排体所必需组分并用CRISPR系统将其转染的试剂盒。该试剂盒可包含一个或更多个密封的小瓶，其中包含任何这样的组分。在一些实施方案中，试剂盒还可包含合适的容器装置，所述容器是不会与试剂盒的组分反应的容器，例如eppendorf管、测定板、注射器、瓶或管。容器可由可灭菌材料(例如塑料或玻璃)制成。
试剂盒还可包含说明单，其概述了本文中所阐述方法的程序性步骤，并且将遵循与本文中所述或本领域普通技术人员已知的基本上相同的程序。指令信息可在包含机器可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行该机器可读指令时，导致显示从样品中纯化外排体并在其中转染或电穿孔CRISPR系统的真实或虚拟程序。
IX.实施例
包括以下实施例以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术表示发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术，并因此可认为构成用于其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可在所公开的一些具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1-材料和方法
外排体的分离和纯化。外排体通过差速离心方法纯化，如前所述(Alvarez-Ervitiet al.，2011；El-Andaloussi et al.，2012)。从在含有外排体耗尽的FBS的培养基中培养48小时的细胞中收集上清液，并随后进行800g 5分钟和2000g 10分钟的连续离心步骤。然后将该所得上清液用0.2pm过滤器在培养瓶中过滤，并在超速离心(Beckman)2小时之后，在SW 32Ti转子中以28,000g回收沉淀(pellet)。吸出上清液并将沉淀重悬于PBS中，并随后超速离心另外2小时。然后分析纯化的外排体并用于实验程序。
外排体和脂质体的电穿孔。将1×108至3×108外排体(通过nanosight分析测量)和指定量的RNA混合在400μl电穿孔缓冲液(1.15mM磷酸钾，pH 7.2，25mM氯化钾，21％OptiprepTM)中。使用Gene Pulser XcellTM电穿孔系统(BioRad)使用4mm比色皿对外排体进行电穿孔，如前所述(Alvarez-Erviti et al.，2011；El-Andaloussi et al.，2012)。电穿孔之后，外排体用无蛋白酶的RNAseA(Sigma Aldrich)处理，然后添加10×浓缩的RNase抑制剂(Ambion)，并根据超速离心方法用PBS洗涤，如上所述。
外排体转染。对于使用外排体的体外转染，如上所述将外排体进行电穿孔并用PBS洗涤，并将6孔板中的200,000个细胞用外排体处理所需的时间(如每种测定所述)，并随后用PBS洗涤并用于进一步分析。
实时PCR分析。根据制造商的指示，在用
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(Invitrogen)纯化总RNA之后，用MultiScribe逆转录酶(Applied Biosystems)和寡d(T)引物对RNA进行逆转录。使用
Figure BDA0002539456870000422
Green Master Mix(Applied Biosystems)在ABI
Figure BDA0002539456870000423
7300HT序列检测系统仪器上进行实时PCR分析。目的转录物以18S转录物术平归一化。每次测量一式三份地进行。确定阈值循环(即扩增靶标的量达到固定阈值的级分循环数)并使用2-ΔCt公式测量表达。
Western印迹。为了推断用外排体处理之后24小时之后细胞的蛋白质表达，将细胞收集在RIPA缓冲液中并使用Bradford定量将蛋白质裂解物归一化。将40μg裂解物上样至丙烯酰胺凝胶上用于在变性条件下进行蛋白质的电泳分离并通过湿电泳转移转移至PVDF膜(ImmobilonP)上。然后将膜在室温下用PBS/0.05％Tween-20中的5％脱脂奶粉封闭1小时，并在4℃下与适当的一抗孵育过夜。二抗在室温下孵育1小时。抗体孵育之后，在定轨震动器上用1×PBS 0.05％
Figure BDA0002539456870000424
-20以15分钟的间隔进行三次洗涤。根据制造商的指示，使用来自Pierce的化学发光试剂显影膜并将化学发光捕获在膜上。
CRISPR-Cas9-sgRab27a-2细胞的转染和验证。通过用lipofectamine处理用CRISPR-Cas9载体对照或CRISPR-Cas9-sgRab27a-2转染HEK293T细胞72小时。细胞然后用1μg/ml嘌呤霉素选择10天，以获得稳定的HEK293T CRISPR-Cas9载体对照和CRISPR-Cas9-sgRab27a-2细胞。然后将稳定细胞用包含1pg/ml嘌呤霉素的选择培养基培养。如上所述从稳定细胞系中提取DNA和RNA，并使用qPCR和RT-qPCR确定Cas9水平。
外排体收集和验证。从未转染的HEK293T细胞以及稳定的HEK293T CRISPR-Cas9载体对照和CRISPR-Cas9-sgRab27a-2细胞收集外排体，如上所述。外排体的品质通过Nanosight验证。
CRISPR-Cas9基因组编辑。为了确保存在并确定合适载体的量，提取外排体DNA和RNA，并进行qPCR和RT-qPCR来检测外排体中Cas9载体对照水平，以及针对Rab27a-2的sgRNA的水平。此外，使用抗-Flag抗体或Cas9抗体，分别用黏着斑蛋白(Vinculin)或CD9作为对照，通过Western印迹评估细胞和外排体二者中的Cas9蛋白质水平。T7/SURVEYOR测定用于确定DNA编辑是否已在细胞和外排体二者中发生。
用外排体处理BxPC-3腺癌细胞。如上所述每24小时将从HEK293T空白细胞、HEK293T CRISPR-Cas9载体对照和CRISPR-Cas9-sgRab27a-2稳定细胞中收集的3×1010个外排体处理入BxPC-3腺癌细胞中，一次或两次。从接受体细胞提取DNA和RNA，并使用qPCR和RT-qPCR从DNA和RNA二者检测Cas9水平或sgRNA水平。然后T7/SURVEYOR测定用于确定接受体BxPC-3细胞中的编辑。
用分离自BJ细胞的CRISPR-Cas9外排体处理BJ细胞。如上从BJ细胞收集外排体。Nanosight用于验证外排体。通过Western印迹检测外排体标志物CD9、CD81、筏蛋白和TSG101以进一步确认外排体。1×1010个分离并验证的BJ细胞外排体用15μgCRISPR-Cas9-GFP质粒进行电穿孔，并随后用或不用DNase进行处理。DNase处理之后，提取外排体DNA并通过qPCR评价Cas9水平。通过绝对qPCR用CRISPR-Cas9-GFP质粒作为标准进一步计算拷贝数。然后如上所述将具有DNase的电穿孔的外排体转染到BJ细胞中持续24小时。然后使用qPCR或RT-qPCR从DNA和mRNA二者检测Cas9水平。
用HEK293T/CRISPR-Cas9培养基转导BxPC-3细胞。使用包装的质粒连同CRISPR-Cas9 Rab27b-1/2或空对照质粒，通过如上lipofectamine2000转染HEK293T细胞。收获包含慢病毒的培养基并随后将其转导至BxPC-3细胞中。转导的细胞进一步用0.4μg/mL嘌呤霉素进行选择，并挑选BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b细胞的单克隆，克隆扩增，并通过Western印迹和T7/SURVEYOR测定二者进行验证。然后在所有单克隆中评价Rab27b和Rab27a蛋白质水平。T7/SURVEYOR测定还用于验证所有克隆中均已发生了基因编辑。用包含0.4μg/ml嘌呤霉素的选择培养基培养BxPC-3/CRISPR-Cas9载体对照稳定细胞和单克隆BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2C6。从上述细胞收集为分泌外排体的外排体，然后进行Nanosight验证。提取外排体DNA和RNA，并进行qPCR以检测外排体中的Cas9水平，以及进行RT-qPCR以检测针对Rab27b-1/2的sgRNA。Cas9和Rab27b蛋白质水平在细胞和外排体二者中通过Western印迹评估，并使用T7/SURVEYOR测定来确定DNA编辑是否已在细胞和外排体二者中发生。
评价来自外排体的蛋白质浓度。如上所述培养BxPC-3/CRISPR-Cas9载体对照稳定细胞和单克隆BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1克隆3(C3)、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2克隆6(C6)，并收集外排体。裂解从BxPC-3/CRISPR-Cas9载体对照稳定细胞和单克隆BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1C3、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2C6收集的外排体，并通过BCA试剂盒根据制造商的说明评估蛋白质含量。
细胞增殖测定。为了确保细胞增殖不受CRISPR-Cas9的存在或基因编辑的影响，评价了对照和CRISPR-Cas9处理的细胞。将100pL未经处理的BxPC-3细胞、具有CRISPR-Cas9空载体对照的BxPC-3、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1C3和BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2C6细胞以1×105个细胞/mL的浓度接种在96孔板中。使用MTT测定在不同时间点评价细胞增殖。
sgRab27b的体外转录。为了生成体外转录的sgRab27b，sgRab27b-1/2首先通过PCR扩增，并随后使用
Figure BDA0002539456870000441
PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。使用MEGAshortscriptTM试剂盒(Thermo Fisher
Figure BDA0002539456870000442
目录号1354)，根据制造商的说明体外转录sgRab27-1/2的经纯化PCR产物。使用8M尿素聚丙烯酰胺凝胶通过电泳进一步评价RNA品质。为了生成体外转录的Cas9，Cas9通过PCR扩增，其中使用
Figure BDA0002539456870000443
PCR纯化试剂盒进一步纯化PCR产物。纯化的Cas9 PCR产物使用mMESSAGE m
Figure BDA0002539456870000444
T7Ultra试剂盒进行体外转录。甲醛凝胶用于检测Cas9 RNA品质。
用体外转录的RNA处理细胞。为了评价转染和CRISPR-Cas9效率，使用lipofectamine 2000、Exo-Fect/外排体转染试剂或电穿孔外排体将HEK293T/CRISPR-Cas9载体对照细胞用1μgIVT-sgRab27b RNA转染72小时。转染之后，提取DNA，并进行T7/SURVEYOR测定以确定是否已发生基因编辑。使用lipofectamine 2000、Exo-Fect/外排体转染试剂用Cas9mRNA转染HEK293T细胞和BxPC-3细胞，或用用Cas9 mRNA电穿孔的1×109个MSC外排体处理48小时。进行Western印迹以检测Cas9蛋白质水平。
Exo-Fect/外排体处理的评价。使用Exo-Fect/外排体转染试剂每24小时用10pg质粒(CRISPR-Cas9-lenti-V2载体对照、CRISPR-Cas9-lenti-V2-sgRab27b-1、CRISPR-Cas9-GFP载体对照)处理Hekt293T细胞4次(第1、2、3、4天)。在第5天对CRISPR-Cas9-GFP细胞成像以检测GFP表达。还在第5天收集细胞用于核酸和蛋白质分离。提取DNA、RNA和蛋白质。通过qPCR确定用每个质粒转染的细胞的相对Cas9表达水平和1/Ct值，并使用Western印迹以检测Cas9蛋白质水平。进行T7/SURVEYOR测定以确定在用CRISPR-Cas9-lenti-V2-sgRab27b-1质粒处理之后HEK293T细胞中基因编辑的发生。用BxPC-3细胞重复相同的实验。
KPC689细胞的sgmKras编辑。KPC689细胞用5μg对照质粒或用CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D-lenti-V2质粒通过lipofectamine 2000转染48小时。转染之后，对CRISPR-Cas9-GFP载体对照细胞进行成像以确定转染效率。如上从所有培养物中提取DNA、RNA和蛋白质。通过qPCR确定相对Cas9和mKrasG12D表达水平，并如上进行T7/SURVEYOR测定以检查在通过lipofectamine转染之后KPC689细胞中是否已经发生基因编辑。使用Exo-Fect/外排体转染试剂每24小时用10pg具有GFP骨架的CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D质粒，或其载体对照处理新鲜的KPC689细胞持续3天。对细胞进行GFP表达成像以确定转染效率，并在第4天收集。提取DNA、RNA和蛋白质，并通过qPCR确定相对Cas9和mKRasG12D表达水平。进行T7/SURVEYOR测定以确认在用CRISPR-Cas9-GFP-mKrasG12D质粒处理之后KPC689细胞中的基因编辑。
多西环素诱导型CRISPR-Cas9质粒的转染和验证。HEK293T细胞用慢病毒包装质粒连同CRISPR-Cas9多西环素诱导型质粒的混合物通过lipofectamine 2000进行转染。收获包含慢病毒的培养基并随后转导至Panc1细胞中。转导的细胞用1μg/ml嘌呤霉素进一步选择。通过与1pg/ml多西环素一起培养，维持具有诱导型Cas9的稳定Panc1细胞。从用或不用多西环素处理的Panc1诱导型细胞中收集外排体。Western印迹用于检查细胞和外排体二者中的Cas9蛋白质水平。Panc1诱导型细胞用2pg针对hKrasG12D的IVT-sgRNA、1pg hKrasG12D质粒通过lipofectamine、Fugene或Exo-Fect处理72小时。然后进行T7/SURVEYOR测定以确认Panc1诱导型细胞中的基因编辑。
用CRISPR-Cas9-sghKRasG12D处理Panc1细胞系。使再基于慢病毒的方法建立Panc1-Cas9和Panc1 sghKrasG12D T1稳定细胞系。通过Western印迹确认Panc1-Cas9细胞中Cas9蛋白质的表达。未转染的Panc1细胞使用lipofectamine、Exo-Fect或电穿孔外排体，用在lenti-V2、GFP或嘌呤霉素骨架中的CRISPR-Cas9-sghKrasG12D处理。使用lipofectamine、Exo-Fect或电穿孔外排体用sghKrasG12D质粒处理Panc1-Cas9稳定细胞，并且PanclsghKrasG12D T1稳定细胞用10pg或20pg具有GFP或嘌呤霉素骨架的Cas9质粒转染24小时。进行T7/SURVEYOR测定以确认基因编辑已发生。
体内植入的KPC689肿瘤的处理。将KPC689细胞皮下植入到每只小鼠的背中。将小鼠分为4组，其中每组1或2只小鼠。第1组用1×109个外排体和10μLExo-Fect处理。第2组用10pg Cas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1质粒处理。第3组用1×109个外排体、10pg Cas9-GFP-载体对照质粒和10pL Exo-Fect处理。第4组用1×109个外排体、10pg Cas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1质粒和10pL Exo-Fect处理。每组中的小鼠每天静脉内(intravenously，I.V.)和瘤内(intratumorally，I.T.)注射，持续两周。测量肿瘤长度(a，mm)和宽度(b，mm)以及体重并计算肿瘤体积。
实施例2-CRISPR-Cas9外排体的建立
从用CRISPR-Cas9载体对照和CRISPR-Cas9-sgRab27a-2转染的HEK293T提取DNA和RNA，并使用定量实时PCR(qPCR)确定Cas9水平(图1a)。相对于β-肌动蛋白对照，这两种载体均被有效转染，并且转染的细胞显示出明显更大的Cas9表达。从HEK293T空白细胞以及稳定的HEK293TCRISPR-Cas9载体对照和CRISPR-Cas9-sgRab27a-2细胞中收集外排体。外排体的Nanosight验证可在图1b中看到。提取外排体DNA和RNA，并进行qPCR以检测外排体中的Cas9水平以及针对Rab27a-2的sgRNA。与细胞类似，载体对照和具有指导RNA的载体二者均在外排体中表达(图1c)。为了确认Cas9表达，使用抗-Flag抗体或Cas9抗体，分别用黏着斑蛋白或CD9作为对照，通过Western印迹在细胞和外排体二者中评估Cas9蛋白质水平(图1d)。T7/SURVEYOR测定用于确认细胞和外排体二者中的DNA编辑，并且其在图1e和1f的框内区域中可见。针对Cas9 DNA的存在和Cas9表达对外排体处理的BxPC-3细胞进行评价(图1g和1h)。如图1g中可看到的，处理两次的细胞的Cas9 DNA提高。针对指导RNA的存在对外排体处理的BxPC-3细胞进行测试以确认其存在(图2a和2c)，并且尽管DNA是明显的，但是没有RNA表达。这通过在T7/SURVEYOR测定中缺少活性来确认(图2b)。
从BJ细胞收集外排体，并通过nanosight分析确认，如图3a中所示。外排体标志物CD9、CD81、筏蛋白和TSG101通过Western印迹检测以进一步确认外排体(图3b)。BJ外排体用15ug CRISPR-Cas9-GFP质粒进行电穿孔，并随后用或不用DNase处理。在未用DNase处理的样品中强烈检测到Cas9 DNA，并且在用DNase处理的样品中(包含外排体和质粒二者)检测到比单独的质粒更有效的Cas9 DNA(图3c)。使用自1/Ct值产生的标准曲线确定质粒拷贝数(图3c)。将具有DNase的电穿孔外排体处理到BJ细胞中持续24小时，并且当与空白外排体比较时，DNA和mRNA二者中的Cas9水平均提高(图3d)。
已经用含有CRISPR-CAS9 Rab27b-1/2质粒的慢病毒培养基转导的克隆扩增的BxPC-3细胞通过Western印迹(图4a)和T7/SURVEYOR测定(图4b)二者进行验证。发现两个克隆是有活性的，并且在图4b中用方框示出。BxPC-3/CRIPSR-Cas9-sgRab27b-1克隆3(C3)和BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2克隆6(C6)用于另一些实验。BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1C3和BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2C6用包含0.4μg/ml嘌呤霉素的选择培养基培养，并提取DNA和RNA。Cas9 DNA的存在通过qPCR确认，而Cas9表达通过RT-qPCR确认，并且发现其显著大于载体对照细胞中的表达(图5a)。从这些细胞收集外排体并通过nanosight分析确认(图5b)。提取外排体DNA和RNA，并进行qPCR以检测外排体中的Cas9水平，并且发现BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2C6具有比BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2C3明显更大的Cas9表达(图5c)。这通过检测针对Rab27b-1/2的sgRNA确认(图5c，底部)。通过Western印迹分别以β-肌动蛋白或CD9作为对照，在细胞和外排体中二者评估了Cas9和Rab27b蛋白质水平，并且发现Rab27b在携带指导RNA的细胞和外排体中被敲减(图5d)。使用两种不同的引物组，T7/SURVEYOR测定用于确认细胞和外排体二者中的DNA编辑(图5e和5f)，并且在方框区域中作为暗条带可见。
BxPC-3/CRISPR-Cas9载体对照稳定细胞和克隆扩增的BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1C3和BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2C6细胞的外排体蛋白含量通过BCA评价(图6a)。通过MTT测定评估细胞增殖，并且CRISPR-Cas9的存在对增殖没有负面影响(图6b)。
用IVTRNA转染。sgRab27b-1/2通过PCR扩增并纯化(图7a)。然后sgRab27-1/2的纯化的PCR产物如上所述进行体外转录，并在变性凝胶上运行以解析其品质(图7a，右)。Cas9通过PCR扩增并纯化(图7b)。将纯化的Cas9 PCR产物进行体外转录并通过在甲醛凝胶上进行电泳来检测(图7b)。使用lipofectamine 2000(图7c)、Exo-Fect/外排体转染试剂(图7d)或电穿孔外排体(图7e)用1pg IVT-sgRab27b RNA处理HEK293T/CRISPR-Cas9载体对照细胞72小时。在用RNA和lipofectamine或外排体转染试剂处理的细胞中确认了基因编辑(图7c和7d)，但未用外排体处理。HEK293T细胞和BxPC-3细胞二者使用lipofectamine 2000、Exo-Fect/外排体转染试剂用Cas9 mRNA进行转染，或用用Cas9 mRNA电穿孔的MSC外排体处理48小时，并再次仅用lipofectamine或外排体转染试剂进行转染产生在Western印迹中表达Cas9的细胞(图7f和7g)。具有Cas9载体的HEK293T细胞和BxPC-3细胞二者的Cas9对照在图8a至8c中示出。
HEK293T和BxPC-3转染和基因编辑。使用Exo-Fect/外排体转染试剂每24小时用10μg质粒(CRISPR-Cas9-lenti-V2载体对照、CRISPR-Cas9-lenti-V2-sgRab27b-1、CRISPR-Cas9-GFP载体对照)处理HEK293T细胞4次(第1、2、3、4天)，并观察Cas9-GFP转染细胞的转染效率(图9a)。通过qPCR确定相对Cas9表达水平和1/Ct值(图9b)，并且通过Western印迹确认Cas9的存在(图9C)。用T7/SURVEYOR测定确认了基因编辑(图9d)。在BxPC-3细胞中进行了相同的实验，尽管在T7/SURVEYOR测定中没有基因编辑可被检测到(图9e至9g)。
KPC689转染和基因编辑。KPC689细胞用5pg质粒(具有lenti-V2、GFP、嘌呤霉素骨架的CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D和载体对照)通过lipofectamine 2000转染48小时，并通过对GFP骨架中的细胞进行成像确认转染(图10a)。通过qPCR确定相对Cas9水平(图10b)和mKrasG12D水平(图10c)，并且进行T7/SURVEYOR测定以检查KPC689细胞中的基因编辑，尽管其不存在(图10d)。与先前类似，使用Exo-Fect/外排体转染试剂用10pg质粒(具有GFP骨架的CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D及其载体对照)处理KPC689细胞，并对GFP转染的细胞进行成像以确认Exo-Fect/外排体转染试剂的转染效率(图10e)。通过qPCR确定相对Cas9表达水平(图10f)和mKrasG12D水平(图10g)。进行T7/SURVEYOR测定以检查在用CRISPR-Cas9-GFP-mKrasG12D质粒处理之后KPC689细胞中的基因编辑，尽管不存在编辑(图10h)。
在包含外排体的细胞中用诱导型质粒处理。HEK293T细胞使用包装质粒连同CRISPR-Cas9多西环素诱导型质粒通过lipofectamine 2000进行转染。收获包含慢病毒的培养基并随后转导至Pancl细胞中。转导细胞用嘌呤霉素选择并用多西环素维持。从用或不用多西环素处理的Panc1诱导型细胞收集外排体，并使用Western印迹以确认细胞和外排体中的Cas9蛋白质水平(图11a和11b)。Panc1诱导型细胞用2μg针对hKrasG12D的IVT-sgRNA、1pg hKrasG12D质粒通过lipofectamine、Fugene或Exo-Fect处理72小时，并进行T7/SURVEYOR测定以检查Panc1诱导型细胞中的基因编辑，其中仅在以lipofectamine转染的具有指导RNA质粒的细胞中检测到编辑(图11c)。通过Western印迹在Pacn1 Cas9稳定细胞中测定Cas9蛋白质水平(图11d)。使用lipofectamine、Exo-Fect或电穿孔外排体用具有lenti-V2、GFP、嘌呤霉素骨架的CRISPR-Cas9-sghKrasG12D处理Panc1细胞，同时如所示出的使用lipofectamine、Exo-Fect或电穿孔外排体用sghKrasG12D质粒处理Panc1 Cas9稳定细胞，并进行T7/SURVEYOR测定以检查Panc1细胞和Panc1 Cas9稳定细胞中的基因编辑(图11e)。如方框区域所示，在用嘌呤霉素骨架中的Cas9转化的Panc1细胞中，以及使用Lipofectamine或Exo-Fect的用指导RNA转染的Panc1-Cas9稳定细胞系中均发现了基因编辑(图11e)。使用基于慢病毒的方法建立Panc1 sghKrasG12DT1稳定细胞。Panc1sghKrasG12DT1稳定细胞用10pg或20pg具有GFP或嘌呤霉素骨架的Cas9质粒转染24小时，并进行T7/SURVEYOR测定，并在Panc1 sghKrasG12DT1稳定细胞中发现了基因编辑(图11f)。
用外排体和CRISPR-Cas9处理诱导的肿瘤。将KPC689细胞皮下植入到小鼠的背中。将小鼠分为四组，并如下所示进行处理(图12a和12b)。每组中的小鼠每天进行静脉内(I.V.)和瘤内(I.T.)注射持续两周，并评估肿瘤体积(图12a)。用外排体和转染剂的处理没有减慢肿瘤生长，然而用外排体、具有指导RNA质粒的Cas9和转染剂的处理在治疗期期间及以后阻止了肿瘤生长(图12a)。还评估了小鼠的体重，并且所有组中的处理均未对体重产生负面影响(图12b)。
***
根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有方法无需过度实验就可进行和实施。尽管已经以一些优选实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说将明显的是可将改变应用于本文中所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，将明显的是，可用化学和生理学二者相关的某些试剂替代本文中描述的试剂，同时将获得相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有此类类似的替代和改变被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
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Claims (93)

1.包含外排体的组合物，其中所述外排体在其表面上包含CD47，并且其中所述外排体包含CRISPR系统。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述CRISPR系统包含内切核酸酶和指导RNA(gRNA)。
3.权利要求2所述的组合物，其中所述内切核酸酶是Cas内切核酸酶。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述内切核酸酶是Cas9内切核酸酶。
5.权利要求2所述的组合物，其中所述内切核酸酶是Cpf1内切核酸酶。
6.权利要求2所述的组合物，其中所述指导RNA是单gRNA。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述单gRNA是CRISPR-RNA(crRNA)。
8.权利要求6所述的组合物，其中所述单gRNA包含crRNA和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的融合体。
9.权利要求2所述的组合物，其中所述指导RNA包含crRNA和tracrRNA。
10.权利要求2所述的组合物，其中所述内切核酸酶和所述gRNA在所述外排体内的单个核酸分子上编码。
11.权利要求1所述的组合物，其中所述CRISPR系统靶向致病突变。
12.权利要求11所述的组合物，其中所述致病突变是致癌突变。
13.权利要求12所述的组合物，其中所述致癌突变是癌基因中的激活突变。
14.权利要求12所述的组合物，其中所述致癌突变是肿瘤抑制基因中的抑制性突变。
15.权利要求12所述的组合物，其中所述致癌突变是KrasG12D。
16.权利要求2所述的组合物，其中所述外排体的至少50％包含内切核酸酶和gRNA。
17.权利要求16所述的组合物，其中所述外排体的至少60％包含内切核酸酶和gRNA。
18.权利要求17所述的组合物，其中所述外排体的至少70％包含内切核酸酶和gRNA。
19.权利要求18所述的组合物，其中所述外排体的至少80％包含内切核酸酶和gRNA。
20.权利要求19所述的组合物，其中所述外排体的至少90％包含内切核酸酶和gRNA。
21.药物组合物，其包含权利要求1至20中任一项所述的外排体和赋形剂。
22.权利要求21所述的组合物，其中所述组合物被配制用于肠胃外施用。
23.权利要求22所述的组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内注射。
24.权利要求22所述的组合物，其还包含抗菌剂。
25.权利要求24所述的组合物，其中所述抗菌剂是苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、布罗波尔、西曲溴铵、十六烷基氯化吡啶
Figure FDA0002539456860000021
氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪唑烷脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇或硫柳汞。
26.在有此需要的患者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用权利要求21至25中任一项所述的组合物，从而在所述患者中治疗所述疾病。
27.权利要求26所述的方法，其中施用引起所述患者的患病细胞中的基因编辑。
28.权利要求26所述的方法，其中所述疾病是癌症。
29.权利要求28所述的方法，其中所述癌症是胰腺导管腺癌。
30.权利要求26所述的方法，其中所述施用是全身性施用。
31.权利要求30所述的方法，其中所述全身性施用是静脉内施用。
32.权利要求26所述的方法，其还包括向所述患者施用至少第二治疗。
33.权利要求32所述的方法，其中所述第二治疗包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗或免疫治疗。
34.权利要求26所述的方法，其中所述患者是人。
35.权利要求34所述的方法，其中所述外排体对于所述患者是自体的。
36.包含外排体的组合物，其用于在患者中治疗疾病，其中所述外排体在其表面上包含CD47，并且其中所述外排体包含CRISPR系统。
37.权利要求36所述的组合物，其中所述CRISPR系统包含内切核酸酶和指导RNA(gRNA)。
38.权利要求37所述的组合物，其中所述内切核酸酶是Cas内切核酸酶。
39.权利要求38所述的组合物，其中所述内切核酸酶是Cas9内切核酸酶。
40.权利要求37所述的组合物，其中所述内切核酸酶是Cpf1内切核酸酶。
41.权利要求37所述的组合物，其中所述指导RNA是单gRNA。
42.权利要求41所述的组合物，其中所述单gRNA是CRISPR-RNA(crRNA)。
43.权利要求41所述的组合物，其中所述单gRNA包含crRNA和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的融合体。
44.权利要求37所述的组合物，其中所述指导RNA包含crRNA和tracrRNA。
45.权利要求36所述的组合物，其中所述内切核酸酶和所述gRNA在所述外排体内的单个核酸分子上编码。
46.权利要求36所述的组合物，其中所述CRISPR系统靶向致病突变。
47.权利要求46所述的组合物，其中所述致病突变是致癌突变。
48.权利要求47所述的组合物，其中所述致癌突变是癌基因中的激活突变。
49.权利要求47所述的组合物，其中所述致癌突变是肿瘤抑制基因中的抑制性突变。
50.权利要求47所述的组合物，其中所述致癌突变是KrasG12D。
51.权利要求37所述的组合物，其中所述外排体的至少50％包含内切核酸酶和gRNA。
52.权利要求51所述的组合物，其中所述外排体的至少60％包含内切核酸酶和gRNA。
53.权利要求52所述的组合物，其中所述外排体的至少70％包含内切核酸酶和gRNA。
54.权利要求53所述的组合物，其中所述外排体的至少80％包含内切核酸酶和gRNA。
55.权利要求54所述的组合物，其中所述外排体的至少90％包含内切核酸酶和gRNA。
56.权利要求36所述的组合物，其中施用引起所述患者的患病细胞中的基因编辑。
57.权利要求36所述的组合物，其中所述疾病是癌症。
58.权利要求57所述的组合物，其中所述癌症是胰腺导管腺癌。
59.权利要求36所述的组合物，其中所述组合物被配制用于肠胃外施用。
60.权利要求59所述的组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内注射。
61.权利要求59所述的组合物，其还包含抗菌剂。
62.权利要求61所述的组合物，其中所述抗菌剂是苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、布罗波尔、西曲溴铵、十六烷基氯化吡啶
Figure FDA0002539456860000041
氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪唑烷脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇或硫柳汞。
63.权利要求36所述的组合物，其还包含至少第二治疗。
64.权利要求63所述的组合物，其中所述第二治疗包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗或免疫治疗。
65.权利要求36所述的组合物，其中所述患者是人。
66.权利要求65所述的组合物，其中所述外排体对于所述患者是自体的。
67.外排体在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述外排体在其表面上包含CD47，并且其中所述外排体包含CRISPR系统。
68.权利要求67所述的用途，其中所述CRISPR系统包含内切核酸酶和指导RNA(gRNA)。
69.权利要求68所述的用途，其中所述内切核酸酶是Cas内切核酸酶。
70.权利要求69所述的用途，其中所述内切核酸酶是Cas9内切核酸酶。
71.权利要求68所述的用途，其中所述内切核酸酶是Cpf1内切核酸酶。
72.权利要求68所述的用途，其中所述指导RNA是单gRNA。
73.权利要求72所述的用途，其中所述单gRNA是CRISPR-RNA(crRNA)。
74.权利要求72所述的用途，其中所述单gRNA包含crRNA和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的融合体。
75.权利要求68所述的用途，其中所述指导RNA包含crRNA和tracrRNA。
76.权利要求68所述的用途，其中所述内切核酸酶和所述gRNA在所述外排体内的单个核酸分子上编码。
77.权利要求67所述的用途，其中所述CRISPR系统靶向致病突变。
78.权利要求77所述的用途，其中所述致病突变是致癌突变。
79.权利要求78所述的用途，其中所述致癌突变是癌基因中的激活突变。
80.权利要求78所述的用途，其中所述致癌突变是肿瘤抑制基因中的抑制性突变。
81.权利要求78所述的用途，其中所述致癌突变是KrasG12D。
82.权利要求68所述的用途，其中所述外排体的至少50％包含内切核酸酶和gRNA。
83.权利要求82所述的用途，其中所述外排体的至少60％包含内切核酸酶和gRNA。
84.权利要求83所述的用途，其中所述外排体的至少70％包含内切核酸酶和gRNA。
85.权利要求84所述的用途，其中所述外排体的至少80％包含内切核酸酶和gRNA。
86.权利要求85所述的用途，其中所述外排体的至少90％包含内切核酸酶和gRNA。
87.权利要求67所述的用途，其中所述疾病是癌症。
88.权利要求87所述的用途，其中所述癌症是胰腺导管腺癌。
89.权利要求67所述的用途，其中所述药物被配制用于肠胃外施用。
90.权利要求67所述的用途，其中所述药物被配制用于全身性施用。
91.权利要求89所述的用途，其中所述药物配制用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内注射。
92.权利要求67所述的用途，其中所述药物包含抗菌剂。
93.权利要求92所述的用途，其中所述抗菌剂是苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、布罗波尔、西曲溴铵、十六烷基氯化吡啶
Figure FDA0002539456860000061
氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪唑烷脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇或硫柳汞。
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