KR20200098639A - 엑소좀 관련 유전자 편집을 이용한 암 치료 방법 및 조성물 - Google Patents

엑소좀 관련 유전자 편집을 이용한 암 치료 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20200098639A
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발레리 레블루
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Abstract

표면에 CD47을 포함하고 CRISPR 시스템을 추가로 포함하는 엑소좀을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 추가로, 유전자 편집 및 유전자 편집에 의한 암 치료를 위해 엑소좀을 사용하는 방법도 제공된다.

Description

엑소좀 관련 유전자 편집을 이용한 암 치료 방법 및 조성물
관련 출원의 인용
[0001] 본 출원은 2017년 12월 15일자로 출원된 미국 가특허출원 62/599,340호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
[0002] 본 발명은 일반적으로 의학 및 종양학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유전자 편집을 위한 뉴클레아제 복합체의 생체내 전달용 엑소좀의 용도에 관한 것이다.
[0003] 유전자 편집은 살아있는 세포 내에서 표적 유전자를 변형시킬 수 있는 기술이다. 최근에, 주문형 유전자 편집을 수행하는데 CRISPR의 박테리아 면역 시스템을 활용하는 것은 과학자들이 유전체 편집에 접근하는 방식에 혁명을 몰고왔다. RNA로 가이드된 DNA 엔도뉴클레아제인 CRISPR 시스템의 Cas9 단백질은 그의 가이드 RNA 서열을 변경시킴으로써 비교적 수월하게 새로운 부위를 표적화하도록 유전자 조작될 수 있다. 이러한 발견을 통해서, 서열 특이적 유전자 편집의 기능을 효과적으로 이용할 수 있게 되었다. 현재의 CRISPR/Cas9 기술은 시험관내 배양된 세포에서 유전자를 편집하는 신뢰성 있는 방법을 제공하지만, 생체 내에서 서로 다른 장기들의 특정한 세포들을 표적으로 하는 새로운 방법이 필요한 실정이다.
[0004] 이러한 이유로, CRISPR-Cas9를 서로 다른 장기 및 종양으로 매우 효율적으로 운반하도록 유전자 조작된 엑소좀을 제공함으로써, 치료 유전자 편집을 가능하도록 하여 암 및 기타 유전적 질환들을 통제하고자 한다. 한 실시양태에서, 엑소좀을 포함하는 조성물이 제공되는데, 이때 상기 엑소좀은 그 표면에 CD47을 포함하고, 상기 엑소좀은 CRISPR 시스템을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제이다. 다른 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cpf1 엔도뉴클레아제이다. 일부 양태에서, 상기 가이드 RNA는 단일 gRNA이다. 일부 양태에서, 상기 단일 gRNA는 CRISPR-RNA (crRNA)이다. 일부 양태에서, 상기 단일 gRNA는 crRNA 및 전사 활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)의 융합물을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 엑소좀 내의 하나의 핵산 분자 상에 암호화된다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 엑소좀 내의 별도의 핵산 분자들 상에 암호화된다.
[0005] 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 질병 유발 돌연변이를 표적으로 삼는다. 일부 양태에서, 상기 질환 유발 돌연변이는 암 유발 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 종양유전자 내의 활성화 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 종양 억제 유전자 내의 억제성 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 기존의 약물로 표적삼기 어려운 유전자를 표적으로 삼는다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 KrasG12D이다. 일부 양태에서, 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% (또는 상기 수치에서 유도가능한 임의의 수치)의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함한다.
[0006] 한 실시양태에서, 엑소좀 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물이 제공되는데, 이때 상기 엑소좀은 그 표면에 CD47을 포함하고, 상기 엑소좀은 CRISPR 시스템을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제이다. 다른 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cpf1 엔도뉴클레아제이다. 일부 양태에서, 상기 가이드 RNA는 단일 gRNA이다. 일부 양태에서, 상기 단일 gRNA는 CRISPR-RNA (crRNA)이다. 일부 양태에서, 상기 단일 gRNA는 crRNA 및 전사 활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)의 융합물을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 엑소좀 내의 하나의 핵산 분자 상에 암호화된다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 엑소좀 내의 별도의 핵산 분자들 상에 암호화된다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 질병 유발 돌연변이를 표적으로 삼는다. 일부 양태에서, 상기 질환 유발 돌연변이는 암 유발 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 종양유전자 내의 활성화 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 종양 억제 유전자 내의 억제성 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 기존의 약물로 표적삼기 어려운 유전자를 표적으로 삼는다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 KrasG12D이다. 일부 양태에서, 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% (또는 상기 수치에서 유도가능한 임의의 수치)의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사용으로 제형화된다. 추가의 양태에서, 상기 조성물은 항균제를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 항균제로는, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질알코올, 브로노폴, 세트리미드, 염화세틸피리디늄, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로록실레놀, 크레졸, 에틸알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸알코올, 페닐질산수은, 프로필렌 글리콜, 또는 티메로살을 들 수 있다.
[0007] 한 실시양태에서, 질환의 치료를 필요로 하는 환자에 있어서 해당 질환을 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 환자에게 엑소좀 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계 (이때, 상기 엑소좀은 그 표면에 CD47을 포함하고; 상기 엑소좀은 CRISPR 시스템을 포함함)를 포함함으로써 상기 환자의 질환을 치료한다. 일부 양태에서, 투여는 환자의 질환이 생긴 세포에서 유전자 편집을 유도한다. 일부 양태에서, 상기 질환은 암이다. 일부 양태에서, 상기 암은 췌장관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma)이다. 일부 양태에서, 상기 투여는 전신 투여이다. 일부 양태에서, 상기 전신 투여는 정맥내 또는 동맥내 투여이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 적어도 제2 요법을 실시하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제2 요법은 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 저온요법, 호르몬 요법 또는 면역요법을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 환자는 인간이다. 일부 양태에서, 상기 엑소좀은 상기 환자에 대해 자가 유래성이다. 일부 양태에서, 상기 약제학적 조성물의 투여는 엑소좀 무함유 CRISPR 시스템의 투여에 비해 월등한 치료적 이점을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 환자에게 단 한번만 투여된다. 일부 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 환자에게 1회 이상 투여된다. 일부 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 환자에게 한정된 횟수로 투여된다. 일부 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 환자에게 연속적으로 투여된다. 일부 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 환자에게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 21, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50회 (또는 상기 횟수에서 유도가능한 임의의 횟수) 투여된다.
[0008] 한 실시양태에서, 환자의 질병을 치료하는데 사용하기 위한 엑소좀을 포함하는 조성물이 제공되는데, 이때 상기 엑소좀은 그 표면에 CD47을 포함하고, 상기 엑소좀은 CRISPR 시스템을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제이다. 다른 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cpf1 엔도뉴클레아제이다. 일부 양태에서, 상기 가이드 RNA는 단일 gRNA이다. 일부 양태에서, 상기 단일 gRNA는 CRISPR-RNA (crRNA)이다. 일부 양태에서, 상기 단일 gRNA는 crRNA 및 전사 활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)의 융합물을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 엑소좀 내의 하나의 핵산 분자 상에 암호화된다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 엑소좀 내의 별도의 핵산 분자들 상에 암호화된다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 질병 유발 돌연변이를 표적으로 삼는다. 일부 양태에서, 상기 질환 유발 돌연변이는 암 유발 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 종양유전자 내의 활성화 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 종양 억제 유전자 내의 억제성 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 기존의 약물로 표적삼기 어려운 유전자를 표적으로 삼는다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 KrasG12D이다. 일부 양태에서, 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% (또는 상기 수치에서 유도가능한 임의의 수치)의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 투여는 환자의 질환이 생긴 세포에서 유전자 편집을 유도한다. 일부 양태에서, 상기 질환은 암이다. 일부 양태에서, 상기 암은 췌장관 선암종이다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사용으로 제형화된다. 추가의 양태에서, 상기 조성물은 항균제를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 항균제로는, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질알코올, 브로노폴, 세트리미드, 염화세틸피리디늄, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로록실레놀, 크레졸, 에틸알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸알코올, 페닐질산수은, 프로필렌 글리콜, 또는 티메로살을 들 수 있다. 추가의 양태에서, 상기 조성물은 적어도 제2 요법제를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제2 요법은 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 저온요법, 호르몬 요법 또는 면역요법을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 환자는 인간이다. 일부 양태에서, 상기 엑소좀은 상기 환자에 대해 자가 유래성이다.
[0009] 한 실시양태에서, 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 엑소좀의 용도가 제공되는데, 이때 상기 엑소좀은 그 표면에 CD47을 포함하고, 상기 엑소좀은 CRISPR 시스템을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제이다. 다른 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cpf1 엔도뉴클레아제이다. 일부 양태에서, 상기 가이드 RNA는 단일 gRNA이다. 일부 양태에서, 상기 단일 gRNA는 CRISPR-RNA (crRNA)이다. 일부 양태에서, 상기 단일 gRNA는 crRNA 및 전사 활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)의 융합물을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 엑소좀 내의 하나의 핵산 분자 상에 암호화된다. 일부 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 엑소좀 내의 별도의 핵산 분자들 상에 암호화된다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 질병 유발 돌연변이를 표적으로 삼는다. 일부 양태에서, 상기 질환 유발 돌연변이는 암 유발 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 종양유전자 내의 활성화 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 종양 억제 유전자 내의 억제성 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 기존의 약물로 표적삼기 어려운 유전자를 표적으로 삼는다. 일부 양태에서, 상기 암 유발 돌연변이는 KrasG12D이다. 일부 양태에서, 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% (또는 상기 수치에서 유도가능한 임의의 수치)의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 질환은 암이다. 일부 양태에서, 상기 암은 췌장관 선암종이다. 일부 양태에서, 상기 약제는 비경구 투여용으로 제형화된다. 일부 양태에서, 상기 약제는 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사용으로 제형화된다. 일부 양태에서, 상기 약제는 항균제를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 항균제로는, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질알코올, 브로노폴, 세트리미드, 염화세틸피리디늄, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로록실레놀, 크레졸, 에틸알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸알코올, 페닐질산수은, 프로필렌 글리콜, 또는 티메로살을 들 수 있다.
[0010] 특정 성분과 관련하여, 본원에 사용된 "본질적으로 없는"이라는 말은, 해당 특정 성분을 의도적으로 조성물에 제제화시키지 않았고/않았거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하고자 본원에 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 초래된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 특정 성분의 양을 표준 분석 방법으로 전혀 검출할 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
[0011] 본 출원의 명세서에서 사용되는 단수형 명사 ("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수도 있다. 본 출원의 청구항에서 사용되는 단수형 명사 ("a" 또는 "an") 단어는, "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
[0012] 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한, 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서, "또 다른"이라는 말은 두번째 또는 그 이상의 경우를 의미할 수 있다.
[0013] 본 출원 전반에 걸쳐, "약"이라는 용어는 어떠한 수치가, 해당 수치를 측정하는데 사용되는 장치, 방법에 대한 고유의 오차 변동, 또는 해당 연구 대상체들 간에 존재하는 편차를 포함하고 있음을 나타내는데 사용된다. 본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명을 보면 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명으로부터 본 발명의 사상과 범위 내에서 다양한 변경과 변형이 당업계의 통상의 기술자에게 자명하기 때문에, 본 발명의 특정 실시양태를 나타내는 상기 상세한 설명과 구체적인 실시예들은 예시로서만 제공된다는 점을 이해해야 한다.
[0014] 하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 양태들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제공되는 특정 실시양태들에대한 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조하면 보다 잘 이해될 수 있다.
[0015] 도 1a-h: HEK293T 세포를 72시간 동안 리포펙타민을 사용하여 CRISPR-Cas9 벡터 대조군 및 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2로 형질감염시킨 후, 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신으로 10일간 선별하여 안정한 HEK293T CRISPR-Cas9 벡터 대조군 및 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2 세포들을 수득하였다. 상기 안정한 세포들을 1㎍/㎖의 퓨로마이신을 함유하는 선별 배지와 함께 배양하였다. (도 1a) DNA 및 RNA를 상기 언급한 세포들로부터 추출하고, Cas9 수준을 실시간 정량 PCR (qPCR)을 사용하여 측정하였다. (도 1b) HEK293T 블랭크(blank) 세포들 뿐만 아니라 안정한 HEK293T CRISPR-Cas9 벡터 대조군 및 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2 세포들로부터 엑소좀을 수집한 후, Nanosight 유효성 검증을 수행하였다. (도 1c) 엑소좀 DNA 및 RNA를 추출하고, qPCR을 수행하여 엑소좀 내의 Cas9 수준 및 Rab27a-2에 대한 sgRNA를 검출하였다. (도 1d) Cas9 단백질 수준은, 각각 빈쿨린 또는 CD9를 대조군으로 하여, 항-Flag 항체 또는 Cas9 항체를 사용해 웨스턴 블롯에 의하여 세포와 엑소좀 모두에서 평가하였다. (도 1e) 및 (도 1f) T7/SURVEYOR 분석을 사용하여 세포 (도 1e) 및 엑소좀 (도 1f) 모두에 있어서 DNA 편집을 살펴보았다. (도 1g) 및 (도 1h) HEK293T 블랭크 세포, 안정한 HEK293T CRISPR-Cas9 벡터 대조군 및 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2 세포들로부터 수집된 3E10 엑소좀을 매 24시간마다 BxPC-3 내에 수용되도록 처리하였다 (+ 1회 처리, ++ 2회 처리). 상기 수용 대상체 세포로부터 DNA 및 RNA를 추출하였다. Cas9 수준은 DNA (g) 및 mRNA (h) 수준 모두로 검출하였다. 각 시간대별 막대들은, 왼쪽에서 오른쪽으로 순서대로 "블랭크 대조군", "CRISPR-Cas9 벡터 대조군" 및 "CRISPR-Cas9-sgRab27a-2"를 나타낸다.
[0016] 도 2a-c: HEK293T 블랭크 세포, 안정한 HEK293T CRISPR-Cas9 벡터 대조군 및 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2 세포들로부터 수집된 3E10 엑소좀을 매 24시간마다 BxPC-3 내에 수용되도록 2회 처리하였다. 상기 수용 대상체 세포로부터 DNA 및 RNA를 추출하였다. (도 2a) 및 (도 2c) Rab27a-2에 대한 sgRNA는 DNA (도 2a) 및 mRNA (도 2c) 수준으로 PCR로 검출하였다. (도 2b) T7/SURVEYOR 분석을 사용하여 수용 대상체인 BxPC-3 세포에서 DNA 편집을 살펴보았다.
[0017] 도 3a-d: 엑소좀을 BJ 세포로부터 수집하였다. (도 3a) Nanosight를 사용하여 상기 엑소좀에 대한 유효성을 검증하였다. (도 3b) 웨스턴 블롯으로 엑소좀 마커 CD9, CD81, 플로틸린 및 TSG101을 검출하여 엑소좀을 추가로 확인하였다. (도 3c) 1E10 BJ 엑소좀을 15 ㎍의 CRISPR-Cas9-GFP 플라스미드로 전기천공시킨 후, DNase로 처리하거나 혹은 처리하지 않았다. 엑소좀 DNA를 추출하여 qPCR로 Cas9 수준을 평가하였다. 표준품으로서 CRISPR-Cas9-GFP 플라스미드를 사용하는 절대 qPCR에 의해 복제수를 추가로 계산하였다. (도 3d) DNase와 함께 상기 전기천공된 엑소좀을 24시간 동안 BJ 세포 내에 수용되도록 처리하였다. Cas9 수준은 DNA 및 mRNA 수준 모두로 검출하였다.
[0018] 도 4a-b: CRISPR-Cas9 Rab27b-1/2 또는 블랭크 대조군 플라스미드와 함께 패키징 플라스미드를 사용하여 리포펙타민 2000으로 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. 렌티바이러스를 함유하는 배지를 수확한 후 BxPC-3 세포 내로 형질도입하였다. 상기 형질도입된 세포를 0.4 ㎍/㎖의 퓨로마이신으로 추가로 선별하고, BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b 세포의 단일 클론을 골라내어 증식시킨 후, 웨스턴 블롯과 T7/SURVEYOR 분석 모두로 그 유효성을 검증하였다. (도 4a) Rab27b 및 Rab27a 단백질 수준은 로딩 대조군으로서 β-액틴을 사용하여 모든 단일 클론에서 평가하였다. 대표적인 웨스턴 블롯 결과들을 (도 4a)에 나타내었다. (도 4b) T7/SURVEYOR 분석도 사용하여 모든 클론들을 추가로 검증하였다. 대표적인 웨스턴 블롯 결과들을 (도 4b)에 나타내었다. BxPC-3/CRISPR-Cas9-Rab27b-1 클론 3 (C3) 및 BxPC-3/CRISPR-Cas9-Rab27b-2 클론 6 (C6)을 추가의 실험에 사용하였다.
[0019] 도 5a-f: BxPC-3/CRISPR-Cas9 벡터 대조군의 안정한 세포 및 단일 클론 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3, BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6을 0.4 ㎍/㎖의 퓨로마이신 함유 선별 배지로 배양하였다. (도 5a) DNA 및 RNA를 상기 언급한 세포들로부터 추출하고, Cas9 수준을 qPCR을 사용하여 측정하였다. (도 5b) 상기 언급한 세포들로부터 엑소좀을 수집한 후, Nanosight 유효성 검증을 수행하였다. 분비된 엑소좀 개수를 분석하여 Nanosight로 비교하였다. (도 5c) 엑소좀 DNA 및 RNA를 추출하고, qPCR을 수행하여 엑소좀 내의 Cas9 수준 및 Rab27b-1/2에 대한 sgRNA를 검출하였다. (도 5d) Cas9 및 Rab27b 단백질 수준은, 각각 b-액틴 또는 CD9를 대조군으로 하여, 웨스턴 블롯으로 세포와 엑소좀 모두에서 평가하였다. (도 5e) 및 (도 5f) T7/SURVEYOR 분석을 사용하여, 2개의 서로 다른 프라이머 세트를 이용하는 세포 (도 5e) 및 엑소좀 (도 5f) 모두에 있어서의 DNA 편집을 살펴보았다.
[0020] 도 6a-b: (도 6a) BxPC-3/CRISPR-Cas9 벡터 대조군의 안정한 세포 및 단일 클론 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3, BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6으로부터 수집한 엑소좀을 용해시키고 제조업자의 지침서에 따라 BCA 키트로 단백질 함량을 추가로 검출하였다. (도 6b) 100 ㎕의 BxPC-3 블랭크, BxPC-3/CRISPR-Cas9 블랭크 대조군, BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3 및 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6 세포를 96-웰 플레이트에 1E5 세포/㎖의 농도로 분주하였다. 서로 다른 시간대에 MTT 분석을 사용하여 세포 증식을 평가하였다. 각 시간대별 막대들은, 왼쪽에서 오른쪽으로 순서대로 "블랭크 대조군", "CRISPR-Cas9 벡터 대조군", "CRISPR-Cas9-sgRab27b-1-C3" 및 "CRISPR-Cas9-sgRab27b-2-C6"을 나타낸다.
[0021] 도 7a-g: (도 7a) 시험관내 전사된 sgRab27b를 제조하기 위해, 먼저 sgRab27b-1/2를 PCR로 증폭시킨 다음, 상기 PCR 생성물을 Qiagen® PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 sgRab27-1/2의 PCR 생성물을 제조업자의 지침서에 따라 MEGAshortscript™ 키트를 사용하여 시험관내 전사시켰다. 8M 우레아 폴리아크릴아미드 겔에 의해 RNA 품질을 추가로 평가하였다 (도 7b). 시험관내 전사된 Cas9를 만들기 위해, Cas9를 PCR로 증폭시키고, 상기 PCR 생성물을 Qiagen® PCR 정제 키트를 사용하여 추가로 정제하였다. 정제된 Cas9 PCR 생성물을 mMESSAGE mMACHINE® T7 울트라 키트를 사용하여 시험관내 전사시켰다. 포름알데히드 겔을 사용하여 Cas9 RNA 품질을 살펴보았다. (도 7c-e) HEK293T/CRISPR-Cas9 벡터 대조군 세포를 리포펙타민 2000 (도 7c), Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약 (도 7d) 또는 전기천공된 엑소좀 (도 7e)을 사용하여 1 ㎍의 IVT-sgRab27b RNA로 72시간 동안 처리하였다. DNA를 추출하고, T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 유전자 편집을 확인하였다. HEK293T 세포 (도 7f) 및 BxPC-3 세포 (도 7g)를 리포펙타민 2000, Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약을 사용하여 Cas9 mRNA로 형질감염시키거나, 또는 Cas9 mRNA로 전기천공된 1E9 MSC 엑소좀으로 48시간 동안 처리하였다. 웨스턴 블롯을 수행하여 Cas9 단백질 수준을 측정하였다.
[0022] 도 8a-c: HEK293T/CRISPRCas9 벡터 대조군 및 BxPC-3/CRISPR-Cas9 벡터 대조군 세포로부터 RNA를 추출하였다. 상대적인 Cas9 발현 수준 (도 8a) 및 1/Ct 값 (도 8b)을 qPCR로 측정하였다. (도 8c) 1㎍의 Cas9 RNA를 HEK293T/CRISPRCas9 벡터 대조군 및 BxPC-3/CRISPR-Cas9 벡터 대조군 세포의 RNA와 함께 역전사에 사용하였다. qPCR을 수행하여 1/Ct 값을 측정하였다.
[0023] 도 9a-g: Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약을 사용하여 HEK293T 세포를 10 ㎍의 플라스미드 (CRISPR-Cas9-렌티-V2 벡터 대조군, CRISPR-Cas9-렌티-V2-sgRab27b-1, CRISPR-Cas9-GFP 벡터 대조군)로 매 24시간마다 4회 (1, 2, 3, 4일) 처리하였다. 5일째에 세포들을 수집하였다. DNA, RNA 및 단백질을 추출하였다. (도 9a) 5일째에 촬영한 사진들은 대조군으로 CRISPR-Cas9-GFP 벡터 대조군 플라스미드를 사용함으로써 Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약이 형질감염 효율을 나타냄을 보여주고 있다. (도 9b) 상대적인 Cas9 발현 수준 및 1/Ct 값을 qPCR로 측정하였다. (도 9c) 웨스턴 블롯을 사용하여 Cas9 단백질 수준을 평가하였다. (도 9d) CRISPR-Cas9-렌티-V2-sgRab27b-1 플라스미드로 처리한 후 HEK293T 세포에서 유전자 편집을 확인하기 위해 T7/SURVEYOR 분석을 수행하였다. 동일한 실험을 BxPC-3 세포에서도 수행하였다. Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약을 사용하여 BxPC-3 세포를 10 ㎍의 플라스미드 (CRISPRCas9-렌티-V2 벡터 대조군, CRISPR-Cas9-렌티-V2-sgRab27b-1)로 매 24시간마다 4회 (1, 2, 3, 4일) 처리하였다. 5일째에 세포들을 수집하였다. (도 9e) 상대적인 Cas9 발현 수준을 qPCR로 측정하였다. (도 9f) 웨스턴 블롯을 사용하여 Cas9 단백질 수준을 평가하였다. (도 9g) T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 BxPC-3 세포에서 유전자 편집을 확인하였다.
[0024] 도 10a-h: 리포펙타민 2000을 사용하여 48시간 동안 5 ㎍의 플라스미드 (렌티-V2, GFP, 퓨로마이신 백본을 갖는 CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D 및 그의 벡터 대조군들)로 KPC689 세포를 형질감염시켰다. DNA, RNA 및 단백질을 추출하였다. (도 10a) 48시간 동안의 형질감염 후 촬영한 사진으로, 대조군으로서 CRISPR-Cas9-GFP 벡터 대조군 플라스미드를 사용함으로써 리포펙타민이 형질감염 효율을 나타내고 있음을 보여준다. 상대적인 Cas9 발현 수준 (도 10b) 및 mKrasG12D 수준 (도 10c)을 qPCR로 측정하였다. (도 10d) T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 리포펙타민에 의한 형질감염 후 KPC689 세포에서의 유전자 편집을 확인하였다. Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약을 사용하여 KPC689 세포를 10 ㎍의 플라스미드 (GFP 백본을 갖는 CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D 및 그의 벡터 대조군)로 매 24시간마다 3회 (1, 2, 3일) 처리하였다. 4일째에 세포들을 수집하였다. DNA, RNA 및 단백질을 추출하였다. (도 10e) 5일째에 촬영한 사진들은 Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약이 형질감염 효율을 나타냄을 보여주고 있다. 상대적인 Cas9 발현 수준 (도 10f) 및 mKrasG12D 수준 (도 10g)을 qPCR로 측정하였다. (도 10h) CRISPR-Cas9-GFP-mKrasG12D 플라스미드로 처리한 후 KPC689 세포에서 유전자 편집을 확인하기 위해 T7/SURVEYOR 분석을 수행하였다.
[0025] 도 11a-f: (도 11a) 및 (도 11b) 리포펙타민 2000에 의한 CRISPR-Cas9 독시사이클린 유도성 플라스미드와 함께 패키징 플라스미드를 사용하여 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. 렌티바이러스를 함유하는 배지를 수확한 후 Panc1 세포 내로 형질도입하였다. 상기 형질도입된 세포를 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신으로 추가로 선별하였다. 상기 Panc1 유도성 Cas9의 안정한 세포들을 1 ㎍/㎖의 독시사이클린을 사용하여 유지시켰다. 독시사이클린으로 처리하거나 또는 처리하지 않은 Panc1 유도성 세포로부터 엑소좀을 수집하였다. 웨스턴 블롯을 사용하여 세포 (도 11a) 및 엑소좀 (도 11b)에서 Cas9 단백질 수준을 확인하였다. (도 11c) 상기 Panc1 유도성 세포를 리포펙타민, 퓨진(Fugene) 또는 Exo-Fect를 사용하여 hKrasG12D에 대한 2㎍의 IVT-sgRNA, 1㎍의 hKrasG12D 플라스미드로 72시간 동안 처리하였다. T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 Panc1 유도성 세포에서 유전자 편집을 확인하였다. (도 11d) Panc1 Cas9의 안정한 세포들을 렌티바이러스 기반의 방법을 사용하여 확립하였다. Cas9 단백질 수준은 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. (도 11e) 리포펙타민, Exo-Fect 또는 전기천공된 엑소좀을 사용하여 렌티-V2, GFP, 퓨로마이신 백본을 갖는 CRISPR-Cas9-sghKrasG12D로 Panc1 세포를 처리하였다. Panc1 Cas9의 안정한 세포들을 리포펙타민, Exo-Fect 또는 전기천공된 엑소좀을 사용하여 sghKrasG12D 플라스미드로 처리하였다. T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 Panc1 세포 및 Panc1 Cas9의 안정한 세포에서 유전자 편집을 확인하였다. (도 11f) Panc1 sghKrasG12D T1의 안정한 세포들을 렌티바이러스 기반의 방법을 사용하여 확립하였다. 상기 Panc1 sghKrasG12D T1의 안정한 세포들을 GFP 또는 퓨로마이신 백본을 갖는 10 ㎍ 또는 20 ㎍의 Cas9 플라스미드로 24시간 동안 형질감염시켰다. T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 Panc1 sghKrasG12D T1의 안정한 세포에서 유전자 편집을 확인하였다.
[0026] 도 12a-b: KPC689 세포를 마우스의 등에 피하 이식하였다. 상기 마우스들을 그룹당 1마리 또는 2마리로 하여 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1: 1E9 엑소좀 및 10 ㎕의 Exo-Fect (n=1, K504)로 처리함; 그룹 2: 10 ㎍의 Cas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1 플라스미드 (n=1, K509)로 처리함; 그룹 3: 1E9 엑소좀, 10 ㎍의 Cas9-GFP-벡터 대조군 플라스미드 및 10 ㎕의 Exo-Fect (n=2, #1: K501, #2: K510. K510은 다른 모든 마우스들에 비해 3일 후에 등록함); 그룹 4: 1E9 엑소좀, 10 ㎍의 Cas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1 플라스미드 및 10 ㎕의 Exo-Fect (n=2, #1: K502, #2: K505)로 처리함. 각 그룹의 마우스들에게 2주간 매일 정맥내 (I.V.) 및 종양내 (I.T.) 주사하였다. (도 12a) 종양 길이 (a, mm) 및 폭 (b, mm) 및 체중 (도 12b)을 측정하였다. 종양 부피 (도 12a)는 V (mm3)=0.52*a*b^2로 계산하였다.
[0027] 본원에서는, 암세포를 표적을 삼아 유전자 편집 프로그램을 유도하여 상기 암세포의 유전체를 변화시키는 능력을 갖는 서로 다른 가이드 RNA 분자들을 사용하여 통합형 CRISPR/Cas9 시스템을 보유하는 엑소좀 (예컨대, iExosomesCRISPR/Cas9)이 제공된다. 유전자 편집 분석은 유전자 편집이 엑소좀에서 자체적으로 효율성있게 일어난다는 것을 보여주기 위해 사용되어 왔던 것으로, 해당 iExosomesCRISPR/Cas9이 KrasG12D와 같은 돌연변이를 갖는 암세포를 표적으로 삼아, 상기 돌연변이 유전자를 잘라내서 이를 야생형 KRAS 유전자로 교체하거나 상기 우성 돌연변이 유전자를 제거하여 정상 유전자가 기능을 인계하도록 하는 유효성 및 후속 사용에 대한 신속한 검증 방법을 제공한다. iExosomesCRISPR/Cas9를 사용하면, 일반적으로 암세포 및 종양의 유전체 DNA의 일부로서 그의 개시, 진행 및/또는 전이에 원인이 되는 어떠한 유전자들이라도 편집하여 치료적 유용성을 제공하거나 또는 암세포 및 종양의 생물학적 작용을 변화시킬 수도 있다. 이러한 기술은, 치료적으로 유익한 암관련 유전자 편집에 있어서 현재 CRISPR/Cas9 기술이 생체 내 적용하는 부분이 부족했던 점을 해결할 수 있다. 표면에 CD47을 보유하는 엑소좀을 사용하면, iExosomesCRISPR/Cas9를 종양에 성공적으로 전달하여 치료 효과를 얻을 수 있다.
I. 지질계 나노입자
[0028] 일부 실시양태에서, 지질계 나노입자는 리포좀, 엑소좀, 지질 제제 또는 다른 지질계 나노입자, 예컨대 지질계 소포 (예를 들어, DOTAP: 콜레스테롤 소포)이다. 지질계 나노입자는 양으로 하전되거나, 음으로 하전되거나 또는 중성으로 하전될 수 있다.
A. 리포좀
[0029] "리포좀"은 밀폐된 지질 이중층 또는 응집체가 생성되어 형성되는 여러가지 단일 및 다중 라멜라 지질 소포를 망라하는 일반적인 용어이다. 리포좀은 일반적으로 인지질을 포함하는 이중층 막, 및 일반적으로 수성 조성물을 포함하는 내부 매질을 갖는 소포 구조체를 보유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본원에 제공되는 리포좀은 단일 라멜라 리포좀, 다중 라멜라 리포좀 및 다중 소포 리포좀을 포함한다. 본원에 제공되는 리포좀은 양으로 하전되거나, 음으로 하전되거나, 또는 중성으로 하전될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 리포좀은 중성으로 하전되어 있다.
[0030] 다중 라멜라 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다수의 지질층을 가진다. 이러한 리포좀은 인지질을 포함하는 지질이 과량의 수용액 중에 현탁되는 경우에 자발적으로 형성된다. 상기 지질 성분들은 폐쇄된 구조를 형성하기 전 자가 재배열을 거쳐 해당 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질들을 포집하게 된다. 친유성 분자 또는 친유성 영역들을 갖는 분자도 지질 이중층 중에 용해되거나 이와 결합될 수도 있다.
[0031] 특정 양태에서, 폴리펩타이드, 핵산 또는 소분자 약물은, 예를 들어 리포좀 중 수성인 내부에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되거나, 상기 리포좀과 폴리펩타이드/핵산 모두에 결합되어 있는 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀에 포집되거나, 리포좀과 복합체를 형성할 수도 있다.
[0032] 본 실시양태에 따라 사용된 리포좀은 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 서로 다른 방법들로 제조될 수 있다. 예를 들어, 인지질, 예컨대 중성 인지질 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC)을 tert-부탄올 중에 용해시킨다. 다음으로, 상기 지질(들)을 폴리펩타이드, 핵산 및/또는 기타 성분(들)과 혼합한다. 상기 지질 혼합물에 Tween 20을 첨가하여 Tween 20이 조성물 중량의 약 5%가 되도록 한다. 과량의 tert-부탄올을 상기 혼합물에 첨가하여 tert-부탄올의 부피가 적어도 95%가 되도록 한다. 상기 혼합물을 볼텍싱하고, 드라이 아이스/아세톤 조에서 냉동시킨 후, 밤새 동결건조시켰다. 상기 동결건조된 제제를 -20℃로 보관하여 최대 3개월간 사용할 수 있다. 필요한 경우마다, 상기 동결건조시킨 리포좀을 0.9%의 식염수 중에서 환원시킨다.
[0033] 다르게는, 리포좀은 용기, 예컨대 유리 재질의 배형(pear-shaped) 플라스크 내의 용매에 지질을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 상기 용기는 리포좀 현탁액의 예상 부피의 10배 큰 부피를 가져야 한다. 회전식 증발기를 사용하여, 음압 하에 약 40℃에서 상기 용매를 제거한다. 상기 용매는 일반적으로 해당 리포좀의 목적한 부피에 따라 약 5분 내지 2시간 이내에 제거한다. 상기 조성물은 진공 하에 건조기 중에서 더 건조시킬 수도 있다. 상기 건조된 지질은 일반적으로 시간이 경과함에 따라 품질이 저하되는 경향이 있으므로 약 1주 후에는 폐기한다.
[0034] 건조된 지질들은 모든 지질막이 재현탁될 때까지 진탕함으로써 멸균 무발열원 증류수 중 약 25-50 mM의 인지질로 수화될 수 있다. 이후, 상기 수성 리포좀들을 분취액으로 나누어, 각각 바이알에 넣어 동결건조시킨 후, 진공 하에 밀봉할 수 있다.
[0035] 상술한 바와 같이 제조된 상기 건조된 지질 또는 동결건조된 리포좀은 단백질 또는 펩타이드의 용액 중에서 탈수 및 환원시키고, 적절한 용매, 예컨대 DPBS를 사용하여 적절한 농도로 희석할 수 있다. 다음으로, 상기 혼합물을 볼텍스 혼합기 중에서 강하게 진탕시킨다. 캡슐화되지 않은 추가의 물질들, 예컨대 호르몬, 약물, 핵산 구조물 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 제제들은 29,000×g로 원심분리하여 제거하고 리포좀 펠릿은 세척한다. 상기 세척한 리포좀은 적절한 총 인지질 농도, 예를 들어 약 50-200 mM로 재현탁된다. 캡슐화된 추가의 물질 또는 활성제의 양은 표준 방법에 따라 측정될 수 있다. 리포좀 제제 중에 캡슐화된 추가의 물질 또는 활성제의 양을 측정한 후, 상기 리포좀을 적절한 농도로 희석하여 사용할 때까지 4℃로 보관할 수 있다. 상기 리포좀을 포함하는 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균된 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 예컨대 물 또는 식염수 용액을 포함할 것이다.
[0036] 본 실시양태에 유용할 수 있는 추가의 리포좀들로는, 예를 들어 WO02/100435A1호, 미국 특허 5,962,016호, 미국 출원 2004/0208921호, WO03/015757A1호, WO04029213A2호, 미국 특허 5,030,453호 및 미국 특허 6,680,068호 (이들의 전문은 해당 특허에 대한 권리에 대한 포기 없이 참고로 포함됨)에 기재된 양이온성 리포좀을 포함한다.
[0037] 이러한 리포좀을 제조함에 있어서는, 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 프로토콜이 사용될 수 있다. 리포좀을 제조하는 추가의 비제한적인 예들은 미국 특허 4,728,578호, 4,728,575호, 4,737,323호, 4,533,254호, 4,162,282호, 4,310,505호 및 4,921,706호; WO1986/000238호 및 WO1990/004943호 (각각 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
[0038] 특정 실시양태에서, 상기 지질계 나노입자는 중성 리포좀 (예컨대, DOPC 리포좀)이다. 본원에 사용된 "중성 리포좀"또는 "하전되지 않은 리포좀"은 본질적으로 중성인 (실질적으로 하전되지 않은) 순전하를 나타내는 하나 이상의 지질 성분들을 함유하는 리포좀으로 정의된다. "본질적으로 중성인" 또는 "본질적으로 하전되지 않는"이라는 말은, 주어진 대상군 (예컨대, 리포좀 대상군) 내의 지질 성분들이 또 다른 성분의 반대 전하에 의해 상쇄되지 않는 전하를 (있다손 치더라도) 거의 포함하지 않는다는 의미로 말하려고 한 것이다 (즉, 성분들 중 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만이 상쇄되지 않은 전하를 포함함). 특정 실시양태에서, 중성 리포좀은 대부분, 생체 조건 하에 (즉, 약 pH 7에서) 자체적으로 중성인 지질 및/또는 인지질을 포함할 수 있다.
[0039] 본 실시양태의 리포좀 및/또는 지질계 나노입자들은 인지질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종의 인지질이 리포좀의 생성에 사용될 수 있다 (예컨대, DOPC와 같은 중성 인지질이 중성 리포좀을 생성하는데 사용될 수 있음). 다른 실시양태에서, 리포좀을 생성하기 위해 1종 이상의 인지질이 사용될 수 있다. 인지질은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래할 수 있다. 인지질은, 예를 들어 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는데; 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린은 생리학적 조건 하에 (즉, 약 pH 7에서) 하전되지 않기 때문에, 이러한 화합물들은 중성 리포좀을 생성하는데 특히 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 인지질 DOPC는 하전되지 않는 리포좀을 제조하는데 사용된다. 특정 실시양태에서, 인지질이 아닌 지질 (예컨대, 콜레스테롤)이 사용될 수 있다.
[0040] 인지질은 글리세로 인지질 및 특정 스핑고 지질을 포함한다. 인지질로는, 이에 제한되지는 않지만, 디올레오일포스파티딜콜린 ("DOPC"), 에그 포스파티딜콜린 ("EPC"), 디라우릴로일포스파티딜콜린 ("DLPC"), 디미리스토일포스파티딜콜린 ("DMPC"), 디팔미토일포스파티딜콜린 ("DPPC"), 디스테아로일포스파티딜콜린 ("DSPC"), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 ("MPPC"), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린 ("PMPC"), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린 ("PSPC"), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 ("SPPC"), 디라우릴로일포스파티딜글리세롤 ("DLPG"), 디미리스토일포스파티딜글리세롤 ("DMPG"), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 ("DPPG"), 디스테아로일포스파티딜글리세롤 ("DSPG"), 디스테아로일 스핑고미엘린 ("DSSP"), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 ("DSPE"), 디올레오일포스파티딜글리세롤 ("DOPG"), 디미리스토일포스파티드산 ("DMPA"), 디팔미토일 포스파티드산 ("DPPA"), 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민 ("DMPE"), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민 ("DPPE"), 디미리스토일 포스파티딜세린 ("DMPS"), 디팔미토일 포스파티딜세린 ("DPPS"), 뇌 포스파티딜세린 ("BPS"), 뇌 스핑고미엘린 ("BSP"), 디팔미토일 스핑고미엘린 ("DPSP"), 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC"), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 ("DAPC"), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 ("DBPC"), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 ("DEPC"), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 ("DOPE"), 팔미토일로에오일 포스파티딜콜린 ("POPC"), 팔미토일로에오일 포스파티딜에탄올아민 ("POPE"), 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민 및 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함한다.
B. 엑소좀
[0041] "세포외 소포" 및 "EV"는 세포 유래의 미세소포 및 세포에서 분비된 미세소포로서, 그 종류로는 엑소좀, 엑소좀 유사 소포, (원형질막으로부터 직접적인 소포 출아(budding)로 인하여 발생하는) 엑토좀, 미세입자, 미세소포, 배출형 미세소포 (shedding microvesicle, SMV), 나노입자 및 심지어 (대형) 아폽토시스성 소기포(bleb) 또는 (세포 사멸로 인한) 사체 또는 막입자를 포함한다.
[0042] 본원에 사용된 "미세소포" 및 "엑소좀"이라는 용어는 약 10 nm 내지 약 5000 nm, 보다 일반적으로는 30 nm 내지 1000 nm, 가장 일반적으로는 약 50 nm 내지 750 nm의 직경 (또는 입자가 구형이 아닌 가장 큰 치수)을 갖는 막성 입자를 가리키며, 이 경우 해당 엑소좀 막의 적어도 일부는 세포로부터 직접 수득된다. 가장 일반적으로, 엑소좀은 공여체 세포 크기의 최대 5%의 크기 (평균 직경)를 가질 것이다. 따라서, 특히 고려되는 엑소좀은 세포로부터 배출되는 것을 포함한다.
[0043] 엑소좀은 예를 들어 체액과 같은 임의 적절한 샘플 종류에서 검출되거나 그로부터 분리될 수 있다. 본원에 사용된 "분리된"이라는 용어는 해당 자연 환경으로부터의 분리를 가리키는 것으로, 적어도 부분적인 정제를 포함하며 실질적인 정제를 포함할 수 있음을 말하고자 한 것이다. 본원에 사용된 "샘플"이라는 용어는 본 발명에 의해 제공된 방법에 적절한 임의의 샘플을 지칭한다. 상기 샘플은 검출 또는 분리에 적합한 엑소좀을 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 샘플의 공급원으로는 혈액, 골수, 흉수, 복막액, 뇌척수액, 소변, 침, 양수, 악성 복수, 기관지 폐포 세척액, 활액, 모유, 땀, 눈물, 관절액 및 기관지 세척물을 포함한다. 한 양태에서, 상기 샘플은 예를 들어 전혈 또는 이의 임의의 분획 또는 성분을 포함하는 혈액 샘플이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 혈액 샘플은 혈액 세포 또는 그의 성분들, 예컨대 정맥, 동맥, 말초, 조직, 탯줄 등을 포함하는 공지된 임의의 공급원으로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 널리 공지되어 있어 통상적인 임상 방법들 (예컨대, 전혈 채혈 및 가공을 위한 절차)을 사용하여 수득해 가공처리할 수 있다. 한 양태에서, 대표적인 샘플은 암에 걸린 대상체로부터 채취한 말초 혈액일 수 있다.
[0044] 엑소좀은 수술 샘플, 생검 샘플, 조직, 대변 및 배양된 세포와 같은 조직 샘플들로부터 분리될 수 있다. 조직 공급원으로부터 엑소좀을 분리할 때, 단일 세포 현탁액을 수득한 후 세포들을 용해시켜 엑소좀을 방출시키기 위해 해당 조직을 균질화하는 것이 필요할 수 있다. 조직 샘플들로부터 엑소좀을 분리할 때, 엑소좀의 붕괴를 초래하지 않는 균질화 및 용해 절차를 선택하는 것이 중요하다. 본원에서 고려되는 엑소좀은 바람직하게는 생리학적으로 허용가능한 용액, 예를 들어 완충 식염수, 증식 배지, 다양한 수성 배지 등 중의 체액으로부터 분리된다.
[0045] 엑소좀은 새로 수집된 샘플이나 냉동 또는 냉장 보관된 샘플로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 엑소좀은 세포 배양 배지로부터 분리될 수 있다. 필수적인 것은 아니지만, 부피 배제 중합체(volume-excluding polymer)로 침전시키기 전에 유체 샘플을 정제하여 해당 샘플로부터 잔해물을 제거하면 고순도의 엑소좀이 수득될 수 있다. 정제 방법으로는 원심분리, 초원심분리, 여과 또는 한외여과를 포함한다. 가장 통상적으로, 엑소좀은 당업계에 널리 공지된 수많은 방법들로 분리할 수 있다. 한 바람직한 방법으로는 체액 또는 세포 배양 상청액으로부터의 분별 원심분리를 들 수 있다. 엑소좀의 분리를 위한 예시적인 방법들은 문헌 [Losche et al., 2004]; [Mesri and Altieri, 1998]; [Morel et al., 2004]에 기술되어 있다. 다르게는, 엑소좀은 문헌 [Combes et al., 1997]에 기술된 바와 같이 유세포분석법을 통해 분리될 수도 있다.
[0046] 엑소좀의 분리를 위해 용인된 한 프로토콜로는 흔히 비교적 저밀도의 엑소좀을 부유시키기 위해 수크로스 밀도 구배 또는 수크로스 쿠션(sucrose cushion)과 조합된 초원심분리를 포함한다. 순차적인 분별 원심분리에 의한 엑소좀의 분리는 다른 미세소포 또는 거대분자 복합체들과 크기 분포가 중첩될 가능성이 있기 때문에 복잡하다. 또한, 원심분리는 크기에 따라 소포들을 분리하기에는 불충분한 방법일 수 있다. 그러나, 순차적 원심분리는, 수크로스 구배 초원심분리와 조합하는 경우라면 엑소좀을 고농축시킬 수 있다.
[0047] 초원심분리 루트에 대한 대안으로서 크기에 기반한 엑소좀의 분리는 또 다른 선택사항이다. 초원심분리에 비해 시간이 덜 걸리고 특수 장비를 사용할 필요가 없는 한외여과 절차를 이용한 엑소좀의 성공적인 정제에 대해서도 보고된 바 있다. 이와 유사하게, 상용 키트도 이용할 수 있는데 [EXOMIR™, 바이우사이언티픽(Bioo Scientific)사 제조], 이를 사용하면 한 마이크로필터에서는 세포, 혈소판 및 세포 잔해물들을 제거하고, 제2 마이크로필터에서는 유체를 구동시키기 위해 양압을 사용하여 30 nm보다 큰 소포들을 포획할 수 있다. 그러나, 이 과정에서, 엑소좀은 회수되지 않고, 이들의 RNA 내용물을 제2 마이크로필터 상에서 걸린 물질로부터 직접 추출한 후, PCR 분석에 사용할 수 있다. HPLC 기반 프로토콜을 통해서 잠재적으로 고순도의 엑소좀을 얻을 수는 있지만, 이러한 공정은 전용 장비가 필요하고 확장성을 갖기가 어렵다. 중요한 문제는 혈액 및 세포 배양 배지 모두 엑소좀과 동일한 크기 범위 내의 다수의 나노입자들 (일부는 비소포성)을 함유한다는 점이다. 예를 들어, 일부 miRNA들은 엑소좀보다는 세포외 단백질 복합체 내에 함유될 수 있으나; 프로테아제 (예컨대, 프로테이나아제 K)로 처리하여 "엑소좀외" 단백질로 인해서 가능한 임의의 오염을 제거할 수 있다.
[0048] 또 다른 실시양태에서, 암세포 유래의 엑소좀은, 엑소좀을 위한 샘플을 농축하는데 통상적으로 사용되는 기법들, 예컨대 면역특이적 상호작용 (예컨대, 면역자성 포획)을 수반하는 기법들에 의해 포획할 수 있다. 면역자성 세포 분리로도 알려진 면역자성 포획은, 통상적으로 특정 세포 유형에서 발견되는 단백질에 대해 유도된 항체를 작은 상자성 비드에 부착시키는 단계를 수반한다. 항체 코팅된 비드들을 혈액과 같은 샘플과 혼합하는 경우, 이들은 특정 세포에 부착하여 이를 둘러싸게 된다. 다음으로, 상기 샘플을 강한 자기장에 위치시켜 상기 비드들이 한쪽으로 펠릿화되도록 한다. 상기 혈액을 제거한 후, 포획된 세포들을 비드로 유지시킨다. 이러한 일반적인 방법에 대한 많은 변형법들은 당업계에 널리 알려져 있으며 엑소좀을 분리하는데 사용하기에 적합하다. 한 예에서, 상기 엑소좀은 자성 비드 (예컨대, 알데하이드/설페이트 비드)에 부착시킨 후, 항체를 상기 혼합물에 첨가하여, 상기 비드들에 부착되어 있는 엑소좀들의 표면 상의 에피토프를 인식시킬 수 있다. 암세포 유래의 엑소좀에서 발견되는 것으로 알려진 대표적인 단백질로는 ATP 결합 카세트 서브 패밀리 A 구성원 6 (ABCA6), 테트라스파닌-4 (TSPAN4), SLIT 및 NTRK 유사 단백질 4 (SLITRK4), 추정상의 프로토카데린 베타-18 (PCDHB18), 골수종 세포 표면 항원 CD33 (CD33) 및 글리피칸-1 (GPC1)을 포함한다. 암세포 유래의 엑소좀은, 예를 들어 이러한 하나 이상의 단백질들에 대한 항체 또는 앱타머를 사용하여 분리될 수 있다.
[0049] 본원에 사용된 분석이란 엑소좀의 직접 또는 간접적인 가시화를 가능케하는 생체내 또는 생체외로 행할 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 예를 들어, 분석은, 이에 제한되지는 않지만, 고체 기질에 결합된 엑소좀의 생체외 현미경 또는 세포분석 검출 및 가시화, 유세포분석, 형광 영상촬영 등을 포함할 수 있다. 예시적인 양태에서, 암세포 유래의 엑소좀은 ATP 결합 카세트 서브 패밀리 A 구성원 6 (ABCA6), 테트라스파닌-4 (TSPAN4), SLIT 및 NTRK 유사 단백질 4 (SLITRK4), 추정상의 프로토카데린 베타-18 (PCDHB18), 골수종 세포 표면 항원 CD33 (CD33), 글리피칸-1 (GPC1), 히스톤 H2A 2-A형 (HIST1H2AA), 히스톤 H2A 1-A형 (HIST1H1AA), 히스톤 H3.3 (H3F3A), 히스톤 H3.1 (HIST1H3A), 징크 핑거 단백질 37 상동체 (ZFP37), 라미닌 서브유닛 베타-1 (LAMB1), 세뇨관간질성 신염 항원 유사형 1 (TINAGL1), 퍼옥시레독신-4 (PRDX4), 콜라겐 알파-2(IV) 사슬 (COL4A2), 추정상의 단백질 C3P1 (C3P1), 헤미센틴-1 (HMCN1), 추정상의 로필린-2 유사 단백질 (RHPN2P1), 안키린 반복 도메인 함유 단백질 62 (ANKRD62), 3분자 모티프 함유 단백질 42 (TRIM42), 결합 플라코글로빈 (JUP), 튜불린 베타-2B 사슬 (TUBB2B), 엔도리보뉴클레아제 다이서 (DICER1), E3 유비퀴틴-단백질 리가제 TRIM71 (TRIM71), 카타닌 p60 ATPase 함유 서브유닛 A 유사형 2 (KATNAL2), 단백질 S100-A6 (S100A6), 5'-뉴클레오티다제 도메인 함유 단백질 3 (NT5DC3), 발린-tRNA 리가제 (VARS), 카즈린 (KAZN), ELAV 유사 단백질 4 (ELAVL4), RING 핑거 단백질 166 (RNF166), FERM 및 PDZ 도메인 함유 단백질 1 (FRMPD1), 78 kDa 글루코스 조절된 단백질 (HSPA5), 수송(Trafficking) 단백질 입자 복합체 서브유닛 6A (TRAPPC6A), 스쿠알렌 모노옥시게나제 (SQLE), 종양 감수성 유전자 101 단백질 (TSG101), 액포 단백질 선별 28 상동체 (VPS28), 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절제 (PTGFRN), 이소부티릴-CoA 탈수소효소, 미토콘드리아 (ACAD8), 26S 프로테아제 조절 서브유닛 6B (PSMC4), 신장 인자 1-감마 (EEF1G), 티틴 (TTN), 티로신-단백질 포스파타제 13형 (PTPN13), 트리오스포스페이트 아이소머라제 (TPI1) 또는 카르복시펩티다제 E (CPE) 중 하나 이상에 대해 유도된 항체들을 사용하여 검출한 후 고체 기질에 결합시키고/시키거나 현미경 또는 세포분석 검출을 사용하여 가시화한다.
[0050] 세포에서 발현되는 단백질들이 모두 해당 세포에 의해 분비되는 엑소좀에서 발견되는 것은 아니라는 점에 유의할 필요가 있다. 예를 들어, 칼넥신, GM130 및 LAMP-2는 모두 MCF-7 세포에서 발현되지만 MCF-7 세포에 의해 분비되는 엑소좀에서는 발견되지 않는 단백질이다 (Baietti et al., 2012). 또 다른 예로서, 한 연구는 190/190 췌장관 선암종 환자들이 건강한 대조군에 비해 높은 수준의 GPC1+ 엑소좀을 보유하고 있음을 발견하였다 (Melo et al., 2015, 본 문헌은 전문이 본원에 참조로 포함됨). 그 중에서도, 평균적으로, 건강한 대조군의 2.3%만이 GPC1+ 엑소좀을 보유하였다.
1. 세포 배양물로부터 엑소좀을 수집하기 위한 예시적인 프로토콜
[0051] 1일째에, 10% FBS를 함유하는 배지 중 T225 플라스크에 충분한 세포 (예컨대, 약 5백만 개의 세포)를 분주하여 다음날 상기 세포들이 약 70% 전면생장될 수 있도록 한다. 2일째에, 상기 세포들에서 배지를 흡인하고, PBS로 상기 세포들을 2회 세척한 후, 25-30 mL의 기본 배지 (즉, PenStrep이나 FBS가 없음)를 상기 세포들에 첨가한다. 상기 세포들을 24-48시간 동안 항온배양한다. 48시간의 항온배양이 바람직하지만, 일부 세포주는 무혈청 배지에 더 민감하기 때문에 상기 항온배양 시간을 24시간으로 감소시켜야 한다. FBS에는 NanoSight 결과를 심히 왜곡시키는 엑소좀들이 함유되어 있음에 유의한다.
[0052] 3/4일째에, 상기 배지를 수집하여 실온에서 800×g로 5분간 원심분리하여 사멸한 세포와 큰 잔해물을 펠릿화시킨다. 상청액을 새 원추형 튜브로 옮겨 상기 배지를 2000×g로 10분간 재차 원심분리하여 다른 큰 잔해물과 큰 소포들을 제거한다. 상기 배지를 0.2 ㎛ 필터에 통과시킨 후, 초원심분리 튜브들 (예컨대, 25×89 mm의 Beckman Ultra-Clear)에 튜브당 35 mL로 분취한다. 튜브당 배지의 부피가 35 mL 미만인 경우에는, 35 mL가 되도록 해당 튜브의 잔여부에 PBS를 채운다. SW 32 Ti 로터 (k-계수 266.7, RCF 최대 133,907)를 사용하여 4℃에서 28,000 rpm으로 2-4시간 동안 상기 배지를 초원심분리한다. 약 1인치의 액체가 남을 때까지 상기 상청액을 조심스럽게 흡인한다. 상기 튜브를 기울여 남아있는 배지가 천천히 흡인기 피펫에 유입되도록 한다. 필요하다면, 상기 엑소좀 펠릿을 PBS에 재현탁시키고, 상기 28,000 rpm에서의 초원심분리를 1-2시간 동안 반복하여 상기 엑소좀 대상군을 추가로 정제할 수도 있다.
[0053] 마지막으로, 상기 엑소좀 펠릿을 210 ㎕의 PBS에 재현탁시킨다. 각 시료에 대해서 다수의 원심분리 튜브가 있는 경우, 동일한 210 ㎕의 PBS를 사용하여 각 엑소좀 펠릿을 연속적으로 재현탁시킨다. 각 시료에 대해, 10 ㎕를 취하여 990 ㎕의 H2O를 첨가해 나노입자 추적 분석에 사용한다. 남아있는 200 ㎕의 엑소좀 함유 현탁액은 이후의 다운스트림 공정에서 사용하거나 또는 이를 -80℃로 즉시 보관한다.
2. 혈청 샘플에서 엑소좀을 추출하기 위한 예시적인 프로토콜
[0054] 먼저, 혈청 샘플을 얼음에서 해동시킨다. 다음으로, 11 mL의 PBS 중에 250 ㎕의 무세포 혈청 샘플을 희석하고; 0.2 ㎛ 공극 필터를 통해 여과한다. 상기 희석된 샘플을 4℃에서 150,000×g로 밤새 초원심분리한다. 그 다음날, 상청액을 조심스럽게 버린 후 상기 엑소좀 펠릿들을 11 mL의 PBS 중에서 세척한다. 4℃에서 150,000×g로 2시간 동안 제2차 초원심분리를 수행한다. 마지막으로, 상청액을 조심스럽게 버린 후 분석을 위해 상기 엑소좀 펠릿들을 100 ㎕의 PBS 중에 재현탁시킨다.
C. 엑소좀 및 리포좀의 전기천공을 위한 예시적인 프로토콜
[0055] 400 ㎕의 전기천공 버퍼 (1.15 mM의 인산칼륨, pH 7.2, 25 mM의 염화칼륨, 21%의 Optiprep) 중에서 1×108개의 엑소좀 (NanoSight 분석으로 측정함) 또는 100 nm의 리포좀 [예컨대, 인캡슐라 나노 사이언시즈(Encapsula Nano Sciences)에서 구입]과 1 ㎍의 siRNA (퀴아젠) 또는 shRNA를 혼합한다. 4 mm의 큐벳을 사용하여 상기 엑소좀 또는 리포좀을 전기천공한다 (예컨대, 문헌 [Alvarez-Erviti et al., 2011]; [El-Andaloussi et al., 2012] 참조). 전기천공후, 상기 엑소좀 또는 리포좀을 프로테아제 무함유 RNAse로 처리한 후 10배로 농축된 RNase 억제제를 첨가한다. 마지막으로, 상기 기술된 바와 같이, 초원심분리 방법 하에 상기 엑소좀 또는 리포좀을 PBS로 세척한다.
II. CRISPR/Cas 시스템
[0056] 일반적으로, "CRISPR 시스템"이란 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr (전사활성화 CRISPR) 서열 (예컨대, tracrRNA 또는 부분 활성 tracrRNA), tracr-메이트(mate) 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 "직접 반복" 및 tracrRNA로 처리된 부분 직접 반복을 망라함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 "스페이서"로도 지칭함) 및/또는 CRISPR 유전자좌의 다른 서열 및 전사체를 포함하는, CRISPR 관련 ("Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성을 유도하는데 관여하는 전사체 및 다른 구성요소들을 총괄적으로 가리킨다.
[0057] 상기 CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은, DNA에 특이적으로 결합하는 비암호화 RNA 분자 (가이드) RNA 및 뉴클레아제 작용성 (예컨대, 2개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 구성요소는, 예를 들어 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래할 수 있다.
[0058] 일부 양태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (표적 서열에 특이적인 crRNA 및 고정된 tracrRNA의 융합물을 포함)를 세포 내로 도입한다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단의 표적 부위들은 상보적 염기쌍을 사용하여 상기 Cas 뉴클레아제를 상기 표적 부위, 예컨대 상기 유전자로 표적화한다. 상기 표적 부위는 일반적으로 NGG 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열의 5'에 가까운 위치에 기초하여 선택될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 gRNA는 해당 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11개 또는 10개의 뉴클레오타이드를 상기 표적 DNA 서열에 상응하도록 변형시킴으로써 원하는 서열에 표적화시킨다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 구성요소들을 특징으로 한다. 일반적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 보유하도록 설계된 서열을 가리키는데, 여기서 상기 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 유도하여 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 존재하는 한, 완전한 상보성이 반드시 요구되는 것은 아니다.
[0059] 상기 CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 절단 (DSB)을 유도한 후, 본원에 논의된 바와 같이 붕괴시킬 수도 있다. 다른 실시양태에서, "니카제(nickase)"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥에 새김눈(nick)을 내는데 사용된다. 각각 한 쌍의 서로 다른 gRNA 표적화 서열들에 의해 유도되는 쌍을 이루고 있는 니카제들은, 예를 들어 특이성을 개선하는데 사용될 수 있는데, 이 경우 새김눈을 동시에 도입할 때 5' 돌출부가 도입되도록 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 촉매적으로 불활성인 Cas9를 이종성 효과기 도메인, 예컨대 전사 억제제 또는 활성제에 융합시켜, 유전자 발현에 영향을 준다.
[0060] 상기 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 표적 서열은 세포의 소기관 내와 같은 세포의 핵이나 세포질 내에 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 주형을 "편집용 주형" 또는 "편집용 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집용 서열"로 지칭한다. 일부 양태에서는, 외인성 주형 폴리뉴클레오타이드도 편집 주형으로 지칭할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 재조합은 상동성 재조합이다.
[0061] 일반적으로, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여, CRISPR 복합체 (표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함함)의 형성으로 해당 표적 서열 내 또는 그 근방 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 이상의 염기쌍 내)의 한 가닥 또는 양 가닥의 절단이 유발된다. 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부 (예컨대, 야생형 tracr 서열 중 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있는 tracr 서열은, 예를 들어 적어도 tracr 서열의 일부를 따라, 가이드 서열에 작동가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부에 하이브리드화시킴으로써, CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수도 있다. 상기 tracr 서열은 하이브리드화하여 CRISPR 복합체의 형성에 참여하도록 tracr 메이트 서열에 대한 충분한 상보성, 예컨대 최적으로 정렬되는 경우 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 가진다.
[0062] CRISPR 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터들을 세포 내로 도입하여, 해당 CRISPR 시스템의 구성요소들의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 유도하도록 할 수 있다. 구성요소들은 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수도 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr 메이트 서열에 결합된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별개의 벡터 상의 별도의 조절 요소들에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다르게는, 동일하거나 상이한 조절 요소들로부터 발현된 2 이상의 구성요소들은, 단일 벡터 중에서 조합될 수 있고, 하나 이상의 추가의 벡터들로 첫 벡터에 포함되어 있지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 구성요소들을 제공할 수 있다. 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 ("클로닝 부위"라고도 함)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 구성요소의 상류 및/또는 하류에 위치된다. 다수의 서로 다른 가이드 서열을 사용하는 경우, 단일 발현 작제물을 사용하여 CRISPR 활성을 한 세포 내에서 상응하는 다수의 서로 다른 표적 서열들을 표적화할 수 있다.
[0063] 벡터는 CRISPR 효소, 예컨대 Cas 단백질을 암호화하는 효소 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 이러한 효소들이 공지되어 있으며; 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 SwissProt 데이터베이스에서 등록번호 Q99ZW2로 찾아볼 수 있다.
[0064] 상기 CRISPR 효소는 (예컨대, S. 피오게네스 또는 S. 뉴모니아 유래의) Cas9일 수 있다. 상기 CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서, 예컨대 표적 서열의 내에서 및/또는 표적 서열의 상보체 내에서 한 가닥 또는 양 가닥의 절단을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 상응하는 야생형 효소에 대하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화하여, 상기 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 한 가닥 또는 양 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 할 수 있다. 예를 들어, S. 피오게네스로부터 유래된 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에 있어서 아스파르테이트에서 알라닌으로의 치환 (D10A)은, Cas9를 양 가닥을 절단하는 뉴클레아제로부터 (단일 가닥을 절단하는) 니카제로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, Cas9 니카제는 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 표적으로 하는 가이드 서열(들), 예컨대 2개의 가이드 서열과 함께 조합하여 사용할 수 있다. 상기 조합은 양 가닥에 모두 새김눈을 내어 NHEJ 또는 HDR을 유도하는데 사용할 수 있게 해준다.
[0065] 일부 실시양태에서, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 암호화 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현에 대해 최적화된 코돈이다. 상기 진핵 세포는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개 또는 인간이 아닌 영장류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 특정 유기체의 세포이거나 이로부터 유래될 수도 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는, 본래의 아미노산 서열을 유지하면서, 본래 서열의 적어도 하나의 코돈을 관심대상 숙주의 유전자에서 보다 빈번하게 혹은 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 상기 숙주 세포에서의 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종들은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특유의 편향성을 나타낸다. 코돈 편향성 (유기체간 코돈 사용빈도의 차이)은 메신저 RNA (mRNA)의 해독 효율성과 관련이 있는 경우가 많은데, 결과적으로 특히 해독되는 코돈의 특성 및 특정한 트랜스퍼 RNA (tRNA) 분자의 유용성에 좌우되는 것으로 생각된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우위성은 일반적으로 펩타이드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 속성을 반영한 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기반하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현에 맞추어질 수 있다.
[0066] 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화하여 상기 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 유도하기에 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시양태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬하는 경우, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성의 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상이다.
[0067] 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적절한 임의의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있는데, 이러한 알고리즘의 비제한적인 예로는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우스-휠러 변환(Burrows-Wheeler Transform)에 기반한 알고리즘 [예컨대, 버로우스 휠러 얼라이너(Aligner)사 제조], Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign [노보크래프트 테크놀로지스(Novocraft Technologies)사 제조], ELAND [미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 일루미나 (Illumina)사 제조], SOAP (soap.genomics.org.cn에서 이용가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 이용가능)를 포함한다.
[0068] CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가 단백질 서열, 및 임의로 임의의 두 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 에피토프 태그; 리포터 유전자 서열; 및 메틸라제 활성, 탈메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성 중 하나 이상의 활성을 보유하는 단백질 도메인을 포함한다. 에피토프 태그의 비제한적 예로는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 베타 갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 자가 형광 단백질, 예컨대 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함한다. CRISPR 효소는, 말토오스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합물, GAL4A DNA 결합 도메인 융합물, 및 단순 포진 바이러스 (HSV) BP16 단백질 융합물을 포함하는 이에 제한되지 않는, DNA 분자나 다른 세포성 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가의 도메인은 본원에 참고로 포함되는 US 20110059502호에 기재되어 있다.
III. CRISPR 시스템의 전달
[0069] 일부 양태에서, CRISPR-Cas9 표적화 분자, 복합체 또는 조합을 암호화하는 핵산을 세포에 투여하거나 도입한다. 일부 양태에서, 상기 시스템은 이미 세포 내에 존재하거나 세포의 엑소좀 내에 존재할 수 있다. 상기 핵산은 일반적으로 바이러스 발현 벡터와 같은 발현 벡터의 형태로 투여된다. 일부 양태에서, 상기 발현 벡터는 레트로바이러스 발현 벡터, 아데노바이러스 발현 벡터, DNA 플라스미드 발현 벡터 또는 AAV 발현 벡터이다. 일부 양태에서, 파괴 분자 또는 복합체, 예컨대 DNA 표적화 분자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포로 전달한다. 일부 양태에서, 상기 전달은 하나 이상의 벡터의 전달에 의해 이루어지고, 이의 하나 이상의 전사체 및/또는 그로부터 전사된 하나 이상의 단백질이 세포로 전달된다.
[0070] 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는, 해당 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입한 결과로 세포 내에서 인시투 (in situ) 합성된다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 세포 외부에서 생성된 후 세포로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 작제물을 동물 세포 내로 도입하는 방법들은 공지되어 있으며, 그 비제한적인 예로서는 상기 폴리뉴클레오타이드 작제물을 세포의 유전체에 통합시키는 안정한 형질전환 방법, 상기 폴리뉴클레오타이드 작제물을 세포의 유전체에 통합시키지 않는 일시적 형질전환 방법, 및 바이러스 매개형 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 재조합 바이러스 벡터 (예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스), 리포좀 등에 의해 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 일시적 형질전환 방법은 미량주입, 전기천공 또는 입자총(particle bombardment)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드를 세포 내에서 발현시키는 관점에서 벡터, 보다 구체적으로 플라스미드 또는 바이러스에 포함시킬 수 있다.
[0071] 일부 실시양태에서, 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 포유동물 세포 또는 표적 조직에 핵산을 도입할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여 CRISPR 시스템의 성분들을 암호화하는 핵산을 배양물 또는 숙주 유기체의 세포에 투여할 수 있다. 비바이러스성 벡터 전달 시스템으로는, DNA 플라스미드, RNA (예컨대, 본원에 기술된 벡터의 전사체), 네이키드 핵산, 및 전달 비히클, 예컨대 리포좀과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스성 벡터 전달 시스템은 세포로 전달된 후 에피솜 유전체 또는 통합된 유전체를 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 요법 절차에 대해 살펴보려면, 문헌 [Anderson, 1992]; [Nabel & Feigner, 1993]; [Mitani & Caskey, 1993]; [Dillon, 1993]; [Miller, 1992]; [Van Brunt, 1988]; [Vigne, 1995]; [Kremer & Perricaudet, 1995]; [Haddada et al., 1995]; 및 [Yu et al., 1994]을 참조한다.
[0072] 핵산의 비바이러스성 전달 방법으로는 엑소좀, 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미량주입, 입자사출(biolistics), 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온 및 DNA 흡수 향상제를 포함한다. 리포펙션은 (예컨대, 미국 특허 번호 5,049,386호, 4,946,787호; 및 4,897,355호)에 기술되어 있으며, 리포펙션 시약은 시판된다 (예컨대, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체 인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질로는 페이그너(Feigner)의 WO 91117424호; WO 91116024호에 기재된 것들을 포함한다. 전달은 세포 (예컨대, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예컨대, 생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.
[0073] 일부 실시양태에서, 전달은 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용을 통해 이루어진다. 일부 양태에서 바이러스성 벡터는 환자에게 직접 (생체 내) 투여할 수 있거나, 또는 시험관내 또는 생체외에서 세포를 치료한 후, 환자에게 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함한다.
[0074] 일부 양태에서, 글루타치온-5-트랜스퍼라제 (GST), 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 자가 형광 단백질, 예컨대 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 리포터 유전자를 세포 내로 도입하여 유전자 산물 발현의 변경 또는 변형을 측정하는 마커로서 기능하는 유전자 산물을 암호화할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 유전자 산물을 암호화하는 DNA 분자는 벡터를 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유전자 산물은 루시퍼라제이다.
[0075] 당업자라면 누구나 이해할 수 있듯이, 탑재물을 로딩하기 전 또는 후에, 본 발명의 엑소좀은 탑재물의 전달 비히클로서의 유용성을 향상시키기 위하여 표적화 모이어티를 도입함으로써 추가로 변형시킬 수 있다. 이와 관련하여, 엑소좀은 어떤 특정 세포를 조직 유형에 특이적으로 표적화하는 물질이 도입되도록 유전자 조작될 수도 있다. 이러한 표적 특이적 물질, 예컨대 표적 세포 또는 조직 상의 수용체 또는 리간드에 친화도를 갖는 펩타이드는, 예를 들어 당업계에 널리 확립된 방법들을 사용하여 엑소좀막 마커에 융합시킴으로써 해당 엑소좀막 내로 통합될 수 있다.
IV. 질병의 치료
[0076] 본 발명의 특정 양태는 CRISPR 시스템과 같은 유전자 편집 시스템을 발현하거나 포함하는 엑소좀으로 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. CRISPR 시스템은 환자의 암세포 내에서 유전자 편집을 유도할 수 있다. 엑소좀은 mRNA 전사 및 단백질 해독을 완료하는데 필요한 기구를 포함하는 것으로 알려져 있기 때문에 (WO2015/085096호, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 치료용 단백질을 암호화하는 mRNA 또는 DNA 핵산을 엑소좀 내로 형질감염시킬 수 있다. 다르게는, 치료용 단백질 자체는 엑소좀 내로 전기천공되거나 리포좀 내로 직접 혼입될 수 있다.
[0077] 본원에 사용된 "대상체"라는 용어는 대상 방법들이 수행되는 임의의 개체 또는 환자를 가리킨다. 일반적으로 상기 대상체는 인간이지만, 당업자라면 누구나 이해할 수 있듯이, 상기 대상체는 동물일 수 있다. 따라서, 설치류 (마우스, 랫트, 햄스터 및 기니피그 포함), 고양이, 개, 토끼, 농장 동물 (소, 말, 염소, 양, 돼지 등을 포함) 및 영장류 (원숭이, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라 포함)와 같은 포유동물을 포함하는 기타 동물들도 본 대상체의 정의 내에 포함된다.
[0078] "치료" 및 "치료하는"이라는 말은, 질병 또는 건강 관련 상태에 대한 치료적 유용성을 얻을 목적으로, 치료제를 대상체에게 투여 또는 적용하거나, 또는 대상체에게 어떤 절차 또는 작용 기작을 수행하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 치료는 CRISPR 시스템을 포함하는 엑소좀의 투여, 화학요법, 면역요법 또는 방사선요법, 수술의 수행 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[0079] 본원에 사용된 "치료적 유용성" 또는 "치료적으로 효과적인"이라는 용어는, 상기 병태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 건강을 증진시키거나 향상시키는 것을 의미한다. 여기에는 질병의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 예를 들어, 암의 치료는 예를 들어 종양의 침습성 감소, 암의 증식 속도 감소, 또는 전이의 방지를 포함할 수 있다. 암의 치료는 암에 걸린 대상체의 생존을 연장하는 것을 지칭할 수도 있다.
[0080] 본원에 사용된 "암"이라는 용어는 고형 종양, 전이성 암 또는 비전이성 암을 기술하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 직장, 항문, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁에서 발생할 수 있다.
[0081] 상기 암은, 구체적으로 하기의 조직학적 유형의 암일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 악성 종양; 암종; 미분화 암종; 거대 세포 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평상피 세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 전이 세포 암종; 유두 전이 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암; 간세포 암종; 간세포 암종과 담관암의 병합 암종; 소주 선암종; 선양 낭포 암종; 선종성 용종의 선암종; 선암종, 가족성 대장 용종증; 고형 암종; 악성 카르시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 혐색소성 암종; 호산성(acidophil) 암종; 호산성(oxyphilic) 선암종; 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비피막형 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 이도 선암종; 점막 표피양 암종; 낭포선암종; 유두 낭포선암종; 장액성 유두 낭포선암종; 점액성 낭포선암종; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 도관 암종; 수질 암종; 소엽성 암종; 염증성 암종; 유방의 페제트병; 선포 세포 암종; 선편평상피 암종; 편평상피 화생이 있는 선암종; 악성 흉선종; 악성 난소 간질성 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포 종양; 악성 남성모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 라이디히(leydig) 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 곁신경절종; 악성 유방외 곁신경절종; 갈색세포종; 사구혈관육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확산성 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유성 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 간질성 육종; 악성 혼합종; 뮬러리안 혼합종; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 중간엽세포종; 악성 브렌너 종양; 악성 엽상 종양; 활막 육종; 악성 중피종; 미분화배세포종; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관 주위 세포종; 림프관 육종; 골육종; 방피질성 골육종; 연골육종; 악성 연골 모세포종; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유윙 육종; 악성 치원성 종양; 법랑질모세포성 치아육종; 악성 법랑질모세포종; 법랑질모세포성 섬유육종; 악성 송과체종; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실 상의 세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상모세포종; 교모세포종; 성긴돌기 아교세포종(oligodendroglioma); 성긴돌기 아교모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경 외배엽 종양; 소뇌 육종; 신경절 모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립상 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 부육아종(paragranuloma); 소형 림프구성 악성 림프종; 확산성 거대 세포 악성 림프종; 여포성 악성 림프종; 균상식육종; 기타 명시된 비호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기구성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모발 세포 백혈병. 하지만, 본 발명은 비암성 질환 (예컨대, 진균성 감염, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 신경퇴행성 질환 및/또는 유전성 질환)을 치료하는데에도 사용될 수 있다.
[0082] 세포에 대하여 사용되는 "접촉된" 및 "노출된"이라는 용어들은 치료제가 표적 세포로 전달되거나 표적 세포와 직접적으로 병치되는 과정을 설명하기 위해 본원에 사용된다. 세포를 사멸시키기 위해, 예를 들어, 해당 세포를 사멸시키거나 해당 세포가 분열하는 것을 방지하는데 효과적인 양으로 하나 이상의 제제를 세포에 전달한다.
[0083] 치료에 대한 환자의 유효 반응 또는 환자의 "반응성"이란 질병 또는 장애에 걸릴 위험이 있거나 해당 질병 또는 장애를 앓고 있는 환자에게 부여되는 임상적 또는 치료적 이점을 가리킨다. 이러한 이점으로는 세포 또는 생체 반응, 완전 반응, 부분 반응, (진행 또는 재발없이) 안정된 질병, 또는 차후 재발하는 반응을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유효 반응이란 암으로 진단받은 환자에서 종양 크기 감소 또는 무진행 생존일 수 있다.
[0084] 치료 결과는 예측하여 모니터링할 수 있고/있거나 이러한 치료로부터 혜택을 받는 환자들은 본원에 기술된 방법을 통해 확인 또는 선택될 수 있다.
[0085] 종양 질환의 치료와 관련하여, 종양 질환의 단계에 따라, 종양 질환의 치료는 종양 조직을 제거하기 위한 수술, 방사선 요법 및 화학요법 중 하나 또는 이들의 조합을 수반한다. 다른 치료 요법들은 항암제, 예컨대 치료 조성물 및 화학요법제의 투여와 조합할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료를 받을 환자는 방사선 요법을 받을 수 있고/있거나 수술을 받을 수도 있다.
[0086] 질환의 치료를 위해, 치료 조성물의 적절한 용량은, 상기 규정한 바와 같이 치료될 질환의 종류, 해당 질환의 중증도 및 경과, 해당 환자의 임상 병력 및 제제에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 좌우될 것이다. 제제는 한번에 투여되거나, 또는 일련의 치료 과정 동안에 걸쳐서 환자에게 적절하게 투여된다.
[0087] 치료 및 예방 방법 및 조성물은 목적하는 효과를 달성하기에 효과적인 총량으로 제공될 수 있다. 조직, 종양 또는 세포는 하나 이상의 제제를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)과 접촉되거나, 또는 조직, 종양 및/또는 세포를 2종 이상의 서로 다른 조성물 또는 제형들과 접촉될 수 있다. 또한, 이러한 병용 요법은 화학요법, 방사선 요법, 수술적 치료 또는 면역요법과 함께 사용될 수 있다.
[0088] 병용 투여는 동일한 제형의 2종 이상의 제제의 동시적 투여, 별도의 제형의 동시적 투여 및 개별적 투여를 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 치료 조성물 및 다른 치료제는 동일한 제형으로 함께 제제화하여 동시에 투여할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 치료 조성물 및 다른 치료제는 동시에 투여될 수 있으며, 이 경우 두 제제는 모두 별도의 제형으로 존재한다. 또 다른 대안으로, 상기 치료제는 다른 치료제를 투여한 직후에 투여하거나, 또는 그 반대로 투여할 수도 있다. 별도의 투여 프로토콜에서, 본 발명의 치료 조성물과 다른 치료제는 몇 분의 간격을 두어, 몇 시간 간격을 두어, 또는 며칠 간격을 두어 투여될 수 있다.
[0089] 제1 항암 치료 (예컨대, 재조합 단백질을 발현하는 엑소좀 또는 엑소좀으로부터 분리된 재조합 단백질과 함께)는 제2 항암 치료와 관련하여 그 전에, 그 동안, 그 후에 또는 이들의 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 동시적 내지 수분 내지 수일 내지 수주까지의 범위 간격으로 이루어질 수 있다. 상기 제1 치료가 제2 치료와는 별도로 환자에 제공되는 실시양태에서, 투여자는 일반적으로 각 전달 시간 사이에 상당한 시간이 경과되지 않도록 함으로써, 상기 두 화합물이 환자에게 유리한 병용 효과를 계속 발휘할 수 있도록 할 것이다. 이러한 경우에, 서로 약 12시간 내지 24시간 또는 72시간 이내에, 보다 구체적으로는 서로 약 6시간 내지 12시간 이내에 환자에게 제1 치료 및 제2 치료를 제공할 수 있을 것이다. 일부 상황에서는, 각 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)의 경과로 치료 기간을 상당 기간 연장하는 것이 바람직할 수도 있다.
[0090] 특정 실시양태에서, 치료 과정은 1-90일 또는 그 이상 (이러한 범위는 중간 조정일을 포함) 지속될 것이다. 한 제제를 1일 내지 90일 중 어느 날 (이러한 범위는 중간 조정일을 포함) 또는 이들을 임의로 조합한 날에 투여할 수 있고, 또 다른 제제를 1일 내지 90일 중 어느 날 (이러한 범위는 중간 조정일을 포함) 또는 이들을 임의로 조합한 날에 투여할 수 있다. 하루 (24시간) 안에, 환자에게 해당 제제(들)을 1회 또는 다회 투여할 수 있다. 또한, 치료 과정 후에, 항암 치료가 실시되지 않는 기간을 두는 것도 고려된다. 이 기간은 환자의 예후, 기운, 건강 등과 같은 환자의 상태에 따라 1-7일 및/또는 1-5주 및/또는 1-12개월 또는 그 이상 (이러한 범위에는 중간 조정일을 포함)이 지속될 수 있다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 것으로 예상된다.
[0091] 다양한 조합들을 사용할 수 있다. 아래 예의 경우, 제1 항암 요법은 "A"이고, 제2 항암 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[0092] 환자에 대한 본 발명의 임의의 화합물 또는 요법의 투여 또는 실시는, 제제들의 독성이 존재하는 경우라면 그의 독성을 고려하여, 상기 화합물의 투여에 대한 일반적인 프로토콜을 따르게 될 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서는 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계를 둔다.
1. 화학요법
[0093] 본 발명에 따르면, 다양한 화학요법제들을 사용할 수 있다. "화학요법"이라는 용어는 암을 치료하기 위해 약물을 사용하는 것을 가리킨다. "화학요법제"는 암 치료시 투여되는 화합물 또는 조성물을 의미하는 것으로 사용된다. 이러한 제제 또는 약물은 세포 내에서의 이들의 활동 방식, 예를 들어 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지의 여부 및 어느 단계에서 영향을 미치는지에 따라 분류된다. 다르게는, 제제는 DNA를 직접 가교결합하거나, DNA에 삽입되거나, 또는 핵산 합성에 영향을 주어 염색체 및 유사분열 변이를 유도하는 그의 능력을 기반으로 특성화시킬 수 있다.
[0094] 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로나파진, 클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네딘 항생제 (예컨대, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마lI 및 칼리케아미신 오메가II); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라, 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질인 에네딘 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라나이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로나놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK다당류 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 엑셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예컨대, CPT-11); 토포아이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라아제 억제제, 트랜스백금, 및 전술한 것들 중 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
2. 방사선요법
[0095] DNA 손상을 유발하는 광범위하게 사용되는 다른 요인으로는 일반적으로 γ-선, X-선 및/또는 종양 세포에 대한 방사성 동위원소의 유도형 전달로 통상적으로 공지된 것들을 포함한다. 마이크로파, 양성자 빔 조사 (미국 특허 5,760,395호 및 4,870,287호) 및 자외선 조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 요인들도 고려된다. 이러한 인자들은 모두 DNA, DNA 전구체, DNA 복제 및 복구, 염색체 조립 및 유지에 광범위하게 손상을 미칠 가능성이 크다. X-선의 조사량 범위는, 장기간 (3주 내지 4주) 동안에는 하루 조사량으로 50 내지 200 ?盧?겐에서부터 단회 조사량으로 2000 내지 6000 ?盧?겐까지의 범위이다. 방사성 동위원소의 조사 범위는 광범위하게 다를 수 있어서, 해당 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도와 종류, 및 신생물 세포의 흡수율에 좌우된다.
3. 면역요법
[0096] 당업자라면 누구나 추가의 면역요법을 본 발명의 방법들과 조합하거나 그와 함께 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 암치료와 관련하여, 면역요법은 일반적으로 암세포를 표적으로 삼아 파괴하는 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙 (RITUXAN®)이 이러한 예이다. 면역 효과기는, 예를 들어, 종양 세포의 표면상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 요법의 효과기로서 기능을 할 수 있거나, 또는 세포 사멸에 실질적으로 영향을 미치는 다른 세포들을 동원할 수도 있다. 또한, 항체는 약물 또는 독소 (화학요법, 방사성 핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합되어 단지 표적화제로만 기능할 수도 있다. 다르게는, 효과기는 종양 세포 표적과 직간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수도 있다. 다양한 효과기 세포로는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
[0097] 면역요법의 한 양태에서, 종양 세포는 표적화가 용이한, 즉 대다수의 다른 세포 상에는 존재하지 않는 일부 마커를 보유하여야 한다. 다수의 종양 마커들이 존재하며, 이들 중 임의의 마커가 본 발명과 관련한 표적화에 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커로는 CD20, 암배아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적인 양태는 항암 효과와 면역 자극 효과를 조합시키는 것이다. 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, γ-IFN, 케모카인, 예컨대 MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예컨대 FLT3 리간드를 포함하는, 면역 자극 분자들도 존재한다.
[0098] 현재 연구 중이거나 사용 중인 면역요법의 예로는 면역 아주반트, 예를 들어, 마이코박테리움 보비스, 플라스모디움 팔시파룸, 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물 (미국 특허 5,801,005호 및 5,739,169호; 문헌 [Hui and Hashimoto, 1998]; [Christodoulides et al., 1998]); 사이토카인 요법, 예를 들어, 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF 및 TNF (문헌 [Bukowski et al., 1998]; [Davidson et al., 1998]; [Hellstrand et al., 1998]); 유전자 요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2 및 p53 (문헌 [Qin et al., 1998]; [Austin-Ward and Villaseca, 1998]; 미국 특허 5,830,880호 및 5,846,945호); 및 단일클론성 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오시드 GM2 및 항-p185 (문헌 [Hollander, 2013]; [Hanibuchi et al., 1998]; 미국 특허 5,824,311호)를 들 수 있다. 하나 이상의 항암 요법들을 본원에 기재된 항체 요법과 함께 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
[0099] 일부 실시양태에서, 면역요법은 면역 체크포인트 억제제일 수 있다. 면역 체크포인트는 신호 (예컨대, 보조 자극 분자)를 증폭시키거나, 신호를 거절한다. 면역 체크포인트 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제성 면역 체크포인트로는 아데노신 A2A 수용체 (A2AR), B7-H3 (CD276으로도 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠기 (BTLA), 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4 (CTLA-4, CD152로도 공지됨), 인돌레아민 2,3-디옥시게나아제 (IDO), 살해 세포 면역글로불린 (KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), 프로그래밍된 사멸 1 (PD-1), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3) 및 T 세포 활성화에 대한 V-도메인 Ig 억제자 (VISTA)를 포함한다. 특히, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적으로 한다.
[00100] 면역 체크포인트 억제제는 리간드 또는 수용체의 재조합체 형태인 소분자와 같은 약물일 수 있거나, 특히 항체, 예컨대 인간 항체이다 (예컨대, 국제 특허 공보 WO2015016718호; 문헌 [Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012]; 상기 문헌 모두 본원에 참조로 포함됨). 면역 체크포인트 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제들이 사용될 수 있으며, 특히 키메라 형태, 인간화 형태, 인간 형태의 항체들이 사용될 수 있다. 당업자가 주지하는 바와 같이, 본 발명에 언급된 특정 항체에 대해서 대안적인 명칭 및/또는 그와 균등한 명칭들이 사용될 수도 있다. 이러한 대안적인 명칭 및/또는 그와 균등한 명칭들은 본 발명의 내용에서 서로 혼용가능하다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 대안적인 명칭 및/또는 그와 균등한 명칭인 MK-3475와 펨브롤리주맙으로도 알려져 있다.
[00101] 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 리간드 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 실시양태에서, PDL1 결합 길항제는 PD-1의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 실시양태에서, PDL2 결합 길항제는 PDL2의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역접합소, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드일 수 있다. 대표적인 항체들은 미국 특허 8,735,553호, 8,354,509호 및 8,008,449호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공되는 방법에 사용하기 위한 다른 PD-1 축 길항제들은, 예컨대 미국 특허 공보 20140294898호, 2014022021호 및 20110008369호에 기술된 바와 같이 당업계에 공지되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다.
[00102] 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체 (예컨대, 인간 항체, 인간화 형태의 항체 또는 키메라 형태의 항체)이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 CT-011로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 면역접합소 [예를 들어, 불변 영역 (예컨대, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역접합소]이다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 및 OPDIVO®로도 알려진 니볼루맙은 WO2006/121168호에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA® 및 SCH-900475로도 알려진 펨브롤리주맙은 WO2009/114335호에 기재된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로도 알려진 CT-011은 WO2009/101611호에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로도 알려진 AMP-224는 WO2010/027827호 및 WO2011/066342호에 기재된 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.
[00103] 본원에 제공된 방법에서 표적으로 삼을 수 있는 또 다른 면역 체크포인트는 CD152로도 알려진 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4 (CTLA-4)이다. 인간 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 수탁번호 L15006으로 등록되어 있다. CTLA-4는 T 세포의 표면에 존재하며, 항원 제시 세포의 표면 상의 CD80 또는 CD86과 결합하는 경우, "오프 (off)" 스위치로 작용한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면 상에 발현되어 T 세포에 억제 신호를 전송하는 면역글로불린 상과 계열의 일원이다. CTLA4는 T 세포 보조 자극 단백질인 CD28과 유사하며, 양 분자 모두 각각 항원 제시 세포 상의 B7-1 및 B7-2로도 불리는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA4는 T 세포에 억제 신호를 전송하는 한편, CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4는 조절 T 세포에서도 발견되며, 이들의 기능에 중요할 수 있다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자의 억제 수용체인 CTLA-4의 발현을 증가시킨다.
[00104] 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체 (예컨대, 인간 항체, 인간 형태의 항체 또는 키메라 형태의 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역접합소, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드이다.
[00105] 본 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-CTLA-4 항체 (또는 그로부터 유래한 VH 및/또는 VL 도메인)는 당업계에 익히 공지되어 있는 방법들을 사용하여 제조할 수 있다. 다르게는, 당업계에 알려져 있는 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 8,119,129호, WO 01/14424호, WO 98/42752호; WO 00/37504호 (CP675,206, 트레멜리무맙으로도 알려짐; 구명칭은 티실리무맙), 미국 특허 6,207,156호; 문헌 [Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071]; [Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (항체 CP-675206)]; 및 [Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304]에 개시된 항-CTLA-4 항체들을 본원에 개시된 방법에 사용할 수 있다. 전술한 공보들의 각 교시내용은 본원에 참조로 포함된다. CTLA-4와 결합하는 것으로 당업계에 알려져 있는 항체들 중 임의의 항체와 경쟁하는 항체들도 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 형태의 CTLA-4 항체가 국제 특허 출원 WO2001014424호, WO2000037504호 및 미국 특허 8,017,114호에 기재되어 있으며; 상기 문헌들은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다.
[00106] 항-CTLA-4 항체의 예로는 이필리무맙 (10D1, MDX-010, MDX-101 및 Yervoy®로도 알려짐) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체 (예컨대, WO 01/14424호 참조)를 들 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 상기 언급한 항체와 동일한 CTLA-4 상의 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/경쟁하거나, 상기에서 언급한 항체와 동일한 CTLA-4 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 90%의 가변 영역 아미노산 서열 동일성 (예컨대, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95% 또는 99%의 가변 영역 동일성)을 가진다.
[00107] CTLA-4를 조절하기 위한 다른 분자들로는, 모두 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5844905호, 5885796호 및 국제 특허 출원 WO1995001994호 및 WO1998042752호에 기재된 것과 같은 CTLA-4 리간드 및 수용체와, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 8329867호에 기재된 것과 같은 면역접합소를 포함한다.
[00108] 일부 실시양태에서, 면역요법은 생체외에서 생성된 자가유래성 항원 특이적 T 세포의 전달을 수반하는 입양 면역요법일 수 있다. 입양 면역요법에 사용되는 T 세포는 항원 특이적 T 세포의 증식 또는 유전공학을 통한 T 세포의 전향에 의해 제조될 수 있다 (Park, Rosenberg et al. 2011). 종양 특이적 T 세포의 분리 및 전달은 흑색종 치료에 성공적인 것으로 나타났다. 유전자이식 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 유전자 전달을 통해 T 세포의 신규한 특이성이 성공적으로 창출된 바 있다 (Jena, Dotti et al. 2010). CAR은 하나의 융합 분자에서 하나 이상의 신호전달 도메인들과 연관된 표적화 모이어티로 이루어진 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 가요성 링커에 의해 연결된 단일클론 항체의 경쇄 및 가변성 단편을 포함하는 단일쇄 항체 (scFv)의 항원 결합 도메인으로 이루어진다. 수용체 또는 리간드 도메인에 기초한 결합 모이어티들도 성공적으로 사용된 바 있다. 1세대 CAR용 신호전달 도메인은 CD3제타의 세포질 영역 또는 Fc 수용체 감마 사슬로부터 유래된다. CAR은 림프종 및 고형 종양을 포함하는 다양한 악성종양들의 종양 세포의 표면에서 발현되는 항원들에 대하여 T 세포들을 성공적으로 전향시킨 바 있다 (Jena, Dotti et al. 2010).
[00109] 한 실시양태에서, 본 출원은 암 치료를 위한 병용 요법을 제공하는데, 여기서 상기 병용 요법은 입양 T 세포 요법 및 체크포인트 억제제를 포함한다. 한 양태에서, 상기 입양 T 세포 요법은 자가유래성 및/또는 동종이계성 T 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 자가유래성 및/또는 동종이계성 T 세포는 종양 항원에 대해 표적화된다.
4. 수술
[00110] 암에 걸린 사람의 약 60%가 예방, 진단 또는 병기결정, 치료 및 완화 수술을 포함하는, 일정 유형의 수술을 받게 될 것이다. 치료 수술은 암 조직의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거, 절개 및/또는 파괴하는 절제술을 포함하며, 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법들과 함께 사용될 수 있다.종양 절제술은 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 가리킨다. 종양 절제술 이외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 저온수술, 전기수술 및 현미경 제어 수술 [모즈 수술 (Mohs' surgery)]을 포함한다.
[00111] 암세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절개시, 체내에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사, 또는 추가의 항암 요법을 사용한 해당 영역에 대한 국소 적용에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다 또는 1, 2, 3, 4 및 5주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복할 수 있다. 이러한 치료 역시 다양한 투여량으로 이루어질 수 있다.
5. 기타 제제
[00112] 기타 다른 제제들을 본 발명의 특정 양태들과 조합해 사용하여 해당 치료의 치료 효능을 개선시키는 것도 고려할 수 있다. 이러한 추가의 제제들은 세포 표면 수용체 및 GAP 접합부의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포 증식 억제제 및 분화제, 세포 부착 억제제, 아폽토시스 유도제에 대한 과증식성 세포의 감응성을 증가시키는 제제, 또는 기타 생물학적 제제를 포함한다. GAP 접합부 수의 증가에 의한 세포간 신호전달의 증가는 인접한 과증식성 세포군에 대한 항-과증식성 효과를 증대시킬 것이다. 다른 실시양태에서, 세포 증식 억제 또는 분화제는 치료의 항-과증식성 효능을 개선시키기 위해, 본 발명의 특정 양태들과 조합하여 사용될 수 있다. 세포 부착 억제제는 본 발명의 효능을 개선시킬 수 있을 것으로 생각된다. 세포 부착 억제제의 예로는 국소 부착 키나제 (FAK) 억제제 및 로바스타틴을 들 수 있다. 추가로, 항체 c225와 같이 치료 효능을 개선시키기 위해, 아폽토시스에 대한 과증식성 세포의 감응성을 증가시키는 다른 제제들을 본 발명의 특정 양태들과 조합하여 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
V. 약제학적 조성물
[00113] CRISPR 시스템을 발현하거나 포함하는 엑소좀을 전신 또는 국소 투여하여 종양 세포 성장을 억제하고, 가장 바람직하게는 국소 진행성 또는 전이성 암이 있는 암 환자에서 암세포를 사멸시킬 수 있다. 이들은 정맥내, 척수강내 및/또는 복강내 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 또는 항증식성 약물과 함께 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들은 수술 또는 다른 절차를 수행하기 전에 환자의 암 부하도를 감소시키기 위해 투여된다. 다르게는, 이들을 수술 후에 투여하여 남아있을 수 있는 암 (예컨대, 수술로 제거하지 못한 암)이 생존하지 못하도록 할 수도 있다.
[00114] 본 발명을 해당 치료 제제의 구체적인 특성에 의해 제한하고자 하는 의도는 없다. 예를 들어, 이러한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 액체, 겔, 고체 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 치료 제제들은 다른 치료제들과 유사한 방식으로 가축에서와 같은 수의용의 포유동물 및 인간의 임상용 포유동물에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능에 필요한 용량은 활용 유형과 투여 방식 뿐만 아니라 개별 대상체의 특수한 요건들에 따라서도 달라질 것이다.
[00115] 임상적으로 활용해야 하는 경우에는, 해당 활용 의도에 적절한 형태로 재조합 단백질 및/또는 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 수도 있다. 일반적으로, 비경구 제형일 수 있는 약제학적 조성물은 유효량의 하나 이상의 재조합 단백질 및/또는 엑소좀 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체에 용해 또는 분산된 추가의 제제들을 포함할 수 있다. "약제학적 또는 약리학적으로 허용가능한"이라는 말은, 예를 들어, 인간과 같은 동물에게 적절하게 투여시 이상 반응, 알러지 반응 또는 기타 뜻하지 않은 반응을 나타내지 않는 성분 의약품 (molecular entities) 및 조성물을 지칭한다. 본원에 개시된 재조합 단백질 및/또는 엑소좀, 또는 추가의 활성 성분들을 포함하는 약제학적 조성물의 제조에 대해서는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990]에 예시되어 있으며, 본 문헌은 여하의 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, 동물 (예컨대, 인간)에게 투여하는 경우, 상기 제제가 FDA 생물의약품국(Office of Biologics) 기준에서 요구하는 무균성, 발열성, 전반적인 안전성 및 순도 기준을 충족해야 함을 이해할 수 있을 것이다.
[00116] 또한, 본 발명의 특정 양태에 따르면, 투여에 적합한 조성물은 불활성 희석제를 함유 또는 함유하지 않는 약제학적으로 허용가능한 담체로 제공될 수 있다. 본원에 사용된 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 당업자에게 공지된 것과 같은 임의의 모든 수성 용매 (예컨대, 물, 알콜/수용액, 에탄올, 식염수, 비경구 비히클, 예컨대 염화나트륨, 링거 덱스트로스 등), 비수성 용매 [예컨대, 지방, 오일, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸올레에이트], 지질, 리포좀, 분산매, 코팅 (예컨대, 레시틴), 계면활성제, 산화방지제, 보존제 [예컨대, 항균제 또는 항진균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 기체, 파라벤 (예컨대, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합], 등장화제 (예컨대, 당 및 염화나트륨), 흡수 지연제 (예컨대, 스테아린산알루미늄 및 젤라틴), 염, 약물, 약물 안정제, 겔, 수지, 충전제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 유체 및 영양 보충제, 이와 유사한 물질들 및 이들의 조합을 포함한다. 상기 담체는 동화될 수 있어야 하며, 액체, 반고체, 즉 페이스트 또는 고체 담체를 포함한다. 또한, 필요하다면, 조성물은 소량의 보조제, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 약제학적 조성물에서 다양한 성분들의 pH 및 정확한 농도는 널리 공지된 파라미터들에 따라 조정한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
[00117] 약제학적으로 허용가능한 담체는, 특히 인간에게 투여하도록 제조되기는 하지만, 특정 실시양태에서는 (예컨대, 정부의 규제로 인해) 인간에게 투여하는 것이 허용되지 않고 인간이 아닌 동물에 투여하도록 제형화되는 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용하는 것이 바람직할 수있다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 함께 사용할 수 없는 경우 (예컨대, 수용 대상체나 해당 담체 내에 함유되어 있는 조성물의 치료적 효능에 유해한 경우)를 제외하고는, 해당 담체의 치료적 조성물 또는 약제학적 조성물에서의 사용은 고려된다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 본 조성물은 임의의 적절하고 실용적인 방식으로, 즉 용해, 현탁, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합된다. 이러한 절차들은 당업자에게는 일반적인 것들이다.
[00118] 본 발명의 특정 실시양태들은 해당 조성물이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여될 것인지의 여부에 따라, 그리고 주사로서의 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는지의 여부에 따라 서로 다른 유형의 담체들을 포함할 수 있다. 본 조성물은 흡입 (예컨대, 에어로졸 흡입)에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포에 대하여 직접적으로 관류욕을 수행함에 의해, 카테터를 통해, 세척술을 통해, 지질 조성물 (예컨대, 리포좀)로, 또는 기타 방법들 또는 상기한 것들의 조합에 의해, 정맥내, 피부내, 경피, 척수강내, 동맥내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 점막, 경구, 국부, 국소 투여될 수 있으며, 이러한 내용에 대해서는 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990]에 기술되어 있다.
[00119] 활성 화합물은 비경구 투여용, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사용으로 제형화될 수 있다. 이러한 이유로, 본 실시양태들은 비경구 제형을 포함한다. 일반적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있으며; 주사하기 전 액체를 첨가하여 용액 또는 현탁액을 제조하는데 사용하기에 적합한 고체 형태 역시 제조될 수 있으며; 해당 제제들은 유화될 수도 있다.
[00120] 본 실시양태에 따르면, 비경구 제형은 본원에 개시된 엑소좀을 하나 이상의 용질 및/또는 용매, 하나 이상의 완충제 및/또는 하나 이상의 항균제, 또는 이들의 임의의 조합과 함께 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 용매는 물, 수용성 용매, 예컨대 에틸 알코올, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 프로필렌 글리콜, 및/또는 불수용성 용매, 예컨대 옥수수유, 면실유, 땅콩유 및/또는 참기름을 비롯한 고정유를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 용질은 하나 이상의 항균제, 완충제, 산화방지제, 등장화제, 동결보호제 및/또는 동결건조보호제를 포함할 수 있다.
[00121] 본 발명에 따른 항균제는 벤질 알콜, 페놀, 수은제 및/또는 파라벤 뿐만 아니라 본 발명의 다른 부분에 제시된 것들도 포함할 수 있다. 항균제로는, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질알코올, 브로노폴, 세트리미드, 염화세틸피리디늄, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로록실레놀, 크레졸, 에틸알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸알코올, 페닐질산수은, 프로필렌 글리콜, 및/또는 티메로살, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 항균제는, 다양한 양태들에서, 약제에 필요한 무균성을 담보하는데 필요한 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 항균제는, 제제, 예컨대 다회분 용량의 용기에 함유된 제제 중에 정균 또는 정진균할 수 있는 농도로 존재할 수 있다. 상기 항균제는, 다양한 실시양태에서, 보존제일 수 있고/있거나, 예를 들어 피하 주사바늘과 주사기로 일부 함량을 추출하는 동안에 의도치 않게 해당 제제에 도입된 미생물과 같이, 미생물의 증식을 방지하기 위해 사용시에 적절한 농도로 존재할 수도 있다. 다양한 양태에서, 항균제는 최대 부피 및/또는 농도 한계 (예컨대, 페닐질산수은 및 티메로살 0.01%, 염화벤제토늄 및 염화벤잘코늄 0.01%, 페놀 또는 크레졸 0.5%, 및 클로로부탄올 0.5%)를 가진다. 다양한 경우에 있어서, 페닐질산수은과 같은 제제들은 0.002%의 농도로 사용된다. 메틸 p-하이드록시벤조에이트 0.18% 및 프로필 p-하이드록시벤조에이트 0.02% 및 벤질 알코올 2%도 해당 실시양태에 따라 사용될 수 있다. 항균제는 헥실레조르시놀 0.5%, 페닐벤조산수은 0.1% 및/또는 치료 화합물을 포함할 수도 있다.
[00122] 본 발명에 따른 산화방지제는 아스코르브산 및/또는 이의 염, 및/또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)의 나트륨 염을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 등장화제는 전해질 및/또는 단당류 또는 이당류를 포함할 수 있다. 동결보호제 및/또는 동결건조보호제란 동결건조 공정 동안 생성물의 동결 및/또는 건조로 인한 해로운 영향으로부터 생물약제를 보호하는 첨가제이다. 동결보호제 및/또는 동결건조보호제는 슈크로스 또는 트레할로스와 같은 (비환원성) 당; 글리신 또는 리신과 같은 아미노산; 액체 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란과 같은 중합체; 및 만니톨 또는 소르비톨과 같은 폴리올을 포함할 수 있으며, 이들은 모두 동결보호제 또는 동결건조보호제로 가능하다. 본 실시양태들은 항진균제, 예컨대 부틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, 프로피온산나트륨 및/또는 소르브산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수도 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 추가의 용질 및 항미생물 제제, 완충제, 산화방지제, 등장화제, 동결보호제 및/또는 동결건조보호제와 이들의 특성, 및 본 발명의 비경구 제형을 제조하는 방법의 양태들에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Ed., 2005](예컨대, 41장)에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 여하의 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참고로 포함된다.
[00123] 주사용으로 적절한 약학적 제형으로는, 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 조제용 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 어떠한 경우에서든, 상기 제형은 멸균되어야 하고, 쉽게 주사될 수 있을 정도로 유동성이 있어야 한다. 또한, 상기 제형은 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아와 진균과 같은 미생물의 오염 활동으로부터 보존되어야 한다.
[00124] 치료제는 유리 염기 형태, 중화 형태 또는 염 형태의 조성물로 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염으로는 산부가염, 예컨대 단백질성 조성물의 유리 아미노기로 형성되거나, 또는 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 것들을 포함한다. 또한, 유리 카르복실기로 형성되는 염은, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기; 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래할 수도 있다. 제제화시, 용액은 해당 제형과 양립가능한 방식으로 그리고 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 상기 제형은 주사용 용액, 또는 폐 전달용 에어로졸과 같이 비경구 투여용으로 제형화되거나, 또는 약물 방출 캡슐 등과 같이 소화관 투여를 위해 제형화되는 것과 같은 여러가지 제형으로 쉽게 투여한다.
[00125] 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 완전히 조합 또는 혼합된다. 상기 혼합은 분쇄와 같은 임의 적절한 방식으로 수행할 수 있다. 해당 조성물의 치료 활성의 손실, 즉 해당 조성물이 위에서 변성되는 것을 방지하기 위해 혼합 공정에서 안정화제를 첨가할 수도 있다. 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예로는, 완충제; 글리신 및 리신과 같은 아미노산; 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 소르비톨, 만니톨 등과 같은 탄수화물을 포함한다.
[00126] 추가의 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 지질 및 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물의 용도에 관한 것일 수 있다. 본원에 사용된 "지질"이라는 용어는 물에 불용성이어서 유기 용매로 추출할 수 있는 것을 특징으로 하는 임의의 광범위한 물질들을 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이러한 광범위한 부류의 화합물들은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, "지질"이라는 용어는 본원에서 사용되는 바와 같이, 이는 임의의 특정한 구조로만 한정되지 않는다. 그 예로는 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 화합물들을 포함한다. 지질은 자연 발생적인 것이거나 합성 (즉, 인간에 의해 설계 또는 제조)될 수 있다. 그러나, 지질은 통상적으로는 생체 물질이다. 생체 지질들은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 중성 지방, 인지질, 포스포글리세리드, 스테로이드, 테르펜, 라이소지질, 글리코스핑고지질, 당지질, 설파티드, 에테르- 및 에스테르-결합 지방산을 함유하는 지질, 중합성 지질 및 이들의 조합을 포함한다. 물론, 당업자에게 지질로서 이해되는 본원에 구체적으로 기재된 것들 이외의 화합물들도 본 조성물과 방법에 포함된다.
[00127] 당업자라면 누구나 지질 비히클에 조성물을 분산시키는데 사용될 수 있는 여러 기법들에 대해서 숙지하고 있을 것이다. 예를 들어, 치료제는 지질을 함유하는 용액 중에 분산되거나, 지질과 함께 용해되거나, 지질과 함께 유화되거나, 지질과 함께 혼합되거나, 지질과 함께 조합되거나, 지질에 공유결합되거나, 지질 중에 현탁물로서 함유되거나, 미셀 또는 리포좀과 함께 함유되거나 복합체화되거나, 또는 그도 아니면 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 지질 또는 지질 구조물과 결합된다. 분산액은 리포좀을 형성하거나 형성하지 않을 수 있다.
[00128] "단위 용량" 또는 "투여량"이라는 용어는 대상체에 사용하기에 적절한 물리적으로 구분된 별개의 단위를 지칭하며, 각 단위는 그의 투여, 즉 적절한 경로 및 치료 처방계획과 관련하여 상기 논의된 목적한 반응을 나타내도록 계산된 사전에 결정된 소정량의 치료 조성물을 함유하고 있다. 치료 횟수와 단위 용량 모두에 따라 투여되는 양은 목적하는 효과에 따라 달라진다. 환자 또는 대상체에게 투여되는 본 발명의 조성물의 실제 투여량은 대상체의 체중, 연령, 건강 및 성별, 치료되는 질환의 종류, 질환의 침투 정도, 기존 또는 현재의 치료적 개입, 해당 환자의 특발성 질환, 투여 경로, 및 구체적인 치료제의 효능, 안정성 및 독성과 같은 물리적 및 생리학적 요인들에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 투여당 약 1 ㎍/kg/체중 내지 약 1000 mg/kg/체중 (이러한 범위는 중간 조정 투여량을 포함함) 이상, 및 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위를 포함할 수도 있다. 본원에 열거된 수치들로부터 유도가능한 범위의 비제한적 예로서, 약 5 ㎍/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 ㎍/kg/체중 내지 약 500 mg/kg/체중 등의 범위를 투여할 수 있다. 투여를 담당하는 의사는 여하튼 조성물 내 활성 성분(들)의 농도와 각 대상체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
[00129] 동물인 환자에 투여되는 조성물의 실제 투여량은 체중, 질환의 중증도, 치료될 질병의 종류, 기존 또는 현재의 치료적 개입, 해당 환자의 특발성 질환과 같은 물리적 및 생리학적 요인들과 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여량과 투여 경로에 따라, 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수도 있다. 투여를 담당하는 의사는 여하튼 조성물 내 활성 성분(들)의 농도와 각 대상체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
[00130] 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 활성 화합물은, 예를 들어 해당 단위의 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 해당 단위의 중량의 약 25% 내지 약 60% 및 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 당연히, 각각의 치료적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물(들)의 양은, 적절한 용량이 임의의 주어진 해당 화합물의 단위 용량 중에 수득되도록 하는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생체 반감기, 투여 경로, 제품 보존 기간 및 기타 약리학적 고려사항들과 같은 요인들이, 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자들에 의해 고려될 것이며, 그런 까닭에 다양한 투여량과 치료 처방계획이 요구될 수 있다.
[00131] 다른 비제한적인 예로서, 용량은 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중 내지 약 1000 밀리그램/kg/체중 또는 그 이상까지, 그리고 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위도 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치들로부터 유도가능한 범위의 비제한적 예로서, 상술한 수치에 기초하여, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위를 투여할 수 있다.
VI. 핵산 및 벡터
[00132] 본 발명의 특정 양태에서, 치료 단백질 또는 치료 단백질을 함유하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 개시될 수 있다. 어떠한 발현 시스템을 사용하느냐에 따라, 핵산 서열은 통상적인 방법에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 각 유전자들 또는 이의 변이체들은 특정 시스템에서의 발현을 위해서 코돈 최적화될 수 있다. 또한, 다양한 벡터들을 사용하여 관심대상 단백질을 발현시킬 수도 있다. 대표적인 벡터로는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포존 또는 리포좀계 벡터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
VII. 재조합 단백질 및 억제성 RNA
[00133] 일부 실시양태들은 재조합 단백질 및 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특정 실시양태는 RNA 유도된 엔도뉴클레아제 활성을 보유하는 재조합 단백질 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 혈청 안정성을 증대시키기 위해 변형될 수도 있다. 따라서, 본 출원에서 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩타이드"의 기능이나 활성을 언급하는 경우, 당업자라면 누구나, 여기에 예를 들어 변형되지 않은 단백질이나 폴리펩타이드에 비해 부가적인 이점을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드가 포함된다는 점을 이해하고 있을 것이다. "변형된 단백질"에 관한 실시양태들은 "변형된 폴리펩타이드"에 대해서도 시행될 수 있고, 그 반대도 역시 가능하다.
[00134] 재조합 단백질은 아미노산의 결실 및/또는 치환을 보유할 수 있기에; 결실이 있는 단백질, 치환이 있는 단백질, 및 결실 및 치환이 있는 단백질은 변형된 단백질이다. 일부 실시양태에서, 이러한 단백질들은, 예를 들어 융합 단백질 또는 링커를 갖는 단백질과 같은 삽입 또는 부가된 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 본래의 단백질 중에서 하나 이상의 잔기가 결핍되어 있지만, 본래 단백질의 특이성 및/또는 활성을 보유할 수 있다. 또한, "변형된 결실 단백질"은 감소된 면역원성 또는 항원성을 보유할 수도 있다. 변형된 결실 단백질의 예로는, 적어도 하나의 항원성 영역, 즉 변형된 해당 단백질이 투여될 수 있는 유형의 유기체와 같은 특정 유기체에서 항원성인 것으로 판단된 단백질의 영역으로부터 아미노산 잔기가 결실된 것을 들 수 있다.
[00135] 치환 또는 치환 변이체는 통상적으로 해당 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 한 아미노산을 다른 아미노산으로 교환하는 것을 포함하며, 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성들, 특히 그의 효과기 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수도 있다. 치환은 보존적인 치환, 다시 말해, 한 아미노산을 유사한 형태와 전하의 아미노산으로 대체하는 것일 수 있거나, 비보존적인 치환일 수도 있다. 보존적 치환은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 다음의 변화를 포함한다: 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 리신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 리신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변화.
[00136] 결실 또는 치환 이외에도, 변형된 단백질에는 잔기가 삽입될 수도 있는데, 이는 통상적으로 폴리펩타이드에 적어도 하나의 잔기를 첨가하는 단계를 수반한다. 이는 표적화 펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 단순히 하나의 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질이라 불리는 말단 부가물에 대해서는 아래에서 논의한다.
[00137] "생체 기능상의 동등물"이라는 용어는 당업계에서 익히 알려져 있으며, 본원에서 더 상세하게 정의한다. 따라서, 해당 단백질의 생물학적 활성이 유지되는 한, 대조군 폴리펩타이드의 아미노산과 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산의 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 81% 내지 약 90%, 또는 심지어 약 91% 내지 약 99%를 갖는 서열이 포함된다. 재조합 단백질은 특정 양태에서 그의 본래 단백질과 생체 기능상 동등할 수 있다.
[00138] 아미노산 및 핵산 서열은, 추가의 잔기, 예컨대 추가의 N- 또는 C- 말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열을 포함할 수는 있으나, 단백질 발현이 관련된 부분에서, 생체 단백질 활성의 유지를 비롯하여 해당 서열이 상기 제시된 기준을 충족하는 한, 그래도 본질적으로는 본원에 개시된 서열들 중 한 서열에 기재된 것과 같을 것이다. 말단 서열의 부가는 특히, 예를 들어, 암호화 영역의 5 '또는 3' 부분에 측접한(flanking) 다양한 비암호화 서열을 포함하거나 또는 다양한 내부 서열들, 즉 유전자 내에서 나타날 수 있는 것으로 알려진 인트론을 포함할 수 있는 핵산 서열에 사용된다.
[00139] 본원에 사용된 단백질 또는 펩타이드란 일반적으로, 이에 제한되지는 않지만, 유전자로부터 해독된 전장 서열 이하의 약 200개 초과의 아미노산의 단백질; 약 100개 초과의 아미노산의 폴리펩타이드; 및/또는 약 3개 내지 약 100개의 아미노산의 펩타이드를 지칭한다. 편의상, "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"라는 용어들은 본원에서 서로 교환하여 사용될 수 있다.
[00140] 본원에 사용된 "아미노산 잔기"는 당업계에 공지된 임의의 천연 아미노산, 임의의 아미노산 유도체 또는 임의의 아미노산 모방체를 가리킨다. 특정 실시양태에서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기들은 아미노산 잔기들의 서열을 중단시키는 임의의 비아미노산이 없이 순차적으로 되어 있다. 다른 실시양태에서, 서열은 하나 이상의 비아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기들의 서열은 하나 이상의 비아미노산 모이어티에 의해 중단될 수 있다.
[00141] 따라서, "단백질 또는 펩타이드"라는 용어는 천연 단백질에서 발견되는 20개의 통상적인 아미노산들 중 적어도 하나의 아미노산, 또는 적어도 하나의 변형되거나 통상적이지 않은 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 망라한다.
[00142] 본 발명의 특정 실시양태는 융합 단백질에 관한 것이다. 이러한 분자들은 N- 또는 C-말단에서 이종 도메인에 결합된 치료 단백질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 융합은 이종성 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용하기 위해 다른 종의 리더 서열을 사용할 수도 있다. 또 다른 유용한 융합에서는, 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 단백질 친화성 태그, 예컨대 혈청 알부민 친화성 태그 또는 6개의 히스티딘 잔기들, 또는 면역학적으로 활성인 도메인, 예컨대 항체 에피토프, 바람직하게는 절단가능한 항체 에피토프와의 부가를 포함한다. 비제한적인 친화성 태그로는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질 (MBP) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)를 포함한다.
[00143] 융합 단백질을 제조하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 이러한 단백질들은, 예를 들어 완전한 융합 단백질의 신생(de novo) 합성에 의해서나, 또는 이종성 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 부착시킨 후 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 제조될 수 있다.
[00144] 모체 단백질의 기능적 활성을 회복시키는 융합 단백질의 생성은, 탠덤 방식으로 연결된 폴리펩타이드들 간에 스플라이싱된 펩타이드 링커를 암호화하는 가교 DNA 분절과 유전자를 연결시킴으로써 촉진될 수 있다. 상기 링커는 생성되는 융합 단백질의 적절한 접힘을 허용하기에 충분한 길이를 가질 것이다.
VIII. 키트 및 진단
[00145] 본 발명의 다양한 양태에서, 체액 또는 조직 배양 배지로부터 엑소좀을 정제하는데 필요한 성분들을 함유하는 키트가 상정된다. 다른 양태에서, 엑소좀을 분리하여 이를 CRISPR 시스템으로 형질감염시키는데 필요한 성분들을 함유하는 키트가 상정된다. 본 키트는 임의의 이러한 성분들을 함유하는 하나 이상의 밀봉된 바이알을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 적절한 용기 수단도 포함할 수 있는데, 이 용기는 상기 키트의 부품들, 예컨대 에펜도르프 튜브, 분석 플레이트, 주사기, 병 또는 튜브와 반응하지 않는 용기이다. 상기 용기는 플라스틱 또는 유리와 같은 멸균가능한 재료로 제조될 수 있다.
[00146] 상기 키트는 본원에 제시된 방법들의 절차적 단계들을 개략적으로 설명하는 지침서를 추가로 포함할 수 있는데, 이것은 본원에 기술된 것과 실질적으로 동일한 절차를 따를 것이거나 당업자에게 공지되어 있다. 상기 지침서의 정보는, 컴퓨터를 사용하여 실행하는 경우에 샘플로부터 엑소좀을 정제하는 단계 및 그 안의 CRISPR 시스템을 형질감염시키거나 전기천공시키는 단계에 대한 실제 또는 가상 절차를 표시하여 보여주는 기계 판독가능 지침들을 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체 내에 존재할 수 있다.
IX. 실시예
[00147] 하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 실시양태를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 실시양태에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1 - 재료와 방법
[00148] 엑소좀의 분리 및 정제. 전술한 바와 같이, 엑소좀을 분별 원심분리 공정에 의해 정제하였다 (문헌 [Alvarez-Erviti et al., 2011]; [El-Andaloussi et al., 2012]). 엑소좀이 결핍된 FBS를 함유하는 배지 중에서 48 시간 동안 배양시킨 세포로부터 상청액을 수집한 후, 800g에서 5분간, 2000g에서 10분간 순차적 원심분리 단계를 거치도록 하였다. 이어서, 상기 생성된 상청액을 배양용 용기에서 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과하고, 펠릿을 2시간의 초원심분리 (Beckman) 후 SW 32 Ti 로터에서 28,000g으로 회수하였다. 상기 상청액을 흡인하여 펠릿을 PBS 중에 재현탁시킨 후, 2시간 더 초원심분리하였다. 다음으로, 상기 정제된 엑소좀을 분석하여 실험 절차에 사용하였다.
[00149] 엑소좀 및 리포좀의 전기천공. 1×108 - 3×108 개의 엑소좀 (nanosight 분석으로 측정) 및 지정량의 RNA를 400 ㎕의 전기천공 완충액 (1.15 mM의 인산칼륨, pH 7.2, 25 mM의 염화칼륨, 21% Optiprep™) 중에서 혼합하였다. 전술한 바와 같이 엑소좀을 Gene Pulser Xcell™ 전기천공 시스템 (BioRad)을 사용하여 4mm 큐벳으로 전기천공시켰다 (문헌 [Alvarez-Erviti et al., 2011]; [El-Andaloussi et al., 2012]). 전기천공 후, 엑소좀을 프로테아제 무함유 RNAse A (Sigma Aldrich)로 처리한 후, 10x 농축된 RNase 억제제 (Ambion)를 첨가하고, 전술한 바와 같이 초원심분리법에 따라 PBS로 세척하였다.
[00150] 엑소좀 형질감염. 엑소좀을 사용한 시험관내 형질감염을 위해, 엑소좀을 상술한 바와 같이 전기천공하여 PBS로 세척하고, 6-웰 플레이트 중의 200,000개의 세포를 각 분석에 대해 기술된 바와 같이 필요 시간 동안 엑소좀으로 처리한 후 PBS로 세척하고 추가의 분석에 사용하였다.
[00151] 실시간 PCR 분석. 제조사의 지침에 따라서, TRIzol® (Invitrogen)을 사용한 총 RNA 정제 후 RNA를 MultiScribe 역전사효소 (Applied Biosystems) 및 oligo-d(T) 프라이머로 역전사시켰다. 실시간 PCR 분석은 SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 ABI PRISM® 7300HT 서열 검출 시스템 기기에서 수행하였다. 관심대상 전사체를 18S 전사체 수준으로 정규화하였다. 각 측정은 3회 수행하였다. 증폭된 표적의 양이 고정된 역치값에 도달하는 부분 주기수인 역치 주기수(Threshold cycle)를 측정하고 2-ΔCt 공식을 사용하여 발현을 측정하였다.
[00152] 웨스턴 블롯. 엑소좀으로 처리한지 24시간 후에 세포의 단백질이 발현하였다는 사실을 도출하기 위해, 세포들을 RIPA 완충액 중에서 수확하고 단백질 용해물을 브래드포드 정량법(Bradford quantification)을 사용하여 정규화하였다. 변성 조건 하에 단백질의 전기영동 분리를 위해 40 ㎍의 용해물을 아크릴아미드 겔 상에 로딩하여 습식 전기영동 전사에 의해 PVDF 막 (ImmobilonP)으로 이동시켰다. 이어서, 상기 막을 PBS/0.05% Tween-20 중의 5% 탈지 분유를 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단하고 적절한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 항체 항온배양 후 세척은 회전 진탕기에서 1×PBS/0.05% Tween®-20을 사용하여 15분 간격으로 3회 수행하였다. 제조사의 지침에 따라서, 막을 피어스(Pierce)사의 화학발광 시약으로 현상하여 필름 상에 화학발광성을 포집하였다.
[00153] CRISPR-Cas9-sgRab27a-2 세포의 형질감염 및 유효성 검증. HEK293T 세포를 72시간 동안 리포펙타민 처리에 의해 CRISPR-Cas9 벡터 대조군 또는 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2로 형질감염시켰다. 다음으로, 세포를 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신으로 10일간 선별하여 안정한 HEK293T CRISPR-Cas9 벡터 대조군 및 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2 세포를 수득하였다. 그 후, 상기 안정한 세포들을 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신을 함유하는 선별 배지를 사용하여 배양하였다. 상술한 바와 같은 안정한 세포주로부터 DNA 및 RNA를 추출하고, qPCR 및 RT-qPCR을 사용하여 Cas9 수준을 측정하였다.
[00154] 엑소좀 수집 및 유효성 검증. 형질감염시키지 않은 HEK293T 세포들 뿐만 아니라 상술한 바와 같은 안정한 HEK293T CRISPR-Cas9 벡터 대조군 및 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2 세포들로부터 엑소좀을 수집하였다. 엑소좀의 품질을 Nanosight로 검증하였다.
[00155] CRISPR-Cas9 게놈 편집. 적절한 벡터의 존재를 담보하여 그 양을 측정하기 위해, 엑소좀 DNA 및 RNA를 추출하고, qPCR 및 RT-qPCR을 수행하여 엑소좀에서의 Cas9 벡터 대조군 수준 및 Rab27a-2에 대한 sgRNA의 수준을 측정하였다. 또한, Cas9 단백질 수준은, 각각 빈쿨린 또는 CD9를 대조군으로 하여, 항-Flag 항체 또는 Cas9 항체를 사용해 웨스턴 블롯에 의하여 세포와 엑소좀 모두에서 평가하였다. T7/SURVEYOR 분석을 이용하여 DNA 편집이 세포와 엑소좀 모두에서 일어났는지의 여부를 알아보았다.
[00156] 엑소좀을 이용한 BxPC-3 선암종 세포의 처리. HEK293T 블랭크 세포, HEK293T CRISPR-Cas9 벡터 대조군 및 안정한 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2 세포들로부터 수집된 3×1010 개의 엑소좀을 상술한 바와 같이 매 24시간마다 BxPC-3 선암종 세포 내에 수용되도록 1회 또는 2회 처리하였다. 수용 대상체 세포로부터 DNA 및 RNA를 추출하고, qPCR 및 RT-qPCR을 사용하여 DNA 및 RNA 모두로부터 Cas9 수준 또는 sgRNA 수준을 측정하였다. 이후, T7/SURVEYOR 분석을 사용하여 수용 대상체인 BxPC-3 세포에서의 편집을 살펴보았다.
[00157] BJ 세포로부터 분리된 CRISPR-Cas9 엑소좀을 사용한 BJ 세포의 처리. 상기와 같이, 엑소좀을 BJ 세포로부터 수집하였다. Nanosight를 사용하여 상기 엑소좀에 대한 유효성을 검증하였다. 웨스턴 블롯으로 엑소좀 마커 CD9, CD81, 플로틸린 및 TSG101을 검출하여 엑소좀을 추가로 확인하였다. 분리하여 유효성을 검증한 1×1010 개의 BJ 엑소좀을 15 ㎍의 CRISPR-Cas9-GFP 플라스미드로 전기천공시킨 후, DNase로 처리하거나 혹은 처리하지 않았다. DNase 처리 후, 엑소좀 DNA를 추출하여 qPCR로 Cas9 수준을 평가하였다. 표준품으로서 CRISPR-Cas9-GFP 플라스미드를 사용하는 절대 qPCR에 의해 복제수를 추가로 계산하였다. 다음으로, DNase로 전기천공시킨 엑소좀을 상술한 바와 같이 24시간 동안 BJ 세포에 형질감염시켰다. 이어서, qPCR 또는 RT-qPCR을 사용하여 DNA 및 mRNA 모두로부터 Cas9 수준을 측정하였다.
[00158] HEK293T/CRISPR-Cas9 배지를 사용한 BxPC-3 세포의 형질도입. 상기와 같이, CRISPR-Cas9 Rab27b-1/2 또는 블랭크 대조군 플라스미드와 함께 패키징 플라스미드를 사용하여 리포펙타민 2000으로 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. 렌티바이러스를 함유하는 배지를 수확한 후 BxPC-3 세포 내로 형질도입하였다. 상기 형질도입된 세포를 0.4 ㎍/㎖의 퓨로마이신으로 추가로 선별하고, BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b 세포의 단일 클론을 골라내어 클론 증식시킨 후, 웨스턴 블롯과 T7/SURVEYOR 분석 모두로 그 유효성을 검증하였다. 이어서, 모든 단일 클론에서 Rab27b 및 Rab27a 단백질 수준을 평가하였다. 또한, T7/SURVEYOR 분석을 사용하여 모든 클론에서 유전자 편집이 일어났음을 검증하였다. BxPC-3/CRISPR-Cas9 벡터 대조군의 안정한 세포 및 단일 클론 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3, BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6을 0.4 ㎍/㎖의 퓨로마이신 함유 선별 배지로 배양하였다. 상기 언급한 세포들로부터 엑소좀, 소위 분비된 엑소좀을 수집한 후, Nanosight 유효성 검증을 수행하였다. 엑소좀 DNA 및 RNA를 추출하고, qPCR을 수행하여 엑소좀 내의 Cas9 수준을 측정한 후, RT-qPCR도 수행하여 Rab27b-1/2에 대한 sgRNA를 검출하였다. Cas9 및 Rab27b 단백질 수준을 웨스턴 블롯에 의해 세포와 엑소좀 모두에서 평가하였고, T7/SURVEYOR 분석을 이용하여 DNA 편집이 세포와 엑소좀 모두에서 일어났는지의 여부를 알아보았다.
[00159] 엑소좀의 단백질 농도에 대한 평가. 상술한 바와 같이 BxPC-3/CRISPR-Cas9 벡터 대조군의 안정한 세포 및 단일 클론 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 클론 3 (C3), BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 클론 6 (C6)을 배양하여, 엑소좀을 수집하였다. BxPC-3/CRISPR-Cas9 벡터 대조군의 안정한 세포 및 단일 클론 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3, BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6으로부터 수집한 엑소좀을 용해시키고 제조사의 지침에 따라 BCA 키트로 단백질 함량을 평가하였다.
[00160] 세포 증식 분석. 세포 증식이 CRISPR-Cas9의 존재 또는 유전자 편집에 의해 영향받지 않는지를 확인하기 위해, 대조군 및 CRISPR-Cas9 처리된 세포를 평가하였다. 100 ㎕의 미처리 BxPC-3 세포, BxPC-3 + CRISPR-Cas9 블랭크 대조군, BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3 및 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6 세포를 96-웰 플레이트에 1×105 개의 세포/㎖의 농도로 분주하였다. 서로 다른 시간대에 MTT 분석을 사용하여 세포 증식을 평가하였다.
[00161] sgRab27b의 시험관내 전사. 시험관내 전사된 sgRab27b를 제조하기 위해, 먼저 sgRab27b-1/2를 PCR로 증폭시킨 후, 상기 PCR 생성물을 Qiagen® PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 sgRab27-1/2의 PCR 생성물을 제조사의 지침에 따라 MEGAshortscript™ 키트(Thermo Fisher Scientific® 카탈로그 번호 1354)를 사용하여 시험관내 전사시켰다. 8M 우레아 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 RNA 품질을 추가로 평가하였다. 시험관내 전사된 Cas9를 제조하기 위해, Cas9를 PCR로 증폭시키고, 상기 PCR 생성물을 Qiagen® PCR 정제 키트를 사용하여 추가로 정제하였다. 정제된 Cas9 PCR 생성물을 mMESSAGE mMACHINE® T7 울트라 키트를 사용하여 시험관내 전사시켰다. 포름알데히드 겔을 사용하여 Cas9 RNA 품질을 살펴보았다.
[00162] 시험관내 전사된 RNA를 사용한 세포의 처리. 형질감염 및 CRISPR-Cas9 효율성을 평가하기 위해, HEK293T/CRISPR-Cas9 벡터 대조군 세포를 리포펙타민 2000, Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약 또는 전기천공된 엑소좀을 사용하여 1 ㎍의 IVT-sgRab27b RNA로 72시간 동안 형질감염시켰다. 형질감염 후, DNA를 추출하고, T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 유전자 편집이 일어났는지의 여부를 확인하였다. HEK293T 세포 및 BxPC-3 세포를 리포펙타민 2000, Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약을 사용하여 Cas9 mRNA로 형질감염시키거나, 또는 Cas9 mRNA로 전기천공시킨 1×109 개의 MSC 엑소좀으로 48시간 동안 처리하였다. 웨스턴 블롯을 수행하여 Cas9 단백질 수준을 측정하였다.
[00163] Exo-Fect/엑소좀 처리에 대한 평가. Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약을 사용하여 Hekt293T 세포를 10 ㎍의 플라스미드 (CRISPR-Cas9-렌티-V2 벡터 대조군, CRISPR-Cas9-렌티-V2-sgRab27b-1, CRISPR-Cas9-GFP 벡터 대조군)로 매 24시간마다 4회 (1, 2, 3, 4일) 처리하였다. 5일째에 CRISPR-Cas9-GFP 세포를 촬영하여 GFP 발현을 측정하였다. 또한, 5일째에 핵산 및 단백질 분리를 위해 세포들도 수집하였다. DNA, RNA 및 단백질을 추출하였다. 각 플라스미드로 형질감염시킨 세포들에 대한 상대적인 Cas9 발현 수준 및 1/Ct 값을 qPCR로 측정하고, 웨스턴 블롯을 사용하여 Cas9 단백질 수준을 검출하였다. CRISPR-Cas9-렌티-V2-sgRab27b-1 플라스미드로 처리한 후 HEK293T 세포에서 유전자 편집이 일어났는지를 알아보기 위해 T7/SURVEYOR 분석을 수행하였다. 동일한 실험을 BxPC-3 세포에서도 반복하였다.
[00164] KPC689 세포의 sgmKras 편집. 리포펙타민 2000을 사용하여 5 ㎍의 대조군 플라스미드, 또는 CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D-렌티-V2 플라스미드로 KPC689 세포를 48시간 동안 형질감염시켰다. 형질감염 후, CRISPR-Cas9-GFP 벡터 대조군 세포를 촬영하여 형질감염 효율성을 측정하였다. DNA, RNA 및 단백질을 상기와 같이 모든 배양물들로부터 추출하였다. 상대적인 Cas9 및 mKrasG12D 발현 수준을 qPCR로 측정하고, 상기와 같이 T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 리포펙타민에 의한 형질감염 후 KPC689 세포에서 유전자 편집이 일어났는지의 여부를 확인하였다. Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약을 사용하여 신선한 KPC689 세포를 GFP 백본을 갖는 CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D의 10 ㎍의 플라스미드 및 그의 벡터 대조군으로 매 24시간마다 3일간 처리하였다. 형질감염 효율성을 측정하기 위해 세포들을 GFP 발현에 대해 촬영하고, 4일째에 수집하였다. DNA, RNA 및 단백질을 추출하고, qPCR로 상대적인 Cas9 및 mKRasG12D 발현 수준을 측정하였다. CRISPR-Cas9-GFP-mKrasG12D 플라스미드로 처리한 후 KPC689 세포에서 유전자 편집을 확인하기 위해 T7/SURVEYOR 분석을 수행하였다.
[00165] 독시사이클린 유도성 CRISPR-Cas9 플라스미드의 형질감염 및 유효성 검증. HEK293T 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 CRISPR-Cas9 독시사이클린 유도성 플라스미드와 함께 렌티바이러스 패키징 플라스미드의 혼합물로 형질감염시켰다. 렌티바이러스를 함유하는 배지를 수확한 후 Panc1 세포 내로 형질도입하였다. 상기 형질도입된 세포를 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신으로 추가로 선별하였다. 상기 유도성 Cas9를 함유하는 안정한 Panc1 세포를 1 ㎍/㎖의 독시사이클린으로 배양하여 유지시켰다. 독시사이클린으로 처리하거나 처리하지 않은 Panc1 유도성 세포로부터 엑소좀을 수집하였다. 웨스턴 블롯을 사용하여 세포와 엑소좀 모두에서 Cas9 단백질 수준을 확인하였다. 상기 Panc1 유도성 세포를 리포펙타민, 퓨진 또는 Exo-Fect를 사용하여 hKrasG12D에 대한 2㎍의 IVT-sgRNA, 1㎍의 hKrasG12D 플라스미드로 72시간 동안 처리하였다. 이어서, T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 Panc1 유도성 세포에서의 유전자 편집을 확인하였다.
[00166] CRISPR-Cas9-sghKRas G12D 를 이용한 Panc1 세포주의 처리. Panc1-Cas9 및 Panc1 sghKrasG12D T1의 안정한 세포들을 렌티바이러스 기반의 방법을 사용하여 확립하였다. Panc1-Cas9 세포에서 Cas9 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 형질감염시키지 못한 Panc1 세포는, 리포펙타민, Exo-Fect 또는 전기천공된 엑소좀을 사용하여 렌티-V2, GFP, 퓨로마이신 백본의 CRISPR-Cas9-sghKrasG12D로 처리하였다. Panc1-Cas9 안정한 세포들은 리포펙타민, Exo-Fect 또는 전기천공된 엑소좀을 사용하여 sghKrasG12D 플라스미드로 처리하고, Panc1 sghKrasG12D T1의 안정한 세포들은 GFP 또는 퓨로마이신 백본을 갖는 10 ㎍ 또는 20 ㎍의 Cas9 플라스미드로 24시간 동안 형질감염시켰다. T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 유전자 편집이 일어났는지를 확인하였다.
[00167] 생체내 이식된 KPC689 종양의 치료. KPC689 세포를 각 마우스의 등에 피하 이식하였다. 상기 마우스들을 그룹당 1마리 또는 2마리로 하여 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1은 1×109 개의 엑소좀 및 10 ㎕의 Exo-Fect로 처리하였다. 그룹 2는 10 ㎍의 Cas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1 플라스미드로 처리하였다. 그룹 3은 1×109 개의 엑소좀, 10 ㎍의 Cas9-GFP-벡터 대조군 플라스미드 및 10 ㎕의 Exo-Fect로 처리하였다. 그룹 4는 1×109 개의 엑소좀, 10 ㎍의 Cas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1 플라스미드 및 10 ㎕의 Exo-Fect로 처리하였다. 각 그룹의 마우스들에게 2주간 매일 정맥내 (I.V.) 및 종양내 (I.T.) 주사하였다. 종양 길이 (a, mm)와 폭 (b, mm) 및 체중을 측정하고 종양 부피를 계산하였다.
실시예 2 - CRISPR-Cas9 엑소좀의 확립
[00168] CRISPR-Cas9 벡터 대조군 및 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2로 형질감염시킨 HEK293T로부터 DNA 및 RNA를 추출하고, 실시간 정량 PCR (qPCR)을 사용하여 Cas9 수준을 측정하였다 (도 1a). 두 벡터 모두 효율적으로 형질감염되었고, 상기 형질감염된 세포는 β-액틴 대조군에 비해 Cas9 발현이 상당히 높게 나타났다. HEK293T 블랭크 세포들 뿐만 아니라 안정한 HEK293T CRISPR-Cas9 벡터 대조군 및 CRISPR-Cas9-sgRab27a-2 세포들로부터 엑소좀을 수집하였다. 엑소좀의 Nanosight 유효성 검증에 대해서는 도 1b에서 볼 수 있다. 엑소좀 DNA 및 RNA를 추출하고, qPCR을 수행하여 엑소좀 내의 Cas9 수준 뿐만 아니라 Rab27a-2에 대한 sgRNA도 검출하였다. 상기 세포들과 유사하게, 벡터 대조군 및 가이드 RNA를 갖는 벡터 모두 엑소좀에서 발현되었다 (도 1c). Cas9 발현을 확인하기 위해, 각각 빈쿨린 또는 CD9를 대조군으로 하여, 항-Flag 항체 또는 Cas9 항체를 사용해 웨스턴 블롯에 의하여 세포와 엑소좀 모두에서 Cas9 단백질 수준을 평가하였다 (도 1d). T7/SURVEYOR 분석을 사용하여 세포와 엑소좀 모두에서 DNA 편집을 확인하였고, 상기 DNA 편집은 도 1e 및 1f의 부분의 박스 내에 보여진다. 엑소좀 처리된 BxPC-3 세포들을 Cas9 DNA의 존재 및 Cas9 발현에 대해서도 평가하였다 (도 1g 및 1h). 도 1g에서 볼 수 있는 바와 같이, 2회 처리된 세포에서는 Cas9 DNA가 증가하였다. 엑소좀 처리된 BxPC-3 세포들을 가이드 RNA의 존재에 대해 시험하여 이의 존재를 확인하는데 (도 2a 및 2c), DNA는 명백이 나타났지만, RNA 발현은 없었다. 이는 T7/SURVEYOR 분석에서 활성의 결핍에 의하여 확인되었다 (도 2b).
[00169] BJ 세포로부터 엑소좀을 수집하여, 도 3a에 도시된 바와 같이 nanosight 분석에 의해 확인하였다. 웨스턴 블롯으로 엑소좀 마커 CD9, CD81, 플로틸린 및 TSG101을 검출하여 엑소좀을 추가로 확인하였다 (도 3b). BJ 엑소좀을 15 ㎍의 CRISPR-Cas9-GFP 플라스미드로 전기천공시킨 후, DNase로 처리하거나 혹은 처리하지 않았다. Cas9 DNA는 DNase로 처리되지 않은 샘플에서 강하게 검출되었고, 플라스미드만을 함유하는 샘플보다 엑소좀과 플라스미드를 모두 함유하는 샘플을 DNase로 처리한 경우에서 더 효율적으로 검출되었다 (도 3c). 1/Ct 값으로 만든 표준 곡선을 사용하여 플라스미드 복제수를 측정하였다 (도 3c). DNase로 전기천공된 엑소좀을 24시간 동안 BJ 세포 내에 수용되도록 처리하였는데, 블랭크 엑소좀과 비교하였을 때 DNA와 mRNA 모두에서 Cas9 수준을 증가시켰다 (도 3d).
[00170] CRISPR-CAS9 Rab27b-1/2 플라스미드를 함유하는 렌티 바이러스 배지로 형질도입된 클론 증식된 BxPC-3 세포들에 대해서 웨스턴 블롯 (도 4a)과 T7/SURVEYOR 분석 (도 4b)을 모두 이용하여 그 유효성을 검증하였다. 2개의 클론이 활성인 것으로 나타났으며, 도 4b에 박스로 도시되어 있다. BxPC-3/CRISPR-Cas9-Rab27b-1 클론 3 (C3) 및 BxPC-3/CRISPR-Cas9-Rab27b-2 클론 6 (C6)을 추가의 실험에 사용하였다. BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3 및 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6을 0.4 ㎍/㎖의 퓨로마이신을 함유하는 선별 배지와 함께 배양하고, DNA 및 RNA를 추출하였다. Cas9 DNA의 존재는 qPCR로 확인하였던 한편, Cas9 발현은 RT-qPCR로 확인하였는데, 이는 벡터 대조군 세포들의 경우에서보다 상당히 높은 것으로 나타났다 (도 5a). 이러한 세포들로부터 엑소좀을 수집하고 nanosight 분석에 의해 확인하였다 (도 5b). 엑소좀 DNA 및 RNA를 추출하고, qPCR을 수행하여 엑소좀에서의 Cas9 수준을 측정하였는데, BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6이 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C3의 경우보다 현저히 더 강한 Cas9 발현을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 5c). 이는 Rab27b-1/2에 대한 sgRNA의 검출에 의해 확인되었다 (도 5c, 아래). Cas9 및 Rab27b 단백질 수준은 각각 대조군으로서 β-액틴 또는 CD9와 함께 웨스턴 블롯에 의해 세포와 엑소좀 모두에서 평가했던 결과, Rab27b는 가이드 RNA를 운반하는 세포와 엑소좀에서 녹다운되는 것으로 나타났다 (도 5d). 2개의 서로 다른 프라이머 세트 (도 5e 및 5f)를 사용하는 T7/SURVEYOR 분석을 사용하여 세포와 엑소좀 모두에서 DNA 편집을 확인하였는데, 이는 박스 영역의 어두운 밴드로 나타나있다.
[00171] BxPC-3/CRISPR-Cas9 벡터 대조군의 안정한 세포 및 클론 증식된 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3 및 BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6 세포의 엑소좀 단백질 함량을 BCA로 평가하였다 (도 6a). 세포 증식을 MTT 분석으로 평가하였는데, CRISPR-Cas9의 존재는 증식에 부정적인 영향을 주지 않았다 (도 6b).
[00172] IVT RNA를 이용한 형질감염. sgRab27b-1/2를 PCR로 증폭시켜 정제하였다 (도 7a). 이후, 상기 정제된 sgRab27-1/2의 PCR 생성물을 상술한 바와 같이 시험관내 전사시키고 그 품질을 분석하기 위해 변성 겔상에 가동시켰다 (도 7a, 오른쪽). Cas9를 PCR로 증폭시켜 정제하였다 (도 7b). 정제된 Cas9 PCR 생성물을 시험관내 전사시키고 포름알데히드 겔상에서 전기영동하여 검출하였다 (도 7b). HEK293T/CRISPR-Cas9 벡터 대조군 세포를 리포펙타민 2000 (도 7c), Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약 (도 7d) 또는 전기천공된 엑소좀 (도 7e)을 사용하여 1 ㎍의 IVT-sgRab27b RNA로 72시간 동안 처리하였다. RNA 및 리포펙타민 또는 엑소좀 형질감염 시약 (도 7c 및 7d)으로 처리된 세포에서는 유전자 편집이 확인되었으나, 엑소좀을 이용한 경우에서는 그렇지 않았다. HEK293T 세포와 BxPC-3 세포 모두 리포펙타민 2000, Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약을 사용하여 Cas9 mRNA로 형질감염시키거나, 또는 48시간 동안 Cas9 mRNA로 전기천공시킨 MSC 엑소좀으로 처리하였던 결과, 역시 리포펙타민 또는 엑소좀 형질감염 시약을 이용한 형질감염만이 웨스턴 블롯에서 Cas9를 발현하는 세포를 생성하였다 (도 7f 및 7g). HEK293T 세포와 Cas9 벡터를 갖는 BxPC-3 세포 모두에 대한 Cas9 대조군을 도 8a-8c에 나타내었다.
[00173] HEK293T 및 BxPC-3 형질감염 및 유전자 편집. HEK293T 세포를 Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약을 사용하여 10 ㎍의 플라스미드 (CRISPR-Cas9-렌티-V2 벡터 대조군, CRISPR-Cas9-렌티-V2-sgRab27b-1, CRISPR-Cas9-GFP 벡터 대조군)로 매 24시간마다 4회 (1, 2, 3, 4일) 처리하고, Cas9-GFP 형질감염된 세포들에 대해 형질감염 효율을 살펴보았다 (도 9a). 상대적인 Cas9 발현 수준 및 1/Ct 값을 qPCR로 측정하고 (도 9b), 웨스턴 블롯으로 Cas9의 존재를 확인하였다 (도 9c). T7/SURVEYOR 분석으로 유전자 편집을 확인하였다 (도 9d). 동일한 실험을 BxPC-3 세포에서도 수행하였으나, T7/SURVEYOR 분석에서 검출가능한 유전자 편집은 나타나지 않았다 (도 9e-9g).
[00174] KPC689 형질감염 및 유전자 편집. 리포펙타민 2000을 사용하여 48시간 동안 5 ㎍의 플라스미드 (렌티-V2, GFP, 퓨로마이신 백본을 갖는 CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D 및 그의 벡터 대조군들)로 KPC689 세포를 형질감염시킨 후, GFP 백본의 세포들을 촬영하여 형질감염을 확인하였다 (도 10a). 상대적인 Cas9 수준 (도 10b) 및 mKrasG12D 수준 (도 10c)을 qPCR로 측정하고, T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 KPC689 세포에서의 유전자 편집을 확인했지만, 나타나지 않았다 (도 10d). 상술한 경우와 유사하게, KPC689 세포를 Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약을 사용하여 10 ㎍의 플라스미드 (GFP 백본을 갖는 CRISPR-Cas9-sgmKrasG12D 및 그의 벡터 대조군)로 처리한 후, GFP 형질감염된 세포들을 촬영하여 Exo-Fect/엑소좀 형질감염 시약의 형질감염 효율을 확인하였다 (도 10e). 상대적인 Cas9 발현 수준 (도 10f) 및 mKrasG12D 수준 (도 10g)을 qPCR로 측정하였다. CRISPR-Cas9-GFP-mKrasG12D 플라스미드로 처리한 후 KPC689 세포에서 유전자 편집을 확인하기 위해 T7/SURVEYOR 분석을 수행하였으나, 편집은 보이지 않았다 (도 10h).
[00175] 엑소좀 함유 세포에서 유도성 플라스미드를 사용한 처리. HEK293T 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 CRISPR-Cas9 독시사이클린 유도성 플라스미드와 함께 패키징 플라스미드로 형질감염시켰다. 렌티바이러스를 함유하는 배지를 수확한 후 Panc1 세포 내로 형질도입하였다. 상기 형질도입된 세포들을 퓨로마이신으로 선별하여 독시사이클린으로 유지시켰다. 독시사이클린으로 처리되거나 처리되지 않은 Panc1 유도성 세포들로부터 엑소좀을 수집하고, 웨스턴 블롯을 이용하여 세포와 엑소좀에서 Cas9 단백질 수준을 확인하였다 (도 11a 및 11b). 상기 Panc1 유도성 세포들을 리포펙타민, 퓨진 또는 Exo-Fect를 이용하여 hKrasG12D에 대한 2 ㎍의 IVT-sgRNA, 1 ㎍의 hKrasG12D 플라스미드로 72시간 동안 처리한 후, T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 Panc1 유도성 세포에서의 유전자 편집을 확인하였는데, 가이드 RNA의 플라스미드로 리포펙타민 중에서 형질감염시킨 세포들에서만 유전자 편집이 나타났다 (도 11c). 웨스턴 블롯으로 Pacn1 Cas9 안정한 세포들에서 Cas9 단백질 수준을 측정하였다 (도 11d). Panc1 세포들은 리포펙타민, Exo-Fect 또는 전기천공된 엑소좀을 사용하여 렌티-V2, GFP, 퓨로마이신 백본을 갖는 CRISPR-Cas9-sghKrasG12D로 처리하였던 반면, Panc1 Cas9 안정한 세포들은 보이는 바와 같이 리포펙타민, Exo-Fect 또는 전기천공된 엑소좀을 사용하여 sghKrasG12D 플라스미드로 처리하였으며, T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 상기 Panc1 세포와 Panc1 Cas9 안정한 세포에서 유전자 편집을 확인하였다 (도 11e). 유전자 편집은, 박스 영역에 보이는 바와 같이, 퓨로마이신 백본의 Cas9로 형질전환된 Panc1 세포들에서 뿐만 아니라 리포펙타민 또는 Exo-Fect를 사용하여 가이드 RNA로 형질감염시킨 Panc1-Cas9 안정한 세포주에서도 나타났다 (도 11e). 렌티바이러스 기반 방법을 사용하여 Panc1 sghKrasG12D T1 안정한 세포를 확립하였다. 상기 Panc1 sghKrasG12D T1 안정한 세포를 24시간 동안 GFP 또는 퓨로마이신 백본을 갖는 10 ㎍ 또는 20 ㎍의 Cas9 플라스미드로 형질감염시킨 후, T7/SURVEYOR 분석을 수행하여 Panc1 sghKrasG12D T1 안정한 세포에서 유전자 편집을 확인하였다 (도 11f).
[00176] 엑소좀 및 CRISPR-Cas9로 유도된 종양의 치료. KPC689 세포를 마우스의 등에 피하 이식하였다. 상기 마우스들을 4개의 그룹으로 나누고, 하기에 나타낸 바와 같이 처리하였다 (도 12a 및 12b). 각 그룹의 마우스들에게 2주간 매일 정맥내 (I.V.) 및 종양내 (I.T.) 주사하고, 종양 부피를 평가하였다 (도 12a). 엑소좀 및 형질감염제를 이용한 처리는 종양 증식을 늦추지 못했지만, 엑소좀, 가이드 RNA 플라스미드를 갖는 Cas9 및 형질감염제를 사용한 처리는 치료 기간 동안 및 그 이후에도 종양 증식을 방지하였다 (도 12a). 또한, 마우스의 체중도 평가하였는데, 모든 그룹에서의 처리는 체중에 부정적인 영향을 주지 않았다 (도 12b).
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[00177] 본원에 개시되어 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 미루어 보면 과도한 실험없이 준비하여 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 실시양태의 양태에서 기재하였으나, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 방법 및 이러한 방법의 단계 또는 상기 단계들의 순서에 다양한 변화들을 적용할 수 있음은 당업계의 통상의 기술자들에게는 자명한 사항일 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련이 있는 특정 제제들은, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있는 것이라면 본원에 기술된 제제들을 대신할 수 있음은 자명한 사항일 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌들은, 본 명세서에 기재된 예시적인 절차 또는 기타 세부적인 내용을 제공하는 하는 범위 내에서, 본원에 참고로 인용된다.
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Claims (93)

  1. 엑소좀을 포함하는 조성물로서, 상기 엑소좀이 그 표면에 CD47을 포함하고, 상기 엑소좀이 CRISPR 시스템을 포함하는 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CRISPR 시스템이 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 Cas 엔도뉴클레아제인 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 Cas9 엔도뉴클레아제인 것인, 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 Cpf1 엔도뉴클레아제인 것인, 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 단일 gRNA인 것인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단일 gRNA가 CRISPR-RNA (crRNA)인 것인, 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 단일 gRNA가 crRNA 및 전사 활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)의 융합물을 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  10. 제2항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA가 엑소좀 내의 하나의 핵산 분자 상에 암호화되는 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 CRISPR 시스템이 질환 유발 돌연변이를 표적으로 삼는 것인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 질환 유발 돌연변이가 암 유발 돌연변이인 것인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 암 유발 돌연변이가 종양유전자 내의 활성화 돌연변이인 것인, 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 암 유발 돌연변이가 종양 억제 유전자 내의 억제성 돌연변이인 것인, 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 암 유발 돌연변이가 KrasG12D인 것인, 조성물.
  16. 제2항에 있어서, 적어도 50%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 적어도 60%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 적어도 70%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 적어도 80%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 적어도 90%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 엑소좀 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 비경구 투여용으로 제형화되는, 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사용으로 제형화되는, 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 항균제를 추가로 포함하는, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항균제가 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질알코올, 브로노폴, 세트리미드, 염화세틸피리디늄, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로록실레놀, 크레졸, 에틸알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸알코올, 페닐질산수은, 프로필렌 글리콜 또는 티메로살인 것인, 조성물.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 조성물을 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 상기 환자의 질환을 치료하는 단계를 포함하는 환자의 질환을 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 투여가 상기 환자의 질환이 생긴 세포에서 유전자 편집을 유도하는 것인, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 질환이 암인 것인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 암이 췌장관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma)인 것인, 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 투여가 전신 투여인 것인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 전신 투여가 정맥내 투여인 것인, 방법.
  32. 제26항에 있어서, 환자에게 적어도 제2 요법을 실시하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제2 요법이 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 저온요법, 호르몬 요법 또는 면역요법을 포함하는 것인, 방법.
  34. 제26항에 있어서, 상기 환자가 인간인 것인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 엑소좀이 환자에 대하여 자가 유래성인 것인, 방법.
  36. 환자의 질병을 치료하는데 사용하기 위한 엑소좀을 포함하는 조성물로서, 상기 엑소좀이 그 표면에 CD47을 포함하고, 상기 엑소좀이 CRISPR 시스템을 포함하는 것인, 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 CRISPR 시스템이 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 것인, 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 Cas 엔도뉴클레아제인 것인, 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 Cas9 엔도뉴클레아제인 것인, 조성물.
  40. 제37항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 Cpf1 엔도뉴클레아제인 것인, 조성물.
  41. 제37항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 단일 gRNA인 것인, 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 단일 gRNA가 CRISPR-RNA (crRNA)인 것인, 조성물.
  43. 제41항에 있어서, 상기 단일 gRNA가 crRNA 및 전사 활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)의 융합물을 포함하는 것인, 조성물.
  44. 제37항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  45. 제36항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA가 엑소좀 내의 하나의 핵산 분자 상에 암호화되는 것인, 조성물.
  46. 제36항에 있어서, 상기 CRISPR 시스템이 질환 유발 돌연변이를 표적으로 삼는 것인, 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 질환 유발 돌연변이가 암 유발 돌연변이인 것인, 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 암 유발 돌연변이가 종양유전자 내의 활성화 돌연변이인 것인, 조성물.
  49. 제47항에 있어서, 상기 암 유발 돌연변이가 종양 억제 유전자 내의 억제성 돌연변이인 것인, 조성물.
  50. 제47항에 있어서, 상기 암 유발 돌연변이가 KrasG12D인 것인, 조성물.
  51. 제37항에 있어서, 적어도 50%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 적어도 60%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 적어도 70%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 적어도 80%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 적어도 90%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 조성물.
  56. 제36항에 있어서, 상기 투여가 상기 환자의 질환이 생긴 세포에서 유전자 편집을 유도하는 것인, 조성물.
  57. 제36항에 있어서, 상기 질환이 암인 것인, 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 암이 췌장관 선암종인 것인, 조성물.
  59. 제36항에 있어서, 비경구 투여용으로 제형화되는, 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사용으로 제형화되는, 조성물.
  61. 제59항에 있어서, 항균제를 추가로 포함하는, 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 상기 항균제가 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질알코올, 브로노폴, 세트리미드, 염화세틸피리디늄, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로록실레놀, 크레졸, 에틸알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸알코올, 페닐질산수은, 프로필렌 글리콜 또는 티메로살인 것인, 조성물.
  63. 제36항에 있어서, 환자에게 적어도 제2 요법제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 제2 요법이 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 저온요법, 호르몬 요법 또는 면역요법을 포함하는 것인, 조성물.
  65. 제36항에 있어서, 상기 환자가 인간인 것인, 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 엑소좀이 환자에 대하여 자가 유래성인 것인, 조성물.
  67. 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 엑소좀의 용도로서, 상기 엑소좀이 그 표면에 CD47을 포함하고, 상기 엑소좀이 CRISPR 시스템을 포함하는 것인, 용도.
  68. 제67항에 있어서, 상기 CRISPR 시스템이 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 것인, 용도.
  69. 제68항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 Cas 엔도뉴클레아제인 것인, 용도.
  70. 제69항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 Cas9 엔도뉴클레아제인 것인, 용도.
  71. 제68항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 Cpf1 엔도뉴클레아제인 것인, 용도.
  72. 제68항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 단일 gRNA인 것인, 용도.
  73. 제72항에 있어서, 상기 단일 gRNA가 CRISPR-RNA (crRNA)인 것인, 용도.
  74. 제72항에 있어서, 상기 단일 gRNA가 crRNA 및 전사 활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)의 융합물을 포함하는 것인, 용도.
  75. 제68항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 것인, 용도.
  76. 제68항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA가 엑소좀 내의 하나의 핵산 분자 상에 암호화되는 것인, 용도.
  77. 제67항에 있어서, 상기 CRISPR 시스템이 질환 유발 돌연변이를 표적으로 삼는 것인, 용도.
  78. 제77항에 있어서, 상기 질환 유발 돌연변이가 암 유발 돌연변이인 것인, 용도.
  79. 제78항에 있어서, 상기 암 유발 돌연변이가 종양유전자 내의 활성화 돌연변이인 것인, 용도.
  80. 제78항에 있어서, 상기 암 유발 돌연변이가 종양 억제 유전자 내의 억제성 돌연변이인 것인, 용도.
  81. 제78항에 있어서, 상기 암 유발 돌연변이가 KrasG12D인 것인, 용도.
  82. 제68항에 있어서, 적어도 50%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 용도.
  83. 제82항에 있어서, 적어도 60%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 용도.
  84. 제83항에 있어서, 적어도 70%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 용도.
  85. 제84항에 있어서, 적어도 80%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 용도.
  86. 제85항에 있어서, 적어도 90%의 엑소좀이 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 포함하는 것인, 용도.
  87. 제67항에 있어서, 상기 질환이 암인 것인, 용도.
  88. 제87항에 있어서, 상기 암이 췌장관 선암종인 것인, 용도.
  89. 제67항에 있어서, 상기 약제가 비경구 투여용으로 제형화되는 것인, 용도.
  90. 제67항에 있어서, 상기 약제가 전신 투여용으로 제형화되는 것인, 용도.
  91. 제89항에 있어서, 상기 약제가 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사용으로 제형화되는, 용도.
  92. 제67항에 있어서, 상기 약제가 항균제를 포함하는 것인, 용도.
  93. 제92항에 있어서, 상기 항균제가 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질알코올, 브로노폴, 세트리미드, 염화세틸피리디늄, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로록실레놀, 크레졸, 에틸알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸알코올, 페닐질산수은, 프로필렌 글리콜 또는 티메로살인 것인, 용도.
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