CN107034188B - 一种靶向骨的外泌体载体、CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用 - Google Patents

一种靶向骨的外泌体载体、CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种靶向骨的外泌体载体、CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用，所述外泌体载体包括靶向骨形成表面、骨吸收表面或内皮细胞中的任意一种的靶向肽。本发明通过对外泌体表面膜蛋白lamp2b进行改造，分别与(AspSerSer)6、(Asp)8、CREDVW寡肽融合，使外泌体能分别靶向骨形成表面、骨吸收表面及内皮细胞；不仅如此，本发明开发骨靶向外泌体作为载体，CRISPR/Cas9系统作为基因编辑和调控工具，二者结合将为各种骨病的治疗有着重要意义。

Description

一种靶向骨的外泌体载体、CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物技术领域，涉及一种靶向骨基因编辑系统的开发，具体涉及一种靶向骨的外泌体载体、CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用。
背景技术
骨是人体的重要组成部分，由骨膜、骨质、骨髓三部分构成。正常骨组织时刻处于成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的骨重建动态平衡过程中，两者相互协调，共同维持骨的正常生理功能。当这种动态平衡受到破坏，就会产生各种骨病，如骨质疏松、骨硬化、骨肿瘤、肿瘤骨转移、骨关节炎、类风湿性关节炎等。由于骨组织特殊的结构，如硬度大、渗透性差、血流量低等，使得通过全身给药途径药物很难在骨富集，达到有效的治疗浓度，治疗效果不佳，且增加药物浓度对其他非骨组织及器官产生较大的毒副作用。因此，寻找一个高效的骨靶向药物递送载体是解决这一问题的关键。
传统的药物递送载体包括病毒载体、纳米材料等。病毒载体如慢病毒载体、腺病毒载体等，首先被作为基因药物运载工具，已有临床试验成功应用腺病毒载体治疗雷伯氏先天性黑内障患者，然而由于逆转录病毒可整合至基因组中以及突变回野生型病毒的危险性存在，使得病毒载体的应用受到限制。随着纳米技术的发展，人工纳米材料如脂质体、纳米颗粒、纳米棒、纳米线、碳纳米管和金纳米粒子等越来越多应用于药物递送系统中，研究已证明纳米材料可有效运载药物至靶位点并发挥作用，但由于其人工合成特征，纳米材料仍然存在生物相容性低、稳定性差等缺点。因此，外泌体作为一种天然的纳米囊泡，成为药物递送载体的最佳选择。
外泌体是一种纳米膜性囊泡，最初被视为溶酶体降解过程、细胞废物的回收和排泄的参与者。人体几乎所有类型细胞均可产生外泌体，包括网织红细胞、T细胞、B细胞、血小板、树突细胞、肥大细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等，且外泌体存在于几乎所有类型体液，包括血液、尿液、脑脊液、母乳、腹水、羊水、精液等。随着发明人研究的深入，发现外泌体不仅可以携带生物活性分子如核酸、蛋白质和脂质，而且是细胞间物质传递和信息交流的重要中介，外泌体呈圆形，大小约30～100nm，蔗糖水溶液密度为1.13～1.19g/ml，沉降速度为100000g。由于外泌体的体积很小，使得他们可以逃避体内单核-吞噬细胞系统的吞噬作用，在血液循环中稳定存在，并且可以穿过血管内皮细胞到达靶细胞。此外，研究还发现外泌体可以通过严密的生理屏障，如血脑屏障、胎盘屏障。此外，由于外泌体是生物来源的，其免疫原型低，可以避免抗体、调理素、补体等的激活。假如能在病人体内寻找到一个理想的外泌体来源，提取自体外泌体，携带药物回输至病人体内，能极大避免免疫排斥反应，这将成为药物递送系统的一个重要里程碑。
外泌体主要通过与细胞膜表面受体相互作用及直接膜融合两种方式进入靶细胞，外泌体通过直接膜融合的方式将药物释放至细胞质中，可以逃避溶酶体途径，减少药物的降解。此外外泌体膜表面配体与特异性受体间的相互作用，是实现外泌体靶向运输的重要机制。还可以通过对外泌体表面的膜蛋白进行修饰来实现其靶向运输。
2011年Alvarez等首次成功利用外泌体治疗鼠阿尔茨海默病模型，其对外泌体表面膜蛋白lamp2b进行改造获得表达RVG-Lamp2b融合蛋白的外泌体，并通过电穿孔的方法使外源性siRNA进入外泌体中，尾静脉注射至小鼠体内，外泌体表面的RVG通过与乙酰胆碱受体结合将siRNA释放入鼠脑神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞中，从而显著下调了阿尔茨海默病相关蛋白的表达(蛋白下降62％)，减少了β淀粉的沉积。
骨结构包括外层的骨组织及其内的骨髓组织，骨组织与骨髓组织通过丰富的血管网密切联系。羟基磷灰石是外层骨组织的主要组成成分，因此羟基磷灰石成为研究骨靶向药物递送系统的重要靶点。有研究表明，骨形成表面羟基磷灰石以低结晶形式存在，而骨吸收表面的羟基磷灰石以高结晶形式存在。寡肽中重复的氨基酸序列能与羟基磷灰石结合，且氨基酸序列的不同对不同晶型的羟基磷灰石的亲和力不同。
骨髓是填充于骨髓腔及骨松质间的海绵状组织，其不仅是人体主要的造血器官，还是许多骨肿瘤发生地点及骨转移瘤的转移地点。此外，间充质干细胞在骨髓含量丰富，其具有多向分化潜能，可以分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、内皮等多种组织细胞，近年来成为骨组织工程的首选种子细胞。骨髓血供丰富，血窦壁是骨髓组织和血循环进行物质交换的屏障，即骨髓-血屏障，由于骨髓-血屏障的存在及骨髓复杂的生理结构，使得传统给药途径药物很难进入骨髓。因此，骨髓靶向成为治疗各种骨病的关键。
内皮细胞是血窦壁的主要组成细胞，是血循环中药物进入骨髓的主要屏障，因此内皮细胞成为骨髓靶向的重要靶位点。此外，骨髓微环境对骨代谢有重要影响，骨的发生需要新生血管的参与，通过血液循环为新骨形成提供必需的营养物质及运走代谢产物，因此通过内皮细胞靶向促进新生血管形成从而促进新骨形成成为治疗各种骨病的新方法。
CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated 9)是近年发展起来的RNA向导的基因编辑和调控技术。相比传统的ZFNs以及TALENs技术，CRISPR/Cas9打靶效率更高，操作更为简便，且可在细胞中实现对多个基因同时操作。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期进化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系统共有3种类型，其中CRISPR/CasII型系统最为简单，目前在研究中使用得也最广泛。野生型CRISPR/Cas II系统由含重复序列小RNAcrRNA(CRISPR RNA，crRNA)、辅助小片段tracrRNA(trans-activatingcrRNA，tracrRNA)以及核酸酶Cas9蛋白组成。CRISPR即规律间隔短回文重复序列，由多个相同的重复序列及穿插其间的间隔序列组成，间隔序列可以特异性地识别外源核酸，转录形成crRNA。CRISPR/Cas II型系统作为细菌体内的免疫机制，其通过以下三个步骤作用：1、间隔序列的获得，当细菌被病毒或外源DNA入侵时，CRISPR/Cas系统能够识别入侵者携带的外源核酸中的原型间隔序列的毗邻基序，即PAM(protospacer-associated motif,PAM)，并将PAM旁的原型间隔序列加工整合入自身基因组中的CRISPR序列中；2、crRNAs的转录与加工，CRISPR转录产生pre-crRNA，tracrRNA(trans-activatingcrRNA)与pre-crRNA结合形成tracrRNA:pre-crRNA双链复合物。该复合物在Cas9的存在下,被双链RNA特异的核糖核酸内切酶RNase III进行切割，产生成熟的crRNAs；3、CRISPR系统对入侵核酸的切割，成熟的crRNAs与tracrRNA及Cas9结合形成一个三元的沉默复合物，该复合物在crRNA的引导下与入侵的双链DNA中目的序列进行结合，由Cas9蛋白于原型间隔序列处进行切割，导致入侵病毒或核酸降解。
目前该系统已被人工改造为基因定点编辑的工具，研究人员根据crRNA和tracrRNA的结构特征,设计出模拟二者结合后形成的二聚体结构的单链引导RNA(singleguide RNA，sgRNA)，sgRNA具备crRNA-tracrRNA复合物的功能，能够与Cas9核酸内切酶结合并将后者引导至基因组上的靶位点处进行结合与切割。除了基因定点编辑外，CRISPR/Cas9还被改造用于基因调控。将Cas92个切割域(Ruv和HNH)D10A和H840A位点突变，会使Cas9蛋白失去对DNA的切割活性，但不影响其与DNA结合的能力，这种失去DNA切割活性的Cas9蛋白命名为dCas9(dead Cas9)。sgRNA可以介导dCas9于靶位点结合，利用其空间位阻效应，如果dCas9与靶基因的阅读框结合可以阻断RNA聚合酶的延伸，如果dCas9与靶基因启动子区域结合则可以阻断基因转录起始阶段，由此形成了CRISPR/dCas9基因转录抑制系统。
除此之外，张锋等人还将该系统成功改造为基因激活系统，Cas9去活化使其失去剪切功能，保留与DNA结合功能，再通过MS2适配子改良sgRNA，使其从Cas9复合体伸出四环和茎环2结构作为活化结构域，招募转录激活因子，他们用改造后的CRISPR系统成功激活了十个基因。CRISPR/Cas9作为一种高效的基因编辑和调控工具，已成为治疗许多疾病的新方法。
因此，开发能够特异性的具有骨靶向的基因编辑系统就成为本领域迫切需要解决的一个技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向骨的外泌体载体、CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用，通过对外泌体表面膜蛋白lamp2b进行改造，分别与(AspSerSer)6、(Asp)8、CREDVW寡肽融合，使外泌体能分别靶向骨形成表面、骨吸收表面及内皮细胞，并携带CRISPR/Cas9基因编辑系统，治疗各种骨病。
为达此目的，本发明采用以下技术方案
第一方面，本发明提供一种靶向骨的外泌体载体，所述外泌体载体包括靶向骨形成表面、骨吸收表面或内皮细胞中的任意一种的靶向肽。
本发明中，所述骨形成表面覆盖有成骨细胞系不同阶段的细胞，包括前体成骨细胞、成熟成骨细胞。
所述骨吸收表面表面覆盖有破骨细胞系不同阶段的细胞，包括前体破骨细胞、成熟破骨细胞。
本发明中，随着研究的深入，发现外泌体不仅可以携带生物活性分子，而且是细胞间物质传递和信息交流的重要中介，由于外泌体的体积很小，可以逃避体内单核-吞噬细胞系统的吞噬作用，在血液循环中稳定存在，还可以穿过血管内皮细胞到达靶细胞，不仅如此，研究还发现外泌体可以通过严密的生理屏障，可以避免抗体、调理素、补体等的激活，所以本申请通过改变外泌体的表面膜蛋白lamp2b，从而达到靶向的效果。
根据本发明，所述骨形成表面靶向的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ IDNO.1所述的氨基酸序列如下：(AspSerSer)6。
根据本发明，所述骨形成表面靶向的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ IDNO.2所述的核酸序列如下：GACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCA。
根据本发明，所述骨吸收表面靶向的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ IDNO.3所述的氨基酸序列如下：(Asp)8。
根据本发明，所述骨吸收表面靶向的核酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述SEQ IDNO.4所述的核酸序列如下：GACGACGACGACGACGACGACGAC。
根据本发明，所述内皮细胞靶向的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SEQ IDNO.5所述的氨基酸序列如下：Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp。
根据本发明，所述内皮细胞靶向的核酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述SEQID NO.6所述的核酸序列如下：TGTAGAGAGGATGTCTGG。
本发明中，(AspSerSer)6与骨形成表面低结晶羟基磷灰石的亲和力强，而(Asp)8与骨吸收表面高结晶形式存在的羟基磷灰石亲和力强，利用此特点，本专利将(AspSerSer)6、(Asp)8分别与外泌体表面膜蛋白lamp2b融合，成功构建靶向骨形成表面及骨吸收表面的外泌体。
第二方面，本发明提供一种靶向骨的外泌体载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建靶向肽修饰的lamp2b重组质粒；
(2)提取骨靶向外泌体。
根据本发明，所述制备方法包括如下具体步骤：
(1’)设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，纯化；
(2’)将步骤(1’)纯化后的lamp2b片段、设计的骨形成表面、骨破坏表面或内皮细胞的靶向序列克隆到载体上，得到靶向肽修饰的lamp2b重组质粒；
(3’)将步骤(2’)的靶向肽修饰的lamp2b重组质粒分别转染293T细胞，培养，收集细胞培养基，离心去除细胞及细胞碎屑，SBI外泌体提取试剂盒提取外泌体。
本发明中，所述骨形成表面、骨破坏表面或内皮细胞可根据需要进行选择，本领域技术人员可以把其中一个作为靶向目标从而选择对应的骨形成表面、骨破坏表面或内皮细胞的靶向序列进行连接。
根据本发明，步骤(1’)所述的lamp2b的引物的核酸序列如SEQ ID NO.7-8所示，所述SEQ ID NO.7-8所示的核酸序列如下：
上游引物(SEQ ID NO.7)：CCTTAATTAACCATGTGCCTCTCTCCGGTTAAAGG；
下游引物(SEQ ID NO.8)：CCGTTTAAACTTACTAAAATTGCTCATATCCAGTAT。
根据本发明，步骤(2’)所述骨形成表面靶向序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ IDNO.2所述的核酸序列如下：GACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCA。
根据本发明，步骤(2’)所述骨吸收表面靶向序列如SEQ ID NO.4所示，所述SEQ IDNO.4所述的核酸序列如下：GACGACGACGACGACGACGACGAC。
根据本发明，步骤(2’)所述内皮细胞的核酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述SEQ IDNO.6所述的核酸序列如下：TGTAGAGAGGATGTCTGG。
根据本发明，步骤(2’)所述的载体为pwpi载体。
根据本发明，步骤(2’)所述基因序列克隆到载体上连接到Pac I和Pme I克隆位点。
根据本发明，步骤(3’)所述的培养的时间为18-30h，例如可以是18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h或30h，优选为20-28h，进一步优选为24h，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，步骤(3’)所述的培养基为无血清DMEM培养基。
根据本发明，步骤(3’)所述离心的转速为2000-4000g，例如可以是2000g、2200g、2300g、2500g、2600g、2800g、3000g、3200g、3500g、3600g、3800g或4000g，优选为2500-3500g，进一步优选为3000g，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，步骤(3’)所述离心的时间为10-20min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，优选为12-18min，进一步优选为15min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
第三方面，本发明提供一种靶向骨的基因编辑系统，所述基因编辑系统包括第一方面所述的外泌体载体和基因编辑器。
根据本发明，所述基因编辑器为CRISP/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器，优选为CRISP/Cas9基因编辑器。
根据本发明，所述CRISP/Cas9基因编辑器的sgRNA为Runx2基因的sgRNA。
第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的基因编辑系统的制备方法，包括如下步骤：所述CRISP/Cas9基因编辑器通过脂质体融合法装载到外泌体载体中。
本发明中，传统关于外泌体装载药物的研究多是一些小分子药物，如小分子核酸、化合物等，通过电穿孔法将药物装载进外泌体中，但由于CRISPR/Cas9基因编辑器中的Cas9质粒及蛋白的分子量大，实验发现无法使用电穿孔法装载进外泌体，此外还尝试用内源性募集法，即将质粒直接转染细胞，收集该细胞产生的外泌体，实验发现Cas9质粒只有部分片段进入外泌体中，全长无法进入，Cas9蛋白虽能进入外泌体，却无法发挥功能。经过多次尝试，发明人发现，采用脂质体融合法可以将CRISPR/Cas9基因编辑器中的的Cas9质粒成功转载到外泌体载体中。
根据本发明，所述脂质体融合法具体包括如下步骤：
将Runx2基因的sgRNA电穿孔进入外泌体载体，将Cas9质粒与lipo2000混合孵育20min后与电穿孔外泌体混合孵育6h，加入MSC细胞培养基中，制备得到基因编辑系统。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明通过对外泌体表面膜蛋白lamp2b进行改造，分别与(AspSerSer)6、(Asp)8、CREDVW寡肽融合，使外泌体能分别靶向骨形成表面、骨吸收表面及内皮细胞；
(2)本发明开发骨靶向外泌体作为载体，CRISPR/Cas9系统作为基因编辑和调控工具，二者结合将为各种骨病的治疗有着重要意义；
(3)本发明通过脂质体融合法将CRISPR/Cas9系统成功装载进外泌体中，使其能到达靶细胞并发挥基因编辑和调控功能。
附图说明
图1为上为sgRNA载体示意图，下为dCas9载体示意图；
图2为(AspSerSer)6-Lamp2b-pWPI载体的测序图谱；
图3为(Asp)8-Lamp2b-pWPI载体的测序图谱；
图4为Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp-Lamp2b-pWPI载体的测序图谱；
图5为实时荧光定量pcr检测对照组与Lamp2b-pwpi转染组Lamp2b mRNA表达水平差异倍数图；
图6为蛋白免疫印迹法分别检测细胞对照组、细胞Flag-Lamp2b转染组和外泌体对照组、外泌体Flag-Lamp2b转染组Flag蛋白、GAPDH蛋白的表达条带图；
图7为CRISPR/dCas9Runx2基因抑制系统示意图；
图8为流式细胞术检测图，其中，图8(A)为lipo2000转染组，图8(B)为exosome转染组；
图9为实时荧光定量pcr分别检测细胞对照组、细胞CRISPR/dCas9Runx2基因抑制系统转染组和外泌体对照组、外泌体CRISPR/dCas9Runx2基因抑制系统转染组Runx2mRNA表达水平差异倍数图。
具体实施方式
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
PMD19T载体(日本TaKaRa公司)
pWPI载体(美国Addgene公司)
PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)
PCR Master Mix(美国Thermo公司)
PacI限制酶(美国New England Biolabs公司)
PmeI限制酶(美国New England Biolabs公司)
琼脂糖凝胶回收试剂盒(美国OMEGA公司)
Trizol Reagent(瑞士Roche公司)
Green Master(瑞士Roche公司)
Transfection Reagent(美国Life Technology公司)
FLAG抗体(美国Sigma-Aldrich公司)
GAPDH抗体(美国Abcam公司)
ExoQuick-TCTM外泌体提取试剂盒(美国System Biosciences公司)
PCR仪(美国Applied Biosystems公司)
qRT-PCR仪(美国Bio-Rad公司)
流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司)
透射电镜(日本JEOL公司)
实施例1：构建靶向骨形成表面的外泌体载体
所述外泌体载体如图1所示，其包括sgRNA和dCas9载体：
1)构建靶向肽修饰的lamp2b重组质粒
(1)设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，纯化；
上游引物(SEQ ID NO.7)：CCTTAATTAACCATGTGCCTCTCTCCGGTTAAAGG；
下游引物(SEQ ID NO.8)：CCGTTTAAACTTACTAAAATTGCTCATATCCAGTAT。
PCR扩增反应体系如下：
反应条件如下：
所获得PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，得到的lamp2b片段，将lamp2b片段连接到PMD19T载体中，得到lamp2b-T载体。
(2)Nsi1限制内切酶切割lamp2b-T载体，采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，并与下述的骨形成表面靶向的核酸序列连接并进行转化，得到(AspSerSer)6-lamp2b-T载体；
所述骨形成表面靶向的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2所述的核酸序列如下：GACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCAGACTCCTCA；
(3)PacI和PmeI分别限制酶切(AspSerSer)6-lamp2b-T载体、pwpi载体，采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，再将(AspSerSer)6-lamp2b片段与pwpi载体连接，转化；
将(AspSerSer)6-lamp2b-pwpi载体进行基因检测，所得的结果如图2所示，验证(AspSerSer)6-lamp2b-pwpi载体构建成功。
(4)将(AspSerSer)6-lamp2b-pwpi质粒通过lipo2000转染293T细胞,24h后提取293T细胞总RNA，通过反转录得到cDNA，实时荧光定量pcr检测对照组与转染组lamp2b mRNA表达水平，所得的结果如图5所示，验证(AspSerSer)6-lamp2b-pwpi载体构建成功。
2)提取骨靶向外泌体
(5)将步骤(3)的靶向肽修饰的lamp2b重组质粒分别转染293T细胞，无血清DMEM培养24h，收集细胞培养基，3000g离心15min后去除细胞和细胞碎屑，采用外泌体提取试剂盒提取外泌体。
将提取的外泌体在透射电镜下观察，提取外泌体呈圆形，直径检测大小约30-120nm。Nsi1限制核酸内切酶酶切lamp2b-T载体，将Flag标签连入得到Flag-lamp2b-T载体，再通过PacI和PmeI分别限制酶切Flag-lamp2b-T载体和pwpi载体，得到Flag-lamp2b再与pwpi载体连接得到Flag-lamp2b-pwpi载体。将Flag-lamp2b-pwpi转染293T细胞，收集细胞培养基外泌体，蛋白免疫印迹法分别检测细胞对照组、细胞Flag-Lamp2b转染组和外泌体对照组、外泌体Flag-Lamp2b转染组Flag蛋白、GAPDH蛋白的表达，结果如图6所示，说明lamp2b-pwpi载体构建成功。
实施例2：构建靶向骨吸收表面的外泌体载体
1)构建靶向肽修饰的lamp2b重组质粒
(1)设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，纯化；
上游引物(SEQ ID NO.7)：CCTTAATTAACCATGTGCCTCTCTCCGGTTAAAGG；
下游引物(SEQ ID NO.8)：CCGTTTAAACTTACTAAAATTGCTCATATCCAGTAT。
PCR扩增反应体系如下：
反应条件如下：
所获得PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，得到的lamp2b片段，将lamp2b片段连接到PMD19T载体中，得到lamp2b-T载体。
(2)Nsi1限制内切酶切割lamp2b-T载体，采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，并与下述的骨吸收表面靶向核酸序列连接并进行转化，得到(Asp)8-lamp2b-T载体；
所述骨吸收表面靶向核酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述SEQ ID NO.4所述的核酸序列如下：GACGACGACGACGACGACGACGAC；
(3)PacI和PmeI分别限制酶切(Asp)8-lamp2b-T载体、pwpi载体，采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，再将(Asp)8-lamp2b片段与pwpi载体连接，转化；
将(Asp)8-lamp2b-pwpi载体进行基因检测，所得的结果如图3所示，验证(Asp)8-lamp2b-pwpi载体构建成功。
(4)将(Asp)8-lamp2b-pwpi质粒通过lipo2000转染293T细胞,24h后提取293T细胞总RNA，通过反转录得到cDNA，实时荧光定量pcr检测对照组与转染组lamp2b mRNA表达水平，所得的结果如图5所示，验证(Asp)8-lamp2b-pwpi载体构建成功。
2)提取骨靶向外泌体
(5)将步骤(3)的靶向肽修饰的lamp2b重组质粒分别转染293T细胞，无血清DMEM培养24h，收集细胞培养基，3000g离心15min后去除细胞和细胞碎屑，采用外泌体提取试剂盒提取外泌体。
将将提取的外泌体在透射电镜下观察，提取外泌体呈圆形，直径检测大小约30-120nm。Nsi1限制核酸内切酶酶切lamp2b-T载体，将Flag标签连入得到Flag-lamp2b-T载体，再通过PacI和PmeI分别限制酶切Flag-lamp2b-T载体和pwpi载体，得到Flag-lamp2b再与pwpi载体连接得到Flag-lamp2b-pwpi载体。将Flag-lamp2b-pwpi转染293T细胞，收集细胞培养基外泌体，蛋白免疫印迹法分别检测细胞对照组、细胞Flag-Lamp2b转染组和外泌体对照组、外泌体Flag-Lamp2b转染组Flag蛋白、GAPDH蛋白的表达，结果如图6所示，说明lamp2b-pwpi载体构建成功。
实施例3：构建靶向内皮细胞的外泌体载体
1)构建靶向肽修饰的lamp2b重组质粒
(1)设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，纯化；
上游引物(SEQ ID NO.7)：CCTTAATTAACCATGTGCCTCTCTCCGGTTAAAGG；
下游引物(SEQ ID NO.8)：CCGTTTAAACTTACTAAAATTGCTCATATCCAGTAT。
PCR扩增反应体系如下：
反应条件如下：
所获得PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，得到的lamp2b片段，将lamp2b片段连接到PMD19T载体中，得到lamp2b-T载体。
(2)Nsi1限制内切酶切割lamp2b-T载体，采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，并与下述的内皮细胞靶向的核酸序列连接并进行转化，得到Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp-lamp2b-T载体；
所述内皮细胞靶向的核酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述SEQ ID NO.6所述的核酸序列如下：TGTAGAGAGGATGTCTGG；
(3)PacI和PmeI分别限制酶切Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp-lamp2b-T载体、pwpi载体，采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，再将Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp-lamp2b片段与pwpi载体连接，转化；
将Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp-lamp2b-pwpi载体进行基因检测，所得的结果如图4所示，验证Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp-lamp2b-pwpi载体构建成功。
(4)将Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp-lamp2b-pwpi质粒通过lipo2000转染293T细胞,24h后提取293T细胞总RNA，通过反转录得到cDNA，实时荧光定量pcr检测对照组与转染组lamp2b mRNA表达水平，所得的结果如图5所示，验证(Asp)8-lamp2b-pwpi载体构建成功。
2)提取骨靶向外泌体
(5)将步骤(3)的靶向肽修饰的lamp2b重组质粒分别转染293T细胞，无血清DMEM培养24h，收集细胞培养基，3000g离心15min后去除细胞和细胞碎屑，采用外泌体提取试剂盒提取外泌体。
将提取的外泌体在透射电镜下观察，提取外泌体呈圆形，直径检测大小约30-120nm。Nsi1限制核酸内切酶酶切lamp2b-T载体，将Flag标签连入得到Flag-lamp2b-T载体，再通过PacI和PmeI分别限制酶切Flag-lamp2b-T载体和pwpi载体，得到Flag-lamp2b再与pwpi载体连接得到Flag-lamp2b-pwpi载体。将Flag-lamp2b-pwpi转染293T细胞，收集细胞培养基外泌体，蛋白免疫印迹法分别检测细胞对照组、细胞Flag-Lamp2b转染组和外泌体对照组、外泌体Flag-Lamp2b转染组Flag蛋白、GAPDH蛋白的表达，结果如图6所示，说明lamp2b-pwpi载体构建成功。
实施例4：构建CRISPR/Cas9基因编辑器
以构建CRISPR/dCas9Runx2基因抑制系统为例，CRISPR/dCas9基因抑制系统如图7所示，共包含2个质粒：一个是dCas9质粒，编码去活化的Cas9核酸酶，一个是sgRNA质粒，编码sgRNA，可引导dCas9核酸酶结合到Runx2基因上，利用空间位阻效应抑制Runx2基因的表达。
(1)设计Runx2基因的sgRNA(http://sam.genome-engineering.org/database/)；
Runx2sgRNA：
F:5’CACCGAGAGAGAGAGAGAAAGAGCA3’
R:5’AAACTGCTCTTTCTCTCTCTCTCT 3’；
(2)BsmB1限制酶切sgRNA(MS2)-Zeo质粒，分别与Runx2sgRNA退火序列连接。
实施例5：基因编辑系统的组装
通过脂质体融合法将质粒装载进外泌体，首先选取与Cas9质粒大小相近的egfp质粒，将egfp质粒与lipo2000混合孵育20min后与外泌体混合孵育6h，加入MSC细胞培养基中，将lipo2000直接转染组作为对照，48h后流式细胞术检测egfp的表达，结果如图8(A)-8(B)所示，可见绿色荧光，说明脂质体融合法可将egfp质粒装载至外泌体中。
同样的，通过脂质体融合法将Cas9质粒装载进外泌体中，首先Runx2sgRNA通过电穿孔法进入exosome中，再将Cas9质粒与lipo2000混合混合孵育20min后与外泌体混合孵育6h，加入MSC细胞培养基中，将lipo2000直接转染组作为对照，48h后qRT-PCR检测Runx2基因表达，检测结果如图9所示，可见Runx2表达下降，说明脂质体融合法能将Cas9质粒装载入外泌体中并发挥作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (17)

1.一种靶向骨的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包含靶向骨的外泌体载体和CRISP/Cas9基因编辑器；
所述外泌体载体包括靶向骨的内皮细胞的靶向肽；所述靶向内皮细胞的靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述靶向内皮细胞的靶向肽的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述CRISP/Cas9基因编辑器的制备方法如下：
将Runx2基因的sgRNA电穿孔外泌体载体，将Cas9质粒与lipo2000混合，再与电穿孔的外泌体载体混合，加入MSC细胞培养基中培养，制备得到基因编辑系统。
2.一种如权利要求1所述的基因编辑系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：所述CRISP/Cas9基因编辑器通过脂质体融合法装载到靶向骨的内皮细胞的外泌体载体中。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述靶向骨的内皮细胞的外泌体载体的制备方法包括如下步骤：
(1)构建靶向肽修饰的lamp2b重组质粒；
(2)提取靶向骨的内皮细胞的外泌体载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1’)设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，纯化；
(2’)将步骤(1’)纯化后的lamp2b片段、设计的靶向骨的内皮细胞的基因序列克隆到载体上，得到靶向肽修饰的lamp2b重组质粒；
(3’)将步骤(2’)的靶向肽修饰的lamp2b重组质粒转染293T细胞，培养，收集细胞培养基，离心去除细胞及细胞碎屑，SBI外泌体提取试剂盒提取外泌体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1’)所述的lamp2b的引物的核酸序列如SEQ ID NO.7-8所示。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2’)所述的载体为pwpi载体。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2’)所述基因序列克隆到载体上连接到Pac I和Pme I克隆位点。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3’)所述的培养的时间为18-30h。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3’)所述的培养的时间为20-28h。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(3’)所述的培养的时间为24h。
11.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3’)所述的培养基为无血清DMEM培养基。
12.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3’)所述离心的转速为2000-4000g。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤(3’)所述离心的转速为2500-3500g。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤(3’)所述离心的转速为3000g。
15.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3’)所述离心的时间为10-20min。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，步骤(3’)所述离心的时间为12-18min。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，步骤(3’)所述离心的时间为15min。
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