CN113198020A - 靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向给药技术领域，具体为一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，包括构建pCMV‑lamp2b质粒；将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1插入到pCMV‑1amp2b质粒上；制备含外泌体的上清液和超速离心法制备外泌体。本发明公开一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的应用，在于外泌体特异性靶向骨肉瘤细胞，使其内部装载药物靶向释放，特异性杀灭癌细胞。有益效果为：本发明采用人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1作为外泌体的靶向多肽，分子质量小，能够增加携带基因的容量，并且人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1的潜在靶点为硫酸乙酰肝素糖蛋白，其可以与骨肉瘤细胞有效且特异性结合，靶向性好，转染骨肉瘤细胞的效率高，具有广阔的应用前景。

Description

靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及靶向给药技术领域，具体为一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用。
背景技术
药物递送系统(Drug Delivery System，DDS，药物传递系统)是指在空间、时间及剂量上全面调控药物在生物体内分布的技术体系。其目标是在恰当的时机将适量的药物递送到正确的位置，从而增加药物的利用效率，提高疗效，降低成本，减少毒副作用。药物递送系统研究对象既包括药物本身，也搭载药物的载体材料、装置，还包括对药物或载体等进行物理化学改性、修饰的相关技术。
外泌体是直径为30-100nm的内吞衍生囊泡，由于外泌体包含的各种物质均来源于其细胞，如蛋白质，RNA，双链DNA，代谢分子。并且外泌体的体积非常小，这点优势使得他们可以逃避机体内的单核吞噬细胞系统的吞噬作用，并且可以穿过血管内皮细胞，到达下游的目的细胞。另外，外泌体具有生物来源的特点，使得其免疫原性比较低，外泌体可以通过和其他细胞的细胞膜进行融合，发生内吞，从而将外泌体的内容物释放到下游细胞中来发挥作用，也可以通过细胞膜表面受体相互作用与靶细胞进行交流，将内含物释放至靶细胞中，运用此类方法，可以减少基因药物的降解，逃避溶酶体途径。
目前，选用最多的是将外泌体的标志物即四跨膜蛋白CD63，CD81，CD9作为引导，将其他目的基因或者荧光蛋白，与标志物蛋白进行融合表达，从而将表达的外源基因引导带至外泌体中。然而，运用类似此类标志物有以下几个弊端：第一就是自身基因较大，受载体限制，使得外源基因的选择余地比较小；其次，此类标志物蛋白靶向性比较差，在细胞器膜上，同样也富含此类蛋白，所以导致转化率比较小，效率较低。另外，CD63，CD9，CD81被视为细胞功能的重要蛋白，利用此类蛋白做引导，势必会影响细胞或者是外泌体的功能。
因此，研发一种有效且有特异性，且不影响细胞、外泌体功能的具有靶向外泌体的载体就成为需要迫切解决的一个技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白(lamp2b)片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到OSP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将OSP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到OSP-lamp2b细胞系。
步骤五：将细胞培养用的血清通过离心机进行离心8-10h后，收取上清液，得到无外泌体血清培养液；
步骤六：将OSP-lamp2b细胞系在正常含血清的培养基中培养12-36h后，等待细胞融合度达到60％-70％时，移去原有含血清的培养基，换成含无外泌体血清培养液的培养基，继续培养24-48h，细胞融合度达到80％-95％时，用0.2μm滤器过滤，得到含外泌体的上清液；
步骤七：将含外泌体的上清液放入高速离心机中，设置相对离心力为104g，4度高速离心20-50min后，经0.22μm膜过滤后，设置相对离心力为105g，4度高速离心60-90min后，弃去上清液，加入30-50ml PBS缓冲液，混匀，设置相对离心力为105g，4度高速离心60-90min后，弃去上清液，用30-50ml PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤八：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
优选的，步骤三中，所述人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1的核酸序列为：
Figure BDA0003045754090000031
优选的，步骤五中，所述离心机采用超速离心机，其相对离心力设置为105g，离心时所用的离心管材料为透明聚丙烯，无外泌体血清培养液放置于4℃冰箱保存。
优选的，步骤七中，所述PBS缓冲液由80mmol/L的Na2HPO4、1.36mol/L的NaCl、20mmol/L的KH2PO4和26mmol/L的KCl组成，使用前，将PBS缓冲液在37℃水浴至完全溶解后，稀释10倍使用。
优选的，步骤八中，所述药物为阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺中任意一种。
一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的应用，所述外泌体特异性靶向骨肉瘤细胞，通过释放内部装载药物，特异性杀灭癌细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明采用人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1作为外泌体的靶向多肽，分子质量小，能够增加携带基因的容量，并且人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1的潜在靶点为硫酸乙酰肝素糖蛋白，其可以与骨肉瘤细胞有效且特异性结合，靶向性好，转染骨肉瘤细胞的效率高，具有广阔的应用前景；
2.本发明的OSP-lamp2b细胞系采用血清培养基进行培养，由于血清培养基的营养更丰富，OSP-lamp2b细胞系长势更好，外泌体收率更高，特别的，血清培养采用超速离心处理，可以有效以去除血清以外的外泌体，避免污染。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种技术方案：一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备，包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白(lamp2b)片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到OSP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将OSP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到OSP-lamp2b细胞系。
步骤五：将细胞培养用的血清通过离心机进行离心8h后，收取上清液，得到无外泌体血清培养液；
步骤六：将OSP-lamp2b细胞系在正常含血清的培养基中培养12h后，等待细胞融合度达到60％时，移去原有含血清的培养基，换成含无外泌体血清培养液的培养基，继续培养24h，细胞融合度达到80％时，用0.2μm滤器过滤，得到含外泌体的上清液；
步骤七：将含外泌体的上清液放入高速离心机中，设置相对离心力为104g，4度高速离心20min后，经0.22μm膜过滤后，设置相对离心力为105g，4度高速离心60min后，弃去上清液，加入30mlPBS缓冲液，混匀，设置相对离心力为105g，4度高速离心60min后，弃去上清液，用30ml PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤八：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
其中，步骤三中，人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1的核酸序列为：
Figure BDA0003045754090000061
步骤五中，离心机采用超速离心机，其相对离心力设置为105g，离心时所用的离心管材料为透明聚丙烯，无外泌体血清培养液放置于4℃冰箱保存；
步骤七中，PBS缓冲液由80mmol/L的Na2HPO4、1.36mol/L的NaCl、20mmol/L的KH2PO4和26mmol/L的KCl组成，使用前，将PBS缓冲液在37℃水浴至完全溶解后，稀释10倍使用；
步骤八中，药物为阿霉素。
实施例2
本发明提供一种技术方案：一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备，包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白(lamp2b)片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到OSP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将OSP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到OSP-lamp2b细胞系。
步骤五：将细胞培养用的血清通过离心机进行离心9h后，收取上清液，得到无外泌体血清培养液；
步骤六：将0SP-lamp2b细胞系在正常含血清的培养基中培养20h后，等待细胞融合度达到64％时，移去原有含血清的培养基，换成含无外泌体血清培养液的培养基，继续培养32h，细胞融合度达到85％时，用0.2μm滤器过滤，得到含外泌体的上清液；
步骤七：将含外泌体的上清液放入高速离心机中，设置相对离心力为104g，4度高速离心30min后，经0.22μm膜过滤后，设置相对离心力为105g，4度高速离心70min后，弃去上清液，加入36m1PBS缓冲液，混匀，设置相对离心力为105g，4度高速离心70min后，弃去上清液，用36ml PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤八：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送；
其中，步骤三中，人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1的核酸序列为：
Figure BDA0003045754090000071
步骤五中，离心机采用超速离心机，其相对离心力设置为105g，离心时所用的离心管材料为透明聚丙烯，无外泌体血清培养液放置于4℃冰箱保存；
步骤七中，PBS缓冲液由80mmol/L的Na2HPO4、1.36mol/L的NaCl、20mmol/L的KH2PO4和26mmol/L的KCl组成，使用前，将PBS缓冲液在37℃水浴至完全溶解后，稀释10倍使用；
步骤八中，药物为阿霉素。
实施例3
本发明提供一种技术方案：一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备，包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白(lamp2b)片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到OSP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将OSP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到OSP-lamp2b细胞系。
步骤五：将细胞培养用的血清通过离心机进行离心9h后，收取上清液，得到无外泌体血清培养液；
步骤六：将OSP-lamp2b细胞系在正常含血清的培养基中培养28h后，等待细胞融合度达到68％时，移去原有含血清的培养基，换成含无外泌体血清培养液的培养基，继续培养40h，细胞融合度达到90％时，用0.2μm滤器过滤，得到含外泌体的上清液；
步骤七：将含外泌体的上清液放入高速离心机中，设置相对离心力为104g，4度高速离心40min后，经0.22μm膜过滤后，设置相对离心力为105g，4度高速离心80min后，弃去上清液，加入45mlPBS缓冲液，混匀，设置相对离心力为105g，4度高速离心80min后，弃去上清液，用45ml PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤八：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
其中，步骤三中，人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1的核酸序列为：
Figure BDA0003045754090000091
步骤五中，离心机采用超速离心机，其相对离心力设置为105g，离心时所用的离心管材料为透明聚丙烯，无外泌体血清培养液放置于4℃冰箱保存；
步骤七中，PBS缓冲液由80mmol/L的Na2HPO4、1.36mol/L的NaCl、20mmol/L的KH2PO4和26mmol/L的KCl组成，使用前，将PBS缓冲液在37℃水浴至完全溶解后，稀释10倍使用；
步骤八中，药物为阿霉素。
实施例4
本发明提供一种技术方案：一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备，包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白(lamp2b)片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到OSP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将OSP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到OSP-lamp2b细胞系。
步骤五：将细胞培养用的血清通过离心机进行离心10h后，收取上清液，得到无外泌体血清培养液；
步骤六：将OSP-lamp2b细胞系在正常含血清的培养基中培养36h后，等待细胞融合度达到70％时，移去原有含血清的培养基，换成含无外泌体血清培养液的培养基，继续培养48h，细胞融合度达到95％时，用0.2μm滤器过滤，得到含外泌体的上清液；
步骤七：将含外泌体的上清液放入高速离心机中，设置相对离心力为104g，4度高速离心50min后，经0.22μm膜过滤后，设置相对离心力为105g，4度高速离心90min后，弃去上清液，加入50mlPBS缓冲液，混匀，设置相对离心力为105g，4度高速离心90min后，弃去上清液，用50ml PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤八：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
其中，步骤三中，人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1的核酸序列为：
Figure BDA0003045754090000101
步骤五中，离心机采用超速离心机，其相对离心力设置为105g，离心时所用的离心管材料为透明聚丙烯，无外泌体血清培养液放置于4℃冰箱保存；
步骤七中，PBS缓冲液由80mmol/L的Na2HPO4、1.36mol/L的NaCl、20mmol/L的KH2PO4和26mmol/L的KCl组成，使用前，将PBS缓冲液在37℃水浴至完全溶解后，稀释10倍使用；
步骤八中，药物为阿霉素。
统计含四组实施例中外泌体的上清液的质量，以及四组实施例中外泌体的质量，计算四组实施例中的外泌体收率，制成下表：
外泌体收率(％)
实施例1 19.04
实施例2 22.33
实施例3 25.21
实施例4 21.79
上述的四组实施例均可以得到本发明的靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统，其中实施例3得到的外泌体的收率最高，为25.21％。
在骨肉瘤治疗上，我们选取SPF级雄性8周雄性大鼠，随机分为治疗组和对照组，治疗组和对照组中大鼠个数均为二十个。治疗组和对照组均用HOS人骨肉瘤细胞悬液注入小鼠右后肢骨骨膜下，一周后，等待微小包块形成，开始灌胃给药：治疗组给予包裹阿霉素的外泌体注射骨膜，每次注射100u1，每隔两天注射一次；对照组给予等量的0.9％生理盐水注射，持续干预一周。使用油标卡尺测量瘤径，间隔两天测量一次，同时称量小鼠体重。实验第三周，处死小鼠，剪取小鼠右后肢骨骨膜，进行病理分析。
病理分析显示出肿瘤组织标本为人骨肉瘤组织。肿瘤体积结果显示：灌胃给药后，对照组瘤体增长明显，治疗组瘤体增长缓慢；移植后第三周，治疗组的平均瘤体体积为714mm3，对照组的平均瘤体体积为1228mm3。上述结果表明：外泌体特异性靶向骨肉瘤细胞可以有效抑制骨肉瘤组织的生长。
一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的应用，在于外泌体特异性靶向骨肉瘤细胞，通过释放内部装载药物，特异性杀灭癌细胞。
本发明的有益效果是：本发明采用人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1作为外泌体的靶向多肽，分子质量小，能够增加携带基因的容量，并且人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1的潜在靶点为硫酸乙酰肝素糖蛋白，其可以与骨肉瘤细胞有效且特异性结合，靶向性好，转染骨肉瘤细胞的效率高，具有广阔的应用前景；本发明的OSP-lamp2b细胞系采用血清培养基进行培养，由于血清培养基的营养更丰富，OSP-lamp2b细胞系长势更好，外泌体收率更高，特别的，血清培养采用超速离心处理，可以有效以去除血清以外的外泌体，避免污染。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白(lamp2b)片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到OSP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将OSP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到0SP-lamp2b细胞系。
步骤五：将细胞培养用的血清通过离心机进行离心8-10h后，收取上清液，得到无外泌体血清培养液；
步骤六：将OSP-lamp2b细胞系在正常含血清的培养基中培养12-36h后，等待细胞融合度达到60％-70％时，移去原有含血清的培养基，换成含无外泌体血清培养液的培养基，继续培养24-48h，细胞融合度达到80％-95％时，用0.2μm滤器过滤，得到含外泌体的上清液；
步骤七：将含外泌体的上清液放入高速离心机中，设置相对离心力为104g，4度高速离心20-50min后，经0.22μm膜过滤后，设置相对离心力为105g，4度高速离心60-90min后，弃去上清液，加入30-50ml PBS缓冲液，混匀，设置相对离心力为105g，4度高速离心60-90min后，弃去上清液，用30-50ml PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤八：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
2.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤三中，所述人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1的核酸序列为：
GCCAGCGGCGCCCTGAGCCCCAGCCGCCTGGACACC。
3.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤五中，所述离心机采用超速离心机，其相对离心力设置为105g，离心时所用的离心管材料为透明聚丙烯，无外泌体血清培养液放置于4℃冰箱保存。
4.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤七中，所述PBS缓冲液由80mmol/L的Na2HPO4、1.36mol/L的NaCl、20mmol/L的KH2PO4和26mmol/L的KCl组成，使用前，将PBS缓冲液在37℃水浴至完全溶解后，稀释10倍使用。
5.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤八中，所述药物为阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺中任意一种。
6.一种如权利要求1-5所述的靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的应用，其特征在于：所述外泌体特异性靶向骨肉瘤细胞，通过释放内部装载药物，特异性杀灭癌细胞。
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