CN109966506A - 基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法 - Google Patents

基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基因工程改造外泌体递送miRNA‑140靶向治疗骨性关节炎的方法，包括以下步骤：构建软骨细胞靶向肽修饰的lamp2b重组质粒、提取软骨亲和靶向外泌体和外泌体包裹上miRNA，运载miRNA‑140；本发明实现了miRNA药物的治疗潜力，高效、组织特异性的递送药物用于治疗骨性关节炎；主要是利用靶向外泌体包裹miRNA‑140在治疗骨关节炎药物中的应用，本发明通过外泌体靶向运输miRNA‑140，能够减缓软骨组织的降解，起到抑制软骨基质分解代谢的作用，从而控制关节软骨破坏并促进软骨修复。

Description

基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的 方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法。
背景技术
向各种特定类型的细胞靶向递送药物分子是精准医学中的主要面临的主要挑战，天然外泌体具备生物功能化纳米囊泡，该囊泡可通过基因工程的手段展示多种靶向蛋白或者多肽的配体并直接包装药物以行使药物靶向递送能力。
miRNA-140其具有抑制骨关节炎症状的特异性生物活性，miRNA-140能够抑制由IL-1beta引起软骨基质的降解，从而维持软骨细胞外基质的II型胶原(Col2Al)和蛋白聚糖(Aggrecan)的表达水平。
因此，发明一种基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法很有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，以解决背景技术提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，包括以下步骤：
步骤一：构建质粒：利用携带软骨细胞的亲合肽(CAP)融合表达于外泌体膜蛋白(lamp2b)上作为靶向的基因工程化外泌体可靶向软骨细胞；
步骤二：在DC细胞中表达质粒CAP-lamp2b，筛选稳定细胞株；
步骤三：利用无外泌体的培养基扩增稳定表达CAP-lamp2b细胞，收集细胞上清液，进行差异超速离心分离获取靶向外泌体；
步骤四：通过电穿孔仪把miRNA-140电转到步骤三中所获得的靶向外泌体中，使外泌体包裹上miRNA，运载miRNA-140；
步骤五：通过关节腔注射软骨细胞靶向外泌体，从而在实现miRNA-140靶向递送到关节软骨细胞里用于骨关节炎实验。
优选的，所述步骤二中靶向外泌体的具体制备步骤如下：
a：设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，PCR纯化；
b：将步骤a中PCR纯化回收后的lamp2b基因克隆到表达载体pCMV-Tag上，构建成pCMV-lamp2b质粒；
c：再将的软骨细胞亲和肽的核酸DNA序列插入到步骤b所构建的质粒pCMV-lamp2b上，得到靶向肽基因改造的lamp2b重组质粒CAP-lamp2b；
d：将步骤c中的靶向肽基因改造的CAP-lamp2b重组质粒转染小鼠树枝状细胞，转染48小时后，加入G418抗生素筛选稳定表达CAP-lamp2b细胞系；
e：在无外泌体增养基和条件下培养CAP-lamp2b细胞的细胞，收集培养基，离心去除死细胞及细胞碎片，通过高速离心法分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，主要步骤如下：提取上清液10000g，4度离心30分钟；0.22微米膜过滤后，100000g，4度，离心70分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀，100000g，4度，70分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体。
优选的，所述软骨细胞亲合肽的氨基酸序列如下：DWRVIIPPRPSA。
优选的，所述软骨细胞亲合肽的核酸DNA序列如下：GACTGGAGGGTGATCATCCCCCCCAGGCCCAGCGCC。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明实现了miRNA药物的治疗潜力，高效、组织特异性的递送药物用于治疗骨性关节炎；主要是利用靶向外泌体包裹miRNA-140在治疗骨关节炎药物中的应用，在大鼠的骨关节炎动物模型中，给予膝关节腔注射miRNA-140能抑制MMP-13表达，能显著改善其软骨基质破坏，延缓骨关节炎动物模型的软骨损伤过程，起到软骨保护的作用；因此，本发明通过外泌体靶向运输miRNA-140，能够减缓软骨组织的降解，起到抑制软骨基质分解代谢的作用，从而控制关节软骨破坏并促进软骨修复。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，包括以下步骤：
步骤一：构建质粒：利用携带软骨细胞的亲合肽(CAP)融合表达于外泌体膜蛋白(lamp2b)上作为靶向的基因工程化外泌体可靶向软骨细胞；
步骤二：在DC细胞中表达质粒CAP-lamp2b，筛选稳定细胞株；
步骤三：利用无外泌体的培养基扩增稳定表达CAP-lamp2b细胞，收集细胞上清液，进行差异超速离心分离获取靶向外泌体；
步骤四：通过电穿孔仪把miRNA-140电转到步骤三中所获得的靶向外泌体中，使外泌体包裹上miRNA，运载miRNA-140；
步骤五：通过关节腔注射软骨细胞靶向外泌体，从而在实现miRNA-140靶向递送到关节软骨细胞里用于骨关节炎实验。
进一步地，步骤二中靶向外泌体的具体制备步骤如下：
a：设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，PCR纯化；
b：将步骤a中PCR纯化回收后的lamp2b基因克隆到表达载体pCMV-Tag上，构建成pCMV-lamp2b质粒；
c：再将的软骨细胞亲和肽的核酸DNA序列插入到步骤b所构建的质粒pCMV-lamp2b上，得到靶向肽基因改造的lamp2b重组质粒CAP-lamp2b；
d：将步骤c中的靶向肽基因改造的CAP-lamp2b重组质粒转染小鼠树枝状细胞，转染48小时后，加入G418抗生素筛选稳定表达CAP-lamp2b细胞系；
e：在无外泌体增养基和条件下培养CAP-lamp2b细胞的细胞，收集培养基，离心去除死细胞及细胞碎片，通过高速离心法分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，主要步骤如下：提取上清液10000g，4度离心30分钟；0.22微米膜过滤后，100000g，4度，离心70分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀，100000g，4度，70分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体。
进一步地，软骨细胞亲合肽的氨基酸序列如下：DWRVIIPPRPSA。
进一步地，软骨细胞亲合肽的核酸DNA序列如下：GACTGGAGGGTGATCATCCCCCCCAGGCCCAGCGCC。
miRNA-140核苷酸序列在各物种间(如人、小鼠、大鼠、猪等)十分保守，本发明所用的miRNA-140化合物为miRNA-140-5p模拟物，其核苷酸序列如下5'-CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG-3'，此miRNA-140选自大鼠的miRNA-140，其在miRbase中的序列编号为：MI0000611。
在骨关节炎治疗上，我们选取SPF级雄性8周雄性大鼠在异氟醚麻醉下，对实验大鼠左右后足进行前交叉韧带横断术，同时在小动物跑步机上进行高强度的跑步运动，增加后腿负荷，使关节强烈受力，达到模拟膝关节软骨长期劳损，以此建立膝骨关节炎动物模型，通过OA关节镜下及组织切片的可以检测病理改变包括股骨髁及髌骨应力区软骨剥脱、软骨下骨裸露、软骨纤维化和半月板磨损等。
在建立模型后进一步通过miRNA-140的靶向外泌体进行治疗，miRNA-140的靶向外泌体进行关节腔注射，每次注射100ul体积，每隔一周注射一次，总共三周时间后进行评估实验效果。对照组用pbs替代。
实验结果表明，miRNA-140的靶向外泌体能靶向关节软骨细胞，维持在关节腔中发挥相应功能，组织切片表明miRNA-140的靶向外泌体能延缓关节软骨的变性，促进关节基质代谢的平衡，维持软骨和滑膜的基质的形态结构，从而达到促进修复，抑制骨性关节炎。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：构建质粒：利用携带软骨细胞的亲合肽(CAP)融合表达于外泌体膜蛋白(lamp2b)上作为靶向的基因工程化外泌体可靶向软骨细胞；
步骤二：在DC细胞中表达质粒CAP-lamp2b，筛选稳定细胞株；
步骤三：利用无外泌体的培养基扩增稳定表达CAP-lamp2b细胞，收集细胞上清液，进行差异超速离心分离获取靶向外泌体；
步骤四：通过电穿孔仪把miRNA-140电转到步骤三中所获得的靶向外泌体中，使外泌体包裹上miRNA，运载miRNA-140；
步骤五：通过关节腔注射软骨细胞靶向外泌体，从而在实现miRNA-140靶向递送到关节软骨细胞里用于骨关节炎实验。
2.根据权利要求1所述的基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，其特征在于：所述步骤二中靶向外泌体的具体制备步骤如下：
a：设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，PCR纯化；
b：将步骤a中PCR纯化回收后的lamp2b基因克隆到表达载体pCMV-Tag上，构建成pCMV-lamp2b质粒；
c：再将的软骨细胞亲和肽的核酸DNA序列插入到步骤b所构建的质粒pCMV-lamp2b上，得到靶向肽基因改造的lamp2b重组质粒CAP-lamp2b；
d：将步骤c中的靶向肽基因改造的CAP-lamp2b重组质粒转染小鼠树枝状细胞，转染48小时后，加入G418抗生素筛选稳定表达CAP-lamp2b细胞系；
e：在无外泌体增养基和条件下培养CAP-lamp2b细胞的细胞，收集培养基，离心去除死细胞及细胞碎片，通过高速离心法分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，主要步骤如下：提取上清液10000g，4度离心30分钟；0.22微米膜过滤后，100000g，4度，离心70分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀，100000g，4度，70分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体。
3.根据权利要求1-2所述的基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，其特征在于：所述软骨细胞亲合肽的氨基酸序列如下：DWRVIIPPRPSA。
4.根据权利要求1-2所述的基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，其特征在于：所述软骨细胞亲合肽的核酸DNA序列如下：GACTGGAGGGTGATCATCCCCCCCAGGCCCAGCGCC。
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