CN113648404B - 一种肿瘤全细胞靶向试剂及其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤全细胞靶向试剂及其制备方法及应用，所述肿瘤全细胞靶向试剂中含有具有癌细胞细胞膜靶向杀伤作用的核酸分子，所述核酸分子由癌细胞细胞膜靶向序列和连接在所述癌细胞细胞膜靶向序列的5’端的金属有机框架配体组成。本发明中的癌细胞细胞膜靶向序列应用范围广泛，对自体或是异体肿瘤细胞均可精准包覆，且不局限于单一癌种，对广泛癌种的癌细胞均有效。而且其生物相容性好，安全性高，对正常细胞无杀伤作用，制备方法简单易行，无需紫外/反复冻融等步骤，常温反应即可。

Description

一种肿瘤全细胞靶向试剂及其制备方法及应用
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种肿瘤全细胞靶向试剂及其制备方法及应用。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的重大疾病之一。在相关技术中，癌症的主要治疗策略包括手术、化疗、放疗等，这些治疗方法虽然能在短期内抑制肿瘤生长，但对于癌症的复发和转移并无良好抑制效果，患者长期存活率依旧堪忧。目前，临床上尚无针对癌症转移或者复发的有效管理方法，且由于癌症异质性的存在，使得有效的癌症治疗从根本上而言困难重重。
癌症免疫治疗是一种利用患者自身固有的免疫系统去识别、攻击、消灭肿瘤细胞并防止复发的治疗方法，因此，癌症免疫治疗也被称作癌症的特异性主动免疫疗法。癌症免疫治疗的关键是设计合成癌症疫苗并通晓其作用机制。但在实际应用中，在癌症早期阶段，自体肿瘤细胞较少，获取难度大，难以用于肿瘤全细胞疫苗的制备，而使用异体培养的肿瘤细胞制备抗原又存在一定的风险，因此，无法实现肿瘤全细胞疫苗的体外规模化量产。
因此，开发一种能够具有癌细胞特异性且能高效杀灭癌细胞的肿瘤全细胞靶向试剂，对于临床上预防和治疗癌症的复发和转移具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种肿瘤全细胞靶向试剂，能够靶向泛癌种癌细胞的细胞膜，并在其表面原位生长MOF，使MOF在细胞表面形成致密包裹层，将癌细胞与细胞外基质完全隔绝，导致癌细胞处于无细胞周期的过程而发生程序性死亡。同时，包裹在细胞膜表面的MOF被吞噬细胞吞噬呈递之后，会使发生免疫原性死亡的癌细胞抗原完全暴露，从而会引发持续的免疫应答，并被记忆T细胞记录，起到持续的肿瘤拮抗作用。
本发明的第一个方面，提供一种核酸分子，该核酸分子由金属有机框架配体和癌细胞细胞膜靶向序列组成。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述癌细胞细胞膜靶向序列靶向癌细胞细胞膜上的特异性抗原。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述金属有机框架配体连接在所述癌细胞细胞膜靶向序列的5’端。
本发明中的核酸分子的作用机制如说明书附图图1所示，具体为：本发明中使用对癌细胞具有较强亲和力而对正常细胞并无亲和力的核酸适配体，通过其具有的特异性识别并结合患者自体或者异体癌细胞的能力，使其连接的金属有机框架(MOF)配体与Zn2+在细胞表面原位生长MOF，并均匀的包裹整个癌细胞，使癌细胞维持在悬浮状态并失去了与细胞外基质的相互作用导致癌细胞处于无细胞周期的过程而发生程序性死亡，同时验证为免疫原性死亡，可作为抗原引发机体的免疫应答反应。同时包裹在细胞膜的MOF作为免疫佐剂，进一步扩大免疫反应，当癌细胞表面的MOF被吞噬呈递之后，发生免疫原性死亡的癌细胞抗原完全暴露，会引发持续的免疫应答，并且被记忆T细胞记录，起到肿瘤拮抗作用。
在本发明的一些优选实施方式中，所述金属有机框架(MOF)配体包括锌离子有机框架的合成配体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述锌离子有机框架包括ZIF-8、ZIF-90、MAF-5和MAF-6。
在本发明实施例中，MOF的选择原则为：
1.可以在水相溶液，室温条件下温和合成；
2.生物相容性高，在合成过程中不能对细胞造成损伤。
在本发明的一些优选实施方式中，发明人选择了由锌离子构筑的部分沸石咪唑框架类MOF，如ZIF-8、ZIF-90、MAF-5和MAF-6等，但需要理解的是，本领域技术人员可以选择任意满足上述MOF的选择原则的MOF作为组件组装核酸分子。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述锌离子有机框架为ZIF-8。
金属-有机框架(MOFs)具有高有序性和表面积、孔隙率可调、易于功能化等优点。本发明选用合成条件较温和的金属有机框架ZIF-8在细胞适宜生存的缓冲溶液中通过核酸适配体与癌细胞原位合成，促进癌细胞的免疫原性死亡，作为一体化全细胞癌症药物或疫苗用于癌症免疫治疗，有效的起到了癌症预防作用。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述ZIF-8的配体为甲基咪唑。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述癌细胞细胞膜靶向序列包括核酸适配体和细胞膜靶向性多肽。
在本发明的一些优选实施方式中，所述核酸适配体靶向癌细胞细胞膜上的特异性抗原，所述特异性抗原包括核仁素。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述核酸适配体包括AS1411，所述细胞膜靶向性多肽包括RGD肽。
在本发明实施例中，癌细胞细胞膜靶向序列的选择目的为：精准的识别肿瘤细胞，保证后续MOF可以特异性自组装于肿瘤细胞膜，从而避免对正常细胞的非特异性包覆。因此，选择的癌细胞细胞膜靶向序列需要满足：
1.该序列高表达于肿瘤细胞膜；
2.该序列在正常细胞中或其细胞膜中不表达或低表达。
其中，AS1411核酸适配体靶向肿瘤细胞膜细胞膜高表达并在正常细胞膜不表达的核仁素。
而RGD肽能识别整合素αvβ3，也满足肿瘤细胞膜高表达，而正常细胞低表达或不表达的条件，因此，也能够作为癌细胞细胞膜靶向序列使用。
当然，本领域技术人员可以选择任意满足上述癌细胞细胞膜靶向序列的选择原则的序列作为组件组装核酸分子。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子3’端连接有荧光基团。
在本发明的一些优选实施方式中，所述荧光基团包括FAM、VIC、Cy5。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述荧光基团为FAM。
本发明的第二个方面，提供一种癌症治疗试剂，该癌症治疗试剂中含有本发明第一个方面所述的核酸分子。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述癌症包括黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和子宫颈癌。
根据本发明实施例中对于肿瘤全细胞靶向试剂普适性的测试，可以发现，本发明实施例中的肿瘤全细胞靶向试剂会针对任意癌种的癌细胞产生特异性识别，因此，该肿瘤全细胞靶向试剂可以针对治疗的癌种包括但不局限于黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和子宫颈癌。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述核酸分子在制备癌症预防或治疗试剂中的应用。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括疫苗和药物。
本发明中的核酸分子可以制备为一种肿瘤全细胞疫苗，通过包覆肿瘤细胞，诱发免疫原性死亡。然后通过吞噬细胞的作用，使癌细胞抗原完全暴露，从而实现将整个肿瘤细胞作为抗原导入患者体内，诱导特异性免疫应答，进而实现免疫治疗效果。由于肿瘤细胞携带所有的抗原信息，因此无需考虑分离肿瘤特异性抗原。此外，由于自体肿瘤细胞还携带白细胞相关抗原，其并不会引发免疫排斥反应。具有极好的临床应用前景。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述核酸分子在制备肿瘤细胞全细胞抗原递送载体中的应用。
本发明中的核酸分子可以制备为一种肿瘤细胞全细胞抗原递送载体，可以在体外预先实现自体癌细胞包覆，诱发免疫原性死亡，然后导入患者体内，使其作为抗原诱导特异性免疫应答，进而实现免疫治疗效果。由于肿瘤细胞携带所有的抗原信息，因此无需考虑分离肿瘤特异性抗原。此外，由于自体肿瘤细胞还携带白细胞相关抗原，其并不会引发免疫排斥反应。具有极好的临床应用前景。
在传统方法中，由于肿瘤抗原进入机体后其免疫原性会大幅下降，同时会刺激机体产生免疫耐受，导致对肿瘤细胞的特异性免疫不能被有效激活。因此，需要提高免疫系统对肿瘤抗原识别并降低免疫抑制，以提高特异性抗肿瘤免疫反应，从而达到降低乃至阻止肿瘤发展转移进而消灭肿瘤的目的。而在本发明中，用于包覆癌细胞的MOF同时可以作为一种免疫佐剂，从而可以与抗原特异性或非特异性结合，以提高抗原对免疫系统的刺激作用、保持抗原对免疫系统的持续激活、提高机体的先天性自身免疫反应。当然，对于免疫佐剂的首要要求是无毒副作用，且能够有效增强细胞免疫与体液免疫应答。传统方法中常使用细胞因子、脂质体、铝佐剂、免疫刺激复合物、核酸佐剂等作为免疫佐剂，但均有各自的限制因素，而本发明中的核酸分子可以在癌细胞表面原位生成MOF，同时兼具了免疫佐剂的功能，因此，使其具有更好的免疫杀伤效果。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述核酸分子在制备免疫激活试剂中的应用。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述免疫激活包括提高CD4+T细胞和CD8+T细胞数量，提高抗原识别效率。
在本发明实施例中，通过使用本发明第一个方面所述核酸分子，可以同时激活CD4+和CD8+T细胞，并提高其有效占比，增强免疫反应，防止肿瘤生长。而且，其在有效激起免疫原性反应的同时，并不会导致全身炎症反应，无明显副作用，具有较高的安全性。
本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述核酸分子在制备ROS激动剂中的应用。
根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述ROS激动剂用于癌细胞或癌症模型中。
在本发明实施例中，发明人发现本发明第一个方面所述核酸分子能在癌细胞内产生较多的活性氧，促使癌细胞发生免疫原性死亡。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的癌细胞细胞膜靶向序列应用范围广泛，采用具有肿瘤细胞靶向性的核酸适配体进行特异性连接，对自体或是异体肿瘤细胞均可精准包覆，且不局限于单一癌种，对广泛癌种的癌细胞均有效。
2.本发明中的癌细胞细胞膜靶向序列生物相容性好，其采用生物友好的有机金属框架ZIF-8作为佐剂进行包覆，无毒副作用，在起到包覆屏障的同时，也能作为一种抗原呈递载体将癌细胞全细胞作为抗原进行呈递，从而激活持续免疫反应。
3.本发明中的癌细胞细胞膜靶向序列安全性更高，对正常细胞无杀伤作用，且本发明中的癌细胞细胞膜靶向序列仅对异体肿瘤细胞表面进行修饰，不改变其基因表达，因此降低了排斥反应的发生风险。
4.本发明中的癌细胞细胞膜靶向序列制备方法简单易行，无需紫外/反复冻融等步骤，常温反应即可。
附图说明
图1为本发明实施例中的癌细胞细胞膜靶向序列的作用示意图(a)及免疫治疗机制示意图(b)；
图2为本发明实施例中的核酸适配体的化学修饰流程示意图；
图3为本发明实施例中的AS1411核酸适配体化学修饰后的MALDI-TOF-MS表征图，其中，a：AS1411；b：2μM AS1411和40μM 2-咪唑甲醛；c：2μM AS1411和100μM 2-咪唑甲醛；
图4为不同浓度AS1411-1作用于癌细胞的存活率比较；
图5为本发明实施例中的肿瘤全细胞靶向试剂与癌细胞共孵育后共聚焦显微镜图像，比例尺:20μm；
图6为不同浓度的肿瘤全细胞靶向试剂与癌细胞共孵育后共聚焦显微镜图像，比例尺:10μm；
图7为B16细胞原位生长ZIF-8后的SEM图像，a-b：B16细胞空白对照组；c-d：B16@ZIF-8；e-f：B16@AS1411-1@ZIF-8；
图8为B16@AS1411-1@ZIF-8的能量色散X-射线光谱元素分布图；
图9为B16@AS1411-1@ZIF-8的X射线粉末衍射图谱；
图10为不同细胞原位生长ZIF-8后SEM表征图；
图11为不同细胞原位生长ZIF-8后的能量色散X-射线光谱元素分布图；
图12为不同细胞使用1μM的肿瘤全细胞靶向试剂后的细胞存活率对比；
图13为不同细胞使用1μM的肿瘤全细胞靶向试剂后的流式图(细胞凋亡)；
图14为不同方法处理后的B16细胞对比，a为激光共聚焦显微镜图，b为B16细胞膜表面CRT暴露情况对比。
图15为使用1μM的肿瘤全细胞靶向试剂后的细胞内活性氧对比，比例尺为：10μm，a为激光共聚焦显微镜图，b为荧光强度差异性对比；
图16为巨噬细胞RAW264.7对B16@AS1411-1@ZIF-8的吞噬作用，比例尺：20μm，a为激光共聚焦显微镜图，b为荧光强度差异性对比。
图17为使用1μM的肿瘤全细胞靶向试剂后，体外细胞因子TNF-α(a)与IL-6(b)的含量变化；
图18为本发明实施例中的体内肿瘤拮抗实验流程示意图；
图19为本发明实施例中的肿瘤全细胞靶向试剂体内抗肿瘤效果验证，a：不同处理组小鼠的肿瘤生长曲线；b：不同处理组小鼠的黑色素瘤照片；c：不同处理组小鼠的肿瘤重量，其中，i为PBS组，ii为ZIF-8组，iii为B16裂解液组，iv为B16@ZIF-8组，v为B16@AS1411-1@ZIF-8组；
图20为不同处理组小鼠的体重变化曲线；
图21为不同处理组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的H&E染色图像
图22为不同处理组小鼠血液和脾脏中CD4+和CD8+T细胞的流式图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实验试剂与耗材
细胞模板：在下述实施例中，均使用B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)作为模板进行相关实验和测试，当然，需要理解的是，可采用的细胞模板包括但不限于任意的已知癌细胞。
核酸适配体：在下述实施例中，均使用核酸适配体AS1411作为靶向性试剂，进行相关实验和测试，当然，需要理解的是，可采用的靶向性试剂也包括本领域中已知的任意对癌细胞的细胞膜有较强亲和力而对正常细胞并无亲和力的核酸适配体，该核酸适配体识别序列需满足高表达于肿瘤细胞膜，而正常细胞不表达或低表达的条件，从而可以保证后续MOF可以特异性自组装于肿瘤细胞膜，从而避免对正常细胞的非特异性包覆。在下述实施例中，所选择的AS1411适配体靶向于肿瘤细胞膜高表达，而正常细胞膜不表达的核仁素。
其中，核酸适配体AS1411的核苷酸序列为：5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQ ID NO.1)。
金属有机框架(MOF，或金属有机骨架)：在下述实施例中，均使用ZIF-8合成配体基团(甲基咪唑，结构式如式1所示)合成得到的ZIF-8作为免疫佐剂，当然，需要理解的是，可采用的免疫佐剂也包括本领域中已知的金属有机框架，选择MOF的原则为：该MOF可以在水相溶液，室温条件下温和合成；同时要求高生物相容性，在合成过程中不能对细胞造成损伤。
肿瘤全细胞靶向试剂(疫苗)的制备
在核酸适配体AS1411的3’端连接一个荧光基团FAM，然后在连接好荧光基团FAM的AS1411的5’端化学修饰一个2-咪唑甲醛(具体步骤为：先在连接好荧光基团FAM的AS1411的5’端连接一个NH2-C6基团，通过醛胺缩合将2-咪唑甲醛与AS1411的5’端的NH2-C6基团连接)，使AS1411的5’末端带有了合成ZIF-8所需的配体基团。
具体制备方法为：
取2μM AS1411和100μM 2-咪唑甲醛溶解于pH 6.8的PBS缓冲溶液中，置于37℃恒温避光缓慢震荡24h，即得肿瘤全细胞靶向试剂(AS1411-1)。
合成流程图如图2所示。
修饰条件优化实验
需要注意的是，在化学修饰时，核酸适配体AS1411与2-咪唑甲醛的比例对于修饰成功的产物的得率有一定的影响。对此，发明人使用了两种不同的核酸适配体AS1411与2-咪唑甲醛的比例进行化学修饰进行检测，具体试验步骤如下：
分别将组合1(2μM AS1411和40μM 2-咪唑甲醛)和组合2(2μM AS1411和100μM2-咪唑甲醛)溶解于pH 6.8的PBS缓冲溶液中，置于37℃恒温避光缓慢震荡24h。
结果如图3所示。
从图3可以发现，AS1411原料峰的质荷比(m/z)显示为9632.1，当AS1411与2-咪唑甲醛的浓度比为1:20时，产物峰m/z为9729.2，产率较低。当浓度比提高为1:50时，产物峰m/z为9736.3，产率相较1:20时有所提升。对比两者可以发现，AS1411与2-咪唑甲醛在两种浓度下均能成功修饰到AS1411上，但通过调整浓度比，可以获得产物的产率更高，说明其产量与2-咪唑甲醛在溶液中的浓度比例有极大的关系。
为了进一步检测修饰完成的肿瘤全细胞靶向试剂的效果，在下述实施例中，均采用以2μM AS1411和100μM 2-咪唑甲醛为原料制备得到的肿瘤全细胞靶向试剂。
细胞毒性测试
为了验证上述实施例制备得到的肿瘤全细胞靶向试剂的细胞毒性，发明人选取了A549细胞(人非小细胞肺癌细胞)、MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)、HeLa细胞(子宫颈癌细胞)和B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)作为检测对象进行细胞毒性测试，具体步骤如下：
分别取处于对数生长期的A549细胞、MCF-7细胞、HeLa细胞和B16细胞，接种于96孔板中，细胞密度为5000/孔，于细胞培养箱培养24h。待细胞生长至贴壁时，更换新鲜培养液。取不同浓度(0.5、1、2、4μM)的肿瘤全细胞靶向试剂分别与细胞孵育24h。向每孔中加入细胞ATP检测试剂(CellTiter-LumiTM发光法细胞活力检测试剂，购自上海碧云天生物技术有限公司)，室温振荡5分钟，以促进细胞的裂解，避光孵育10分钟，使发光信号趋于稳定，然后使用多功能酶标仪进行化学发光检测。
结果如图4所示。
可以发现，当肿瘤全细胞靶向试剂的浓度为1μM或以下时，其能充分结合细胞而不造成明显的细胞损伤；而当浓度提高至2～4μM时，MCF-7细胞和A549细胞损伤情况明显，而HeLa细胞和B16细胞相对损伤较轻。为了能够更好的验证肿瘤全细胞靶向试剂的使用效果，下述实施例中，肿瘤全细胞靶向试剂的使用浓度均采用1μM。
特异性检测
为了验证上述实施例制备得到的肿瘤全细胞靶向试剂的选择特异性，发明人选取了HeLa细胞(子宫颈癌细胞)、HLF细胞(人肺成纤维细胞)和MCF-10A细胞(人正常乳腺细胞)作为检测对象进行特异性检测，具体步骤如下：
分别取处于对数生长期的HeLa细胞、HLF细胞和MCF-10A细胞，接种于48孔板，细胞密度为5000/孔，于细胞培养箱培养24h。待细胞生长至贴壁时，更换新鲜培养液(DMEM)。取1μM的肿瘤全细胞靶向试剂，4℃孵育30min，然后用PBS清洗3次，在激光共聚焦显微镜下观察荧光强度。
结果如图5所示。
可以发现，在三种检测对象中，仅HeLa细胞出现绿色荧光，而正常细胞(HLF细胞和MCF-10A细胞)均未出现荧光，从而可以说明，上述实施例制备得到的肿瘤全细胞靶向试剂能够特异性结合癌细胞，而不会结合正常细胞。
普适性验证
为了验证上述实施例制备得到的肿瘤全细胞靶向试剂的普适性，即上述实施例制备得到的肿瘤全细胞靶向试剂是否可以广泛用于泛癌种的靶向治疗，发明人选取了不同种类的癌细胞作为检测对象。
具体步骤如下：
取处于对数生长期的A549细胞、MCF-7细胞、HeLa细胞和B16细胞，接种于48孔板，细胞密度为5000/孔，于细胞培养箱培养24h。待细胞生长至贴壁时，更换新鲜培养液。取不同浓度(0.5、1、2、4μM)的肿瘤全细胞靶向试剂分别与细胞混合，4℃孵育30min，然后用预冷的PBS清洗3次，在激光共聚焦显微镜下观察荧光强度。
结果如图6所示。
可以发现，以不同种类的癌细胞作为检测对象在不同浓度的肿瘤全细胞靶向试剂条件下均有荧光，说明上述实施例制备得到的肿瘤全细胞靶向试剂可以靶向不同种类的癌细胞，可以用于泛癌种的靶向治疗。
肿瘤全细胞靶向试剂实际使用效果
1.肿瘤全细胞靶向试剂使用后在肿瘤细胞表面特异性生长的ZIF-8的形貌与成分表征：
具体实验步骤如下：
选取处于对数生长期的模板细胞(B16细胞)，用PBS清洗，胰蛋白酶消化，收集，离心，重悬，获得模板细胞悬液。取肿瘤全细胞靶向试剂(1μM)加入模板细胞悬液中，4℃孵育30min，离心，PBS清洗掉未结合的部分。将细胞重悬于50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液中，加入醋酸锌溶液(20mM，稀释液为HEPES)，震荡5min，加入甲基咪唑(400mM，稀释液为HEPES)，混匀，室温震荡20min。同时设置不加入肿瘤全细胞靶向试剂的对照组(HeLa@ZIF-8)。使用扫描电子显微镜(SEM)观察包覆效果，使用能量色散X-射线光谱元素分布图(EDS mapping)检测ZIF-8包覆后的形貌。同时，通过X射线粉末衍射(PXRD)判断所生成的纳米材料是否为ZIF-8。
结果如图7～9所示。
如图7所示，当醋酸锌浓度为20mM，甲基咪唑浓度为400mM时，使用肿瘤全细胞靶向试剂后，HeLa细胞细胞膜表面出现ZIF-8，且ZIF-8可以均匀包覆HeLa细胞。根据能量色散X-射线光谱元素分布图(图8)显示，可以发现C、P、O、Zn元素均均匀的分布于HeLa细胞膜表面，其中，P元素为细胞膜磷脂双分层主要元素，再次说明ZIF-8均匀的包覆在HeLa细胞细胞膜表面。通过PXRD表征，发现细胞膜表面所生长的纳米颗粒为ZIF-8(图9)。
2.肿瘤全细胞靶向试剂使用后在肿瘤细胞表面特异性生长ZIF-8的普适性：
具体实验步骤如下：
分别取处于对数生长期的HeLa细胞、A549细胞和MCF-7细胞，用PBS清洗，胰蛋白酶消化，收集，离心，重悬，获得HeLa细胞、A549细胞和MCF-7细胞悬液。取肿瘤全细胞靶向试剂(1μM)分别加入HeLa细胞、A549细胞和MCF-7细胞悬液中，4℃孵育30min，离心，PBS清洗掉未结合的部分。将细胞重悬于50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液中，加入醋酸锌溶液(20mM，稀释液为HEPES)，震荡5min，加入甲基咪唑(400mM，稀释液为HEPES)，混匀，室温震荡20min。同时设置不加入肿瘤全细胞靶向试剂的对照组。使用扫描电子显微镜(SEM)观察包覆效果，使用能量色散X-射线光谱元素分布图(EDS mapping)检测ZIF-8包覆后的形貌。
结果如图10～11所示。
如图10所示，使用肿瘤全细胞靶向试剂后，HeLa细胞、A549细胞和MCF-7细胞的细胞膜表面出现ZIF-8，且ZIF-8可以均匀包覆HeLa细胞、A549细胞和MCF-7细胞。根据能量色散X-射线光谱元素分布图(图11)显示，可以发现C、P、O、Zn元素均均匀的分布于HeLa细胞、A549细胞和MCF-7细胞膜表面，其中，P元素为细胞膜磷脂双分层主要元素，再次说明ZIF-8均匀的包覆在HeLa细胞、A549细胞和MCF-7细胞细胞膜表面。
3.肿瘤全细胞靶向试剂使用后对细胞活力的影响：
根据上述实施例中的操作，使用1μM的肿瘤全细胞靶向试剂，使HeLa细胞、A549细胞、MCF-7细胞和B16细胞细胞膜表面原位生长ZIF-8，离心，去上清，得到HeLa@AS1411-1@ZIF-8、A549@AS1411-1@ZIF-8、MCF-7@AS1411-1@ZIF-8、B16@AS1411-1@ZIF-8。将获得的HeLa@AS1411-1@ZIF-8、A549@AS1411-1@ZIF-8、MCF-7@AS1411-1@ZIF-8、B16@AS1411-1@ZIF-8分别接种于96孔板中，细胞密度5000/孔，向每孔中加入细胞ATP检测试剂(CellTiter-LumiTM发光法细胞活力检测试剂)，室温振荡5分钟，以促进细胞的裂解，避光孵育10分钟，使发光信号趋于稳定。使用多功能酶标仪进行化学发光检测。
上述步骤均在HEPES缓冲溶液中进行，以模拟细胞生存环境。
结果如图12所示。
可以发现，MCF-7细胞、A549细胞、HeLa细胞和B16细胞的细胞存活率分别为82.5％、77.4％、84.1％和84.1％。上述数据可以说明，在细胞适宜生存环境中，使用肿瘤全细胞靶向试剂并不会对正常细胞带来实际损伤，本发明中的肿瘤全细胞靶向试剂具有较好的生物相容性。
4.肿瘤全细胞靶向试剂促使癌细胞凋亡实验：
根据上述实施例中的操作，使用1μM的肿瘤全细胞靶向试剂，使模板细胞(B16细胞)细胞膜表面原位生长ZIF-8，离心，去上清，得到B16@AS1411-1@ZIF-8。将获得的B16@AS1411-1@ZIF-8置于新鲜无血清的DMEM培养基中孵育3h，同时设置不做任何处理的B16空白组、ZIF-8对照组(ZIF-8加入量为1mg/mL)与B16@ZIF-8对照组(ZIF-8加入量为1mg/mL)。分别使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)检测实验组、对照组和空白组中的细胞凋亡情况(室温避光孵育10min，流式细胞仪检测荧光)。
结果如图13所示。
空白组中的B16细胞存在少量凋亡，凋亡率约为4.4％，而实验对照组中的ZIF-8(1mg/mL)对照组的凋亡率为3.2％，B16@ZIF-8对照组的凋亡率为33.5％，实验组B16@AS1411-1@ZIF-8的细胞凋亡率为99.2％。从数据可知，实验组B16@AS1411-1@ZIF-8中的大部分细胞均处于凋亡状态。因此，可以说明，在使用1μM的肿瘤全细胞靶向试剂后，使ZIF-8包裹癌细胞后，由于癌细胞与细胞外基质的相互作用缺失，从而导致细胞出现失巢凋亡，加速或促进了癌细胞的凋亡。
为了进一步验证上述结论，根据上述实施例中的操作，制备B16@ZIF-8和B16@AS1411-1@ZIF-8。将获得的B16@ZIF-8和B16@AS1411-1@ZIF-8用新鲜培养基重新孵育3h，使用Alexa Fluor 488-CRT抗体进行处理，孵育0.5h，用多聚甲醛(4％，v/v)固定细胞，DAPI染色细胞核，用405nm和488nm激光在激光共聚焦下观察CRT分子暴露。同时，使用DOX(2μM)孵育B16细胞12h作为阳性对照，使用Alexa Fluor 488-CRT抗体进行处理，孵育0.5h，使用流式细胞仪分析检测B16@AS1411-1@ZIF-8诱导的CRT暴露。设置B16空白组(仅加入PBS)。
结果如图14所示。
如图14所示，未处理的空白对照组B16细胞和B16@ZIF-8组的CRT阳性率较低(分别为3.3％和8.8％)，而B16@AS1411-1@ZIF-8组的CRT阳性率高达99.2％，阳性对照DOX处理组中的B16细胞的CRT阳性率为99.7％，可以发现，B16@AS1411-1@ZIF-8组的CRT阳性率与阳性对照的CRT阳性率十分接近，因此，可以认为通过本方法使细胞发生免疫原性死亡，可以用做后续疫苗的检测。
5.活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测：
为了进一步研究细胞发生免疫原性死亡(immungentic cell death,ICD)的原因，将上述实施例制备得到的B16@AS1411-1@ZIF-8置于新鲜无血清DMEM培养基中孵育3h，加入细胞活性氧检测试剂(2,7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，37℃孵育30min，用预冷的PBS清洗三次，使用激光共聚焦对活性氧荧光进行检测。设置B16细胞空白组合ROS阳性对照(Rosup，购自上海碧云天生物技术有限公司)。
结果如图15所示。
由图15可知，空白组并未显示出荧光，而实验组和阳性对照组均出现较强的绿色荧光，由此可见，在正常的B16细胞中几乎不会或仅产生极少的活性氧，而经过肿瘤全细胞靶向试剂处理的肿瘤全细胞则会产生较多的活性氧，证明原位合成ZIF-8包封的细胞免疫原性死亡可能是由细胞内ROS水平升高引起的。
6.肿瘤全细胞靶向试剂的促体外巨噬细胞吞噬效果：
取处于对数生长期的巨噬细胞RAW264.7接种于48孔板中，细胞密度8000/孔，在5％CO2、37℃条件下培养至细胞贴壁。向每孔加入B16@AS1411-1@ZIF-8(细胞数为5×105个B16细胞)，分别孵育1、6、12和24h。加入荧光染料磺酰罗丹明B(SRB)进行荧光染色，洗净多余的荧光染料，使用激光共聚焦检测荧光强度。
结果如图16所示。
可以发现，随着孵育时间的增长，巨噬细胞RAW264.7吞噬B16@AS1411-1@ZIF-8的量未出现显著增加，说明了上述实施例制备得到的B16@AS1411-1@ZIF-8可以有效逃避巨噬细胞的吞噬，顺利进入血液循环，从而提高了其实际利用率。
7.肿瘤全细胞靶向试剂使用后对体外细胞因子的影响：
取处于对数生长期的巨噬细胞RAW264.7接种于48孔板中，细胞密度8000/孔，在5％CO2、37℃条件下培养至细胞贴壁。向每孔加入B16@AS1411-1@ZIF-8(细胞数为5×105个B16细胞)，分别孵育1、6、12和24h。同时，设置同时设置空白对照组(Control)，细胞裂解液组(Lysate)与ZIF-8组(1mg/mL)。孵育结束后，离心，取上清，使用ELISA试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)对肿瘤坏死因子TNF-α以及白细胞介素-6(IL-6)进行检测。
结果如图17所示。
从图17可以看出，孵育48h后，B16@AS1411-1@ZIF-8能够显著刺激巨噬细胞RAW264.7中的TNF-α水平，相较于未使用肿瘤全细胞靶向试剂的空白对照组(Control)，B16@AS1411-1@ZIF-8处理后的TNF-α水平约是空白对照组的11.50倍。而根据IL-6的ELISA检测结果来看，B16@AS1411-1@ZIF-8组在不同时间点的IL-6浓度均高于空白对照组，孵育48h后，B16@AS1411-1@ZIF-8组刺激巨噬细胞RAW264.7中的IL-6水平，相较于未使用肿瘤全细胞靶向试剂的空白对照组(Control)，B16@AS1411-1@ZIF-8处理后的IL-6水平约是空白对照组的1.72倍，但远低于脂多糖(LPS)处理的阳性组(LPS，200ng/mL)。上述结果说明，使用上述实施例中的肿瘤全细胞靶向试剂在体外可以有效激起免疫原性反应，并不会导致全身炎症反应，无明显副作用，具有较高的安全性。
8.肿瘤全细胞靶向试剂的体内肿瘤拮抗效果检测：
在本实施例中，采用5～8周的Balb/c雌鼠为试验对象。
将5-8周的Balb/c雌鼠随机分为5组(PBS组、ZIF-8组、细胞裂解液(B16 Lysate)组、B16@ZIF-8组与B16@AS1411-1@ZIF-8组)，每组5只。
根据分组情况，每组分别接受三次尾静脉注射(分别注射PBS(200uL)、ZIF-8(10mg/kg)、B16 Lysate(5×105个B16细胞/200uL)、B16@ZIF-8(5×105个B16细胞/200uL)、B16@AS1411-1@ZIF-8(5×105个B16细胞/200uL))，每次免疫注射间隔7天，第3次免疫注射72h后，分别将B16细胞(5×105个B16细胞)皮下植入小鼠背部。监测各组小鼠体重与肿瘤体积(每两天一次)，18天后处死小鼠，收集小鼠血液，检测血液T淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞所占的比例。
实验流程如图18所示。
结果如图19～22所示。
由图19可知，在小鼠背部植入B16细胞后，B16@AS1411-1@ZIF-8处理组的小鼠几乎没有长出任何肿瘤，而其他组(PBS组、ZIF-8组、细胞裂解液(B16 Lysate)组、B16@ZIF-8组)则均出现肿瘤，且生长速度较快。实验进行18天后，B16@AS1411-1@ZIF-8处理组的肿瘤体积显著小于PBS组、ZIF-8组和细胞裂解液组，肿瘤体积约为PBS组的3.8％。其结论与18天后从安乐死小鼠中切除肿瘤的重量对比情况一致，上述实施例中的肿瘤全细胞靶向试剂显著抑制肿瘤生长，抑制率可达96.7％，显示出优越的体内肿瘤预防效果。
同时，发明人还通过监测各组小鼠体重，发现使用B16@AS1411-1@ZIF-8接种C57BL/6小鼠后，小鼠体重无明显波动(图20)。在安乐死各组小鼠之后，取其心、肝、脾、肺、肾等器官，使用福尔马林固定，石蜡包埋，切片，制成2mm切片(H&E染色)，在光学显微镜下观察。发现各组小鼠主要器官包括肝、脾、肺、肾和心脏的H&E染色图像显示出上述实施例中的肿瘤全细胞靶向试剂具有较高的生物相容性，说明上述实施例中的肿瘤全细胞靶向试剂具有较好的体内使用安全性。
此外，在实验完成后，从小鼠血液和脾脏制得的单细胞悬液中提取得到的T淋巴细胞，用CD3、CD4、CD8抗体进行染色。然后使用流式细胞术检测细胞毒性T淋巴细胞(CD3+CD8+)和辅助性T细胞(CD3+CD4+)。发现，与PBS处理组相比(细胞毒性T淋巴细胞占比10.6％，辅助性T细胞占比8.8％)，B16@AS1411-1@ZIF-8处理组中的血液中CD4+和CD8+T细胞的百分比分别为61.8％和22.9％，CD4+和CD8+T细胞的百分比相较于PBS处理组均有显著增加。同样，在小鼠脾脏中，B16@AS1411-1@ZIF-8处理后的CD4+和CD8+T细胞也均有表达上调，从而可以说明，上述实施例中的肿瘤全细胞靶向试剂可同时激活CD4+和CD8+T细胞，有效增强免疫反应，防止肿瘤生长，具有极高的应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种肿瘤全细胞靶向试剂及其制备方法及应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> AS1411
<400> 1
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26

Claims (4)

1.一种具有癌细胞细胞膜靶向杀伤作用的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子由金属有机框架配体ZIF-8和癌细胞细胞膜靶向序列组成；
所述癌细胞细胞膜靶向序列为核酸适配体AS1411，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述金属有机框架配体连接在所述癌细胞细胞膜靶向序列的5’端。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子3’端连接有荧光基团，所述荧光基团包括FAM、VIC或Cy5。
3.一种癌症治疗试剂，其特征在于，所述癌症治疗试剂中含有权利要求1~2任一项所述的核酸分子，所述癌症为黑色素瘤。
4.权利要求1~2任一项所述的核酸分子在制备癌症预防或治疗试剂中的应用；
所述试剂包括疫苗和药物；所述癌症为黑色素瘤。
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