CN112870224B - 一种放疗增敏剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种放疗增敏剂及其制备方法。所述放疗增敏剂包含二价锰或能够形成二价锰的源中的一种或两种多种。所述的放疗增敏剂能够联合放疗增效抑制肿瘤的效果。选用载体负载的二价锰作为放疗增敏剂的成分时，其能够在体内缓释Mn2+长达120小时。其制备方法简单，在合理剂量下基本无毒，原料成本低廉且易得，易推广使用，具有良好的应用前景。

Description

一种放疗增敏剂及其制备方法
技术领域
本发明属于肿瘤治疗药物领域，具体涉及一种作为放疗增敏剂的锰组合物及其制备方法。
背景技术
放疗对肿瘤的治疗作用一直归因于其能诱导肿瘤细胞DNA损伤或断裂，这可能导致肿瘤细胞直接死亡。然而，早在1953年，Mole等人研究发现局部的肿瘤接受放疗能够引起远端转移处没有接受放疗的肿瘤发生消退，他们认为这是放疗激活了系统性的抗肿瘤免疫反应，并把这种现象命名为远端效应。当发现放疗诱导的远端效应后，放疗引发机体的抗肿瘤免疫反应被寄予很高的期望。然而，机体对肿瘤的免疫耐受使这种远端效应发生的机率非常的低。
现在的证据表明，放疗除了直接依赖损伤DNA诱导肿瘤细胞死亡外，放疗损伤的DNA释放到细胞质中能够被一种DNA感受器识别进而引发机体的抗肿瘤免疫反应。这种DNA感受器是cGAS(cGMP-AMP synthase)，它是一种核苷酸转移酶，它能产生内源性的免疫刺激分子2′-3′环AMP-GMP(cGAMP)，cGAMP能够与干扰素刺激基因蛋白(stimulator ofinterferon genes，STING)结合进而诱导细胞合成和分泌I型干扰素等炎性细胞因子。该通路被命名为cGAS-STING通路，它在诱导和调节机体免疫反应等过程中起到非常重要的作用。
金属锰的二价离子形式(Mn2+)可增强cGAS对细胞质中DNA的识别以促进cGAMP的合成，以及增强cGAMP与STING的结合，从而促进I型干扰素的产生和细胞抗病毒感染的能力。
Mn2+能够作为佐剂联合OVA抗原肌肉注射增加机体对抗原OVA的免疫反应性。此外，Mn2+联合肿瘤细胞裂解物制备的肿瘤疫苗能够通过激活免疫细胞的cGAS-STING通路引发机体的抗肿瘤免疫反应。
临床试验结果显示，Mn2+能够增强免疫检查点抑制剂抗PD-1抗体的治疗效果。
CN107412260A公开了Mn2+是一种cGAS-STING通路激活剂，具有增强免疫的作用，例如可用作免疫佐剂。然而，现有技术仍然缺乏进一步提高肿瘤放疗治疗效果的方案。
发明内容
针对上述问题，为了提高放疗的治疗效果，发明人探究向肿瘤递送Mn2+以试图增强cGAS对放疗损伤的DNA的识别，进而有效地激活cGAS-STING通路，诱导更强的远端效应。
发明人在探究时发现，单独向肿瘤注射Mn2+而不联合放疗并不能抑制肿瘤的生长，向肿瘤中注射Mn2+联合放疗却能够抑制肿瘤生长。
更重要的是，研究过程中还发现，向放疗后的肿瘤中注射Mn2+的时间对放疗的作用有明显的影响。放疗后立即向肿瘤中注射Mn2+并不能增效放疗，但是放疗24小时后瘤内注射Mn2+能够增效放疗作用。
发明人发现瘤内注射游离的Mn2+很快就被机体代谢并积累在肾脏部位。发明人认为这种游离的Mn2+由于被机体快速代谢而不能维持Mn2+在肿瘤中的局部浓度，所以放疗后立即瘤内注射Mn2+不能增效放疗。
发明人在此基础上完成了本发明，本发明的目的在于提供Mn2+的新用途，即Mn2+在制备放疗增敏剂中的应用，以及含有Mn2+的放疗增敏剂。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明提供一种放疗增敏剂，所述放疗增敏剂含有二价锰或能够形成二价锰的源中的一种或多种。
优选的，所述二价锰为游离态Mn2+或载体负载的二价锰中的一种或多种；所述载体为药学上可接受的载体。
优选的，所述游离态Mn2+源自氯化锰、硫酸锰或醋酸锰中的一种或多种。
优选的，所述载体为多糖或蛋白中的一种或多种。
优选的，所述多糖为海藻酸、海藻酸钠、壳聚糖、N-羧甲基壳聚糖或β-环糊精中的一种或多种。
优选的，所述蛋白为白蛋白、血清蛋白、转铁蛋白、珠蛋白、血红蛋白或肌红蛋白中的一种或多种。
优选的，所述能够形成二价锰的源为氢氧化锰、磷酸锰、磷酸氢锰或磷酸二氢锰中的一种或多种。
优选的，所述放疗增敏剂适用于食管癌、头颈癌、鼻咽癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、肉瘤、胆管癌、膀胱癌、肾癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌或子宫癌的放疗增敏。
优选的，所述二价锰在所述放疗增敏剂中的质量分数为0.001％～6％。
优选的，所述放疗增敏剂为适用于X射线、电子线或质子射线放疗的放疗增敏剂。
作为最优选的技术方案，所述二价锰以海藻酸锰凝胶的形态存在。
优选的，所述放疗增敏剂为注射制剂或半固体制剂。
本发明还提供一种二价锰在制备放疗增敏剂中的应用。
本发明还提供含有载体负载的二价锰的放疗增敏剂的制备方法，所述载体为蛋白或多糖中的一种或多种，包括如下步骤：
将含有二价锰和/或能够形成二价锰的源的第二溶液加入到含有载体和/或能够形成所述载体的源的第一溶液中使二价锰和载体结合即得。
优选的，所述载体为多糖时，还可向二价锰和载体结合后得到的溶液中加入加入含有钙离子和/或能够形成钙离子的第三溶液；所述第三溶液和所述第二溶液的溶剂相同。最优选的，所述载体为海藻酸或海藻酸钠中的一种或多种。
优选的，所述第一溶液的溶剂是水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、甘露醇溶液或蔗糖溶液中的一种或多种。
优选的，所述第二溶液的溶剂是水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、乙醇水溶液、葡萄糖溶液或蔗糖溶液中的一种或多种。
优选的，制备体系的pH值为3～10，优选的pH值为5～8。
优选的，所述制备方法还包括外力辅助载体结合二价锰的步骤。
优选的，所述的外力为温度、变化压力、施加机械力或辐射中的一种或多种。
优选的，所述的变化压力为对反应施加10～10000psi的压力，优选地对反应施加200～1000psi的压力。
优选的，所述载体占所述放疗增敏剂总重量的0.01％～8％。
优选的，钙离子占所述放疗增敏剂总重量的0.0001％～4％。
上述制备方法制备得到的放疗增敏剂，即含有载体负载的二价锰的放疗增敏剂，其能够在体内缓释Mn2+长达120小时。
施用所述的放疗增敏剂增效放疗的方法，由两步过程组成：
A)放疗；和
B)施用放疗增敏剂。
任选地，过程A和过程B可以任意顺序先后完成。
优选地，所述施用选自瘤内注射、瘤周注射、皮下注射、静脉注射及其任意组合。
优选地，所述的放疗增敏剂给药时按其中二价锰的剂量折算不超过10mg/kg。
优选地，所述的放疗增敏剂的给药时间范围为放疗前7天内至放疗后7天内。
优选地，每次放疗之间的时间间隔不超过3天，单次放疗剂量不超过50Gy。
本发明的有益效果在于：
本发明所述的放疗增敏剂能够联合放疗增效抑制肿瘤的效果。
特别是，选用载体负载的二价锰作为放疗增敏剂的成分时，其能够在体内缓释Mn2+长达120小时。
本发明所述的放疗增敏剂中的锰离子为100μg/kg时即可提高放疗组的抑瘤率，这表明本发明制备的放疗增敏剂具有增效放疗的作用；尤其是当所述放疗增敏剂中的锰离子超过1mg/kg时，相比于没有给予放疗增敏剂的单独放疗组提高了放疗侧肿瘤65％的抑瘤率和未放疗侧90％的抑瘤率。这种放疗增敏效果在多种肿瘤模型中得到了验证，这进一步表明本发明提供的放疗增敏剂能够有效增效放疗。
总之，本发明提供了一种放疗增敏剂；并且本发明所述的放疗增敏剂制备简单，在合理剂量下基本无毒，原料成本低廉且易得，易推广使用，具有良好的应用前景。
附图说明
下面通过对本发明的详细描述以及附图清楚地说明本发明前面叙述的方面以及其他方面。为了举例说明本发明，在附图中的实施方案是目前优选的，然而，可以理解，本发明并不限于所公开的特定实施方案。
图1图示了实施例1中体外B16F10肿瘤细胞在接受放疗后的DNA损伤会随着时间的推移而积累在细胞质中。图1A示肿瘤细胞接受8Gy放疗后不同时间点的激光共聚焦显微镜图；图1B为对图1A肿瘤细胞核外DNA损伤积累的定量统计。图1C和1D图示了BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)放疗后损伤的DNA随时间积累。图1C示放疗后不同时间点离体的CT26肿瘤切片DNA荧光染色激光共聚焦显微镜图；图1D为对图1C中细胞核外DNA损伤积累的定量统计。
图2图示了实施例2中锰离子联合放疗后的肿瘤细胞以激活小鼠骨髓来源的树突状细胞I型干扰素通路。图2A示锰离子、放疗后的B16F10肿瘤细胞和小鼠骨髓来源的树突状细胞共孵育不同时间后，I型干扰素的表达量，未放疗的B16F10肿瘤细胞和未添加锰离子作为对照。图2B示锰离子、放疗后的CT26肿瘤细胞与小鼠巨噬细胞Raw264.7共孵育24小时后，I型干扰素的表达量。
图3图示了实施例3BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)放疗后立即瘤内注射+2价锰离子的治疗效果图。图3A为治疗方案示意图；图3B为BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)放疗侧肿瘤体积生长变化曲线；图3C为BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)未治疗侧肿瘤体积生长变化曲线；图3D为BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)生存曲线。
图4图示了实施例3BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)放疗24小时后瘤内注射锰离子的治疗效果图。图4A为治疗方案示意图；图4B为BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)放疗侧肿瘤体积生长变化曲线；图4C为BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)未治疗侧肿瘤体积生长变化曲线；图4D为BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)生存曲线。
图5图示了实施例15中缓释锰组合物能够向肿瘤缓释+2价锰离子。图5A为海藻酸-锰组合物缓释锰的示意图；图5B示海藻酸-锰组合物在小鼠体内缓释+2价锰离子的核磁成像图；图5C为海藻酸-锰组合物释放到肿瘤中的+2价锰离子在不同时间点的浓度定量。
图6图示了实施例16中BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)放疗24小时后瘤周注射缓释锰组合物能够显著抑制CT26结肠癌肿瘤的生长。图6A为治疗方案示意图；图7B为BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)放疗侧肿瘤体积生长变化曲线；图6C为BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)未治疗侧肿瘤体积生长变化曲线；图6D为BALB/c荷瘤小鼠(CT26肿瘤)生存曲线。
图7图示了实施例16中C57BL/6荷瘤小鼠(黑色素瘤B16F10)放疗24小时后瘤周注射缓释锰组合物能够显著抑制B16F10黑色素瘤的生长。图7A为治疗方案示意图；图7B为C57BL/6荷瘤小鼠(黑色素瘤B16F10)放疗侧肿瘤体积生长变化曲线；图7C为C57BL/6荷瘤小鼠(黑色素瘤B16F10)未治疗侧肿瘤体积生长变化曲线；图7D为C57BL/6荷瘤小鼠(黑色素瘤B16F10)生存曲线。
图8图示了实施例16中按照图7A的治疗方案对C57BL/6荷瘤小鼠(黑色素瘤B16F10)治疗10天后的实拍图。
图9图示了实施例17中缓释锰组合物联合放疗能够显著逆转黑色素瘤B16F10的免疫抑制微环境。图9A为采用氯化锰-海藻酸缓释锰组合物按照图7A的治疗方案对C57BL/6荷瘤小鼠(黑色素瘤B16F10)治疗7天后，治疗测肿瘤和远端未治疗侧的肿瘤中浸润的T淋巴细胞流式分析结果图；图9B为按照图7A的治疗方案对C57BL/6荷瘤小鼠(黑色素瘤B16F10)治疗2天后，治疗侧肿瘤的转录组学分析结果图；图9C为图9A肿瘤中浸润的CD3+T淋巴细胞统计分析结果图；图9D为肿瘤中浸润的CD8+T细胞占CD3+T淋巴细胞中的比例统计分析结果图；图9E为按照图7A的治疗方案对C57BL/6荷瘤小鼠(黑色素瘤B16F10)治疗7天后，治疗测肿瘤和远端未治疗侧的肿瘤中I型干扰素-γ的表达量。
图10图示了以氯化锰-海藻酸缓释锰组合物为例，其作为放疗增敏剂联合放疗用于肿瘤治疗的模式图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应了解这些实施例仅以举例的方式来说明，并不旨在限制本发明的范围。从上面的讨论以及这些例子中，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，而且在不脱离其本质和范围的情况下，能够对本发明做出各方面的改变和修改来使之适应各种各样的用法和条件。
定义
本文中所使用的术语“放疗”是指采用一定剂量的X射线对选定的对象进行照射这一过程，下文附图中放疗以“RT”表示。
本文中所使用的术语“锰离子”，即为所述二价锰，可以是游离态Mn2+或载体负载的二价锰中的一种或两种；所述载体为药学上可接受的载体，下文附图中锰离子以“Mn”表示。
本文中所使用的术语“缓释锰组合物”，即为所述载体负载的二价锰，其可以是海藻酸、海藻酸钠、壳聚糖、N-羧甲基壳聚糖、β-环糊精、白蛋白、血清蛋白、转铁蛋白、珠蛋白、血红蛋白、肌红蛋白，或者他们的组合或者其任意组合负载二价锰构成的缓释锰组合物。所述缓释锰组合物是药学上可接受的。
本文使用的术语例如“包含”、“含”、“含有”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，“或”、“或者”意指“和/或”。
本文使用的术语“药学上可接受的载体”可选自：水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的放疗增敏剂是否配制为用于经瘤内、瘤周、皮下或静脉施用。
本文使用的术语“施用”意指以在药理学上可用的方式向对象提供物质。
本文所使用的术语“对象”意指动物，包括温血哺乳动物，例如人和灵长类动物；鸟类；驯养的家养或农场动物，例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验室动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鱼；爬行动物；动物园动物和野生动物等。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。
除非另有说明，任何关于本方法和产品一种实施方案公开的组分、元素、属性或者步骤可以应用于任何其他在此公开的方法和产品。
本文公开的每项专利、专利申请、引用的出版物或者本文件中的描述以参考的方式整体并入文本中。
抗体和试剂
抗体来源如下：抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体购自BioLegend。
除另有说明外，所有化学品购自Sigma-Aldrich。海藻酸(阿拉丁)、PicoGreen(翊圣生物)、小鼠干扰素-beta ELISA Kit(BioLegend)、小鼠干扰素-γELISA Kit(BioLegend)和DAPI(碧云天生物)、人血白蛋白(杰特贝林)均为商业化产品。
细胞
B16F10细胞培养于添加有10％FBS(Gibco)、5μg/ml青霉素和10μg/ml链霉素的DMEM(Gibco)培养基中。CT26细胞培养于添加有10％FBS(Gibco)、5μg/ml青霉素和10μg/ml链霉素的RPMI-1640(Gibco)培养基中。骨髓来源的树突状细胞(bone marrow deriveddendritic cells,BMDCs)在含有10ng/mL GM-CSF(Abcam)、10ng/mL IL-4(Abcam)、10％FBS(Gibco)的RPMI-1640(Gibco)培养基中诱导，第3天补充上述培养基，第5天半量更换培养基，第7天进行收集BMDCs用于实验。
小鼠
实验过程中使用的BALB/c雄性小鼠(6-8周龄)和C57BL/6小鼠(6-8周龄)均购自扬州大学比较医学中心，按照南京大学动物护理和使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee of Nanjing University,IACUC-NJU)要求饲养。
统计分析
生物学重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SE展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。采用t检验或方差分析比较两组或两组以上的平均值差异。生存率用Kaplan-Meier法和对数秩检验进行分析。统计分析差异p值＜0.05、p值＜0.01和p值＜0.001时均被认为存在显著的差异，并分别以“*”、“**”和“***”在下文附图中展示。
实施例1.放疗损伤肿瘤细胞的DNA缓慢积累到细胞质中。
细胞的胞质中除了线粒体中存在少量的DNA外，在正常情况下并不会存在DNA。细胞接受放疗会发生DNA损伤，损伤的DNA可能会泄露到细胞质中，泄露到胞质中的DNA可以采用双链DNA染色试剂PicoGreen进行染色并用于观察和定量分析，实验方法具体如下：
将B16F10肿瘤细胞按照10000个/mL的密度接种在细胞培养皿中。24小时后接受放疗，剂量为8Gy，不接受放疗的B16F10肿瘤细胞作为对照组。采用PicoGreen对放疗后指定时间点的细胞进行染色，然后用激光共聚焦显微镜观察放疗和未放疗的肿瘤细胞的细胞核外DNA的积累情况并统计分析(如图1所示)。
结果显示：B16F10肿瘤细胞放疗后6小时内，细胞质中没有损伤的DNA，B16F10肿瘤细胞放疗24小时后明显观察到细胞质中积累了损伤的DNA，并且随着时间的推移至72小时，细胞质中积累了更多的DNA，与前人研究结果一致，即放疗诱导的肿瘤细胞DNA损伤可通过有丝分裂积累到胞质中。
进一步地，发明人观察了体内肿瘤组织接受放疗后，肿瘤DNA损伤的积累情况。将0.1mL的3×106个/mL的CT26肿瘤细胞皮下接种在小鼠腹部，待肿瘤生长至300mm3后，对肿瘤进行放疗，剂量为5Gy；放疗后在指定的时间点取出肿瘤组织进行切片，并采用PicoGreen对肿瘤切片进行染色，采用激光共聚焦显微镜对组织切片进行观察(如图1C)。结果与体外实验一致，放疗后损伤的肿瘤细胞DNA需要长达24小时进行积累，
实施例2.锰离子联合放疗的肿瘤细胞刺激免疫细胞分泌I型干扰素
肿瘤细胞表达I型干扰素的通路多数情况下是被阻断状态，所以肿瘤细胞接受放疗后分泌I型干扰素的能力很弱，将免疫细胞与肿瘤细胞共孵育可以检测免疫细胞的I型干扰素表达情况。选择BMDCs和Raw264.7两种免疫细胞分别与放疗的B16F10和CT26细胞共孵育，检测培养上清液中I型干扰素的浓度，具体实验方法如下：
将B16F10细胞按照50000个/mL的密度接种在六孔板中。24小时后接受放疗，剂量为8Gy。将BMDCs以200000个/孔加入六孔板中与B16F10细胞共孵育，加入含有锰离子的培养基使得锰离子终浓度为200μM，锰离子与细胞的孵育时间2小时或一直与细胞共孵育。分别在加入BMDCs后的指定时间点收集细胞培养上清液采用Mouse IFN-βELISA Kit检测其中IFN-β的含量(如图2A)。该方法同时在CT26肿瘤细胞上进行了验证，将放疗的CT26细胞与Raw264.7共培养时加入锰离子孵育24小时并检测上清培养液中IFN-β的含量(如图2B)。
结果表明，延长锰离子与细胞的共孵育时间对细胞分泌I型干扰素具有显著性的促进作用，这可能是因为短期放疗诱导的细胞DNA损伤没有释放到细胞质中而不能被cGAS所识别，所以短时间的与锰离子共孵育不能有效地促进细胞分泌I型干扰素。
实施例3.锰离子联合放疗对体内CT26肿瘤抑制实验
CT26小鼠模型构建：实验过程中使用的BALB/c雌性小鼠(6-8周龄)均购于扬州大学比较医学中心，按照IACUC-NJU的要求饲养。小鼠每笼5-6只，能够自由饮水进食，控制12h光照和12h黑暗，维持小鼠健康生长。
CT26荷瘤小鼠模型的制作方法如下：将小鼠腹部左右两侧的毛剔除，将0.1mL的3×106个/mL的CT26肿瘤细胞的悬液注射到小鼠右侧腹部皮下，将0.1mL的1×106个/mL的CT26肿瘤细胞的悬液注射到小鼠左侧腹部皮下，待右侧肿瘤长到约100mm3左右时随机分为4组：生理盐水(Saline)，Mn离子组(Mn)，放疗组(RT)和锰离子联合放疗组(Mn+RT)。治疗方案如图3A和4A所示，放疗增敏剂通过瘤内注射到荷瘤小鼠体内，给药体积为200μL；放疗剂量为5Gy。小鼠肿瘤体积V是根据该公式计算出：V＝D×d2/2，其中D是肿瘤的长直径，d是肿瘤的短直径。治疗期间每天记录两侧肿瘤的大小和小鼠的体重并绘制肿瘤生长曲线(如图3和图4所示)。
结果显示，放疗后立即瘤内注射放疗增敏剂组与放疗组的治疗效果没有区别；然而，放疗24小时后瘤内注射放疗增敏剂组小鼠治疗侧肿瘤体积和未治疗侧肿瘤体积均显著减少；单独瘤内注射放疗增敏剂没有治疗效果(如图3B、3C和图4B、4C所示)。
进一步地，对治疗后对荷瘤小鼠的生存情况进行了统计分析，结果显示放疗后瘤内立即注射放疗增敏剂不能延长荷瘤小鼠的生存时间，而放疗24小时后瘤内注射锰离子能显著延长小鼠生存时间。
本实施例中，所注射的放疗增敏剂为氯化锰水溶液。
实施例4.氢氧化锰-白蛋白缓释锰组合物的制备
100mg白蛋白溶于10mL pH7.0的含有0.05M乙醇的磷酸盐缓冲液，在60℃下持续搅拌2小时，再加入0.5mL200 mg/mL的氯化锰水溶液，混合均匀并持续搅拌10分钟，加入2mL1M的氢氧化钠溶液并持续搅拌，得到的悬液透明呈褐色，且载锰离子的粒径约139nm，(BIC90plus Particle Size Analyzer)。采用干法消化：精密称制备的氢氧化锰-白蛋白缓释锰组合物并置于坩埚中，放在电炉上加热至炭化，移入马弗炉中500℃下加热4h。若仍有黑色炭粒存在，则补加少量5％硝酸，在电炉上加热蒸干，再移入马弗炉中500℃加热2h，直至样品全部变为白色粉末，加超纯水定容至10mL。采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，PerKinElmer，Avio500)检测其中锰离子的含量。分析结果表明Mn2+载量达90％。
实施例5.磷酸氢锰-白蛋白缓释锰组合物的制备
100mg白蛋白溶于10mL pH7.0的含有0.05M的乙醇-生理盐水缓冲液，在60℃下持续搅拌2小时，再加入0.5mL200 mg/mL的氯化锰水溶液，混合均匀并持续搅拌10分钟，加入2mL 0.5M的磷酸氢二钠溶液并持续搅拌，得到的悬液透明呈白色，且载锰离子的粒径约254nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。采用干法消化样品，并采用ICP-OES(PerKinElmer，Avio500)检测其中锰离子的含量。分析结果表明Mn2+载量达20％。
100mg白蛋白溶于10mL pH7.0的含有0.05M的乙醇-生理盐水缓冲液，在60℃下持续搅拌2小时，再加入0.5mL200 mg/mL的氯化锰水溶液，混合均匀并持续搅拌10分钟，加入2mL 1M的磷酸二氢钠溶液并持续搅拌，得到的悬液透明呈白色，且载锰离子的粒径约310nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。采用干法消化所的样品，并采用ICP-OES(PerKinElmer，Avio500)检测其中锰离子的含量。分析结果表明Mn2+载量达20％。
实施例6.磷酸锰-白蛋白缓释锰组合物的制备
100mg白蛋白溶于10mL pH7.0的含有0.05M的乙醇-生理盐水缓冲液，在60℃下持续搅拌2小时，再加入0.5mL200mg/mL的氯化锰水溶液，混合均匀并持续搅拌10分钟，加入2mL 0.5M的磷酸钠溶液并持续搅拌，得到的悬液透明呈白色，且载锰离子的粒径约290nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。采用干法消化样品，并采用ICP-OES(PerKinElmer，Avio500)检测其中锰离子的含量。分析结果表明Mn2+载量达20％。
实施例7.氢氧化锰-血红蛋白缓释锰组合物的制备
100mg血红蛋白溶于10mL pH7.0的含有0.05M的乙醇-生理盐水缓冲液，在60℃下持续搅拌2小时，再加入0.5mL200mg/mL的氯化锰水溶液，混合均匀并持续搅拌10分钟，加入2mL 1.5M的氢氧化钠溶液并持续搅拌，得到的悬液透明呈褐色，且载锰粒子的粒径约145nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。采用干法消化，并采用ICP-OES(PerKinElmer，Avio500)检测其中锰离子的含量。分析结果表明Mn2+载量达90％。
实施例8.磷酸锰-血红蛋白缓释锰组合物的制备
50mg血红蛋白溶于50mL pH7.4的含有0.05M的乙醇-生理盐水缓冲液，在60℃下持续搅拌2小时，再加入0.5mL200mg/mL的氯化锰水溶液，混合均匀并持续搅拌10分钟，加入2mL 0.5M的磷酸钠溶液并持续搅拌，得到的悬液透明呈白色，且载锰粒子的粒径约265nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。采用干法消化，并采用ICP-OES(PerKinElmer，Avio500)检测其中锰离子的含量。分析结果表明Mn2+载量达35％。
实施例9.氢氧化锰-珠蛋白缓释锰组合物的制备
50mg珠蛋白溶于10mL pH7.0的含有0.05M的乙醇-生理盐水缓冲液，在60℃下持续搅拌2小时，再加入0.5mL200mg/mL的氯化锰水溶液，混合均匀并持续搅拌10分钟，加入2mL1M的氢氧化钠溶液并持续搅拌，得到的悬液透明呈褐色，且载锰粒子的粒径约80-250nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。采用干法消化，并采用ICP-OES(PerKinElmer，Avio500)检测其中锰离子的含量。分析结果表明Mn2+载量达90％。
实施例10.磷酸锰-珠蛋白缓释锰组合物的制备
50mg珠蛋白溶于10mL pH7.0的含有0.05M的乙醇-生理盐水缓冲液，在60℃下持续搅拌2小时，再加入0.5mL200mg/mL的氯化锰水溶液，混合均匀并持续搅拌10分钟，加入2mL0.5M的磷酸钠溶液并持续搅拌，得到的悬液透明呈白色，且载锰粒子的粒径约100-300nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。采用干法消化样品，并采用ICP-OES(PerKinElmer，Avio500)检测其中锰离子的含量。分析结果表明Mn2+载量达75％。
实施例11.氯化锰-海藻酸缓释锰组合物的制备
海藻酸作为(Alg)是一种天然高分子材料，具有螯合2价阳离子的特性，其与2价阳离子螯合能力依下列顺序而减弱：Pb2+>Ca2+>Zn2+>Co2+>Mn2+，其中海藻酸与Ca2+的螯合能力是其与Mn2+螯合能力的1000倍。
在70℃水浴且磁力搅拌下，向50mL磷酸盐缓冲液中缓缓加入2.0g海藻酸钠固体溶解配制成质量分数为4％的海藻酸钠溶液并经103.4kPa压力、121℃灭菌15分钟。配制浓度2mM的氯化锰水溶液和2mM的氯化钙水溶液并经103.4kPa压力、121℃灭菌15分钟。取4％海藻酸钠水溶液与2mM氯化锰水溶液和2mM的氯化钙水溶液1:1:1等体积混合均匀制备成氯化锰-海藻酸缓释锰组合物。
实施例12.硫酸锰-海藻酸缓释锰组合物的制备
在70℃水浴且磁力搅拌下，向50mL磷酸盐缓冲液中缓缓加入2.0g海藻酸钠固体溶解配制成质量分数为4％的海藻酸钠溶液并经103.4kPa压力、121℃灭菌15分钟。配制浓度2mM的硫酸锰水溶液并经103.4kPa压力、121℃灭菌15分钟。取4％海藻酸钠溶液与2mM硫酸锰水溶液1:1等体积混合均匀制备成硫酸锰-海藻酸缓释锰组合物。
实施例13.氯化锰-壳聚糖缓释锰组合物的制备
在60℃水浴且磁力搅拌下，向50mL蒸馏水中缓缓加入1.0g溶解配制成质量分数为2％的壳聚糖溶液并经103.4kPa压力、121℃灭菌15分钟。配制浓度2mM的硫酸锰水溶液并经103.4kPa压力、121℃灭菌15分钟。取4％壳聚糖水溶液与2mM硫酸锰水溶液1:1等体积混合均匀制备成硫酸锰-壳聚糖缓释锰组合物。
实施例14.硫酸锰-壳聚糖缓释锰组合物的制备
在60℃水浴且磁力搅拌下，向50mL蒸馏水中缓缓加入1.0g壳聚糖粉末溶解配制成质量分数为2％的壳聚糖溶液并经103.4kPa压力、121℃灭菌15分钟。配制浓度2mM的硫酸锰水溶液并经103.4kPa压力、121℃灭菌15分钟。取4％壳聚糖水溶液与2mM硫酸锰水溶液1:1等体积混合均匀制备成硫酸锰-壳聚糖缓释锰组合物。
实施例15.缓释锰组合物延长锰离子在体内的代谢
这里以氯化锰-海藻酸缓释锰组合物为例。取BALB/c雌性小鼠(6-8周龄)分为锰离子组(MnCl2)和氯化锰-海藻酸缓释锰组合物组(Alg-Mn)，对分组的小鼠皮下分别接种上述制备的氯化锰-海藻酸缓释锰组合物、经灭菌的氯化锰溶液。采用异氟烷吸入式麻醉并固定小鼠，然后采用核磁共振成像仪对小鼠体内锰进行成像。对小鼠皮下缓释锰组合物中锰离子信号衰减情况进行观察，观察的时间节点为0h、1h、24h、72h、120h和240h。此外，采用皮下注射相同浓度的游离氯化锰水溶液作为对照，在上述时间节点下进行观察。图5B核磁成像结果显示，皮下注射的游离氯化锰在24h时基本代谢蓄积在肾脏部位，而氯化锰-海藻酸缓释锰组合物可维持较长时间的缓慢释放，大约在72h至120h基本完全释放出Mn2+。
进一步地，采用ICP-OES分别测定了荷瘤小鼠皮下氯化锰-海藻酸缓释锰组合物中锰离子的含量以及肿瘤中锰离子的含量。精密称取肿瘤样品采用干法消化，并采用ICP-OES对样品中的Mn2+精确定量。图5C定量检测结果与上述核磁成像检测结果相似，氯化锰-海藻酸缓释锰组合物在体内缓慢释放出Mn2+。
进一步地，验证了硫酸锰-海藻酸缓释锰组合物、氯化锰-壳聚糖缓释锰组合物、硫酸锰-壳聚糖缓释锰组合物、氢氧化锰-白蛋白缓释锰组合物、磷酸氢锰-白蛋白缓释锰组合物、磷酸锰-白蛋白缓释锰组合物、氢氧化锰-珠蛋白缓释锰组合物、磷酸锰-珠蛋白缓释锰组合物、氢氧化锰-血红蛋白缓释锰组合物、磷酸氢锰-血红蛋白缓释锰组合物在肿瘤中缓释Mn2+的能力。将各种通过上述实施例制备的缓释锰组合物通过瘤内注射到肿瘤中，精密称取各组0.1h、1h、24h和48h的肿瘤组织，采用干法消化肿瘤组织后经ICP-OES测定其中Mn2+的含量，计算出其在给药剂量中的相应占比，以作缓释Mn2+的表征。结果如表1所示：
表1.缓释锰组合物在肿瘤中释放锰离子
组别 给药后0.1h 给药后1h 给药后24h 给药后48h
MnCl<sub>2</sub> 40.2％ 20.0％ 2.0％ 0.1％
硫酸锰-海藻酸缓释锰组合物 5.1％ 12.7％ 46.5％ 49.8％
氯化锰-壳聚糖缓释锰组合物 3.2％ 8.2％ 36.6％ 43.5％
硫酸锰-壳聚糖缓释锰组合物 5.2％ 7.8％ 42.1％ 53.9％
氢氧化锰-白蛋白缓释锰组合物 100.5％ 100.2％ 75.1％ 37.6％
磷酸氢锰-白蛋白缓释锰组合物 98.6％ 100.0％ 84.3％ 42.1％
磷酸锰-白蛋白缓释锰组合物 100.6％ 98.8％ 75.2％ 22.8％
氢氧化锰-珠蛋白缓释锰组合物 99.9％ 98.9％ 65.8％ 32.9％
磷酸锰-珠蛋白缓释锰组合物 101.0％ 99.5％ 83.7％ 55.7％
氢氧化锰-血红蛋白缓释锰组合物 97.0％ 96.7％ 77.6％ 25.4％
磷酸氢锰-血红蛋白缓释锰组合物 100.7％ 97.9％ 73.1％ 45.6％
实施例16.缓释锰组合物在体内缓释锰离子以增效放疗
以氯化锰-海藻酸缓释锰组合物为例评估缓释锰组合物联合放疗的抑瘤实验。
构建双侧CT26肿瘤模型。
将0.1mL的3×106个/mL的CT26肿瘤细胞的悬液注射到小鼠右侧腹部皮下，将0.1mL的1×106个/mL的CT26肿瘤细胞的悬液注射到小鼠左侧腹部皮下，待右侧肿瘤长到约100mm3左右时进行随机分组。
实验分组：
瘤内注射生理盐水组(Saline)、瘤内注射游离氯化锰组(MnCl2)、瘤内注射Alg和生理盐水混合组(Alg)、瘤内注射缓释锰组合物组(Alg-Mn)、瘤内注射生理盐水联合放疗组(RT+Saline)、瘤内注射游离氯化锰联合放疗组(RT+MnCl2)、瘤内注射Alg和Saline混合联合放疗组(RT+Alg)和瘤内注射缓释锰组合物联合放疗组(RT+Alg-Mn)，每组9-10只小鼠。
治疗方案如图6A，将小鼠麻醉固定后，对需要放疗的小鼠右侧肿瘤(右侧为治疗侧，左侧为远端肿瘤不放疗)进行放射治疗，放射剂量5Gy，放疗当天作为药效实验的第8天。第9天分别对不同组小鼠按照上述分组方案进行治疗。每天称量并记录小鼠体重，同时用分别游标卡尺测量并记录小鼠左右两侧的肿瘤长径(D)和短径(d)，按以下公式计算每只小鼠的肿瘤体积(V)：V＝D×d2/2，计算出每组小鼠左右两侧肿瘤体积的平均值和标准误差SE(Standard error)，绘制肿瘤生长曲线。
结果显示RT+MnCl2组与RT+Alg-Mn组在治疗侧的肿瘤平均体积上无明显差异，RT+Alg组或RT+Saline组与RT+Alg-Mn组在治疗侧的肿瘤平均体积上有明显区别，统计分析p<0.05(图6B)。从远端未接受治疗的肿瘤生长曲线来看，RT+Alg组或RT+Saline组与RT+Alg-Mn组的远端肿瘤平均体积上有非常明显区别，统计分析p<0.001(图6C)，此外RT+MnCl2组与RT+Alg-Mn组在远端肿瘤平均体积上也有显著性差异，p<0.01。
此外，我们也监测了小鼠经治疗后的存活时间，发现瘤周注射Alg-Mn联合放疗相比于单独放疗或者放疗后瘤内注射游离氯化锰都显著性延长了荷瘤小鼠的生存期(图6D)。以上的药效学的实验结果综合起来表明肿瘤瘤周注射Alg-Mn联合放疗比瘤内注射游离氯化锰联合放疗对肿瘤的治疗更有效。
进一步地，构建双侧B16F10黑色素肿瘤模型上评估以氢氧化锰-白蛋白缓释锰组合物为例的缓释锰组合物联合放疗的抑瘤实验。
将0.1mL的1.5×106个/mL的B16F10肿瘤细胞的悬液注射到小鼠右侧腹部皮下，将0.1mL的5×105个/mL的B16F10肿瘤细胞的悬液注射到小鼠左侧腹部皮下，待右侧肿瘤长到约100mm3左右时进行随机分成8组：
分别为瘤内注射生理盐水组(Saline)、瘤内注射游离氯化锰组(MnCl2)、瘤内注射白蛋白生理盐水溶液组(Alb)、瘤内注射氢氧化锰-白蛋白缓释锰组合物组(Alb-Mn)、瘤内注射生理盐水联合放疗组(RT+Saline)、瘤内注射游离氯化锰联合放疗组(RT+MnCl2)、瘤内注射白蛋白生理盐水溶液联合放疗组(RT+Alb)和瘤内注射氢氧化锰-白蛋白缓释锰组合物组联合放疗组(RT+Alb-Mn)，每组7-8只小鼠。
治疗方案如图7A，将小鼠麻醉固定后，对需要放疗的小鼠右侧肿瘤(右侧为治疗侧，左侧为远端肿瘤不放疗)进行放射治疗，放射剂量8Gy，放疗当天作为药效实验的第10天。第11天分别对不同组小鼠按照上述分组方案进行治疗。每天称量并记录小鼠体重，同时用分别游标卡尺测量并记录小鼠左右两侧的肿瘤长径(D)和短径(d)，按以下公式计算每只小鼠的肿瘤体积(V)：V＝D×d2/2，计算出每组小鼠左右两侧肿瘤体积的平均值和标准误差SE(Standard error)，绘制肿瘤生长曲线。
结果显示，RT+MnCl2组和RT+Alb-Mn组无论在治疗侧的还是远端的平均肿瘤体积都有明显的区别，统计分析均具有显著性差异(p<0.001，图7B和7C)。无论是RT+MnCl2组还是RT+Alb-Mn组对小鼠治疗侧肿瘤和远端肿瘤的生长抑制都比RT+Saline组和RT+Alb组的效果好，其中RT+Alb-Mn组的治疗效果最好。以上的实验结果综合起来表明，瘤内注射MnCl2确实能够增效放疗，而且在一定程度上能够增效放疗的远端效应，但是其治疗效果相比于肿瘤内注射Alb-Mn联合放疗的效果要略差一些。
实施例17.Alg-Mn联合放疗能够显著逆转黑色素瘤B16F10的免疫抑制微环境
实验a.转录组测序分析(RNA-Seq)肿瘤经氯化锰-海藻酸缓释锰组合物(Alg-Mn)联合放疗治疗后转录组学的变化：
同上述的B16F10双侧肿瘤模型实验，小鼠经瘤内给药后的第24h将小鼠颈椎脱臼处死，取各组小鼠的肿瘤组织(每组取3只)浸没在1mL的Trizol中交由上海凌恩生物科技有限公司完成对肿瘤组织RNA的提取及RNA-Seq部分实验，采用Ge SX等人开发的iDEP方法对转录组学实验数据进行分析处理，绘制相对基因表达的聚类分析图。
结果显示，RT+Alg-Mn组和RT+MnCl2组小鼠的肿瘤中干扰素基因和下游相关基因的表达明显上调，这说明Alg-Mn或MnCl2联合放疗能够逆转肿瘤免疫抑制微环境，促进机体的抗肿瘤免疫反应。
实验b.肿瘤浸润的T淋巴细胞流式分析实验：
同上述B16F10双侧肿瘤模型实验，小鼠经瘤内给药后的第7天将小鼠颈椎脱臼处死取各组小鼠的两侧肿瘤组织，将肿瘤组织剪碎呈立方毫米的小块，加入500μL的酶混合液(含125μg/mL的DNA酶、500μg/mL的胶原酶Ⅳ)在37℃条件下消化30min，将消化的肿瘤组织过200目细胞筛网收集单细胞悬液并稀释至细胞密度为2×107个/mL，加入APC anti-mouseCD3、FITC anti-mouse CD4和PE/Cy5 anti-mouse CD8α等荧光抗体染色30min，再用Saline淋洗离心收集细胞重复三次，将收集的细胞置于流式管中在FACSCalibur流式细胞仪上进行检测分析。
结果显示，单独放疗不能明显促进肿瘤中T淋巴细胞的浸润，而瘤周注射Alg-Mn或瘤内注射MnCl2联合放疗对治疗侧肿瘤和远端肿瘤都能够促进其肿瘤浸润的T淋巴细胞数量增加(图5-5b)。此外，肿瘤中浸润的T淋巴细胞中CD8+T淋巴细胞的比例明显上调，其中Alg-Mn相比于MnCl2的上述作用效果更明显，具有显著性差异。
实验c.肿瘤组织中IFN-γ的含量测定：
在上述B16F10双侧肿瘤药效实验基础上，小鼠经瘤内给药后的第7天将小鼠颈椎脱臼处死取各组小鼠的两侧肿瘤组织，将肿瘤组织均浆后3500g离心收集上清液，采用Mouse IFN-γELISAKit检测各个上清液样品中IFN-γ的含量并进行统计和分析。
实验结果表明Alg-Mn能够有效促进治疗侧肿瘤和远端肿瘤的T细胞分泌更多的IFN-γ。

Claims (8)

1.一种缓释锰组合物在制备放疗增敏剂中的应用，其特征在于，所述缓释锰组合物为载体负载的二价锰，所述载体为药学上可接受的载体；所述载体为多糖或蛋白中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多糖为海藻酸、海藻酸钠、壳聚糖、N-羧甲基壳聚糖或β-环糊精中的一种或多种；所述蛋白为白蛋白、血清蛋白、转铁蛋白、珠蛋白、血红蛋白或肌红蛋白中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述放疗增敏剂为适用于食管癌、头颈癌、鼻咽癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、肉瘤、胆管癌、膀胱癌、肾癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌或子宫癌的放疗增敏剂。
4.一种放疗增敏剂的制备方法，其特征在于，包括：将含有二价锰和/或能够形成二价锰的源的第二溶液加入到含有载体和/或能够形成所述载体的源的第一溶液中使二价锰和载体结合即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述能够形成二价锰的源为氢氧化锰、磷酸锰、磷酸氢锰或磷酸二氢锰中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述载体为多糖，所述制备步骤还包括向二价锰和载体结合后得到的溶液中加入含有钙离子和/或能够形成钙离子的第三溶液的步骤；所述第三溶液和所述第二溶液的溶剂相同。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括外力辅助载体结合二价锰的步骤。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一溶液的溶剂是水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、甘露醇溶液或蔗糖溶液中的一种或多种；
所述第二溶液的溶剂是水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、乙醇水溶液、葡萄糖溶液或蔗糖溶液中的一种或多种。
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