CN116510003B - 一种负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗鼠疫菌中的应用 - Google Patents

一种负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗鼠疫菌中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116510003B
CN116510003B CN202310727748.0A CN202310727748A CN116510003B CN 116510003 B CN116510003 B CN 116510003B CN 202310727748 A CN202310727748 A CN 202310727748A CN 116510003 B CN116510003 B CN 116510003B
Authority
CN
China
Prior art keywords
manganese
ammsn
plague
based nanoparticle
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310727748.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116510003A (zh
Inventor
欧阳譞
刘惠玉
周冬生
许溪璨
秦晴晴
戴晨曦
吴妮尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing University of Chemical Technology
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
Beijing University of Chemical Technology
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing University of Chemical Technology, Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA filed Critical Beijing University of Chemical Technology
Priority to CN202310727748.0A priority Critical patent/CN116510003B/zh
Publication of CN116510003A publication Critical patent/CN116510003A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116510003B publication Critical patent/CN116510003B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0291—Yersinia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种负载鼠疫菌rF1‑V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗鼠疫菌中的应用。本发明提供了一种负载rF1‑V10的锰基纳米颗粒，包括氨基化锰基纳米颗粒和与其吸附的rF1‑V10蛋白；所述rF1‑V10蛋白来源于鼠疫菌。本发明提出一种锰基纳米颗粒疫苗rF1‑V10@AMMSN的制备方法并研究其免疫防护方向的应用。rF1‑V10@AMMSN具有安全性好、免疫程序简便、保护效率高等特性，可对鼠疫菌感染有明显的预防效果。

Description

一种负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗 鼠疫菌中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗鼠疫菌中的应用。
背景技术
鼠疫是由革兰氏阴性的鼠疫耶尔森菌（Yersinia Pestis）感染引起的一种极其危险的人畜共患病，在人类历史上引起三次世界范围性的大流行，导致约2 亿人死亡。肺鼠疫因可通过气溶胶传播，传播速度快，病程进展迅猛，病死率极高，而被认为是三种临床鼠疫类型中最危险的一种，因此肺鼠疫成为亟待解决的全球卫生安全难题。疫苗接种是预防肺鼠疫最重要的手段之一，而目前尚无FDA批准使用的人用鼠疫疫苗，因此亟需探索安全高效的保护性疫苗。
亚单位疫苗易降解、免疫原性低，需要铝佐剂等传统疫苗免疫佐剂增强免疫保护效果，而传统佐剂具有毒性高、难代谢等劣势，安全性和有效性难以平衡。锰元素作为人体必需的微量元素广泛分布于人体组织中，其参与机体生长发育、能量代谢、免疫调节和氧化应激反应等多个生理过程，具有不可或缺的作用。锰离子可高效刺激天然免疫的优势，在免疫调节方面存在巨大的潜力，此外，作为一种有效的cGAS激活剂，可以通过激活胞内cGAS-STING信号通路产生I型IFN，诱导宿主天然免疫应答。含锰材料能够强烈促进树突状细胞的成熟，激活T细胞同时诱导高浓度抗体的产生；强效地激活体液免疫以及细胞免疫应答，使得机体对抗原性弱的抗原也能产生抗体。但目前国内外的研究中，对于锰基纳米颗粒疫苗在抗鼠疫菌的免疫保护中的应用没有相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗鼠疫菌中的应用。
第一方面，本发明提供了一种负载rF1-V10的锰基纳米颗粒，包括氨基化修饰的锰基纳米颗粒和与其吸附的rF1-V10蛋白；
所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒中的锰基纳米颗粒为由硅酸根离子和锰离子沉淀形成的硅酸锰纳米颗粒；
所述rF1-V10蛋白来源于鼠疫菌。
上文中，所述硅酸根离子为二氧化硅在碱性条件下水解产生；在本发明的实施例中具体为介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）在碱性条件下水解产生。
或，所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒通过静电吸附负载所述rF1-V10蛋白。在本发明的实施例中，所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒（AMMSN）为用3-氨丙基三乙氧基硅烷对所述锰基纳米颗粒进行氨基化修饰得到。
上述所述负载rF1-V10的锰基纳米颗粒中，所述rF1-V10蛋白和所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒的负载质量比为1:5。
上述所述负载rF1-V10的锰基纳米颗粒中，所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒为以介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）为模板，添加锰离子（Mn离子）并采用水热法制备得到硅酸锰纳米颗粒，即为锰基纳米颗粒（MMSN），利用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）对所述锰基纳米颗粒（MMSN）进行氨基化修饰得到表面正电荷增加的氨基化修饰的锰基纳米颗粒（AMMSN）；
进一步地，所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒按照包括如下步骤的方法制备：
A1）将介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）和锰离子（Mn离子）在碱性条件中进行水热反应，得到锰基纳米颗粒，记作锰基纳米颗粒（MMSN）；
A2）将所述锰基纳米颗粒（MMSN）和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中进行氨基化修饰反应，得到氨基化修饰的锰基纳米颗粒(AMMSN)。
上述步骤A1）中，所述碱性条件所需溶液包括NH3·H2O和NH4Cl；所述介孔二氧化硅纳米颗粒和所述锰离子的加入配比为30 mg：0.1-0.75 mmol；在本发明的实施例中，所述介孔二氧化硅纳米颗粒和所述锰离子的加入配比具体为30 mg：0.15 mmol；
所述水热反应的条件为120～160℃水热反应8～24小时；在本发明的实施例中，所述水热反应的条件为140 ℃下反应12小时；
上述步骤A2）中，所述锰基纳米颗粒和所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的加入配比为30 mg：0.8-2 mL，在本发明的实施例中，所述锰基纳米颗粒和所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的加入配比为30 mg：1 mL。
所述氨基化修饰反应的条件为室温搅拌反应12-36 小时；在本发明的实施例中，所述氨基化修饰反应条件为室温搅拌反应24小时。
步骤A1）具体为如下：
将30 mg MSN均匀分散在15 mL去离子水中，得到浓度为2 mg mL-1的MSN分散液。
将0.15 mmol MnCl2（提供锰离子）和18 mmol NH4Cl添加到15 mL去离子水中，待试剂溶解后，在室温下加入NH3·H2O 700 μL，得到含Mn的溶液（锰离子含量为0.15 mmol）；
再将上述获得含Mn的溶液快速滴入上述MSN分散液中并搅拌5分钟，然后转移到不锈钢高压釜的聚四氟乙烯内衬中，在140 ℃下反应12小时，所得样品依次用去离子水和乙醇洗涤三次（去离子水洗涤3次后再用乙醇洗涤3次）；再将洗涤后的样品在60 ℃下干燥过夜后得到MMSN。
步骤A2）具体为如下：
将30 mg MMSN分散在含有30 mL DMF的锥形瓶中并加入1 mL APTES，得到混合物；再将混合物在室温下搅拌反应24小时，再11000 rpm 离心5分钟收集固体产物，用乙醇洗涤固体产物3次，在60 ℃下干燥过夜即可得到AMMSN。
上述MSN的粒径为50-250 nm；在本发明中，MSN粒径为50-100 nm，MSN制备方法具体方法如下：
将0.18 g三乙醇胺(TEA)加入到36 mL去离子水中,再加入24 mL25 wt%（g：mL）的十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)水溶液；60 ℃下搅拌1小时；再加入20 mL正硅酸乙酯(TEOS)的正己烷溶液（该溶液由TEOS与正己烷混合得到，且TEOS与正己烷的体积比为1:9），反应17小时后10000 rpm离心5 分钟收集固体产物；再将固体产物加入到60 mL浓度为0.6 %（质量体积百分含量，g：mL）的硝酸铵乙醇溶液（溶质为硝酸铵，溶剂为乙醇）中,60 ℃搅拌6 小时,10000 rpm离心5 分钟收集固体产物,用乙醇洗涤固体产物3次,干燥后得到介孔二氧化硅纳米颗粒（即为MSN）。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的负载rF1-V10的锰基纳米颗粒在如下任一中的应用：
B1）制备预防或治疗鼠疫的产品；
B2）作为或制备鼠疫疫苗；
B3）制备提高鼠疫疫苗免疫原性的产品。
上文所述应用中，所述鼠疫为肺鼠疫；
所述鼠疫的病原菌为鼠疫菌，所述鼠疫菌具体为烈性或致命性鼠疫菌，进一步具体为鼠疫菌201株。
第三方面，本发明提供了一种鼠疫疫苗，其包括第一方面所述的负载rF1-V10的锰基纳米颗粒。
第四方面，本发明提供了第一方面中的所述锰基纳米颗粒或氨基化修饰的锰基纳米颗粒在如下任一中的应用：
C1）递送或负载蛋白或其他小分子药物；
C2）作为佐剂；
C3）制备预防或治疗病原菌感染的产品；
C4）制备提高疫苗免疫原性的产品。
上文中，所述病原菌为鼠疫病原菌。
所述蛋白为带有负电荷的蛋白，具体可以为抗原蛋白；进一步地，所述抗原蛋白具体来自鼠疫菌。
所述疫苗为鼠疫疫苗，所述鼠疫具体为肺鼠疫；
所述鼠疫的病原菌或上述病原菌为鼠疫菌，所述鼠疫菌为烈性或致命性鼠疫菌，具体为鼠疫菌201株。
所述应用中，上述递送或负载包括但不限于作为递送疫苗或药物等。
第五方面，本发明提供了第一方面所述的负载rF1-V10的锰基纳米颗粒或第三方面所述鼠疫疫苗在制备具有如下任一功能产品中的应用：
D1）预防或治疗鼠疫；
D2）天然免疫刺激性能，具体体现在促进细胞成熟、激活天然免疫cGAS-STING信号通路(STING、TBK1和IRF3)和/或提高细胞因子β干扰素分泌；
D3）促进树突细胞成熟；
D4）激活cGAS-STING信号通路（具体体现在信号通路关键分子STING、TBK-1、IRF-3蛋白磷酸化水平显著升高）；
D5）促进细胞因子β干扰素分泌；
D6）产生体液免疫应答反应；
D7）提高鼠疫菌攻毒下动物的存活率；
D8）降低鼠疫菌攻毒下动物脏器中细菌载量；
D9）降低鼠疫菌攻毒下动物肺部病理评分；
D10）增强机体对鼠疫菌攻毒的保护功能。
第六方面，本发明提供了如下方法：
本发明提供了一种制备第一方面中所述锰基纳米颗粒的方法，包括第一方面所述方法中的步骤A1），得到锰基纳米颗粒（MMSN）。
或，本发明提供了一种制备第一方面中所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒的方法，包括第一方面所述方法中的步骤A1）和步骤A2），得到氨基化修饰的锰基纳米颗粒（AMMSN）。
本发明提供了锰基纳米颗粒疫苗rF1-V10@AMMSN的制备方法并研究其免疫防护方向的应用，具体为以MSN纳米颗粒为模板，基于水热法制备得到MMSN，利用APTES对其进行氨基化修饰以得到表面正电荷增加的AMMSN，通过静电吸附作用负载鼠疫重组蛋白rF1-V10，从而制备得到锰基纳米颗粒疫苗rF1-V10@AMMSN。rF1-V10@AMMSN具有安全性好、免疫程序简便、保护效率高等特性，可对鼠疫菌感染有明显的预防效果，具体体现在如下：
锰基纳米颗粒疫苗rF1-V10@AMMSN皮下免疫接种小鼠后，可实现对高剂量鼠疫菌液体气溶胶肺递送攻毒的完全保护效果。证明rF1-V10@AMMSN可被树突状细胞DC摄取并释放Mn离子激活STING及下游β干扰素信号通路，并启动IFN-β和炎症因子转录分泌，进而促进DC成熟和rF1-V10抗原呈递，最终增强对鼠疫菌感染的免疫保护。综上，本发明的研究发现，安全可降解的硅酸锰纳米颗粒不仅可以作为载体高效负载蛋白，还可以作为佐剂利用释放的Mn2+介导激活STING信号通路来促进天然免疫，无需添加任何额外的佐剂就可实现对致命性肺鼠疫的强大保护效果。
在现有的合成方法中，本发明具有以下优点：本发明合成的rF1-V10@AMMSN形貌良好，颗粒均一、制备简单，利用水热法制备的MMSN含有锰金属元素，使其具有激活天然免疫特性，对MMSN进行氨基化修饰后，使其表面正电荷增加，有利于负载负电蛋白rF1-V10，得到的rF1-V10@AMMSN具有优异的天然免疫刺激性能和免疫原性，作为纳米疫苗递送载体在抗菌免疫中等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为MSN、MMSN、AMMSN、rF1-V10@AMMSN的透射电镜图，比例尺：50 nm。
图2为rF1-V10@AMMSN的Zeta电位图。
图3为rF1-V10@AMMSN粒径分布情况。
图4为rF1-V10@AMMSN的蛋白质免疫印迹和聚丙烯凝胶电泳验证。
图5为rF1-V10@AMMSN的体外生物相容性评价。
图6为rF1-V10@AMMSN的体内生物安全性评价。
图7为rF1-V10@AMMSN促进小鼠骨髓分离树突状细胞成熟的效果图。
图8为rF1-V10@AMMSN激活天然免疫信号通路分子效果图。
图9为rF1-V10@AMMSN促进β干扰素分泌的效果图。
图10为rF1-V10@AMSN和rF1-V10@AMMSN促进小鼠体内产生IgG抗体效果图。
图11为50×LD50鼠疫菌攻毒后rF1-V10@AMMSN免疫小鼠的生存曲线。
图12为50×LD50鼠疫菌攻毒后rF1-V10@AMMSN免疫小鼠的体重变化。
图13为50×LD50鼠疫菌攻毒后rF1-V10@AMMSN免疫小鼠的脏器载菌量。
图14为50×LD50鼠疫菌攻毒后rF1-V10@AMMSN免疫小鼠的脏器病理变化。
图15为不同pH条件下AMMSN随时间变化的降解行为结果。
图16为不同pH条件下AMMSN随时间变化的锰离子释放情况结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从生化试剂厂或代理商处得到。
下述实施例中抗体部分如下：p-STING (#D8F4W, Cell Signaling Technology,USA), STING (#D2P2F, Cell Signaling Technology, USA), p-TBK1 (#5483, CellSignaling Technology, USA), TBK1 (#3504, Cell Signaling Technology, USA),IRF-3 (#D83B9, Cell Signaling Technology, USA), p-IRF3 (#4D4G, Cell SignalingTechnology, USA)。HRP 标记的山羊抗小鼠IgG (#ab214879, Abcam), HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG1 (#ab97240, Abcam), HRP 标记的山羊抗小鼠IgG2c (#ab97255, Abcam)。
下述实施例中的PBS配方如下：1 mM KH2PO4、155 mM NaCl、3 mM Na2HPO4·7H2O，余量为水，pH 7.4。
实施例1、负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗的制备和表征
一、负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒rF1-V10@AMMSN的制备
1、MSN的获得
粒径为50-250 nm介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）均可作为本发明实验材料。
本发明中介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）的粒径为50-100 nm。具体方法如下：
将0.18 g三乙醇胺(TEA)加入到36 mL去离子水中,再加入24 mL 25 wt%（g：mL）的十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)水溶液；60 ℃下搅拌1 小时；再加入20 mL正硅酸乙酯(TEOS)的正己烷溶液（该溶液由TEOS与正己烷混合得到，且TEOS与正己烷的体积比为1:9），反应17 小时后10000 rpm离心5 分钟收集固体产物；再将固体产物加入到60 mL浓度为0.6%（质量体积百分含量，g：mL）的硝酸铵乙醇溶液（溶质为硝酸铵，溶剂为乙醇）中,60 ℃搅拌6 小时,10000 rpm离心5 分钟收集固体产物,用乙醇洗涤固体产物3次,干燥后得到介孔二氧化硅纳米颗粒（即为MSN）。
2、MMSN的获得
介孔二氧化硅在碱性环境中水解产生的硅酸根离子和锰离子沉淀形成硅酸锰纳米颗粒，记作锰基纳米颗粒MMSN，具体制备如下：
将上述1的30 mg MSN均匀分散在15 mL去离子水中，得到浓度为2 mg mL-1的MSN分散液。
将0.15 mmol MnCl2和18 mmol NH4Cl添加到15 mL去离子水中，待试剂溶解后，在室温下加入NH3·H2O 700 μL，得到含Mn的溶液（锰离子含量为0.15 mmol）；
再将上述获得含Mn的溶液快速滴入上述MSN分散液中并搅拌5分钟，然后转移到不锈钢高压釜的聚四氟乙烯内衬中，在140 ℃下反应12小时，所得样品依次用去离子水和乙醇洗涤三次（去离子水洗涤3次后再用乙醇洗涤3次）；再将洗涤后的样品在60 ℃下干燥过夜后得到MMSN。
上述反应中，介孔二氧化硅MSN和锰离子的加入配比为30 mg（约为0.5 mmol）：0.1-0.75 mmol，具体为30 mg（约为0.5 mmol）：0.15 mmol。
3、AMMSN和AMSN的获得
AMMSN的获得：将30 mg MMSN分散在含有30 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的锥形瓶中并加入1 mL APTES，得到混合物；再将混合物在室温下搅拌反应24小时，再11000 rpm 离心5分钟收集固体产物，用乙醇洗涤固体产物3次，在60 ℃下干燥过夜即可得到AMMSN。
上述反应中，MMSN和APTES的加入配比为30 mg：1 mL。
AMSN的获得：方法与AMMSN的获得基本相同，不同的仅为将MMSN替换为 MSN。
4、rF1-V10@AMMSN和rF1-V10@AMSN的获得
将rF1-V10蛋白分别负载在上述AMMSN和AMSN中，具体如下：
1）rF1-V10@AMMSN的制备
rF1-V10储备溶液：将 rF1-V10 （氨基酸序列为序列1）溶解在PBS中以获得浓度为5 mg mL-1的rF1-V10储备溶液；
AMMSN悬浮液：将上述3制备的AMMSN溶解在PBS中，得到浓度为2 mg mL-1的AMMSN悬浮液）；
将400 μL的rF1-V10 储备溶液（5 mg mL-1）与1 mL AMMSN悬浮液（2 mg mL-1）混合（rF1-V10和AMMSN加入质量比为1:1），并在4 ℃下搅拌12小时，再12000 rpm离心5分钟收集固体产物，再将得到的固体产物用PBS洗涤3次以去除游离蛋白质，得到负载rF1-V10的AMMSN，命名为rF1-V10@AMMSN。
将rF1-V10@AMMSN储存在PBS中以备后用，即为rF1-V10@AMMSN溶液。
上述rF1-V10@AMMSN制备中rF1-V10和AMMSN的投料或加入质量比为1: 1。
检测rF1-V10@AMMSN中rF1-V10和AMMSN的负载质量比rF1-V10：AMMSN为1:5。
2）rF1-V10@AMSN的制备
rF1-V10储备溶液：将 rF1-V10 （氨基酸序列为序列1）溶解在 PBS （1 mM KH2PO4、155 mM NaCl、3 mM Na2HPO4·7H2O，余量为水，pH 7.4）中以获得浓度为5 mg mL-1的rF1-V10储备溶液；
AMSN悬浮液：将上述3制备的AMSN溶解在PBS中，得到浓度为2 mg mL-1的AMSN悬浮液）；
将400 μL的rF1-V10 储备溶液（5 mg mL-1）与1 mLAMSN悬浮液（2 mg mL-1）混合，并在4 ℃下搅拌12小时，再12000 rpm离心5分钟收集固体产物，再将得到的固体产物用PBS洗涤3次以去除游离蛋白质，得到负载rF1-V10的AMSN，命名为rF1-V10@AMSN。
将rF1-V10@AMSN储存在PBS中以备后用，即为rF1-V10@AMSN溶液。
上述rF1-V10@AMSN制备中rF1-V10和AMSN的投料或加入质量比为1: 1。
检测rF1-V10@AMSN中rF1-V10和AMSN的负载质量比rF1-V10：AMSN为1:5。
二、负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒rF1-V10@AMMSN的表征
将上述一制备的MSN、MMSN、AMMSN、rF1-V10@AMMSN纳米颗粒进行透射电镜检测（HT-7700，Hitachi）。
结果如图1所示，其中，a-b分别为MSN、MMSN、AMMSN、rF1-V10@AMMSN纳米颗粒，可以看出，rF1-V10@AMMSN纳米颗粒呈表面粗糙的均匀球形，且形态基本相似。
将上述制备的MSN、AMSN、MMSN、AMMSN、rF1-V10@AMMSN等纳米颗粒在PBS缓冲液中进行Zeta电位检测（Zetasizer Nano ZS90，Malvern）。
结果如图2所示，可以看出，MMSN氨基化后得到的AMMSN电位升高，有利于负载蛋白。
将上述制备的rF1-V10@AMMSN纳米颗粒用动态光散射DLS方法（Zetasizer NanoZS90，Malvern）进行粒径分布检测。
结果如图3所示，rF1-V10@AMMSN流体动力学粒径约为276.4 nm，为小于300 nm的纳米尺寸材料。
将上述制备的rF1-V10@AMMSN纳米颗粒提取总蛋白，用蛋白质免疫印迹和聚丙烯凝胶电泳检测rF1-V10的表达，以rF1-V10为对照。
结果如图4所示，可以看出，rF1-V10@AMMSN中有rF1-V10蛋白表达，表明，rF1-V10蛋白成功负载在了AMMSN上。
综上，负载鼠疫菌rF1-V10的锰基纳米颗粒rF1-V10@AMMSN制备成功。
实施例2、rF1-V10@AMMSN的生物安全性验证
1、体外生物相容性评价
采用BALB/c小鼠的红细胞来评估rF1-V10@AMMSN在体外的血液毒性。
将实施例1制备的rF1-V10@AMMSN分散在PBS中，使其浓度分别为50、100、150、200、250和300 μg mL-1，得到rF1-V10@AMMSN分散液，然后取1 mL上述不同浓度的rF1-V10@AMMSN分散液分别加入到300 μL来源于小鼠的红细胞稀释液（将3 mL小鼠红细胞用27 mL PBS溶液稀释），作为样品。
将分散在蒸馏水和PBS中的血细胞分别作为阳性对照和阴性对照。
随后将所有样品和对照在室温下静置1 h，3000 rpm 离心 10 min收集上清液。最后将收集的上清液在570 nm 处测量吸光度。
溶血率计算公式为：
溶血率（%）=（样品吸光度-阴性对照吸光度）/（阳性对照吸光度-阴性对照吸光度）×100%。
溶血实验初步验证AMMSN的体外安全性的结果如图5所示，可以看出，rF1-V10@AMMSN在 300 μg/mL的浓度下仍保持低于5%的溶血率，表明rF1-V10@AMMSN在体外具有良好的生物安全性。
2、体内生物安全性评价
使用C57BL/6J小鼠评估rF1-V10@AMMSN的体内生物安全性。
采取双侧腹股沟皮下免疫方式，每间隔21天免疫一次，共免疫两次，具体免疫方式为将rF1-V10@AMMSN（20 μg rF1-V10，100 μg AMMSN）以100 μL剂量进行小鼠双侧腹股沟皮下免疫（每侧注射50ul rF1-V10@AMMSN溶液，rF1-V10@AMMSN溶液为将rF1-V10@AMMSN溶解在PBS中，得到的溶液，其中rF1-V10和AMMSN浓度分别为0.2 mg/mL和1 mg/mL）。
在第一次免疫后第7、21、42天分别取3只小鼠用CO2致死后，解剖小鼠并取出心、肝、脾、肾等各类脏器组织，随即放入4 %多聚甲醛溶液中固定48 h以上后进行水洗、脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色等步骤，最终获得病理切片。将得到的病理切片放置光学显微镜下观察，进行组织病评分。
体内病理组织切片结果如图6所示，可以看出，在免疫后各时间点均未观察到明显的组织病理改变，表明rF1-V10@AMMSN在体内具有良好的生物安全性。
实施例3、rF1-V10@AMMSN激活天然免疫效果测定
1、设置各组
BMDCs细胞培养液为BMDCs细胞在培养基（1640培养基+10% FBS+55μM β-巯基乙醇+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素）中培养获得的培养产物。
采用C57BL/6J小鼠（维通利华，产品目录号219）骨髓分离的树突状细胞（BMDCs），设置五组实验组，一组阳性对照组，一组阴性对照组，具体如下：
无处理对照组（阴性对照组）：1×106cells/mL 2 mL的BMDCs细胞培养液37 ℃，5%CO2培养12 h；
ADU-S100（5μM）组（阳性对照组）：1×106cells/mL 2 mL的BMDCs细胞培养液中加入100 uL 100μMADU-S100溶液（MCE，产品目录号HY-12885A，溶剂为PBS），使ADU-S100在反应体系中的浓度为5 μM，37 ℃，5% CO2培养12 h；
AMSN（100 μg/ml）组：1×106cells/mL 2mL的BMDCs细胞培养液中加入100 μL 2mg/mLAMSN溶液（溶剂为PBS），使AMSN在反应体系中的浓度为100 μg/ml，37 ℃，5% CO2培养12 h；
AMMSN（100 μg/ml）组：1×106cells/mL 2mL的BMDCs细胞培养液中加入100μL 2mg/mLAMMSN溶液（溶剂为PBS），使AMMSN在反应体系中的浓度为100 μg/ml，37 ℃，5% CO2培养12 h；
rF1-V10（20 μg/ml）组：1×106cells/mL 2mL的BMDCs细胞培养液中加入100μL0.4 mg/mLrF1-V10溶液（溶剂为PBS），使rF1-V10在反应体系中的浓度为20 μg/ml，37 ℃，5% CO2培养12 h；
rF1-V10@AMSN（20 μg/mL rF1-V10，100 μg/mL AMSN）组：1×106cells/mL 2 mL的BMDCs细胞培养液中加入100μL rF1-V10@AMSN溶液（将rF1-V10@AMSN溶解在PBS中，得到的溶液，其中rF1-V10浓度为0.4 mg/mLrF1-V10, AMSN的浓度为2 mg/mL），使rF1-V10在反应体系中的浓度为20 μg/ml，AMSN在反应体系中的浓度为100 μg/ml，37 ℃，5% CO2培养12h；
rF1-V10@AMMSN（20 μg/mL rF1-V10，100 μg/mL AMMSN）组：1×106cells/mL 2mL的BMDCs细胞培养液中加入100 μL rF1-V10@AMMSN（将rF1-V10@AMMSN溶解在PBS中，得到的溶液，rF1-V10的浓度为0.4 mg/mL, AMMSN的浓度为2 mg/mL），使rF1-V10在反应体系中的浓度为20 μg/ml，AMMSN在反应体系中的浓度为100 μg/ml，37 ℃，5% CO2培养12 h。
上述各组设置3个重复。
2、检测
1）、流式细胞术检测BMDCs细胞成熟度
（1）将上述1的各组培养12小时后的细胞吸入至流式管中，400×g离心5min，弃除上清液加入1 mLDPBS，400×g离心5 min，弃掉上清液，此步骤重复2遍。
（2）染色方案
其中各个抗体分别设置一支单染管作为补偿。
（3）染色
A.每支流式管加入3.9 μL染色抗体，室温避光染色25分钟；
B.加入2 mL DPBS，400×g离心5 min，重复2遍；
C.弃液，加入50 μL DPBS重悬，使用BDVerse流式细胞仪器检测样本。
结果如图7所示，其中，a为平均荧光强度示意图；b为平均荧光强度统计图；与AMSN、AMMSN 、rF1-V10、rF1-V10@AMSN 组相比，BMDCs在rF1-V10@AMMSN刺激后可使细胞表面成熟度标志物CD40和CD86表达显著提高。
2）、蛋白质免疫印迹法检测STING、TBK1、IRF3磷酸化表达
（1）制备样品：
将上述1的各组细胞培养2 h、6 h后，弃除上清液，加入200 μl细胞裂解液（公司碧云天，产品目录号P0013）置于冰上裂解30 min，随后用细胞刮刀将细胞刮下来，吸取至EP管，12000 rpm, 4 ℃离心10 分钟，挑出沉淀，加入相应体积的5×蛋白Loading buffer，沸水浴10 分钟后放置冰上冷却后，放入-80 ℃备用；
（2）制备蛋白胶：用PAGE凝胶快速制备试剂盒按照相应配方制成12.5 % SDS-PAGE蛋白凝胶；
（3）电泳：将制备好的样品和蛋白Maker加入胶孔，再将电泳槽与正负极相对应，80V将样品跑出浓缩胶后转120 V跑胶；
（4）转印：先将裁好的PVDF膜浸泡在甲醇溶液中激活，再转入转印液中待用。取出蛋白胶并根据目的条带大小切割凝胶，将切割后的凝胶放置在已对应放好海绵垫、滤纸的转印夹上，随后在凝胶上依次放上PVDF膜、滤纸和海绵垫，接着将转印夹合上放入转印槽内，加入预冷好的转印液和冰盒，开始转印，一般根据蛋白分子量大小控制转印时长；
（5）封闭：转印结束后将PVDF膜浸没入含5%脱脂奶粉的封闭液中，放置摇床室温封闭1h；
（6）一抗：封闭结束后，按照1:1000稀释一抗p-STING、STING、p-TBK1、TBK1、IRF-3、p-IRF3，将PVDF膜放入装有一抗的盒子中室温孵育1h；
（7）二抗：孵育一抗结束后将PVDF膜放入1×TBST中进行洗膜，每次5 min，共计3次，洗膜结束后再将膜放入装有二抗的盒子里孵育30 min；
（8）曝光：孵育二抗结束后也将膜放入1×TBST中洗3次，每次5 min，然后将发光液A液与B液1：1混合制成显影液，将膜再吸水纸上控干后放入显影液中浸泡，随后将膜放置在化学发光成像系统中自动曝光。
结果如图8所示，其中，a 为rF1-V10@AMMSN激活天然免疫信号通路STING分子效果图，b为rF1-V10@AMMSN激活天然免疫信号通路TBK1分子效果图，c为rF1-V10@AMMSN激活天然免疫信号通路IRF3分子效果图，可以看出，与AMSN 、AMMSN 、rF1-V10、rF1-V10@AMSN 组相比，信号通路关键分子STING、TBK-1、IRF-3蛋白磷酸化水平显著升高。
3）、ELISA检测细胞因子分泌
（1）样品制备：上述1中各组细胞培养12 h后，吸取上清液，2200 rpm离心5 min，吸取上清液，放入-80℃备用。
（2）ELISA试剂盒（索莱宝，产品目录号SEKM-0007）准备：
a、试剂回温：在实验前 30 min 将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，放入37 ℃温浴直到结晶全部溶解；
b、溶解标准品：在冻干标准品管内加入1mL标准品/样本稀释液，静置15分钟，待其充分溶解，混匀后待用；
c、稀释标准品：取6个EP管，做好标记，依次2倍比稀释标准品，然后取标准品/样本稀释液作为空白对照；
d、洗液：将20×Washing Buffer 用双蒸水稀释至1×；
e、生物素化抗体：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液将100×抗体浓缩液稀释成1×应用工作液（稀释前充分混匀）；
f、链霉亲和素-酶结合物：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液将100X浓缩酶结合物稀释成1×应用工作液（稀释前离心）。
（3）检测：
a、从已平衡至室温的密封袋中取出实验所需板条，使用前清洗3次并甩干；
b、加入标准品和样本：加入100 μL标准品及检测样本至反应孔中, 封板后于37℃孵箱孵育90 min；
c、洗涤：弃去孔内液体，每孔加入300 μL洗液，静置30 s后甩干液体，重复5次，最后一次在滤纸或吸水纸上扣干；
d、加入生物素化抗体：每孔加入100 μL生物素化抗体工作液，封膜，37 ℃孵育60min；
e、洗涤：重复步骤c；
f、加入链霉亲和素-酶结合物：每孔加入100 μL酶结合物工作液，封膜，37 ℃避光孵育30 min；
g、洗涤：重复步骤c；
h、加入显色底物（TMB）：每孔加入100 μLTMB，37 ℃避光孵育15 min；
i、加入终止液：每孔加入50 μL终止液；
j、检测结果：反应终止后使用酶标仪在波长450-630 nm下测定OD值，并进行数据分析。
结果如图9所示，可以看出，与AMSN 、AMMSN 、rF1-V10、rF1-V10@AMSN组相比，rF1-V10@AMMSN组细胞因子β干扰素分泌水平显著升高。
上述结果表明，rF1-V10@AMMSN可促进细胞成熟、cGAS-STING信号通路激活和细胞因子β干扰素分泌，具有激活天然免疫刺激效果，具有免疫原性。
实施例4、rF1-V10@AMMSN的免疫保护效果测定
设置4个实验组，分别为无处理对照、rF1-V10（20 μg）、rF1-V10@AMSN（20 μg rF1-V10，100 μg AMSN）、rF1-V10@AMMSN（20 μg rF1-V10，100 μg AMMSN）。每组10只小鼠。
对C57BL/6J小鼠采用双侧腹股沟皮下免疫方式进行间隔21天的二次免疫，末次免疫21天后进行50×LD50鼠疫菌201株液体气溶胶肺递送攻毒。
利用ELISA方法评价免疫后小鼠体内抗体滴度的变化；通过生存分析、组织病理学分析、脏器载菌量测定评价疫苗免疫保护力。具体实施方法如下：
1、小鼠免疫和攻毒方案
无处理对照组：小鼠两侧腹股沟处各免疫50 μlPBS；
rF1-V10（20 μg）：小鼠两侧腹股沟处各免疫50 μL浓度为0.4 mg/mL的 rF1-V10溶液（溶剂为PBS），免疫剂量为20 μg/处；
rF1-V10@AMSN（20 μg rF1-V10，100 μg AMSN）：小鼠两侧腹股沟处各免疫50 μLrF1-V10@AMSN溶液（溶剂为PBS，溶液中rF1-V10和AMSN浓度分别为0.2 mg/mL和 1 mg/mL），免疫剂量为10 μg rF1-V10/处，50 μg AMSN /处；
rF1-V10@AMMSN（20 μg rF1-V10，100 μg AMMSN）：小鼠两侧腹股沟处各免疫50 μLrF1-V10@ AMMSN溶液（溶剂为PBS，其中 rF1-V10和AMMSN浓度分别为0.2 mg/mL和1 mg/mL），免疫剂量为10 μg rF1-V10/处，50 μg AMMSN /处。
上述各组采取双侧腹股沟皮下免疫方式，每间隔21天免疫一次，共免疫两次，具体免疫方式为将各组药品皮下注射至小鼠两侧腹股沟处，左右两侧腹股沟处各注射50 μl药品，共计注射100 μl。
在第二次免疫后第21天（以第1次免疫当天记作第0天），用1000 CFU（50× LD50）的鼠疫菌201株菌液对所有免疫组小鼠进行液体气溶胶肺递送攻毒：按100 mg/kg的剂量腹腔注射 1 %戊巴比妥钠麻醉小鼠，在麻醉成功后将其呈仰卧体位方式固定于操作台上，调整操作台使其倾斜方向与水平方向呈适宜角度，再使用喉镜充分暴露小鼠气管口，将手持式液体气溶胶肺递送装置的发生头沿着与气管平行的方向插入气管约2 cm，快速推动发生器的推柄，将1000 CFU（50× LD50）的鼠疫菌201株攻毒发生液（鼠疫菌201株菌液）以液体气溶胶的形式递送至小鼠肺部。
上述鼠疫菌201株菌液按照如下方法制备：
（1）活化：从-80 ℃冰箱取出分装好的20 μL的鼠疫甘油菌鼠疫菌201株（Front. Immunol.2022,13, 793382.）解冻后转接于20 mL的BHI液体培养基中，26 ℃下200 rpm/min培养36 h，使鼠疫菌生长至平台期，此为第一代菌。
（2）预培养：将一代菌20倍稀释转接于20 mL的BHI液体培养基（公司BD，货号237500）中，26 ℃下200 rpm/min培养至OD600=1.0，此为第二代菌。
（3）正式培养：将二代菌100倍稀释转接于20 mL的BHI液体培养基中，26 ℃下200rpm/min培养至OD600=1.0，此为第三代菌，然后将其转37 ℃恒温培养箱培养3 h，此时鼠疫菌生长处于对数期中期。
（4）离心集菌：收集500 μL的菌液3000×g, 10 min离心集菌。
（5）菌液重悬：弃掉培养基，加入同体积生理盐水（含0.05 %体积百分含量（ml:ml）泊洛沙姆）重悬鼠疫菌，并按此方法重复洗菌2次，再用生理盐水（含0.05%泊洛沙姆）调整菌液OD600 为1.0。此时菌液理论浓度为2×108 CFU/ml，并将其用生理盐水继续稀释至攻毒浓度用于后续攻毒实验。
（6）滴板计数：将菌液按5倍比等比稀释后取10 μL菌液进行血平皿滴板，于26 ℃细菌培养箱培养72 h后对其进行菌落计数，从而计算出实际菌浓度。
2、 血清抗体水平检测
（1）样本的采集与制备：上述1各免疫组随机选取6只小鼠，做好标记，在每次免疫后第7、14、21 d，用尾部采血法对各组标记的小鼠采血，共采血6次。每次采集的样品置于干净的EP 管中室温静置4 h后，4000 rpm，4 ℃离心10 min以分离血清，并重新分装至新的灭菌的EP管中，于 -80 ℃ 保 存 备 用 。后续采用ELISA检测血清中特异性 IgG、IgG1抗体水平。下面ELISA检测试剂均来自公司达优，产品货号1030011。
（2）包被：将蛋白rF1-V10用包被缓冲液稀释至1 μg/ml，排枪吸取稀释的rF1-V10，以每孔 100 µl的体积加至各免疫组的96 孔ELISA 酶联免疫板，放置 4 ℃包被过夜。
（3）封闭：甩掉包被液后，将96 孔ELISA 酶联免疫板在吸水纸上轻轻拍干，然后排枪吸取封闭液，以每孔200 µl 的体积加入孔板中，37 ℃恒温培养箱孵育2 h。
（4）一抗孵育：将封闭液弃掉，并在吸水纸上轻轻拍干板子。各免疫组每次免疫后的血清用稀释液依次 2 倍比稀释8- 12 个梯度（分别为一免后7、14d血清按照 1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400、1：204800、1：409600；一免后21d和二免后7、14、21d血清按照 1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400、1：204800、1：409600、1：819200、1：1638400、1：3276800、1：6553600稀释），稀释好后用排枪吸取100 μL稀释后的血清从低浓度至高浓度依次加入到已包被并封闭好的96 孔 ELISA 酶联免疫板中。再取6 只空白小鼠的血清按 1：100 稀释后以100 µl 的体积加至对照孔中，37 ℃孵育 30 min。
（5）洗板：扣掉稀释后的血清一抗液体，每孔加入 200 μL洗液，振荡约 1 min后弃掉，按照此步骤洗板5 次后将96 孔ELISA酶联免疫板在吸水纸上轻轻拍干。
（6）二抗孵育：在 96 孔 ELISA 酶联免疫板中用排枪分别加入 1：10000 稀释后的HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG、IgG1、IgG2c 抗体，100 μL/孔，37 ℃孵育 20 min。
（7）洗板：扣掉二抗液体，每孔加入 200 μL洗液，振荡约 1 min 后弃掉，按照此步骤洗板5 次后将96 孔ELISA酶联免疫板在吸水纸上轻轻拍干。
（8）显色：排枪以 100 µl/孔向 96 孔 ELISA 酶联免疫板中加入 TMB 显色液，37℃避光孵育 5-10 min。
（9）终止：排枪吸取终止液，每孔加入100 µL 终止液以终止反应。
（10）检测：利用酶标仪对 96 孔 ELISA 酶联免疫板各个孔在波长 450 nm 和630nm 处的吸光值进行检测。待测样品孔吸光值与正常小鼠血清样品孔吸光值的比值大于 2时记为阳性，取阳性值所对应的最大稀释梯度即为血清的 IgG、IgG1抗体水平。
结果如图10所示，其中，a为rF1-V10@AMMSN促进小鼠体内产生IgG抗体效果图，b为rF1-V10@AMMSN促进小鼠体内产生IgG1抗体效果图；可以看出，与rF1-V10、rF1-V10@AMSN相比，经rF1-V10@AMMSN疫苗免疫的小鼠能产生强烈的体液免疫应答反应，血清抗体IgG、IgG1滴度均随着免疫进程推进而增加且均高于其他免疫组。
3、鼠疫菌株液体气溶胶肺递送攻毒后临床症状观察
在第二次免疫后第21天（d42），将1000 CFU（50×LD50）的鼠疫菌201株菌液对所有免疫组小鼠进行液体气溶胶肺递送攻毒，并观察攻毒后14天内小鼠的生存情况和体重情况，绘制生存曲线和体重曲线。
生存曲线结果如图11所示，在50×LD50攻毒水平下，rF1-V10@AMMSN免疫对小鼠仍具有完全保护作用，显著高于rF1-V10组和rF1-V10@AMSN组20%（2/10）的存活率。
体重曲线结果如图12所示，rF1-V10@AMMSN组小鼠体重呈现较为平稳走向，rF1-V10@AMSN和rF1-V10组小鼠体重在初期逐步下滑，后期体重回升。
4、鼠疫菌株液体气溶胶肺递送攻毒后脏器菌载量检测
鼠疫菌液体气溶胶肺递送攻毒后第2天，在各组攻毒小鼠中随机选择3只用CO2处死后，于生物安全柜中摘除小鼠眼球取全血，并解剖取其肺脏、脾脏、肝脏放置无菌平皿中。再剪取适当大小的脏器组织称重后分别放入加有 800 μL无菌 PBS 的匀浆管中，5200rpm/min匀浆 90 s，然后将匀浆液用PBS进行5倍倍比稀释，分别吸取10 μL不同梯度的稀释液滴至血琼脂平板上，将平板在 26 ℃恒温培养箱中倒置培养 72 h，统计各脏器不同稀释梯度的菌落数。
结果如图13所示，可以看出，在攻毒后第2天，rF1-V10@AMMSN组小鼠脾脏和肝脏的细菌载量显著降低。
5、鼠疫菌株液体气溶胶肺递送攻毒后脏器组织病理检测
（1）取材和固定组织：鼠疫菌液体气溶胶肺递送攻毒后第2天，在各组攻毒小鼠中随机选择3只用CO2处死，解剖后取肝脏、脾脏和肺，将小鼠脏器置于4%多聚甲醛溶液固定。
（2）脱水透明：固定48小时后，取出各脏器，依次用浓度80%、90%、95%、100%的乙醇进行脱水，每次2 h，然后将脏器放入二甲苯中静置1 h。
（3）浸蜡包埋：将脏器放入55℃液体石蜡中，待石蜡自然凝固后即成蜡块。
（4）切片与染色：将蜡块切成4-6 μm厚的蜡带，用镊子轻轻夹起蜡带并将其放置在40 ℃~45 ℃的水面上，待切片完全自然展开后将其轻轻捞起放置在干净载玻片上，倾去载玻片上的余水，置入60 ℃～65 ℃恒温箱内烘烤30 min，HE染色，显微镜下观察组织细胞变化。
结果如图14所示，a图为HE染色结果，b图是根据嗜中性粒细胞浸润、出血、组织坏死等炎症改变获得的肺部病理评分，可以看出，rF1-V10@AMMSN免疫显著降低肺部病理评分。
综上，rF1-V10@AMMSN免疫增强了小鼠对肺鼠疫的保护。
实施例5、AMMSN降解速率的效果检测
AMMSN 降解实验在37 ℃的 pH值分别为5.0 和 7.4的浓度0.1 mo/l NaAc/HAc缓冲液中进行：将6 mL的AMMSN溶液(溶质为AMMSN，溶剂为PBS，浓度1 mgmL−1)添加到透析袋(MWCO = 3.5 k)中，密封后，置于300 mL不同pH缓冲液体系中（5.0 和 7.4）。随后，在特定的时间点各取出0.5 mL，通过TEM观察形貌，并通过ICP-MS检测不同时间点上清液中Mn离子的浓度。
不同pH条件下AMMSN随时间变化的降解行为，用TEM观察形貌结果如图15所示，AMMSN在pH 5.0酸性环境中孵育24小时后，形貌逐渐降解，在孵育240小时后，几乎完全降解。
不同pH条件下AMMSN随时间变化的锰离子释放情况结果如图16所示，AMMSN在pH5.0酸性环境中锰离子释放量高于pH 7.4中性环境。

Claims (5)

1.一种负载rF1-V10的锰基纳米颗粒，包括氨基化修饰的锰基纳米颗粒和与其吸附的rF1-V10蛋白；
所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒中的锰基纳米颗粒，其为由硅酸根离子和锰离子沉淀形成的硅酸锰纳米颗粒；
所述rF1-V10蛋白来源于鼠疫菌；
所述rF1-V10蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；
所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒通过静电吸附负载所述rF1-V10蛋白；
所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒按照包括如下步骤的方法制备：
A1）将介孔二氧化硅纳米颗粒和所述锰离子在碱性条件中进行水热反应，得到硅酸锰纳米颗粒，记作锰基纳米颗粒；
A2）将所述锰基纳米颗粒和3-氨丙基三乙氧基硅烷在N,N-二甲基甲酰胺中进行氨基化修饰反应，得到氨基化修饰的锰基纳米颗粒；
步骤A1）中，所述介孔二氧化硅纳米颗粒和所述锰离子的加入配比为30 mg：0.1-0.75mmol；
步骤A2）中，所述锰基纳米颗粒和所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的加入配比为30 mg：0.8-2 mL。
2.根据权利要求1所述的锰基纳米颗粒，其特征在于：
所述rF1-V10蛋白和所述氨基化修饰的锰基纳米颗粒的负载质量比为1:5。
3.权利要求1-2任一所述的负载rF1-V10的锰基纳米颗粒在如下任一中的应用：
B1）制备预防或治疗鼠疫的产品；
B2）制备鼠疫疫苗。
4.一种鼠疫疫苗，其包括权利要求1-2任一所述的负载rF1-V10的锰基纳米颗粒。
5.权利要求1-2任一所述的负载rF1-V10的锰基纳米颗粒或权利要求4所述的鼠疫疫苗在制备具有如下任一功能产品中的应用：
D1）预防或治疗鼠疫；
D2）天然免疫刺激性能；
D3）促进树突细胞成熟；
D4）激活cGAS-STING信号通路；
D5）促进细胞因子β干扰素分泌；
D6）产生体液免疫应答反应；
D7）提高鼠疫菌攻毒下动物的存活率；
D8）降低鼠疫菌攻毒下动物脏器中细菌载量；
D9）降低鼠疫菌攻毒下动物肺部病理评分；
D10）增强机体对鼠疫菌攻毒的保护功能。
CN202310727748.0A 2023-06-20 2023-06-20 一种负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗鼠疫菌中的应用 Active CN116510003B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310727748.0A CN116510003B (zh) 2023-06-20 2023-06-20 一种负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗鼠疫菌中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310727748.0A CN116510003B (zh) 2023-06-20 2023-06-20 一种负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗鼠疫菌中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116510003A CN116510003A (zh) 2023-08-01
CN116510003B true CN116510003B (zh) 2023-10-20

Family

ID=87401405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310727748.0A Active CN116510003B (zh) 2023-06-20 2023-06-20 一种负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗鼠疫菌中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116510003B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113633762A (zh) * 2021-06-25 2021-11-12 中国矿业大学 一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法及其应用
CN114940512A (zh) * 2022-05-18 2022-08-26 西南医科大学 一种中空二氧化锰纳米粒及其制备方法、用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7093955B2 (ja) * 2016-04-14 2022-07-01 スピネカー バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 治療剤の送達のためのケイ酸金属塩を含むポーラスシリコン物質
KR102056453B1 (ko) * 2017-03-31 2020-01-22 포항공과대학교 산학협력단 망간실리케이트 나노입자를 포함하는 간 조직-특이성 영상진단용 조영제

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113633762A (zh) * 2021-06-25 2021-11-12 中国矿业大学 一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法及其应用
CN114940512A (zh) * 2022-05-18 2022-08-26 西南医科大学 一种中空二氧化锰纳米粒及其制备方法、用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Manganese-Doped Silica-Based Nanoparticles Promote the Efficacy of Antigen-Specific Immunotherapy;Janin Chandra等;J Immunol;第206卷(第5期);参考文献1的摘要、第6408页右栏末段至6409页左栏第2段和第6413页右栏第2段 *
Prevention of pneumonic plague in mice, rats, guinea pigs and non-human primates with clinical grade rV10, rV10-2 or F1-V vaccines;Lauriane E. Quenee等;Vaccine;第29卷;第6572-6583页 *
STING agonist-loaded mesoporous manganese-silica nanoparticles for vaccine applications;Cheng Xu等;Journal of Controlled Release;第357卷;第84-93页 *
锰离子作为免疫调节剂的发现及应用展望;卫潇茗;王晨光;张睿;蒋争凡;;中国细胞生物学学报(10);第7-17页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116510003A (zh) 2023-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111643454B (zh) 用于免疫治疗的含锰微沉淀脂质体及其制备方法
EP2068913A2 (en) Immune modulators, preparations and compositions including immune modulators, tests for evaluating the activity of immune modulators and preparations and compositions including the same, and methods
WO2022100746A1 (zh) 双特异性单链抗体、负载抗体的重组溶瘤病毒及病毒组合
CN115252582A (zh) 红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备及应用
CN111346224B (zh) 一种免疫佐剂组合物及其制备方法和应用
KR20160132044A (ko) 효모 세포벽 입자를 사용하는 백신 전달 시스템
Zuo et al. Macro-microporous ZIF-8 MOF complexed with lysosomal pH-adjusting hexadecylsulfonylfluoride as tumor vaccine delivery systems for improving anti-tumor cellular immunity
CN116510003B (zh) 一种负载鼠疫菌rF1-V10蛋白的锰基纳米颗粒疫苗及其在抗鼠疫菌中的应用
CN110755607B (zh) 氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗、其制备方法与应用
CN111848808A (zh) 一种用于生物矿化口蹄疫病毒样颗粒的磷酸钙材料以及制备方法与应用
CN117281896A (zh) 一种复合佐剂及其制备方法和应用
CN111671893B (zh) 牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮mdbk细胞
CN103948921A (zh) 一种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法
CN114522247A (zh) 一种复合纳米粒及其制备方法和用途
CN107446858B (zh) 一株鸽支原体及其应用
CN112870224B (zh) 一种放疗增敏剂及其制备方法
CN113940994B (zh) 壳聚糖-Pickering乳液白细胞介素12佐剂体系的制备方法及其应用
CN115645523B (zh) 聚合物脂质杂化纳米粒作为免疫佐剂的应用以及一种免疫制剂
CN114748414B (zh) 一种共负载化疗药和纳米粒的海藻酸钠水凝胶复合体系及其制备方法和应用
US20230192852A1 (en) Virus composition
TWI554610B (zh) 蝦淋巴細胞及其純化方法與用於體外評估先天免疫反應的方法
CN116570722A (zh) 一种皮克林乳剂递送系统及其制备方法和应用
CN117599211A (zh) 一种靶向肿瘤的药物递送系统及其制备方法和用途
CN116036308A (zh) 一种膜蛋白脂质纳米颗粒复合物及其制备方法与应用
CN116585463A (zh) 一种红细胞膜包覆的禽流感病毒样颗粒纳米疫苗及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant