KR102056453B1 - 망간실리케이트 나노입자를 포함하는 간 조직-특이성 영상진단용 조영제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산성 조건에서 망간 이온 (Mn2 +)이 방출되는 망간실리케이트 간종양-특이적 영상진단용 MRI 조영제 및 이를 이용한 간조직의 특성화 방법에 관한 것으로, 비교적 단시간 내에 혈관 분포 (vascularity), 세포 밀도 (cell density), 미토콘드리아 활성도 (mitochondrial activity), 간세포성 친화도 (hepatocellular affinity) 등 정상 간조직 및 질환 조직(특히 간종양)의 조직-특이성에 따라 T1-강조영상의 양상 (pattern)이 상이하게 나타나는바, 이와 같은 T1-강조영상의 분석을 통하여 적정 시간에 간종양의 질환-특이적 특징을 파악할 수 있다. 특히 간종양의 종류를 감별 진단하거나 치료효과를 판정하는 데 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대되며, 나아가 간 이외의 장기에서 발생하는 질환에도 조직-특이성에 따른 진단에 도움이될 것으로 기대된다.

Description

망간실리케이트 나노입자를 포함하는 간 조직-특이성 영상진단용 조영제{Contrast agent for tissue-specific imaging diagnosis of the liver comprising manganese silicate nanoparticles}
본 발명은 간조직 영상진단용 조영제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 산성 조건에서 망간 이온 (Mn2 +)이 방출되는 공동성 망간실리케이트(hollow manganese silicate, HMS) 나노입자를 포함하는 간 조직-특이성 영상진단용 조영제, 더욱 자세하게는 간종양-특이성(hepatic tumor-specific) 영상진단용 MRI 조영제에 관한 것이다.
자기공명영상 (magnetic resonance imaging, MRI)에서 조영제의 역할은 장기나 병변을 조영증강 (contrast enhancement)시켜, 병변의 검출 능력을 향상시키거나 병변의 특성화를 가능하게 하여 진단 및 감별 진단의 능력을 향상시키는데 사용된다. 현재 주로 사용되는 상자성 Gd3 + 킬레이트 콤플렉스 기반의 조영제는 혈관 분포 (vascularity)의 차이에 의존하는 비특이적 세포외액 (extracellular fluid, ECF) 조영제로 간 MRI에도 널리 사용되고 있다. 그 중 Gd-EOB-DTPA는 간세포에만 흡수되고 간에만 존재하는 담도로 배출되는 간담도성 배출 (hepatobiliary excretion)의 기능이 있어 간특이성 (liver-specific) 조영제라고 하며 특히 간 MRI에 많이 사용된다. 그러나, ECF제를 이용한 MR 영상은 빠른 영상 수집 및 정밀한 시작 시기와 같은 어려운 작업을 필요로 한다. 그리고 탈킬레이트된 Gd3+ 이온에 의한 신원전신섬유증 (nephrogenic systemic fibrosis)의 가능성이 우려된다. 그 외 SPIO (superparamagnetic iron oxide) 및 MnDPDP (mangafodipirtrisodium) 등의 조영제가 ECF제의 문제점을 극복하기 위하여 개발되었으나, 현재는 여러 문제점들 때문에 거의 사용되지 않고 있다.
SPIO는 간을 구성하는 세포 중 하나인 쿠퍼세포 (Kupffer cell)에 우선적으로 흡수되는 나노입자로서 MRI 영상에 서는 T2-강조영상에서 쿠퍼세포가 있는 정상 간의 신호강도를 감소시키는 T2 조영제 역할만 했다. 간에만 존재하는 쿠퍼세포에 흡수된다는 의미에서 간특이성 조영제라고 할 수 있으나, 간종양의 신호강도에는 영향을 주지 않기 때문에 간종양의 특성에 따라 감별진단을 할 수 없다는 결정적인 약점이 있었다.
정맥 내로 투여된 MnDPDP는 혈류 내에서 Zn2 + 이온에 의해 리간드가 교체되고 (transmetallated), 유리 Mn2 + 이온을 방출한다. 혈류 내 Mn2 + 이온은 간을 포함한 여러 장기에 흡수되어, T1-강조영상에서 신호강도를 증가시키기 때문에 T1 조영제이다. 간에 흡수된 MnDPDP는 간세포와 간종양에 동시에 흡수되나 간종양의 특성에 따라 주위 간보다 희게 보이기도 하고 (고 신호강도), 검게 보이기도 한다 (저 신호강도). 이 때 MnDPDP가 간세포에도 흡수되기 때문에 양자 간에 구분이 쉽지 않아 간종양의 검출 성적 등이 문제가 되면서 차츰 사용하지 않게 되었다. 즉 MnDPDP가 간세포에 흡수되고 담도로 배출이 되는 간담도성이기는 하나 간세포 외에도 모든 장기의 세포에도 흡수되고 충분한 연구가 이루어지지 않아서 간특이성 조영제라고 부르기에는 제한점이 있었다.
현재 많이 사용하고 있는 Gd3 +-기반 조영제는 간종양의 검출 및 특성화에 높은 정확성이 있으나, 방출된 Gd3 + 이온의 임상적 독성 (예를 들면, 신원전신섬유증)이나 환경 오염 등의 문제점이 대두되고 있고, 이를 보완할 만한 Mn2 +-기반 조영제 (MnDPDP)는 독성이 낮아 안전성은 확보하였으나, 종양의 특성에 따라 다양한 간종양을 구별하는데 제한점이 있었다.
이에 본 발명자들은 위에서 언급된 MnDPDP의 문제점에도 불구하고 Gd3+-기반 조영제와 비교해서 독성이 낮은 T1 조영제의 필요성을 인식하고 개발을 시도하였으나 (한국공개특허 제10-2016-0023963호 참조), 쿠퍼세포에서 방출되는 Mn2 +의 방출속도가 느려서 간종양의 영상 획득에 비교적 오랜 시간이 소요되는 문제점이 있었으며, 나아가 간종양의 특성에 따른 감별진단이 가능한지에 대한 연구도 이루어지지 않았다.
따라서, 영상진단용 MRI 조영제는 종양 특성화에 따라 감별진단이 가능해야 하는 것이 필수적인바, 이러한 특징을 가지면서 영상을 신속히 획득할 수 있는 간종양-특이성 MRI 조영제를 개발하는 것이 시급한 실정이다.
본 발명자들은 다양한 간종양을 구별할 수 있는 간종양-특이성 MRI 조영제를 찾고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 망간실리케이트 나노입자를 조영제로 사용하여 간조직에서 망간 이온의 방출속도를 조절함으로써 보다 빠른 시간 내에 간종양들에 대해 질환 별로 특성을 파악하여 감별 진단을 하거나, 치료 후 질환들이 괴사되었을 때 세포 생존 정도를 판단하여 치료효과를 판정할 수 있다는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 공동성 망간실리케이트 (hollow manganese silicate, HMS) 나노입자를 조영제로 사용하는 경우, 독성이 없고, 보다 빠른 시간 내에 간 종양들에 대해 질환 별로 특성을 파악하여 감별 진단을 하거나, 치료 후 질환들이 괴사되었을 때 세포 생존 정도를 판단하여 치료효과를 판정할 수 있다는 것을 확인하였으며, 산화망간 핵-실리카껍질 구조를 갖는 나노입자(MnO@SiO2)의 실리카껍질의 두께 및/또는 공극을 조절해 Mn2 + 방출속도를 조절해 정상 간조직 및 질환 조직(특히 간종양) 별로 특성을 감별하기 최적의 나노입자를 제공할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 망간실리케이트 (manganese silicate) 나노입자를 포함하는, 간 조직-특이성 MRI (magnetic resonance imaging) 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 산성조건에서 특정 속도로 망간이온을 방출 가능한 망간실리케이트 나노입자를 포함하는 간 조직-특이성 MRI 조영제로서, 상기 망간이온은, 간조직에 특이적으로 축적되며, 특이적으로 구별되는 MRI 변화 패턴을 효과적으로 생성하는 것인, 간 조직-특이성 MRI 조영제을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산성조건에서 망간이온을 방출 가능한 망간실리케이트(manganese silicate) 나노입자를 포함하는 간 조직-특이성 MRI 조영제로서, 상기 망간이온은, 간조직에 특이적으로 축적되어, 정상 간조직 및 질환 조직을 특이적으로 구별되는 MRI 변화 패턴을 생성하는 것인, 간 조직-특이성 MRI 조영제를 제공한다.
본 발명의 일 예는, 상기 간 조직-특이성 MRI 조영제 중 어느 하나 이상을 대상에 투여하는 단계; 상기 대상의 간조직을 시간에 따라 연속적으로 촬영한 자기공명영상을 획득하는 단계; 및 상기 간조직 자기공명영상의 경시적인 변화 패턴을 추출하는 단계를 포함하는 간조직의 특성화 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예는 상기 간 조직-특이성 MRI 조영제 중 어느 하나 이상을 대상에 투여하고 상기 대상의 간조직을 시간에 따라 연속적으로 촬영한 자기공명 영상을 획득하여, 간종양 진단 및 간종양의 종류를 결정할 수 있는 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 산성 조건에서 망간 이온 (Mn2 +)이 방출되는 망간실리케이트(manganese silicate) 나노입자를 포함하는 간조직용 MRI 조영제에 관한 것으로, 비교적 단시간 내에 혈관 분포 (vascularity), 세포 밀도 (cell density), 미토콘드리아 활성도 (mitochondrial activity), 간세포성 친화도 (hepatocellular affinity) 등 간종양의 조직 특성에 따라 T1-강조영상의 양상 (pattern)이 상이하게 나타나는 바, 이와 같은 T1-강조영상의 분석을 통하여 짧은 시간 안에 간종양의 특징을 파악할 수 있으므로, 특히 간종양의 종류를 감별 진단하거나 치료효과를 판정하는 데 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 공동성 망간실리케이트 (HMS) 나노입자의 망간 방출 능력과 T1 조영증강 효과를 확인한 것으로, a) 합성된 나노입자 TEM 영상, b) pH 5 citrate 버퍼현탁액의 TEM 영상, c) HMS로부터 방출되는 Mn2 +의 양, 및 d) T1-강조영상을 확인한 도이다.
도 2는 HMS (3 mg/kg)를 간세포암종 (hepatocellular carcinoma, HCC) 모델에 정맥 주사 후, T1-강조영상 및 작용기전의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3a는 대표적인 3종의 간종양 (원발성-HCC, 전이성-SNC (소장 신경내분비암종, small intestinal neuroendocrine carcinoma), 및 CAC (결장 선암종, colonic adenocarcinoma))의 T1-강조영상을 나타낸 것으로, a) HCC 모델, b) SNC 모델, 및 c) CAC 모델의 영상을 확인한 도이고, 도 3b는 이를 보다 구체적으로 나타낸 도이다.
도 4는 anti-prohibin 항체염색법 (갈색으로 발색)을 통하여 미토콘드리아를 염색하여 세포의 분포 및 활성도를 확인하고, hematoxylin 염색 (푸른색으로 발색)을 통하여 세포의 핵을 염색하여 세포의 밀도 및 간종양 별 혈관 분포를 확인한 도이다.
도 5는 Fast spin echo T1-강조영상을 통하여 3 종의 간종양에 대해 혈관 분포에 따른 조영증강 효과를 확인한 도이다.
도 6은 HCC 간종양 모델의 간동맥 결찰후 (HAO, hepatic artery occlusion) 획득한 T1-강조영상을 (상단), 및 NADH-tetrazolium reductase 염색법을 이용하여 간동맥 결찰 후 HCC 괴사 (하단)를 확인한 도이다.
도 7은 MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr), MnO@p8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr), MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)나노입자의 모식도와 현미경 관찰이미지 및 각각의 나노입자 합성 시 사용하는 구성성분과 함량을 나타낸다.
도 8a는 MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr), MnO@p8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr), MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr) 나노입자의 조감도와 MnO-SiO2-0.5h, MnO-SiO2-2h, MnO-SiO2-12h 순으로 입자의 Mn2 + 이온 방출속도가 증가함을 보여준다.
도 8b는 MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)로부터 Mn2 + 이온이 방출되는 속도를 시간변화에 따라 pH 5, pH 6, pH 7 조건에서 측정한 그래프이다.
도 8c는 MnO@p8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr)로부터 Mn2 + 이온이 방출되는 속도를 시간변화에 따라 pH 5, pH 6, pH 7 조건에서 측정한 그래프이다.
도 8d는 MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)로부터 Mn2 + 이온이 방출되는 속도를 시간변화에 따라 pH 5, pH 6, pH 7 조건에서 측정한 그래프이다.
도 8e는 pH 5 조건에서 MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr), MnO@p8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr), MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)의 Mn2 + 이온의 방출 속도를 비교한 그래프이다.
도 9a는 pH 5 citrate buffer에서 MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr), MnO@p8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr), MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr) 각각의 나노입자에서 방출된 Mn2 + 이온에 의한 T1-강조영상(T1-weighted imaging) 의 조영 세기 변화를 보여준다.
도 9b는 도 9a에서 촬영한 영상의 조영 세기를 수치화 (R1, 단위는 /second)하여 나타낸 그래프이다.
도 9c는 Mn2 +의 농도와 영상의 조영 세기(R1)의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 10a는 HCC 암모델에 MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr) 나노입자를 정맥투여한 후, 주입 전, 15분, 30분, 45분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 이후 촬영한 MRI 조영이미지를 나타낸다.
도 10b는 HCC 암모델에 MnO@p8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr) 나노입자를 정맥투여한 후, 주입 전, 15분, 30분, 45분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 이후 촬영한 MRI 조영이미지를 나타낸다.
도 10c는 HCC 암모델에 MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr) 나노입자를 정맥투여한 후, 주입 전, 15분, 30분, 45분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 이후 촬영한 MRI 조영이미지를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11e는 각 장기별 MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr), MnO@p8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr), MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr) 각각의 조영제 투여후 조영증강효과 SNR (small-to-noise ratio)값을 시간별로 측정한 결과를 나타낸다. 도 11a는 간암, 도 11b는 정상 간 조직, 도 11c는 신장, 도 11d는 비장, 도 11e는 장에서 측정한 시간변화에 따른 SNR 값 변화 그래프를 나타낸다.
도 12a는 CAC 암모델에 MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr) 나노입자를 정맥투여한 후, 주입 전, 15분, 30분, 45분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 이후 촬영한 MRI 조영이미지를 나타낸다.
도 12b는 CAC 암모델에 MnO@p8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr) 나노입자를 정맥투여한 후, 주입 전, 15분, 30분, 45분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 이후 촬영한 MRI 조영이미지를 나타낸다.
도 12c는 CAC 암모델에 MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr) 나노입자를 정맥투여한 후, 주입 전, 15분, 30분, 45분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 이후 촬영한 MRI 조영이미지를 나타낸다.
도 13a는 SNC 암모델에 MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr) 나노입자를 정맥투여한 후, 주입 전, 15분, 30분, 45분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 이후 촬영한 MRI 조영이미지를 나타낸다.
도 13b는 SNC 암모델에 MnO@p8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr) 나노입자를 정맥투여한 후, 주입 전, 15분, 30분, 45분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 이후 촬영한 MRI 조영이미지를 나타낸다.
도 13c는 SNC 암모델에 MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr) 나노입자를 정맥투여한 후, 주입 전, 15분, 30분, 45분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 이후 촬영한 MRI 조영이미지를 나타낸다.
도 14a는 도 10a 내지 도 10c의 MRI 조영이미지를 합쳐 나타낸 것이다
도 14b는 도 12a 내지 도 12c의 MRI 조영이미지를 합쳐 나타낸 것이다.
도 14c는 도 13a 내지 도 13c의 MRI 조영이미지를 합쳐 나타낸 것이다.
도 15a는 MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr) 조영제를 세가지 암모델 각각에 투여한 후, 시간변화에 따른 MRI 조영이미지의 변화를 나타낸다.
도 15b는 MnO@p8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr) 조영제를 세가지 암모델 각각에 투여한 후, 시간변화에 따른 MRI 조영이미지의 변화를 나타낸다.
도 15c는 MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr) 조영제를 세가지 암모델 각각에 투여한 후, 시간변화에 따른 MRI 조영이미지의 변화를 나타낸다.
본 발명자들은, 망간 이온 (Mn2 +)이 방출되는 망간실리케이트 (manganese silicate) 나노입자, 예를 들면 공동성 망간실리케이트 (HMS, hollow manganese silica) 나노입자 또는 산화망간 핵(core)- 실리카 껍질(shell) 구조를 갖는 나노입자가 낮은 독성, 빠른 조영 효과 및 상이한 T1-강조영상의 패턴을 통한 간종양의 종류를 구별할 수 있는 능력을 보이는 점에 기반하여 상기 나노입자에서의 Mn2 + 이온의 방출, 이완 특성 및 상기 나노입자의 T1-강조영상 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 산화망간 핵(core)- 실리카 껍질(shell) 구조를 갖는 나노입자의 MnO 핵은 낮은 pH 조건(pH 4-5)에서 쉽게 용해되며, 쿠퍼세포 내부가 상기 pH 조건에 있기 때문에, pH-반응성 간-특이적 MRI 조영제로서 유용하다. 상기 조영제는 산성 조건에서 Mn2 +이온을 방출시킴으로써 암 병변에 대비하여 정상 간 조직에 위치한 쿠퍼 세포(kupffer cell)의 대조를 향상시킬 수 있다.
본 발명자의 이전 연구에서는 Mn2 +가 도핑된 실리카 나노입자를 조영제로 사용하였다. 본 발명의 망간실리케이트 나노입자의 한 종류인 공동성 망간실리케이트 (HMS)는 낮은 pH 조건에서 자유로운 Mn2 +를 방출하나 그들의 방출 속도는 나노입자의 구조에 의해 조절되고, 공동성 망간실리케이트 (HMS)의 Mn2 + 방출속도는 Mn2 +가 도핑된 실리카 나노입자보다 훨씬 빠르고, 이로 인해, 조영제를 정맥 주사한 후 초기 단계에서 서로 다른 T1-가중 간 MRI 이미징을 나타낸다.
산화망간 핵(core)- 실리카 껍질(shell) 구조를 갖는 나노입자의 경우, 나노입자의 실리카 껍질의 두께 및/또는 다공성을 조절해 Mn2 + 방출은 조절할 수 있으며, 낮은 pH 조건의 엔도좀 내에서 나노입자의 외부로 Mn2 +의 방출을 조절함으로써 contrast 강화 시간은 조절할 수 있다.
이러한 T1-강조 간 MRI의 조영 증강 패턴상의 차이점들은 간종양의 병리학적 특징에 관한 유용한 진단 정보를 제공할 수 있으며, 원발성 악성 종양(primary malignant tumor)과 전이 종양(metastatic tumor)을 구분할 수 있고, 이에 더 나아가 간종양의 종류를 감별할 수 있다. 본 발명자들은 낮은 pH 조건에서 Mn2 + 방출 속도를 조절한 일련의 pH-반응성 MnO 실리카 나노입자를 제조하고, 병리학적 특징 및 혈관신생에 기초한 다른 종양 모델간에 T1-강조 간 MRI의 다양한 변화를 측정함으로써, 병변 탐지 및 특징화를 위해 설계된 NPs(Nanoparticle)의 최적화된 방출 속도를 확인하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 산성조건에서 망간이온을 방출 가능한 망간실리케이트(manganese silicate) 나노입자를 포함하는 간조직용 MRI 조영제로서, 상기 망간이온은 간조직에 특이적으로 축적되어, 특이적으로 구별되는 MRI 변화 패턴을 생성하는 것인, 간조직-특이성 MRI 조영제를 제공한다.
상기 망간실리케이트 나노입자는 간조직의 쿠퍼 세포로 흡수되어 망간이온을 방출시키며, 방출된 망간이온은 쿠퍼 세포 밖으로 배출되어 간조직에 특이적으로 흡수 및 축적되어 특이적으로 구별되는 MRI 변화 패턴을 생성할 수 있다.
상기 쿠퍼 세포 밖으로 방출되는 망간 이온의 방출속도는, 망간 이온이 간조직에 특이적으로 축적되어 간조직 특이적으로 구별되는 MRI 이미지의 변화 패턴을 생성하는 방출속도를 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 간암과 정상간의 구분에 더하여, 간 조직-특이적으로 구별할 수 있는, 구체적으로 간암의 종류와 기원까지 구별할 수 있는 망간실리케이트 나노입자를 포함하는 간 조직-특이성 MRI 조영제를 제공한다.
본 발명자들은 간암의 종류와 기원까지 구별 가능하게 하기 위해서는 쿠퍼세포에 엔도사이토시스(endocytosis)된 망간이온을 담지하는 나노입자에서의 망간 이온의 방출속도 및/또는 방출양이 중요함을 밝혔다. 구체적으로, 간조직 특이적으로 구별까지 가능하기 위해서는 순간적으로 과량의 망간이온(Mn2 +)을 방출할 수 있어야 한다.
본 발명의 망간실리케이트 나노입자를 포함하는 조영제는 망간 이온이 간조직에 특이적으로 축적되어 간조직 특이적으로 구별되는 MRI 변화 패턴을 생성하는 방출속도로 망간 이온을 방출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예에 따르면, 상기 망간 이온의 방출 속도는 나노입자의 공극도 및 층 두께를 조절하여 조절될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면 상기 간 조직-특이성 MRI 조영제는 혈관 분포 (vascularity), 세포 밀도 (cell density), 미토콘드리아 활성도 (mitochondrial activity), 또는 간세포성 친화도 (hepatocellular affinity)를 분석하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 MRI 조영제는 T1 조영증강 방식의 T1 조영제일 수 있다.
또한, 상기 조영제를 사용할 경우, 간종양과 정상 간조직을 구별할 수 있으며, 이에 더 나아가 간종양의 종류를 구별할 수 있고, 간종양의 치료 효과를 모니터링할 수 있다.
상기 본 발명의 조영제를 사용해 구별할 수 있는 정상 간은 실질조직 (parenchymal tissue) 일 수 있으며, 간종양의 종류는 일반적으로 알려진 간종양의 모든 종류를 포함할 수 있다. 구체적으로, 간에 생기는 양성 종양, 간 고유세포의 암성 변이에 의해 발생되는 원발성 간암 또는 간 이외의 장기에서 발생하여 간으로 전이된 전이성 간암 종류를 포함할 수 있으며, 양성 종양의 예로 혈관종(Hemangioma), 간선종(Hepatic adenoma), 국소결정성과증식(Focal nodular hyperplasia, FNH) 등, 원발성 간암의 예로 간세포암종(Hepatocellular carcinoma, HCC), 담관암(Cholangiocarcinoma), 간모세포종(Hepatoblastoma), 혈관육종(Angiosarcoma), 전이성 간암의 대표적인 예로 혈관성(vascularity)을 기준으로 할 때 저혈관성인 결장 선암종 (colonic adenocarcinoma, CAC), 과혈관성인 소장신경내분비암종(small intestinal neuroendocrine carcinoma, SNC) 등을 구별할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 망간실리케이트 나노입자는 공동성 (hollow)을 갖는 구조를 가질 수 있다.
본 발명에서, "공동성 망간실리케이트 (hollow manganese silicate, HMS) 나노입자"는 망간 함유량이 높고, 식세포-엔도좀 환경과 같은 산성 조건 노출시 망간의 비정질 특성으로 인하여 망간 (Mn) 이온의 파열 및 고용량 방출을 일으킬 수 있다. 따라서 상기 망간실리케이트 나노입자는 혈액으로부터 쉽게 여과되어 간의 쿠퍼세포 (Kupffer cell)에 의해 우선적으로 흡수된 후 쿠퍼세포에서 다량의 Mn2 +이온을 방출하고, 방출된 Mn2 + 이온은 종양의 혈관 분포, 세포 밀도, 미토콘드리아 활성도, 간세포성 친화도 등에 따라 다양하게 간조직 예를 들어, 종양 내로 흡수 및 축적되는 조직-특이적(tissue-specific) 성질을 갖는다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 망간실리케이트 나노입자는 산화망간 핵(core)- 실리카 껍질(shell) 구조를 갖는 것일 수 있다.
이 후, 상기 산화망간 핵(core)- 실리카 껍질(shell) 구조를 갖는 나노입자를 MnO@SiO2로 표시한다. 실리카 껍질은 낮은 pH 환경에서 Mn2 +의 즉시 방출을 보호하고 중성 pH 조건에서 입자의 분산도를 향상시킨다.
상기 실리카 껍질의 두께 및 공극을 조절하여 산성조건에서 Mn2 +의 방출속도를 조절할 수 있으며, 실리카 껍질의 두께가 두꺼워 질수록 방출 속도가 감소하고, 공극도가 높아질수록 방출속도가 증가한다.
본 발명은 산화망간 핵(core)-실리카 껍질(shell) 구조 나노입자의 실리카 껍질의 두께 및 공극을 조절함으로써, 간암의 종류를 효과적으로 구별(discrimination)할 수 있는, 예를 들어, 정상 간조직과 간종양 조직의 시간 변화에 따른 MRI 이미지 변화 패턴 차이가 명확히 나타나거나 짧은 시간내 간암 구별을 가능하게 하도록 Mn2+를 방출하는 최적 구조의 나노입자를 제공할 수 있다.
상기 산화망간 핵(core)- 실리카 껍질(shell) 구조 나노입자의 실리카 껍질의 두께는 0.5nm 내지 20nm, 바람직하게는 1nm 내지 15nm, 더욱 바람직하게는 2nm 내지 12nm 인 것이 바람직하다. 상기 상한 두께 범위를 넘어설 경우, Mn2 + 방출속도가 현저히 감소하여, MRI 측정시간이 오래 걸린다는 단점이 있으며, 하한 두께 미만일 경우, Mn2 +가 과도하게 급속히 방출되어 간종양 종류까지 감별하기는 쉽지 않다는 문제점이 있다.
하기 본 발명의 실시예 11에 따르면, 간암 종류별 및 나노입자의 종류별 시간변화에 따른 MRI 이미지 변화 패턴의 차이가 발생함을 알 수 있으며, 적절한 구조의 나노입자 조영제를 선택해 사용함으로써 MRI 이미지만으로 간종양의 탐지 및 간종양의 종류를 빠른 시간 내 효율적으로 구분할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 망간실리케이트 나노입자에서 망간 이온은 나노입자의 총중량을 기준으로 하여 0.5-55 중량%로 포함되고, 보다 바람직하게는 15-55 중량%, 보다 더 바람직하게는 19-55 중량% 또는 20-47 중량%로 포함된다. 나노입자에 망간 이온이 상기 함량으로 포함된 경우에 MRI 조영제로서의 조영증강 효과가 개선된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 MRI 조영제는 pH-응답(responsive) 신호 증강 방식이며, 이는 본 발명의 가장 큰 특징 중 하나이다.
구체적으로, 보다 바람직하게는, 상기 공동성 망간실리케이트(HMS) MRI 조영제는 인 비트로 중성 조건에 서 비이완성 (specific relaxivities)인 r1 값은 0.12 s-1·mM-1이고, 이는 유리 망간 이온 (Mn2 +)의 r1 값인 7.8 s-1·mM- 1와 비교할 때, 물 양성자의 이완시간을 감소시키지 못하여 MR 영상의 신호 강도에 영향이 없음을 의미한다. 한편, 산성 조건에서 HMS로부터의 Mn2 + 이온의 방출이 증가하며, 이로 인해 MRI 영상의 조영 증강을 나타낸다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 산성 조건은 pH 2-5.5 이고, 보다 바람직하게는 pH 3-5이다.
MRI는 물 분자의 수소의 핵스핀의 이완을 측정하는데 크게 T1, T2 영상을 측정할 수 있다. MRI 조영제는 T1 조영제와 T2 조영제로 분류되며, T1 또는 T2 신호를 증폭하는 역할을 한다. T1, T2는 MRI에서 핵스핀이 여기된 이후에 스핀-격자 완화 시간 또는 스핀-스핀 완화 시간을 각각 의미하며 서로 다른 조영효과를 가져온다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 MRI 조영제는 T1 조영증강방식 MRI 조영제이며, 본 발명의 MRI 조영제에 이용되는 상자성 물질인 망간 이온에 의해 통상 물과 비교하여 밝은 신호 효과 (bright or positive contrast effect)를 나타낸다.
본 발명의 상기 조영제는 생체 내 (in vivo)에서 질환-특이성 (disease-specific) 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화패턴을 생성할 수 있다.
본 발명에서 용어 "특이성"은, 본 발명의 MRI 조영제가 생체 내 특정 기관 또는 조직의 특징에 따라 상대적으로 많은 양으로 축적되거나 배출되는 것을 의미한다. 본 발명의 상기 질환은 그 종류를 특별하지 않으며, 체내의 모든 장기 질환일 수 있으나 바람직하게는 간질환인 것이 바람직하다.
예를 들면, 본 발명의 MRI 조영제는 특히, 간 특이성(liver specific)을 가지며, 정상적인 간 조직에만 존재하는 쿠퍼세포에 먼저 나노입자 형태로 흡수되어 많이 존재한다는 점은 간 특이적이라 할 수 있고, Mn2 + 형태로 간세포에 흡수되는 과정은 간 특이적이라고 할 수 없지만, 담도로 배출되는 과정은 간세포에서만 가능하므로 간 특이적이라고 할 수 있다. 상기로부터, 본 발명의 MRI 조영제는 간에 종양이 생겼을 때 그 종양이 간종양-특이성을 가지는지에 따라 종양여부 및 종양의 종류를 진단하는 데 매우 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 상기 MRI 조영제는 생체 내(in vivo)에서 질환-특이성 (disease-specific) 신호 증강을 발생시킨다.
이러한 질환-특이적 증강 특성 또한 본 발명의 가장 큰 특징 중 또 다른 하나인데, 이는 MRI 조영제 주입 시 간종양 종류별 특성 (혈관 분포, 세포 밀도, 미토콘드리아 활성도, 및 간세포성 친화도 등)에 따라, 종양부 또는 종양의 가장자리 부분이 특징적으로 차이가 나게 조영증강되는 양상을 말하며, 이러한 특성으로 MR 영상을 통하여 간종양의 종류를 감별하여 진단하거나, 간종양의 치료 효과를 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, HMS를 제조하고, HMS의 망간 방출 능력 및 T1 조영 효과를 확인한 결과, 산성 조건에서 모든 방출 가능한 Mn2+가 즉시 방출되고, 유리 Mn2 + 이온의 농도를 15 분 이내에 최대로 증가시킬 수 있음을 알 수 있었으며(실시예 2 참조), 다른 실시예에서는, 3 종의 간종양 타입 (HCC-원발성, SNC, CAC-전이성)에 따라 T1-강조영상이 다르게 나타남을 확인하였다 (실시예 4 참조).
본 발명의 또다른 일 실시예에서는, 산화망간 핵-실리카 껍질 구조(MnO@SiO2)를 갖는 나노입자를 제조하고, 실리카 껍질의 두께 및/또는 공극을 조절하여, 세 종류의 (MnO@5nm-SiO2, MnO@8nm-pSiO2, MnO@10nm-SiO2) 나노입자를 제조하였으며, 각각의 나노입자 조영제를 정맥투여했을 때, 간종양 타입 (HCC-원발성, SNC, CAC-전이성)에 따라 T1-강조영상이 다르게 나타남을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 나노입자는 간종양의 특성에 따라 T1-강조영상의 패턴이 상이하게 나타나는 바, 특히 간종양의 종류를 구별하여 진단하거나, 간종양의 치료 효과를 판단하는 것이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면 상기 간조직용 MRI 조영제 투여후 얻은 MRI 영상 이미지의 변화패턴은 MRI 촬영 영상 이미지의 밝기 변화 패턴인 것일 수 있다.
상기 밝기 변화 패턴은 시간의 흐름에 따라 촬영한 MRI 영상 이미지를 나열했을 때 경시적으로 판단할 수 있는 것이다.
상기 조영제 투여 후 얻어지는 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화패턴이, 정상 간조직은 조영제 투여 후 시간순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 것일 수 있다. 특히. 상기 정상 간조직은 간 실질조직 (parenchymal tissue) 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 간조직은 간세포암종(HCC, hepatocellular carcinoma)이며, 상기 조영제 투여 후 얻어지는 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화 패턴이, 조영제 투여 후 시간순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 정상 간조직의 이미지 변화 패턴을 기준으로 하여, 간세포암종(HCC)은, 조영제 투여 후 시간순차에 따라 어두운 상태로 유지되다가, 정상 간조직의 영역이 최대로 밝아지는 시점부터 밝아지기 시작하여 밝기가 유지되는 패턴을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 간종양으로 추측되는 부분은 HMS 주입 후 종양 주변부부터 비균질적으로 조영증강 된 후, 24 시간까지 중심부로 조영증강이 차들어가면서 균질적으로 변하는 양상을 보이는 경우, 상기 특정부위를 HCC로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 간조직은 결장 선암종 (CAC, colonic adenocarcinoma)이며, 상기 조영제 투여 후 얻어지는 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화패턴이, 조영제 투여 후 시간순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 정상 간조직의 이미지 변화 패턴을 기준으로 하여, 상기 결장 선암종은, 조영제 투여 후 검게 유지되거나 또는 정상 간조직의 MRI 이미지 밝기보다 어두운 상태로 높게 점진적으로 증가 또는 가장자리만 원형 모양으로 밝아지는 패턴을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 간종양으로 탐지된 부분이 HMS 주입 후 종양이 조영증강 정도가 초기부터 24 시간까지 전반적으로 비교적 감소된 조영증강을 유지하는 양상을 보이는 경우, 상기 특정 부위를 CAC로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 간조직은 소장신경내분비암종(SNC, small intestinal neuroendocrine carcinoma)이며, 상기 조영제 투여 후 얻어지는 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화패턴이, 조영제 투여 후 시간순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 정상 간조직의 이미지 변화 패턴을 기준으로 하여, 상기 소장신경내분비암종은, 조영제 투여 후 시간순차에 따라 점진적으로 밝기가 증가하고, 정상 간조직의 MRI 이미지 밝기보다 높게 유지되며 어두워지지 않는 패턴을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 간종양으로 탐지된 부분이 HMS 주입 후 종양이 조영증강 정도가 초기부터 24 시간까지 전반적으로 비교적 강한 조영증강이 유지되는 양상을 보이는 경우, 상기 특정부위를 SNC로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, MnO@SiO2 나노입자를 각각의 암종(HCC, CAC, SNC)에 주입하고 시간 변화에따른 MRI 이미지 변화를 측정해 간암을 탐지 및 구별할 수 있다. 비록, MnO@SiO2 나노입자의 껍질 두께, 공극 정도에 따라 MRI 변화 패턴이 발생하는 시간상 차이는 존재하나, 명암 변화 패턴은 공통되게 나타난다.
하기 본 발명의 실시예 9에 따르면, HCC의 경우, MnO@5nm-SiO2 조영제를 사용시 상기 조영제 정맥투입 후 촬영한 MRI 이미지 변화 패턴에서, 30분 내지 1시간 동안 높은 조영증강을 나타내고, 1시간 내지 24시간 동안 낮은 조영증강을 나타내는 부분을 정상조직으로 판별할 수 있으며, 30분 내지 4시간 동안은 어둡거나(black) 주변만 조영증강 되며, 4시간 내지 24시간 동안 높은 조영증강을 나타내는 부분은 HCC 종양조직으로 판별할 수 있다.
MnO@8nm-pSiO2 조영제를 사용시 상기 조영제 정맥투입 후 촬영한 MRI 이미지 변화 패턴에서, 45분 내지 4시간 동안 높은 조영증강을 나타내고, 4시간 내지 24시간 동안 서서히 조영증강이 감소하는 부분을 정상조직으로 판별할 수 있으며, 45분 내지 4시간 동안은 어둡게(black) 나타나나, 4시간 내지 24시간 동안 높은 바깥쪽에서 종양 내부로 점점 조영증강이 확산되는 부분을 HCC 종양조직으로 판별할 수 있다.
MnO@10nm-SiO2 조영제를 사용시 상기 조영제 정맥투입 후 촬영한 MRI 이미지 변화 패턴에서, 45분 내지 8시간 동안 높은 조영증강을 나타내고, 8시간 내지 24시간 동안 서서히 조영증강이 감소하는 부분을 정상조직으로 판별할 수 있으며, 45분 내지 8시간 동안은 어둡게(black) 나타나거나 주변만 조영증강 되고, 8시간 내지 24시간 동안 전반적인 종양부분에서 높은 조영증강을 나타내는 부분을 HCC 종양조직으로 판단할 수 있다.
하기 본 발명의 실시예 11에 따르면, CAC(HT29)의 경우, MnO@5nm-SiO2 조영제를 투입 후 촬영한 MRI 이미지 변화 패턴에서 15분에서 45분 동안 높은 조영증강을 나타내고 1시간 이후부터 24시간 까지 점차 조영증강이 감소되는 부분을 정상조직으로 판별할 수 있으며, 15분 내지 24시간 동안 검거나 주변부만 밝게 유지되는 부분을 CAC 종양조직으로 판단할 수 있다.
MnO@8nm-pSiO2 조영제를 정맥 투입 후 촬영한 MRI 이미지 변화 패턴에서, 30분에서 4시간 동안 높은 조영증강을 나타내고 4시간 이후부터 24시간 까지 점차 조영증강이 감소하는 부분을 정상조직으로 판별할 수 있으며, 30분 내지 24시간 동안 검거나 주변부만 밝게 유지되는 부분을 CAC 종양조직으로 판별할 수 있다.
MnO@10nm-SiO2 조영제를 정맥 투입 후 촬영한 MRI 이미지 변화 패턴에서, 15분에서 4시간 동안 높은 조영증강을 나타내고 8시간 이후부터 24시간 까지 조영증강이 감소되면 정상조직으로 판별할 수 있으며, 15분 내지 4시간 동안 검게 나타나거나 주변부만 밝게 유지되었고, 8시간 내지 24시간 동안 종양의 경계 부분만 조영증강되는 부분은 CAC 종양조직으로 판별할 수 있다.
하기 본 발명의 실시예 12에 따르면, SNC(STC-1)의 경우, MnO@5nm-SiO2, MnO@8nm-pSiO2, MnO@10nm-SiO2 각각의 조영제를 투입 후 촬영한 MRI 이미지 변화 패턴에서 15분 내지 1시간 동안은 두 조직이 구별이 잘 되지 않으나, 4시간 이후부터 24시간 까지 점차 조영증강이 일어나 밝아지는 부분을 SNC 종양조직으로 판별할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 MRI 조영제는 생체 내 (in vivo)에서 시간 차 (time-sequence)에 따라 신호강도 증강을 발생시킨다. 구체적으로, 보다 바람직하게는 상기 HMS 조영제를 투여할 경우, 생체 내 주입 후 0.1 내지 5 시간에 정상 간 조직에 고 신호강도 (high signal intensity)를 나타내고, 생체 내 주입 후 6 내지 24 시간에 간 질환 조직에 고 신호강도를 나타낸다.
이러한 시간차 신호 증강 특성은 본 발명의 가장 큰 특징 중 다른 하나인데, 이는 HMS MRI 조영제 주입 후 5 시간까지는 정상 간 조직에 있는 쿠퍼세포 (Kupffer cells)에 의해 흡수된 HMS가 산성 엔도좀 환경에서 Mn 이온이 방출되어 정상 간 조직에는 고 신호강도를, 한편 간 병변 조직에는 저 신호강도를 나타내고, 이후 시간에는 쿠퍼 세포 밖으로 배출 및 확산된 망간 이온을 간 병변 조직이 흡수하여 정상 간 조직은 저 신호강도를, 한편 간 병변 조직은 고 신호강도를 나타냄을 의미한다.
즉, 정상 간 조직은 T1-강조영상에서 희게 보이다가 검게 보이는, 반대로 간 병변조직은 검게 보이다가 희게 보이는 양상을 말한다.
이러한 시간차 신호 증강 특성으로 단일 MRI 영상 세션 내 역전 대조 모드로 간 병변 조직의 뚜렷한 이중 MRI 영상을 수집할 수 있으며, 간 병변 조직의 검출률 및 감별 진단의 가능성을 높일 수 있을 것이다.
본 발명의 일 예는, 상기 조영제 중 어느 하나 이상을 대상에 투여하는 단계; 상기 대상의 간조직을 시간에 따라 연속적으로 촬영한 자기공명영상을 획득하는 단계; 및 상기 간조직 자기공명영상의 경시적인 변화 패턴을 추출하는 단계를 포함하는 간조직의 특성화 방법을 제공한다.
상기 간조직 지기공명영상의 간조직의 특성에 따른 경시적인 변화 패턴은 앞선 조영제 부분에서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명의 일 예는 상기 조영제 중 어느 하나 이상을 대상에 투여하고 상기 대상의 간조직을 시간에 따라 연속적으로 촬영한 자기공명영상을 획득하여, 간종양 진단 및 간종양의 종류를 결정할 수 있는 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 간종양 진단 및 간종양의 종류를 결정할 수 있는 정보는 자기공명영상의 시간에 따른 밝기 변화 패턴이다.
상기 대상은 동물, 바람직하게는 포유류일 수 있으며, 인간을 제외할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법
1-1. 실험 재료
시약은 MnCl2·4H2O (Kanto), 올레산나트륨 (Sodium Oleate, TCI), 1-옥타데센 (Aldrich), Igepal® CO-520 (Aldrich), 테트라에틸 오소실리케이트 (Tetraethyl Orthosilicate, Acros), NH4OH (Samchun Chem.), Ni(NO3)6H2O (Strem), Cu(NO3)2·3H2O (Strem), NaBH4 (Samchun Chem.), 2-[메톡시(폴리에틸레녹시)-프로필]9∼12-트리메톡시실레인 (MPEOPS, Gelest, Inc.), 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC, Aldrich), 및 3-아미노프로필트리에톡시실레인 (APTES, Aldrich)을 사용하였으며, 모든 시약은 정제하지 않고 구입한대로 사용하였다.
1-2. HMS (hollow manganese silicate)의 준비
HMS (hollow manganese silicate) 나노파티클 (NPs)은 이전에 공지된 절차에 의하여, MnO@SiO2/Cu2 + 를 어닐링 (annealing)한 후, 선택적으로 Cu@HSNP (hollow-구조 NPs)의 외부 실리카 껍질을 에칭 (etching)함으로써 합성하였다 (Kim, J. G.,Kim, S. M. & Lee, I. S. Mechanistic insight into the yolk@shell transformation of MnO@silica nanospheres incorporating Ni2+ ions toward a colloidal hollow nanoreactor. Small 11, 1930-1938 (2015)). 합성된 HMS는 다음과 같은 특성을 갖는다; Cu2 +-결합 SiO2 나노구(nanosphere)를 함유하는 MnO 나노결정으로부터 solid-state-hollowing 공정을 사용하여 합성된, 공동 (14±2 nm) 내부에 캡슐화된 Cu 나노결정 (9±1 nm)을 갖는 HMS (39±2 nm).
1-3. HMS의 방출 및 이완 특성 확인
HMS로부터 망간 이온의 방출 프로파일을 pH 5 및 pH 6.2의 구연산염 완충액 16 ml 및 증류수 중에서 8 mg의 HMS 현탁액을 사용하여 실온에서 정량화하였다. 각 현탁액에서 4 ml의 시료를 15 분, 1 시간, 7 시간 및 20 시간에 채취하였으며, 15,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 시료의 나노파티클 (NPs)을 제거한 후, 각 상층액을 0.2 mm 공극 크기의 주사기 필터로 여과하였다. ICP-AES 및 3.0-T 임상 MR 스캐너 (Philips, Achieva ver.1.2, Philips Medical Systems, Best, The Netherlands)를 사용하여 각각의 방출된 망간 이온의 양과 상층액에서의 양성자의 T1 이완 시간을 정량화하였다.
1-4. 동물모델 (원발성-HCC, 전이성-SNC 및 CAC)의 준비
6 주령의 BALB/C 누드 마우스 (HCC 모델의 수컷, 전이성 암종 모델의 암컷)를 Orient Bio (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 모든 동물 연구는 삼성 생명과학연구소의 동물 실험실 이용 위원회에서 승인되었다. HCC 모델은 인간 HCC 세포주(HepG2, Korean Cell Line Bank)를 이용하여 제작하였으며, 전이성 암종 모델은 인간 CAC 세포주 (HT29, ATCC) 및 마우스 SNC 세포주 (STC-1, ATCC)를 사용하여 제작하였다. 상기 세포주는 최소 필수 배지 (HepG2), 맥코이 5a 배지 (HT29) 및 10 % 소태아혈청 (Invitrogen) 및 1 % 항생제 (ThermoFisher)를 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle's 배지 (STC-1)에서 유지되었다. 세포를 37 ℃ 및 5 % CO2 조건에서 배양하고, 0.25 % Trypsin/EDTA (ThermoFisher)로 회수하였다. 회수된 세포 (1x106 HepG2, 5x106 HT29 및 1x107 STC-1)는 마트리겔 (1:1)을 포함하는 10 μl HBSS에 현탁시켰다. 세포를 샘플링한 후, 페이스 마스크를 통해 2 % (v/v) 이소플루란을 O2/N2 가스 (3:7 비율)의 혼합물로 적용하여 마우스를 완전히 마취시키고, 간을 수술로 노출시켰다. 마트리겔과 혼합된 세포를 천천히 간으로 주입한 후, 절개를 막았다. 4~6 주 후, MR 영상을 이용하여 종양의 크기를 확인하였다.
1-5. MRI 영상
HCC, SNC 및 CAC 종양의 MR 영상은 다음과 같은 방법으로 얻었다.
페이스 마스크를 통해 O2/N2 가스 (3:7 비율)를 혼합한 5 % (v/v) 이소플루란을 투여하여 마취시킨 후, 1.5~2 % 이소플루란을 사용하여 마취를 유지시켰다.
순환 발열 패드 (circulatingwater warming pad)를 사용하여 체온을 36±1 ℃로 유지하고, 전체 스캔 시간 동안 호흡수를 지속적으로 모니터링하였다. 조영증강전(Pre-contrast) MRI 영상을 얻은 후, 정맥 주사를 이용하여 HMS (체중 1 kg 당 Mn 3 mg)를 꼬리 정맥을 통해 전달하였으며, HMS 전달 후, 3 분, 6 분, 9 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 및 48 시간에 조영증강후(post-contrast) MRI 영상을 수집하였다.
나아가, 뇌 및 다양한 장기의 MR 이미지는 HCC 종양이 있는 마우스에서 얻었으며, Pre-contrast MR 영상을 얻은 후, 꼬리 정맥을 통해 HMS (체중 1 kg 당 Mn 3mg)를 정맥 주사 한 후, Post-contrast MR 영상을 얻었다.
모든 생체 내 (in vivo) MR 영상은 100-μs 상승 시간 (rise-time)에 최대 400 mT/m를 공급할 수 있는 20-cm 기울기 세트가 장착된 7 T/20 MR 시스템(Bruker-Biospin, Fallanden, Switzerland)에서 수행되었다. 먼저, 마우스 간의 MR 이미지는 quadrature volume coil (35 mm i.d.)이 여기 (excitation) 및 신호 수신을 위해 사용되었으며, 호흡 동조 (respiratory gating) 시스템 하에서 fast spinecho(FSE) T1-강조 MRI sequence (반복 시간 (TR)/에코 시간 (TE) = 380/7.7 ms, 실험 수 NEX = 3, 에코 트레인 길이 = 2, 평면 내 해상도 200 x 200 mm, 슬라이스 두께 1 mm 및 14 슬라이스)를 사용하여 측정하였다. HMS 주입 30 분 후, 호흡 동조(respiratory gating) 시스템 하에서 FSE T1-강조 MRI sequence (TR/TE = 380/7.7ms, NEX = 8, 에코 트레인 길이 = 2, 평면 내 해상도 100 x 100 mm, 슬라이스 두께 1 mm 및 14 슬라이스)를 사용하여 MR 이미지를 재측정하였다.
뇌 MR 이미지를 얻기 위하여 birdcage coil (72 mm i.d.)이 여기(excitation)에 사용되었으며, actively-decoupled phased array coil이 신호 수신을 위해 사용되었다. 뇌 이미징은 호흡 동조 (respiratory gating) 시스템 하에서 FSE T1-강조 MRI sequence (TR/TE = 325/7.7 ms, NEX = 12, 에코 트레인 길이 = 2, 평면 내 해상도 100 x 100 mm, 슬라이스 두께 1 mm 및 12 슬라이스)를 사용하여 측정하였다.
1-6. 면역조직화학 염색 (Anti-prohibin 항체)
종양동물 모델의 간을 적출한 후 10 % 포르말린 용액에 조직을 고정시키고, 고정된 조직을 파라핀 블록으로 제작한 후, 4 μm 두께로 조직을 절단하여 슬라이드 위에 고정시켰다. 슬라이드 위에 고정된 조직을 탈파라핀한 후, antiprohibitin(abcam 사, 미토콘드리아 마커) 및 hematoxylin (세포핵 염색)을 이용하여 조직염색을 수행하였다. 염색 후, 착색 방지 마운팅 (mounting) 배지로 마운팅하고, 마우팅된 조직 슬라이드를 Olympus DP70 디지털 형광 현미경 카메라(Olympus, Melville, NY)를 사용하여 시각화하였다.
1-7. NADH-tetrazolium reductase 염색
종양동물의 간을 적출하여 바로 조직을 Optimal Cutting Temperature 화합물(OCT compoune, Tissue Tek, Sakura, France)에 묻고, 절개 전까지 액체 질소-냉각 이소펜탄에 두었다. 냉동 샘플을 cryostat (Thermo Scientific, Kalamazoo, MI)을 사용하여 5 μm로 절단한 후, 절단된 조직 슬라이드 위에 0.4 mg/ml NADH 및 0.8 mg/ml NBT (4-nitro blue tetrazolium chloride) 용액을 떨어뜨린 후, 30~60 분간 37 ℃에서 반응시켰다. 세척 후, 착색 방지 마운팅 (mounting) 배지로 마운팅한 후 상기 실시예 1-6과 동일한 방법으로 시각화하였다.
실시예 2. 공동성 망간실리케이트 (hollow manganese silicate, HMS) 나노입자의 망간 방출 능력 및 T1 조영증강 효과 확인
상기 실시예 1-2의 방법으로 제작한 HMS에 대하여, 상기 실시예　1-3의 방법으로 HMS의 망간 방출 능력 및 T1 조영증강 효과를 확인하였다. 합성된 나노입자 및 pH 5.0의 완충액으로부터 분리된 나노입자는 투과 전자 현미경 (TEM)으로 확인하였다 (도 1a 및 1b).
그 결과, 도 1c 및 1d에 나타낸 바와 같이, 19.3 wt%의 망간을 함유하는
PEG-변형 HMS를 pH 5.0 완충액에 담그는 경우, 모든 방출 가능한 Mn2 +가 즉시 방출되고, 유리 Mn2 + 이온의 농도를 15 분 이내에 최대로 증가시켰으나, 이와 대조적으로, pH 6.0 완충액 또는 증류수에서는 Mn2 + 방출이 매우 느리게 나타났다 (도 1c). 또한, 증류수의 T1-강조영상은 HMS의 영향을 크게 받지 않았으나, pH 5.0 완충액에 HMS 첨가시 T1 신호 강도가 즉각적으로 증가하여, T1-강조영상이 HMS 첨가 후 15 분부터 밝게 나타났다.
이러한 결과는 산성 용액에서 HMS로부터의 Mn2 +유출에 의한 조영증강 효과가 두드러짐을 의미한다.
실시예 3. HMS의 HCC의 조영증강 양상 (pattern) 평가
먼저, HMS의 간 종양을 구별할 수 있는 조영제로서의 사용 가능성을 평가하기 위하여, 인간 간세포 암종 (HCC) 모델에 HMS를 주입 (3 mg/kg 체중)하고, HMS 주입 후 0.5-24 시간 동안 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, HMS 주입 후 0.5-6 시간 동안 유의미한 조영 증강을 보였으며, 그 후, 6-24 시간 동안 주변부에서 중심부로 천천히 밝아지기 시작하였으며, 괴사된 부분은 조영증강되지 않음을 확인하였다.
이러한 결과는 처음 0.5-6 시간 (쿠퍼세포 흡수 기간) 동안 쿠퍼세포에 흡수된 나노입자에서 용해된 Mn2 + 이온이 방출되고, 그 후, 6-24 시간 (담즙 배출 기간)동안 간 조직에 배출된 망간 이온이 간세포에 의해 흡수된 후, 담즙으로 배출되는 것으로 해석될 수 있다.
실시예 4. HMS에 의한 조영증강 후, T1-강조영상에서 간종양의 조직 특성
(혈관 분포, 세포 밀도, 미토콘드리아 활성도, 및 간세포성 친화도)에 따른 감별진단 효과 확인
상기 실시예 3의 결과를 바탕으로, 실시예 1-4의 방법으로 준비된 3 종의 간종양 (원발성-HCC, 전이성-SNC 및 CAC) 모델에 대해 T1-강조영상에서 조영증강 양상에 차이가 있는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, HMS 주입 후 24 시간까지 관찰하였을때, HCC (hepatocellular carcinoma) 모델의 경우, 종양의 신호강도가 초기에 비해 24 시간까지 가면서 점차 증가하는 것을 확인하였고, SNC (small intestinal neuroendocrine carcinoma) 모델의 경우, 초기부터 24시간까지 종양의 신호강도가 비교적 강하게 유지되는 것을 확인하였으며, CAC (colonic adenocarcinoma) 모델의 경우, 초기부터 24시간까지 종양의 신호강도가 약하게 유지되는 것을 확인하였다.
또한, 도 3b에서도 HMS 주입 후 24 시간까지는 비슷한 양상을 보이는데, 보다 구체적으로, HCC 모델은 1 시간 후 영상에서 종양의 주변부부터 비균질적으로 조영증강이 되다가 24 시간까지 점점 종양의 중앙부로 조영증강이 차들어가면서 균질적으로 변하는 양상을 확인하였고, SNC 모델은 1 시간 후 영상에서 종양의 주변부의 비균질적 조영증강 정도가 중앙부보다 증가되어 있으나 HCC 모델보다 조영증강되는 범위가 넓게 나타나고, 24 시간 후 영상에서 종양의 조영증강 정도가 약간 더 증가했으나 전반적으로 HCC 모델에 비해 종양의 조영증강이 초기부터 24 시간까지 비교적 강하게 유지되고 있는 양상을 확인하였으며, 마지막으로 CAC 모델은 HMS 주입 후 1 시간에서 24 시간 후 영상까지 종양의 조영증강 정도가 HCC 모델이나 SNC 모델에 비해 매우 감소된 상태로 유지되는 양상을 확인하였으며, 종양 주변부가 얇은 띠 모양의 조영증강을 보이기도 하였다. 결과적으로, 3 종의 간종양 모두는 48 시간 및 5일 후 영상에 나타난 바와 같이, 24 시간 이후부터 종양의 조영증강 정도는 감소되며, 또한 간실질 (liver parenchyma)은 1-3 시간 후 영상에서 가장 조영증강이 강하게 증가되는 것을 알 수 있었다.
상기 내용을 종합한 결과, 현재 주로 사용되는 Gd3 +-기반의 MRI 조영제는 조영제 주입 후 짧은 시간 내에 단순히 혈류 분포를 보는 역동적 검사 (dynamic study)용 조영제인데 반해, HMS를 이용한 본 발명의 조영제는 3 종의 간종양에 주입 후 24 시간에 걸쳐서 종양 내의 망간 이온의 분포에 따라 매우 다른 조영증강영상을 볼 수 있음을 확인하였다. 즉, HMS의 경우 각 종양의 혈류 분포 외에도 조직 특성에 따라 특징적인 조영증강 양상을 얻을 가능성이 높아, 기존의 MRI 조영제보다 간종양의 감별 진단에 매우 우월할 것으로 예상된다. 이런 의미에서 HMS로 조영증강된 MRI 영상이 각 종양마다 특징적인 소견을 보인다면, 질환-특이성(disease-specific) MRI 조영제라고 할 수 있다.
실시예 5. 미토콘드리아 염색에 의한 간종양의 조직 특성 (혈관 분포, 세포밀도 , 및 미토콘드리아 활성도)에 따른 감별진단 효과 확인
망간 이온은 모든 세포 내에 존재하는 미토콘드리아에 침착되기 때문에, 특정 장기나 질환에서 미토콘드리아 활성도가 높다면 HMS에서 분리된 망간 이온이 그 장기나 질환으로 이동한 후 다량 침착함으로써, T1-강조영상에서 고 신호강도 (high signal intensity)를 보이게 한다. 이에, 상기 실시예 결과를 바탕으로, HMS로 조영증강한 MRI 영상이 질환의 조직 특성을 반영할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 미토콘드리아 활성도를 측정하여 도 4에 나타내었다.
먼저, 미토콘드리아의 분포를 살펴보면, HCC 모델에서는 간실질보다 종양이 더 많이 염색이 되어 보이는 반면, CAC 모델에서는 종양보다 간실질이 더 많이 염색이 되어 보이는 것을 알 수 있었다. 이때, 더 많이 염색되는 부위가 미토콘드리아가 더 많이 존재하는 부위로, 어떤 조직에서 미토콘드리아가 더 많이 존재한다는 의미는 그 조직의 세포 내에 미토콘드리아 자체의 수가 많거나, 그 조직 내에서 세포 자체의 밀도가 높다는 것을 의미한다.
또한, 항체염색과 동시에 hematoxylin 염색 (세포핵 염색)을 수행하여, 혈관분포 및 세포 밀도를 확인해본 결과, HCC 모델에서는 간실질보다 HCC의 세포 밀도가 높게 나타났으며, CAC 모델에서도 CAC 내의 중앙부에는 괴사가 많고, 주변부의 세포 밀도는 간실질보다 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 종합한 결과, HCC 모델에서는, 간실질보다 HCC에 미토콘드리아가 더 많이 존재하고, T1-강조영상에서도 HCC가 간실질보다 고 신호강도를 나타내었으나, 반대로 CAC 모델에서는, CAC보다 간실질에 미토콘드리아가 더 많이 존재하고, T1-강조영상에서도 CAC가 간실질보다 저 신호강도를 나타내는 것을 알 수 있었다 (이때, CAC 모델에서 보이는 띠 모양의 조영증강은 이 부분에 암세포 또는 주위 정상 세포가 압박에 의해 밀집되어 세포 밀도가 높기 때문으로 추정할 수 있다.).
마지막으로, SNC 모델에서는, 간실질과 종양 모두에서 염색 정도가 미약하며 큰 차이가 없어 보이기는 하나, 그럼에도 종양이 간실질에 비해서 조영증강 정도가 매우 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 이는, SNC 모델이 미토콘드리아 염색 소견에서 보면 혈관 분포가 매우 높은 과혈관성 (hypervascular) 종양이기 때문인 것으로 추정할 수 있다.
또한, HCC 모델은 시간이 지나면서 조영증강 정도가 증가하나, SNC 모델은 비교적 일정하게 높은 조영증강을 유지하는 이유는, HCC 모델은 망간 이온이 세포 내로 흡수도 되지만 간세포성 친화도가 남아 있어 담도로 배출도 되기 때문에 망간 이온의 양이 점진적으로 증가하게 되고 (Ni, Y, et al. Tumor models and specific contrast agents for small animal imaging in oncology. Methods 48, 1930-1938 (2015)), SNC 모델은 간세포성 친화도가 없기 때문에 망간 이온이 세포 내로 흡수만 되고 담도로 배출되지 않아 초기부터 비슷하게 다량의 망간 이온이 축적되기 때문이다.
따라서, 이와 같이 상기 3 종의 간종양은 각 간종양의 혈관 분포, 세포 밀도, 미토콘드리아 활성도, 및 간세포성 친화도 등의 다양한 조직특이성을 갖는바, 이에 따라 T1-강조영상에서 적정 시간에 특징적인 조영증강 양상으로 나타나게 된다.
실시예 6. FSE T1-강조영상을 통한 간종양 별 혈관 분포 확인
상기 실시예 결과를 바탕으로, HMS 주입 후 3 분에서 15 분까지 얻은 Fast spin echo (FSE) T1-강조영상을 통하여 3 종의 간종양 타입에 따른 조영증강 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 비교적 각 종양의 혈관 분포를 반영하는 조영증강 양상을 보이는 것을 확인할 수 있는데, 이러한 결과는, 이 시기 (3~15 분)에 HMS는 주로 쿠퍼세포에 흡수되기 때문에, 망간 이온을 방출해서 간종양을 조영증강시키는 시기보다 빨리 조영증강 양상이 나타나며, 따라서 이 시기에는 미토콘드리아 활성도에 의한 조영증강도 있지만, 혈관 분포를 반영하는 조영증강이 많이 반영되었기 때문인 것으로 판단된다.
보다 구체적으로, 이 시기의 HCC 모델과 SNC 모델에서 종양의 조영증강 양상은 1 시간 후 영상에 비해서 조영증강 부위가 주변부에 더 분포하고 있음을 알 수 있으나, CAC 모델은 약한 띠 모양의 조영증강만 보이고 종양 자체는 조영증강이 거의 되지 않음을 알 수 있다.
상기 결과를 종합한 결과, 3종의 간종양의 조영증강 양상에는 혈관 분포도 기여함을 알 수 있는바, 이를 간종양의 감별진단에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 7. NADH - tetrazolium reductase 염색법에 의한 간동맥 결찰 후 HCC의 괴사 (세포사) 정도 평가
간암 치료 방법 중 경도자동맥색전술 (TACE)은 환자의 간동맥을 막음으로써 종양으로 가는 혈류를 차단해서 HCC를 괴사시키는 치료 방법이다. 이에, HCC 모델에서 마우스의 간동맥을 결찰한 후, 시간에 따라 종양의 괴사 (세포사) 정도와 HMS로 조영증강한 T1-강조영상의 신호강도 간에 상관관계가 있는지 여부를 확인하기 위하여, 살아있는 세포내 미토콘드리아의 NADH-dehydrogenase의 활성을 측정할 수 있는 NADH-tetrazolium reductase 염색법을 사용하였다 (Berardi et al. Neurol Res. 2008;30(2):160-9).
보다 구체적으로, HCC 모델 마우스의 복벽을 절개하여 좌간동맥 (left hepatic artery)를 결찰하고 다시 복벽을 봉합한 후 2 시간 및 24 시간이 경과한 후에 HMS를 주입하고 1 시간 및 4 시간 후에 MRI 영상을 얻었다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 먼저 2 시간 결찰 후 HMS를 주입하고 1시간 후에 얻은 T1-강조영상에서 종양은 주변부에 조영증강이 되는 것을 확인하였고, 이때 종양이 대조군 그룹보다는 약하지만 전반적으로 염색이 되기 때문에 생존한 암세포가 있음을 알 수 있었다. 따라서, 염색 결과 및 MRI 결과를 연관시키면, 간동맥 결찰 시, 간문맥을 통해 종양에 혈류가 공급되기 때문에 종양의 주변부만 혈류 공급이 되고, 혈류가 공급된 부위의 생존한 암세포에 NADH 염색이 되고, 같은 부위가 T1-강조영상에서 조영증강이 됨을 의미한다.
다음으로, 24 시간 결찰 후에 HMS를 주입하고 1 시간 및 4 시간 후에 얻은 T1-강조영상에서는 종양은 전혀 조영증강이 되지 않고 NADH 염색에서도 염색되는 암세포가 없으므로 종양이 완전히 괴사되었음을 알 수 있었다.
상기 결과를 종합한 결과, HMS의 미토콘드리아 활성도를 이용하면 HCC의 암세포 괴사 (세포사) 여부를 평가할 수 있고, 이를 이용하여 TACE 뿐만 아니라 항암 치료 후에도 세포사 여부를 평가하여 치료 효과를 판정할 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
실시예 8. MnO@SiO 2 NPs MRI 조영제 준비 (Preparation of MnO@SiO 2 NPs MRI contrast agents)
8-1. MnO@10nm-SiO 2 (MnO-SiO 2 -12hr) 제조 및 Mn 2+ 방출시간 측정
(1) MnO@10nm-SiO2 (MnO-SiO2-12hr)나노입자 제조
Mn2 + 이온 공급원으로 MnO NPs를 사용하였다. 이 입자는 중성 pH 조건(~pH 7)에서는 용해되지 않고, 낮은 pH 조건(pH 4~5)에서 용해된다.
우선, 입자에서 Mn2 +의 방출 속도를 감소시키기 위해, MnO NPs(15nm)를 합성하였으며, 합성된 MnO NPs(15nm)를 역-미셀 에멀젼 탬플릿을 사용해 실리카 껍질로 덮었다(도 7).
구체적으로 15nm의 MnO 나노파티클(NPs)을 합성하기 위해, 1.24g의 Mn-oleate 착물을 10g의 1-octadecene 용매에 분산시킨 후, 산소와 수분을 차단하는 조건에서 용액을 교반하면서 온도를 300℃까지 5℃?/분의 속도로 올렸다. 다음으로 용액을 300℃에서 1시간 가열하고 상온까지 냉각시킨 후 원심분리를 통해 입자를 분리하였다. 분리한 입자를 헥산과 아세톤으로 세척한 후, 합성된 15 nm 크기의 MnO 나노입자를 사이클로헥산에 분산하여 보관하였다.
다음으로 MnO@SiO2 나노입자는 MnO 나노입자를 역-미셀 에멀젼 템플릿을 사용하여 실리카 껍질로 둘러싸서 얻었다. 구체적으로 40mL의 사이클로헥산에 20mg의 MnO 나노입자를 분산시킨 후, 계면활성제인 IGEPAL CO-520 3.2mL를 추가하여 30분간 교반하였다. 이후, 0.3mL의 NH4OH 용액과 0.8mL의 TEOS (Tetraethyl orthosilicate)를 순서대로 30분 간격으로 첨가하였다. 용액을 하루 동안 교반한 후, 메탄올 5mL를 가해 수용성 층(aqueous layer)과 유기성 층(organic layer)을 분리하였다. 이 중 수용성 층을 취해 원심분리로 입자를 분리하고 에탄올과 물로 세척하여 10nm 두께의 실리카로 둘러싸인 MnO@10nm-SiO2 입자를 얻었다.
(2) Mn2+ 방출시간 측정
실리카 껍질은 낮은 pH 환경에서 Mn2 +의 즉시 방출을 보호하고 중성 pH 조건에서 입자의 분산도를 향상시킨다.
MnO@10nm-SiO2로부터 Mn2 + 이온이 방출되는 속도를 pH 5, 또는 pH 6의 citrate buffer나 pH 7의 증류수 32 mL에 분산된 16 mg의 MnO@10nm-SiO2 현탁액을 사용하여 실온에서 정량화하였다. 각 현탁액에서 4 mL의 시료를 0분, 15분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간에 채취하였으며, 15,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 현탁액 속 나노입자(NPs)를 분리한 후, 상층액을 0.2 um (micro-meter) 공극 크기의 주사기 필터로 여과하였다. 여과한 상층액 속 Mn2 + 이온의 농도를 ICP-AES 분석을 통해 측정한 후, 채취한 시료 속 망간의 질량 대비 상층액 속 Mn2+ 이온의 질량을 이용하여 Mn2+ 이온의 방출 속도를 계산하였다.
도 8b에 나타낸 바와 같이, 10 nm 두께 실리카 껍질을 가지는 나노입자는 pH 5의 Citrate buffer에서 Mn2 +를 천천히 방출시키며, MnO NPs로부터 Mn2 + 의 80 wt%를 방출하는데 12시간이 걸렸다. 반면에, pH 6.0 Citrate buffer 또는 증류수에서는 오직 10 wt% Mn2 + 만이 방출되었다. 이 후, 10nm 실리카 껍질 두께를 갖는 MnO@SiO2 NPs를 MnO@10nm-SiO2 또는 MnO-SiO2-12hr로 표시하였다(도 8b).
8-2. MnO@8nm-pSiO 2 (MnO-SiO 2 -2hr) 제조 및 Mn 2+ 방출시간 측정
(1) MnO@8nm-SiO2 (MnO-SiO2-2hr)나노입자 제조
다음으로 낮은 pH 조건에서 MnO@10nm-SiO2보다 빠르게 Mn2 + 이온을 방출하는 입자를 만들기 위해 실리카 쉘의 다공성과 두께를 조절하였다.
실리카 껍질이 8nm인 나노입자의 합성을 위해 실시예 8-1의 제조방법에서 0.8mL TEOS를 0.72mL의 TEOS와 0.08mL의 C18TMS (n-octadecyl trimethoxy silane)로 바꿔주었다.
다음으로, 실리카 껍질의 다공성을 증가시키기 위해, 유기실란제(C18TMS, n-octadecyltrimethoxy silane)을 porogen으로 사용하였다. Porogen-혼합 실란제(90 vol% TEOS+10 vol% C18TMS)는 실리카 껍질에 더 많은 기공을 생성하여 코어 MnO에 대한 용액의 침투를 가능하게 한다.
(2) Mn2+ 방출시간 측정
다공성의 증가 또는 실리카 껍질 두께의 감소는 산성 용액에 MnO 나노입자를 더 쉽게 노출되게 하여, Mn2+의 방출 속도를 증가시킨다.
도 8c에 나타낸 바와 같이, Porogen-혼합 실란제에 의해 캡슐화된 MnO@SiO2 NPs는 pH 5.0 시트레이트 버퍼 용액에서 2시간 내에 80wt%의 Mn2 +를 방출시켰다. 이후 상기 입자를 MnO@8nm-pSiO2 또는 Mn-SiO2-2hr로 표시하였다.
MnO@10nm-SiO2와 MnO@8nm-pSiO2 NP는 유사한 실리카 껍질 두께를 가지고 있지만, 다공성의 차로 인해 pH 5.0 구연산염 완충 용액에서의 Mn2 + 방출 속도가 매우 상이하게 나타났다(도 8c).
실시예 8-3. MnO@5nm-SiO 2 (MnO-SiO 2 -0.5hr) 제조
(1) MnO@5nm-SiO2 (MnO-SiO2-0.5hr)나노입자 제조
실리카 껍질의 두께를 감소시키기 위해, 상기 실시예 8-1의 제조방법에서 MnO 핵 위로 SiO2가 코팅되는 과정 동안 MnO@10nm-SiO2에서보다 실리카 전구체(TEOS)의 양의 절반(0.4mL)만을 추가하여, 나노입자의 실리카 껍질 두께를 5nm로 만들었다.
(2) Mn2+ 방출시간 측정
도 8d에 나타난 바와 같이, MnO@5nm-SiO2는 pH 5.0에서 30분 내에 Mn2 +의 80wt%를 방출하였다. 이후, 상기 입자를 MnO@5nm-SiO2(Mn-SiO2-0.5hr)로 명명하였다.
실시예 8-2의 MnO@8nm-pSiO2와 MnO@5nm-SiO2는 pH6.0 시트레이트 버퍼 용액 또는 증류수에서 오직 10wt%의 Mn2 +만을 방출하였다(도 8c, 8d). 모든 설계된 나노입자에 대하여, 메톡시 말단 캡핑된 PEG를 수성 조건(aqueous condition)에서 유익한 분산을 위해 사용하였다.
실시예 8-4. 간의 쿠퍼세포와 유사한 pH 조건에서 나노입자 특성에 따른 방출속도 차이 비교
상기 실시예 8-1 내지 8-3에서 측정한 바와 같이, pH 5 citrate buffer 조건에서 Mn2 + 이온의 방출 속도를 모아 입자별로 비교하였으며, 그 결과를 도 8e에 나타냈다.
나노입자를 체내에 주사하면 (in-vivo condition) 간조직 내 쿠퍼세포(Kupffer cell)에 흡수되며, 쿠퍼세포 안쪽의 pH 값은 약 5 정도로 알려져 있다. 즉, 본 실험에서는 쿠퍼 세포와 유사한 pH 조건의 생체 외 (in-vitro) pH 5 buffer 에서 입자별 방출속도를 비교함으로써 입자가 쿠퍼세포에 흡수되었을 때 (in-vivo) 입자의 방출속도를 예측하였다.
실시예 8-5. 방출된 Mn 2 + 이온의 T1-강조 자기공명영상(T1-weighted-MRI)에서 조영효과 확인
나노입자에서 방출된 Mn2 + 이온이 T1-강조 자기공명영상(T1-weighted-MRI)에서 어떤 조영효과를 나타내는지를 확인하기 위해서 앞서 실시예 8-1에 서술한, pH 5 citrate buffer에서 입자의 Mn2 + 이온 방출속도를 확인하기 위해 기록된 시간마다 채취했던 상층액의 T1-강조영상을 촬영하였으며, 그 결과를 도 9a에 나타냈다.
도 9a에 따르면, MnO-SiO2-0.5h 입자는 Mn2 + 입자가 0.5 시간만에 대부분 방출되기 때문에 0.5h 내지 12h 동안 영상의 조영 세기가 거의 비슷하게 나타났으며, MnO-SiO2-12h 입자의 경우 Mn2 + 방출속도가 상대적으로 느려 시간이 증가함에 따라 영상의 조영 세기가 증가함을 확인할 수 있었다.
상기 촬영한 영상의 조영 세기를 수치화(R1, 단위는 /second)하여 도 9b의 그래프에 나타냈다. 도 9b가 도 8e에서 나타난 입자별 Mn2 + 이온의 방출속도 그래프와 거의 일치하는 것으로 보아 방출된 Mn2 + 이온이 T1-강조영상의 조영효과를 증가시키는 것을 유추할 수 있었다.
다음으로, Mn 농도와 영상의 조영 세기(R1)의 관계를 그래프로 도 9c에 나타냈다. 이 그래프의 기울기를 r1으로 표현하며, 물질마다 고유한 값을 가진다. 세 입자가 7.5~8.2 범위 안에서 비슷한 기울기를 가지는 것을 확인할 수 있었고, 순수한 Mn2+ 이온(MnCl2 수용액)이 약 7.4의 r1 값을 가지는 것과 비교해 Mn2 + 이온에 의한 조영효과의 증가를 다시 확인할 수 있었다.
실시예 9. In-vivo MRI data
9-1. HCC 동물모델 구축
설계된 MnO@SiO2 조영제의 서로다른 Mn2 + 방출속도에서 MRI가 어떻게 변하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 인간 간세포 암종(HCC)를 마우스에 삽입하여 생체 내 암모델을 구축하였다. 구체적으로 HCC 동물모델 제조방법은 상기 실시예 1-4의 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
9-2. MRI 영상 측정 방법
이후, HCC MRI 영상은 나노입자로 MnO@5nm-SiO 2 (Mn- SiO 2 - 0.5hr ) 를 사용하고, 나노입자 주입 후, 15분, 30분, 45분. 1시간, 4시간, 8시간, 24시간에 조영증강 후 MRI 영상을 수집한 것만 차이가 날 뿐, 실시예 1-5과 동일한 방법으로 수집하였다.
9-3. HCC 모델에서 MnO@5nm-SiO 2 를 주입 후 MRI 영상 변화
상기 실시예 9-2의 방법에 따라, HCC 모델에서 MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5h) 를 주입 후 획득한 MRI 영상을 도 10a에 나타냈다.
(1) 간 정상조직의 조영변화
도 10a에 나타난 바와 같이, HCC 모델에 MnO@5nm-SiO2를 주입하면 간 실질조직(liver parenchyma)의 경우, 일련의 T1-강조 MRI 조영 증강이 30분에 일어나기 시작해 1시간 후 최대가 된다. 1시간 후, 간 실질조직의 조영 증강은 점차적으로 감소하고 8시간 이후 주입 전 레벨로 완전히 회복되었다.
즉, 이는 혈관을 통해 간에 도달한 MnO@5nm-SiO2 NP이 쿠퍼세포에 endocytosed되고 30분 후 대부분의 Mn2 +가 방출되기에 조영증강이 일어나기 시작하고, 이 후 방출된 Mn2 +이온은 미토콘드리아 활성을 통해 간세포에 흡수되며, 1시간 후, 쿠퍼세포에서 Mn2+는 더 이상 방출되지 않고, 간세포에 흡수된 이온이 간담도(hepatobiliary) 경로를 통해 담즙관(biliary canaliculi)으로 배출되기 때문에 조영 증강이 감소하는 것이다.
(2) HCC 종양조직의 조영변화
HCC 종양조직은 1시간 후에 말초 부위로부터 밝아지기 시작하고 조영 증강은 점진적으로 HCC 조직의 중심 지역으로 옮겨간다(도 10). 24시간 후에, 괴사된 부분은 조영이 변하지 않고 어둡게 남아있는 반면, 전체 HCC 조직의 조영은 증가한다.
HCC 종양조직은 쿠퍼 세포가 결핍되어 있어, 나노입자를 직접적으로 endocytose 시키지는 않는다. 그러나 HCC 조직의 간세포는 미토콘드리아 활성을 가지고 있기에, 정상 조직을 둘러싼 쿠퍼 세포로부터 배출된 Mn2 +를 흡수할 수 있다. 따라서, HCC 종양조직의 조영 증강은 정상 조직의 쿠퍼세포가 Mn2 + 를 최대로 배출하는 시점인 1시간 정도 이후부터 종양의 말초에서 시작해 점차 밝아지기 시작하며, 정상 조직의 주변 실질조직으로부터 확산되어 나온 Mn2 +가 내부로 이동함에 따라 중심부분까지 밝아진다.
(3) MnO@5nm-SiO2 조영제 사용시, 간 정상조직과 HCC 종양 조직의 구별 기준
따라서, MnO@5nm-SiO2 정맥 주입 후, 30분 내지 24시간 동안에 얻은 MRI 이미지의 시간 흐름에 따른 조영증강 명암 이미지의 밝기 변화 패턴에 따라 간 정상조직과 HCC 종양 조직을 구분할 수 있다.
정상조직은 30분 내지 1시간 동안 높은 조영증강을 나타내고, 1시간 내지 24시간 동안 낮은 조영증강을 나타내며, HCC 종양조직은 30분 내지 4시간 동안은 어둡거나(black) 주변만 조영증강 되며, 4시간 내지 24시간 동안 높은 조영증강을 나타낸다.
9-4. HCC 모델에서 MnO@8nm-pSiO 2 를 주입 후 MRI 영상 변화
상기 실시예 9-2의 방법에 따라, HCC 모델에서 MnO@8nm-pSiO2를 주입 후 획득한 MRI 영상을 도 10b에 나타냈다.
(1) 간 실질조직의 조영변화
HCC 모델에 MnO@8nm-pSiO2를 정맥투여하여 얻어진 MRI 이미지는 상기 실시예 9-3의 MnO@5nm-SiO2(도 10a)로부터 얻어진 이미지와 크게 다르지 않았다.
정상 간 실질조직에서 조영은 MnO@8nm-pSiO2 정맥 투여 30분 후에 증가하기 시작하여, 4시간 이후에 최대치에 도달했다. 그러나 MnO@5nm-SiO2와 달리, 8시간 후에 약간의 조영 증강이 남아있었다.
MnO@5nm-SiO2와 유사하게 MnO@8nm-pSiO2 또한, 정상 조직의 조영이 점진적으로 증가한다. 이는 정상 조직에서 Mn2 + 방출 속도보다 정상조직에 endocytosed 된 나노파티클에서의 Mn2 + 방출 속도가 빠르기 때문이다. 반면에, Mn2 +는 간세포(hepatocyte)에서 천천히 축적되고 나중에는 MnO@5nm-SiO2보다 훨씬 많이 남아있게 된다. 따라서, 조양의 최대 증강은 느리게 발생하고 사전 주입 레벨까지 천천히 감소한다.
(2) HCC 종양조직의 조영변화
HCC 종양조직의 경우, 나노입자 투입 후, 1시간까지는 조영이 증가하지 않았지만, 4시간 이후부터 종양 가장자리(periphery) 부분에서부터 조영이 증가되기 시작하고, 24시간 까지 종양의 내부로 서서히 조영이 증가한다.
HCC 종양조직의 말초 영역에서 조영 증강 시간은 정상 조직에 위치한 쿠퍼 세포 내에 endocytosed된 MnO NPs로부터 방출된 Mn2 +의 방출속도에 의해 결정된다. MnO@8nm-pSiO2는 MnO@5nm-SiO2보다 상대적으로 느린 방출 속도로 Mn2 +를 방출하기에 HCC 종양조직의 주변부분의 조영 증강은 MnO@5nm-SiO2보다 느리게 나타난다.
(3) MnO@8nm-pSiO2 조영제 사용시, 간 정상조직과 HCC 종양 조직의 구별 기준
따라서, MnO@8nm-pSiO2 정맥 주입 후, 45분 내지 24시간 동안에 얻은 MRI 이미지의 시간 흐름에 따른 조영증강 명암 이미지의 밝기 변화 패턴에 따라 간 정상조직과 HCC 종양 조직을 구분할 수 있다.
정상조직은 45분 내지 4시간 동안 높은 조영증강을 나타내고, 4시간 내지 24시간 동안 서서히 조영증강이 감소하며, HCC 종양조직은 45분 내지 4시간 동안은 어둡게(black) 나타나나, 4시간 내지 24시간 동안 높은 바깥쪽에서 종양 내부로 점점 조영증강이 확산한다.
9-5. HCC 모델에서 MnO@10nm-SiO 2 를 주입 후 MRI 영상 변화
상기 실시예 9-2의 방법에 따라, HCC 모델에서 MnO@10nm-SiO2를 주입 후 획득한 MRI 영상을 도 10c에 나타냈다.
(1) 간 실질조직의 조영변화
도 10c에 나타난 바와 같이, MnO@8nm-pSiO2와 MnO@5nm-SiO2의 이전 두 개의 조영제와 달리, MnO@10nm-SiO2에 의해 조절된 HCC 모델 간 실질조직의 일련이 T1-증강 MRI는 45분 후에 조영 증강이 나타나기 시작했으며, 8시간 까지는 큰 변화 없이 밝기를 동등한 정도로 유지했다(도 10c). 24시간 후에도 MnO@10nm-SiO2에 의해 매개되는 조영 증강은 주입 이전 수준으로 돌아가지 않았다.
(2) HCC 종양조직의 조영변화
HCC 조직은 4시간 까지 전반적으로 검게 보였으며, 얇은 주변 조영 증강이 8시간 이후부터 나타났다. 그러나, 24시간 후에도 HCC 조직의 중심 부분의 조영 증강은 확장되지 않았다.
MnO@10nm-SiO2는 이 전 두개의 조영제와 비교해, 산성 환경에서 Mn2 +의 방출 속도가 좀 더 느려지기 때문에, 비록 쿠퍼세포가 endocytosed했더라도 느린 조영 증강을 보여준다. HCC에 의한 Mn2 +의 흡수 속도 및 쿠퍼세포로부터의 방출 속도가 평형 상태에 있기 때문에, 정상 조직에서 MnO@10nm-SiO2에 의해 매개되는 조영 증강은 일정하게 유지된다. MnO@10nm-SiO2의 주변부 조영 증강은 또한 3 개의 NP 중에서 가장 느리게 나타났다.
(3) MnO@10nm-SiO2 조영제 사용시, 간 정상조직과 HCC 종양 조직의 구별 기준
따라서, MnO@10nm-SiO2 정맥 주입 후, 45분 내지 24시간 동안에 얻은 MRI 이미지의 시간 흐름에 따른 조영증강 명암 이미지의 밝기 변화 패턴에 따라 간 정상조직과 HCC 종양 조직을 구분할 수 있다.
정상조직은 45분 내지 8시간 동안 높은 조영증강을 나타내고, 8시간 내지 24시간 동안 서서히 조영증강이 감소하며, HCC 종양조직은 45분 내지 8시간 동안은 어둡게(black) 나타나거나 주변만 조영증강 되고, 8시간 내지 24시간 동안 전반적인 종양부분에서 높은 조영증강을 나타낸다.
실시예 10. HCC 모델에 조영제 투입 후 장기별 조영증강 확인
원발성 간암모델 (HCC model)에 앞선 실시예에서 합성한 MnO@5nm-SiO2, MnO@8nm-pSiO2, MnO@10nm-SiO2 조영제를 실시예 1-5의 방법으로 각각 투여 후 시간별로 해당 장기의 영상을 획득하였으며, 각 장기의 MRI 영상에서 신호를 측정해 (paravision software version 5.0,Bruker-Biospin). 장기별 조영증강효과 및 배출을 시간별로 측정하였으며, 그 결과를 도 11a 내지 도 11e에 나타냈다.
정상간의 경우, MnO@5nm-SiO2(Mn-SiO2-0.5hr) 투여 후 30분부터 현저한 조영효과를 나타냈으며, 45분째 가장 강한 신호가 보이고 1시간 이후 서서히 감소되었다. MnO@8nm-pSiO2(Mn-SiO2-2hr) 투여 후 45분부터 조영효과가 보이며, 1시간~4시간까지 가장 강신신호를 유지하고 이후 감소되었으며, MnO@10nm-SiO2(Mn-SiO2-12h) 투여 45분 후부터 조영효과가 나타났으며, 8시간째까지 조영효과가 유지되다 24시간 이후에는 감소되었다(도 11a).
종양부위의 경우, MnO@5nm-SiO2(Mn-SiO2-0.5hr) 투여 1시간 이후 정상부위의 조영효과가 감소되며, 이후 종양 부위의 조영효과가 증대되었고, 종양부위 조영효과는 24시간까지 유지되었다. MnO@8nm-pSiO2(Mn-SiO2-2hr) 투여 4 시간 이후 정상부위 조영효과가 감소되며, 이후 종양부위 조영효과가 증가되었다(도 11b). MnO@10nm-SiO2(Mn-SiO2-12hr)은 투여 8시간 이후 정상부위 조영효과가 감소되며 이후 종양부위의 조영효과가 24시간까지 유지되었다(도 11b).
신장(Kidney)의 경우, 각각의 조영제들의 투여후 공통적으로 4시간째 이후 신장에서의 조영효과가 증대된 후 감소되었으며, 이로부터 조영제 투여 4시간 이후 renal pathway 를 통해 Mn2+ 가 방출됨을 알 수 있다(도 11c).
비장(Spleen)에서는 특별한 조영효과가 관찰되지 않았다(도 11d).
장(Intestin)에서는 MnO@5nm-SiO2(Mn-SiO2-0.5hr) 투여 45분 까지 조영효과가 증대된 이후 조영효과가 감소되었으며, MnO@8nm-pSiO2(Mn-SiO2-2hr)의 경우, 투여 4 시간까지 조영효과가 증대된 이후 감소되었고, MnO@10nm-SiO2(Mn-SiO2-12hr)의 경우, 투여 1시간까지 조영효과가 증대되고 이후 조영효과가 감소하였다(도 11e).
실시예 11. Mn 2 + 방출 속도 조절 및 간암 종류에 따른 조영을 최적화 할 수 있는 나노입자 선택
본 발명자들은 Mn2 + 방출 속도를 조절하기 위해 실시예 8에서 제조한 세 종류의 MnO2@SiO2 NPs를 사용하여 다양한 종양 모델(HCC, SNC, CAC)의 병리학적 특성과 혈관 신생을 판별하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 생체 내 MRI 결과를 얻었다.
11-1. 동물모델 구축
동소 이종이식 마우스의 암 모델을 설정하기 위해, 간세포암종(HCC)에 추가적으로 SNC(small intestinal neuroendocrine carcinoma, 소장 신경내분비암종) 및 CAC(colonic adenocarcinoma, 결장선암종)를 미토콘드리아가 충분하지 않은 세포와 미토콘드리아가 결핍된 세포의 대표적인 비간세포 전이암 모델로 실험에 사용하였다.
구체적으로 SNC(STC-1) 및 CAC(HT29) 동물모델은 상기 실시예 1-4의 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
11-2. CAC(HT29) 모델에서 나노입자 주입 후 MRI 영상 변화
상기 실시예 9-2의 방법에 따라, CAC모델에서 MnO@5nm-SiO2, MnO@8nm-pSiO2, 및 MnO@10nm-SiO2를 각각 별개로 주입 후 24시간 동안 획득한 MRI 영상을 촬영하였으며, 시간 변화에 따른 MRI 영상 이미지를 도 12에 나타냈다.
(1) MnO@5nm-SiO2를 주입
MnO@5nm-SiO2를 주입한 후 획득한 영상이미지를 도 12a에 나타냈다. 도 12a에 따르면, 정상 조직은 15분 내지 45분간 조영증강을 나타냈고, 1시간 내지 24시간 동안은 조영증강이 점차 감소하였고 조영제 주입 전 수준으로 회복 되었다.
반면, 종양 조직의 경우 15분에서 24시간이 경과하는 동안 종양의 가장자리(rim) 부분에서만 조영증강이 나타났다.
상기 조영제를 사용해 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화패턴으로 정상조직과 CAC 종양조직을 구별할 수 있으며, 정상조직은 15분에서 45분 동안 높은 조영증강을 나타냈고 1시간 이후부터 24시간 까지 점차 조영증강이 감소하고, 종양조직은 15분 내지 24시간 동안 검거나 주변부만 밝게 유지된다.
(2) MnO@p8nm-pSiO2를 주입
MnO@p8nm-pSiO2를 주입한 후 획득한 영상이미지를 도 12b에 나타냈다. 도 12b에 따르면, 정상 조직은 30분 내지 4시간 동안 조영증강을 나타냈고, 4시간 이후 조영증강이 점차 감소하였고 24시간 이후에는 조영제 주입 전 수준으로 회복 되었다.
반면, 종양 조직의 경우 45분부터 종양의 가장자리부터 조영증강되기 시작했으며. 종양의 내부가 두개의 층으로 이루어지며 안쪽은 조영증강이 전혀 없어 검게 나타났으며, 검은 부분으로 직접적으로 둘러싼 바깥 부분은 HCC처럼 안쪽으로 일부 조영증강이 확산되어 나타났다.
상기 조영제를 사용해 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화패턴으로 정상조직과 CAC 종양조직을 구별할 수 있으며, 정상조직은 30분에서 4시간 동안 높은 조영증강을 나타냈고 4시간 이후부터 24시간 까지 점차 조영증강이 감소하고, 종양조직은 30분 내지 24시간 동안 검거나 주변부만 밝게 유지된다.
(3) MnO@10nm-SiO2 를 주입
MnO@10nm-SiO2 를 주입한 후 획득한 영상이미지를 도 12c에 나타냈다. 도 12c에 따르면, 정상 조직은 15분 내지 4시간 동안 조영증강을 나타냈고, 8시간 내지 24시간 동안은 조영증강이 점차 감소하였고 조영제 주입 전 수준으로 회복 되었다.
반면, 종양 조직의 경우 1시간 이후부터 24시간 까지 계속해서 종양의 가장자리만 조영증강되었다.
상기 조영제를 사용해 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화패턴으로 정상조직과 CAC 종양조직을 구별할 수 있으며, 정상조직은 15분에서 4시간 동안 높은 조영증강을 나타냈고 8시간 이후부터 24시간 까지 조영증강이 감소되었고, 종양조직은 15분 내지 4시간 동안 검게 나타나거나 주변부만 밝게 유지되었고, 8시간 내지 24시간 동안 종양의 경계 부분만 조영증강되었다.
11-3. SNC(STC-1) 모델에서 나노입자 주입 후 MRI 영상 변화
상기 실시예 9-2의 방법에 따라, SNC 모델에서 MnO@5nm-SiO2, MnO@8nm-pSiO2, 및 MnO@10nm-SiO2를 각각 별개로 주입 후 24시간 동안 획득한 MRI 영상을 촬영하였으며, 시간 변화에 따른 MRI 영상 이미지를 도 13에 나타냈다.
(1) MnO@5nm-SiO2를 주입
MnO@5nm-SiO2를 주입한 후 획득한 영상이미지를 도 13a에 나타냈다. 도 13a에 따르면, 정상 조직은 15분 내지 4시간 동안 조영증강을 나타냈고, 4시간 내지 24시간 동안은 조영증강이 점차 감소하였고 조영제 주입 전 수준으로 회복 되었다.
반면, 종양 조직의 경우 30분에서 1시간 동안 정상조직과 비슷하게 나타나나, 4시간 내지 24시간 동안 정상조직과 다르게 계속해서 조영증강이 나타났다.
상기 조영제를 사용해 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화패턴으로 정상조직과 SNC 종양조직을 구별할 수 있으며, 15분 내지 1시간 동안은 두 조직이 구별이 잘 되지 않으나, 종양조직은 4시간 이후부터 24시간 까지 점차 조영증강이 일어나 밝아진다.
(2) MnO@8nm-pSiO2를 주입
MnO@8nm-pSiO2를 주입한 후 획득한 영상이미지를 도 13b에 나타냈다. 도 13b에 따르면, 정상 조직은 15분 내지 1시간 동안 조영증강을 나타났으나 그 강도가 높지 않았으며, 4시간 내지 24시간 동안은 조영증강이 눈에 띄게 관찰되지 않았다.
반면, 종양 조직의 경우 조영제 주입 후 15분부터 1시간 까지는 낮은 강도로 어둡게 보이지만 정상조직보다 밝게 나타나며, 4시간 내지 24시간 동안 높은 강도로 계속해서 밝게 나타난다.
상기 조영제를 사용해 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화패턴으로 정상조직과 SNC 종양조직을 구별할 수 있으며, 15분에서 1시간 동안은 전체적으로 낮은 조영증강을 나타내고 정상조직과 종양조직을 명확히 구분하기 어려우나, 4시간 이후부터 24시간까지는 정상조직은 낮은 조영증강을 나타내고, 종양 조직은 높은 조영증강을 나타낸다.
(3) MnO@10nm-SiO2 를 주입
MnO@10nm-SiO2 를 주입한 후 획득한 영상이미지를 도 13c에 나타냈다. 도 13c에 따르면, 정상 조직은 30분 내지 1시간 동안 강도가 높지 않은 조영증강이 나타났고, 4시간 내지 24시간 동안은 조영증강이 확인되지 않았다.
반면, 종양 조직의 경우 15분 내지 1시간 동안 낮은 조영증강을 보이지만, 정상조직보다 강하게 나타나며, 4시간부터 24시간 높은 강도로 계속해서 조영증강된다.
상기 조영제를 사용해 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 변화패턴으로 정상조직과 SNC 종양조직을 구별할 수 있었으며, 15분에서 1시간 동안은 두 조직을 구별하기 쉽지 않으나 4시간 이후 내지 24시간 동안 정상조직은 낮은 조영증강을 나타내고, 종양은 높은 조영증강을 나타내었다.
11-4. HCC, CAC, SNC 종양 검진을 위한 최적 나노입자 확인
정상 조직영역에서만 SNC및 CAC 모델의 조영 증강 패턴이 HCC 모델과 유사하게 나타났다. Mn2 +의 방출속도와 관계없이 조영 증강은 MnO@SiO2 나노입자가 정상 조직내에서 쿠퍼세포로 흡수될 때부터 시작되었다.
HCC는 과도한 혈관을 가지고 있고, 높은 미토콘드리아 활성 및 특징적인 배출 경로를 가진다. HCC의 높은 미토콘드리아 활성 때문에, 정상 세포 주변부에서 쿠퍼 세포로부터 방출된 Mn2 +의 흡수가 효과적으로 일어난다. 또한, HCC 경로에 의한 배설이 HCC 내부에서도 일어나기에 주변부 조영 증강은 SNC의 것보다 느림에도 불구하고 관찰된다.
결과적으로, MnO@10nm-SiO2는 HCC 진단 시스템에서 가장 효과적으로 최적화된 MRI 조영제이다. MnO@5nm-SiO2를 사용할 경우, 정상 조직의 빠른 조영 증강 때문에, HCC의 MRI는 45분에서 1시간 사이에 어둡게 되어 특성 분석이 가능하다. 반면에, 24시간 후에 정상 조직의 MRI는 회복되는 반면 HCC의 MRI내의 조영은 강화되고, 이는 간암 진단을 다시 가능하게 한다.
SNC는 혈관이 많고, 높은 미토콘드리아 활성을 가지고 있지만 배출 경로가 없다. 높은 미토콘드리아 활성 때문에, 주변 정상 조직에서 쿠퍼 세포에 의해 제공된 Mn2 + 를 효과적으로 흡수하나, 배설 경로가 없기 때문에 Mn2 +가 연속적으로 축적된다. 이로 인해, SNC의 경우 HCC와 비교해 전반적인 조영 증강이 빠르게 일어난다. 설계된 MnO@SiO2 나노입자는 쿠퍼 세포에 의해 endocytosed되고, SNC 암과 정상 조직은 거의 동시에 조영 증강을 나타낸다. 따라서, 빠른 회복 속도를 갖는 MnO@5nm-SiO2 또는 MnO@8nm-pSiO2는 상기 SNC 종양 모델 시스템에서 가장 효과적인 조영제이다.
CAC는 저혈관성이면서 미토콘드리아 배출 경로를 가지고 있지 않다. 미토콘드리아의 부족 때문에, 전체 측정 기간 동안 Mn2 +의 흡수는 효과적이지 않다. 이는 오직 얇은 층의 주변부 조영 증강을 나타낸다. MnO@5nm-SiO2는 정상 조직의 조영 증강에 있어 최대 포인트를 나타내고 따라서, CAC 부분과 정상 조직 사이의 두드러진 대조가 나타난다. 반면, MnO@10nm-SiO2는 정상조직이 NP 주입 1시간 후 이후에 오랜시간 동안 눈에 띄는 변화 없이 약간 향상된 명암을 유지하기 때문에, 느린 속도 절차를 분석하는데 사용할 수 있다.
CAC 모델 시스템은 주변 정상 조직에서 Mn2 +가 방출된 이후에 Mn2 +이온이 섭취되기 때문에 정상세포보다 느린 조영 거동을 보여준다. HCC와 SNC의 높은 미토콘드리아 활성을 갖기에 종양과 정상 조직 대비의 명확한 비교를 위해 사전 주입 수준으로 빠르게 회복되는 나노입자를 사용하는 것이 유익하다. 반면, CAC의 경우, 연장된 대조 증강 때문에 MnO@10nm-SiO2를 사용하는 것이 유리하다.
요약하면, 설계된 MRI 조영제를 사용해 얻은 시간변화에 따른 MRI 조영 증강 패턴 분석을 통해 정상 간조직과 종양을 구분할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 내에서 종양의 종류와 기원을 특징화하고 구분(discrimination)할 수 있다.

Claims (26)

  1. 산성조건에서 망간이온을 방출 가능한 망간실리케이트 (manganese silicate) 나노입자를 포함하는, 간종양 종류의 구별용 MRI 조영제로서,
    상기 망간이온은 간조직에 특이적으로 축적되어, 시간 변화에 따라 간종양 특이적으로 구별되는 MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴을 생성하고,
    상기 간종양은 간세포암종 (HCC, hepatocellular carcinoma), 결장 선암종 (CAC, colonic adenocarcinoma) 및 소장신경내분비암종 (SNC, small intestinal neuroendocrine carcinoma)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 간종양 종류의 구별용 MRI 조영제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MRI 조영제는 간종양과 정상 간조직을 구별하는 것인, MRI 조영제.
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  5. 제1항에 있어서, 상기 조영제는 혈관 분포 (vascularity), 세포 밀도 (cell density), 미토콘드리아 활성도 (mitochondrial activity), 또는 간세포성 친화도 (hepatocellular affinity)의 분석에 사용되는 것인, MRI 조영제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 망간 이온의 방출 속도는 나노입자의 공극도 및 층 두께를 조절하여 조절되는 것인, MRI 조영제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 MRI 조영제는 T1 조영증강 방식의 T1 조영제인, MRI 조영제.
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  10. 제1항에 있어서, 상기 조영제는 간종양의 치료 효과를 모니터링 하는 것인, MRI 조영제.
  11. 제1항에 있어서, 상기 망간실리케이트 나노입자는 공동성 (hollow)을 갖는 구조를 갖는 것인, MRI 조영제.
  12. 제1항에 있어서, 상기 망간실리케이트 나노입자는 산화망간 핵(core)- 실리카 껍질(shell) 구조를 갖는 것인, MRI 조영제.
  13. 제1항에 있어서, 상기 망간실리케이트 나노입자는 나노입자의 총중량을 기준으로 하여 0.5-55중량%로 망간 이온을 포함하는 것인, MRI 조영제.
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  16. 제2항에 있어서, 조영제 투여 후 얻어지는 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴이, 정상 간조직은 조영제 투여 후 시간순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 것인, MRI 조영제.
  17. 제1항에 있어서, 상기 간종양은 간세포암종 (HCC, hepatocellular carcinoma)이며,
    조영제 투여 후 얻어지는 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴이, 조영제 투여 후 시간순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 정상 간조직의 MRI 영상 이미지 밝기 변화 패턴을 기준으로 하여,
    상기 간세포암종은, 조영제 투여 후 시간순차에 따라 어두운 상태로 유지되다가, 정상 간조직의 영역이 최대로 밝아지는 시점부터 밝아지기 시작하여 밝기가 유지되는 패턴을 갖는 것인, MRI 조영제.
  18. 제1항에 있어서, 상기 간종양은 결장 선암종 (CAC, colonic adenocarcinoma)이며,
    조영제 투여 후 얻어지는 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴이, 조영제 투여 후 시간순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 정상 간조직의 MRI 영상 이미지 변화 패턴을 기준으로 하여,
    상기 결장 선암종은, 조영제 투여 후 검게 유지되거나 또는 정상 간조직의 MRI 이미지 밝기 보다 어두운 상태로 높게 점진적으로 증가 또는 가장자리만 원형 모양으로 밝아지는 패턴을 갖는 것인, MRI 조영제.
  19. 제1항에 있어서, 상기 간종양은 소장신경내분비암종 (SNC, small intestinal neuroendocrine carcinoma)이며,
    상기 조영제 투여 후 얻어지는 시간변화에 따른 MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴이, 조영제 투여 후 시간순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 정상 간조직의 MRI 영상 이미지 밝기 변화 패턴을 기준으로 하여,
    상기 소장신경내분비암종은, 조영제 투여 후 시간순차에 따라 점진적으로 밝기가 증가하고, 정상 간조직의 MRI 이미지 밝기보다 높게 유지되며 어두워지지 않는 패턴을 갖는 것인, MRI 조영제.
  20. 제1항, 제2항, 제5항 내지 제7항, 제10항 내지 제13항, 및 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 MRI 조영제와 반응시킨 대상의 간조직을 시간에 따라 연속적으로 촬영하여 얻어진 MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴을 추출하는 단계를 포함하는, 간종양의 종류를 구별할 수 있는 정보를 제공하는 방법으로서,
    상기 간종양은 간세포암종(HCC, hepatocellular carcinoma), 결장 선암종(CAC, colonic adenocarcinoma) 및 소장신경내분비암종(SNC, small intestinal neuroendocrine carcinoma)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 간세포암종 (HCC, hepatocellular carcinoma)은, MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴이 조영제를 대상의 간조직과 반응시킨 후 시간 순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 정상 간조직 부분을 기준으로 하여,
    상기 MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴이 조영제를 대상의 간조직과 반응시킨 후 시간 순차에 따라 어두운 상태로 유지되다가, 정상 간조직의 영역이 최대로 밝아지는 시점부터 밝아지기 시작하여 밝기가 유지되는 패턴을 갖는 부분인, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 결장 선암종 (CAC, colonic adenocarcinoma)은, MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴이 조영제를 대상의 간조직과 반응시킨 후 시간 순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 정상 간조직 부분을 기준으로 하여,
    상기 MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴이 조영제를 대상의 간조직과 반응시킨 후 검게 유지되거나 또는 정상 간조직 부분 보다 이미지 밝기가 어두운 상태로 높게 점진적으로 증가 또는 가장자리만 원형 모양으로 밝아지는 패턴을 갖는 부분인, 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 소장신경내분비암종 (SNC, small intestinal neuroendocrine carcinoma)은, MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴이 조영제를 대상의 간조직과 반응시킨 후 시간 순차에 따라 점진적으로 밝아지고 최대로 밝아진 후 어두워지는 패턴을 갖는 정상 간조직 부분을 기준으로 하여,
    상기 MRI 영상 이미지의 밝기 변화 패턴이 조영제를 대상의 간조직과 반응시킨 후 점진적으로 밝기가 증가하고 정상 간조직 부분 보다 밝기가 높게 유지되며 어두워지지 않는 패턴인, 방법.
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