KR20080071472A - 산화망간 나노입자를 포함하는 자기공명영상 티1 조영제 - Google Patents

산화망간 나노입자를 포함하는 자기공명영상 티1 조영제 Download PDF

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KR20080071472A
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Abstract

본 발명은 조직의 T1을 감소시키는 산화망간 (MnO) 나노입자를 자기공명영상(MRI)의 조영제로 이용하는 방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 산화망간 나노입자가 자기공명영상 조영제로 사용되어 종래의 일반적인 T1 강조 영상보다 세밀한 영상을 얻을 뿐만 아니라, 종양 마커 등의 표적지향성 물질과 같은 생체내 활성 물질을 산화망간 나노입자와 결합시킨 미세 나노구조 물질 또는 이를 이용한 조영제를 이용한 종양 등의 진단 및 치료 방법 대한 것이다. 본 발명의 조영제는 조직별 조영제 침착 정도 차이에 따라 발생하는 조직간 T1 대조영상을 부각하여 고해상도 해부학적 영상이 가능하게 하며, 살아있는 세포에 침투하는 성질이 있어 세포의 분포도를 반영할 수 있으며, 나노입자 표면에 질환 특이적 표지인자와 결합하는 표적인자를 부칠 경우 종양을 비롯한 다양한 질병의 표적지향적 진단 및 치료를 위한 조영제로 쓰일 수 있다.
조영제

Description

산화망간 나노입자를 포함하는 자기공명영상 티1 조영제{MRI T1 Contrasting Agent comprising Manganese Oxide Nanoparticle}
본 발명은 조직의 T1을 감소시키는 산화망간 (MnO) 나노입자를 자기공명영상(MRI)의 조영제로 이용하는 방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 산화망간 나노입자가 자기공명영상 조영제로 사용되어 종래의 일반적인 T1 강조 영상보다 세밀한 영상을 얻을 뿐만 아니라, 종양 마커 등의 표적지향성 물질과 같은 생체내 활성 물질을 산화망간 나노입자와 결합시킨 미세 나노구조 물질 또는 이를 이용한 조영제를 이용한 종양 등의 진단 및 치료 방법 대한 것이다.
본 발명의 조영제는 조직별 조영제 침착 정도 차이에 따라 발생하는 조직간 T1 대조영상을 부각하여 고해상도 해부학적 영상이 가능하게 하며, 살아있는 세포에 침투하는 성질이 있어 세포의 분포도를 반영할 수 있으며, 나노입자 표면에 질환 특이적 표지인자와 결합하는 표적인자를 부칠 경우 종양을 비롯한 다양한 질병의 표적지향적 진단 및 치료를 위한 조영제로 쓰일 수 있다.
자기공명영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging)은 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용해 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보를 영상으로 얻는 방법으로서 현재 살아있는 사람이나 동물의 신체기관을 비침습적이 며 실시간 영상화할 수 있는 현재까지 가장 뛰어난 영상 진단 장비중의 하나이다.
생명과학이나 의학 분야에서 MRI를 다양하고 정밀하게 활용하기 위해서 외부에서 물질을 주입하여 영상 대조도를 증가하는 방법을 사용하는데, 이러한 물질을 조영제라고 한다. MRI 이미지 상에서 조직들 사이의 대조도(contrast)는 조직 내의 물분자 핵스핀(nuclear spin)이 평형상태로 돌아가는 이완작용(relaxation)이 조직별로 다르기 때문에 생기는 현상인데, 조영제는 이러한 이완작용에 영향을 끼쳐 조직간 이완도의 차이를 벌리고 MRI 시그널의 변화를 유발하여 조직간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다.
조영제는 특징과 기능, 주입하는 대상에 따라 활용도와 정밀도의 차이가 생긴다. 조영제들을 이용한 증강된 대조는 특정 생체기관과 조직들의 주변과 영상신호를 높이거나 낮추어서 보다 선명하게 영상화하게 해 준다. MRI 영상을 얻기를 원하는 신체부위의 영상신호를 주위보다 상대적으로 높게 만드는 조영제를 ‘positive’ 조영제라고 하며, 이와 반대로 주위보다 상대적으로 낮게 만드는 조영제를 ‘negative’ 조영제라고 한다.
‘positive’ 조영제는, T1 이완, 즉 종이완에 관계하는 조영제이다. 이러한 종이완은 스핀(spin)의 Z축 방향의 자화성분 Mz가 X 축으로부터 가해진 RF 에너지 충격흡수 이후 X-Y 평면의 Y 축에 정렬(align) 한 후 에너지를 외부로 방출하며 원래의 값으로 돌아오는 과정이며, 이 현상을 “T1 이완 (T1 relaxation)”이라고 표현한다. Mz가 처음값의 63%로 돌아올때 까지의 시간을 “T1 이완시간 (T1 relaxation time)” 이라고 하며, T1 이완이 짧을 수록 MRI의 시그날은 크고, 따라 서 영상 획득 시간도 짧아진다.
'negative' 조영제는 T2 이완, 횡이완에 관계하는 조영제이다. 스핀의 Z축 방향의 자화성분 Mz가 X 축으로부터 가해진 RF 에너지 충격흡수 이후 X-Y 평면의 Y 축에 정렬(align)한 후 스스로 에너지가 감쇠하거나 주변 스핀들에게 에너지를 방출하며 원래의 값으로 돌아오려고 하는데, 이 때 X-Y 평면상 에서 균등하게 넓어진 spin 의 성분 My 가 지수 함수적으로 감쇠하는 현상을 “T2 이완 (T2 relaxation)”이라고 표현한다. My가 처음값으로 37%로 감쇠 할 때까지의 시간을 “T2 이완시간 (T2 relaxation time)” 이라고 하며, My 가 시간에 따라 감소하는 시간의 함수로 Y축에 설치된 수신코일을 통하여 측정 한 것을 자유 유도 감쇠 신호(free induction decay, FID)라고 한다. T2 이완시간이 짧은 조직은 MRI 상에 어둡게 나타난다.
현재까지 상업화된 MRI 조영제는 ‘positive’ 조영제로 상자성(paramagnetic) 화합물과 ‘negative’ 조영제로 초상자성(superparamagnetic) 나노입자가 사용되고 있다. ‘positive’ 조영제인 상자성 화합물은 보통 가돌리늄 이온(Gd3+) 나 망간 이온(Mn2+)의 킬레이트 화합물이며, 물의 양자의 이완을 가속하여 조영제 주위에서 밝은 대조영상을 얻게 한다.
그런데, 가돌리늄 이온의 경우 독성이 아주 높아 이를 방지하기 위해 킬레이트 화합물이나 고분자 물질과 결합된 화합물의 형태로 사용되고 있다. 이중 Gd- DTPA는 가장 널리 쓰이고 있으며, 이의 주요 의학적 활용처는 혈액-뇌 격막(BBB)의 손상여부나 혈관시스템의 변화, 혈액의 유동이나 관류 상태의 진단이다. 이는 조영제가 화합물의 형태로 구성되어 있기 때문에 생체 내의 면역기능을 활성화시키거나, 간에서의 분해 작용을 야기하여 혈액상에서 머무르는 시간이 약 20분 정도로 짧다는 문제를 야기한다.
망간이온(Mn2+)을 T1 조영제로 이용한 망간 강조 자기공명영상 (Manganese-enhanced MRI, MEMRI)은 뇌과학 등 다양한 영역에서 해부학적 구조와 세포의 기능등을 연구하는데 이용되고 있다(Lin YJ, Koretsky AP, Manganese ion enhances T1-weighted MRI during brain activation: an approach to direct imaging of brain function, Magn. Reson. Med. 1997; 38: 378-388). 망간 이온을 조영제로 이용한 MEMRI의 경우 아주 뛰어난 조영특성에도 불구하고 MnCl2의 투과량이 많고 (> 88 ~ 175 mg/kg) 망간 이온이 조직에 축적이 되어 나타나는 독성으로 인하여, 동물 뇌의 조영에만 이용되고 있으며, 사람의 두뇌에 대한 활용에는 독성이나 체내 축적가능성으로 인하여 본질적인 사용상의 한계가 있다.
현재, 망간을 이용한 조영제로서 사람의 간의 조영에 사용되는 망간 이온 조영제로 Mn-DPDP (teslascan)이 일반에 공지되어 있다. Mn-DPDP가 신체에 투여되면 Zn가 Mn을 치환하여 Zn-DPDP가 되어 신장을 통해서 배설되고, Mn2 +은 혈액과 함께 순환하다가 간, 신장, 췌장 등에 흡수되어 조영제로서 역할을 하게 된다. 이 또한 Mn2+의 독성으로 인하여 2 내지 3ml/hr 정도의 느린 속도의 주입(slow infusion) 방법이 요구된다. 통상 5μmol/kg 몸무게 (0.5ml/kg 몸무게) 정도가 사람에게 쓰일 수 있는 양인데, 이는 뇌나 기타 다른 장기에 사용하기에 턱없이 모자라는 양이다. (ref. Rofsky NM, Weinreb JC, Bernardino ME et al. Hepatocellular tumors: characterization with Mn-DPDP-enhanced MR imaging. Radiology 188:53, 1993).
‘positive’ 조영제를 이용한 T1 조영은 이미지의 왜곡이 없으며 조직의 해부학적 구조와 세포의 기능을 연구하는데 적합하며, 해상도가 뛰어나 MRI에서 가장 널리 사용되고 있어서 이에 관한 많은 연구개발이 이루어지고 있으나, 현재까지의 ‘positive’ 조영제의 경우 상자성 금속 이온 혹은 그들의 착화합물에 기반하고 있기 때문에 독성으로 인한 인체에의 응용 한계와 혈액에 머무르는 시간이 짧으며, 착화합물의 리간드 분자에 의한 입체적 방해로 인하여 표적지향성 물질을 부착하기 어렵게 한다.
이와 같은 종래 기술의 문제를 극복하기 위해 미국특허 US 2003/0215392 A1은 고분자 나노 구조체에 가돌리늄 이온을 농축하여 국지적 농도를 높이면서, 입자의 형태를 유지하려는 연구결과를 개시하고 있다. 그러나 입자의 크기가 크고, 가돌리늄 이온이 고분자 나노 구조체에 묶여 있는 형태이기 때문에 입자의 표면에서 쉽게 분리될 수 있으며, 세포투과율이 높지 않다는 문제점이 있다.
‘negative’ 조영제로 초상자성(superparamagnetic) 나노입자가 쓰이고 있으며 대표적인 예가 초상자성 산화철 나노입자 (SPIO: superparamagnetic iron oxide)이다.
미국특허 제4,951,675호는 생체적합성 초상자기성 입자를 자기성 입자를 자기공명영상의 T2 조영제로 사용하였으며, 미국특허 제6,274,121호는 초상자기성 입자와 이 입자의 표면에 조직 특이적 결합 물질, 진단용 또는 약제학적 활성 물질과 커플링(coupling)할 수 있는 결합자리를 포함하는 무기 또는 유기 물질로 이루어진 상자기성 입자를 개시하고 있다.
나노입자의 형태를 갖춘 초상자성 산화철은 그 형태가 수 내지 수백 nm 크기의 입자이기 때문에, 생체내 체류 시간이 수시간에 이르므로 화합물의 생체내 체류시간에 비하여 월등히 길며, 입자의 표면에 다양한 작용기와 표적물질을 결합시킬 수 있기 때문에, 표적지향성 조영제로서 크게 각광받고 있다.
그러나, 초상자성 나노입자의 경우, 자체의 자성 때문에 T2 이완시간이 짧아지는데 이의 부작용으로 MRI에서 자기장을 형성하여 영상을 교란시키기도 한다. 그리고 T2 강조 영상의 경우 조영된 부분이 검게 강조되는데 이렇게 검게 강조되는 부분은 체내 출혈, 체내 석화조직, 중금속 축척 부분같이 이미 검게 나타나는 부분과 혼동을 일으킬 수 있다.
또한, 자체 자성으로 인하여 조영제 부근의 자장에 뒤틀림(blooming effect)을 초래하여 신호 손실(signal loss)이나 배경이미지에 왜곡을 가져오기 때문에 해부학적 이미지에 가까운 영상을 얻을 수 없다는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명의 기본적인 목적은 산화망간 나노입자의 구성물질인 망간 이온(Mn2+)을 통해 MRI의 효율적인 활용을 위해 영상을 밝게 해주면서도 영상의 왜곡이 없는 T1 조영효과를 나타내며, 나노입자의 형태로서 높은 세포 내부 침투율 및 세포내 축적 능력, 목표지향성 조영효과, 용이한 전달성, 안전한 소거, 부작용이 최소화될 수 있는 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상(MRI) T1 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명의 나노입자의 형태의 T1 조영제는 종래의 이온 혹은 화합물 형태의 가돌리움 이온 또는 망간 이온 기반의 T1 조영제에 비하여, 생체 내 잔류시간을 확장시켜주는 효과가 있으므로, 생체 내에 투여 후 충분한 시간동안 MRI 촬영 및 진단 시간을 가능하게 하며, 높은 세포 내부 침투율은 조영제 입자가 세포 내에 머무르는 시간을 증대시킴으로써 장시간 동안의 연속적 또는 간헐적 영상 진단을 가능하게 하고, 세포 단위에서 이미지를 얻을 수 있는 세포 영상화(cellular imaging)를 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 목적은, i)C4-25카르복실레이트-망간 착화합물(Mn-C4-25 Carboxylate complex)을 열분해시켜, C6-26 방향족 탄화수소, C6-26 에테르, C6-25 지방족 탄화수소, C6-26 알콜, C6-26 티올 그리고 C6-25 아민으로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매에 분산된, 50nm 이하의, 바람직하게는 40nm 이하의, 보다 바람직하게는 35nm 이하의 직경을 갖는 산화망간 나노 입자를 제조하는 단계; 그리고 ii) 상기 산화망간 나노 입자를 생체적합성 물질을 사용하여 피복시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 자기공명영상(MRI) T1 조영제 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 생체적합성 물질로 피복된 본 발명의 산화망간 나노입자와 생체 활성 물질(biologically active material)을 결합시킨 것을 특징으로 하는, 생체 활성 물질이 결합된 미세 나노 구조물인 자기공명영상 T1 조영제를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 상기 산화망간 나노입자에 부착영역 또는 활성성분 결합영역을 도입시킴으로써 종양 마커 등 표적지향성 물질, 약제적으로 허용되는 담체를 담지한 진단용 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상(MRI) T1 조영제를 사용하여, 동물 세포에 대한 T1 조영 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상(MRI) T1 조영제를 사용하는, 동물 혈관에 대한 T1 조영 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 기본적인 목적은, 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상(MRI) T1 조영제를 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에서 ‘산화망간 나노입자(MnO nanoparticles)’는 산화망간(MnO) 또 는 이를 함유하는 다성분 혼성 구조체를 포함하는 것으로서, 직경이 1000nm이하의 입자, 바람직하게는 100nm 이하의 나노 입자를 의미한다.
본 발명의 MRI 조영제로 사용하기에 특히 적합한 MnO의 입자 크기는 바람직하게는 50nm이하, 보다 바람직하게는 40nm 이하, 가장 바람직하게는 35nm 이하이다. 또한 이러한 본 발명에 따른 MRI 조영제로서 사용하기 위한 MnO 나노입자는 그 크기의 평균값에 대한 표준 편차가 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 가장 바람직하게는 5% 이하의 범위 내인 것이 바람직하다.
본 발명에서 제시하는 MnO 나노입자의 크기 범위는, 조영제로서 혈관 내에 장시간 잔류하면서 지속적, 간헐적인 MRI 영상을 얻어내기에 매우 중요한 기술적 특징일 뿐만 아니라, MnO 나노입자의 수성분산액을 안정한 상태로 유지하기 위해 반드시 고려되어야 할 기술적 요소이다.
따라서, 본 발명의 MRI 조영제로 사용되는 MnO 나노입자는, 그 크기를 일정한 크기 이하, 가장 바람직하게는 35nm 이하의 크기로 정밀하게 조절될 수 있는 것이라는 점을 기술적 특징으로 함으로써 본 용도 발명을 완성시킨다.
종래의 T1 조영제 또는, 특히 Mn2 + 이온을 사용하는 T1 조영제는 Ca2 + 이온과의 경합으로 인한 생체에 대한 독성 문제도 있었지만, 본 발명의 산화망간 나노입자는 Mn2 + 이온이 고체상 나노입자를 형성하고, 수용액에서 자유 Mn2 + 이온(free Mn2 + ions) 상태로 존재하기 때문에 종래의 Mn2 + 이온을 사용하는 T1 조영제보다 거의 독성이 없다는 장점을 가지고 있다.
또한, 본 발명의 MnO MRI 조영제가 세포 조영제로서 또는 혈관 조영제로서의 용도를 확보하기 위해서는, 생체적합성 물질로 피복됨으로써 혈액 내에서의 분산 상태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 세포막을 포함하여 생체내의 각종 막을 투과하는 것을 용이하게 한다.
본 발명의 MRI 조영제로서 사용되기 위해 생체 적합성 물질로 피복된 상태의 MnO 나노입자의 크기는 바람직하게는 500nm 이하, 보다 바람직하게는 100nm 이하, 가장 바람직하게는 50nm 이하이다. 그러나 생체적합성 물질로 피복된 상태의 조영제 입자의 크기는 피복 물질의 종류에 따라 크게 달라질 수 있으며, 예를 들면 덱스트린과 같은 물질로 피복되는 경우는 100nm 를초과하는 크기를 가질 수도 있다. 그러나, 가급적 조영제 입자의 크기를 작게 하는 것이, 100nm 이하로 하는 것이 생체 내 면역기능으로 인한 소멸 또는 간에서의 분해 가능성을 최소화 시키는 것이며, 이렇게 조영제 입자의 크기를 최소화함으로써 장시간 동안의 지속적, 간헐적, 연속적 MRI 영상 촬영을 가능케 한다는 점이 본 발명의 특징을 이룬다.
이상과 같은 본발명의 MnO 나노입자는 산화망간 나노입자의 구성체인 망간 원자가 기존에 개시된 망간 이온 기반의 조영제와 같이 뛰어난 T1 조영제로서의 능력을 나타내는 산화망간 나노입자 T1 조영제로서의 용도를 가능하게 한다. 산화망간 나노입자의 화학구조식은 MnO 의 형태로 나노입자의 망간이온(Mn2+) 이온이 산화망간 나노입자의 주위에 존재하는 물분자의 스핀의 이완을 가속하는 방식으로 T1 조영제 효과를 나타낸다.
본 발명의 산화망간(MnO) 나노입자의 경우 반강자성(antiferromagnetic) 특 성을 보이므로 상온에서 자기공명영상에 자체 자화현상이 없으므로 SPIO와 같은 자제 자화현상으로 인한 신호 손실을 비롯한 뒤틀림현상을 초래하지 않는다.
본 발명의 산화망간 나노입자는 나노입자의 크기가 일정 범위 이하의 크기를 갖는다는 점 때문에 높은 세포 내부 침투율 및 세포내 축적능력을 보이며, 생체 내의 표적 지향 물질과 같은 활성성분의 결합이 용이한 산화망간 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T1 조영제로서의 용도를 갖는다.
본 발명에서 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T1 조영제는 나노입자가 수용성 환경에서 분산상태가 안정하고 생체적합성 물질로 피복되기 쉽고, 표적지향성 물질과 같은 생체 내의 활성 성분과의 결합영역을 포함하고 있으며, 질병 진단제 도는 치료제로서 가공되기에도 적합하다.
전술한 본 발명의 또 다른 목적은 i)C4 - 25카르복실레이트-망간 착화합물(Mn-C4-25 Carboxylate complex)을 열분해시켜, C6 -26 방향족 탄화수소, C6 -26 에테르, C6 -25 지방족 탄화수소, C6 -26 알콜, C6 -26 티올 그리고 C6 -25 아민으로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매에 분산된 50nm, 바람직하게는 40nm, 가장 바람직하게는 35nm 이하의 직경을 갖는 산화망간 나노 입자를 제조하는 단계; 그리고 ii) 상기 산화망간 나노 입자를 덱스트란, PEG, PPG와 같은 혈액 정립성 또는 생체적합성 물질을 사용하여 피복시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 자기공명영상(MRI) T1 조영제 제조 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 명세서에서 열거하지는 아니하였지만, 이 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 산화망간 나노입자 합성법으로 제조된 모든 산화망간 나노입자가 본 발명의 산화망간 나노입자로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 나노입자를 수용성 환경에서 분산상태를 안정하게 하고 생체적합성을 갖게 하는 물질은, 생체내에서 독성을 보이지 않는 물질이며, 예를 들면 폴리비닐알콜, 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리락타이드글리콜라이드공중합체(poly(lactide-co-glycolide)), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리에스테르(polyester), 폴리에테르에스테르(polyetherester), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리에스테르아마이드(polyesteramide), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐플루오라이드(polyvinyl fluoride), 폴리비닐이미다졸(poly(vinyl imidazole)), 클로로술포네이트 폴리올레핀(chlorosulphonate polyolefin), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol)) 또는 덱스트란(dextran) 등과 같은 물질들로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물 또는 이들의 공중합체를 포함한다.
본 명세서에서 열거하지는 아니하였지만, 혈액적합성 도는 생체적합성을 타타내는 물질로서 이 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 모든 물질은 본 발명의 MnO 나노입자의 피복 불질로 사용될 수 있다. 그러나 이들로 피복된 상태의 조영제 입자의 직경은 500nm 이하인 것이 바람직하다.
전술한 본 발명의 또 다른 목적은, 생체적합성 물질로 피복된 산화망간 나노입자와 생체 활성 물질(biologically active material)을 결합시킨 것을 특징으로 하는, 생체 활성 물질이 결합된 자기공명영상 T1 조영제를 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에서의 생체활성 물질은, 생체 내의 면역활성화에 의해서 특정 항원에 대한 인식과 선택적 결합을 하는 항체, 이를 기초로 제조되는 모노크로널 항체, 항체의 가변부위(variable region) 또는 불변부위(constant region), 일부 또는 전부를 인위적으로 변화시킨 키메릭 항체, 인간화 항체 등을 포함하며, 또한 특정 염기서열을 갖는 RNA나 DNA에 상보적 결합이 가능한 DNA 또는 RNA와 같은 핵산, 그리고 특정 화학작용기와 일정 조건하에 수소 결합 등을 통하여 결합이 가능한 비생물학적(non-biological) 화학물질 등을 포함하는 표적지향성 물질과, 각종 질병 부위에 치료, 예방 또는 병증 완화 효과를 갖는 다양한 약리 활성물질, 세포사멸을 유도하는 유전자 또는 독성 단백질과 같은 독성 활성물질, 전자기파, 자기장, 전기장, 빛이나 열에 감응하는 화학물질, 형광을 발생시키는 형광물질 그리고 방사선을 발생시키는 동위 원소와 같은 생체내 활성물질 등이 포함된다.
이렇게 본 발명의 산화망간 나노입자 MRI 조영제에 결합시킬 수 있는 물질은, 이미 관련 기술 분야에서 일반에 알려진 생체 내 활성 물질을 포함하며, 본 발명에 사용되기에 특별한 제한은 없다.
보다 구체적으로는 본 발명의 MnO 나노 입자 조영제에 결합될 수 있는 모든 생체 내 활성 물질에는 이제까지 각종 문헌을 통하여 공지된 방법으로 결합될 수 있는 모든 생체 내 활 성 물질이 포함되며, 이들에 대한 일반적인 제한은 존재하지 아니한다. 특히, 본 발명의 생체 활성 물질과 결합된 MnO 나노입자로 이루어진 MRI 조영제는 혈관 조영제로 사용되는 경우 그 제한이 없다. 그러나, 세포 조영제로 사용되는 경우, 상기 생체 내 활성 물질은 본 발명의 MnO 나노 입자가 갖는 것과 대등한 세포막 투과도를 보이는 물질로 한정되는 것이 바람직하다.
이상과 같은, 본발명의 산화망간 나노입자에 결합될 수 있는 물질과 그들간의 결합방법은 예를 들면, 미합중국 특허출원 제410607호, 제 335995호, 제171761호, 제640126호, 제348609호 또는 제559957호 등에 기재되어 있으며, 이들의 해당 내용을 본 명세서의 일부로서 인용한다.
본 발명에서 산화망간 나노입자는, 의약으로서 활성을 가지거나, 방사선, 전기장, 자기장, 각종 전자기파, 열 및 빛에 감응할 수 있는 활성성분과 결합될 수 있다. 특히 종양, 특이 단백질 등을 진단 및/또는 치료할 수 있는 물질을 포함할 수 있으며, 위암, 폐암, 유방암, 간암, 후두암, 자궁경부암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 췌장암, 방광암 및 결장암 등의 각종 종양과 관련된 다양한 질병과 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 광우병 등의 특이 단백질과 관련된 다양한 질병을 진단 및/또는 치료하는데 이용될 수 있다.
이와 같은 종양 세포 혹은 특이 단백질은 정상 세포 혹은 단백질에서는 거의 또는 전혀 생산, 발현되지 않는 특정 물질을 분비 및/또는 발현하게 되며 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을, 본 발명의 산화망간 나노입자의 활성작용기를 이용해 그것에 결합시켜 진단 및/또는 치료에 이용될 수 있다.
현재 다양한 종양 또는 특이 단백질과 특이적으로 반응 또는 결합할 수 있는 물질을 포함하며, 본 발명에 따른 진단 및/치료 방법에서 이용될 수 있는 생체 활 성 물질을 표 1에 예시하였으나, 본 발명의 MnO MRI 조영제에 결합시킬 수 있는 생체 활성 물질은 이들만으로 제한되는 것은 아니다 (표1 참조).
표 1. 질병에 따른 표적지향성 물질
종류 대응질병 표적지향물
항체 비호지킨 림프종 리툭산(Rituxan)
유방암 허셉틴(Herceptin)
면역거부반응 올소크론(Orthoclone)
동맥경화 레오프로(Reopro)
면역거부반응 제나팍스(Zenapax)
호흡기질환 시나지스(Synagis)
류마티스, 염증성질환 레미케이드(Remicade)
면역거부반응 마이로타그(Mylotarg)
백혈병 캠패스(Campath)
폐암, 결장암 어비툭스(Erbitux)
수용체 난소암 엽산
리간드 종양 VEGFR
EGFR
펩타이드 알츠하이머 병 아밀로이드 베타 펩타이드 (Abeta)
즉, 본 발명의 산화망간 나노입자에 결합시키는 생체 활성 물질은 리툭산(Rituxan), 허셉틴(Herceptin), 올소크론(Orthoclone), 레오프로(Reopro), 제나팍스(Zenapax), 시나지스(Synagis), 레미케이드(Remicade), 마이로타그(Mylotarg), 캠패스(Campath) 또는 어비툭스(Erbitux) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물 이거나; 엽산, 혈관내피성장인자수용체(VEGFR), 표피성장인자수용체(EGFR) 또는 이들에 대한 리간드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물이거나; 또는 아밀로이드 베타 펩타이드(Abeta), RGD(Arg-Gly-Asp) 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 핵 위치신호(nuclear localization signal, NLS) 펩타이드 또는 TAT 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들 의 혼합물 중에서 선택되는 것이다. 본 발명의 산화망간 나노입자에는 표적지향과 치료를 동시에 가능하게 하는 물질을 결합시키거나 항암제와 같은 치료목적의 물질을 추가적으로 담지하는 것이 가능하다.
현재 다양한 종양 또는 특이 단백질과 관련된 치료 물질이 공지되어 있으며 본 발명에 따른 치료 방법에서 이용될 수 있는 것으로는, 이들만으로 한정하는 것은 아니지만, 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 택솔(taxol), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 트랜스플라티눔(transplatinum), 빈블라스틴(vinblastin) 또는 메토트렉세이트(methotrexate) 등이 있다.
전술한 본 발명의 또 다른 목적은, 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상(MRI) T1 조영제를 사용하는, 동물 세포에 대한 자기공명영상 T1 조영 방법을 제공함으로써 달성된다.
즉, 본 발명은 i) 본 발명에 따른 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T1 조영제를 생체 또는 시료에 주입하여 상기 생체 또는 시료로부터 자기공명영상 T1 강조영상을 얻어내는 단계; 또는 ii) 표적지향 및/또는 치료물질이 담지된 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T1 조영제를 생체 또는 시료에 주입하여 표적에 도달한 부분으로부터 자기공명영상 T1 강조영상을 얻어내는 단계; 및 iii) 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T1 조영제에 의해 발산되는 신호를 자기공명영상 진단장치로 감지하여 이상 및/또는 정상조직 유무를 진단하는 단계를 포함한 진단방법 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T1 조영제는 통상적으로 의약분야에서 사용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.
산화망간 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T1 조영제를 상기 투여경로를 통해서 투여한 후에 진단방법은 자기공명영상 진단장치(MRI)를 포함한 진단장치를 이용한다. 자기공명영상 진단장치(MRI)는 통상적으로 의약분야에서 사용되고 있는 1.5T, 3T, 4.7T, 9T 등의 자기장을 이용하는 자기공명영상 진단장치를 포함한 진단장치를 이용해 진단할 수 있다. 산화망간 나노입자를 포함하는 자기공명영상화 방법은 T1 강조영상을 포함한 진단방법을 이용할 수 있으며 T2 강조영상을 포함한 진단방법을 병행하여 진단방법을 수행할 수 있다.
산화망간 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T1 조영제로 뇌, 골수, 관절, 근육, 간, 신장, 위장 등을 포함한 생체기관 또는 시료에서 자기공명영상 진단장치로 얻는 영상은 세포수준의 정상 및/또는 이상 조직간의 해부학적 정보를 얻을 수 있다.
표적지향 및/또는 약리 활성 물질이 담지된 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상 T1 조영제를 생체 또는 시료에 주입하여 표적에 도달한 부분에 서 자기공명영상 진단장치로 얻는 영상은 원하는 표적의 존재 여부를 판독이 가능하며, 표적의 분포를 통한 종양, 이상단백질 질환 등의 진척상황의 판별을 통한 진단이 가능하며, 담지 된 치료물질을 국지적으로 분포하게 하므로 이를 통한 치료가 가능하다.
본 발명의 또 다른 목적은, 산화망간(MnO) 나노입자를 포함하는 자기공명영상(MRI) T1 조영제를 사용하는, 동물 혈관에 대한 T1 조영 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다. 동물 혈관의 T1 조영에 사용되는 본 발명의 산화망간(MnO) 나노입자 조영제는 세포 조영제의 경우보다 세포막 투과성을 요구하지 아니한다는 점에서 비교적 조영제의 크기에 대한 제한이 약하지만, 그 크기가 너무 커지면 면역기능을 활성화시키거나 간에서의 분해작용을 촉발함으로써, 혈관 내 체류시간이 짧아지는 문제점이 여전히 있다.
첫째, 본 발명에 따르면 산화망간 나노입자를 조영제로 사용하여 뇌, 간, 신장, 척수 등 다양한 장기를 밝은 강조 영상인 T1 강조 영상화가 가능하고, 높은 세포투과율, 특히 혈액-뇌관문(BBB)을 통과하기도 하여 해부학적 구조를 영상화 할 수 있고, Mn2+ 이온을 이용했을 때의 단점인 독성을 최소화 하여 인체에 적용이 가능하여 사람의 혈관이나 세포의 영상화도 가능하다.
둘째, 표면의 개질이 가능한 나노입자의 형태를 취하고 있어 표적지향성 물질의 도입이 가능하여 암, 종양등의 세포의 표적영상화가 가능하고 줄기세포, 세포치료등에서 세포의 발현, 이동경로의 추적이 가능하다.
이하, 본 발명의 구성 요소와 기술적 특징을 다음의 실시 예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기의 실시 예들은 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 구성요소의 기술적 범위를 실시 예들에 예시한 것들로 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 생체 적합성 물질로 피복시킨 산화망간(MnO) 나노입자의 제조
생체 적합성 물질로 둘러 싸인 산화망간(MnO) 나노입자의 제조는 여러 가지 방법을 통해 가능하며 제조된 산화망간 나노입자의 화학식은 MnO를 만족해야한다. 산화망간의 제조방법의 대표적인 예는 아래와 같으나 이 제조방법만으로 제조된 MnO 나노입자로만 한정하고자 하는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 혈관 조영제로서 바람직한 조영제 입자 크기는 500nm 이하의 크기, 더욱 바람직하게는 100nm이하의 크기를 갖는 것이 바람직하다. 동물 혈관 조영제로 사용되는 본 발명의 MnO MRI 조영제는 하나 또는 하나 이상의 MnO 나노 입자가 덱스트란과 같은 혈액 적합성 물질에 분산된 것이 바람직한 형태일 수 있다.
먼저 망간 올레이트 착화합물(Mn-oleate complex)을 합성하였는데, 7.92g 의 manganese chloride tetrahydrate와 24.36 g의 sodium oleate를 에탄올-물-헥산의 혼합물에 넣었다. 이를 섭씨 70도까지 가열하고 하루 동안 유지하였다. 이 용액에 서 상층 유기용매부분을 수집하여 증류수로 수회 세척한 후에 헥산을 증발시키 분홍색의 망간 올레이트 분말을 얻었다.
그 후 MnO 나노입자를 합성하였는데, 1.24g의 망간 올레이트 화합물을 10g 의 1-octadecne에 녹이고 섭씨 70도에서 진공으로 물과 산소를 제거하였다. 이 용액을 교반하면서 섭씨 300도 까지 가열하고 1 내지 2시간 유지하여 나노입자가 생성되었다.
이 용액에서 순수한 나노입자를 분리하기 위해 아세톤과 핵산의 혼합용액을 넣고 원심분리하고 세척하여 분말을 얻었다. 얻어진 나노입자는 헥산, 클로로포름등에 분산되었다. 나노입자의 크기는 300도에서 유지하는 시간에 따라 7 내지 35 nm로 균일하게 조절되었다(평균 크기로부터의 표준편차는 10%이하).
이 경우, 상기 산화망간 나노입자의 직경이 35 nm 내지 50nm 되면 상기 산화망간 나노입자의 콜로이드 안정성(colloidal stability)이 감소하여 상기 산화망간 나노입자끼리 엉겨 붙어 침전을 형성하는 경우가 간혹 발생한다.
또한, 제조된 상기 산화망간 나노입자의 크기분포의 표준편차는 10% 이하가 되었다.
마지막으로 MnO 나노입자를 대표적인 생체적합성 물질인 poly(ethylene glycol)로 둘러싸서 물에 분산시키는데(Science 2002년 298호 1759쪽), 합성된 MnO 나노입자를 클로로포름에 분산시키고 (5mg/ml) 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (mPEG-2000 PE, Avanti Polar Lipids, Inc.) 10mg을 넣은후 섭씨 80도에서 클로로포름을 제거한후 물을 넣어 분산시켰다.
실시예 2: 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 둘러싸인 MnO 나노입자의 생체적합적 특성 및 조영 능력
제조된 나노입자는 그 크기가 매우 균일하며 (도 1) 크기의 조절이 가능하였다. 또한 PEG로 둘러싸여 있기 때문에 생체적합적 특성을 가졌으며 수개월에 걸쳐 안정하였다.
산화망간 나노입자 및 생체적합성 물질을 포함한 전체 입자 크기가 500 nm 이상이 되면 인체 면역계의 작동 또는 간에서 분해되어 생체 내 체류시간이 저하되어 촬영시간이 감소되는 현상이 나타났다. 그러므로 생체적합성 물질을 포함한 산화망간 나노입자의 직경은 500nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하가 되어야 한다.
MnO 나노입자의 MRI 조영제로서의 조영능력을 테스트하였다. 3.0T 의료용 장비에서 나노입자 자체를 MRI 실험하였다. 도 2에서 보이듯이 5 mM 망간 농도하의 시료를 테스트한 결과 T1 이완이 짧아져 밝게 영상화되었다. 이는 T1 조영제로서의 조영능력이 있음을 뜻한다. 아울러 T2 이완을 짧게하는 T2조영효과도 같이 나타났다.
실시예 3: MnO 나노입자 강조 MRI ( Manganese Oxide NanoparticlesEnhanced MR Imaging (MONEMRI))
실질적으로 쥐(mouse)에 MnO 나노입자를 조영제로 사용하여 MnO 나노입자 강 조 MRI를 촬영하였다. MRI 실험은 4.7T/30 MRI System (Bruker-Biospin, Fallanden, Switzerland)에서 행해졌다. 쥐의 꼬리 정맥을 통해 25 nm 의 MnO 나노입자를 한번에 주입한 후 MRI 영상을 얻었다. 실험조건은 아래와 같았다.
3-1. 뇌의 MRI 영상화 조건
fast spin-echo T1-weighted MRI sequence
TR/TE = 300/12.3 ms
echo train length = 2
140 m 3D isotropic resolution
FOV = 2.56 x 1.28 x 1.28 cm3
matrix size = 256 x 128 x 128
3-2. 복부 MRI 영상화 조건
spin-echo T1-weighted MRI sequence
TR/TE = 400/12 ms
NEX = 16
slice thickness = 1.5 mm
FOV = 2.78 x 168 cm2
matrix size = 192 x 192
이를 이용하여 얻은 쥐의 뇌 영상(도 3)은 조영제를 쓰지 않았을 때와 비교하여 월등히 뛰어난 해부학적 이미지를 얻을 수 있었다. 또한 간, 신장, 척수 등의 복부의 영상(도 4)도 각 장기와 조직들이 뛰어난 해부학적 이미지를 얻을 수 있었다.
뇌에 교아세포종(gliblastoma)을 갖고 있는 쥐에 MnO 나노입자를 같은 방식으로 꼬리 정맥에 주입하여 MRI 영상화를 할 경우 종양이 더 밝게 영상화 되어 암의 특이적 영상화도 가능하였다(도 5).
실시예 4: 표적지향성 탐침(probe)를 결합시킨 MnO 나노입자의 제조
표적지향성 탐침을 갖는 MnO 나노입자는 다음과 같은 두 단계의 제조 단계를 거쳤다.
4-1. 반응성이 있는 작용기를 갖는 MnO 나노입자의 합성
실시예 1에서 유기 용매에 분산된 나노입자를 생적합성 고분자인 poly(ethylene glycol) 로 피복시키는 단계에서 poly(ethyelne glycol) 말단에 아민(amine, -NH2), 티올(thiol, -SH), 카르복시산염 (carboxylate. -CO2-) 등의 반응성이 있는 작용기가 부여된 poly(ethtlene glycol)을 포함한 인지질(phospholipid) 를 사용하여 피복시켰다. 예로 말레이마이드(maleimide) 작용기를 MnO 나노입자에 도입하기 위해 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[methoxy (polyethylene glycol)-2000] (mPEG-2000 PE, Avanti Polar Lipids, Inc.) 와 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG(2000)Maleimide, Avanti Polar Lipids, Inc.)를 섞어서 피복시켰다. 실험방법은 실시예 1에서 기술한 방법과 유사하였다.
4-2. 유방암 표적지향성 항체를 결합시킨 MnO 나노입자의 제조
유방암 항체인 Herceptin (Roche Phama Ltd.) 6 mg을 인산염 완충액 (phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2)) 0.5 ml 에 녹인후, 과량의 N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA)와 혼합하였다. 30분 후에 0.5M의 hydroxylamine을 섞고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응물을 탈염 컬럼(desalting column)에서 정제한후 말레이마이드 작용기를 갖고있는 MnO나노입자(maleimido-MnO) 0.3 ml (10 mg/ml) 와 섞었다. 4 ℃에서 12시간 반응한후에 컬럼을 통해 유방암 표적지향성 항체가 결합된 MnO나노입자를 정제하였다.
실시예 5: 표적지향성 탐침(probe)를 결합시킨 MnO 나노입자를 이용한 암세포 지향 MRI
MDA-MB-435 암세포를 쥐에 심어 유방암-뇌 종양 전이 모델을 만들고 유방암 표적지향 항체(Herceptin)가 결합된 MnO나노입자로 암세포 지향 MRI를 하였다. MRI 실험은 4.7T/30 MRI System (Bruker-Biospin, Fallanden, Switzerland)에서 행해졌 다. 쥐의 꼬리 정맥을 통해 25 nm 의 MnO 나노입자를 한번에 주입한 후 MRI 영상을 얻었으며 실험조건은 실시예 3과 유사하였다.
이를 이용하여 얻은 쥐의 뇌 영상(도 6)은 유방암 표적지향 항체(Herceptin)가 결합된 MnO 나노입자를 사용한 경우는 항체가 결합되지 아니한 MnO 나노입자를 사용했을 때보다 더 뛰어난 암세포 표적지향 MRI를 얻을 수 있었다.
유방암 표적지향 항체가 결합되지 아니한 MnO를 사용한 경우가 3시간 이후에 조영효과가 사라지는데 반해 유방암 표적지향 항체(Herceptin)가 결합된 MnO 나노입자를 사용한 경우는 1일 이후에도 암세포가 조영되어 뛰어난 T1 강조영상을 얻었고 암세포의 위치를 파악하는데 용이하였다.
도 1은 물에 분산된 다양한 크기의 MnO 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 사진이다.
도 2는 MnO 나노입자의 상온에서의 자화곡선 그래프이다.
도 3는 3.0T 의료용 MRI 장비하에서 얻어진 다양한 크기의 MnO 나노입자의 T1 강조 MRI 영상이다.
도 4는 MnO 나노입자를 쥐(mouse)의 정맥에 주사한 후 쥐의 뇌의 T1 강조 영상 (MnO nanoparticle enhanced MRI (MONEMRI))이다.
도 5는 MnO 나노입자를 쥐(mouse)의 정맥에 주사한 후 쥐의 신장(A), 간(B), 척수(C)에 대한 T1 강조 영상 (MnO nanoparticle enhanced MRI (MONEMRI))이다.
도 6은 뇌에 교아세포종(gliblastoma)을 갖고 있는 쥐의 MONEMRI 이다.
도 7은 뇌에 Her2/neu를 발현하는 유방암 전이 종양을 갖고 있는 쥐에 Her2/neu 항체(Herceptine)가 결합된 MnO나노입자를 조영제로 사용한 T1 강조영상(A)과 항체가 결합되어지지 않은 MnO 나노입자를 조영제로 사용한 T1 강조영상(B)의 비교이다.

Claims (13)

  1. i)C4-25카르복실레이트-망간 착화합물(Mn-C4-25 Carboxylate complex)을 열분해시켜, C6-26 방향족 탄화수소, C6-26 에테르, C6-25 지방족 탄화수소, C6-26 알콜, C6-26 티올 그리고 C6-25 아민으로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매에 분산된 35나노미터 이하의 직경을 갖는 산화망간 나노 입자를 제조하는 단계; 그리고 ii) 상기 산화망간 나노 입자를 생체적합성 물질을 사용하여 피복시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 자기공명영상(MRI) T1 조영제 제조 방법.
  2. 제1항의 제조 방법에 있어서, 상기 i)단계의 유기 용매가, 클로로포름, 1-헥타데센 그리고 1-옥타데센으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는, 자기공명영상 T1 조영제 제조 방법.
  3. 제1항의 제조 방법에 있어서, 상기 ⅱ)단계의 생체적합성 물질이, 폴리비닐알콜, 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리락타이드글리콜라이드공중합체(poly(lactide-co-glycolide)), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리에스테르(polyester), 폴리에테르에스테르(polyetherester), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리에스테르아마이드(polyesteramide), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐플루오라이드(polyvinyl fluoride), 폴리비닐이미다졸(poly(vinyl imidazole)), 클로로술포네이트 폴리올레핀(chlorosulphonate polyolefin), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol)) 그리고 덱스트란(dextran)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물 또는 이들의 공중합체를 포함하는 것임을 특징으로 하는 자기공명영상(MRI) T1 조영제 제조 방법.
  4. 제1항의 제조 방법에 있어서, 상기 생체적합성 물질이 폴리에틸렌글리콜인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T1 조영제 제조 방법.
  5. 제1항의 제조 방법에 있어서, 상기 생체적합성 물질이 덱스트란인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T1 조영제 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 제조 방법에 있어서, 상기 산화망간 나노입자의 직경이 35nm 이하인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T1 조영제 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 제조 방법에 있어서, 상기 산화망간 나노입자의 직경이 30nm 이하인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T1 조영제 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조 방법에 있어서, 생체적합성 물질 층을 포함하는 상기 T1 조영제의 직경이 50nm 이하인 것을 특징으로 하는 자기공명영상 T1 조영제 제조방법.
  9. 제4항의 제조 방법에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 층의 두께가 5 내지 10 nm인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T1 조영제 제조 방법.
  10. 제6항의 제조 방법에 있어서, 상기 산화망간 나노입자 직경의 분포의 표준편차가 10% 이하인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T1 조영제 제조 방법.
  11. 제7항의 제조 방법에 있어서, 상기 산화망간 나노입자 직경의 분포의 표준편차가 5% 이하인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T1 조영제 제조 방법.
  12. 제5항의 제조 방법에 있어서, 생체적합성 물질 층을 포함하는 상기 T1 조영제의 직경이 500nm 이하인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T1 조영제 제조 방법.
  13. 제1항, 제2항, 제4항 또는 제9항의 어느 한 항의 T1 조영제에 있어서, 상기 T1 조영제가 세포 조영제인 것임을 특징으로 하는 자기공명영상 T1 조영제.
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