JPWO2019004297A1 - ナノ粒子、これを含む磁気共鳴イメージング用造影剤及びリガンド化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
造影剤が占める組織に信号上昇をもたらす。また、T2緩和を利用し、T2強調画像上での信号を減衰する目的で使用される造影剤をT2短縮造影剤又は陰性造影剤(negative contrast agent)と呼ぶ。陰性造影剤は、当該造影剤が占める組織に信号減少をもたらす。
T1強調MRIは、T2強調MRIに比して人為的影響が小さく、高い空間分解能を示すことから、近年注目されている。高いコントラストを示すT1強調MR画像を得るためには、水プロトン緩和時間を変化させることによってMRIのコントラストを増強する陽性造影剤の使用が不可欠である。
<1>酸化鉄を含有する金属粒子と、
前記金属粒子表面の金属原子と結合した式(3)で表されるリガンドと、
を含むナノ粒子。
<2>(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウム。
一般に「ナノ粒子」とは、ナノメートルスケールの粒子径を有する粒子を指し、通常、1μm未満の粒子径を有する粒子をいう。ここで粒子径の詳細については、以下の粒子径の項目において詳細に説明する。
本発明に係るナノ粒子は、酸化鉄を含有する金属粒子と、前記金属粒子表面の金属原子と結合した下記式(3)で表されるリガンドと、を含むナノ粒子であり、好ましくは当該リガンドが下記式(1)で表されるリガンドである、ナノ粒子である。
また、本発明の別の態様のナノ粒子は、酸化鉄を含有する金属粒子と、前記金属粒子表面の金属原子と結合した上記式(3)で表されるリガンドと、を含むナノ粒子において、上記式(3)中、mが1、2又は4の整数であるナノ粒子である。
金属粒子は、酸化鉄を含有する。一実施形態では、金属粒子は、酸化鉄のみを含有する酸化鉄粒子である。
本明細書において、粒子径という場合は、特に記載をしていない場合は平均粒子径を指す。
ナノ粒子の粒径は上記金属粒子に被膜されたリガンドの厚さの分大きくなるが、測定は難しい。通常、ナノ粒子を溶液とした場合の流体力学的直径(hydrodynamic diameter、HD)がその大きさの指標とされる。一例としては、ナノ粒子の平均HDは30nm以下、好ましくは、10nm以下である。更に別の一例としては、ナノ粒子の平均HDは7nm以下、好ましくは6nm以下、好ましくは5nm以下、好ましくは4nm以下、更に好ましくは3nm以下である。
本発明に係るリガンド化合物は、下記式(4)で示される化合物である。
ある態様としては、下記式(2)で示される(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウム(DDSA)である。後記するリガンド置換反応において、本化合物の2つの水酸基から水素イオンが脱離し、残る酸素原子と金属粒子表面の金属原子とが配位結合し、本発明のナノ粒子を形成する。金属粒子表面の金属原子と配位結合しているリガンドは、前記式(1)で表される構造を有している。
リガンドの製造方法は特に限定されず、当業者に周知の反応を用いて公知原料化合物から容易に製造することができる。例えば、Wei H. et al., Nano Lett. 12, 22-25, 2012に記載の方法を参考にすることができる。
本発明のナノ粒子は、本発明のリガンド以外を含んでいてもよく、一実施形態においてナノ粒子は、コア粒子そのものが蛍光特性を持つか、コア粒子の表面に結合された蛍光分子又は色素分子等の分子をさらに含んでいてもよい。コア粒子そのものが蛍光特性を持つか、蛍光分子又は色素分子をナノ粒子に導入することによって、ナノ粒子は、MRI用の造影剤としてのみならず、同時に、光学画像造影剤としても使用することができる。別の一実施形態として、本発明のリガンドに共有結合により結合された蛍光分子又は色素分子を有していてもよく、酸化鉄粒子とはリガンドを介し連結されている。体内にナノ粒子が注入された後にも、蛍光分子は酸化鉄粒子の表面に存在することによって、顕微鏡イメージングならびにナノ粒子の局在化を調べるのに利用することができる。蛍光分子及び色素分子としては、ローダミン、フルオレセイン、ニトロベンゾオキサジアゾール(NBD)、シアニン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、クマリン及びこれらの誘導体が挙げられる。
次に、ナノ粒子の製造方法について説明する。ナノ粒子の製造方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
工程(a)は金属塩と、炭素数18のカルボン酸のアルカリ金属塩とを反応させて、金属カルボン酸錯体を形成する工程である。
工程(b)は上記工程(a)で得られた錯体に疎水性リガンドを反応させて、コアとなる金属粒子の表面が疎水性リガンドで被覆されたナノ粒子を合成する工程である。
工程(c)は、上記工程(b)において得られたナノ粒子の表面にコーティングされた疎水性リガンドを、カルボキシル基を有する親水性リガンドで置換し、高極性溶媒への分散を可能な粒子にする工程である。
工程(d)は上記工程(c)で得られた親水性リガンドで被覆された金属粒子と本発明のリガンド化合物とを反応させて、金属粒子表面に本発明のリガンド化合物が被覆したナノ粒子を得る工程である。
本発明は、上述のナノ粒子を含む、磁気共鳴イメージング用造影剤も提供する。
=ナノ粒子=
一実施形態において、本発明のMRI用造影剤は、上述したナノ粒子を、少なくとも1種類含んでいることを特徴とする。別の実施形態において、本発明のMRI用造影剤は、上述したナノ粒子の2種類以上の組み合わせを含んでいてもよい。
MRI用造影剤に含まれる溶媒としては、水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液としては、さらに、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、リンガー溶液等が挙げられる。剤型が注射剤である場合の好ましい溶媒は、例えば水、リンガー溶液、生理食塩水等である。
MRI用造影剤に含まれる担体、錯体、ビヒクル等の添加剤としては、医薬分野及び生命工学分野において一般的に使用される担体、ビヒクル等が挙げられる。担体の例としては、ポリエチレングリコール等のポリマー、金属微粒子等が挙げられ、錯体の例としては、ジエチレントリアミン5酢酸(DTPA)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸(DOTA)、等が挙げられ、ビヒクルの例としては、石灰、ソーダ灰、ケイ酸ソーダ、デンプン、膠、ゼラチン、タンニン及びケブラチョが挙げられる。
本発明のMRI用造影剤の剤型は特に限定されず、液体、固体又は半固体若しくは半液体とすることができる。これらの剤型は、当業者に公知の方法に基づき、容易に製造することができる。剤型が液体の場合は例えば水性の溶媒に本発明に係るナノ粒子を分散、懸濁又は溶解して含有させた形態であり得る。また凍結乾燥剤の形態として、使用する際に分散、懸濁又は溶解して用いるものであってもよい。
MRI用造影剤中のナノ粒子の濃度は目的及び造影対象組織等に応じて適宜決定される。例えば、適当な造影能を有し、且つ生体への影響が許容できる範囲の濃度が選択される。
本発明に係る造影剤の投与の対象としては任意のヒト以外の生物又はヒトが挙げられる。ヒト以外の生物としては、哺乳類(例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及びブタ等)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫及び植物を含むが、これらに限定されない。ある態様において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物又はクローン生物であり得る。また、生体以外の投与対象としては、組織試料又は細胞を含む生物学的材料であり得る。
MRI用造影剤には、前記の通り陽性造影剤及び陰性造影剤の2種類が存在している。
本発明のMRI用造影剤は、ナノ粒子の安定性が高く、後記実施例4に示すように、溶液中において、室温又は4℃で長期間凝集することなく保存可能であることが確認されている。また、生物に対して毒性が低く、長期的かつ連続的な生体への適用も可能である。
本発明は、前記式(2)で示される(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウム、及びそのナノ粒子製造のための使用にも関する。
一実施形態において本発明に係る化合物は、Fe、Gd及びMnから選択される金属及びその金属誘導体ならびにそれらの組み合わせを材料とするナノ粒子における、コアとなる金属粒子と結合するリガンドとして用いることができる。金属誘導体としては、酸化物、窒化物、炭化物及び硫化物が挙げられる。例えば、金属粒子と、化合物とは、該金属粒子表面の金属原子と、酸素原子とで配位結合によって結合する。
本発明の別の態様の化合物としては、上記式(4)で表される化合物において、nが1、2又は4である、好ましくはnが2又は4である、さらに好ましくはnが4である、化合物である。
上記の課題を解決するために、本発明は、以下の何れかの一態様を包含する。
<1>酸化鉄を含有する金属粒子と、上記金属粒子表面の金属原子と結合した式(3)で表されるリガンドと、を含むナノ粒子。
<2> 上記<1>に記載の金属粒子表面の金属原子と結合したリガンドが下記式(1)で表されるリガンドである、上記<1>に記載のナノ粒子。
<3> 上記式(3)中、上記mが1、2又は4である、上記<1>に記載のナノ粒子。
<4>上記酸化鉄を含有する金属粒子が、酸化鉄粒子である、上記<1>〜<3>のいずれかに記載のナノ粒子。
<5>上記金属粒子の平均粒子径が5nm以下である、上記<1>〜<4>のいずれかに記載のナノ粒子。
<6>上記金属粒子の平均粒子径が4nm以下である、上記<5>に記載のナノ粒子。
<7>上記金属粒子の平均粒子径が3nm以下である、上記<5>に記載のナノ粒子。
<8>上記<1>〜<7>のいずれかに記載のナノ粒子を含む、磁気共鳴イメージング用造影剤。
<9>陽性造影剤である、上記<8>に記載の磁気共鳴イメージング用造影剤。
<10>上記<2>に記載のナノ粒子を製造するための、(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウムの使用。
<11>(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウム。
<12>酸化鉄を含有する金属粒子と、
上記金属粒子表面の金属原子と結合した式(1)で表されるリガンドと、
を含むナノ粒子。
<13>上記酸化鉄を含有する金属粒子が、酸化鉄粒子である、上記<12>に記載のナノ粒子。
<14>上記金属粒子の平均粒子径が5nm以下である、上記<12>又は<13>に記載のナノ粒子。
<15>上記<12>〜<14>のいずれかに記載のナノ粒子を含む、磁気共鳴イメージング用造影剤。
<16>陽性造影剤である、上記<15>に記載の磁気共鳴イメージング用造影剤。
<17>上記<12>〜<14>のいずれかに記載のナノ粒子を製造するための(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウムの使用。
<18>(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウム。
以下のスキーム1に沿って、本発明のリガンド化合物である(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウム(DDSA;スキーム1の化合物3)を合成した。
下記のスキーム2に記載の手順で、平均粒径1.8nmの酸化鉄ナノ粒子(SNP)をコア粒子とするDDSAで被覆されたナノ粒子(SNP−DDSA)を製造した。
塩化鉄(III)にオレイン酸(OA)を添加してオレイン酸と鉄イオンとからなる錯体(FeOA3)を製造する工程である。
FeOA3にオレイルアルコールを反応させて表面がオレイン酸で被覆された酸化鉄粒子(SNP−OA)を製造する工程である。
上記工程(b)において得られたSNP−OAの表面に被覆されたオレイル酸を2−メトキシエトキシエトキシ酢酸(MEEA)で置換し、親水性リガンドで被覆されたナノ粒子(SNP−MEEA)を製造する工程である。
<工程(d)>
上記工程(c)で得られたSNP−MEEAと、(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウム(DDSA)を反応させ、酸化鉄粒子がDDSAで被覆されたナノ粒子(SNP−DDSA)を製造する工程である。なお、ナノ粒子(SNP−DDSA)において、酸化鉄粒子表面に被覆したDDSAリガンドは以下の式(1)の構造を有している。
SNP−MEEA溶液1mLに、リガンド化合物としてDDSA 85mgをAr雰囲気下で加え、50℃で12時間撹拌した。その後、室温まで温度を下げたあと、20mLのアセトンを加え、5800rpmで3分間遠心し、上澄みを除去した。得られた沈殿をリン酸緩衝液(phosphate buffered saline、PBS)2mL中に分散させた。得られた溶液をAmicon Ultra centrifuge 3K filter(Merck Millipore、以下3K filterと略記する)を用い、8000rpmで30分ほど遠心し、体積を1/5ぐらいになるまで減らした。そこにまた溶液体積が全量で約2mLになるようにPBSを加え、遠心をした。この操作をFilterから落ちてくる溶液の色が完全に消えるまで、5〜8回程度繰り返して行った。得られた溶液を、1〜1.5mLになるようにPBSで希釈し、SNP−DDSA溶液とした。
上記実施例2で得られた、直径1.8nmの酸化鉄粒子をコアとするナノ粒子、SNP−DDSAを以下の実験に用いた。
T1強調画像
Pulse Sequence : MSME, TR = 400 msec, TE = 10 msec, Slice Thickness = 2 mm, Number of Slice = 1, Matrix Size = 256 × 256, FOV = 38.4 × 38.4 mm2, scan time = 1min 42 sec.
T2測定(マルチエコー・スピンエコー法)
Pulse Sequence : MSME, TR = 15,000 msec, TE = 20 msecを256回繰り返した(maoパルス使用), Slice Thickness = 2 mm, Number of Slice = 1, FOV = 38.4 × 38.4 mm2, Matrix Size = 64 × 64, Scan Time = 16 min 00 sec.
T1測定(反転回復法)
Pulse : SE-RARE, TR = 20,000 sec, TE = 17 msec, NEX = 1, RARE Factor = 4, Numberof slice = 1, slice thickness = 2 mm, FOV = 38.4 × 38.4 mm2, Matrix Size = 64 × 64, 1スキャンにつきScan Time = 21 min 20 sec, Inversion Time = 45, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200, 6400, 8000, 10000, 12000 の11点測定
結果を図2に示す。図2の(a)は、系列的に希釈された、SNP−DDSAのPBS溶液中の緩和時間の測定結果を示す。図2の(b)は、緩和時間をSNP−DDSAの鉄原子濃度に対してプロットした図である。図2の(b)から、T1及びT2がSNP濃度に線形に比例することを確認した。図2の(c)は図2の(b)のプロットの傾きから決定された緩和能r1、r2及びr1/r2の値を示す。
ナノ粒子を用いた造影剤が期待された性能を発揮するためには、それらが溶液中に安定に分散している必要があり、長い期間、高濃度な状態でも分散性を維持していることが望ましい。
<SEC条件>
流速:0.3mL/min
溶離液:PBS
カラム:Shodex KW403-4F
検出器:UV 280nm、PDA 200-650nm
<DLS条件>
装置:Malvern Zetasizer nano
溶液をFeイオン濃度が1mM程度となるように希釈して測定
28日間にわたってSEC及びDLSで観察した結果、4℃及び室温のいずれにおいても、SECでの測定において新しいピークの出現やピークのシフトは起こらず、DLSでの測定においても流体力学半径の分布や平均値にほとんど変化がなかったことから、SNP−DDSAの凝集は確認されず、優れた安定性が確認された。
実施例2で作製したSNP−DDSA(直径1.8nmの酸化鉄粒子をコアとするナノ粒子)を含有する造影剤をラットに投与し、1テスラのMRI装置においてT1強調画像を取得した。測定時の条件を以下に示す。
動物:C57BL/6j jms mouse 雄、体重27.8g
投与ナノ粒子濃度:40mM
投与量:200μL
磁場強度:1T
撮影モード:T1強調(図3〜図5)、MR angiography(血管造影)(図6)
使用装置:1テスラ MRI装置(Bruker Biospin社製 ICON, solenoidコイル)
<1T−MRI>
T1強調画像
Pulse sequence : MSME (Mulch Slice Mulch Echo), Slice Orient = Axial, TE/TR = 10.464 / 400 msec, Field of view = 40 × 40 mm2, matrix size = 256 × 256, Number of Slice = 15, Slice thickness = 1 mm, Slice Gap = 2 mm, Number of averages = 8, Scan Time = 13 min 39 sec
<MR血管造影>
Pulse sequence : FLASH (Fast Low Angle Shot), Slice Orient = Axial, TE/TR = 5.954 / 15 msec, Field of view = 28.8 × 28.8 mm2, matrix size = 192 × 192, Number of Slice = 1, Slice thickness = 1 mm, Number of averages = 32, Scan Time = 1 min32 sec
なお、画像は1スライス(Slice)を、3箇所に分けて撮像した(一度に撮像すると、血液の信号が低下するため。)。
図3の(a)は、実施例2のSNP−DDSAを含有する造影剤を投与したマウスの膀胱における投与前(pre)、投与直後(post)、投与後30分(30min)、投与後3時間(3h)の経時的なMRI測定結果の画像を、図3の(b)は、実施例2のSNP−DDSAを含有する造影剤を投与したマウスの膀胱における投与前(pre)、投与直後(post)、投与後1時間(1h)、投与後2時間(2h)の経時的なMRI測定結果の画像を、それぞれ示す。投与直後から造影剤を含む尿が溜まっていくのが観察されたことから、本造影剤は、腎臓から尿排泄されていることが示された。
以下のスキーム3に沿って、前記式(4)のnが4である本発明の別の態様のリガンド化合物である(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(4−スルホナートブチル)アンモニウム(C4−DDSA;化合物6)を合成した。
MASS(ESI+):290
MASS(ESI+):318
MASS(ESI+):290
1H NMR (DMSO-d6) δ ppm 1.36 - 1.57 (4 H, m) 2.32 - 2.41 (2 H, m) 3.41 - 3.48 (6 H, m) 3.69 - 3.86 (2 H, m) 6.86 (1 H, d, J=8.8 Hz) 7.07 (1 H, dd, J=8.8, 3.1 Hz) 7.23 (1 H, d, J=3.1 Hz) 9.57 (1 H, br s) 9.80 (1 H, br s)
下記スキーム4に記載の手順で、酸化鉄ナノ粒子(SNP)をコア粒子とするC4−DDSAで被覆されたナノ粒子(SNP−C4−DDSA)を製造した。
塩化鉄(III)にオレイン酸(OA)を添加してオレイン酸と鉄イオンとからなる錯体(FeOA3)を製造する工程である。当該工程は前記スキーム2中の工程(a)に従い行うことができる。
FeOA3にオレイルアルコールを反応させてSNP−OAを製造する工程である。
上記工程(b)において得られたSNP−OAの表面に被覆されたオレイル酸をMEEAで置換し、SNP−MEEAを製造する工程である。
<工程(d)>
上記工程(c)で得られたSNP−MEEAと、C4−DDSAを反応させ、酸化鉄粒子がC4−DDSAで被覆されたナノ粒子(SNP−C4−DDSA)を製造する工程である。なお、ナノ粒子(SNP−C4−DDSA)において、酸化鉄粒子表面に被覆したDDSAリガンドは以下の式(5)の構造を有している。
C4−DDSA(250mg)を加熱しながら水(3.3mL)に溶解し、炭酸水素ナトリウム(50mg)を加えた。この溶液を上記工程(c)で得られたSNP−MEEAに加え、更に、DMF(6.7mL)を加え、50℃で終夜攪拌した。室温まで放冷後、水(1.5mL)及びアセトン(60mL)を加え、2つに分け、それぞれ7800rpm、10℃で10分間遠心し上澄みを取り除いた。得られた沈殿をPBSに分散させ、Amicon Ultra centrifuge 100K filter(Merck Millipore)を用い、5800rpm、10℃で30分間遠心した。これに更にPBSを加え、遠心した。この操作を後3回行った。得られた濾液をAmicon Ultra centrifuge 10K filter(Merck Millipore、以下10K filterと略記する)を用い、5800rpm、10℃で30分間遠心した。これに更に水を加え、遠心した。この操作を後3回行った。濃縮液をYMC Duo-Filter(XQ DUO 15, ポアサイズ0.2μm)で濾過し、凍結乾燥して、SNP−C4−DDSA(10K)を得た(1.9mg)。10K filterの濾液を、3K filterを用い、5800rpm、10℃で1時間遠心した。これに更に水を加え、遠心した。この操作を後8回行った。濃縮液をYMC Duo-Filterで濾過し、凍結乾燥して、SNP−C4−DDSA(3K)を得た(0.5mg)。なお、SNP−C4−DDSAの後ろの(10K)及び(3K)は最後に用いたフィルターの種類を示す。
Claims (11)
- 酸化鉄を含有する金属粒子と、
前記金属粒子表面の金属原子と結合した式(3)で表されるリガンドと、
を含むナノ粒子。
- 請求項1に記載の前記金属粒子表面の金属原子と結合したリガンドが下式(1)で表されるリガンドである、請求項1に記載のナノ粒子。
- 前記式(3)中、前記mが1、2又は4である、請求項1に記載のナノ粒子。
- 前記酸化鉄を含有する金属粒子が、酸化鉄粒子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のナノ粒子。
- 前記金属粒子の平均粒子径が5nm以下である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のナノ粒子。
- 前記金属粒子の平均粒子径が4nm以下である、請求項5に記載のナノ粒子。
- 前記金属粒子の平均粒子径が3nm以下である、請求項5に記載のナノ粒子。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のナノ粒子を含む、磁気共鳴イメージング用造影剤。
- 陽性造影剤である、請求項8に記載の磁気共鳴イメージング用造影剤。
- 請求項2に記載のナノ粒子を製造するための、(3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウムの使用。
- (3,4−ジヒドロキシフェニル)(ジメチル)(3−スルホナートプロピル)アンモニウム。
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