CN110505889A - 包括硅酸锰纳米颗粒的诊断成像肝组织特异性造影剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诊断成像的硅酸锰肝肿瘤特异性MRI造影剂以及使用MRI造影剂来表征肝组织的方法,该造影剂在酸性条件下释放锰离子(Mn2+)。在相对短的时间段内,根据正常肝组织和病变肝组织(尤其是肝肿瘤)中的诸如血管分布、细胞密度、线粒体活性、肝细胞亲和力等的组织特异性,T1加权成像显示出不同的图案,通过分析这样的T1加权成像,本发明允许在适当的时间检测肝肿瘤的疾病特异性特性。基于组织特异性,预期本发明非常有效地用于区分并诊断肝肿瘤的类型或者用于确定治疗效果,并且进一步有助于诊断除肝脏之外的器官中发生的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于肝组织成像诊断的造影剂,更具体地,涉及一种包括在酸性条件下释放锰离子(Mn2+)的硅酸锰的用于肝癌特异性成像诊断的造影剂,或者更具体地,涉及一种用于肝肿瘤特异性成像诊断的MRI(磁共振成像)造影剂。
背景技术
造影剂(contrast agent)在磁共振成像(MRI)中的作用在于用于通过增强对病变的检测能力或者利用器官或病变的造影增强(contrast enhancement)来表征病变以改善诊断或鉴别诊断的能力。目前,因为顺磁性Gd3+螯合物类造影剂是一种基于血管分布的差异的非特异性细胞外液(extracellular fluid,ECF)造影剂,所以顺磁性Gd3+螯合物类造影剂广泛用于肝脏MRI。在它们之中,被称为肝脏特异性(liver-specific)造影剂的Gd-EOB-DTPA仅在肝细胞中被吸收,并且具有肝胆排泄物被排到胆管树中。然而,使用ECF的MR成像需要诸如快速图像采集和精确启动时间的困难条件。另外,将预期出现由于去螯合的Gd3+离子引起的肾源性系统性纤维化的可能性。另外,已经开发出诸如SPIO(superparamagneticiron oxide,超顺磁性氧化铁)和MnDPDP(mangafodipir trisodium,锰福地吡三钠)的造影剂以克服ECF的问题,但是由于目前的各种问题很少使用它们。
SPIO是优先被库普弗细胞(Kupffer cell)吸收的纳米颗粒,库普弗细胞是构成肝脏的细胞之一。在MRI成像方面,因为SPIO仅降低包括库普弗细胞的正常肝脏中的T2加权图像的信号强度,所以SPIO用作T2造影剂。在库普弗细胞中被吸收的方面,SPIO可以是肝脏特异性造影剂。然而,因为SPIO不影响肝癌的信号强度,所以SPIO具有对肝肿瘤的特性无鉴别诊断的关键缺点。
静脉施用的MnDPDP通过血流中的Zn2+离子被金属迁移,并释放游离的Mn2+离子。血流中的Mn2+离子被包括肝脏的各种器官吸收,并对T1加权图像增加T1信号强度。因此,MnDPDP是T1造影剂。被肝脏吸收的MnDPDP同时被肝细胞和肝肿瘤吸收,但MnDPDP根据肝肿瘤的特性会看起来更白(高信号强度)、更暗(低信号强度)。由于MnDPDP也在肝细胞中被吸收,因此在肝细胞与肝肿瘤之间不容易区分,导致因对肝癌检测的问题而逐渐不被使用。换言之,MnDPDP具有被吸收到肝细胞中并释放到胆管中的肝胆分泌物。然而,MnDPDP也被所有器官的细胞以及肝细胞吸收,并且没有对此进行充分研究。因此,将MnDPDP称为肝脏特异性造影剂是有局限的。
当前使用的Gd3+类造影剂在肝癌的检测和表征方面具有高精度,但是诸如释放的Gd3+离子的临床毒性(例如,肾源性系统性纤维化)和环境污染等的问题正在出现。能够对Gd3+类造影剂进行补充的Mn2+类造影剂(MnDPDP)由于低毒性而已经是安全的,但是在根据癌症的特性来区分各种肝癌方面存在限制。
尽管存在上面提及的MnDPDP的问题,但本发明人已经认识到与Gd3+类造影剂相比毒性较小的T1造影剂的需求并对其进行了开发(参见第10-2016-0023963号韩国专利公开)。然而,由于从库普弗细胞释放的Mn2+速度缓慢,因此它具有获得肝癌图像相对长时间的缺点,并且尚未研究根据肝癌的特性用于鉴别诊断的可能性。
因此,用于成像诊断的MRI造影剂必须根据癌症特性进行鉴别诊断。迫切需要开发能够快速获取具有这种鉴别诊断特性的图像的肝癌特异性MRI造影剂。
发明内容
【技术问题】
本发明人具体发现了硅酸锰纳米颗粒的Mn2+离子的释放和弛豫性质以及T1加权图像,并且基于如下内容完成了本发明:释放锰离子(Mn2+)的硅酸锰纳米颗粒(诸如,中空硅酸锰(HMS)纳米颗粒)或者氧化锰核和二氧化硅壳的结构具有低毒性、快速造影效果并且能够通过不同T1加权图像的图案在肝癌类型之间区分。
具体地,包括氧化锰核和二氧化硅壳的纳米颗粒中的MnO核在低pH条件(pH 4-5)下易于溶解,并且由于库普弗细胞的细胞内条件处于pH条件,因此作为反应性和肝脏特异性MRI造影剂是有用的。通过在酸性条件下释放Mn2+离子,造影剂可以增强位于正常肝组织中的库普弗细胞对癌性病变的造影。
在本发明人的先前研究中,Mn2+掺杂的二氧化硅纳米颗粒被用作造影剂。作为本发明的一种硅酸锰纳米颗粒的中空硅酸锰(HMS)在低pH下释放游离的Mn2+,但是硅酸锰纳米颗粒的释放速率受纳米颗粒的结构控制,并且中空硅酸锰(HMS)的Mn2+释放速率比Mn2+掺杂的二氧化硅纳米颗粒快得多,从而在静脉注射造影剂之后的早期阶段表现出肝脏的不同T1加权MRI成像。
在具有氧化锰核-二氧化硅壳结构的纳米颗粒的情况下,可以通过调节纳米颗粒中二氧化硅壳的厚度和/或孔隙率来控制Mn2+的释放,可以通过调节Mn2+向颗粒外的释放来控制造影增强时间。
T1加权MRI的造影增强图案的差异可以为肝肿瘤的病理特征提供有价值的诊断信息,并区分原发性恶性肿瘤与转移性肿瘤和肝肿瘤类型。本发明人已经发现,通过在调节低pH条件下Mn2+释放的速率的情况下制备一系列pH反应性MnO二氧化硅纳米颗粒并且基于病理特征和血管生成来测量不同肿瘤模型之间T1加权MRI的各种变化,确定了为病变检测和表征设计的NP(纳米颗粒)的优化释放速率。
在下文中,将详细地描述本发明。
本发明涉及一种用于肝组织的MRI造影剂,该MRI造影剂包含能够在酸性条件下释放锰离子的硅酸锰纳米颗粒,其中,锰离子特异性地积聚在肝组织中,以产生特异性可区分的MRI变化图案。
硅酸锰纳米颗粒被吸收到肝组织的库普弗细胞中以释放锰离子,并且释放的锰离子排到库普弗细胞外并被特异性地吸收并积聚在肝组织中,以产生特异性可区分的MRI变化图案。
从库普弗细胞释放的锰离子的释放速率可以使得锰离子特异性地积聚在肝组织中并且具有在肝组织中产生特异性区分的MRI变化图案的释放速率。
本发明提供一种肝脏特异性MRI造影剂,该肝脏特异性MRI造影剂包括能够特异性地区分肝组织(具体地,肝癌的种类和起源)以及肝癌与正常肝组织的硅酸锰纳米颗粒。
本发明人已经发现,为了区分肝癌的类型和起源,载有被内吞至库普弗细胞的锰离子的纳米颗粒中的锰离子的释放速率和/或释放量是重要的。具体地,纳米颗粒必须瞬间释放过量的锰离子(Mn2+),以特异性地区分肝组织。
本发明的包含硅酸锰纳米颗粒的造影剂可以以锰离子特异性地积聚在肝组织中的释放速率释放锰离子,以在肝组织中特异性地产生MRI变化图案。
根据本发明的优选实施例,可以通过调节纳米颗粒的孔隙率和层厚来控制锰离子的释放速率。
根据本发明的一个实施例,肝脏特异性MRI造影剂可以分析血管分布、细胞密度、线粒体活性或肝细胞亲和力。
根据本发明的实施例,MRI造影剂可以是具有造影增强T1加权类型的T1造影剂。
另外,当使用造影剂时,能够区分肝癌与正常肝组织以及肝癌的类型,并监测肝癌的治疗效果。
可以通过使用本发明的造影剂区分的正常肝组织可以是实质组织,并且肝癌的类型可以包括通常已知的所有种类的肝癌。具体地,肝癌可以包括肝脏的良性癌症、由肝细胞癌的癌变引起的原发性肝癌或者除肝脏之外的器官引起的转移性肝细胞癌。基于参考血管,良性肿瘤包括血管瘤、肝腺瘤和局灶性结节性增生(FNH)等,原发性肝癌包括肝细胞癌(HCC)、胆管癌、肝胚细胞瘤和血管肉瘤等,转移性肝癌包括结肠腺癌(CAC)和小肠神经内分泌癌(SNC)。
根据本发明的优选实施例,硅酸锰纳米颗粒可以具有中空结构。
在本发明中,“中空硅酸锰(HMS)纳米颗粒”具有高锰含量,并且当暴露于诸如吞噬细胞-内体环境的酸性条件时,由于锰的无定形性质可以中断并以大量锰离子释放。因此,硅酸锰纳米颗粒容易从血液中过滤并优先被库普弗细胞吸收,然后大量的Mn2+离子从库普弗细胞释放。释放的Mn2+离子根据癌症的血管分布、细胞密度、线粒体活性或肝细胞亲和力等分布在各种肝组织中。例如,释放的Mn2+离子被吸收并积聚在癌内,因此纳米颗粒具有组织特异性。
根据本发明的实施例,硅酸锰纳米颗粒可以具有氧化锰核-二氧化硅壳结构。
此后,具有氧化锰核-二氧化硅壳结构的纳米颗粒由MnO@SiO2表示。二氧化硅壳保护Mn2+在低pH环境中的立即释放,并改善颗粒在中性pH条件下的分散。
可以通过调节二氧化硅壳的厚度和孔径来控制Mn2+的释放速率。随着二氧化硅壳的厚度增大,释放速率降低,并且随着孔隙率增大,释放速率增大。
本发明涉及一种通过控制氧化锰核-二氧化硅壳纳米颗粒的二氧化硅壳的厚度和孔径来有效地区分肝癌类型的方法。例如,能够提供具有最优结构的纳米颗粒以释放Mn2+,使得肝肿瘤组织与正常肝组织之间的MRI图像变化图案随时间的差异变得清晰或者使得可以在短时间内区分肝癌。
氧化锰核-二氧化硅壳纳米颗粒的二氧化硅壳的厚度优选地为0.5nm至20nm或1nm至15nm,或者更优选地为2nm至12nm。当厚度超过厚度范围的上限时,具有显著降低的Mn2+释放速率和长MRI测量时间的缺点。当厚度小于下限厚度时,Mn2+迅速过度释放,从而使得难以区分肝癌的类型。
根据本发明的示例11,可以看出MRI变化图案随时间的差异是根据肝癌的类型和每种类型的纳米颗粒的时间而产生的,并且在短时间段内仅通过使用具有合适的结构、检测和肝肿瘤类型的合适的纳米颗粒造影剂,可以在短时间内有效地区分肝癌和肝肿瘤类型。
根据本发明的优选实施例,本发明的硅酸锰纳米颗粒中包含0.5wt%至55wt%或15wt%至55wt%或者更优选地19wt%-55wt%或20wt%-47wt%的量的锰离子。当该含量的锰离子包括在纳米颗粒中时,MRI造影剂的造影增强得到改善。
根据本发明的优选实施例,MRI造影剂是pH响应信号增强型,这是本发明的最大特征之一。
更优选地,中空硅酸锰(HMS)MRI造影剂具有0.12s-1·mM-1的r1值,该值是体外中性条件下的特定弛豫度。这表示与游离锰离子的7.8s-1·mM-1的r1值相比,通过不减少水质子的弛豫时间,不影响MR图像的信号强度。另一方面,Mn2+离子从HMS的释放在酸性条件下增加,导致MRI成像的造影增强。根据优选的实施例,酸性条件是pH 2-5.5,或者更优选地为pH3-5。
MRI可以通过测量水分子中氢分子的核自旋弛豫来测量T1和T2图像。MRI造影剂被分为T1造影剂和T2造影剂,并且用于放大T1或T2信号。T1和T2中的每个分别表示MRI中核自旋激发之后的自旋-晶格弛豫时间或自旋-自旋弛豫时间,产生不同造影效果。
根据本发明的优选实施例,本发明的MRI造影剂是T1造影增强MRI造影剂。大体上,与水相比,本发明的MRI造影剂中的顺磁性物质的锰离子显示出明亮或正的造影效果。
本发明的造影剂可以产生在体内条件下随时间变化的MRI疾病特异性变化图案。
本发明中的术语“特异性”表示本发明的MRI造影剂根据体内特定器官或组织的特性以相对大的量积聚或释放。本发明的疾病类型不受具体限制,并且可以是身体器官中的所有疾病,优选地为肝脏疾病。
例如,本发明的MRI造影剂具有肝脏特异性,即它们通过首先仅存在于正常肝组织中的库普弗细胞以纳米颗粒的形式被吸收而在肝脏中大量存在。以Mn2+形式吸收进入肝细胞的过程不能说是肝脏特异性的,但排到胆管中的过程是肝脏特异性的。根据以上所述,当肝肿瘤发生时,本发明的MRI造影剂可以根据肿瘤是否具有肝肿瘤特异性非常有用地应用于诊断肿瘤状态和肿瘤类型。
根据本发明的另一实施例,MRI造影剂在体内条件中引起疾病特异性信号增强。
疾病特异性造影增强也是本发明的最大特征之一,并且表示在注射MRI造影剂期间,肿瘤区域或肿瘤边缘基于肝肿瘤类型的特性(血管分布、细胞密度、线粒体活性、肝细胞亲和力等)显示出差异造影增强。这些特性可以用于通过MR成像区分肝肿瘤的类型或者确定肝肿瘤的治疗效果。
在本发明的一个实施例中,作为制备HMS并查验HMS的锰释放能力和T1造影效果的结果,能够释放的所有Mn2+在酸性条件下立即释放,并且在15分钟内使游离Mn2+离子的浓度最大化(见示例2)。在另一示例中,根据三种类型的肝肿瘤(HCC-原发性、SNC、CAC-转移性)来区分T1加权图像(见示例4)。
在本发明的另一实施例中,制备具有锰核-二氧化硅壳结构的纳米颗粒(MnO@SiO2),并且控制二氧化硅壳的厚度和/或孔径以制备三种类型的MnO@SiO2(HCC-原发性、SNC和CAC-转移性)。当静脉注射每种纳米颗粒造影剂时,获得不同的T1加权图像。
因此,本发明的纳米颗粒根据肝肿瘤的特性表现出不同图案的T1加权图像。具体地,本发明的纳米颗粒可以用于诊断和区分肝肿瘤的类型,或者应用于确定肝肿瘤治疗效果所需的各种目的和用途。
根据本发明的实施例,在施用用于肝组织的MRI造影剂之后获得的MRI移动图像的变化图案可以是MRI图像的亮度变化图案。
当列出沿时间拍摄的MRI图像时,可以随时间判断亮度变化图案。
施用造影剂之后获得的MRI图像随时间的造影增强变化图案可以是这样的:在施用造影剂之后正常肝组织的造影增强变化图案按时间顺序逐渐增亮并且在最大程度地变亮后变暗。特别地,正常肝组织可以是实质组织。
根据本发明的实施例,肝组织可以是肝细胞癌(HCC)。将造影剂施用在正常组织中之后获得的MRI随时间的变化图案中,在施用造影剂之后MRI的亮度随着时间推移逐渐增大并且达到最大亮度,然后变暗。基于正常肝组织中的MRI的变化图案,肝细胞癌可以具有这样的MRI的变化图案:在施用造影剂之后肝细胞癌组织随时间推移保持暗状态,从正常肝组织区域达到最大亮度时开始变亮,并且保持亮状态。
根据本发明的实施例,预期为肝细胞癌的部分显示出这样的MRI的变化图案:在被HMS注射之后,造影从肿瘤周边部分立即不均匀地增强,然后均匀增强以填充中心部分直至24小时。预期的部分可以确定为肝细胞癌。
根据本发明的一个实施例,在肝组织是结肠腺癌(CAC)的情况下,基于正常肝组织中的MRI的变化图案,在施用造影剂之后结肠腺癌组织立即保持黑色状态或比正常肝组织的MRI亮度更暗的状态,然后仅在周边部分中逐渐变亮或变成明亮的圆形,正常肝组织中的MRI的变化图案是这样的:在施用造影剂之后,MRI的亮度随着时间推移逐渐增大并达到最大亮度,然后变暗。
根据本发明的实施例,当被检测为肝肿瘤的部分保持从注射HMS之后的初始阶段至24小时完全相对减少的造影增强时,特异性部分可以被确定为CAC。
根据本发明的一个实施例,在肝组织为小肠神经内分泌癌(SNC)的情况下,SNC显示出在施用HMS之后获得的MRI随时间的变化图案,在该变化图案中,基于正常肝组织中的MRI的变化图案,在施用造影剂之后MRI的亮度随着时间推移逐渐增大,并且保持在比正常肝组织更亮的状态而不变暗,正常肝组织中的MRI的变化图案是这样的:在施用造影剂之后,MRI的亮度随着时间推移逐渐增大并达到最大亮度,然后变暗。
根据本发明的实施例,当被检测为肝肿瘤的部分保持从注射HMS之后的初始阶段至24小时完全相对保持高度造影增强时,特异性部分可以被确定为SNC。
根据本发明的一个实施例,通过将MnO@SiO2纳米颗粒注射到每种癌(HCC、CAC、SNC)中并测量随着时间进程的MRI变化,可以检测并区分肝癌。尽管MRI的变化图案根据MnO@SiO2纳米颗粒的壳厚度和孔隙度在不同的时间间隔内发生,但亮度和暗度的变化图案是癌的公共特性。
根据本发明的示例9的HCC,在静脉施用MnO@5nm-SiO2造影剂之后取得的MRI变化图案中,其中高造影增强在30分钟至1小时内保持并且低造影增强在1小时至24小时内保持的组织部分可以被确定为正常肝组织。当该部分在30分钟至4小时内是暗的(黑色)或仅在周边区域中显示出造影增强,然后在4小时至24小时内显示出高造影增强时,该部分可以被确定为HCC组织。
其中高造影增强在30分钟至1小时内保持并且低造影增强在1小时至24小时内保持的组织部分可以被确定为正常肝组织。
在MnO@8nm-pSiO2作为造影剂的情况下,在静脉施用MnO@8nm-pSiO2造影剂之后取得的MRI变化图案中,当该部分在45分钟至4小时内显示出高造影增强,然后在4小时至24小时内显示出逐渐降低的造影增强时,该部分可以被确定为正常肝组织。在正常肝组织的MRI的变化图案中,当该部分具有这样的变化图案时:该部分在45分钟至4小时内为暗的(黑色),然后在4小时至24小时内造影增强从高增强的外部逐渐扩散到肿瘤内,该部分可以被确定为HCC组织。
在MnO@10m-SiO2作为造影剂的情况下,在静脉施用MnO@10nm-SiO2造影剂之后取得的MRI变化图案中,当该部分在45分钟至8小时内显示出高造影增强,然后造影增强在8小时至24小时内逐渐降低时,该部分可以被确定为正常肝组织。在正常肝组织的MRI的变化图案中,当该部分具有这样的变化图案时:该部分在45分钟至8小时内为暗的(黑色)或者造影增强显示在周边区域中,然后造影增强在8小时至24小时内在整个肿瘤区域中是高的,该部分可以被确定为HCC组织。
根据本发明的示例11的CAC(HT29),在静脉施用MnO@5nm-SiO2造影剂之后取得的MRI变化图案中,当该部分在15分钟至45分钟内显示出高造影增强,然后在1小时至24小时之后显示出逐渐降低的造影增强时,该部分可以被确定为正常肝组织。在正常肝组织的MRI的变化图案中,当该部分在15分钟至24小时内为黑的或仅在周边区域中为亮的时,该部分可以被确定为CAC组织。
在静脉注射MnO@8nm-pSiO2造影剂之后取得的MRI变化图案中,当该部分在30分钟至4小时内显示出高造影增强,然后在4小时至24小时之后显示出逐渐降低的造影增强时,该部分可以被确定为正常肝组织。在正常肝组织的MRI的变化图案中,当该部分在30分钟至24小时内为黑的或仅在周边区域中为亮的时,该部分可以被确定为CAC组织。
在静脉注射MnO@10nm-SiO2造影剂之后取得的MRI变化图案中,当该部分在15分钟至4小时内显示出高造影增强,然后在8小时至24小时之后显示出逐渐降低的造影增强时,该部分可以被确定为正常肝组织。在正常肝组织的MRI的变化图案中,当该部分在15分钟至4小时内为黑的或者仅在周边区域中为亮的,然后在8小时至24小时之后仅在肿瘤的边界区域中显示出造影增强时,该部分可以被确定为CAC组织。
根据本发明的示例12的SNC(STC-1),在静脉注射造影剂MnO@5nm-SiO2、MnO@8nm-pSiO2和MnO@10nm-SiO2中的每种之后取得的MRI变化图案中,在两个部分在15分钟至1小时内不能被区分,但是在4小时至24小时之后一个部分由于逐渐造影增强而变亮的情况下,这一个部分可以被确定为SNC组织。
根据本发明的优选实施例,MRI造影剂以连续的时间顺序引起体内信号强度增强。更具体地,当施用HMS造影剂时,在体内注射之后的0.1小时至5小时在正常肝组织中表现出高信号强度,并且在体内注射之后的6小时至24小时在肝脏疾病组织中表现出高信号强度。
这种时间差信号增强的特性是本发明的最大特征之一,因为被正常肝组织中的库普弗细胞吸收的HMS在酸性内体环境中释放出Mn2+离子,以在注射HMS造影剂之后直至5小时在正常肝组织中表现出高信号强度,但在肝脏病变组织中表现出低信号强度。然后,因为从库普弗细胞外释放并扩散的Mn2+离子被肝脏病变组织吸收,所以在正常肝组织中表现出低信号强度,但在肝脏病变中显示出高信号强度。
换言之,正常肝组织在T1加权图像中发白然后变黑,但肝脏病变组织发黑然后变白。
由于这种时间差的信号增强,可以在一系列单个MRI图片中以反向造影的模式收集清楚地显示肝脏病变组织的双MRI图片,并且可以增加肝脏病变组织的检出率和鉴别诊断的可能性。
本发明的实施例在于提供一种表征肝组织的方法,该方法包括以下步骤:对受试者施用至少一种造影剂;获得通过随着时间对受试者的肝组织连续成像而获得的磁共振图像;以及提取肝组织的磁共振成像的时间变化图案。
因肝组织的特性引起的肝组织的磁共振成像随时间的变化图案与造影剂的上述部分中描述的相同。
另外,本发明的实施例提供一种提供关于肝肿瘤诊断和肝肿瘤类型确定的信息的方法,该方法包括以下步骤:对受试者施用至少一种造影剂;获得通过随着时间对受试者的肝组织连续成像而获得的磁共振图像。
关于肝肿瘤诊断和肝肿瘤类型确定的信息可以是磁共振成像随时间的亮度变化图案。
受试者可以是动物,优选地为哺乳动物,并且可以不包括人。
【发明的效果】
本发明涉及一种用于肝组织的MRI造影剂,该MRI造影剂包括在酸性条件下释放锰离子(Mn2+)的硅酸锰纳米颗粒。本发明涉及一种用于肝组织的MRI造影剂,该MRI造影剂能够抑制血管分布、细胞密度。T1加权图像的图案根据肝肿瘤的组织特性(诸如血管分布、细胞密度、线粒体活性、肝细胞亲和力等)是不同的。通过分析T1加权图像,可以在短时间内检测肝肿瘤的特性,因此预期对于区分肝肿瘤的类型和确定治疗效果非常有用。
附图说明
图1示出了中空硅酸锰(HMS)纳米颗粒的锰释放能力和T1造影增强效果,a)合成的纳米颗粒的TEM图像,b)pH 5柠檬酸(盐)缓冲悬浮液的TEM图像,c)从HMS颗粒释放的Mn2+的量,以及d)T1加权图像。
图2是在将HMS(3mg/kg)静脉注射到肝细胞癌(HCC)模型中后T1加权图像和功能机制的示意图。
图3a示出了代表性的三种类型的肝肿瘤(原发性HCC、转移性SNC(smallintestinal neuroendocrine carcinoma,小肠神经内分泌癌)以及CAC(colonicadenocarcinoma,结肠腺癌))的T1加权图像,具体地,a)HCC模型的图像增强,b)SNC模型的图像增强,c)CAC模型图像的图像增强,图3b示出了详细的图片。
图4示出了通过根据anti-prohibin抗体(或称为抑制素/肿瘤抑制因子抗体)染色使线粒体染色(着褐色)的细胞的分布和活性以及通过根据苏木精染色使细胞核染色(着蓝色)的肝肿瘤类型的细胞密度和囊泡分布。
图5是示出通过快速自旋回声T1加权图像对三种肝肿瘤的血管分布的造影增强效果的图。
图6是示出在使用NADH-四唑(鎓)还原酶染色的肝动脉结扎之后在HAO(肝动脉闭塞)(上)和HCC坏死(下)处获得的T1加权图像的图。
图7是MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)纳米颗粒、MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)纳米颗粒、MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)纳米颗粒的示意图、显微图像以及用于合成MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)纳米颗粒、MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)纳米颗粒、MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)纳米颗粒的成分及其用量。
图8a是分别示出MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)纳米颗粒、MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)纳米颗粒、MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)纳米颗粒的透视图的图以及按照MnO-SiO2-0.5h、MnO-SiO2-2h和MnO-SiO2-12h的顺序Mn2+的增大的释放速率的图。
图8b是示出在pH 5、pH 6、pH 7的条件下随时间流逝Mn2+离子从MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)的释放速率的图。
图8c是示出在pH 5、pH 6、pH 7的条件下随时间流逝Mn2+离子从MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)的释放速率的图。
图8d是示出在pH 5、pH 6、pH 7的条件下随时间流逝Mn2+离子从MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)的释放速率的图。
图8e是示出针对MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)、MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)、MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)的Mn2+离子的释放速率的对比的图。
图9a是示出通过从MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)纳米颗粒、MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)纳米颗粒、MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)纳米颗粒释放的Mn2+离子获得的T1加权图像的造影强度变化的图。
图9b是示出通过使图9a中拍摄的图像的造影强度量化的数值的图。(R1,单位=秒)。
图9c是示出Mn2+离子的浓度与图像的造影强度(R1)之间的关系的图。
图10a示出了在注射之前拍摄的MRI以及在将MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)纳米颗粒静脉注射到HCC肿瘤模型中之后15分钟、30分钟、45分钟、1小时、4小时、8小时、24小时拍摄的MRI。
图10b示出了在注射之前拍摄的MRI以及在将MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)纳米颗粒静脉注射到HCC肿瘤模型中之后15分钟、30分钟、45分钟、1小时、4小时、8小时、24小时拍摄的MRI。
图10c示出了在注射之前拍摄的MRI以及在将MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)纳米颗粒静脉注射到HCC肿瘤模型中之后15分钟、30分钟、45分钟、1小时、4小时、8小时、24小时拍摄的MRI。
图11a至图11e是示出在将MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)纳米颗粒、MnO@8nm-SiO2(MnO-SiO2-2hr)纳米颗粒、MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)纳米颗粒注射到每个器官之后,针对每个器官测量造影增强效果随时间的SNR(小噪声比)值的结果的图:图11a针对肝肿瘤,图11b针对正常肝组织,图11c针对肾,图11d针对脾,图11e针对肠。
图12a是在注射之前拍摄的MRI以及在将MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)纳米颗粒静脉注射到CAC肿瘤模型中之后的15分钟、30分钟、45分钟、1小时、4小时、8小时、24小时拍摄的MRI。
图12b示出了在注射之前拍摄的MRI以及在将MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)纳米颗粒静脉注射到CAC肿瘤模型中之后的15分钟、30分钟、45分钟、1小时、4小时、8小时、24小时拍摄的MRI。
图12c示出了在注射之前拍摄的MRI以及在将MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)纳米颗粒静脉注射到CAC肿瘤模型中之后的15分钟、30分钟、45分钟、1小时、4小时、8小时、24小时拍摄的MRI。
图13a是在注射之前拍摄的MRI以及在将MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)纳米颗粒静脉注射到SNC肿瘤模型中之后的15分钟、30分钟、45分钟、1小时、4小时、8小时、24小时拍摄的MRI。
图13b示出了在注射之前拍摄的MRI以及在将MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)纳米颗粒静脉注射到SNC肿瘤模型中之后的15分钟、30分钟、45分钟、1小时、4小时、8小时、24小时拍摄的MRI。
图13c示出了在注射之前拍摄的MRI以及在将MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)纳米颗粒静脉注射到SNC肿瘤模型中之后的15分钟、30分钟、45分钟、1小时、4小时、8小时、24小时拍摄的MRI。
图14a示出了通过图10a至图10c收集的MRI造影图像。
图14b示出了通过图12a至图12c收集的MRI造影图像。
图14c示出了通过图13a至图13c收集的MRI造影图像。
图15a示出了在将MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)造影剂施用到三种肿瘤模型中的每种之后MRI造影图像随时间流逝的变化。
图15b示出了在将MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)造影剂施用到三种肿瘤模型中的每种之后MRI造影图像随时间流逝的变化。
图15c示出了在将MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)造影剂施用到三种肿瘤模型中的每种之后MRI造影图像随时间流逝的变化。
具体实施方式
在下文中,将描述本发明的优选实施例以便于理解本发明。然而,提供下面的示例仅是为了更容易理解本发明的目的,而本发明不受下面的示例限制。
[示例]
示例1、材料的准备和步骤
1-1、实验材料
使用没有任何纯化的如购买的MnCl2·4H2O(kanto)、油酸钠(TCI)、1-十八碳烯(Aldrich)、 CO-520(Aldrich)、硅酸四乙酯(Acros)、NH4OH(Samchun Chem.)、Ni(NO3)6H2O(Strem)、Cu(NO3)2·3H2O(Strem)、NaBH4(Samchun Chem.)、2-[甲氧基(聚乙烯氧基)-丙基]9-12-三甲氧基硅烷(MPEOPS,Gelest,Inc.)、异硫氰酸荧光素(FITC,Aldrich)以及3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES,Aldrich)。
1-2、HMS(中空硅酸锰)的制备
根据先前报道的技术,通过使MnO@SiO2/Cu2+退火然后选择性地蚀刻Cu@HSNP(中空结构的NP)的外部二氧化硅壳(Kim,J.G.,Kim,S.M.&Lee,I.S.Mechanistic insight intothe yolk@shell transformation of MnO@silica nanospheres incorporating Ni2+ionstoward a colloidal hollow nanoreactor.Small 11,1930-1938(2015))来合成HMS(中空硅酸锰)纳米颗粒(NP)。合成的HMS具有下面的性质;在中空孔(14±2nm)内包括包封的Cu纳米晶体(9±1nm)的HMS(39±2nm)是根据固溶-中空(solid-state-hollowing)从包含结合Cu2+的SiO2纳米球的纳米晶体合成的。
1-3、HMS的释放和弛豫性质
在室温下,在16mL且pH 5和pH 6.2的柠檬酸(盐)缓冲液以及蒸馏水中使用8mg的HMS悬浮液来对锰离子从HMS的释放曲线进行量化。在15分钟、1小时、7小时和20小时时从样品收集4mL的每种HMS悬浮液,并通过以15,000rpm离心10分钟来去除样品的纳米颗粒(NP),并通过使用孔径为0.2mm的注射式过滤器来过滤每种上清液。使用ICP-AES和3.0-T临床MR扫描仪(飞利浦,Achieva版本1.2,飞利浦医疗系统,最佳,荷兰)来对每种上清液中每种释放的锰离子的量和质子的T1弛豫时间进行量化。
1-4、动物模型的准备(原发性HCC、转移性SNC和CAC)
从Orient Bio(首尔,韩国(Seoul,Korea))购买6周龄BALB/C裸鼠(HCC模型为雄性并且转移性癌模型为雌性)。所有动物研究都通过三星生命科学研究所动物实验室使用委员会(Animal Laboratory Use Committee of the Samsung Life Sciences Institute)批准。使用人HCC细胞株(HepG2,韩国细胞株库(Korean Cell Line Bank))来构建HCC模型,使用人CAC细胞株(HT29,ATCC)和小鼠SNC细胞株(STC-1,ATCC)来构建转移性癌模型。将细胞株保持在DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle's medium,STC-1)中,该DMEM培养基包含最小必需培养基(HepG2)、McCoy 5a培养基(HT29)以及10%胎牛血清(Invitrogen)和1%抗生素(ThermoFisher)。将细胞在37℃下在5%CO2中培养并用0.25%的胰蛋白酶/EDTA(ThermoFisher)对其进行回收。将回收的细胞(1×106HepG2、5×106HT29和1×107STC-1)悬浮于10μL包含基质胶(1:1)的HBSS中。在对细胞取样之后,通过经由以O2/N2气体(3:7的比例)的混合物的面罩来施用2%(v/v)异氟烷而使小鼠完全麻醉,而将肝脏暴露于外科手术。将与基质胶混合的细胞缓慢注入肝脏中并闭合切口。在4周至6周之后,使用MR图像来确认肿瘤尺寸。
1-5、MRI成像
通过下面的方法来获得HCC肿瘤、SNC肿瘤和CAC肿瘤的MR图像。通过面罩施用混合有O2/N2气体(3:7的比例)的5%(v/v)异氟烷来使动物麻醉,并通过施用1.5%至2%异氟烷来保持。
使用循环水加热垫将体温维持在36±1℃,并在整个扫描时间期间持续监测呼吸速率。在造影增强之前获得预造影MRI图像之后,经由尾静脉利用静脉注射来输送HMS(每kg体重3mg Mn)。在造影增强之后在3分钟、6分钟、9分钟、15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、12小时、24小时和48小时时收集造影后的MR图像。
此外,从具有HCC肿瘤的小鼠获得脑部和各种器官的MR图像。在获得预造影MR图像之后,执行通过尾静脉静脉注射HMS(每kg体重3mg Mn)以获得MR图像。
使用7T/20MR系统(Bruker-Biospin,Fallanden,瑞士)来执行所有活体内MR成像,7T/20MR系统带有能够在100μs上升时间达到400mT/m的20cm倾斜装置。首先,通过正交音圈(35mm id)以及快速自旋回波(FSE)T1加权MRI序列((重复时间TR)/回波时间(TE)=380/7.7ms,实验序号NEX=3,回波链长度=2,平面内分辨率200×200mm,层厚1mm并且14层)将小鼠肝脏的MR图像用于激发和信号接收。在HMS注射30分钟之后,使用FSE T1加权MRI序列(TR/TE=380/7.7ms,NEX=8,回波链长度=2,平面内分辨率100×100mm,层厚1mm并且14层)以再测量MR图像。
为了获得脑部MR图像,使用鸟笼线圈(72mm i.d.)用于激发,并且使用激活的去耦相位阵列线圈用于信号接收。对FSE T1加权MRI序列(TR/TE=325/7.7ms,NEX=12,回波链长度=2,平面内分辨率100×100mm,12层)执行脑部成像。
1-6、免疫染色(Anti-prohibin抗体)
从癌症动物模型提取肝组织并立即浸固在10%福尔马林溶液中。将浸固的组织制备成蜡块,切割成4μm厚度并固定在载玻片上。将固定在载玻片上的组织脱蜡,然后用antiprohibitin(abcam,线粒体标记物)和苏木精(细胞核染色)对其进行染色。在染色之后,将染色的组织安装在抗染色封固剂上并使用Olympus DP70数字荧光显微镜照相机(Olympus,Melville,NY)使其可视化。
1-7、NADH-四氮唑还原酶染色
从肿瘤动物模型提取肝组织,并且立即将其埋入OCT包埋剂(Optimal CuttingTemperature compound,OCT混合物,Tissue Tek,Sakura,France)中并置于液氮冷却的异戊烷中直至切割。使用冷冻切片机(Thermo Scientific,Kalamazoo,MI)将冷冻样品切割成5μm的尺寸,并滴加0.4mg/mL NADH和0.8mg/mL NBT(4-硝基蓝氯化四氮唑),然后在37℃下反应30分钟至60分钟。洗涤之后,将样品安装在抗染色封固剂上并以与示例1-6的方式相同的方式使其可视化。
示例2、中空硅酸锰(HMS)纳米颗粒的Mn弛豫性质和T1造影增强性质
根据示例1-3来测试示例1-2中制备的HMS的Mn弛豫性质和T1造影增强性质。使用TEM来观察合成的纳米颗粒和从pH 5.0的缓冲溶液分离的纳米颗粒(图1a和图1b)。
如图1c和图1d的结果,当包含19.3wt%的Mn的PEG修饰的HMS浸于pH 5.0的缓冲溶液中时,能够释放的所有Mn2+立即释放,并且在15分钟内增加到游离Mn2+离子的最大浓度。相反,当PEG修饰的HMS浸于pH 6.0的缓冲溶液或者蒸馏水中时,Mn2+离子非常缓慢地释放(图1c)。另外,蒸馏水中的T1加权图像不受HMS影响。然而,当HMS加入到pH 5.0的缓冲溶液时,T1信号强度很快增大,因此,在加入HMS的15分钟之后T1加权图像明亮地显示。
这些结果表明,从HMS流出的Mn2+在酸性溶液中造影增强效果显著。
示例3、HCC中HMS的造影增强图案的评价
首先,将HMS注射到(3mg/kg体重)人肝细胞癌(HCC)模型中,并且在注射HMS之后在0.5小时至24小时内观察,以评价HMS作为用于区分肝肿瘤的造影剂的可能性。
如图2的结果,在注射HMS之后在0.5小时至6小时内观察到明显的造影增强,然后在6小时至24小时内从周边区域到中心区域缓慢地开始变亮,并且坏死区域没有被增强。
可以解释为,这些结果表明,在最初的0.5小时至6小时期间(库伯细胞(Coopercell)摄取期),Mn2+离子从吸收在库普弗细胞中的纳米颗粒释放,然后在6小时至24小时(胆汁释放期)内释放到肝组织中的Mn2+离子被肝细胞吸收并释放到胆汁中,即,离子被肝细胞吸收然后释放到胆汁中。
示例4、在T1加权图像中通过HMS进行造影增强之后肝肿瘤的组织性质的表征(根据血管分布、细胞密度、线粒体活性和肝细胞亲和力的可区分的诊断效果)
基于示例3中的结果,测试示例1-4中制备的三种肝肿瘤模型(原发性HCC、转移性SNC和CAC)的T1加权图像的造影增强图案的差异。
如图3a的结果,在注射HMS之后的24小时期间,HCC模型显示出肿瘤的信号强度从初始阶段直至24小时逐渐增强。小肠神经内分泌癌(SNC)模型显示出肿瘤的信号强度从开始到24小时仍强地保持。CAC(colonic adenocarcinoma,结肠腺癌)显示出肿瘤的信号强度从开始到24小时弱地保持。图3b示出在注射HMS之后直至24小时的类似图案。更具体地,HCC模型显示出在注射HMS之后1小时内造影增强从肿瘤周边变得异质,并且随着均匀增强逐渐填充到肿瘤的中心区域直至24小时。在SNC模型中,肿瘤的周边部分的造影增强程度高于中心部分的造影增强程度,但是增强区域比HCC模型的增强区域大。与HCC模型对比,尽管SNC模型中的肿瘤的造影增强与HCC模型相比略微增大,但是SNC模型中的肿瘤的造影增强强地保持至24小时。最后,在HMS注射后在1小时至24小时内观察CAC模型。与HCC模型或SNC模型相比,CAC模型中的肿瘤的造影增强程度保持为显著降低状态,并且在肿瘤的周边区域中显示出薄带状造影增强。结果,在所有三种肝癌中,肿瘤的造影增强程度在24小时之后降低(如在48小时和5天之后的图像中所示),并且肝实质的造影增强在1小时至3小时之后最强地增加。
结果,当前主要使用的Gd3+类MRI造影剂是用于在注射造影剂之后的短时间内简单地观察到血流分布的动态研究的造影剂。另一方面,该实验的结果显示出,在本发明中使用HMS的造影剂在注射到肝肿瘤中24小时之后显示出根据肿瘤中锰离子的分布观察到的非常不同的造影增强图像。
也就是说,因为HMS具有根据组织特性以及血流分布而获得特性造影增强图案的高可能性,所以预期HMS对肝肿瘤的鉴别诊断具有优异的效果。在这方面,如果HMS增强的MRI成像在每个肿瘤中提供特性特征,则HMS可以被称为疾病特异性MRI造影剂。
示例5、根据通过使用线粒体染色的肝肿瘤的组织特性(血管分布、细胞密度、线粒体活性和肝细胞亲和力)的可区分的诊断效果
锰离子沉积在所有细胞中存在的线粒体中。因此,如果某些器官或疾病中的线粒体活性高,则从HMS释放的锰离子转移到器官或疾病并被大量沉积,从而在T1加权图像中表现出高信号强度。基于示例的结果,为了测试通过HMS的造影增强获得的MRI是否反映了疾病的组织特异性,测量了线粒体活性并示出在图4中。
首先,根据线粒体的分布,HCC模型显示出肿瘤中的染色程度高于肝实质中的染色程度,而CAC模型显示出肝实质中的染色程度高于肿瘤中的染色程度。在这种情况下,染色程度较高的区域包括更多的线粒体。在一些组织中存在更多的线粒体,这表示组织的细胞中线粒体的数量更高或组织中细胞的密度更高。
另外,如通过苏木精染色(细胞核染色)和抗体染色分析血管分布和细胞密度的结果,在HCC模型中,HCC细胞密度高于肝实质的细胞密度。在CAC模型中,在CAC的中心区域中出现大量细胞坏死,并且周边区域处的细胞密度低于肝实质的细胞密度。
在HCC模型中,在HCC中比在肝实质中存在更多线粒体,并且T1加权图像在HCC中比在肝实质中显示出更高的信号强度。相反,在CAC模型中,在肝实质中比在CAC中存在更多线粒体,并且T1加权图像在CAC中比在肝实质中显示出更低的信号强度。在CAC模型中,由于肿瘤细胞紧密或周围正常细胞处于压缩状态而导致该区域的细胞密度高,推测出带状的造影增强。
最后,在SNC模型中,尽管肝实质和肿瘤中的染色程度不高并且没有显著差异,但是与肝实质相比,肿瘤显示出非常高的造影增强程度。这可以推测出SNC模型是在线粒体染色中具有非常高的血管分布的血管性肿瘤。
另外,HCC模型显示出随时间增大的造影增强,但是SNC模型保持相对恒定的高造影增强。在HCC模型中,因为锰离子被吸收到细胞中但是由于肝细胞亲和力的维持而排入胆道(Ni,Y,et al.,Tumor models and specific contrast agents for small animalimaging in oncology,Methods 48,1930-1938(2015)),所以锰离子的浓度逐渐增大。在SNC模型中,因为锰离子仅被吸收到细胞中,并且由于没有肝细胞亲和力而不被排放到胆管中,所以大量的锰离子从初始阶段积聚。
因此,三种类型的肝肿瘤具有各种组织特性,诸如血管分布、细胞密度、线粒体活性以及每个肝肿瘤的肝细胞亲和力,从而在T1加权图像中在特定成像时间提供具有特性造影图像的三种类型的肝肿瘤。
示例6、通过使用FSE T1加权图像的肝脏癌特异性血管分布
基于上述结果,在注射HMS之后3分钟至15分钟获得的快速自旋回声(FSE)T1加权图像显示出对三种类型的肝癌的造影增强效果。
如图5的结果,这些结果表明HMS在该阶段(在注射HMS之后3分钟至15分钟)主要被库普弗细胞吸收,因此在肝肿瘤的造影增强时间造影增强图案出现得更迅速,其中肝肿瘤的造影增强通过释放锰离子而发生。因此,由血管分布引起的造影增强比由初始阶段线粒体活性引起的造影增强反映得多。
更具体地,与注射HMS之后的1小时后获得的图像相比,在该阶段HCC模型和SNC模型中的肿瘤的造影增强图案更多地分布在周边区域中。然而,在CAC模型中,仅观察到带状的弱造影增强,并且肿瘤本身未显示出造影增强。
作为上述结果的结果,预期血管分布可以有助于三种类型肝肿瘤的增强图案,这可用于肝肿瘤的鉴别诊断。
示例7、通过NADH-四唑(鎓)还原酶染色评价肝动脉结扎之后HCC的坏死(细胞死亡)程度
在治疗肝癌的方法之中,TACE是通过阻断血液流向肿瘤并阻断患者的肝动脉来治疗HCC坏死的方法。为了确认HCC模型小鼠肝动脉结扎后肿瘤坏死(细胞死亡)与T1加权图像随时间的HMS信号强度之间是否存在相关性,使用NADH-四唑(鎓)还原酶染色方法来测量活细胞中细胞内线粒体的NADH-脱氢酶活性(Berardi et al.,Neurol Res.2008;30(2):160-9)。
更具体地,解剖HCC模型小鼠的腹壁,并且结扎左肝动脉并闭合腹壁。在2小时和24小时之后对动物施用HMS。在注射HMS 2小时和24小时之后,获得MRI图像。
如图6中示出的结果,在结扎后2小时注射HMS 1小时之后获得的T1加权图像证实肿瘤在周边显示出造影增强。因为肿瘤细胞整体染色的程度比对照组弱,所以发现存活的肿瘤细胞。因此,通过结合染色结果和MRI结果,因为在肝动脉结扎中血流通过肝门静脉供应到肿瘤,并且使用NADH染色对仅存活在供应有血液的区域中的肿瘤细胞染色,因此在T1加权图像中相同的区域显示出造影增强。
另外,在结扎后1小时和4小时注射HMS 1小时之后获得的T1加权图像中,在肿瘤中完全未观察到造影增强,并且不存在用NADH染色染色的细胞,证实了肿瘤完全坏死。
作为总结该结果的结果,预期HMS的线粒体活性可以用于评价HCC的癌细胞坏死(细胞死亡),从而通过评价抗癌治疗后的细胞坏死以及TACE而用于确定治疗效果。
本发明的前述描述是说明性的。本领域技术人员将理解的是,在不改变本发明的精神或基本特征的情况下,可以容易地以其它特定形式修改本发明。
示例8、作为MRI造影剂的MnO@SiO2NP的制备
8-1、MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)的制备以及Mn2+释放时间的测量
(1)MnO@10nm-SiO2(MnO-SiO2-12hr)纳米颗粒的制备
MnO NP用作Mn2+离子源。这些颗粒在中性pH条件(~pH7)下不溶解,并在低pH条件(pH 4~5)下溶解。
首先,为了减小Mn2+从颗粒的释放速率,合成MnO NP(15nm),并使用反胶束乳液模板使合成的MnO NP(15nm)覆盖有二氧化硅壳(图7)。
为了合成15nm MnO纳米颗粒(NP),将1.24g的Mn-油酸络合物分散在10g的1-十八碳烯溶剂中,并且在阻挡氧和湿气的条件下,以5℃/分钟的速率下连同搅拌将溶液加热到300℃。然后,将溶液在300℃下加热1小时,冷却至室温,并将其离心以分离颗粒。用己烷和丙酮洗涤分离的颗粒,并将尺寸为15nm的合成的MnO纳米颗粒分散在环己烷中并储存。
接着,通过使用反胶束乳液模板用二氧化硅壳包围MnO纳米颗粒来获得MnO@SiO2纳米颗粒。具体地,在将20mg的MnO纳米颗粒分散在40mL的环己烷中之后,加入3.2mL的表面活性剂IGEPAL CO-520,并将该混合物搅拌30分钟。此后,以30分钟的间隔依次加入0.3mL的NH4OH溶液和0.8mL的TEOS(硅酸四乙酯)。将溶液搅拌一天后,加入5mL的甲醇以分离水层和有机层。将水层分离并且离心以分离颗粒,用乙醇和水洗涤颗粒以获得被厚度为10nm的二氧化硅壳包围的MnO@10nm-SiO2颗粒。
(2)Mn2+释放时间的测量
二氧化硅壳防止Mn2+在低pH环境中立即释放并且改善颗粒在中性pH条件下的分散。
在室温下使用分散在32mL的pH 5或6的柠檬酸(盐)缓冲液或者蒸馏水中的16mg的MnO@10nm-SiO2的悬浮液来量化Mn2+离子从MnO@10nm-SiO2的释放速率。在0分钟、15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和12小时收集4mL的每种样品,并以15,000rpm离心10分钟,以从悬浮液中获得纳米颗粒(NP)。然后,用0.2μm(微米)孔径的注射式过滤器过滤上清液。通过ICP-AES分析测量过滤的上清液中Mn2+离子的浓度,并使用上清液中Mn2+离子的质量相对于样品中锰的质量来计算Mn2+离子的释放速率。
如图8b中所示,具有厚度为10nm的二氧化硅壳的纳米颗粒在pH 5的柠檬酸(盐)缓冲液中缓慢释放Mn2+,并花费12小时从MnO NP释放80wt%的Mn2+离子。另一方面,在pH 6.0的柠檬酸(盐)缓冲液或pH 7的蒸馏水中仅释放10wt%的Mn2+离子。然后,具有厚度为10nm的二氧化硅壳的MnO@SiO2NP表示为MnO@10nm-SiO2或MnO-SiO2-12hr(图8b)。
8-2、MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)的制备以及Mn2+释放时间的测量
(1)MnO@8nm-pSiO2(MnO-SiO2-2hr)纳米颗粒的制造
为了在较低pH条件下制造比MnO@10nm-SiO2更快地释放Mn2+离子的颗粒,调节二氧化硅壳的孔隙率和厚度。
为了合成具有厚度为8nm的二氧化硅壳的纳米颗粒,将示例8-1中的0.8mL TEOS替换为0.72mL TEOS和0.08mL C18TMS(正十八烷基三甲氧基硅烷)。
接着,为了增大二氧化硅壳的孔隙率,使用有机硅烷(C18TMS,正十八烷基三甲氧基硅烷)作为造孔剂。混合有造孔剂(90vol%TEOS+10vol%C18TMS)的硅烷在二氧化硅壳中产生更多的孔,从而允许溶液渗透到核MnO中。
(2)Mn2+释放时间的测量
二氧化硅壳的增大的孔隙率或减小的厚度使得MnO纳米颗粒更容易暴露于酸性溶液,从而增大Mn2+的释放速率。
如图8c中所示,用造孔剂混合的硅烷包封的MnO@SiO2NP在pH 5.0的柠檬酸(盐)缓冲溶液中在2小时内释放80wt%的Mn2+。然后颗粒被命名为MnO@8nm-pSiO2或Mn-SiO2-2hr。
MnO@10nm-SiO2NP和MnO@8nm-pSiO2NP具有相似厚度的二氧化硅壳,但是由于不同的孔隙率,在pH 5.0的柠檬酸(盐)缓冲液中显示出非常不同的Mn2+的释放速率(图8c)。
8-3、MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)的制造
(1)MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5hr)纳米颗粒的制造
为了在示例8-1的制造方法中减小二氧化硅壳的厚度,在用SiO2涂覆MnO核的工艺期间,仅加入如MnO@10nm-SiO2的二氧化硅前驱体的一半量(0.4mL)的二氧化硅前驱体(TEOS)。纳米颗粒的二氧化硅壳厚度为5nm。
(2)Mn2+释放时间的测量
如图8d中所示,MnO@5nm-SiO2在pH5.0下在30分钟内释放80wt%的Mn2+。此后,颗粒被命名为MnO@5nm-SiO2(Mn-SiO2-0.5hr)。
示例8-2中的MnO@8nm-pSiO2和MnO@5nm-SiO2在pH 6.0的柠檬酸(盐)缓冲液溶液或蒸馏水中仅释放10wt%的Mn2+(图8c和图8d)。对于所有设计的纳米颗粒,用甲氧基封端的PEG用于在水性条件下有效分散。
8-4、肝脏库普弗细胞的在相似pH条件下的释放速率以及纳米颗粒特性的差异比
较
如示例8-1至示例8-3中测量的,在pH 5的柠檬酸(盐)缓冲液条件下针对每个颗粒收集并比较Mn2+离子的释放速率。结果示出在图8e中。
当纳米颗粒注射到体内中(体内条件)时,它们被肝组织中的库普弗细胞吸收。已知库普弗细胞内的pH值为约pH 5。换言之,在该实验中,通过比较在pH 5缓冲液的体外条件下每种颗粒的Mn2+离子的释放速率,预测当颗粒被吸收到库普弗细胞(体内)时每种颗粒的Mn2+离子的释放速率,pH 5缓冲液的体外条件与库普弗细胞的pH条件相似。
8-5、释放的Mn2+离子在T1加权MRI中的造影效果
为了确定从纳米颗粒释放的Mn2+离子对T1加权MRI表现出怎样的造影效果,获得并在图9a中示出在特定时间取得的用于测试示例8-1中的柠檬酸(盐)缓冲液(pH 5.0)的Mn2+离子的释放速率的上清液溶液的T1加权MRI。
根据图9a,MnO-SiO2-0.5h颗粒的Mn2+离子大部分在0.5小时内释放,因此在0.5h至12h表现出几乎相同的造影强度。因为MnO-SiO2-12h颗粒的Mn2+离子的释放速率相对低,所以MRI的造影强度随着时间推移逐渐增大。
拍摄的图像的造影信号强度被数字化(R1,单位=秒(s)),并且示出在图9b的曲线图中。基于图9b几乎与图8e中示出的每种颗粒的Mn2+离子的释放速率的曲线一致,推断释放的Mn2+离子可以增大T1加权图像的造影效果。
接着,Mn2+离子的浓度与图像的造影强度R1之间的关系示出在图9c的曲线中。该曲线的斜率表示为r1,并且针对每种材料是唯一值。确认的是三种颗粒具有范围在7.5~8.2内的相似斜率,并且通过与r1值为约7.4的纯Mn2+离子(MnCl2水溶液)相比,再次证实了造影效果因Mn2+离子而增大。
示例9、体内MRI数据
9-1、HCC动物模型的制造
为了测试MRI如何在设计的MnO@SiO2造影剂的不同Mn2+释放速率下怎样变化,发明人将人肝细胞癌(HCC)插入小鼠以制造体内肿瘤模型。具体地,HCC动物模型的制造方法与示例1-4中的方式相同。
9-2、MRI成像
此后,除了使用MnO@5nm-SiO2(Mn-SiO2-0.5hr)纳米颗粒以及在注射纳米颗粒之后在15分钟、30分钟、45分钟、1小时、4小时、8小时和24小时收集MRI图像之外,以示例1-5的相同方法来获得HCC的MRI图像。
9-3、在HCC模型中注射MnO@5nm-SiO2之后的MRI图像变化
根据示例9-2的方法,在HCC模型中注射MnO@5nm-SiO2(MnO-SiO2-0.5h)之后获得的MRI图像示出在图10a中。
(1)正常肝组织的造影变化
如图10a中所示,当将MnO@5nm-SiO2注射到HCC模型(肝实质)中时,一系列T1加权MRI造影增强在30分钟开始并在1小时之后被最大化。1小时之后,肝实质的造影增强逐渐减少,并且在8小时之后完全恢复到预注射水平。
也就是说,通过血管到达肝脏的MnO@5nm-SiO2NP被内吞到库普弗细胞中,并且大部分Mn2+离子在30分钟内释放,因此开始出现造影增强。在1小时之后,Mn2+离子不再从库普弗细胞释放,并且因为肝细胞吸收的Mn2+离子通过肝胆途径释放到胆小管中,所以造影增强降低。
(2)HCC肿瘤组织的造影变化
HCC肿瘤组织在1小时之后从周边区域开始变亮,并且造影增强逐渐移向HCC组织的中心区域(图10)。从注射24小时之后,坏死部分保持不变并且保持暗的造影,而整个HCC组织的造影增大。
HCC肿瘤组织缺乏库普弗细胞并且不直接内吞纳米颗粒。然而,HCC组织的肝细胞具有线粒体活性,因此它们可以吸收从正常组织周围的库普弗细胞释放的Mn2+。因此,HCC肿瘤组织的造影增强开始于肿瘤的外周区域,并且约1小时之后当正常组织中的库普弗细胞释放Mn2+达到最大水平时逐渐变亮,并且随着从围绕肝脏正常组织的实质组织区域扩散和排出的Mn2+向肿瘤组织内,增亮至中心区域。
(3)在MnO@5nm-SiO2造影剂的情况下区分肝脏正常组织与HCC肿瘤组织的标准
因此,可以根据在静脉注射MnO@5nm-SiO2之后随时间获得的MRI图像的造影增强图像的亮度变化图案来区分正常肝组织和HCC肿瘤组织。
正常组织从注射起30分钟至1小时内显示出高造影增强,并且在1小时至24小时内显示出低造影增强。HCC肿瘤组织从注射时间起30分钟至4小时内是暗的(黑色)或仅在周边区域变亮,并且在4小时至24小时内表现出高造影增强。
9-4、在HCC模型中注射MnO@8nm-pSiO2后的MRI变化
根据示例9-2的方法,在HCC模型中注射MnO@8nm-pSiO2之后获得的MRI图像示出在图10b中。
(1)肝实质的造影变化
通过将MnO@8nm-pSiO2静脉内施用到HCC模型获得的MRI图像与从示例9-3中的MnO@5nm-SiO2获得的图像(图10a)没有显著差异。
在正常肝实质中,造影增强在从静脉注射MnO@8nm-pSiO2起30分钟内开始增大,并且在4小时之后达到最大水平。然而,与MnO@5nm-SiO2不同,在8小时之后仍然存在一些造影增强。
与MnO@5nm-SiO2一样,MnO@8nm-pSiO2也逐渐增大正常组织的造影。这是因为通过正常组织内吞的纳米颗粒的Mn2+释放速率高于正常组织的Mn2+释放速率。另一方面,Mn2+在肝细胞中缓慢积累,并且比MnO@5nm-SiO2保持得晚得多。因此,最大造影增强缓慢发生并缓慢降低至预注射水平。
(2)HCC肿瘤组织的造影变化
在HCC肿瘤组织中,造影从注射纳米颗粒起直到1小时才增加,但在4小时之后从肿瘤组织的外周区域开始增加并且逐渐变亮到肿瘤内部直到24小时。
在HCC肿瘤组织的外周区域中造影增强所需的时间由来自MnO NP的Mn2+离子的释放速率确定,所述MnO NP被位于正常组织中的库普弗细胞内吞。由于MnO@8nm-pSiO2以比MnO@5nm-SiO2相对更低的释放速率释放Mn2+离子,因此HCC肿瘤组织周边区域的造影增强表现出比MnO@5nm-SiO2慢。
(3)在MnO@8nm-pSiO2造影剂的情况下区分肝脏正常组织与HCC肿瘤组织的标准
因此,根据静脉注射MnO@8nm-pSiO2之后在45分钟至24小时内造影增强图像随时间的亮度变化的图案,可以区分正常肝脏和HCC肿瘤组织。
正常组织在45分钟至4小时内显示出高造影增强,并且在4小时至24小时内显示出逐渐减少的增强。HCC肿瘤组织在45分钟至4小时内呈现黑色,但在4至24小时内造影增强从外部以高强度逐渐扩散到肿瘤内部区域。
9-5、在HCC模型中注射MnO@10nm-SiO2之后MRI变化
根据示例9-2的方法,在HCC模型中注射MnO@10nm-SiO2之后获得的MRI图像示出在图10c中。
(1)肝实质的造影变化
如图10c中所示,与前两种MnO@8nm-pSiO2造影剂和MnO@5nm-SiO2造影剂不同,通过MnO@10nm-SiO2控制的HCC模型的肝实质之间的一系列T1增强MRI在45分钟之后开始产生造影增强,并且亮度保持在相同水平,直到8小时而没有显著变化(图10c)。在24小时之后,MnO@10nm-SiO2介导的造影增强没有恢复到预注射水平。
(2)HCC肿瘤组织的造影变化
HCC组织整体呈黑色直至4小时,并且在8小时之后出现薄外周形状的造影增强。然而,即使在24小时之后,HCC组织的中心部分的造影增强也没有被扩大。
由于与前两种造影剂相比,Mn2+释放速率在酸性环境下较低,因此MnO@10nm-SiO2即使在库普弗细胞被内吞也显示出较慢的造影增强。由于HCC对Mn2+离子的吸收速率以及Mn2+离子从库普弗细胞释放的速率处于平衡状态,因此在正常组织中由MnO@10nm-SiO2介导的造影增强保持不变。MnO@10nm-SiO2的造影增强在周边区域中显示出三种NP中最慢的。
(3)在MnO@10nm-SiO2造影剂的情况下区分肝脏正常组织与HCC肿瘤组织的标准
因此,根据在静脉注射MnO@10nm-SiO2之后在45分钟至24小时内造影增强图像随时间的亮度变化的图案,可以区分正常肝组织和HCC肿瘤组织。
正常组织在45分钟至8小时内显示出高造影增强,并且在8小时至24小时内显示出逐渐降低的造影增强。HCC肿瘤组织在45分钟至8小时内呈现暗(黑色)或仅在周边区域具有造影增强,并且在8至24小时内在整个肿瘤区域中呈现高造影增强。
示例10、在将造影剂注射到HCC模型中之后长期造影增强的确认
根据示例1-5的相同的方法,将前述示例中合成的MnO@5nm-SiO2造影剂、MnO@8nm-pSiO2造影剂和MnO@10nm-SiO2造影剂中的每个施用到原发性肝肿瘤模型(HCC模型),然后对每个器官的MRI图像测量信号(paravision软件版本5.0,Bruker-Biospin)。随时间测量长期造影增强效果和排放,结果示出在图11a至图11e中。
在正常肝脏中,从施用MnO@5nm-SiO2(Mn-SiO2-0.5hr)起30分钟之后造影明显显著并在45分钟时信号最强,并且在1小时之后逐渐降低。从注射MnO@8nm-pSiO2(Mn-SiO2-2hr)起45分钟之后,造影效果保持,并且最强信号从1小时保持至4小时,然后降低。从注射MnO@10nm-SiO2(Mn-SiO2-12hr)起45分钟之后,出现造影效果,并且造影效果保持直到8小时并且在24小时之后降低(图11a)。
在肿瘤区域中,从施用MnO@5nm-SiO2(Mn-SiO2-0.5hr)之时起1小时之后,正常区域的造影效果降低,1小时之后肿瘤区域的造影效果增加并保持至24小时。从施用MnO@8nm-pSiO2(Mn-SiO2-2hr)之时起4小时之后,正常组织的造影效果降低,然后肿瘤组织的的造影效果增加(图11b)。从施用MnO@10nm-SiO2(Mn-SiO2-12hr)之时起8小时之后,正常区域的造影效果降低,然后肿瘤区域的造影效果保持至24小时(图11b)。
在肾的情况下,在施用造影剂之时起4小时之后,肾中的造影效果在4小时之后增加,这表示在施用造影剂之时起4小时之后Mn2+离子通过肾途径释放。(图11c)。
在脾中未观察到特异性造影效果(图11d)。
在肠中,造影效果在施用MnO@5nm-SiO2(Mn-SiO2-0.5hr)之后至45分钟增加,然后降低。在MnO@8nm-pSiO2(Mn-SiO2-2hr)的情况下,造影效果在施用之时起4小时之后增加,然后降低。在MnO@10nm-SiO2(Mn-SiO2-12hr)的情况下,造影效果在施用之后至1小时增加,然后降低(图11e)。
示例11、选择纳米颗粒以控制Mn2+释放速率并优化肝肿瘤类型的造影
为了控制Mn2+释放速率,本发明人使用示例8中制备的三种MnO2@SiO2NP进行了实验,以确定各种肿瘤模型(HCC、SNC、CAC)的病理学特性和血管的血管生成。为此,获得了体内MRI结果。
11-1、动物模型的制造
为了制造同种异体移植小鼠的肿瘤模型,在实验中使用小肠神经内分泌癌(SNC)和结肠腺癌(CAC)以及肝细胞癌(HCC)作为线粒体不足以及线粒体缺乏的细胞的代表性的非肝细胞转移性肿瘤模型。
具体地,以示例1-4中相同的方式来制备SNC(STC-1)动物模型和CAC(HT29)动物模型。
11-2、在CAC(HT29)模型中注射纳米颗粒之后的MRI变化
根据示例9-2的方法,将MnO@5nm-SiO2、MnO@8nm-pSiO2和MnO@10nm-SiO2分别注射到CAC模型,获得24小时的MRI图像。MRI图像示出在图12中。
(1)MnO@5nm-SiO2注射
图12a中示出了在注射MnO@5nm-SiO2之后获得的图像。根据图12a,正常组织在注射时起15分钟至45分钟内显示出造影增强,造影增强从1小时至24小时逐渐降低,并恢复到注射造影剂之前的水平。
另一方面,在肿瘤组织中,在15分钟至24小时内仅在肿瘤的边缘区域处观察到造影增强。
通过分析MRI图像随时间的变化图案,造影剂可以用于区分正常组织与CAC肿瘤组织。正常组织在15分钟至45分钟内显示出高造影,并从1小时至24小时逐渐降低。肿瘤组织在15分钟至24小时内保持黑色或者仅在周边区域中保持明亮。
(2)MnO@8nm-pSiO2注射
图12b中示出了在注射MnO@8nm-pSiO2之后获得的MRI图像。根据图12b,正常组织在30分钟至4小时内显示出造影增强,并且在4小时之后,造影增强逐渐降低并且在24小时之后恢复到注射造影剂之前的水平。
另一方面,肿瘤组织的造影增强从45分钟开始增加且从肿瘤边缘开始增加,并且形成肿瘤内部的两层,其中内层为黑色而不具有造影增强,直接围绕黑色部分的外层具有一些如同HCC一样向内扩散的造影增强。
通过分析MRI图像随时间的变化图案,造影剂可以用于区分正常组织与CAC肿瘤组织。正常组织在30分钟至4小时内显示出高造影增强,并且在4小时至24小时之后显示出逐渐降低的造影增强。肿瘤组织在30分钟至24小时内保持黑色或者仅在周边区域中保持明亮。
(3)MnO@10nm-SiO2注射
图12c中示出了在注射MnO@10nm-SiO2之后获得的MIR图像。根据图12c,正常组织在15分钟至4小时内显示出造影增强,并且造影增强在8小时至24小时内逐渐降低,并且恢复到造影剂注射之前的水平。
另一方面,在肿瘤组织中,从1小时至24小时仅肿瘤的边缘连续增强。
通过分析MRI图像随时间的变化图案,造影剂可以用于区分正常组织与CAC肿瘤组织。正常组织在15分钟至4小时内显示出高造影增强,并且从8小时至24小时显示出逐渐降低的造影增强。肿瘤组织在15分钟至4小时内呈现黑色或者仅在周边区域中保持明亮,并且在8小时至24小时内仅在肿瘤边界观察到造影增强。
11-3、在SNC(STC-1)模型中注射纳米颗粒之后的MRI图像变化
根据示例9-2的方法,在MnO@5nm-SiO2、MnO@8nm-pSiO2和MnO@10nm-SiO2分别注射到SNC模型中之后,针对24小时获得随时间的MRI图像。MRI图像示出在图13中。
(1)MnO@5nm-SiO2注射
图13a中示出了在注射MnO@5nm-SiO2之后获得的MRI图像。根据图13a,正常组织在15分钟至4小时内显示出造影增强,并且在4小时至24小时内造影增强逐渐降低,并且恢复到造影剂注射之前的水平。
另一方面,肿瘤组织在30分钟至1小时内呈现出与正常组织类似,但在4至24小时内造影增强持续。
通过分析MRI图像随时间的变化图案,造影剂可以用于区分正常组织与SNC肿瘤组织,两种组织在15分钟至1小时内不能很好地被区分,但在4小时直至24小时之后肿瘤组织中的造影增强逐渐出现并且变亮。
(2)MnO@8nm-pSiO2注射
图13b中示出了在注射MnO@8nm-pSiO2之后获得的MRI图像。根据图13b,正常组织在15分钟至1小时内显示出造影增强且没有高强度,并且在4小时至24小时内未观察到造影增强。
另一方面,肿瘤组织在造影剂注射之后15分钟至1小时以较低强度呈现为较暗,但呈现得比正常组织亮,并且在4小时至24小时内以高强度持续变亮。
通过分析MRI图像随时间的变化图案,造影剂可以用于区分正常组织与SNC肿瘤组织,并且在15分钟至1小时内难以清楚地区分正常组织与肿瘤组织。从4小时至24小时,正常组织显示出低造影增强,肿瘤组织显示出高造影增强。
(3)MnO@10nm-SiO2注射
图13c中示出了注射MnO@10nm-SiO2之后获得的MRI图像。参照图13c,正常组织在30分钟至1小时内显示出造影增强且没有高强度,并且在4至24小时内未观察到造影增强。
另一方面,肿瘤组织在15分钟至1小时内显示出低造影增强,但是比正常组织强,并且从4小时至24小时持续增大造影强度。
通过分析MRI图像随时间的变化图案,造影剂能够区分正常组织与SNC肿瘤组织,并且在15分钟至1小时内不容易区分两种组织,但在4小时至24小时内,正常组织显示出低造影增强,而肿瘤组织显示出高造影增强。
11-4、用于筛查HCC、CAC和SNC肿瘤的最优纳米颗粒的测试
SNC模型和CAC模型的造影增强图案仅在正常组织区域中与HCC模型的造影增强图案类似。造影增强在MnO@SiO2纳米颗粒被正常组织中的库普弗细胞吸收时开始,而与Mn2+的释放速率无关。
HCC具有过多的血管、高线粒体活性和特性释放途径。因为HCC的高线粒体活性,所以从库普弗细胞释放的Mn2+的摄取有效地发生在正常细胞周围。另外,因为通过HCC途径的外周排泄也发生在HCC内部,所以观察到周边区域的造影增强比SNC的造影增强慢。
结果,在HCC诊断系统中,MnO@10nm-SiO2是最有效最优的MRI造影剂。当使用MnO@5nm-SiO2时,由于正常组织的快速增强,HCC的MRI在45分钟与1小时之间变暗,从而能够表征。另一方面,正常组织的MRI在24小时之后被恢复,同时HCC的MRI造影被增强,以再次诊断肝癌。
SNC具有许多血管和高线粒体活性,但不具有释放途径。因为高线粒体活性,由库普弗细胞提供的Mn2+被周围的正常组织有效地吸收,但是Mn2+由于没有排泄途径而不断积聚。与HCC相比,这些导致SNC的整体造影增强更快。工程化的MnO@SiO2纳米颗粒被库普弗细胞内吞,并且SNC肿瘤组织和正常组织几乎同时显示出造影增强。因此,具有快恢复率的MnO@5nm-SiO2和MnO@8nm-pSiO2是SNC肿瘤模型系统中最有效的造影剂。
CAC是低血管性的并且不具有线粒体释放途径。由于线粒体缺乏,在整个测量期间摄取Mn2+是无效的。这仅显示出在周边区域中薄层的造影增强。MnO@5nm-SiO2表示正常组织中的最大造影增强,因此观察到CAC部分和正常组织之间的显著造影。另一方面,由于正常组织保持略微改善的造影且在NP注射后1小时之后长时间内没有明显变化,因此MnO@10nm-SiO2可以用于分析慢速程序。
因为Mn2+离子在Mn2+离子从周围正常组织释放后被摄取,所以CAC模型系统显示出比正常细胞更慢的造影行为。由于HCC和SNC的高线粒体活性,使用快速恢复到预注射水平的纳米颗粒有利于肿瘤和正常组织之间的清晰比较。另一方面,在CAC中,由于扩大的造影增强,使用MnO@10nm-SiO2是有利的。
综上,使用设计的MRI造影剂获得的MRI造影增强随时间的变化图案的分析不仅可以区分肿瘤与正常肝组织,而且可以表征和区分体内的肿瘤类型和起源。
Claims (26)
1.一种肝组织特异性磁共振成像(MRI)造影剂,所述肝组织特异性MRI造影剂包括能够在酸性条件下释放锰离子的硅酸锰纳米颗粒,其中,锰离子特异性地积聚在肝组织中,以产生MRI的特异性可区分的变化图案。
2.根据权利要求1所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,硅酸锰纳米颗粒被吸收到肝组织的库普弗细胞中以释放锰离子,并且释放的锰离子排到库普弗细胞外并被特异性地吸收并积聚在肝组织中,以产生在肝组织中被特异性地区分的变化。
3.根据权利要求2所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,从库普弗细胞的外部释放的锰离子的释放速率是这样的:锰离子特异性地积聚在肝组织中,以产生在肝组织中被特异性地区分的。
4.根据权利要求1所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,造影剂产生随时间的MRI变化图案,MRI变化图案在肝组织中被特异性区分。
5.根据权利要求1所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,造影剂分析血管分布、细胞密度、线粒体活性或肝细胞亲和力。
6.根据权利要求3所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,锰离子的释放速率通过调节纳米颗粒的孔隙率和层厚度来控制。
7.根据权利要求1所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,造影剂是用于T1加权MRI的发亮的造影剂。
8.根据权利要求1所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,造影剂将肝肿瘤与正常肝组织区分开。
9.根据权利要求1所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,造影剂将不同类型的肝肿瘤区分开。
10.根据权利要求1所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,造影剂监测肝肿瘤治疗的治疗效果。
11.根据权利要求1所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,硅酸锰纳米颗粒具有中空结构。
12.根据权利要求1所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,硅酸锰纳米颗粒具有包括氧化锰的核和二氧化硅的壳的结构。
13.根据权利要求1所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,基于纳米颗粒的总重量,硅酸锰纳米颗粒包括0.5重量%至55重量%的锰离子。
14.根据权利要求8所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,造影剂产生在体内随时间对疾病有特异性的MRI变化。
15.根据权利要求14所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,MRI变化图案是亮度变化。
16.根据权利要求15所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,施用造影剂后获得的随时间的MRI变化图案在正常肝组织中具有逐渐变亮并且在达到最大亮度后逐渐变暗的图案。
17.根据权利要求15所述的组织肝特异性MRI造影剂,其中,肝组织是肝细胞癌(HCC),并且
施用造影剂后获得的肝细胞癌组织随时间的MRI变化图案具有这样的图案:基于正常肝组织的MRI变化图案,在施用造影剂后肝细胞癌随时间保持暗状态,并且在正常肝组织达到最大亮度时开始变亮,然后保持亮度,所述正常肝组织的MRI变化图案逐渐变亮并且在达到最大亮度后逐渐变暗。
18.根据权利要求15所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,肝组织是结肠腺癌(CAC),并且
施用造影剂后获得的结肠腺癌随时间的MRI变化图案具有这样的图案:基于正常肝组织的MRI变化图案,施用造影剂后CAC随时间保持在暗状态,在比正常肝组织更暗状态下逐渐变亮,或者仅在边缘具有亮圆,所述正常肝组织的MRI变化图案逐渐变亮并且在达到最大亮度后逐渐变暗。
19.根据权利要求15所述的肝组织特异性MRI造影剂,其中,肝组织是小肠神经内分泌癌(SNC),并且
施用造影剂后获得的SNC随时间的MRI变化图案具有这样的图案:基于正常肝组织的MRI变化图案,施用造影剂后SNC随时间逐渐变亮并且保持在比正常肝组织更亮的状态,而不变暗,所述正常肝组织的MRI变化图案逐渐变亮并且在达到最大亮度时逐渐变暗。
20.一种表征肝组织的方法,所述方法包括以下步骤:对受试者施用根据权利要求1至19所述的一种或更多种造影剂;通过随时间对受试者的肝组织连续成像来获得MRI;以及
提取肝组织的MRI的时间变化图案。
21.根据权利要求20所述的表征肝组织的方法,其中,肝随时间的MRI变化图案是MRI的亮度变化图案。
22.根据权利要求20所述的表征肝组织的方法,其中,在施用造影剂后通过随时间对受试者的肝组织连续成像来获得MRI中,正常肝组织具有逐渐变亮并且在达到最大亮度时逐渐变暗的图案。
23.根据权利要求20所述的表征肝组织的方法,其中,肝组织是肝细胞癌(HCC),并且
施用造影剂后获得的肝细胞癌随时间的MRI变化图案具有这样的图案:基于正常肝组织的MRI变化图案,在施用造影剂后肝细胞癌随时间保持在暗状态然后在正常肝组织达到最大亮度时开始变亮,然后保持亮度,所述正常肝组织的MRI变化图案逐渐变亮并且在达到最大亮度后逐渐变暗。
24.根据权利要求20所述的表征肝组织的方法,其中,肝组织是结肠腺癌(CAC),并且
施用造影剂后获得的结肠腺癌随时间的MRI变化图案具有这样的图案:基于正常肝组织的MRI变化图案,施用造影剂后CAC随时间保持暗状态,在比正常肝组织更暗状态下逐渐变亮,或者仅在边缘具有亮圆,所述正常肝组织的MRI变化图案逐渐变亮并且在达到最大亮度后逐渐变暗。
25.根据权利要求20所述的表征肝组织的方法,其中,肝组织是小肠神经内分泌癌(SNC),并且
施用造影剂后获得的SNC随时间的MRI变化图案具有这样的图案:基于正常肝组织的MRI变化图案,施用造影剂后SNC随时间逐渐变亮并且保持在比正常肝组织更亮的状态,而不变暗,所述正常肝组织的MRI变化图案逐渐变亮并且在达到最大亮度时逐渐变暗。
26.一种用于提供关于肝肿瘤的诊断和肝肿瘤的类型确定的信息的方法,所述方法包括以下步骤:对受试者施用根据权利要求1至19所述的一种或更多种造影剂;以及
通过随时间对受试者的肝组织连续成像来获得MRI。
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