CN113633762A - 一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种介孔硅负载SARS‑CoV‑2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法及其应用。介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）具有稳定的物理化学性质，高的药物负载量。将蛋白抗原负载到介孔内，既可以提高疫苗的热稳定性，又可以保护疫苗在体内循环过程中的酶促降解。除此之外，纳米尺度的介孔粒子易被抗原提呈细胞吞噬，可以增强疫苗免疫原性。本发明从S蛋白中筛选出潜在的B细胞主要抗原表位，并负载到MSNs孔内，开发一种新型的、可快速制备的抗SARS‑CoV‑2纳米颗粒候选疫苗的技术方法。制备的纳米颗粒候选疫苗具有良好的生物安全性并可以有效地诱导小鼠产生体液免疫应答，是一个安全有效的潜在候选疫苗。

Description

一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的 制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法及其应用。
背景技术
目前在研的SARS-CoV-2疫苗主要基于灭活或减毒活病毒、蛋白质亚单位、病毒样颗粒(VLP)、DNA/RNA等。
传统的灭活和减毒活病毒疫苗，其制备周期长、工艺复杂、对制备条件与环境要求苛刻。而现代基因工程疫苗，包括DNA/RNA及蛋白/多肽疫苗，尽管可以实现快速制备，但存在体内代谢快，免疫源性低，诱导机体免疫反应能力差等不足。而以纳米颗粒作为载体，负载并递送DNA、RNA或抗原多肽的疫苗制备技术成为解决上述问题重要手段。
介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)具有稳定的物理化学性质，高的药物负载量。将DNA/RNA或蛋白/多肽负载到介孔内，在体外，可以提高疫苗的热稳定性，减少传统疫苗对冷链的依赖，降低运输成本，减少疫苗因暴露于次优温度的失活率。在体内，可以防止疫苗在体内循环过程中的酶促降解。缓释效果还可以延长疫苗作用时间，提高免疫效果。除此之外，纳米尺度的介孔粒子易被抗原提呈细胞吞噬，可以增强疫苗免疫原性。且MSNs合成过程简单，成本低廉，有望实现快速、大量生产。
SARS-CoV-2的S蛋白是一种多功能跨膜糖蛋白，对病毒的粘附、融合和进入宿主细胞起着至关重要的作用。S蛋白通过与血管紧张素转换酶 (Angiotensin-convertingenzyme 2，ACE2)受体结合，从而介导病毒进入细胞。在氨基(S1)和羧基(S2)末端有两个保守结构域。S1负责识别和结合宿主细胞受体，随后S2介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合。因此，S蛋白及其抗原片段是建立疫苗的重要靶点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B 细胞抗原的纳米颗粒的制备方法及其应用，该纳米颗粒候选疫苗以MSNs作为载体，通过负载SARS-CoV-2的S蛋白的B细胞主要抗原表位，制备而成，该候选疫苗是一种安全有效的、方便运输的抗SARS-CoV-2的纳米颗粒候选疫苗。
一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，制备可降解介孔二氧化硅(BMSNs)
分别取0.2g十六烷基三甲基溴化铵，0.176-0.351g磷酸氢二钠溶解在70mL 去离子水中，随后加入11.2-28mL乙醇和0.27mL氨水，在40℃下磁力搅拌30min 后，再依次加入1mL正硅酸乙酯，0.083-0.165g氯化钙，40℃下继续搅拌反应 24h，反应得到的粒子用乙醇和去离子水在8000-10000rpm条件下交替反复洗涤离心3次，收集沉淀，冷冻干燥得粒子，将干燥后的粒子进行煅烧，升温速度1℃ /min，550℃保温6h，得具有孔洞结构的可降解介孔粒子，记为BMSNs粒子；
步骤2，BMSNs对抗原的负载
将BMSNs粒子超声分散于PBS溶液中，加入筛选出的S蛋白B细胞抗原溶液，抗原和粒子按照1：5质量比混合混匀后，置于摇床上摇晃，使粒子和抗原充分接触，摇晃完成吸附24h后，8000rpm下离心8min，用去离子水洗涤2次，去除未吸附的抗原，真空冷冻干燥后得介孔二氧化硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B 细胞抗原的纳米颗粒，记为B@BMSNs。
作为改进的是，可降解介孔粒子(BMSNs)的粒径在50-200nm，孔径在 2.9-4nm。
进一步改进的是，可降解介孔粒子(BMSNs)的粒径为100nm，采用可降解介孔粒子(BMSNs)(BMSNs)作为载体，可酸性降解，安全性高。
作为改进的是，所述S蛋白的B细胞抗原表位的氨基酸的序列如SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6 或SEQ ID No.7中一种或任意几种组合。
作为改进的是，步骤2中摇晃速度为200-300rpm。
上述制备的介孔二氧化硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒在制备治疗新冠病毒药物上的应用。
作为改进的是，所述药物为候选疫苗。
进一步改进的是，所述候选疫苗通过肌肉注射。
有益效果：
与现有技术相比，本发明提供一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法及其应用，具有如下优势：
1、本发明制备的介孔二氧化硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒，即基于BMSNs的SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原递送系统，制备方法简单、快速、成本低廉、安全有效；
2、本发明制备的BMSNs具有较高的比表面积1095m2/g，具有较高的抗原负载量，抗原负载量最高可达203.16mg/g。且制备的BMSNs具有酸性可降解的特性，内吞到细胞内酸性的溶酶体或内吞体内可实现降解，减小在体内由于长时间积聚给正常组织器官带来的副作用；
3、将筛选出的B细胞主要抗原表位负载到可降解介孔二氧化硅(BMSNs)内，制备的BMSNs载体尺寸在100nm左右，BMSNs可高效地将抗原递送到抗原递呈细胞内并释放，提高抗原递送效率；
4、制备的纳米候选疫苗B@BMSNs可诱导小鼠血清产生较高水平的IgG抗体。从S蛋白中筛选出的7种B细胞抗原表位均可刺激体液免疫，产生IgG抗体，均为有效的抗原表位。诱导产生的抗体还能与S1+S2重组蛋白特异性结合，且BS1 多肽诱导的抗体还能与ACE-2产生竞争作用，抑制S蛋白与ACE-2的结合，是功能性的抗体。
附图说明
图1为介孔二氧化硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒，可激起体液免疫反应；
图2为实施例1制备的BMSNs相关性能图，其中，(A)BMSNs透射电镜图， (B)BMSNs氮气吸附脱附等温曲线及孔径分布图；
图3为BMSNs在pH5.0的PBS溶液中降解3天和7天的透射电镜图；
图4为具有相同抗原浓度的B2@BMSNs和B2分别与Raw264.7培养6h后的 CLSM图。红色：B2，蓝色：细胞核，绿色：BMSNs-FITC。
图5为ELISA法检测介孔二氧化硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原在小鼠体血清内产生的IgG抗体水平，其中，(A)S1亚基BS1(B1、B2、B3、B4),(B)S2 亚基BS2(B5、B6、B7)共同为包被抗原
图6为ELISA法检测免疫小鼠血清中IgG抗体水平(A)S1亚基(B1、B2、B3、 B4)，(B)S2亚基(B5、B6、B7)分别为包被抗原；
图7为以S1+S2重组蛋白作为包被抗原,ELISA法检测免疫小鼠血清中的IgG 抗体水平；
图8为以S1+S2重组蛋白为包被抗原，ELISA法检测ACE-2竞争结合S蛋白的能力，(A)1:40倍稀释的小鼠血清和不同浓度ACE-2受体(200ng/ml，40ng/ml， 8ng/ml，1.6ng/ml，0.32ng/ml)竞争结合S蛋白的能力,(B)不同稀释倍数的小鼠血清(倍比稀释：20，40，80，160，320倍)和100ng/ml ACE-2受体竞争结合S蛋白的能力。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细说明，具体实例有助于本发明进行充分的理解和实现，但并不因此对本发明进行限制。本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，可以对本发明进行改良，但均属于本发明的范围。
此处需要说明的是，本发明中所有提及的“介孔硅”均为“介孔二氧化硅”的缩写，不存在其他含义。
实施例1 BMSNs制备
0.2g十六烷基三甲基溴化铵，0.176g磷酸氢二钠溶解在70mL去离子水中，随后加入20mL乙醇和0.27mL氨水。在40℃条件下磁力搅拌30min后，加入1mL 正硅酸乙酯，随后快速加入0.083g氯化钙，40℃继续搅拌反应24h，反应得到的粒子用乙醇和去离子水在8000rpm条件下交替反复洗涤离心3次，收集沉淀，冷冻干燥获得粒子。将干燥的粒子进行煅烧，升温速度1℃/min，550℃保温6h，得具有孔洞结构的可降解介孔粒子。
制备的粒子形貌如图2(A)所示，从图中可以看出，实施例1制备的BMSNs 具有规则的球形形貌，分散性良好，粒径在100nm左右。图2(B)为BMSNs的氮气吸附脱附等温曲线及孔径分布曲线，通过计算得出，BMSNs的BET比表面积为1095m2/g，孔径分布在2.9-4nm。
实施例2
SARS-CoV-2-S蛋白结构分析：从NCBI蛋白质数据库搜索并下载 SARS-CoV-2-S蛋白FASTA序列，并与SARS-CoV刺突蛋白(SARS-CoV-S)进行序列比对，以SARS-CoV-S为模板，通过SWISS-MODEL进行在线同源模建，分析 SARS-CoV-2-S蛋白三维结构。
实施例3
B细胞抗原表位分析与筛选：借助BepiPred 2.0分别分析SARS-CoV-2-S蛋白S1，S2亚基的潜在的连续性B细胞表位(sequential B cell epitopes)，将得分高于0.5以上的表位通过ABCPred进一步分析，结合VaxiJen 2.0分析候选表位的抗原性(antigenicity)，最终从S1亚基中筛选出四种潜在B细胞抗原表位(B1，B2，B3，B4)，统一记为BS1，从S2亚基中筛选出三种B细胞抗原表位 (B5，B6，B7)，统一记为BS2。具体序列如SEQ ID No.1-7所示：
B1：DAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQT(SEQ ID No.1)
B2：PLQSYGFQPTNGVGY(SEQ ID No.2)
B3：STEIYQAGSTPCNGV(SEQ ID No.3)
B4：GPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESN(SEQ ID No.4)
B5：FSQILPDPSKPSKRSFIE(SEQ ID No.5)
B6：SFIEDLLFNKVTLADAGF(SEQ ID No.6)
B7：FGAGAALQIPFAMQMAYRFNGI(SEQ ID No.7)
实施例4 BMSNs对B细胞抗原的负载
用PBS分别配制体积10mL，浓度为0.2mg/mL的7种B细胞抗原(B1-B7，序列如SEQ IDNo.1-7)溶液；分别称量10mg BMSNs粒子加入7种抗原溶液，每种抗原和粒子分别按照1：5质量比混合。充分混匀后，放于摇床上摇晃(200-300rpm)，使粒子和抗原充分接触，吸附24h后，8000rpm离心8min，用去离子水洗涤两次，去除未吸附的多肽。真空冷冻干燥后得到负载抗原的粒子，分别记为B1@BMSNs，B2@BMSNs，B3@BMSNs，B4@BMSNs，B5@BMSNs，B6@BMSNs， B7@BMSNs。其中B1-B4@BMSNs统一记为BS1@BMSNs，B5-B7@BMSNs统一记为 BS2@BMSNs。
实施例5体外细胞内吞实验
体外培养Raw264.7(小鼠单核巨噬细胞),细胞生长至对数期后，1×104个 /孔密度接种至24板中。分别用高糖培养基DMEM配制50μg/mL的B2@BMSNs和具有等量抗原浓度的B2溶液。B2@BMSNs、B2分别与Raw264.7细胞一起培养6h，细胞通过甲醛固定后，用DAPI对细胞核进行染色，样品封片后借助激光共聚焦显微镜(CLSM)观察细胞对样品的内吞情况。
实验结果如图4所示，与纯抗原B2相比，B2@BMSNs组有更多的抗原(红色荧光)被递送至细胞中，表明B2@BMSNs被吞噬效率更高。进而说明BMSNs是良好的抗原递送载体，可以高效率地将抗原递送到细胞内。
实施例6小鼠免疫实验
采购雌性，6-8周BALB/c小鼠，如表1所示，实验分为5组。采用肌肉注射途径，分别于第0d，28d对小鼠进行免疫接种。用PBS配制样品，按照每种多肽1.5μg/只小鼠接种，每次注射200μL(n＝5)。
表1小鼠实验分组
Figure RE-GDA0003274657320000061
实施例7小鼠体液免疫检测
于第二次免疫接种后的第14天，采小鼠静脉血，4000rpm离心10min，取血清。分别用BS1(图5(A))和BS2抗原多肽(图5(B))为包被抗原，加入抗原免疫的小鼠血清(倍比稀释不同倍数：200、400、800、1600、3200、6400、 12800、25600)，通过ELISA法检测小鼠血清中的抗体(IgG)水平。从图5(A) 和图5(B)中可以看出，3组接种抗原多肽的小鼠(BS1@BMSNs、BS2@BMSNs与 BS1/BS2@BMSNs)均产生了高水平的多肽特异性的抗体反应，其中BS1/BS2@BMSNs 组小鼠的特异性抗体反应最强。
这些结果表明，小鼠经负载抗原多肽的纳米颗粒接种后可以激活特异性的体液免疫应答，产生高水平的多肽特异性IgG抗体。
为进一步验证筛选出的7种B细胞抗原(B1-B7)是否均能激活体液免疫应答，分别以B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7为包被抗原，加入抗原免疫的小鼠血清(倍比稀释不同倍数：200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600)，通过ELISA法检测小鼠血清中的抗体(IgG)水平。结果如图6(A)和图6(B) 所示，从图6(A)可以看出，BS1的四种抗原多肽B1，B2，B3，B4均能刺激机体产生体液免疫作用，且四种多肽刺激小鼠产生IgG抗体水平相当。同样地，由图6(B)可知，BS2的三种抗原多肽B5，B6，B7也能刺激机体产生体液免疫反应，产生的IgG水平相当。该结果证实，我们通过生物信息学预测分析并筛选获得的7种B细胞表位均为有效的抗原表位，可以诱导相应的体液免疫应答。
为进一步验证免疫后小鼠血清中的多肽特异性抗体是否具有与SARS-CoV-2 S蛋白特异性结合的能力，以杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备的SARS-CoV-2 S 蛋白胞外区重组蛋白(S1+S2 ECD，His tag)为包被抗原，加入抗原免疫的小鼠血清(倍比稀释不同倍数：200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600)，通过ELISA法检测小鼠血清中的抗体(IgG)水平。
结果如图7所示，从图中可以看出三个实验组小鼠均表现出高水平的特异性抗体反应。其中，BS1/BS2@BMSNs组抗体水平最高，BS1@BMSNs组次之，BS2@BMSNs 相对较弱，这可能和BS1多肽诱导的抗体更易于同暴露在S1亚基头部表面的区域结合，而BS2多肽诱导的抗体较难与隐藏在S2亚基内部的颈部区域结合有关。这些结果表明，接种多肽后诱导产生的抗体具有与SARS-CoV-2 S蛋白特异性结合的能力，因而推测可能具有病毒中和能力。
实施例8
ACE-2竞争结合检测：以S1+S2重组蛋白为包被抗原，加入1:40倍稀释的免疫小鼠血清和不同浓度的ACE-2(200ng/ml,40ng/ml,8ng/ml,1.6ng/ml, 0.32ng/ml)，或者加入不同稀释倍数小鼠免疫血清(20，40，80，160，320)和 100ng/ml ACE-2。通过ELISA法检测ACE-2受体与小鼠血清中的抗体竞争结合 S蛋白的能力。
结果如图8(A)和8(B)所示，从图中可以看出由于BS1多肽诱导的抗体与S1亚基结合，BS1@BMSNs组和BS1/BS2@BMSNs组产生了高效的ACE-2竞争抑制效果。实验结果表明BS1多肽诱导的抗体可以与ACE-2产生竞争作用，抑制S 蛋白与ACE-2的结合，是功能性的抗体。
综上所述，本发明提供了一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法及其应用，所得BMSNs可酸性降解，生物安全性高，具有高的抗原负载量，可以成功地将抗原递送到细胞内部，展现出较高的递送效率。体液免疫分析结果表明该纳米候选疫苗可诱导小鼠血清产生较高水平的IgG抗体。筛选出的7种B细胞抗原表位均可刺激产生IgG抗体，均是有效的抗原表位，诱导产生的抗体还能与S1+S2重组蛋白特异性结合。且BS1多肽诱导的抗体还能与 ACE-2产生竞争作用，抑制S蛋白与ACE-2的结合，是功能性的抗体。该候选疫苗具有良好的生物安全性，且能激起较高水平的体液免疫，是一种安全有效的候选疫苗，具有潜在的应用前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国矿业大学
<120> 一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 1
Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr
20 25
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 2
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 3
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 4
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
1 5 10 15
Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
20 25 30
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 5
Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe
1 5 10 15
Ile Glu
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 6
Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala
1 5 10 15
Gly Phe
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 7
Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala
1 5 10 15
Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
20

Claims (8)

1.一种介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，制备可降解介孔二氧化硅
0.2g十六烷基三甲基溴化铵，0.176g-0.351g磷酸氢二钠溶解在70mL去离子水中，随后加入11.2-28mL乙醇和0.27mL氨水，在40℃条件下磁力搅拌30min后，加入1mL正硅酸乙酯，随后加入0.083-0.165g氯化钙，40℃继续搅拌反应24h，反应得到的粒子用乙醇和去离子水在8000-10000rpm条件下交替反复洗涤离心3次，收集沉淀，冷冻干燥获得粒子，将干燥的粒子进行煅烧，升温速度1℃/min，550℃保温6h，最终得到具有孔洞结构的可降解介孔粒子；
步骤2，BMSNs对抗原的负载
将BMSNs粒子超声分散于PBS溶液中，加入筛选出的S蛋白B细胞抗原溶液，抗原和粒子按照1：5质量比混合；充分混匀后，放于摇床上摇晃，使粒子和抗原充分接触，吸附24 h后，8000 rpm离心8 min，用去离子水洗涤两次，去除未吸附的抗原，真空冷冻干燥后得介孔二氧化硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒，记为B@BMSNs。
2.根据权利要求1所述的介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，可降解介孔粒子的粒径在50-200nm，孔径在2.9-4nm。
3.根据权利要求2所述的介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，可降解介孔粒子的粒径在100nm。
4.根据权利要求1所述的介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述S蛋白的B细胞抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7中一种或任意几种组合。
5.根据权利要求1所述的介孔硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤2中摇晃速度为200-300rpm。
6.基于权利要求1制备的介孔二氧化硅负载SARS-CoV-2 S蛋白B细胞抗原的纳米颗粒在制备治疗新冠病毒药物上的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物为候选疫苗。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述候选疫苗通过肌肉注射。
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