KR20190024849A - 자가 조립형 백신 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항원단백질-양친매성 고분자 중합체가 자가 조립된 면역유도 입자에 관한 것으로, 본 발명의 면역유도 입자를 이용하는 경우 항원 단백질을 단순히 담체에 포함하는 종래의 백신과 비교해서 더 적은 백신의 양으로도 더욱 많은 면역반응을 유도할 수 있고, 바이러스 질환이 감염과 같은 부작용은 배제할 수 있는 효율적인 백신 플랫폼을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 단백질-양친매성 고분자를 포함하며, 자가 조립된 백신 입자 및 상기 자가 조립된 백신 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
백신은 병원체의 감염이 있기 전 인체 내에 인위적으로 병원성이 제거된 불활화 병원체 또는 병원성을 약하게 만든 약독화 병원체를 주입하여 인체의 면역체계를 활성화시킴으로써 인체의 면역세포가 항체를 형성하게 하여, 이후 병원체에 감염되더라도 병원체에 의한 피해를 예방하거나 그 피해를 최소화하여 질병을 예방할 수 있게 해준다.
그러나, 불활성화 또는 약독화 병원체를 이용한 백신은 통증, 발적, 발열, 오한 등과 같은 부장용을 일으킬 수 있고, 면역이 약화된 개체에서는 감염 질환을 유발시키기도 하는 문제가 있다. 또는, 인플루엔자 바이러스의 특이 항원인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니다제(neuraminidase, NA) 성분을 정제한 표면항원백신(surface antigen vaccine)과 같이 정제된 병원체 성분을 이용하는 경우도 있는데, 이 경우 낮은 역가의 면역반응에 의하여 백신의 효과를 기대하기 어려운 문제가 있다.
또한, 인플루엔자 바이러스의 계속적으로 항원 소변이(小變異, antigenic drift)에 백신 항원이 지속적으로 변하는 문제가 있는바, 바이러스 감염의 창궐 초기에 신속하게 백신을 제조할 필요가 있으나, 현재 불활성 또는 약독화 개체를 포함하는 백신은 신속한 생산이 어려워 감염성 질환의 창궐을 막는데 어려움이 있다.
이러한 백신의 단점을 보완하기 위해 다양한 연구가 시도되고 있는데, WO2011-151723호는 액체 조성물 내의 백신 항원의 농도를 증가시키는 방법을 개시하고 있으나, 액체 조성물 상태에서 단백질이 고농도로 존재하는 경우, 단백질의 응집, 분해 등에 의하여, 백신의 효과가 저해되는 문제가 여전히 존재한다.
따라서, 체내 면역반응을 유도하는 효과를 높으나, 개체 내 투여 시 해당 질환의 유발과 같은 부장용은 일으키지 않는, 개선된 백신 제제에 대한 연구는 현재에도 지속적으로 요구되고 있다.
본 발명은 종래 바이러스 백신의 백신 효율이 떨어지는 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 이러한 효율을 개선하여 효율적으로 면역 반응을 유도할 수 있는 면역유도 입자 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 면역유도 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 항원단백질과 양친매성 고분자의 복합체를 포함하는 면역유도 입자로, 상기 항원단백질-양친매성 고분자 복합체의 자가 결합에 의하여 형성되며, 입자의 내부로부터 순서대로 소수성 고분자층, 친수성 고분자층 및 항원단백질층의 구조를 갖는 면역유도 입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역유도 입자를 포함하는 백신용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역유도 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 상기 면역유도 입자를 개체에 투여하여 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 면역유도 입자는 병원체를 포함하지 않고, 항원단백질만을 포함함에도, 입자 당 표면에서 제시하는 항원단백질의 밀도가 높아, 면역 유도 효과가 우수하고, 약독화 병원체 등에 의한 백신의 부작용을 수반하지 않으며, 더욱이, 간단하고 신속한 제조가 가능하여, 바이러스와 같은 감염성 질환을 초기에 제어하는 것을 가능하게 한다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 양친매성 고분자를 합성 과정을 나타내는 모식도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원단백질-양친매성 고분자 자가 조립체에 의한 백신 입자와 양친매성 고분자 표면에 항원단백질이 결합된 입자를 비교하여 나타낸 모식도이다.
도 2a, 2b 및 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 각 단계의 합성 물질의 NMR 피크를 확인한 결과이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 양친매성 고분자의 피크의 변화를 FTIR 분석기로 확인한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 양친매성 고분자 전체 질량 중에서 소수성 고분자의 함량을 달리하여 제조된 나노입자의 현미경 사진이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 면역유도 입자의 전자현미경 사진과, 상기 면역유도 입자의 평균 입자크기의 분포를 분석한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HA 단백질-양친매성 고분자 복합체의 자가조립에 의하여 형성된 면역유도 입자를 현미경 사진으로 확인한 것이다.
도 6a 및 6b은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 개질도에 따른 면역유도 입자의 평균 입경 분포를 나타낸 그래프이다: 6a 오브알부민 개질도에 따른 입자의 크기, 6b: 헤마글루티닌 개질도에 따른 자가 조립 입자의 크기.
도 7a 및 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역유도 입자를 이용한 BCA 분석에 사용된 표준 곡선 및 면역유도 입자를 이용한 BCA 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 면역유도 입자를 이용한 마우스에서 면역 유도능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 면역유도 입자를 이용한 BCA 분석에 사용된 표준 곡선을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 OVA-면역유도 입자를 이용한 항체 유도 반응을 확인한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HA-면역유도 입자의 유도능을 확인한 결과이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원단백질-양친매성 고분자 자가 조립체에 의한 백신 입자와 양친매성 고분자 표면에 항원단백질이 결합된 입자를 비교하여 나타낸 모식도이다.
도 2a, 2b 및 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 각 단계의 합성 물질의 NMR 피크를 확인한 결과이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 양친매성 고분자의 피크의 변화를 FTIR 분석기로 확인한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 양친매성 고분자 전체 질량 중에서 소수성 고분자의 함량을 달리하여 제조된 나노입자의 현미경 사진이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 면역유도 입자의 전자현미경 사진과, 상기 면역유도 입자의 평균 입자크기의 분포를 분석한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HA 단백질-양친매성 고분자 복합체의 자가조립에 의하여 형성된 면역유도 입자를 현미경 사진으로 확인한 것이다.
도 6a 및 6b은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 개질도에 따른 면역유도 입자의 평균 입경 분포를 나타낸 그래프이다: 6a 오브알부민 개질도에 따른 입자의 크기, 6b: 헤마글루티닌 개질도에 따른 자가 조립 입자의 크기.
도 7a 및 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역유도 입자를 이용한 BCA 분석에 사용된 표준 곡선 및 면역유도 입자를 이용한 BCA 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 면역유도 입자를 이용한 마우스에서 면역 유도능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 면역유도 입자를 이용한 BCA 분석에 사용된 표준 곡선을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 OVA-면역유도 입자를 이용한 항체 유도 반응을 확인한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HA-면역유도 입자의 유도능을 확인한 결과이다.
이하에서, 본 발명의 에 대하여 상세히 설명한다.
다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은, 항원단백질과 양친매성 고분자의 복합체를 포함하며, 상기 복합체는 자가 조립된 면역유도 입자를 제공한다.
본 발명에서 "면역유도 입자"란 동물 또는 인간의 내부에서 해당 숙주의 면역체계를 자극하여 체액성 면역 반응 또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 입자를 의미한다. 본 발명의 면역유도 입자는 숙주 개체 내에서 면역 반응을 유도하여, 이후 동일한 항원에 대한 신속한 방어를 가능하게 해, 해당 항원에 의한 질병을 예방하거나 증상의 정도를 낮춰줄 수 있다. 이러한 의미에서 본 발명의 면역유도 입자는 백신으로서 사용될 수 있어, 백신입자와 상호 교환적인 의미로 사용될 수 있다.
본 발명의 면역유도 입자는 항원단백질-양친매성 고분자 복합체의 자가 조립에 의하여 형성되는 것으로, 상기 고분자의 자가 조립에 의하여 입자의 입자의 내부로부터 순서대로 외각을 향해서 소수성 고분자층, 친수성 고분자층 및 항원단백질층의 구조를 갖는다.
특히, 본 발명의 면역유도 입자에서 항원단백질은 입자의 최외각에 형성된다. 상기 항원단백질은 자가 조립입자를 형성하는 양친매성 고분자와 결합된 상태로 면역입자에 포함되기 때문에, 양친매성 고분자 입자 형성 후 그 표면에 항원 단백질을 결합시키는 경우와 비교해서, 보다 많은 양의 항원단백질을 제공할 수 있고, 항원단백질이 입자에 안정적으로 결합되어 있어 백신 제제 등에 포함하는 경우 백신의 안정성을 높여줄 수 있다는 점에서 이점을 갖는다.
종래 약독화 또는 불활성 병원체를 이용하는 경우 일부 개체에서 질병의 감염을 유발하는 문제가 있었으나, 본 발명의 면역유도입자는 특정 항원단백질만 포함하므로 이러한 부작용 가능성을 효과적으로 해결할 수 있다. 다만, 정제된 항원 단백질만 포함하는 백신의 경우, 백신의 효과 자체가 너무 미미하다는 문제점이 있었으나, 본 발명의 경우 하나의 면역입자 표면에서 제시할 수 있는 항원단백질의 양을 현저히 증가시킬 수 있어, 투여된 개체에서 우수한 면역반응을 유도할 수 있다는 점에서 우수한 효과가 인정된다. 본 발명의 일 실시예에서는, 단순 정제된 항원 단백질과 본 발명의 면역유도 입자를 각각 마우스에 주입하여, 면역반응을 유도하고, 생성된 IgM 항체의 양을 확인한 결과, 본 발명의 면역유도 입자를 이용하는 경우 더욱 우수한 항체 형성 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 면역유도 입자는 항원단백질과 양친매성 고분자를 연결하기 위한 링커를 더 포함할 수 있다. 상기 링커를 더 포함하는 경우, 상기 친수성 고분자층과 항원단백질층 사이에 링커층을 더 포함할 수 있다. 상기 링커층은 면역유도 입자에서 항원단백질과 양친매성 고분자 사이에 물리적으로 분리된 공간을 확보할 수 있게 해주며, 상기 물리적 공간에 의하여 본 발명의 면역유도 입자는 입자 안정성이 더 우수해진다.
본 발명에서 링커는 두 개의 물질을 화학적으로 합성하여 연결시킬 수 있도록 양 끝에 반응부위를 가지는 분자를 의미하는 것으로, 본 발명의 링커는 아민기를 가지는 아민계 링커분자 또는 카르복시기를 가지는 링커분자일 수 있다. 상기 아민계 링커분자는 2개의 아민기(NH2)를 가지는 디아민계 링커분자를 모두 포함한다. 바람직하게는 분자의 양 말단에 각각 하나의 아민기를 가지는 디아민계 분자 일 수 있다. 상기 디아민계 링커분자는 일 말단이 항원단백질의 카르복실기와 반응하고, 다른 일 말단이 양친매성 고분자와 반응하여 양친매성 고분자와 항원단백질 복합체를 형성할 수 있다는 점에서, 그 종류에 제한되지 않고 본 발명에 포함될 수 있다. 또한, 카르복시기를 가지는 링커분자는 2개의 카르복시기를 가지는 것 일 수 있다. 카르복시기를 가지는 링커분자를 이용하는 경우 항원단백질의 아민기와 반응하여 링커-항원단백질 결합을 할 수 있다.
일 예로 본 발명의 링커는 헥사메틸렌디아민, 1,4-디아미노부탄(1,4-diaminobutane), 1,8-디아미노옥탄(1,8-diaminooctane), 에틸렌디아민, 1,6-헥산디아민(1,6-hexanediamine), 페닐렌디아민(phenylenediamine), 1,3-프로판디아민(1,3-propanediamine), 1,13-트리데칸디아민(1,13-tridecanediamine), 1,2-에탄디아민(1,2-ethanediamine) 또는 1,5-펜탄디아민(1,5-pentanediamine) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 본 발명의 링커는 헥사메틸렌디아민 일 수 있다.
본 발명의 면역유도 입자가 링커 더 포함하는 경우, 링커로 항원단백질이 표면 모이어티를 개질하는 정도를 조절하여 본 발명 면역유도 입자의 면역 반응 유도능을 조절할 수 있다. 이러한 개질도는 본 발명의 면역유도 입자의 항원성과 안정성에 영향을 미치는바, 다음의 식 1의 조건을 만족하는 경우, 더욱 우수한 면역유도능을 갖는 입자를 얻을 수 있다.
[식 1]
개질도 = {링커의 양 (g) x [116.21 (g/mol) / 링커분자의 단위 몰질량 (g/mol)]} / [항원단백질의 양 (g) x A]
(여기서, A는 517.5 kDA/항원단백질 분자량 (kDA) 이다.)
상기 식 1에서 링커의 양과 항원단백질의 양은 링커와 항원단백질을 반응시켜 링커-항원단백질 결합체를 제조할 때 반응에 첨가시키는 링커와 항원단백질의 양일 수 있다.
본 발명의 면역유도 입자는 상기 식 1에 따른 개질도가 3 미만 인 것 일 수 있고, 또는 2 미만인 것 일 수 있다. 상기 개질도가 3 이상인 경우 입자에 결합된 항원단백질의 항원성이 낮아져 면역 유도 효과가 낮아질 수 있다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 상기 면역유도 입자에서 항원단백질의 개질도는 1/1000 이상 내지 2 미만, 또는 1/500 이상 내지 1.8 이하, 1/100 이상 내지 1.7이하, 1/80 이상 내지 1.6 이하, 1/60 이상 내지 1.5이하, 1/40 이상 내지 1.4 이하, 또는 1/20 이상 내지 1.3 이하 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 범위를 만족시키는 경우, 면역유도 입자의 항원성이 우수하여, 투여 개체에서 우수한 면역반응 유도 효과를 갖는다.
또한, 본 발명의 항원 단백질은 상기 식 1에 따른 개질도가 1/1000 이상인 것 일 수 있다. 상기 개질도가 1/10 미만인 경우 양친매성 고분자와 항원단백질 간의 결합이 줄어들어, 자가조립을 위한 소수성 상호작용(Hydrophobic interaction)이 감소하여 면역유도 입자의 제조 효율이 저하 될 수 있다. 또한, 소수성 상호작용의 감소에 의하여 면역유도 입자의 안정성이 낮아지는 문제가 있다.
본 발명에서, 양친매성 고분자는 친수성을 나타내는 영역과 소수성을 나타내는 영역을 갖는 입자를 의미한다. 양친매성 고분자는 친수성 영역 및 소수성 영역이 있는 입자이기만 하면 제한 없이 이용 가능하다. 양친매성 고분자는 친수성 고분자, 소수성 고분자 및 이들의 조합을 포함한다. 상기 양친매성 고분자는 친수성 고분자와 소수성 고분자의 중합체 형태일 수 있다.
본 발명의 양친매성 고분자는 (친수성 고분자)m-(소수성 고분자)n 형태일 수 있다. 바람직하게는 [식 2] 에서 K는 0.1 내지 0.8, 또는 0.2 내지 0.6, 또는 0.3 내지 0.5를 만족하는 양친매성 고분자 일 수 있다.
[식 2]
K = 친수성 고분자의 중량/양친매성 고분자 전체의 중량
보다 바람직하게, 본 발명의 일 실시예에 따라 상기 중량비가 0.1 내지 0.6인 경우 면역유도 입자의 안정성이 향상된다. 특히 소수성 고분자의 양이 너무 적어지는 경우 자가 조립된 입자 내의 소수성 상호작용이 약해질 수 있어, 상기 범위를 만족하는 것은 중요하다.
한 구체예에서, 상기 친수성 고분자는 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴리아크릴릭애시드(PAA), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아세테이트(PVAc), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 친수성 폴리아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상 및 그 유도체를 포함한다. 상기 유도체는 예를 들어 (모노)메톡시폴리에틸렌글리콜, (모노)아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글루타민, 폴리글루탐산, 폴리트레오닌, 폴리아스파라긴, 폴리아르기닌 및 폴리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직한 예로, 상기 친수성 고분자는 메톡시 폴리에틸렌글리콜(mPEG)일 수 있다.
한 구체예에서, 소수성 고분자는 친수성 고분자와 함께 양친매성 고분자를 형성할 수 있는 물질이면 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 소수성 고분자는 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 소수성 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 일 수 있다. 상기 소수성 폴리아미노산은 폴리루신, 폴리이소루신, 폴리발린, 폴리페닐알라닌, 폴리프롤린, 폴리글리신, 폴리트립토판, 폴리알라닌, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 및 폴리메티오닌으로 이루어진 군에서 하나 이상을 포함한다. 또한 상기 소수성 고분자는 그 유도체를 포함한다.
본 발명의 양친매성 고분자는 친수성 고분자로 mPEG를 소수성 고분자로 락타이드(Lactide, 3,6-Dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione)를 포함하는 mPEG와 폴리 락타이드 공중합체 (mPEG)m-(b-PLA)n 일 수 있다. 이 경우 m은 100 내지 200, n은 30 내지 100 일 수 있다.
본 발명에서 "항원단백질"은 항원에 대한 면역 반응을 유도 또는 증진시킬 수 있는 단백질을 의미하는 것으로, 단백질의 에피토프 부위를 포함하는 단편도 이에 포함된다. 일 예로 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(the Hemagglutinin, HA), 뉴라미니다아제(the Neuraminidase, NA), 핵단백질(the Nucleoprotein, NP), M1 단백질, M2 단백질, NS1 단백질, NS2 단백질(NEP 단백질: 핵 방출 단백질(nuclear export protein)), PA 단백질, PB1 단백질(중합효소 염기성 1 단백질, polymerase basic 1 protein), PB1-F2 단백질 및 PB2 단백질;
광견병 바이러스의 경우에, 핵단백질(N), 인단백질(P), 기질 단백질(M), 당단백질(G), 및 바이러스 RNA 중합효소(L);
B형 간염 바이러스의 경우에, B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg), B형 간염 바이러스 코어 항원(HbcAg), B형 간염 바이러스 DNA 중합효소, HBx 단백질, preS2 중간 표면 단백질(the preS2 middle surface protein), 큰 S 단백질(large S protein), 바이러스 단백질 VP1, 바이러스 단백질 VP2, 바이러스 단백질 VP3, 및 바이러스 단백질 VP4;
로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.
본 발명의 면역유도 입자는 양친매성 고분자와 결합된 나노입자 형태로 면역반응 유도하는 경우, 항원단백질만을 투여하여 면역반응을 유도하는 경우보다 더 낮은 농도에서 더 우수한 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역유도 입자는 양친매성 고분자와 결합 가능한 카르복시기 및 항원 결정부위(에피토프)를 포함하는 항원단백질에 대해서는 그 종류에 상관없이 적용 가능하므로, 본 발명은 항원단백질의 종류에 한정되지 않는다.
본 발명의 면역유도 입자는 복합체의 일 구성인 양친매성 고분자에 의하여 자가 결합(self-assembly)된 것, 즉 양친매성 고분자의 자가 결합에 의하여 입자화 된 것 이다. 따라서, 본 발명의 자가 결합으로 형성된 입자는 고분자 영역(친수성 고분자층, 소수성 고분자층)과 항원단백질 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 자가 조립된 면역유도 입자는 막구조를 갖는 것 일 수 있다.
본 발명에서 "막(membrane) 구조"란 막 또는 쉘(shell)에 의하여 내부가 둘러싸여 있는 구조를 의미한다. 상기 막 구조는 상기 내부에 유체 또는 별도의 구성을 포함할 수 있다. 상기 막은 단일막(single membrane) 또는 단일막이 2 개 이상 존재하는 다중막(multi membrane)을 모두 포함한다. 일 예로, 단일막을 갖는 입자가 다시 하나의 단일막으로 둘러싸인 경우, 다중막을 갖는 입자가 될 수 있다. 상기 단일막 및 다중막은 단일층 및 이중층과 구별되는 개념이다. 구체적으로, 이중층(bilayer) 구조의 막을 하나만 포함하는 입자는 단일막을 갖는 것이며, 단일층(monolayer) 구조의 막을 포함하는 입자를 다시 단일층 구조의 막이 둘러싸고 있는 입자는 다중막 구조의 입자를 의미한다.
본 발명에서 막(membrane) 구조를 갖는 나노입자는 베지클(vesicle), 마이셀(micelle), 폴리머좀(polymersome), 액적(droplet) 또는 콜로이드좀(colloidsome) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 형태적으로 로드(rod), 구, 링(ring), 판(flat), 실린더, 타원형, 구형 등의 형태를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "마이셀(micelle)"은 소수성 코어와 친수성 쉘을 갖는 입자를 의미한다. 한 구체예에서, 상기 마이셀은 고분자 자가 조립 마이셀 일 수 있다. 자가 조립에 의한 마이셀의 경우 공중합체를 형성하는 고분자의 종류에 따라 다양한 형태를 띌 수 있고, 그 형태에 제한을 받는 것은 아니다. 상기 마이셀은 단일층(monolayer)을 2 이상 포함하는 다중막 형태도 포함한다.
상기 "폴리머좀(polymersome)"은 "친수성 영역-소수성 영역-소수성 영역-친수성 영역"을 갖는 2중층 막 구조를 갖는 나노입자를 의미한다. 상기 폴리머좀은 이중층 막구조의 단일막 및 상기 단일막을 2개 이상 포함하는 다중막을 모두 포함한다.
상기 "콜로이드좀"은 1nm 내지 1000nm 크기의 콜로이드상 입자 또는 상기 입차가 치밀하게 패킹된 구조물을 의미한다. 막을 형성하는 친수성 및 소수성 영역의 고분자의 종류에 따라서 단일층 및 이중층을 포함할 수 있다.
상기 "액적(droplet)"은 상기 막 구조 입자 중에서 물방울 모양의 형태를 나타내는 것을 의미한다. 단일층 및 이중층을 포함하고, 단일막 및 다중막을 모두 포함한다.
본 발명의 자가 결합 형태의 면역유도 입자는 단일 항원 단백질 형태의 백신 보다 체내 안정성이 높고, 나노입자에 항원 단백질을 결합시킨 종래의 백신과 비교해서, 더욱 높은 밀도로 표면에 항원 단백질을 제시할 수 있어, 적응 양으로도 우수한 면역반응을 유도할 수 있다.
본 발명은 상기 면역유도 입자를 포함하는 백신용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 면역유도 입자를 포함하는 백신제제를 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 상기 면역유도 입자 외에 용매, 어쥬번트(ajuvant) 또는 부형제 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매는 생리식염수, 증류수 또는 완충액이 있으며, 면역증강제로는 프로인트(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 및 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트(alum)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 공지의 물질을 더 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 비경구형 제제로 제조하는 경우 주사액제로 제조될 수 있고, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강 또는 경막외 경로로 투여할 수 있으나, 상기 제제의 투여 형태에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 면역유도 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 면역유도 입자 제조방법은 양친매성 고분자 및 항원단백질을 혼합하여 복합체를 형성하는 것; 및 상기 복합체를 자가 결합 하여 입자화 하는 것을 포함 할 수 있다.
바람직하게, 친수성 용매 중에 항원단백질을 포함하는 단백질 용액에 소수성 용매 중의 양친매성 고분자를 첨가한 항원단백질-양친매성 고분자 혼합용액을 20 내지 28시간 동안 흔들어 주면서 반응시켜 양친매성 고분자-항원단백질 복합체를 형성하는 것; 및 상기 혼합용액이 항원단백질 포함하는 친수성 용매 중에 소수성 용매가 액적 상태로 존재하는 콜로이드 상일 때 양친매성 고분자-항원단백질 복합체의 자가조립에 의하여 입자화하는 것을 포함하는 면역유도 입자 제조방법일 수 있다.
상기 단백질 용액은 글리세롤을 더 포함할 수 있다. 이 경우 조성물 내의 항원단백질이 서로 응집되는 현상을 막고, 항원단백질-양친매성 고분자 복합체 형성 과정에 단백질이 더욱 안정하게 반응에 참여할 수 있도록 하여 매우 효과적인다.
본 발명은 친수성 용매 중에 항원단백질을 포함하는 단백질 용액에 소수성 용매 중의 양친매성 고분자를 첨가한 이후 소정의 시간 이상 동안 흔들어주어 상기 혼합용액이 친수성 용매를 분산매로 하여 소수성 용매가 분산질로 액적상태로 존재하는 콜로이드 상일 때 입자화하여, 단백질이 최외각층에 형성된 입자를 형성할 수 있다는 점에 특징이 있다. 상기 콜로이드 상에서 혼합용매 내의 소수성 고분자와 항원단백질은 서로 다른 층상에서 계면 결합된 상태일 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 항원단백질-양친매성 고분자 복합체 형성하기 전에 항원단백질을 링커로 개질하는 것을 더 포함 할 수 있다. 상기 링커로 단백질을 개질한 후 복합체를 형성하는 경우 고분자의 모이어티와 링커의 모이어티의 접촉 가능성이 증가하여, 항원단백질-양친매성 고분자 복합체 형성 효율을 높일 수 있다. 상기 개질도는 본 발명의 면역유도 입자를 설명할 때 설명된 [식 1]에 따라서 계산될 수 있고, 상기한 내용은 본 제조방법에도 준용된다.
본 발명의 면역유도 입자는 항원 단백질의 종류에 상관없이, 나노입자 형태로 항원단백질을 제시함으로써, 적은 양으로도 강한 면역반응을 나타낼 수 있어, 백신으로 우수한 효과를 갖는다. 또한, 본원발명의 제조방법에 따르면 항원단백질의 종류에 제한되지 않고 우수한 면역반응 유도 효과를 갖는 면역유도 입자를 제조할 수 있어, 백신의 제조 분야에서 다양하게 사용될 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명은 상기 면역유도 입자를 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체에서 면역반응 유도하는 방법을 제공한다. 상기 면역반응을 유도하는 방법은 개체의 질병 감염 가능성을 낮추거나 이를 예방하기 위한 것이라는 점에서, 질병 또는 감염을 예방하는 것일 수 있다. 상기 투여는 1회 이상 수행될 수 있다.
상기 개체에서 면역반응을 유도하는 방법은 개체에서 면역반응을 유도하는데 약학적으로 유효한 양의 면역유도 입자를 개체에 투여할 수 있고, 이를 통해 개체의 체액성 또는 세포성 면역방응을 유도하여, 목적하는 질병에 대한 감염의 가능성을 낮출 수 있다.
상기 면역반응을 유도하는데 약학적으로 유효한 양은 면역유도 입자의 구체적인 형태, 항원 단백질의 종류, 개체의 나이, 몸무게 등의 신체적 상황을 고려해서 달리 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 면역유도 입자를 마우스에 투여하고, 마우스의 혈액를 분석한 결과, 항원단백질에 대한 IgM 항체의 생산이 효과적으로 유도되었음을 실험적으로 확인하였다. 더욱이, 단순히 정제된 항원 단백질이나, 나노입자의 표면에 항원이 단순 결합된 입자와 비교해서, 더욱 많은 양의 항체가 생산됨을 확인하였는바, 매우 우수한 효능을 갖는 백신 플랫폼으로 이용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.
[
제조예
1]
양친매성
고분자의 합성
본 발명의 항원 단백질과 결합할 양친매성 고분자를 도 1 및 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 생체 친화적 고분자 mPEG(Poly(ethylene Glycol) Methyl Ether. Mw: 2,000)와 락티드(Lactide, 3,6-Dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione, Sigma Aldrich)를 컨쥬게이션 한 다음 개환반응을 통해서 양친매성 고분자 mPEG-b-PLA를 합성하였다.
구체적으로, 3-목 둥근 플라스크(3-neck rounded flask)에 mPEG 1g, Sn(Oct)2 약간(Tin(Ⅱ) 2-ethylhexanoate, Sigma Aldrich), 락티드 그리고 톨루엔 50 mL(anhydrous, Sigma Aldrich)을 넣고, 진공과 N2 퍼지(purge)를 반복적으로 처리한 다음, 120℃에 도달하면 N2 퍼지를 멈추고, 교반(stirring)하였다. 용액이 맑아지는지 확인하여 24시간 동안 반응시켰다. 그 다음, 감압 및 가열하여 상기 생성물 겔 상태 전까지 농축시킨 다음에 DCM(Dichloromethane, Sigma Aldrich) 10 mL를 첨가하였다. 상기 생성물을 디에틸 에테르(Diethyl ether)에 천천히 떨어뜨려 침전시키면서 약 30분 동안 교반한 후 상기 침전물을 감압하여 분리시켰다. 이후 침전 및 감압하여 분리하는 단계를 세 번 반복 한 후, 상기 분리된 물질을 하루 동안 건조하였다.
[반응식 1]
그 다음, 상기 공중합체와 항원단백질을 결합하기 위해서, mPEG-b-PLA의 OH기를 COOH기로 치환하여 mPEC-b-PLA-COOH를 제조하였다. 구체적으로
상기에서 합성한 mPEG-b-PLA 500mg, 숙신산 무수물(succinic anhydride, Sigma Aldrich) 80mg 그리고 DMAP(Sigma Aldrich) 35.7mg를 디클로로메탄(DCM, Sigma Aldrich) 10 mL에 넣고, 트리에틸아민(TEA) 30㎕를 드롭방식으로 첨가하였다. 실온(ambient temperature)에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 차가운 디에틸 에테르를 이용하여 결과물을 침전시키고, 진공건조 하여, mPEG-b-PLA-COOH를 얻었다.
상기에서 합성한 mPEG-b-PLA-COOH를 NHS-sulfo를 이용해서 mPEG-b-PLA-NHS를 합성하였다. 구체적으로, 상기에서 합성한 mPEG-b-COOH 325mg, NHS(Thermo Scientific) 17mg 그리고 DCC(Sigma Aldrich) 21mg를 디클로로메탄(DCM, Sigma Aldrich) 10 mL에 넣고, 트리에틸아민(TEA) 20㎕를 드롭방식으로 첨가하였다. 실온(ambient temperature)에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 차가운 디에틸 에테르를 이용하여 결과물을 침전시키고, 진공건조 하여, mPEG-b-PLA-NHS를 얻었다.
NMR을 통해 합성된 공중합체의 각 과정의 합성여부를 확인 하였다. 하기 도 2a, 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이, PLA 와 PEG의 피크를 공통으로 가지고 있고, 각 작용기의 피크가 생긴 것을 확인할 수 있다.
또한, mPEG와 락티드(Lactide, 3,6-Dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione)의 중합비를 달리하여 (mPEG)m-(b-PLA)n를 합성하고, 그 피크의 변화를 확인 하였다. mPEG와 락티드(3,6-Dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione)의 양을 하기 표 1과 같이 조절하였다.
| mPEG (g) | DL-Lactide(g) | Mw (g/mol) | fmPEG (중량%) |
m | n |
| 1 | 4.5 | 8262.967 | 0.242044 | 181.8 | 86.98565 |
| 1 | 2.9 | 4928.322 | 0.405818 | 181.8 | 40.6711409395973 |
| 1 | 3.1 | 5596.044 | 0.357395 | 181.8 | 49.94505 |
| 1 | 3.3 | 5566.649 | 0.359283 | 181.8 | 49.53678 |
도 3a에 나타낸 바와 같이, 공중합체에서 mPEG의 부분이 감소함에 따라 C-H 부분의 피크가 감소함을 FTIR 분석 결과에서 확인하였다. 락틱산의 중합도가 증가함에 따라 고분자 내에서 PEG의 비율이 감소하여 C-H 결합 피크가 C=O 결합 피크에 비해 상대적으로 감소함을 확인하였다.
더불어, 표 2에 나타낸 조건에 따라, mPEG와 락티드(Lactide, 3,6-Dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione)의 중합비를 달리하여 (mPEG)m-(b-PLA)n를 합성하고, 친수성 고분자의 비율에 따른, 자가조립 입자의 형태적 특성을 확인하였다.
| mPEG (g) | DL-Lactide(g) | Mw (g/mol) | fmPEG (중량%) |
m | n |
| 1 | 2.9 | 4928.322 | 0.405818 | 181.8 | 40.6711409395973 |
| 1 | 4.5 | 8262.967 | 0.242044 | 181.8 | 86.98565 |
| 0.5 | 9 | 39398.86 | 0.057 | 181.8 | 519.42857 |
도 3b에 나타낸 바와 같이, 양친매성 고분자 내 친수성 고분자의 중량비율에 따라, 생성되는 자가조립 입자의 형태가 달라지는 것을 확인하였다.
[제조예 2] 폴리머-단백질 복합체 형성 및 입자화
본 발명의 면역유도 입자는 항원단백질-양친매성 고분자 복합체의 자가조립에 의하여 형성된 입자라는 점에 특징을 갖는바, 면역유도 능을 가지기 위해서는 항원단백질이 자가 조립의 최외각에 위치하여야만 한다. 따라서, 본 발명의 항원단백질이 최외각에 최외각에 존재하는 자가조립입자를 하기와 같은 방법으로 제조하였다. 항원단백질로는 오브알부민(ovalbumine, Thermo Scientific)과 헤마글루티닌 (hemagglutinin, A/California/04/2009(H1N1), 서열번호 1)을 이용하였다.
우선, 항원단백질을 링커로 개질하기 위해, 항원단백질과 헥사메틸렌디아민(링커)를 반응시켰다. 항원단백질 오브알부민의 응집을 감소시키기 위해서, OVA (1mg/1mL) 용액에 글리세롤을 5 부피%로 첨가하였다. 상기 OVA (1mg/1mL) 용액 300㎕에 EDAC/Sulfo-NHS 용액(DW 100㎕ 중 각각 20mg) 40㎕를 첨가하고, 헥사메틸렌디아민 (104mg/DW 2mL) 80㎕을 상기 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 혼합 용액을 볼텍싱한 후에, 30k 멤프레인 필터를 사용하여 원심분리로 여분의 반응물을 제거하였다(12300rcf, 10분, 3회 반복). 오브알부민의 COOH(글루탐산)기에 헥사메틸렌디아민이 결합된 OVA-NH2를 얻었다.
다음으로, 양친매성 고분자-항원단백질 복합체를 형성하기 위해서, mPEG-b-PLA-NHS (클로로포름 100 ㎕ 중 4mg) 20㎕를 상기 OVA-NH2를 포함하는 용액(글리세롤(5 v/v%) 포함된 DPBS, OVA 함량 1mg/mL)에 넣고, 실온에서 하룻 밤 동안 볼텍싱하여 mPEG-b-PLA-HA 복합체를 제조하면서, 상기 복합체를 입자화 하였다. 상기 볼텍싱에 의하여 OVA-NH2 용액의 친수성 용매 내에 클로로포름이 액적 형태로 존재하게된다. 이 경우 소수성 용매인 클로로포름 액적과 친수성 용매 사이에 양친매성 고분자-항원단백질 복합체가 계면 결합된 상태로 존재하면서 자가 조립하여 입자화 되었다. 구체적으로, 소수성 고분자의 상호작용에 의하여 클로로포름 액적 내의 소수성 고분자가 입자의 내부를 형성하고 친수성 고분자가 소수성 고분자 층 상에 형성되며, 링커에 의하여 항원단백질이 입자의 최외각 층에 형성되었다. 이를 통해서 mPEG-b-PLA-OVA 복합체의 자가조립 입자(proteSome)를 얻었다. 상기와 동일한 방법으로 mPEB-b-PLA-HA 복합체를 형성하고 입자화시켜, mPEB-b-PLA-HA 복합체의 자가조립 입자를 얻었다.
상기에서 DLS 및 전자현미경을 이용하여, mPEG-b-PLA-OVA 복합체 및 mPEB-b-PLA-HA 복합체의 입자화 정도를 확인하였고, 입자의 크기를 측정하였다.
도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, OVA-양친매성 고분자 복합체가 자가 조립에 의하여 입자를 잘 형성한 것을 확인할 수 있고, 1/2 개질된 OVA-고분자 입자의 평균 크기는 148 nm인 것을 확인하였다. 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 헤마글루티닌-양친매성 고분자 복합체도 자가 조립에 의하여 입자를 잘 형성한 것을 확인하였다.
[제조예 3] 단백질 항원 최적 개질 조건 확인
단백질 항원의 표면 개질 정도는 단백질의 항원성 및 백신의 안정성과 관련이 있으므로, 링커인 헥사메틸렌디아민(Hexa.)에 의한 단백질 개질 정도를 달리하여 항원성을 확인하는 실험을 실시하였다. OVA 단백질(45 kDA)은 스톡용액(OVA 1㎍/㎕)을 이용하였고, 제조예 1에서 합성한 양친매성 고분자 mPEG-b-PLA-NHS(분자량 6kDA)을 이용하였다.
개질비율은 항원단백질 1mg을 개질하는데 필요한 링커의 양(mg)을 개질 상수(k)라고 했을 때, 링커의 양/(항원의 양 x k) 값을 나타낸다. 본 실험에서 OVA 단백질 1mg을 개질하는데 필요한 헥사메틸렌디아민(단위 몰질량; 116.21 g/mol)의 양은 11.5mg으로 하여 실험하였다. 또한, 헤마글루티닌 1mg을 개질하는데 필요한 헥사메틸렌디아민의 양은 6.088mg으로 하여 실험하였다.
| 실험군 | 개질도 | OVA(㎍) | 고분자(㎍) | Hexa.(㎍) |
| 실시예1 | 1 | 200 | 400 | 2300 |
| 실시예2 | 1/2 | 200 | 400 | 1150 |
| 실시예3 | 1/4 | 200 | 400 | 575 |
| 실시예4 | 1/8 | 200 | 400 | 287.5 |
| 실시예5 | 2 | 200 | 400 | 143.75 |
또한, OVA 단백질과 헤마글루티닌(HA, 85kDA) 단백질 각각에 대해서도, 헥사메틸렌디아민에 의한 단백질 개질도를 1, 1/10 또는 1/100으로 달리해서 입자를 형성하였다. 실시예 6-8 및 실시예 9-10의 입도를 DLS를 통해서 분석하였다.
| 실험군 | 개질도 (약) | OVA(㎍) | 고분자(㎍) | Hexa.(㎍) |
| 실시예 6 | 1 | 300 | 800 | 3420 |
| 실시예 7 | 1/10 | 300 | 800 | 342 |
| 실시예 8 | 1/100 | 300 | 800 | 34.2 |
| 실험군 | 개질도 (약) | HA(㎍) | 고분자(㎍) | Hexa.(㎍) |
| 실시예 9 | 1 | 300 | 800 | 1710 |
| 실시예10 | 1/10 | 300 | 800 | 171 |
| 실시예11 | 1/100 | 300 | 800 | 17.1 |
도 6에 나타낸 바와 같이, 수력학적 입자 직경(Hydrodynamic diameter)은 약 500nm로 측정되었고, 개질비율이 낮아짐에 따라, 크기 편차가 벌어지는 경향을 보였다.
[제조예 4] 단백질이 표면 결합된 입자의 제조
본 발명의 항원단백질-양친매성 고분자 복합체의 자가 조립 입자와 고분자로 이루어진 나노입자 표면에 항원 단백질이 결합된 형태의 입자의 백신으로서 효과 차이를 확인하기 위해서, 나노입자 표면에 항원단백질이 결합된 입자를 제조하였다.
항원 단백질 (OVA, HA)을 개질도 1/10 조건으로 개질 시킨 후, 양친매성 고분자 mPEG-b-PLA-NHS(분자량 6kDA)를 이용하여 자가 조립형태로 입자화 시켰다. 그 다음 상기에 EDC/Sulfo-NHS 스톡를 넣고 항원 단백질 OVA (45 kDA)를 첨가하여 자가 조립된 나노입자와 OVA 단백질을 혼합하여 OVA가 표면 결합된 나노입자 (비교예 2)를 제조하였다. 또한, HA 단백질에 대해서도 상기와 동일한 방법으로 실시하여 HA가 표면 결합된 나노입자(비교예 3)를 제조하였다. 사용한 항원 단백질 및 반응물 양은 표 4에서 개질도 1/10인 경우와 동일하게 하여 입자를 제조하였다.
[실험예 1] 백신 입자에 의한 항체 형성 정도 확인
제조예 2의 방법에 따라 제조된 면역유도 입자(ProteSome)를 이용하여, 항체 형성 효과를 하기와 같이 확인하였다.
실험은 OVA만 처리한 군(양성대조군), 본 발명의 면역유도 입자 처리군 (실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4) 그리고 아무것도 처리하지 않은 군 (음성대조군)으로 나누어 진행하였고, 면역유도 입자 처리군은 헥사메틸렌디아민에 의한 항원단백질의 개질도를 실시예 1의 개질도 1에서 시작해서, 1/2씩 줄여서 제조된 면역유도 입자를 각각 처리하였다.
면역유도 입자는 BCA 분석을 통해 정량 후 밀도를 컨트롤하여 접종하였는데, 구체적으로 R 2≥0.99로 신뢰도 있는 표준곡선(Standard curve, 도 7a)으로 정량하였고, 1차 접종 및 2차 접종 전에 모두 분석을 진행하여 밀도를 컨트롤 하였다. 다만, 1차 주입의 실시예 2 처리군의 경우, 나노입자의 생산량이 적어 낮은 농도로 1차 접종하였다. 구체적으로 접종된 백신의 함량은 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.
| 실험군 | mPEG-b-PLA-NHS | 1차 접종 (㎍/50㎕) | 2차 접종 (㎍/50㎕) | |
| 비교예1 | OVA 단독 | - | 22 | 17.73672 |
| 실시예1 | ProteSome 1 | 200㎍/10㎕ | 22.09521 | 17.73672 |
| 실시예2 | ProteSome 1/2 | 200㎍/10㎕ | 9.232413 | 17.73672 |
| 실시예3 | ProteSome 1/4 | 200㎍/10㎕ | 21.73613 | 17.73672 |
| 실시예4 | ProteSome 1/8 | 200㎍/10㎕ | 22.06306 | 17.73672 |
| 음성 대조군1 | Negative | - | - | - |
구체적으로, 마우스(n=18, 각 실험군 마다 3마리씩 진행)에 대하여, 백신 접종 전에 채혈(접종 전 채혈)을 진행 한 후, 1차 백신을 접종 하였다. 1차 백신 접종일로부터 14일 째 되는 날 채혈을 진행하고(접종 후 1차 채혈), 2차 백신을 접종하였다. 다시 2차 접종 후 28일 때 되는 날 채혈(접종 후 2차 채혈)을 진행하였다.
상기 접종 후 1차 채혈 및 2차 채혈로 수득한 혈액의 혈청으로 50배, 100배, 200배 및 400배 희석하여 ELISA를 이용한 항체가 분석을 실시하였다. 각 실험군의 처리에 따른 분석결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 입자화를 위한 단백질 개질을 1/2배수로 줄였을 경우, 1/8배수까지 IgG가 더 많이 발현됨을 확인하였고, 실시예 4(ProteSome 1/8) 입자의 IgG 값은 OVA 단일 접종에 비해 50X, 100X, 200X, 400X에서 각각 4.9배, 7.6배, 11.9배 18.7배 높게 측정되었다. 따라서, 본 발명의 항원단백질의 개질 정도가 낮아지는 경우, 면역반응 유도 효과가 더 우수해짐을 확인하였다.
[실험예 2] 백신 입자에 의한 항체 형성 정도 확인
제조예 3의 방법에 따라 제조된 면역유도 입자(ProteSome)를 이용하여, 항체 형성 효과를 하기와 같이 확인하였다.
실험은 OVA 항원 단백질만 처리한 군(비교예 1; OVA), 본 발명의 면역유도 입자 처리군 (실시예 5, 6,7), 표면 결합 나노입자 군(비교예 1, 비교예 2) 그리고 아무것도 처리하지 않은 군(음성대조군2)으로 나누어 진행하였다.
면역유도 입자는 BCA 분석을 통해 정량 후 밀도를 컨트롤하여 접종하였는데, 구체적으로 R 2≥0.99로 신뢰도 있는 표준곡선(Standard curve, 도 9)으로 정량하였고, 1차 접종 및 2차 접종 전에 모두 분석을 진행하여 밀도를 컨트롤하였다. 구체적으로 접종된 백신의 함량은 하기 표 6에 나타낸 바와 같다.
| OVA | mPEG-b-PLA-NHS (㎍/50㎕) |
1차 접종 (㎍/50㎕) |
2 차 접종 (㎍/50㎕) |
| 비교예 1(OVA 단독) | X | 20 | 20 |
| 실시예 6 | 334 | 20 | 20 |
| 실시예 7 | 334 | 20 | 20 |
| 실시예 8 | 334 | 20 | 20 |
| 비교예 2(표면 결합입자) | 334 | 20 | 20 |
| 음성 대조군 2 | X | X | X |
구체적으로, 마우스(n=30, 각 실험군 마다 5마리씩 진행)에 대하여, 백신 접종 전에 채혈(접종 전 채혈)을 진행 한 후, 1차 백신을 접종 하였다. 1차 백신 접종일로부터 14일 째 되는 날 채혈을 진행하고(접종 후 1차 채혈), 2차 백신을 접종하였다. 다시 2차 접종 후 28일 때 되는 날 채혈(접종 후 2차 채혈)을 진행하였다.
상기 접종 후 1차 채혈 및 2차 채혈로 수득한 혈액의 혈청으로 효소면역분석법 (ELISA)을 이용한 항체(IgG) 유도 정도를 흡광세기를 측정하여 확인하였다. 각 실험군의 흡광 세기는 표 7에 나타내었다. 96 웰 플레이트에 오브알부민(OVA) 500ng/well로 코팅하여 이용하였다. 혈청 희석은 100배부터 800배로 4가지로 진행하였고, 각 실시예 별로 도출되는 결과값(N=5)의 평균에서 가장 벗어난 2개의 샘플을 제외하여 (N=3) 최종적으로 도식화하였다.
| 희석 | OVA P (비교예 2) |
OVA 1 (실시예 6) |
OVA 0.1 (실시예 7) |
OVA 0.01 (실시예 8) |
| 1/100 | 1.178129 | 1.922218 | 1.471825 | 2.780263 |
| 1/200 | 0.92587 | 1.880971 | 1.634751 | 3.156385 |
| 1/400 | 1.187006 | 1.522782 | 1.495559 | 2.788081 |
| 1/800 | 1.273497 | 1.381065 | 1.605979 | 2.765058 |
본 발명의 실시예 6 내지 8의 자가 조립 항원 입자를 접종하는 경우, 항원 단백질 단일 접종(양성대조군 1)과 항원 표면 결합입자(비교예 1)를 접종한 경우와 비교해서, 보다 높은 항체 생성 효과를 가짐을 확인하였다. 개질 정도에 따라서는 그 정도가 가장 낮은 1/100 에서 분명하게 높은 항체 유도 효과를 보였다. 따라서, 본 발명의 자가조립 항원 입자의 경우, 양친매성 입자의 표면에 항원이 결합된 항원 입자 또는 단백질 단독과 비교해서, 높은 항체 유도능을 보였는바, 종래의 백신제제와 비교해서 효과적인 백신 플랫폼으로 이용가능 함을 알 수 있다.
[실험예 3] 백신 입자에 의한 항체 형성 정도 확인
제조예 3의 방법에 따라 제조된 HA 단백질을 포함하는 면역유도 입자(ProteSome)를 이용하여, 항체 형성 효과를 하기와 같이 확인하였다.
본 발명의 면역유도 입자 처리군 (실시예 8, 9, 10), 표면 결합 나노입자 군(비교예 3) 그리고 아무것도 처리하지 않은 군(음성대조군 3)으로 나누어 실험을 진행하였고, 면역 유도만 달리할 뿐, 실험 조건 및 결과를 분석하는 방법은 실험예 2와 동일하게 진행하였다.
| HA | mPEG-b-PLA-NHS (㎍/50㎕) |
1차 접종 (㎍/50㎕) | 2 차 접종 (㎍/50㎕) |
| 실시예 9 | 334 | 20 | 20 |
| 실시예 10 | 334 | 20 | 20 |
| 실시예 11 | 334 | 20 | 20 |
| 비교예 3(표면 결합입자) | 334 | 20 | 20 |
| 음성 대조군 3 | - | - | - |
96 웰 플레이트에 헤마글루티닌 (600ng/well)으로 코팅하여 효소면역분석법 (ELISA)을 이용하여 측정하였다. 실시예 별로 도출되는 결과값(N=6)의 평균에서 가장 벗어난 1개의 샘플을 제외하여 (N=5), 최종적으로 도식화 하였다.
| N=5 | HA P (비교예 3) |
HA 1 (실시예 9) |
HA 0.1 (실시예 10) |
HA 0.01 (실시예 11) |
NC (음성대조군 3) |
| Average | 0.84721 | 1.28734 | 2.3174 | 1.49575 | 0.0735 |
| STD | 0.224198 | 0.291706 | 0.331991 | 0.128784 | 0.003486 |
도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 면역유도 입자의 경우, 모든 실험군에서 나노입자에 표면결합된 나노입자 보다 면역 반응을 유도하는 효과가 높은 것을 확인하였다. 이는 시험예 2의 OVA 단백질과 일치하는 결과를 나타내는 것으로, 본 발명의 면역유도 입자는 우수한 면역반응 유도능을 갖는 백신 제제로서 매우 우수한 효과를 가짐을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> HuVet bio, Inc.
<120> SELF-ASSEMBLED PARTICLES AND METHOD OF PREPARING THEREOF
<130> P18E10C1122
<150> 10-2017-0111104
<151> 2018-08-31
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 566
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 1
Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Ala Asp Thr Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
Claims (13)
- 항원단백질과 양친매성 고분자의 복합체를 포함하는 면역유도 입자로,
상기 항원단백질-양친매성 고분자 복합체의 자가 조립에 의하여 형성되며, 입자의 내부로부터 순서대로 소수성 고분자층, 친수성 고분자층 및 항원단백질층의 구조를 갖는 것인, 면역유도 입자. - 제1항에 있어서,
상기 항원단백질과 양친매성 고분자의 복합체는 링커를 더 포함하는 것인, 면역유도 입자. - 제2항에 있어서,
상기 입자는 친수성 고분자층과 항원단백질층 사이에 링커층을 더 포함하는 것인, 면역유도 입자. - 제2항에 있어서,
상기 면역유도 입자는 하기 식 1에서 개질도가 3 미만인 것인, 면역 유도 입자.
[식 1]
개질도 = {링커의 양 (g) x [116.21 (g/mol) / 링커분자의 단위 몰질량 (g/mol)]} / [항원단백질의 양 (g) x A]
(여기서, A는 517.5 kDA/항원단백질 분자량 (kDA) 이다.) - 제1항에 있어서,
양친매성 고분자는 친수성 고분자 및 소수성 고분자를 포함하는 것인 면역유도 입자. - 제1항에 있어서,
상기 양친매성 고분자는 하기 [식 2]에서 K는 0.1 내지 0.8을 만족하는 것인, 면역유도 입자
[식 2]
K = 친수성 고분자의 중량/양친매성 고분자 전체의 중량 - 제1항에 있어서,
상기 친수성 고분자는 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴리아크릴릭애시드(PAA), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아세테이트(PVAc), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴아미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 백신 입자. - 제1항에 있어서,
상기 소수성 고분자는 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리오르소에스테르, 폴리포스파진, 폴리루신, 폴리이소루신, 폴리발린, 폴리페닐알라닌, 폴리프롤린, 폴리글리신, 폴리트립토판, 폴리알라닌, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤 및 폴리메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 면역유도 입자. - 제1항에 있어서,
상기 항원단백질은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(the Hemagglutinin, HA), 뉴라미니다아제(the Neuraminidase, NA), 핵단백질(the Nucleoprotein, NP), M1 단백질, M2 단백질, NS1 단백질, NS2 단백질(NEP 단백질: 핵 방출 단백질(nuclear export protein)), PA 단백질, PB1 단백질(중합효소 염기성 1 단백질, polymerase basic 1 protein), PB1-F2 단백질 및 PB2 단백질;
광견병 바이러스의 경우에, 핵단백질(N), 인단백질(P), 기질 단백질(M), 당단백질(G), 및 바이러스 RNA 중합효소(L);
B형 간염 바이러스의 경우에, B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg), B형 간염 바이러스 코어 항원(HbcAg), B형 간염 바이러스 DNA 중합효소, HBx 단백질, preS2 중간 표면 단백질(the preS2 middle surface protein), 큰 S 단백질(large S protein), 바이러스 단백질 VP1, 바이러스 단백질 VP2, 바이러스 단백질 VP3, 및 바이러스 단백질 VP4;
로 이루어진 군에서 선택된 것인 면역유도 입자. - 친수성 용매 중에 항원단백질을 포함하는 단백질 용액에 소수성 용매 중의 양친매성 고분자를 첨가한 항원단백질-양친매성 고분자 혼합용액을 20 내지 28시간 동안 흔들어 주면서 반응시켜 양친매성 고분자-항원단백질 복합체를 형성하는 것; 및
상기 혼합용액이 항원단백질 포함하는 친수성 용매 중에 소수성 용매가 액적 상태로 존재하는 콜로이드 상일 때 양친매성 고분자-항원단백질 복합체의 자가조립에 의하여 입자화하는 것을 포함하는 면역유도 입자 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 단백질 용액은 글리세롤을 더 포함하는 것인, 면역유도 입자 제조방법. - 제1항에 따른 면역유도 입자를 포함하는 백신용 조성물.
- 제12항에 있어서,
아쥬반트를 더 포함하는 백신용 조성물.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021091272A1 (ko) * | 2019-11-07 | 2021-05-14 | 주식회사 삼양바이오팜 | 면역유도용 고분자 나노입자 조성물 및 그 제조방법 |
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| KR101592235B1 (ko) * | 2013-03-22 | 2016-02-12 | 부산대학교 산학협력단 | 단백질 케이지의 제조방법 및 소수성 첨가제를 담지한 코어-쉘 구조의 고분자-단백질 입자의 in-situ 제조방법 |
-
2018
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- 2018-08-31 KR KR1020180103876A patent/KR20190024849A/ko not_active Application Discontinuation
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