CN117084982B - 一种纳米工程化红细胞的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米工程化红细胞的制备及其应用。制备该纳米工程化红细胞的方法包括如下步骤：将HMSN纳米粒、Camostat和E‑64d混合，避光搅拌24h以上，离心，收集并洗涤沉淀1；重悬沉淀1，之后加入PDA，避光搅拌24h以上，离心，收集并洗涤沉淀2；将沉淀2和anti‑ACE2混匀，20‑30℃反应1h以上，收集混合物；将混合物与红细胞以5000个纳米粒子：1个红细胞的比例混匀，2‑6℃反应2h以上，离心并洗涤，得到纳米工程化红细胞。实验证明，该纳米工程化红细胞能够有效阻断动物体内新型冠状病毒的入侵且对脏器无损伤。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种纳米工程化红细胞的制备及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纳米工程化红细胞的制备及其应用。
背景技术
新型冠状病毒在感染期间的一个关键事件中，SARS-CoV-2的刺突糖蛋白（Spikeglycolprotein，S蛋白）与宿主细胞上的血管紧张素转换酶2（Angiotensin ConvertingEnzyme 2，ACE2）受体结合，导致病毒包膜和宿主细胞膜融合。ACE2受体也是其他冠状病毒（如SARS-CoV、H1N1、H5N1和HCoV-NL63等）的共享受体。S蛋白有S1和S2两个亚基，其中S1含有一个特异性识别ACE2受体的受体结合区域（Receptor Binding Domain，RBD）。SARS-CoV-2在S1/S2边界进化出一个多碱基位点，该位点被弗林蛋白酶（Furin）裂解，导致S1解离，S2被S2’位点的跨膜丝氨酸蛋白酶2（Transmembrane Serine Proteinase 2，TMPRSS2）进一步裂解，这是进一步的病毒和细胞膜发生膜融合所必需的。然后，病毒通过以下两种途径之一进入细胞：TMPRSS2介导的质膜融合途径和组织蛋白酶（Cathepsin L，CTSL）介导的内吞途径。因此，弗林蛋白酶、TMPRSS2和CTSL的酶活性以及ACE2受体结合对于冠状病毒进入宿主细胞是必要的。
SARS-CoV-2在入侵宿主细胞后便开始大量复制，其中以遗传物质RNA基因组的转录和复制两个过程为核心。遗传物质的转录将最终经过翻译形成新生病毒的结构组成蛋白质，而其复制将形成新生病毒的RNA基因组。病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNApolymerases，RdRp），也被称为第12号非结构蛋白（non-structural protein 12，nsp12），能够与其他多个非结构蛋白质组装形成一台高效的RNA合成“机器”，完成这两大过程。RNA聚合酶作为转录复制机器的核心部件，是最重要的抗病毒药物靶标之一，破坏其功能预期将能够阻止病毒的复制，最终达到治疗的目的。目前，应对SARS-CoV-2有预防和治疗两个方面，其中预防以疫苗为主，治疗主要分为三种，分别为靶向RNA聚合酶的抗病毒药物、靶向受体结合域（RBD）的中和抗体以及针对病毒引起的炎症风暴而采取的免疫调节手段。其中大家耳熟能详的瑞德西韦（GS-5734）、法匹拉韦（T-705）、利巴韦林就是作用于上述靶点。然而，病毒RNA聚合酶具有相对较高的聚合错误率，并且缺乏校对能力，这可能导致病毒发生突变和随后的耐药性。目前，在全球范围内新型冠状病毒变异毒株已超1000种，新型冠状病毒属于RNA病毒，作为最大最复杂的RNA病毒，冠状病毒拥有长达32000个核苷酸组成的基因组，这为新型冠状病毒的变异创造了得天独厚的条件。新变种的出现会导致最初研发的中和抗体效力下降。因此，亟待开发一种广谱抗病毒方法，以加强对当前和未来冠状病毒相关疾病的管理。值得注意的是，在病毒复制和广泛变异之前阻止冠状病毒进入宿主细胞是更有前景的治疗策略之一。尤其是当发现新的病毒，并且没有有效的治疗和疫苗接种时，这具有很高的治疗价值。在病毒感染周期的早期阶段，精确抑制宿主ACE2+肺细胞中的这些关键蛋白酶可以阻止S蛋白的激活、其与宿主细胞膜的融合以及随后进入细胞。通过药物干预实现这一目标的主要挑战之一是需要确保药物精确递送到ACE2+细胞，因为这些酶（弗林蛋白酶、TMPRSS2和CTSL）发挥着重要的生理作用，如果通过全身给药的方式，会带来对机体正常生理活动的严重干扰。
纳米材料在诊断测试、疫苗研发、病患治疗等方面具有重要的作用。多种临床研究使用纳米颗粒为载体，包裹和递送有效治疗的药物进行精准递送和靶向。随着纳米材料的快速发展，中空介孔二氧化硅（Hollow Mesoporous Silica Nanoparticles，HMSN）作为一种新型的纳米治疗工具逐渐进入人们的视野。相比于普通的介孔二氧化硅（Mesop-orousSilica Nanoparticles，MSN），HMSN无论在载药容量或者联合用药方面都有很大提升，并且其安全性很高，被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）认证可以作为化妆品和食品添加剂使用。但由于体内输送屏障—单核巨噬细胞系统（Mononuclearphagocyte System，MPS）摄取了超过95%静脉注射的纳米粒子，纳米医学的潜力尚未完全发挥出来，无法有效实现器官靶向。
近年来兴起的“红细胞搭便车技术”是一种新型的肺部特异性靶向药物运输技术，是指构建的载药纳米载体（NCs）通过氢键和/或静电相互作用与完整的红细胞（RBC）结合，而不是仅仅只用提取的红细胞膜包裹纳米载体。作为静脉注射纳米载体-RBCs复合物后遇到的第一个器官，远端肺毛细血管的压缩和变形将触发NCs从RBCs上释放。这种方法不仅可以实现有效的肺部靶向，还可以防止大多数载药NCs被肝脏和脾脏中的巨噬细胞吞噬。
发明内容
本发明的目的为抑制SARS-CoV-2入侵宿主细胞（即肺部细胞）。
本发明首先保护联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的制备方法，可包括如下步骤：
（a1）将HMSN纳米粒、酶抑制剂Camostat和酶抑制剂E-64d混合，避光搅拌12h以上（如12-18h、18-24h、12h、18h或24h），离心，收集并洗涤沉淀1；
（a2）重悬沉淀1，之后加入PDA，避光搅拌12h以上（如12-18h、18-24h、12h、18h或24h），离心，收集并洗涤沉淀2；
沉淀2即为联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA。
上述方法中，所述步骤（a1）中，所述洗涤为用无菌水洗涤。所述洗涤的目的可为洗去未装载的酶抑制剂。
上述方法中，所述步骤（a2）中，所述重悬为用Tris-HCl缓冲液重悬；所述洗涤为用PBS缓冲液洗涤。
上述方法中，所述步骤（a1）中，HMSN纳米粒可以以HMSN纳米粒沉淀的形式加入。HMSN纳米粒沉淀的制备方法可为：用无菌水重悬HMSN纳米粒，之后超声清洗至弥散，离心，收集沉淀。
上述方法中，所述步骤（a1）中，HMSN纳米粒、酶抑制剂Camostat和酶抑制剂E-64d的质量比可为10mg：（1-1.5）mg：（1-1.5）mg（如10mg：（1-1.25）mg：（1-1.25）mg、10mg：（1.25-1.5）mg：（1.25-1.5）mg、10mg：1mg：1mg、10mg：1.25mg：1.25mg或10mg：1.5mg：1.5mg）。
上述方法中，所述步骤（a1）中，“将HMSN纳米粒、酶抑制剂Camostat和酶抑制剂E-64d混合”可为将HMSN纳米粒、酶抑制剂Camostat和酶抑制剂E-64d在无菌水中混合。
上述方法中，所述步骤（a2）中，重悬沉淀1之后加入PDA之前还可进行超声步骤。即将沉淀1用Tris-HCl缓冲液重悬并超声，之后加入PDA。
上述方法中，HMSN纳米粒和PDA的比例可为10mg：（4-6）mg（如10mg：（4-5）mg、10mg：（5-6）mg、10mg：4mg、10mg：5mg或10mg：6mg）。
采用上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA也属于本发明的保护范围。
本发明还保护联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2的制备方法，可包括如下步骤：将上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA和anti-ACE2混匀，20-30℃（如20-25℃、25-30℃、20℃、25℃或30℃）反应1h以上（如1h、2h或3h），得到联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2。
上述方法中，所述将上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA和anti-ACE2混匀可为在PBS缓冲液中将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA和anti-ACE2混匀。
上述方法中，anti-ACE2的加入形式可为anti-ACE2溶液；anti-ACE2溶液的浓度可为300-500μg/mL（如300-400μg/mL、400-500μg/mL、300μg/mL、400μg/mL或500μg/mL）。
采用上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2也属于本发明的保护范围。单细胞测序表明ACE2在0.64%的肺细胞中表达，且80%以上都集中表达于II型肺泡细胞。所以肺泡中占II型肺泡上皮细胞总数量1.4%的ACE2+细胞是新型冠状病毒在肺部的真正靶细胞，基于此，发明人将ACE2抗体偶联在PDA表面，来实现精准治疗。
本发明还保护纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs的制备方法，可包括如下步骤：
（b1）将上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2与红细胞以200-5000个纳米粒子：1个红细胞（如200-1000个纳米粒子：1个红细胞、1000-3000个纳米粒子：1个红细胞、3000-5000个纳米粒子：1个红细胞、200个纳米粒子：1个红细胞、1000个纳米粒子：1个红细胞、3000个纳米粒子：1个红细胞或5000个纳米粒子：1个红细胞）的比例混匀，2-6℃（如2-4℃、4-6℃、2℃、4℃或6℃）反应2h以上（如2h、4h、6h或8h）；
（b2）完成步骤（b1）后，离心并洗涤，得到纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs。
上述方法中，所述将上述任一所述制备方法制备的联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2与红细胞以200-5000个纳米粒子：1个红细胞的比例混匀可为在PBS缓冲液中将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2和红细胞混匀。
采用上述任一所述制备方法制备的纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs也属于本发明的保护范围。
本发明还保护上述任一所述联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的应用，可为c1）或c2）或c3）：
c1）制备纳米工程化红细胞；
c2）制备所述联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2；
c3）制备所述纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs。
本发明还保护上述任一所述联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2的应用，可为d1）或d2）或d3）或d4）或d5）：
d1）阻断新型冠状病毒感染细胞；
d2）阻断新型冠状病毒感染肺部细胞；
d3）制备纳米工程化红细胞；
d4）制备所述纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs；
d5）制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病的产品。
本发明还保护上述任一所述纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs的应用，可为e1）或e2）：
e1）阻断新型冠状病毒入侵肺部细胞；
e2）制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病的产品。
本发明提供了联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2和该联合载药纳米粒修饰的纳米工程化红细胞，并在新型冠状假病毒体外感染模型和人源化小鼠模型中进行了治疗及效果评估。具体如下：（1）本申请的发明人首先构建单独和联合载药纳米粒：分别以萘基荧光素（Naph）、肽基氯甲基酮（CMK）、六-D-精氨酸酰胺（Hexa-D-arginine）、抑肽酶（Aprotintin）、卡莫司他（Camostat）和阿洛司他丁（E-64d）为候选药物，装载进HMSN中，得到5种单独载药纳米粒；联合药物治疗已应用于临床的各个领域，多靶点混合药物越来越受到发明者们的关注，筛选出Camostat和E-64d两种酶抑制剂后，发明人也构建了联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA。（2）发明人对载药纳米粒在新型冠状假病毒体外感染模型中的阻断效果进行了验证，结果表明，新型冠状假病毒体外感染模型中筛选出阻断效果最佳的治疗性纳米粒为联合载药纳米粒Camostat+E64d@HMSN@PDA。（3）构建了治疗性的“赋能”红细胞，即将筛选出的联合载药纳米粒Camostat+E64d@HMSN@PDA与红细胞进行非共价结合，并对联合载药纳米粒Camostat+E64d@HMSN@PDA的血液相容性进行了检测，血清稳定性实验验证了其在体内正常血管中能够保持在比较高的负载率，同时，扫描电镜也观察到纳米粒有效负载在红细胞上，由此可见，成功构建了治疗性的“赋能”红细胞。（4）本发明对小鼠进行新型冠状假病毒给药，之后尾静脉注射纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs，采用生物发光成像检测全身Luc表达判定ACE2表达，荧光发光成像检测判定治疗效果，并对小鼠肺部以及其它脏器行病理生理学检测分析。结果表明，联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2修饰的纳米工程化红细胞可以精准靶向阻断新型冠状病毒入侵肺部宿主细胞且对脏器无损伤。
本申请的发明人创新性的首次建立了一种新型的广谱的抗病毒策略，即通过红细胞搭便车技术输送装载有抑制病毒入侵的关键酶的抑制剂的载药纳米粒（本申请中称之为“纳米工程化红细胞”），精准靶向肺部组织ACE2+细胞释放抑制病毒入侵的关键酶，实现抑制SARS-CoV-2入侵宿主细胞的目标。该策略与SARS-CoV-2是否发生基因变异无关，因为目前来看，无论SARS-CoV-2如何变异，其入侵宿主细胞的所需要的宿主细胞参与的酶是不变的。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为制备的6个标准曲线。
图2为不同载药纳米粒的合成、表征以及在新型冠状假病毒细胞体系中的筛选。
图3为联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的合成、表征以及在新型冠状假病毒细胞体系中的筛选。
图4为纳米工程化红细胞的构建及功能效果验证。
图5为纳米工程化红细胞在新型冠状病毒入侵肺部靶细胞的动物模型中的阻断效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、靶向性纳米递送药物载体（即载药纳米粒）的构建及其应用
一、载药纳米粒的构建
Furin、TMPRSS2、CTSL的活性以及ACE2在病毒入侵中起着非常重要的作用。萘基荧光素（Naph）、肽基氯甲基酮（CMK）和六-D-精氨酸酰胺（Hexa-D-arginine）均为Furin酶抑制剂；抑肽酶（Aprotintin）和卡莫司他（Camostat）均为TMPRSS2酶抑制剂；阿洛司他丁（E-64d）为CTSL酶抑制剂。这些酶抑制剂均可抑制新型冠状病毒S蛋白的活化。
（一）标准曲线的制备
1、用Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）溶解Naph，分别得到浓度为0.03125、0.015625、0.007813和0.003907 mg/mL的Naph标准溶液；之后用多功能微孔板读板机检测，得到594nm处的荧光值Ex和663 nm处的荧光值Em；以Naph浓度为横坐标，Ex/Em值为纵坐标，绘制Naph标准曲线。
2、用水溶解CMK，根据Pierce™ 定量肽检测试剂盒分别得到浓度为841、420.5、210.3、105.1、52.6、26.3、13.2和6.6 µM的CMK标准溶液；之后用多功能微孔板读板机检测，得到390 nm处的荧光值Ex和475 nm处的荧光值Em；以CMK浓度为横坐标，Ex/Em值为纵坐标，绘制CMK标准曲线。
3、用水溶解Hexa-D-arginine，根据Pierce™定量肽检测试剂盒分别得到浓度为100、500、250、125、62.5、31.3、15.6和7.8 µg/mL的Hexa-D-arginine标准溶液；之后用多功能微孔板读板机检测，得到390 nm处的荧光值Ex和475 nm处的荧光值Em；以Hexa-D-arginine浓度为横坐标，Ex/Em值为纵坐标，绘制Hexa-D-arginine标准曲线。
4、用水溶解Aprotintin，分别得到浓度为2.5、1.25、0.625、0.3125、0.078125和0.039063 mg/mL的Aprotintin标准溶液；之后用多功能微孔板读板机检测，得到275 nm处的吸光值；以Aprotintin浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制Aprotintin标准曲线。
5、用水溶解Camostat，分别得到浓度为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625和0.3125mg/mL的Camostat标准溶液；之后用多功能微孔板读板机检测，得到265 nm处的吸光值；以Camostat浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制Camostat标准曲线。
6、用水溶解E-64d，分别得到浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625和0.3125 µg/mL的E-64d标准溶液；之后用多功能微孔板读板机检测，得到210 nm处的吸光值；以E-64d浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制E-64d标准曲线。
6个标准曲线的绘制结果见图1：Naph标准曲线方程为y = -9x106X2+ 624181x +955.28；CMK标准曲线方程为y = -0.0077X2+ 15.891x + 128.04；Hexa-D-arginine标准曲线方程为y = -0.0054X2+ 13.364x + 128.42；Aprotintin标准曲线方程为y = 0.1658x +0.09091；Camostat标准曲线方程为y = 0.01058x + 0.07738；E-64d标准曲线方程为y =0.1030x + 0.6735。
（二）载药纳米粒的构建
1、载药纳米粒Naph@HMSN@PDA的构建
（1）取10mg HMSN纳米粒（江苏先丰纳米材料科技有限公司，产品目录号为102968），加入1ml无菌水制成悬液；之后将悬液超声清洗至完全弥散，12000rpm离心10min，弃上清，得到HMSN纳米粒沉淀。
（2）将步骤（1）得到的HMSN纳米粒沉淀和1.25mg酶抑制剂Naph一起加入2.5ml无菌水中，24h避光搅拌，12000rpm离心10min，收集上清液1和沉淀1；然后用1ml无菌水洗涤沉淀1（目的为洗去未装载的酶抑制剂Naph），12000rpm离心10min，收集上清液2和沉淀2。将上清液1和上清液2混合，混合液命名为上清。
（3）用多功能微孔板读板机检测步骤（2）中获得的上清，得到594 nm处的荧光值Ex和663 nm处的荧光值Em，进一步获得上清的Ex/Em值；之后根据Naph标准曲线，获得上清中的Naph含量（即Naph浓度）。进一步，根据下述公式计算包封率和载药量：
包封率=（W总药物量-W游离药物量）/ W总药物量×100%；
载药量=（W总药物量-W游离药物量）/ W载药纳米粒总量×100%；
其中W总药物量为体系中的药物总质量（mg）即1.25mg酶抑制剂Naph；W游离药物量为上清中的Naph含量；W载药纳米粒总量为载体和所装Naph的总质量（mg），载体即HMSN纳米粒，W载药纳米粒总量即10mg HMSN纳米粒和所装Naph的总质量，所装Naph的质量=W总药物量-W游离药物量。
（4）将步骤（2）中获得的沉淀2用少量Tris-HCl缓冲液重悬并轻微超声，得到悬浊液。向所述悬浊液中加入5mg PDA，之后用Tris-HCl缓冲液定容至10ml，24h避光搅拌，离心，得到黑色沉淀。将黑色沉淀用PBS缓冲液清洗3次后重悬，得到载药纳米粒，命名为Naph@HMSN@PDA。
2、载药纳米粒CMK@HMSN@PDA的构建
按照上述步骤1，将酶抑制剂Naph替换为酶抑制剂CMK，Naph标准曲线替换为CMK标准曲线，其他步骤均不变，获得载药纳米粒，命名为CMK@HMSN@PDA。
3、载药纳米粒Hexa-D-arginine@HMSN@PDA的构建
按照上述步骤1，将酶抑制剂Naph替换为酶抑制剂Hexa-D-arginine，Naph标准曲线替换为Hexa-D-arginine标准曲线，其他步骤均不变，获得载药纳米粒，命名为Hexa-D-arginine@HMSN@PDA。
4、载药纳米粒Aprotinin@HMSN@PDA的构建
按照上述步骤1，将酶抑制剂Naph替换为酶抑制剂Aprotinin，Naph标准曲线替换为Aprotintin标准曲线，其他步骤均不变，获得载药纳米粒，命名为Aprotinin@HMSN@PDA。
5、载药纳米粒Camostat@HMSN@PDA的构建
按照上述步骤1，将酶抑制剂Naph替换为酶抑制剂Camostat，Naph标准曲线替换为Camostat标准曲线，其他步骤均不变，获得载药纳米粒，命名为Camostat@HMSN@PDA。
6、载药纳米粒E-64d@HMSN@PDA的构建
按照上述步骤1，将酶抑制剂Naph替换为酶抑制剂E-64d，Naph标准曲线替换为E-64d标准曲线，其他步骤均不变，获得载药纳米粒，命名为E-64d@HMSN@PDA。
7、模式纳米粒Cy5@HMSN@PDA的构建
按照上述步骤1中的（1）、（2）和（4），将酶抑制剂Naph替换为Cy5，其他步骤均不变，获得模式纳米粒Cy5@HMSN@PDA（简称Cy5@HMSN@PDA）。
8、模式纳米粒Cy5-NH2-HMSN的构建
（1）取10mg NH2-HMSN，加入1ml 无菌水制成悬液；之后将悬液超声清洗至完全弥散，12000rpm离心10min，弃上清，得到NH2-HMSN纳米粒沉淀。
（2）将步骤（1）得到的NH2-HMSN纳米粒沉淀和0.7mg Cy5一起加入2.5ml PBS缓冲液（pH8.5）中，24h避光搅拌，12000rpm离心10min，收集上清液1和沉淀1；然后用1ml PBS缓冲液洗涤沉淀1（目的为洗去未装载的Cy5），12000rpm离心10min，收集上清液2和沉淀2。将上清液1和上清液2混合，混合液命名为上清。
（3）将步骤（2）中获得的沉淀2用少量PBS缓冲液重悬并轻微超声，得到模式纳米粒Cy5-NH2-HMSN（简称Cy5-NH2-HMSN）。
9、载药纳米粒HMSN@PDA的构建
将步骤1中（1）得到的HMSN纳米粒沉淀用少量无菌水重悬并轻微超声，得到悬浊液。向所述悬浊液中加入5mg PDA，之后用Tris-HCl缓冲液定容至10ml，24h避光搅拌，离心，得到黑色沉淀。将黑色沉淀用PBS缓冲液清洗3次后重悬，得到载药纳米粒，命名为HMSN@PDA。
10、载药纳米粒HMSN的构建
将步骤1中（1）得到的HMSN纳米粒沉淀用PBS重悬，得到载药纳米粒，命名为HMSN。
11、载药纳米粒Camostat@HMSN@PDA-anti-ACE2
将步骤5中得到的载药纳米粒Camostat@HMSN@PDA与浓度为400μg/mL的anti-ACE2混匀，并用PBS缓冲液定容至100µl，室温旋转1h，得到载药纳米粒Camostat@HMSN@PDA-anti-ACE2，简称Camostat@HMSN@PDA-anti-ACE2。
12、载药纳米粒E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2
将步骤6中得到的载药纳米粒E-64d@HMSN@PDA与浓度为400μg/mL的anti-ACE2混匀，并用PBS缓冲液定容至100µl，室温旋转1h，得到载药纳米粒E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2，简称E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2。
13、将载药纳米粒（HMSN、HMSN@PDA、Naph@HMSN@PDA、CMK@HMSN@PDA、Hexa-D-arginine@HMSN@PDA、Aprotinin@HMSN@PDA、Camostat@HMSN@PDA、Camostat@HMSN@PDA-anti-ACE2、E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2或E-64d@HMSN@PDA）、模式纳米粒Cy5@HMSN@PDA和模式纳米粒Cy5-NH2-HMSN稀释至最适浓度，得到样品。将铜网蘸取样品后放到滤纸片上，过夜晾干，在透射电镜下观察。
各个载药纳米粒的透射电镜图见图2中A。
部分载药纳米粒的包封率和载药量见图2中B。
结果表明，本发明成功构建了载药纳米粒HMSN、HMSN@PDA、Naph@HMSN@PDA、CMK@HMSN@PDA、Hexa-D-arginine@HMSN@PDA、Aprotinin@HMSN@PDA、Camostat@HMSN@PDA、E-64d@HMSN@PDA、Camostat@HMSN@PDA-anti-ACE2、E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2、模式纳米粒Cy5-NH2-HMSN和模式纳米粒Cy5@HMSN@PDA。
二、检测体外细胞生长抑制率
1、用DMEM培养基稀释载药纳米粒（Naph@HMSN@PDA、CMK@HMSN@PDA、Hexa-D-arginine@HMSN@PDA、Aprotinin@HMS-N@PDA、Camostat@HMSN@PDA或E-64d@HMSN@PDA），得到浓度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20或40µM的药液。用DMEM培养基稀释等体积DMSO，得到的溶液作为对照。
2、将293T-hACE2细胞（武汉爱博泰克生物科技有限公司，产品目录号为RM02851）消化、离心后，用DMEM培养基重悬，反复吹打成单细胞悬液；之后将293T-hACE2细胞接种至96孔板（10000/孔），置于细胞培养箱，静置培养过夜。
3、完成步骤2后，弃96孔板中的液相，加入步骤1制备的药液或对照，轻轻摇匀后培养48h。
每个浓度和对照均设置5个重复孔。
4、完成步骤3后，弃上清，每孔加入100µl细胞增殖活性检测试剂（Cell CountingKit-8，CCK8）稀释工作液（CCK8和无血清DMEM培养基按体积比1：9混合而成），37℃细胞培养箱中孵育2h。
5、完成步骤4后，将96孔板放入M5多功能微孔板读板机中，检测450nm的吸光度值，记录各组吸光度值并绘制生长曲线。
各个载药纳米粒的生长曲线见图2中C。结果表明，不同浓度的载药纳米粒与细胞共培养48h后，对细胞的增殖抑制呈现剂量依赖性。根据生长曲线，确定Naph@HMSN@PDA、CMK@HMSN@PDA、Hexa-D-arginine@HMSN@PDA、Aprotinin@HMSN@PDA、Camostat@HMSN@PDA和E-64d@HMSN@PDA的工作浓度依次为1.25、5、10、1.25、10和2.5µM。
三、生物相容性评价
1、用DMEM培养基分别稀释Naph@HMSN@PDA、CMK@HMSN@PDA、Hexa-D-arginine@HMSN@PDA、Aprotinin@HMSN@PDA、Camostat@HMSN@PDA和E-64d@HMSN@PDA，依次得到浓度为1.25µM的Naph@HMSN@PDA溶液、浓度为5µM的CMK@HMSN@PDA溶液、浓度为10µM的Hexa-D-arginine@HMSN@PDA溶液、浓度为1.25µM的Aprotinin@HMSN@PDA溶液、浓度为10µM的Camostat@HMSN@PDA和浓度为2.5µM的E-64d@HMSN@PDA溶液，均作为实验组。用DMEM培养基稀释等体积DMSO，得到的对照溶液作为对照组。
2、将293T-hACE2细胞消化、离心后，用DMEM培养基重悬，反复吹打成单细胞悬液；之后将293T-hACE2细胞接种至96孔板（10000个293T-hACE2细胞/孔），置于细胞培养箱，静置培养过夜。
3、完成步骤2后，弃96孔板中的液相，加入步骤1制备的对照溶液、Naph@HMSN@PDA溶液、CMK@HMSN@PDA溶液、Hexa-D-arginine@HMSN@PDA溶液、Aprotinin@HMSN@PDA溶液、Camostat@HMSN@PDA溶液、E-64d@HMSN@PDA溶液或DMEM培养基（作为空白对照组）至体积为200µl。设置5个重复孔。
4、完成步骤3后，轻轻摇匀后培养24h、48h或72h，弃上清，每孔加入100µl细胞增殖活性检测试剂稀释工作液，37℃细胞培养箱中孵育2h。
5、完成步骤4后，将96孔板放入M5多功能微孔板读板机中，检测450nm的吸光度值，记录各组吸光度值并利用软件进行柱状图的绘制，根据下述公式计算细胞存活率，统计数据进行生物相容性评价。
存活率（%）=（实验组OD450nm-空白对照组OD450nm）/（对照组OD450nm-空白对照组OD450nm）×100%
各个载药纳米粒与细胞共培养后的细胞存活率见图2中D。结果表明，不同时间点选定浓度的载药纳米粒与细胞共培养后的细胞存活率均为90%以上。
由此可见，Naph@HMSN@PDA、CMK@HMSN@PDA、Hexa-D-arginine@HMSN@PDA、Aprotinin@HMSN@PDA、Camostat@HMSN@PDA和E-64d@HMSN@PDA均具有良好的生物相容性。
四、Naph@HMSN@PDA的细胞吞噬实验
1、将293T-hACE2细胞消化、离心后，用DMEM培养基重悬，反复吹打成单细胞悬液；之后将293T-hACE2细胞接种至共聚焦小皿（25000个293T-hACE2细胞/孔），置于细胞培养箱，静置培养过夜。
2、完成步骤1的第2天，加入Naph、Naph@HMSN@PDA或PBS（作为空白对照），继续培养。培养第2、第4、第6、第8、第24或第48h，弃培养基，用PBS缓冲液洗涤3次；然后用4%多聚甲醛室温固定20min，再次弃上清，PBS缓冲液洗涤3次；之后每孔加入DAPI染色溶液（0.5µg/ml），室温染色15min后，弃上清，PBS缓冲液洗涤3次；最后加200µl Tris-HCl缓冲液（pH8.5）覆盖小皿，通过激光共聚焦显微镜分别观察Naph和Naph@HMSN@PDA进入293T-hACE2细胞内情况，并进行拍摄。
同时，消化各个时间段的各组细胞，1200rpm离心5min，PBS缓冲液清洗1遍后用Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）重悬，流式细胞仪检测各组细胞的Naph荧光阳性率，检测通道为APC。
部分检测结果见图2中E和F。结果表明，载药纳米粒Naph@HMSN@PDA与293T-hACE2细胞共培养6-8h时，293T-hACE2细胞对纳米粒的摄取率到达顶峰。
五、载药纳米粒在新型冠状假病毒细胞体系中的阻断效果验证
1、将293T-hACE2细胞消化、离心后，用DMEM培养基重悬，反复吹打成单细胞悬液；之后将293T-hACE2细胞接种至96孔板（10000个293T-hACE2细胞/孔），置于细胞培养箱，静置培养过夜。
2、完成步骤1后，先加入2.5µl新型冠状假病毒溶液（广州派真生物技术有限公司的产品，病毒滴度为1×106TU/ml），37℃细胞培养箱中培养8h；之后加入载药纳米粒（Naph@HMSN@PDA、CMK@HMSN@PDA、Hexa-D-arginine@HMSN@PDA、Aprotinin@HMSN@PDA、Camostat@HMSN@PDA或E-64d@HMSN@PDA），37℃细胞培养箱中培养48h。
3、完成步骤2后，消化细胞，1200rpm离心5min，PBS缓冲液清洗1遍后用PBS缓冲液重悬，流式细胞仪检测各组细胞的EGFP阳性率，计算各组感染效率。
检测结果见图2中G。结果表明，Camostat@HMSN@PDA和E-64d@HMSN@PDA抑制新型冠状假病毒细胞的效果最佳。
实施例2、联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的构建及其在新型冠状假病毒细胞体系中的效果验证
一、联合载药纳米粒的构建
1、联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的构建及透射电镜（TEM）表征
（1）取10mg HMSN纳米粒（江苏先丰纳米材料科技有限公司，产品目录号为102968），加入1ml无菌水制成悬液；之后将悬液超声清洗至完全弥散，12000rpm离心10min，弃上清，得到HMSN纳米粒沉淀。
（2）将步骤（1）得到的HMSN纳米粒沉淀、1.25mg酶抑制剂Camostat和1.25mg酶抑制剂E-64d一起加入2.5ml无菌水中，24h避光搅拌，12000rpm离心10min，收集上清液a和沉淀a；然后用1ml无菌水洗涤沉淀a（目的为洗去未装载的酶抑制剂），12000rpm离心10min，收集上清液b和沉淀b。将上清液a和上清液b混合，混合液命名为上清A。
（3）用多功能微孔板读板机检测步骤（2）中获得的上清A，得到594 nm处的荧光值Ex和663 nm处的荧光值Em，进一步获得上清的Ex/Em值；之后根据Camostat标准曲线和E-64d标准曲线，依次获得上清中的Camostat含量和E-64d含量，进一步，根据实施例1步骤一（二）中1公式，计算包封率和载药量。
（4）将步骤（2）中获得的沉淀b用Tris-HCl缓冲液重悬并轻微超声，得到悬浊液。向所述悬浊液中加入5mg PDA，之后用Tris-HCl缓冲液定容至10ml，24h避光搅拌，离心，得到黑色沉淀。将黑色沉淀用PBS缓冲液清洗3次后重悬，得到联合载药纳米粒，命名为Camostat+E-64d@HMSN@PDA。
将步骤（4）构建的联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA稀释至最适浓度，得到样品。将铜网蘸取样品后放到滤纸片上，过夜晾干，在透射电镜下观察。
联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的透射电镜图见图3中A。
联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的包封率和载药量见图3中B。
结果表明，本发明成功构建了联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA，简称Camostat+E-64d@HMSN@PDA。
2、联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2的构建
将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA与浓度为400μg/mL的anti-ACE2混匀，并用PBS缓冲液定容至100µl，室温旋转1h，得到联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2，简称Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2。
二、检测体外细胞生长抑制率
按照实施例1中步骤二的方法，将载药纳米粒替换为联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA，其他步骤均不变。
联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的生长曲线见图3中C。结果表明，不同浓度的联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA与细胞共培养48h后，对细胞的增殖抑制呈现剂量依赖性。根据生长曲线，确定联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的工作浓度为2.5µM（由于涉及两种药物，这里以E-64d的浓度为准）。
三、生物相容性评价
按照实施例1中步骤三的方法，将载药纳米粒替换为联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA，其他步骤均不变。
联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA与细胞共培养后的细胞存活率见见图3中D。结果表明，不同时间点选定浓度的联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA与细胞共培养后的细胞存活率均为90%以上。由此可见，联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA具有良好的生物相容性。
四、联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的体外药物释放分析（透析法）
1、将5mg联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA分散于1ml 释放液（PBS溶液（pH 5.0）或PBS溶液（pH 7.4））中，然后转移至截流量为2000的透析袋中，再将透析袋置于20ml释放液，37℃避光恒温搅拌1h、2h、4h、12h、24h或48h。
2、完成步骤1后，取14ml溶液并加入等体积的释放液，通过紫外-可见分光光度计测定每个时间点释放液中Camostat在265nm处吸光度值以及E-64d在210nm处吸光度值，绘制累积释放百分率曲线。
检测结果见图3中E。结果表明，联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的累积释放量在pH 7.4的条件明显低于pH 5.0，这表明联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA的释放有pH依赖性，即酸性（pH 5.0）条件下药物快速释放，而生理（pH 7.4）条件下药物缓慢释放。在溶酶体酸性环境下，这种pH值触发的快速释药能在短时间内显著增加胞内药物浓度，从而达到有效治疗的目的。
五、联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA在新型冠状假病毒细胞感染体系中的阻断效果验证
1、空白对照组
（1）将293T-hACE2细胞消化、离心后，用DMEM培养基重悬，反复吹打成单细胞悬液；之后将293T-hACE2细胞接种至96孔板（10000个293T-hACE2细胞/孔），置于细胞培养箱，静置培养过夜。
（2）完成步骤（1）后，37℃细胞培养箱中培养56h。
（3）完成步骤（2）后，消化细胞，1200rpm离心5min，PBS缓冲液清洗1遍后用PBS缓冲液重悬，流式细胞仪检测细胞的EGFP阳性率，计算感染效率。
2、假病毒对照组
（1）将293T-hACE2细胞消化、离心后，用DMEM培养基重悬，反复吹打成单细胞悬液；之后将293T-hACE2细胞接种至96孔板（10000个293T-hACE2细胞/孔，置于细胞培养箱，静置培养过夜。
（2）完成步骤（1）后，先加入2.5µl新型冠状假病毒溶液（广州派真生物技术有限公司的产品，病毒滴度为1×106TU/ml），37℃细胞培养箱中培养56h。
（3）完成步骤（2）后，消化细胞，1200rpm离心5min，PBS缓冲液清洗1遍后用PBS缓冲液重悬，流式细胞仪检测细胞的EGFP阳性率，计算感染效率。
3、Camostat组
（1）将293T-hACE2细胞消化、离心后，用DMEM培养基重悬，反复吹打成单细胞悬液；之后将293T-hACE2细胞接种至96孔板（10000个293T-hACE2细胞/孔，置于细胞培养箱，静置培养过夜。
（2）完成步骤（1）后，先加入2.5µl新型冠状假病毒溶液（广州派真生物技术有限公司的产品，病毒滴度为1×106TU/ml），37℃细胞培养箱中培养8h；之后加入Camostat，37℃细胞培养箱中培养48h。
（3）完成步骤（2）后，消化细胞，1200rpm离心5min，PBS缓冲液清洗1遍后用PBS缓冲液重悬，流式细胞仪检测细胞的EGFP阳性率，计算感染效率。
4、E-64d组
按照步骤3的方法，将步骤（2）中的Camostat替换为E-64d，其它步骤均不变。
5、Camostat+E-64d组
按照步骤3的方法，将步骤（2）中的Camostat替换为Camostat和E-64d，其它步骤均不变。
6、Camostat@HMSN@PDA组
按照步骤3的方法，将步骤（2）中的Camostat替换为载药纳米粒Camostat@HMSN@PDA，其它步骤均不变。
7、E-64d@HMSN@PDA组
按照步骤3的方法，将步骤（2）中的Camostat替换为载药纳米粒E-64d@HMSN@PDA，其它步骤均不变。
8、Camostat+E-64d@HMSN@PDA组
按照步骤3的方法，将步骤（2）中的Camostat替换为联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA，其它步骤均不变。
9、anti-ACE2组
（1）将293T-hACE2细胞消化、离心后，用DMEM培养基重悬，反复吹打成单细胞悬液；之后将293T-hACE2细胞接种至96孔板（10000个293T-hACE2细胞/孔，置于细胞培养箱，静置培养过夜。
（2）完成步骤（1）后，先加入2.5µl新型冠状假病毒溶液（广州派真生物技术有限公司的产品，病毒滴度为1×106TU/ml），37℃细胞培养箱中培养8h；之后加入anti-ACE2（R&D公司的产品，产品货号为AF933），37℃细胞培养箱中培养48h。
（3）完成步骤（2）后，消化细胞，1200rpm离心5min，PBS缓冲液清洗1遍后用PBS缓冲液重悬，流式细胞仪检测细胞的EGFP阳性率，计算感染效率。
10、Camostat@HMSN@PDA-anti-ACE2组
按照步骤3的方法，将步骤（2）中的Camostat替换为联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2，其它步骤均不变。
11、E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2组
按照步骤3的方法，将步骤（2）中的Camostat替换为载药纳米粒E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2，其它步骤均不变。
12、Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2组
按照步骤3的方法，将步骤（2）中的Camostat替换为载药纳米粒Camostat@HMSN@PDA-anti-ACE2，其它步骤均不变。
检测结果见图3中F、G和H。结果表明，与载药纳米粒Camostat@HMSN@PDA和载药纳米粒E-64d@HMSN@PDA相比，联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA抑制新型冠状假病毒感染细胞的效果最佳。
实施例3、纳米工程化红细胞的构建及功能效果验证
一、红细胞凝集实验
1、红细胞的提取
（1）小鼠心脏取血
固定鼠，剪去胸部毛发，常规消毒。在胸骨左侧3-4肋间摸到心尖搏动，在心搏最明显处作刺穿点，右手持注射器，在胸骨左缘3cm处将针头插入肋间隙，在左手触摸到心跳的配合下，垂直刺入心脏，当持针手感到心脏搏动时，再稍微刺入即到达心腔，取血体积大约为0.5ml。
（2）完成步骤（1）后，4℃、1000g离心10min，弃上层血清，在血浆和红细胞之间的界面上观察到含有包细胞的棕黄层弃去，留下最下层红细胞。
（3）完成步骤（2）后，将分离的红细胞转移至离心管，加入冷的DPBS（pH 7.4），轻轻上下混匀，洗涤红细胞，再次4℃、650g离心15min，重复洗涤3次。
（4）完成步骤（3）后，弃缓冲液上清后，用1ml PBS缓冲液重悬红细胞，得到浓度为3×109个/ml的红细胞溶液。
2、红细胞凝集实验
（1）分为四组进行实验：
NPs RBCs组（Camostat+E-64d@HMSN@PDA搭载红细胞组）：将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA与红细胞溶液按照200个纳米粒子：1个红细胞、1000个纳米粒子：1个红细胞、3000个纳米粒子：1个红细胞或5000个纳米粒子：1个红细胞的投料比（1mgCamostat+E-64d@HMSN@PDA大约有1×1012个纳米粒子）进行混合，然后加入PBS缓冲液，得到总体积为100µl的混合液。之后将混合液加入96孔“U”形微量反应板。
NPs RBCs+IgG组（Camostat+E-64d@HMSN@PDA+IgG搭载红细胞组）：将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA与红细胞溶液按照200个纳米粒子：1个红细胞、1000个纳米粒子：1个红细胞、3000个纳米粒子：1个红细胞或5000个纳米粒子：1个红细胞的投料比（1mgCamostat+E-64d@HMSN@PDA大约有1×1012个纳米粒子）进行混合，然后加入PBS缓冲液和IgG，得到总体积为100µl的混合液，混合液中IgG的浓度为400 μg/mL。之后将混合液加入96孔“U”形微量反应板。
No NPs组（空白组）：向96孔“U”形微量反应板中加入红细胞，作为阴性对照。
Donkey serum组（驴血清对照组）：向96孔“U”形微量反应板中加入红细胞和驴血清作为阳性对照。
（2）将96孔“U”形微量反应板放入孵箱，37℃孵育30min。
（3）拍照。
红细胞凝集反应结果见图4中A。结果表明，联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA与红细胞的投料比越大，凝集现象越明显，但当加入IgG时，能够有效缓解。
二、纳米工程化红细胞的构建
1、将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2与红细胞以200个纳米粒子：1个红细胞、1000个纳米粒子：1个红细胞、3000个纳米粒子：1个红细胞或5000个纳米粒子：1个红细胞的投料比（1mg 联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2大约有1×1012个纳米粒子）进行混匀，然后用PBS缓冲液补齐至500µl，4℃恒定旋转2h。
2、完成步骤1后，400g离心8min（目的为除去未结合的抗体），洗涤3次，重悬于500µl PBS缓冲液，得到纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs，4℃储存。
按照上述步骤，将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2替换为联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA，得到纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA+RBCs。
按照上述步骤，将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2替换为混合物，其他步骤均不变，得到纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA+IgG+RBCs。混合物的制备方法为：将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA与浓度为400μg/mL的IgG混匀，并用PBS缓冲液定容至100µl，室温旋转1h，得到混合物。
三、联合载药纳米粒的溶血实验
1、为探究IgG对联合载药纳米粒溶血的影响，设置Camostat+E-64d@HMSN@PDA搭载红细胞组、Camostat+E-64d@HMSN@PDA+IgG搭载红细胞组、阳性对照和空白对照，进行如下实验：
Camostat+E-64d@HMSN@PDA搭载红细胞组：分别将0.01mg Camostat+E-64d@HMSN@PDA、0.05mg Camostat+E-64d@HMSN@PDA、0.15mg Camostat+E-64d@HMSN@PDA和0.25mgCamostat+E-64d@HMSN@PDA与红细胞（投料比分别为200个纳米粒子：1个红细胞、1000个纳米粒子：1个红细胞、3000个纳米粒子：1个红细胞或5000个纳米粒子：1个红细胞，1mgCamostat+E-64d@HMSN@PDA大约有1×1012个纳米粒子），一起加入PBS缓冲液，得到总体积为1ml的混合液，缓慢倒转混匀。
Camostat+E-64d@HMSN@PDA+IgG搭载红细胞组：分别将0.01mg Camostat+E-64d@HMSN@PDA、0.05mg Camostat+E-64d@HMSN@PDA、0.15mg Camostat+E-64d@HMSN@PDA和0.25mg Camostat+E-64d@HMSN@PDA与红细胞（投料比分别为200个纳米粒子：1个红细胞、1000个纳米粒子：1个红细胞、3000个纳米粒子：1个红细胞或5000个纳米粒子：1个红细胞，1mg Camostat+E-64d@HMSN@PDA大约有1×1012个纳米粒子）一起加入PBS缓冲液和IgG，得到总体积为1ml的混合液，混合液中IgG的浓度为400 μg/mL。缓慢倒转混匀。
阳性对照：向EP管中加入1ml 0.2% Triton溶液。
空白对照：向EP管中加入1ml PBS缓冲液。
2、完成步骤1后，将EP管一起置于37℃恒温水浴锅中孵育1h，1500rpm离心5min；然后取800µl上清液，10000rpm离心10min；之后取150µl上清液置于96孔板，并设置3个复孔，使用酶标仪检测上清液在414nm处的吸收值（用Abs表示）。按照下述公式计算溶血率。
溶血率=（Abs样品-Abs空白对照）/（Abs阳性对照-Abs空白对照）×100%
检测结果见图4中B。结果表明，在体系中加入IgG时，能够降低联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA对红细胞造成的溶血效应。
四、纳米工程化红细胞的体外血清稳定性实验
1、设置Cy5@HMSN@PDA搭载红细胞组和Cy5@HMSN@PDA+IgG搭载红细胞组，进行如下实验：
Cy5@HMSN@PDA搭载红细胞组：将模式纳米粒Cy5@HMSN@PDA与红细胞以1000个纳米粒子：1个红细胞、3000个纳米粒子：1个红细胞或5000个纳米粒子：1个红细胞的投料比（1mgCy5@HMSN@PDA大约有1×1012个纳米粒子）进行混匀，400g离心8min，加入1ml 胎牛血清（FBS），37℃、12rpm孵育（模拟体内正常血管剪切力条件）0或0.5h，得到Cy5@HMSN@PDA+RBCs。
Cy5@HMSN@PDA+IgG搭载红细胞组：将模式纳米粒Cy5@HMSN@PDA与红细胞以1000个纳米粒子：1个红细胞、3000个纳米粒子：1个红细胞或5000个纳米粒子：1个红细胞的投料比（1mg Cy5@HMSN@PDA大约有1×1012个纳米粒子）进行混匀，400g离心8min，之后加入1ml 含有400μg IgG的胎牛血清（FBS），37℃、12rpm孵育（模拟体内正常血管剪切力条件）0或0.5h，得到Cy5@HMSN@PDA +IgG+RBCs。
2、完成步骤1后，400g离心8min，用PBS缓冲液重悬。
3、完成步骤2后，用流式细胞仪检测0和0.5h两个时间段各组红细胞的Cy5阳性率，以检测在低剪切生理条件下纳米工程化红细胞的稳定性。
检测结果见图4中C。结果表明，用流式检测低剪切生理环境下，不同投料比构建的Cy5@HMSN@PDA-RBCs和Cy5@HMSN@PDA +IgG-RBCs均能保持高水平负载率。
五、红细胞渗透脆性
1、取16支小试管（编号分别为1-16），加入不同体积的生理盐水和无菌水，配置成不同浓度的NaCl溶液，其中无菌水为阳性对照（编号为15），生理盐水为阴性对照（编号为16）。总体积均为10ml。具体见表1。
2、向红细胞（7.5×106个）、纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA+RBCs（红细胞数目为7.5×106个，Camostat+E-64d@HMSN@PDA与红细胞的投料比为5000个纳米粒子：1个红细胞）或纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA+IgG+RBCs（红细胞数目为7.5×106个，Camostat+E-64d@HMSN@PDA与红细胞的投料比为5000个纳米粒子：1个红细胞）中加入1ml步骤1制备的不同浓度的NaCl溶液，轻轻颠倒混匀。
3、完成步骤2后，室温放置30 min，3000g离心3min，收集上清。将200µl上清置于96孔板中，并设置3个复孔，使用酶标仪检测上清在414nm处的吸收值（用Abs表示）。按照下述公式根据吸收值计算溶血率。
溶血率=Abs样品/Abs阳性对照×100%
检测结果见图4中D。结果表明，红细胞、纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA+RBCs和纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA+IgG+RBCs对不同浓度低渗NaCl溶血的抵抗力基本一致。
六、纳米工程化红细胞的扫描电镜（SEM）表征
取红细胞（107个）、纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA+RBCs（红细胞数目为107个，Camostat+E-64d@HMSN@PDA与红细胞的投料比为5000个纳米粒子：1个红细胞）或纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA+IgG+RBCs（红细胞数目为107个，Camostat+E-64d@HMSN@PDA与红细胞的投料比为5000个纳米粒子：1个红细胞），离心，加电镜固定液并将细胞吹打开，悬浮于固定液内室温避光固定30min，再转移至4℃保存，过夜后进行扫描电镜拍摄鉴定。
检测结果见图4中E。结果表明，红细胞能够有效负载联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA。
七、模式纳米粒Cy5-NH2-HMSN搭载红细胞体内示踪实验
1、取9只C57小鼠，随机分为对照组、实验组和治疗组，每组3只，进行如下处理：
对照组（Ctrl组）：尾静脉注射500µl PBS缓冲液；
实验组（Cy5-NH2-HMSN组）：尾静脉注射0.65mg 模式纳米粒Cy5-NH2-HMSN，用PBS缓冲液稀释，总体积为500µl；
治疗组（Cy5-NH2-HMSN搭载红细胞组）：尾静脉注射0.65mg 模式纳米粒Cy5-NH2-HMSN 与红细胞混合液（模式纳米粒Cy5-NH2-HMSN与红细胞溶液以5000个纳米粒子：1个红细胞的投料比混合制备，1mg 模式纳米粒Cy5-NH2-HMSN大约有1×1012个纳米粒子）用PBS缓冲液稀释，总体积为500µl。
2、分别在完成步骤1的第0.5、第2、第18和第24h，解剖小鼠的各个脏器，包括心、肝、脾、肺和肾，利用小鼠活体成像仪观察Cy5荧光，体内示踪纳米粒子。
检测结果见图4中F。结果表明，通过Cy5荧光在不同时间段仍然在肺中高表达可以表明尾静脉注射Cy5-NH2-HMSN+RBCs能够高效到达肺部。由此可见，本发明制备的纳米工程化红细胞能够精准靶向肺组织。
实施例4、纳米工程化红细胞在新型冠状病毒入侵肺部靶细胞的动物模型中的阻断效果
一、构建模式纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs体内治疗模型
1、从江苏集萃药康生物科技股份有限公司购买K18-hACE2转基因小鼠，K18-hACE2转基因小鼠以下简称小鼠。
2、从南京诺唯赞生物科技股份有限公司购买新型冠状假病毒，其名称为SARS-CoV-2-Fluc WT 。
3、小鼠肺部给药
（1）将小鼠进行异氟烷麻醉，麻醉后将其固定在可调角度手术板上；
（2）利用小鼠喉镜观察气管位置；
（3）用肺部雾化给药器吸取50µl新型冠状假病毒（病毒滴度为5904900 TCID50/ml），将给药器针头经小鼠口腔插入气管进行喷雾给药。
（4）给药结束后小心拉扯小鼠舌头，避免窒息，然后将小鼠放回饲养笼，等待其苏醒，获得新型冠状病毒入侵肺部靶细胞的动物模型。
4、纳米工程化红细胞治疗
纳米工程化红细胞治疗组：
（1）将小鼠固定在小鼠固定器内，使尾巴外露，尾部用45-50℃的温水浸泡半分钟，或用酒精擦拭使血管扩张，并可使表皮角质软化，将鼠尾向左或向右拧好，使一侧尾静脉朝上；
（2）用注射器吸取500 µl纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs（红细胞数目为1.25×108个，Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2与红细胞的投料比为5000个纳米粒子：1个红细胞）；然后左手食指和中指捏住鼠尾上下，使静脉充盈，用无名指从下面托起尾巴，以拇指和小指夹住尾巴的末梢，右手持注射器，使枕头与静脉平行，从尾下四分之一处进针，刺入后先缓注少量药液，如无阻力，可继续注入，注射完毕后把尾巴向注射侧弯曲以止血。
新冠假病毒组：按照上述步骤将500 µl纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs替换为500 µl PBS缓冲液，其它步骤均不变。
二、小鼠活体成像
完成步骤一后，生物发光成像检测小鼠全身Luc表达。
小鼠肺部Luc的表达情况见图5中A。结果表明，纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs能够有效阻断新型冠状病毒的入侵。
三、组织脏器HE染色检测
1、完成步骤二后，处死小鼠，解剖小鼠的脏器组织（包括心、肝、脾、肺和肾），之后固定、脱水。将处理后的组织样品进行常规的石蜡包埋，然后用石蜡切片机进行厚度4µm的切片，置于载玻片上。
2、将石蜡切片置于恒温箱中，60℃烘烤60min。
3、将切片趁热放入脱蜡二甲苯Ⅰ浸泡15min，更换二甲苯Ⅱ浸泡15min。
4、切片依次放入100%乙醇5min，90%乙醇5min，70%乙醇5min，ddH2O中各浸泡5min。
5、将水化后的切片在自来水中浸泡清洗，之后浸入Harris苏木素中，充分染色5min；然后使用1%的盐酸酒精进行分化，使细胞核中结合过多的染液和细胞浆中的多余的染液被除去；分化后自来水洗涤，浸入0.1%氨水中泛蓝1min，再次自来水洗涤。
6、切片于酸化伊红中浸泡3min，自来水洗涤；之后于90%乙醇以及无水乙醇中梯度脱水。
7、从二甲苯中取出，残余二甲苯很快挥发，中性树脂封片。
检测结果见图5中B。结果表明，采用纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs治疗的小鼠的脏器（如心、肝、脾、肺、肾）无损伤。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (4)

1.纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs的制备方法，包括如下步骤：
（a1）将HMSN纳米粒、酶抑制剂Camostat和酶抑制剂E-64d混合，避光搅拌12h以上，离心，收集并洗涤沉淀1；
（a2）重悬沉淀1，之后加入聚多巴胺PDA，避光搅拌12h以上，离心，收集并洗涤沉淀2；沉淀2即为联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA；
（a3）将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA和anti-ACE2混匀，20-30℃反应1h以上，得到联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2；
（a4）将联合载药纳米粒Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2与红细胞以200-5000个纳米粒子：1个红细胞的比例混匀，2-6℃反应2h以上；
（a5）完成步骤（a4）后，离心并洗涤，得到纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤（a1）中，所述洗涤为用无菌水洗涤；
所述步骤（a2）中，所述重悬为用Tris-HCl缓冲液重悬；所述洗涤为用PBS缓冲液洗涤。
3.权利要求1或2所述制备方法制备的纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs。
4.权利要求3所述纳米工程化红细胞Camostat+E-64d@HMSN@PDA-anti-ACE2+RBCs的应用，为e1）或e2）：
e1）制备用于阻断新型冠状病毒入侵肺部细胞的产品；
e2）制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病的产品。
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