CN110327314B

CN110327314B - 一种可气溶胶化的A型肉毒毒素AHc亚单位疫苗干粉吸入剂

Info

Publication number: CN110327314B
Application number: CN201910665269.4A
Authority: CN
Inventors: 杨慧盈; 干长姣; 周冬生; 孙岩松; 法云智; 高波; 邱业峰; 焦周光; 郝淮杰; 杨文慧; 胡凌飞; 赵月娥; 于学东; 熊小路; 焦俊; 殷喆
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2039-07-23
Also published as: CN110327314A

Abstract

本发明公开了一种可气溶胶化的A型肉毒毒素AHc亚单位疫苗干粉吸入剂。本发明通过喷雾冷冻干燥法成功制备了AHc亚单位疫苗干粉。其空气动力学质量中值直径(MMAD)接近2.5μm，粒子呈圆球状，形态疏松多孔，粒径分布较均匀。此范围粒径有利于疫苗沉积到肺深部，增加抗原与粘膜组织接触反应的时间，提高免疫保护效果。本发明制备的重组AHc亚单位疫苗干粉符合肺递送免疫要求，经肺递送免疫可保护小鼠抵御1440倍LD₅₀的BoNT/A复合物攻击，为肉毒毒素亚单位疫苗干粉疫苗的研制及肺递送免疫保护效果的研究奠定了基础，为其吸入干粉疫苗研制提供了先进的技术方案。

Description

一种可气溶胶化的A型肉毒毒素AHc亚单位疫苗干粉吸入剂

技术领域

本发明涉及一种可气溶胶化的A型肉毒毒素AHc亚单位疫苗干粉吸入剂。

背景技术

肉毒毒素是由肉毒梭菌产生的神经毒素,是目前已知毒性最强的生物毒素，根据抗原性可分为分为八种血清型A-H，其中自然存在的A、B、E和F型能够引起人类中毒,属于危害性最高的A类生物战剂之一。

A型肉毒毒素是经典的AB蛋白毒素，分子量为150kDa，通过二硫键链接一条50kDa的轻链和一条100kDa的重链；其中重链的C端为受体结合区(Hc结构域),可用于制备亚单位疫苗，重组蛋白Hc亚单位疫苗具有生产过程安全，费用低等优点，多次免疫后可激发机体产生较强的免疫应答。可以弥补BoNT类毒素疫苗(PBT)工艺复杂、危险性高、推广应用受限等缺点。

疫苗的防护效果同时受疫苗成分、载体、佐剂、剂型、接种途径等因素影响。目前疫苗的改进方向众多，例如针对亚单位疫苗载体修饰、佐剂优化等，气溶胶化疫苗经肺吸入免疫接种后，疫苗成分能更多地沉积于肺深部，能诱导与传统免疫接种途径相当甚至更高的全身免疫，并能诱导传统免疫接种途径欠缺的黏膜局部免疫应答。有研究表明，抗原包裹在赋型剂中制成的干粉疫苗在肺局部的黏附力较好，从而延缓了黏膜对其的清除速度，增加了抗原递呈的时间。同时，干粉剂型具有良好的热稳定性，较液体疫苗节省了运输与保存成本。

人工合成的含有CpG基序(C指胞嘧啶，cytosine；G指鸟嘌呤，guanine；P指两者间的磷酸二酯键，phosphorylated)的寡聚糖脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpGODN)，是TLR(Toll样受体)9激动剂，具有微生物CpG DNA的免疫刺激作用，可作为免疫佐剂。

喷雾冷冻干燥法是通过雾化喷头把需要干燥的液体雾化成为细小的雾化液滴在液氮作用下迅速冷冻成冰晶；通过升华原理，对冻结粉末进行真空冷冻干燥，最终获得干燥的细颗粒物成品。

发明内容

本发明的目的是提供一种可气溶胶化的A型肉毒毒素AHc亚单位疫苗干粉吸入剂。

第一方面，本发明保护一种干粉吸入剂的制备方法，包括如下步骤：(A)制备液体制剂；(B)将步骤(A)制备的液体制剂经过喷雾冷冻干燥处理得到所述干粉吸入剂；

所述液体制剂中含有以下质量百分含量的溶质：AHc蛋白或具有AHc蛋白的融合蛋白0.1％、CpG 0.05-0.15％、甘露醇0.5-1.5％、肌醇0.5-1.5％、亮氨酸0.4-0.6％和泊洛沙姆0.04-0.06％；

AHc蛋白为如下(1)或(2)：

(1)序列表的序列1所示的蛋白质；

(2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

具有AHc蛋白的融合蛋白为在AHc蛋白的N末端和/或C末端融合标签蛋白得到的。标签蛋白与AHc蛋白可以直接融合连接，也可以通过1-10个氨基酸残基的连接肽融合连接。具有AHc蛋白的融合蛋白具体可为AHc-His₆蛋白。AHc-His₆蛋白具体可为序列表的序列3所示的蛋白质。

所述液体制剂的溶剂为水。

在本发明的实施例中，所述液体制剂中具体含有以下质量百分含量的溶质：AHc蛋白或具有AHc蛋白的融合蛋白0.1％、CpG 0.1％、甘露醇1％、肌醇1％、亮氨酸0.5％和泊洛沙姆0.05％。

上述方法中，所述步骤(B)包括如下步骤(B1)-(B3)：

(B1)将步骤(A)制备的液体制剂4℃预处理1-3h；

(B2)完成步骤(B1)后，将液体制剂采用二流体喷头喷雾至液氮；喷头离液氮液面的距离为9-11cm；喷雾时气泵气压为0.1-0.2兆帕；

(B3)完成步骤(B2)后，将冰晶连同少量剩余液氮真空冷冻干燥。

上述步骤(B1)中，所述预处理时间具体可为2h。

上述步骤(B2)中，喷头离液氮液面的距离具体可为10cm。

上述步骤(B2)中，喷雾时气泵气压具体可为0.15兆帕。

上述步骤(B3)中，所述冷冻干燥时间具体可为36h。

第二方面，本发明保护利用第一方法中所示的方法制备得到的干粉吸入剂。

第三方面，本发明保护第二方面中所述的干粉吸入剂的应用，为如下(a1)-(a3)中的任一种：

(a1)作为A型肉毒毒素疫苗；

(a2)制备A型肉毒毒素疫苗；

(a3)制备用于预防和/或治疗A型肉毒毒素感染的产品。

第四方面，本发明保护一种A型肉毒毒素疫苗，其有效成分为第二方面中所述的干粉吸入剂。

所述疫苗为肺递送疫苗。

第五方面，本发明一种用于预防和/或治疗A型肉毒毒素感染的产品，其有效成分为第二方面中所述的干粉吸入剂。

第六方面，本发明一种预防和/或治疗A型肉毒毒素感染的套件，包括第二方面中所述的干粉吸入剂和干粉气溶胶肺递送装置。

第七方面，本发明保护在第一方面中任一所述的液体制剂。

第八方面，本发明第七方面中所述的液体制剂在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a3)中的任一种：

(a1)作为A型肉毒毒素疫苗；

(a2)制备A型肉毒毒素疫苗；

(a3)制备用于预防和/或治疗A型肉毒毒素感染的产品。

所述产品具体可为干粉吸入剂。

以上任一所述的A型肉毒毒素具体可为A型肉毒神经毒素(BoNT/A)。

本发明通过喷雾冷冻干燥法成功制备了AHc亚单位疫苗干粉。其空气动力学质量中值直径(MMAD)接近2.5μm，粒子呈圆球状，形态疏松多孔，粒径分布较均匀。此范围粒径有利于疫苗沉积到肺深部，增加抗原与粘膜组织接触反应的时间，提高免疫保护效果。本发明制备的重组AHc亚单位疫苗干粉符合肺递送免疫要求，经肺递送免疫可保护小鼠抵御1440倍LD₅₀的BoNT/A复合物攻击，为肉毒毒素亚单位疫苗干粉疫苗的研制及肺递送免疫保护效果的研究奠定了基础，为其吸入干粉疫苗研制提供了先进的技术方案。

附图说明

图1为实施例2中制备的干粉成品图。

图2为实施例3中生物活性检测结果。

图3为实施例3中含水量检测结果。

图4为实施例3中吸湿曲线。

图5为实施例3中扫描电镜观察结果。

图6为实施例3中总粒子粒度分布检测结果。

图7为实施例4的第一部分中的小鼠生存曲线。

图8为实施例4的第二部分中的小鼠生存曲线。

图9为实施例4的第二部分中的小鼠症状观察结果。

图10为实施例4的第二部分中的小鼠体重统计结果。

图11为实施例4的第二部分中的小鼠抗体水平统计结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

CpG，全称为Class B CpG oligonucleotide(B类CpG寡核苷酸)，具有免疫激活功能，是针对人或小鼠TLR9的免疫刺激剂，是一种典型的黏膜免疫佐剂。实施例中所用的CpG，为sigma公司产品目录号为tlrl-2006的产品，该产品的网址链接为：https://www.invivogen.com/odn2006。

甘露醇：Sigma，M1902。

肌醇：Sigma，I7508。

亮氨酸：Sigma，L8912。

泊洛沙姆：Sigma，P5556。

手持式液体气溶胶肺递送装置：北京慧荣和科技有限公司。

手持式干粉气溶胶肺递送装置：北京慧荣和科技有限公司。

实施例1、蛋白的制备

一、A型肉毒神经毒素(BoNT/A)的制备

制备A型肉毒神经毒素。按照文献(《一种方便易用的A型肉毒毒素活性检测方法的建立》，刘婧)中记载的方法进行制备。采用A型肉毒梭菌(Clostridium botulinum typeA)62A，先进行增菌和产毒培养，然后进行沉淀和抽提，然后进行硫酸铵沉淀(60％的饱和度)与去除核酸，然后进行凝胶过滤与离子交换层析，得到A型肉毒神经毒素溶液。具体步骤见文献。

取A型肉毒神经毒素溶液，BCA法测定蛋白浓度，蛋白浓度为0.3mg/mL。

二、AHc蛋白的制备

AHc蛋白即A型肉毒神经毒素的重链中的无毒50kD羧基端片段。AHc蛋白如序列表的序列1所示，序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列1所示的AHc蛋白。

1、重组载体pTIG-Trx的构建

重组载体pTIG-Trx：将载体pET-22b(+)中的特异DNA片段取代为序列表的序列4所示的DNA分子，得到重组载体pTIG-Trx。特异DNA片段指的是载体pET-22b(+)中自Nde I酶切识别序列开始至His₆标签编码序列后的终止密码子结束。

序列表的序列4所示的DNA分子中，第4-360位核苷酸为Trx基因的编码框，第360-1676位核苷酸为AHc-His₆蛋白的编码框。

Trx基因编码硫氧还蛋白。硫氧还蛋白是参与新生蛋白肽链折叠的辅助蛋白，当重组蛋白与之共表达时，它可促进下游正在折叠的目的蛋白通过异构反应获得正确的折叠，另外，也能够增强胞内蛋白质的二硫键的形成，使表达产物不易形成包涵体。

AHc-His₆蛋白是在AHc蛋白的C末端融合His₆标签得到的(它们之间具有2个氨基酸残基的间隔)，如序列表的序列3所示。

2、将重组载体pTIG-Trx导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

3、将步骤2得到的重组菌接种至含100mg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃、250rpm培养至对数生长期(OD_600nm约为0.4-0.6)。

4、完成步骤3后，在体系中加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.2mmol/L，然后30℃、250rpm诱导培养5小时，然后收集菌体沉淀。

5、取步骤4得到的菌体沉淀，进行超声破碎，收集上清液。

6、取步骤5得到的上清液，采用Ni-NTA亲和层析柱(购自法玛西亚公司)并参照说明书进行蛋白纯化，将纯化收集的溶液转移到透析袋中，在PBS缓冲液中进行透析，得到AHc-His₆蛋白溶液。

7、蛋白浓度检测

取AHc-His₆蛋白溶液(下述实验中简称AHc蛋白)，BCA法测定蛋白浓度，蛋白浓度为3.092mg/mL。

实施例2、AHc亚单位疫苗干粉的制备

一、喷雾前样品的制备

1、AHc亚单位疫苗干粉喷雾前样品

AHc亚单位疫苗干粉喷雾前样品(pH 7.2)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在喷雾前样品中的浓度为：实施例1中制备的AHc蛋白0.1％(质量百分含量)、CpG 0.1％(质量百分含量)、甘露醇1％(质量百分含量)、肌醇1％(质量百分含量)、亮氨酸0.5％(质量百分含量)、泊洛沙姆0.05％(质量百分含量)；所述溶剂为去离子水。

2、CpG干粉喷雾前样品

CpG干粉喷雾前样品(pH 7.2)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在喷雾前样品中的浓度为：CpG 0.1％(质量百分含量)、甘露醇1％(质量百分含量)、肌醇1％(质量百分含量)、亮氨酸0.5％(质量百分含量)、泊洛沙姆0.05％(质量百分含量)；所述溶剂为去离子水。

二、干粉吸入剂的制备

将20ml步骤一制备的AHc亚单位疫苗干粉喷雾前样品和CpG干粉喷雾前样品分别按照下述步骤操作，得到AHc亚单位疫苗干粉和CpG干粉。

1、将喷雾前样品4℃冰浴2h。

2、完成步骤1后，将20ml预冷的样品转入20ml注射器中，连接上二流体喷头，直接喷雾至液氮(液氮置于不锈钢盆中，不锈钢盆底部直径约16cm，高约13cm，加入液氮体积约2L)中，喷雾过程中一直伴随着搅拌，喷头离液氮液面≈10cm，设置气泵气压0.15兆帕(1.5Bar)。喷出来的雾化液滴，在液氮作用下迅速冷冻成冰晶，记录喷雾时长，共5min。将冰晶连同少量剩余液氮，转至不锈刚杯中，开口处封上一层纱布，置于真空冷冻干燥机中干燥36h。

3、完成步骤2后，收集干粉样品至5ml的带橡胶塞的西林瓶中，得到干粉，-20℃密封贮存。

共制备AHc亚单位疫苗干粉516.9mg；共制备CpG干粉388.9mg。(图1)。

实施例3、AHc亚单位疫苗干粉的特性分析

一、生物活性检测

1、取实施例2制备的AHc亚单位疫苗干粉、CpG干粉和实施例1中制备的AHc蛋白溶液，采用SDS-PAGE检测目的蛋白。

结果如图2所示。结果表明，AHc干粉条带和AHc蛋白溶液的条带在同一位置，约为50kD，且没有杂带，而CpG干粉在同一位置没有条带，可见AHc蛋白制备成干粉依旧保持了蛋白的结构稳定性，且没有免疫佐剂和赋型剂的干扰。

二、含水量及吸湿曲线测定

采用热重分析仪测定AHc亚单位疫苗干粉残留水分含量。

吸湿曲线测定方法如下：

1、将电子天平放入恒温恒湿箱中，调节参数为湿度60％，25℃进行平衡(约1h)。

2、完成步骤1后，取小平皿去盖于电子天平称量，去皮。

3、完成步骤2后，取一定量的实施例2制备的AHc亚单位疫苗干粉置于小平皿内，迅速放入电子天平中，记录所加干粉的质量，调零，每隔30min记录一次增加质量，总时间6h。计算每个时间点相对于0时间点的重量增加百分比(％)，绘制吸湿曲线。

含水量检测结果如图3所示。在100℃，AHc亚单位疫苗干粉中残余水分为0.03616％。

吸湿曲线如图4所示。在25℃，60％RH条件下，AHc亚单位疫苗干粉的吸湿能力在35％左右，约120min时达到平衡。

三、观察粒子形态和粒度分布

通过扫描电镜观察AHc亚单位疫苗干粉粒子，取多个视野，观察粒子形态。

结果如图5所示。AHc亚单位疫苗干粉粒子呈现圆球状，疏松多孔。

四、空气动力学参数检测

开启小型气溶胶沉降评测舱(舱内底部直径0.76m、高0.73m)，调至循环风模式；开启质量浓度检测仪TSI 8530，实时监测舱内气溶胶粒子质量浓度，采样流量3L/min，直至舱内气溶胶粒子质量浓度降低至0.005mg/m³；关闭舱内循环风，开启舱内底部放置的小功率风扇；打开评测舱采样口，使用小鼠适用手持式生物干粉气溶胶肺递送装置向舱内发生干粉气溶胶，发生量0.5-5mg/次，只发生1次；干粉气溶胶发生后风扇混匀30S，关闭风扇；使用激光粒度分析仪TSI 3321，并在采样口前段连接慧荣和生产的稀释器，采样流量5L/min，采样时间5min。检测指标包括单次采样的总粒子粒度分布和总粒子空气动力学质量中值直径，实验重复三次。

总粒子粒度分布如图6所示。总粒子空气动力学质量中值直径如表1所示。

结果显示，AHc亚单位疫苗干粉的总粒子空气动力学质量中值直径符合要求(≈2.5μm)。

表1

实施例4、AHc亚单位疫苗干粉的免疫原性及免疫保护性评价

一、A型肉毒神经毒素溶液气溶胶肺递送感染的半数致死剂量研究

采用改进寇式法(Karber)测定A型肉毒神经毒素对小鼠的半数致死剂量(LD₅₀)。

设置5个剂量的攻毒组，即第1组至第5组，每组10只BALB/c小鼠(每只小鼠体重15-17g)。处理过程：先腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉(麻醉前3h禁食和禁饮，戊巴比妥钠的使用剂量为60mg/kg体重，1％戊巴比妥钠用生理盐水配制)；完全麻醉后，小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，右手用小镊子轻夹住小鼠舌部并向上提起，左手拿带光源的小鼠喉镜使其声门暴露，看见气管入口后将手持式液体气溶胶肺递送装置的喷雾头插入气管快速攻毒(每只小鼠的攻毒体积均为50μL)；攻毒完成后退出喷雾头和喉镜，并继续保持小鼠头处于较高位置的姿势10-20s，然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。攻毒采用实施例1制备的A型肉毒神经毒素溶液的稀释液(溶剂为PBS缓冲液)，第1组至第5组的攻毒剂量依次为281.25ng/kg体重、234.375ng/kg体重、187.5ng/kg体重、140.625ng/kg体重、93.75ng/kg体重。

设置空白对照组，5只BALB/c小鼠(每只小鼠体重15-17g)，用等体积PBS缓冲液代替A型肉毒神经毒素溶液的稀释液。

每24小时作为1天，分别于攻毒0时刻，攻毒1天后、攻毒2天后、攻毒3天后、攻毒4天后、攻毒5天后、攻毒6天后、攻毒7天后，记录存活小鼠数量，计算死亡率，结果见表2。小鼠生存曲线如图7所示。采用改进寇式法公式计算半数致死剂量(LD₅₀)。半数致死剂量为165.679ng/kg体重。

表2

每24小时作为1天，分别于攻毒0时刻，攻毒1天后、攻毒2天后、攻毒3天后、攻毒4天后、攻毒5天后、攻毒6天后、给药7天后，观察并记录小鼠病症(虚脱，不活动，毛发直立，息肉样，拒绝进食或饮水，以及某些情况下的上睑下垂等)。小鼠在攻毒6-12小时后出现虚脱，不活动，毛发直立，息肉样，拒绝进食或饮水，对外部刺激后反应迟钝等症状。随后部分小鼠症状逐渐加重，攻毒剂量越高的组别中，有临床症状小鼠数量越多。

二、AHc亚单位疫苗干粉的免疫原性及免疫保护性评价

实验动物：BALB/c小鼠(SPF级雌性，6-8周，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006)。

将实验动物按照表3所示方式分为四组(每组32只)进行免疫；粉复溶组剂量为50μl，为500μgAHc亚单位疫苗干粉或CpG干粉溶解于50μl含有0.05％泊洛沙姆(质量百分含量)生理盐水制备而成。

表3

所有小鼠先按上述剂量初次免疫(干粉组以手持式干粉气溶胶肺递送装置递送，复溶组以手持式液体气溶胶肺递送装置递送)，第三周按相同剂量进行第二次免疫，第六周按相同剂量进行第三次免疫，第九周以液体气溶胶肺递送方式给所有小鼠攻毒A型肉毒毒素复合物，攻毒剂量为2000倍LD₅₀。

攻毒后，每组取5只小鼠，在攻毒后记录小鼠14天内死亡只数，绘制生存曲线。

图8为免疫后BALB/c小鼠受到2000倍LD₅₀BoNT/A复合物攻击的生存曲线。

结果显示，AHc亚单位疫苗干粉组、AHc亚单位疫苗干粉复溶组小鼠存活率100％，CpG干粉组、CpG干粉复溶组小鼠在24h内全部死亡。

CpG干粉组、CpG干粉复溶组小鼠在攻毒后出现虚脱，不活动，毛发直立，拒绝进食或饮水，四肢瘫痪无力，息肉样，强迫腹式呼吸等症状(图9)最后小鼠死亡。AHc亚单位疫苗干粉组、AHc亚单位疫苗干粉复溶组小鼠在攻毒后有轻微耸毛现象，且小鼠平均体重在7天内出现先下降后逐渐恢复正常的趋势(图10)，但小鼠全部存活。

在初次免疫前2天(简称一免前2天)、第一次加强免疫前2天(简称二免前2天)第二次加强免疫前2天(简称三免前2天)、第10周(简称攻毒前2天)，每组从剩余的小鼠中随机取4只存活小鼠，摘眼球取小鼠全血。将全血3000g离心10min，将血清分装至EP管中，于-20度冰箱保存。在一免前2天、二免前2天、三免前2天、攻毒前2天这四个时间点，采用Elisa方法检测各组小鼠血清中5种特异性抗体(IgG、IgG1、IgG2a、IgM、IgA)滴度(HRP标记的山羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgA、IgM抗体购自abcam)。

结果如图11所示。结果显示，CpG干粉组、CpG干粉复溶组小鼠血清中的5种抗体滴度均为零。AHc亚单位疫苗干粉组、AHc亚单位疫苗干粉复溶组血清中的抗体IgG及其亚型IgG1(Th-2)、IgG2a(Th-1)滴度逐渐升高，且两组的抗体滴度没有显著性差异。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种可气溶胶化的A型肉毒毒素AHc亚单位疫苗干粉吸入剂

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 429

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr

1 5 10 15

Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn

20 25 30

Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln

35 40 45

Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala

50 55 60

Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile

65 70 75 80

Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr

85 90 95

Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn

100 105 110

Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln

115 120 125

Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile

130 135 140

Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser

145 150 155 160

Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn

165 170 175

Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly

180 185 190

Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe

195 200 205

Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln

210 215 220

Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr

225 230 235 240

Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val

245 250 255

Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro

260 265 270

Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr

275 280 285

Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp

290 295 300

Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys

305 310 315 320

Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

325 330 335

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln

340 345 350

Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys

355 360 365

Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly

370 375 380

Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr

385 390 395 400

Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu

405 410 415

Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu

420 425

<210> 2

<211> 1287

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaatacatca agaacatcat caatacctcc atcctgaacc tgcgttacga atccaatcac 60

ctgatcgacc tgtctcgtta cgcttccaaa atcaacatcg gttctaaagt taacttcgat 120

ccaatcgaca agaatcagat ccagctgttc aatctggaat cttccaaaat cgaagttatc 180

ctgaagaatg ctatcgtata caactctatg tacgaaaact tctccacctc cttctggatt 240

cgtatcccaa aatacttcaa ctccatctct ctgaacaatg aatacaccat catcaactgc 300

atggaaaaca attctggttg gaaagtatct ctgaactacg gtgaaatcat ctggactctg 360

caggacactc aggaaatcaa acagcgtgtt gtattcaaat actctcagat gatcaacatc 420

tctgactaca tcaatcgttg gatcttcgtt accatcacca acaatcgtct gaataactcc 480

aaaatctaca tcaacggccg tctgatcgac cagaaaccaa tctccaatct gggtaacatc 540

cacgcttcta ataacatcat gttcaaactg gacggttgcc gtgacactca ccgttacatc 600

tggatcaaat acttcaatct gttcgacaaa gaactgaacg aaaaagaaat caaagatctg 660

tacgacaacc agtccaattc tggtatcctg aaagacttct ggggtgacta cctgcagtac 720

gacaaaccat actacatgct gaatctgtac gatccaaaca aatacgttga cgtcaacaat 780

gtaggtatcc gtggttacat gtacctgaaa ggtccacgtg gttctgttat gactaccaac 840

atctacctga actcttccct gtaccgtggt accaaattca tcatcaagaa atacgcgtct 900

ggtaacaagg acaatatcgt tcgtaacaat gatcgtgtat acatcaatgt tgtagttaag 960

aacaaagaat accgtctggc taccaatgct tctcaggctg gtgtagaaaa aatcttgtct 1020

gctctggaaa tcccagacgt tggtaatctg tctcaggtag ttgtaatgaa atccaagaac 1080

gaccagggta tcactaacaa atgcaaaatg aatctgcagg acaacaatgg taacgatatc 1140

ggtttcatcg gtttccacca gttcaacaat atcgctaaac tggttgcttc caactggtac 1200

aatcgtcaga tcgaacgttc ctctcgtact ctgggttgct cttgggagtt catcccagtt 1260

gatgacggtt ggggtgaacg tccactg 1287

<210> 3

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg

1 5 10 15

Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile

20 25 30

Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile

35 40 45

Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn

50 55 60

Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp

65 70 75 80

Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr

85 90 95

Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu

100 105 110

Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys

115 120 125

Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr

130 135 140

Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn

145 150 155 160

Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser

165 170 175

Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp

180 185 190

Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu

195 200 205

Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn

210 215 220

Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln

225 230 235 240

Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr

245 250 255

Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly

260 265 270

Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu

275 280 285

Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val

305 310 315 320

Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val

325 330 335

Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

340 345 350

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys

355 360 365

Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile

370 375 380

Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp

385 390 395 400

Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp

405 410 415

Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu Leu Glu

420 425 430

His His His His His His

435

<210> 4

<211> 1676

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catatgagcg ataaaattat tcacctgact gacgacagtt ttgacacgga tgtactcaaa 60

gcggacgggg cgatcctcgt cgatttctgg gcagagtggt gcggtccgtg caaaatgatc 120

gccccgattc tggatgaaat cgctgacgaa tatcagggca aactggccgt tgcaaaactg 180

aacatcgatc aaaaccctgg cactgcgccg aaatatggca tccgtggtat cccgactctg 240

ctgctgttca aaaacggtga agtggcggca accaaagtgg gtgcactgtc taaaggtcag 300

ttgaaagagt tcctcgacgc taatctggcg ggagcgggat ccggtaagga ggaattctaa 360

tggaatacat caagaacatc atcaatacct ccatcctgaa cctgcgttac gaatccaatc 420

acctgatcga cctgtctcgt tacgcttcca aaatcaacat cggttctaaa gttaacttcg 480

atccaatcga caagaatcag atccagctgt tcaatctgga atcttccaaa atcgaagtta 540

tcctgaagaa tgctatcgta tacaactcta tgtacgaaaa cttctccacc tccttctgga 600

ttcgtatccc aaaatacttc aactccatct ctctgaacaa tgaatacacc atcatcaact 660

gcatggaaaa caattctggt tggaaagtat ctctgaacta cggtgaaatc atctggactc 720

tgcaggacac tcaggaaatc aaacagcgtg ttgtattcaa atactctcag atgatcaaca 780

tctctgacta catcaatcgt tggatcttcg ttaccatcac caacaatcgt ctgaataact 840

ccaaaatcta catcaacggc cgtctgatcg accagaaacc aatctccaat ctgggtaaca 900

tccacgcttc taataacatc atgttcaaac tggacggttg ccgtgacact caccgttaca 960

tctggatcaa atacttcaat ctgttcgaca aagaactgaa cgaaaaagaa atcaaagatc 1020

tgtacgacaa ccagtccaat tctggtatcc tgaaagactt ctggggtgac tacctgcagt 1080

acgacaaacc atactacatg ctgaatctgt acgatccaaa caaatacgtt gacgtcaaca 1140

atgtaggtat ccgtggttac atgtacctga aaggtccacg tggttctgtt atgactacca 1200

acatctacct gaactcttcc ctgtaccgtg gtaccaaatt catcatcaag aaatacgcgt 1260

ctggtaacaa ggacaatatc gttcgtaaca atgatcgtgt atacatcaat gttgtagtta 1320

agaacaaaga ataccgtctg gctaccaatg cttctcaggc tggtgtagaa aaaatcttgt 1380

ctgctctgga aatcccagac gttggtaatc tgtctcaggt agttgtaatg aaatccaaga 1440

acgaccaggg tatcactaac aaatgcaaaa tgaatctgca ggacaacaat ggtaacgata 1500

tcggtttcat cggtttccac cagttcaaca atatcgctaa actggttgct tccaactggt 1560

acaatcgtca gatcgaacgt tcctctcgta ctctgggttg ctcttgggag ttcatcccag 1620

ttgatgacgg ttggggtgaa cgtccactgc tcgagcacca ccaccaccac cactag 1676

Claims

1.一种干粉吸入剂的制备方法，包括如下步骤：（A）制备液体制剂；（B）将步骤（A）制备的液体制剂经过喷雾冷冻干燥处理得到所述干粉吸入剂；

所述液体制剂中含有以下质量百分含量的溶质：AHc蛋白或具有AHc蛋白的融合蛋白0.1%、CpG 0.05-0.15%、甘露醇 0.5-1.5%、肌醇 0.5-1.5%、亮氨酸0.4-0.6%和泊洛沙姆0.04-0.06%；

AHc蛋白为序列表的序列1所示的蛋白质，具有AHc蛋白的融合蛋白为序列表的序列3所示的蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液体制剂中含有以下质量百分含量的溶质：AHc蛋白或具有AHc蛋白的融合蛋白 0.1%、CpG 0.1%、甘露醇 1%、肌醇1%、亮氨酸0.5%和泊洛沙姆0.05%。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述步骤（B）包括如下步骤（B1）-（B3）：

（B1）将步骤（A）制备的液体制剂4℃预处理1-3h；

（B2）完成步骤（B1）后，将液体制剂采用二流体喷头喷雾至液氮；喷头离液氮液面的距离为9-11cm；喷雾时气泵气压为0.1-0.2兆帕；

（B3）完成步骤（B2）后，将冰晶连同少量剩余液氮真空冷冻干燥。

4.权利要求1至3任一所述的方法制备得到的干粉吸入剂。

5.权利要求4所述的干粉吸入剂在制备用于预防和/或治疗A型肉毒毒素感染的产品中的应用。

6.权利要求4所述的干粉吸入剂在制备A型肉毒毒素疫苗中的应用。

7.一种A型肉毒毒素疫苗，其有效成分为权利要求4所述的干粉吸入剂。

8.一种用于预防和/或治疗A型肉毒毒素感染的产品，其有效成分为权利要求4所述的干粉吸入剂。

9.一种预防和/或治疗A型肉毒毒素感染的套件，包括权利要求4所述的干粉吸入剂和干粉气溶胶肺递送装置。