CN101115503A - 输送粘膜疫苗用的肽 - Google Patents

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M·迪·玛姬斯翠斯
A·法撒诺
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INSTITUTO SUPERIORE DE SANITA
University of Maryland at Baltimore
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Abstract

本发明涉及一种佐剂肽，及其促进粘膜中、特别是在鼻组织中的抗原吸收的用途。用于粘膜输送的疫苗组合物包括佐剂肽和用于诱发免疫反应的抗原。

Description

输送粘膜疫苗用的肽
相关申请的相互参考
本申请要求享有2005年1月14日提交的第60/643,606号美国临时专利申请的优先权，本发明引用其具体内容作为参考。
关于政府资助研究的声明
本发明是利用美国政府的资金，在国家健康研究院DK048373(theNational Institutes of Health DK048373)的授权下做出的。因此美国政府根据该授权条款保留本发明的某些权利。本发明是利用意大利政府的资金，在意大利卫生部的授权，即“Ricerca Finalizzata”之“3AIF”授权以及the Istituto Superiore di Sanita的授权，即内部研究之“C3MJ”授权下做出的。
发明的技术领域
本发明涉及疫苗和免疫治疗领域。特别的是，本发明涉及一种包含佐剂肽和抗原的鼻用制剂组合物，以及使用该组合物进行粘膜免疫的方法。
发明的背景
疫苗已经被证实为预防感染性疾病的成功的且易于接受的方法。其具有经济效益，不会诱发针对目标病原体的抗生素耐药性，也不影响宿主体内的正常菌群。在许多例子中，例如通过诱导抗病毒免疫，疫苗能够预防那些无可行的治疗或缓解方式可用的疾病。
正如现有技术所熟知的，疫苗的功能在于启动免疫系统，对免疫原性物质或抗原(抗原物质)进行应答，典型的是具有感染性的有机体或其一部分，以非感染性或非致病性的形式进入机体。一旦免疫系统被引发，或是对有机体敏感，随后作为感染性病原体的有机体就暴露于免疫系统中并引发快速而强烈的免疫反应，从而在病原体在宿主机体中复制并感染相当数量的宿主细胞进而引发病症之前破坏这些病原体。用于引发免疫系统的物质或抗原可以是具有较小感染性的完整有机体，即已知的减毒有机体，或是在一些例子中，为有机体的一部分，如糖类、蛋白质或代表有机体的各种结构成分的肽。
在许多例子中，为了刺激免疫系统达到使疫苗发挥作用的程度，例如致免疫性，就必须加强针对疫苗中存在的抗原的免疫反应。许多蛋白质，绝大部分肽以及糖类抗原在单独给予时不会产生足够的抗体反应形成免疫性。这些抗原需要在免疫系统中被视为外源性时，才会引发免疫反应。因此，建议使用佐剂来刺激免疫反应。
最为人所熟知的佐剂即弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)，包含一种存在于油/水乳液中的分枝杆菌的混合物。弗氏佐剂以两种方式发挥作用：第一，通过加强细胞和体液性介导的免疫性；第二，通过截断抗原刺激的快速分散(“贮库效应”(depot effect))。然而，由于该物质常引起的有毒的生理性反应与免疫反应，弗氏佐剂无法应用于人体。另一种已经显示出具有免疫刺激性或佐剂活性的分子为内毒素，也被称作脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。LPS通过触发一种“天然”免疫反应来刺激免疫系统—这种反应经过演化使得有机体能够识别内毒素(以及入侵细菌的一部份)，而不需事先与该有机体接触。然而LPS毒性太强以致于不能成为可用的佐剂，与内毒素结构相关的分子，例如单磷酰基脂质A(monophosphoryllipid A，MPL)，已经作为佐剂进行临床试验。然而，目前FDA核准用于人体的佐剂只有铝盐(alum)，其通过抗原沉淀而“贮存”抗原。Alum也能刺激针对抗原的免疫反应。
因此，在本领域中公认的需要这样一种化合物，即与抗原单独注射或与alum共同给药相比，它能够与抗原共同给药来刺激免疫系统针对抗原产生更强的抗体反应。而且，由于粘膜疫苗的发展需要应用特殊的佐剂，用于系统性免疫反应的佐剂，例如Alum通常对于粘膜免疫反应不起效。尽管近十年来对于粘膜性疫苗用佐剂有了深入的研究，但到目前为止尚未发现适合用于人体的佐剂。佐剂研究的重点在于其有效性与毒性，而候选的粘膜佐剂无法完全满足高效性与无毒性的要求。此外，绝大部分试验的粘膜佐剂都是尚未了解其作用机制的复杂分子。申请人在本发明中提供一种可选择的针对抗原诱发免疫反应的无毒的肽佐剂。此肽的生物活性已经被详细说明，且其用作为佐剂的作用机制也已得到研究。
本发明的粘膜佐剂的一个例子是一种闭合带毒素(zonula occludenstoxin，ZOT)的肽(参见例如第5,665,389号；第5,908,825号；第5,864,014号；第5,912,323号；第5,948,629号；第5,945,510号与第6,458,925号美国专利)。美国专利第5,908,825号记载了一种用于经鼻输送的鼻用制剂组合物，其中包含一种治疗剂与一种使经鼻吸收有效量增加的纯化的霍乱弧菌(Vibrio cholera)闭合带毒素。这种纯化的霍乱弧菌(Vibrio cholera)闭合带毒素经SDS-PAGE分析表明具有约44kDa的分子量，然而其结构信息尚未被了解或披露。相关美国专利第5,864,014号和第5,912,323号进一步披露了纯化的霍乱弧菌闭合带毒素的受体。
来自于霍乱弧菌的闭合带毒素(ZOT)已被鉴定为粘膜免疫的佐剂(Infect.Immun.1999，67：1287；Infect.Immun.2003，71：1897)。将ZOT与小鼠的可溶性抗原通过鼻腔给药，刺激产生了系统性的体液与细胞介导的反应，该反应与卵白蛋白抗原诱导的特异性的粘膜反应相同(Infect.Immun.2003，71：1897)。ZOT是一种44.8kDa的蛋白质，其与上皮细胞上的受体结合，且调节闭合带(tight junction)，诱导粘膜屏障通透性的提高。ZOT对闭合带的作用是可逆的，不会造成组织受损(J.ClinInvest.1995，96：710)。上皮细胞上的ZOT受体的已经被部分定性，近来一种与ZOT同源的哺乳动物蛋白质已经被确认并命名为Zonulin。有趣的是，此种由上皮细胞释放出的蛋白质显示出具有闭合带内部调控子的功能，并且能够与ZOT所结合的同样的受体结合(Ann.NY.Acad Sci.2000，915：214)。ZOT作为佐剂的机理，可能包括了其与鼻粘膜上的ZOT受体的结合，调节闭合带以及粘膜下层的抗原通路，随后暴露于免疫系统的细胞中。
为了预防感染性疾病而发展粘膜性疫苗是非常需要的。粘膜性免疫与胃肠道外免疫相比具有几个优点。粘膜性免疫在感染部位(局部)诱发免疫反应。另外，由于粘膜免疫系统的固有特性，在一个粘膜位置上的免疫反应能够诱发远处部位(区域)发生特定反应。这种灵活性对于消除针对免疫接种形成的文化上的和宗教上的障碍是重要的，因为保护性免疫(例如对抗性传播疾病)在实际操作中可以在各自分离的粘膜部位诱导产生。除了对抗在粘膜上的抗原所需的局部反应之外，粘膜性疫苗还诱发包括体液与细胞介导的反应的系统性免疫反应。因此，可以开发粘膜性免疫来对抗经由其它途径(如血液或皮肤)造成的感染。最后，粘膜性疫苗的给予不需要使用针头，这可以提高疫苗的顺应性，消除了对血液传播传染的疑虑。综上所述，粘膜性疫苗也可以与预防性或治疗性免疫一起用于对抗癌症。这些疫苗可以同时对抗感染物(如幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)，乳突病毒(Papilloma virus)，疱疹病毒(Herpes virus))所导致的癌症以及不同病原的癌症(如黑色素瘤，结肠癌和其它癌症)。
有趣的是，绝大部分人类病原体是透过粘膜途径获得的，然而，目前很少使用粘膜性疫苗。现在使用的疫苗是基于活体减毒微生物。此外，当纯化的抗原经由粘膜表面输送时，本身并不能刺激/诱发免疫反应的发生。因此，这样的疫苗需要使用特殊的佐剂。然而不幸的是，如上所述，缺乏安全有效的佐剂很大程度上阻碍了粘膜性疫苗的开发。一种有效的粘膜性佐剂可允许抗原(Ag)穿过粘膜屏障，并且易于诱发抗原特异性免疫反应。
本申请人揭示了佐剂肽，例如ZOT肽，以及将抗原与佐剂肽一起经粘膜输送，从而诱发针对抗原的特异性的系统和/或粘膜反应的方法。由于抗原透过粘膜输送不诱发免疫反应，申请人发现将其与ZOT肽共同给药可以诱发针对抗原的系统性与粘膜性反应。佐剂肽能够促进抗原透过粘膜输送。本发明所述佐剂肽的优势在于其无毒性、效果可逆、避免了内毒素损害、合成简单以及生产和纯化便宜。
发明概要
本发明的第一个方案是一种在哺乳动物体内诱发针对抗原的免疫反应的方法，包括向该动物给予具有氨基酸序列FCIGRL(序列号1(SEQ ID NO.1))的肽或其功能性衍生物以及抗原，以增强哺乳动物对抗原的免疫反应。
本发明的第二个方案是一种通过哺乳动物的粘膜输送抗原的方法，包括向哺乳动物的粘膜给予抗原和具有氨基酸序列FCIGRL的肽或其功能性衍生物。
本发明的第三个方案是一种通过鼻组织输送抗原的方法，包括向鼻组织给予抗原和具有氨基酸序列FCIGRL的肽或其功能性衍生物。
本发明的第四个方案是一种诱发针对抗原的系统性反应的方法，包括通过哺乳动物的粘膜给予抗原和具有氨基酸序列FCIGRL的肽或其功能性衍生物。
本发明的第五个方案是一种诱发针对抗原的粘膜反应的方法，包括通过哺乳动物的粘膜给予抗原和具有氨基酸序列FCIGRL的肽或其功能性衍生物。
本发明的第六个方案是一种用于诱发免疫反应的疫苗组合物。该疫苗包含用于诱发免疫反应的抗原，以及具有氨基酸序列FCIGRL(序列号1(SEQID NO.1))的肽或其功能性衍生物。该疫苗为粘膜性疫苗并且被输送至哺乳动物的粘膜。
本发明的第七个方案是一种将抗原输送至哺乳动物的粘膜的方法，包括向哺乳动物给予抗原和具有氨基酸序列FCIGRL(序列号1(SEQ ID NO.1))的肽或其功能性衍生物。
在某些方案中，给予方式是鼻内给药、阴道内给药、口服给药或经肠道给药。给药剂型可以是气雾剂、吸入剂、滴剂、乳剂或类似剂型。
在某些方案中，肽包括选自由下列序列组成的组中的序列：Xaa1 Cys IleGly Arg Leu(SEQ ID NO：2)，Phe Xaa2 Ile Gly Arg Leu(SEQ ID NO：3)，PheCys Xaa3 Gly Arg Leu(SEQ ID NO：4)，Phe Cys Ile Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：5)，Phe Cys Ile Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：6)，以及Phe Cys Ile Gly Arg Xaa6(SEQID NO：7)。多肽的长度少于10个氨基酸残基。Xaa1选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Tyr和Met组成的组。Xaa2选自由Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn和Gln组成的组。Xaa3选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met组成的组。Xaa4选自由Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Ala和Gln组成的组。Xaa5选自由Lys和His组成的组。Xaa6选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met组成的组。
在其他方案中，肽包括选自由下列序列组成的组中的序列：Xaa1 Xaa2 IleGly Arg Leu(SEQ ID NO：8)，Xaa1 Cys Xaa3 Gly Arg Leu(SEQ ID NO：9)，Xaa1Cys Ile Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：10)，Xaa1 Cys Ile Gly Xaa5 Leu(SEQ IDNO：11)，Xaa1 Cys Ile Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：12)，Phe Xaa2 Xaa3 Gly ArgLeu(SEQ ID NO：13)，Phe Xaa2 Ile Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：14)，Phe Xaa2Ile Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：15)，Phe Xaa2 Ile Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：16)，Phe Cys Xaa3 Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：17)，Phe Cys Xaa3 Gly Xaa5 Leu(SEQID NO：18)，Phe Cys Xaa3 Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：19)，Phe Cys Ile Xaa4Xaa5 Leu(SEQ ID NO：20)，Phe Cys Ile Xaa4 Arg Xaa6(SEQ ID NO：21)，以及Phe Cys Ile Gly Xaa5 Xaa6(SEQ ID NO：22)。多肽的长度少于10个氨基酸残基。Xaa1选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Tyr和Met组成的组。Xaa2选自由Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn和Gln组成的组。Xaa3选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met组成的组。Xaa4选自由Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Ala和Gln组成的组。Xaa5选自由Lys和His组成的组。Xaa6选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Tyr和Met组成的组。
在其它方案中，肽佐剂是SLIGRL(SEQ ID NO：23)。在其它方案中，肽佐剂是SLIGKV(SEQ ID NO：24)。
在某些方案中，本发明是一种诱发针对抗原的系统性与粘膜性反应的方法，包括给予抗原和具有选自由SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24组成的组中的氨基酸序列的肽。
在某些方案中，本发明是一种诱发针对抗原的免疫反应的方法，包括给予抗原与具有选自由SEQ ID NO：23和sEQ ID NO：24组成的组中的氨基酸序列的肽。
在一种方案中，本发明提供了诱发动物体内免疫反应的方法。该方法可以包括给予动物粘膜一种或多种抗原以及一种或多种肽佐剂。在某些方案中，至少一种抗原与至少一种肽佐剂是以组合物的方式给予的，例如，抗原和佐剂可以存在于溶液中(例如水溶液，如盐水溶液)。组合物可以进一步包括一种或多种药学上可接受的赋形剂(如，盐、缓冲液、缓冲盐、糖、清洁剂和滑石粉等)。该方法可以在任何类型的动物上实施，例如在哺乳动物上，如人类。用于本发明的肽佐剂可以包含序列FCIGRL，其长度可以为约6到约50个氨基酸、约6到约25个氨基酸、约6到约15个氨基酸。任何期望的抗原都可以使用，例如，麻疹病毒抗原(measles virus antigens)、腮腺炎病毒抗原(mumps virus antigens)、风疹病毒抗原(rubella virus antigens)、白喉棒状杆菌抗原(Corynebacterium diphtheriae antigens)、百日咳博德特氏菌抗原(Bordetella pertussis antigens)、破伤风杆菌抗原(Clostridiumtetani antigens)、炭疽杆菌抗原(Bacillus anthracis antigens)、流感病毒抗原(influenza virus antigens)及其组合。在一个具体的方案中，本发明是提供一种在动物(例如，哺乳动物如人类)体内诱发免疫反应的方法，其中至少一种肽佐剂包含序列FCIGRL，组合物是水溶液，组合物中包含一种或多种选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原和流感病毒抗原组成的组中的抗原。
在另一方案中，本发明提供了用于粘膜给药的免疫原性组合物。该组合物可以包含一种或多种抗原以及一种或多种肽佐剂。该组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂(如盐、缓冲液、缓冲盐、糖、清洁剂和滑石粉等)。在某些本发明的组合物中，至少一种抗原选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原和流感病毒抗原组成的组。在本发明的某些组合物中，至少一种肽佐剂包含序列FCIGRL。肽佐剂的长度可以是约6到约50个氨基酸、约6到约25个氨基酸或约6到约15个氨基酸。在某些方案中，本发明的组合物可以存在于水溶液(例如盐水溶液)中，并且可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一个具体方案中，用于粘膜给药的免疫原性组合物可以包含至少一种含有序列FCIGRL的肽佐剂，组合物可以存在水溶液中，组合物可以包含至少一种选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原和流感病毒抗原组成的组中的抗原。
在本发明的另一个方案中，本发明提供用于粘膜给药的疫苗。该疫苗可以包含一种或多种抗原以及一种或多种肽佐剂。任何合适的抗原都可以使用，例如，选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原和流感病毒抗原组成的组中的抗原及其组合。在某些方案中，用于粘膜给药的疫苗可以包括至少一种含有序列FCIGRL的肽佐剂。适合的肽佐剂的长度可以是约6到约50个氨基酸、约6到约25个氨基酸、或约6到约15个氨基酸。用于粘膜给药的疫苗可以存在于水溶液(例如盐水溶液)中，并且可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一个具体的方案中，用于粘膜给药的疫苗可以包含至少一种含有序列FCIGRL的肽佐剂，且该疫苗可以存在于水溶液中，疫苗可以包含至少一种选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原和流感病毒抗原组成的组中的抗原。
在另一个方案中，本发明提供一种刺激抗原呈递细胞的方法。该方法可以包括将抗原呈递细胞与肽佐剂接触。任何抗原呈递细胞均可以使用本发明的方法进行刺激，例如，单核细胞和/或巨噬细胞都可以被刺激。当抗原呈递细胞为人类细胞时，刺激抗原呈递细胞可以导致抗原呈递细胞的人类主要组织相容性I类和II类分子和/或CD40的表达量升高。适于刺激抗原呈递细胞的佐剂肽包括但不限于，含有序列FCIGRL的肽。典型地，佐剂肽可以以刺激抗原呈递细胞的有效浓度存在。有效浓度可以自约0.01μg/ml到约500μg/ml，自约0.1μg/ml到约250μg/ml，自约1μg/ml到约100μg/ml，自约1μg/ml到约75μg/ml，自约1μg/ml到约50μg/ml，自约1μg/ml到约40μg/ml，自约1μg/ml到约30μg/ml，自约1μg/ml到约20μg/ml。
这些方案以及其它方案对于阅读了本说明书的本领域技术人员而言将是显而易见的，其为本领域提供了治疗和/或预防疾病的试剂与方法。
附图说明
图1在四种剂量下，佐剂AT1002的剂量反应曲线(AT1002具有序列FCIGRL，SEQ ID：1)
图2在五种剂量下，佐剂AT1002的剂量反应曲线。
图3经四次与五次免疫反应后，佐剂AT1002的剂量反应曲线的对比。
图4以TT和不同剂量的佐剂AT1002进行六次免疫后诱发的血清抗TT的IgA反应。
图5以TT和不同剂量的佐剂AT1002进行六次免疫后，在阴道分泌物中诱发的抗TT的IgA反应。
图6为一条状图，其显示了接受单独(白色条带)将破伤风类毒素(TT；1μg/剂)或者共同将TT+AT1002(22.5μg/剂；斜纹条带)经鼻内给药四周后，经过破伤风类毒素刺激的小鼠(C57BL/6)的脾脏细胞的增殖反应。
图7显示了以AT1002(SEQ ID：1)在所示浓度下刺激人类单核细胞时流式细胞仪(FACS)的分析结果。在18小时后收集细胞，以所示单克隆抗体染色并以流式细胞仪进行分析。
图8显示了以AT1002(SEQ ID：1)在所示浓度下刺激人类巨噬细胞时流式细胞仪(FACS)的分析结果。在18小时后收集细胞，以所示单克隆抗体染色并以流式细胞仪进行分析。
发明详述
定义
说明书中所述的“一”可以指一个或多个。其用于在本申请的权利要求书中，当其与“包含”一起使用时，“一”是指一个或一个以上。在此所使用的“另一个”可以指至少第二个或更多。
在此所使用的“肽佐剂”或“佐剂肽”，是指一种通过诱发、加强和/或促进针对抗原的免疫反应来促进或调节抗原功能而作为功能性组分(组合物中)的肽。
在此所使用的“抗原”是指任何可以引起免疫反应的抗原性物质(免疫原)，其可以由，例如，特异性结合抗原的抗体的产生来决定。
在此所使用的“粘膜”是指一种直接或间接地与外界(例如：消化道、呼吸道与泌尿生殖道)相联系的形成人体的通道或空腔的分泌粘液的膜(充满粘液腺体)，其功能在于保护、支持、吸收营养或分泌粘液、酶和盐类。它是由深部血管结缔组织基质和表面上皮组织组成，所述基质在消化道导管的多个部分中包含薄且明确的无横纹肌肉层，所述上皮组织下面具有基底膜，其种类和厚度有所变化，但总是通过嵌于膜中的细胞和众多腺体的分泌保持湿润和柔软光滑。在实施例中，“粘膜”是指鼻、阴道、直肠、口腔或小肠的粘膜。
在此所使用的“肽”是指具有氨基酸序列SEQ ID：1(FCIGRL)的ZOT肽及其功能性衍生物，包含但不限于SEQ ID NOS：2到24。在某些方案中，本发明的肽是指AT1002(FCIGRL，SEQ ID：1)。
在此所使用的“疫苗”是指一种给予受试者以产生或人为地提高对特定疾病的免疫性的制剂。该制剂包括抗原，例如灭活的微生物、活的减毒有机体、活的完全致病有机体、重组生物分子、来自病原体的免疫原性蛋白、抗体、脂质、多糖、糖以及类似物，和肽佐剂。
本发明
本申请人开发了一种来自霍乱弧菌噬菌体CTXΦ的ZOT蛋白质的肽，如本发明所揭示的，其具有新型佐剂肽的功能。该佐剂肽包括氨基酸序列FCIGRL(SEQ ID：1)及其功能性衍生物。佐剂肽具有少于10个的氨基酸残基。佐剂肽可以包含仅6个氨基酸FCIGRL(SEQ ID：1)，也可以包含其它氨基酸。其它氨基酸可以提供其它的功能，例如，利于纯化的抗原标记。
肽FCIGRL的功能性衍生物包括，例如，Xaa1 Cys Ile Gly Arg Leu(SEQ IDNO：2)，Phe Xaa2 Ile Gly Arg Leu(SEQ ID NO：3)，Phe Cys Xaa3 Gly Arg Leu(SEQID NO：4)，Phe Cys Ile Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：5)，Phe Cys Ile Gly Xaa5Leu(SEQ ID NO：6)，以及Phe Cys Ile Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：7)。Xaa1选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Tyr和Met组成的组。Xaa2选自由Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn和Gln组成的组。Xaa3选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met组成的组。Xaa4选自由Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Ala和Gln组成的组。Xaa5选自由Lys和His组成的组。Xaa6选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met组成的组。
肽FCIGRL的功能性衍生物进一步包括：Xaa1 Xaa2 Ile Gly Arg Leu(SEQ IDNO：8)，Xaa1 Cys Xaa3 Gly Arg Leu(SEQ ID NO：9)，Xaa1 Cys Ile Xaa4 Arg Leu(SEQID NO：10)，Xaa1 Cys Ile Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：11)，Xaa1 Cys Ile Gly ArgXaa6(SEQID NO：12)，Phe Xaa2 Xaa3 Gly Arg Leu(SEQ ID NO：13)，Phe Xaa2 IleXaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：14)，Phe Xaa2 Ile Cly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：15)，PheXaa2 Ile Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：16)，Phe Cys Xaa3 Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：17)，Phe Cys Xaa3 Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：18)，Phe Cys Xaa3 Gly Arg Xaa6(SEQ IDNO：19)，Phe Cys Ile Xaa4 Xaa5 Leu(SEQ ID NO：20)，Phe Cys Ile Xaa4 Arg Xaa6(SEQ ID NO：21)以及Phe Cys Ile Gly Xaa5 Xaa6(SEQ ID NO：22)。Xaa1选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Tyr和Met组成的组。Xaa2选自由Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn和Gln组成的组。Xaa3选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met组成的组。Xaa4选自由Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Ala和Gln组成的组。Xaa5选自由Lys与His组成的组。Xaa6选自由Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met组成的组。
任何长度的肽佐剂都可以使用。一般而言，肽佐剂的长度范围自大约6到大约100，自大约6到大约90，自大约6到大约80，自大约6到大约70，自大约6到大约60，自大约6到大约50，自大约6到大约40，自大约6到大约30，自大约6到大约25，自大约6到大约20，自大约6到大约15，自大约6到大约14，自大约6到大约13，自大约6到大约12，自大约6到大约11，自大约6到大约10，自大约6到大约9，自大约6到大约8个氨基酸。本发明的肽佐剂的长度可以自大约8到大约100，自大约8到大约90，自大约8到大约80，自大约8到大约70，自大约8到大约60，自大约8到大约50，自大约8到大约40，自大约8到大约30，自大约8到大约25，自大约8到大约20，自大约8到大约15，自大约8到大约14，自大约8到大约13，自大约8到大约12，自大约8到大约11，自大约8到大约10个氨基酸。本发明的肽佐剂的长度可以自大约10到大约100，自大约10到大约90，自大约10到大约80，自大约10到大约70，自大约10到大约60，自大约10到大约50，自大约10到大约40，自大约10到大约30，自大约10到大约25，自大约10到大约20，自大约10到大约15，自大约10到大约14，自大约10到大约13，自大约10到大约12个氨基酸。本发明的肽佐剂的长度可以自大约12到大约100，自大约12到大约90，自大约12到大约80，自大约12到大约70，自大约12到大约60，自大约12到大约50，自大约12到大约40，自大约12到大约30，自大约12到大约25，自大约12到大约20，自大约12到大约15，自大约12到大约14个氨基酸。本发明的肽佐剂的长度可以自大约15到大约100，自大约15到大约90，自大约15到大约80，自大约15到大约70，自大约15到大约60，自大约15到大约50，自大约15到大约40，自大约15到大约30，自大约15到大约25，自大约15到大约20，自大约15到大约19，自大约15到大约18，自大约15到大约17个氨基酸。本发明的肽佐剂可以包含含有大约6，大约7，大约8，大约9，大约10，大约11，大约12，大约13，大约14，大约15，大约20，大约30，大约40，大约50，大约60，大约70，大约80，大约90，大约100个氨基酸的肽。
肽佐剂可以以化学方法合成，并且使用熟知的技术进行纯化，例如HighPerformance Liquid Chromatography of Peptide and Proteins：SeparationAnalysis and Conformation Eds.Mant et al.，C.R.C Press(1991)中记载的，以及肽合成仪，如Symphony(Protein Technologies，Inc.)；或通过使用重组DNA技术，例如，将编码肽的核苷酸序列插入适当的表达载体中，例如大肠杆菌或酵母菌表达载体，并在各自的宿主细胞中表达，使用熟知的技术对其进行纯化。
肽是用于促进抗原吸收的。此外，吸收透过粘膜进行，特别是透过鼻粘膜。肽促进透过肠、血脑屏障、皮肤以及鼻粘膜的吸收(还参见未决的第10/891,492号美国申请，2004年7月15日申请，公开号为20050059593，在此引用其全文以供参考)。因此肽可以与以鼻和/或鼻粘膜组织为目标的抗原一起配制或共同给药。根据本发明，药物组合物可以在给予前预先混合而成，或者两种药剂各自在24小时内给予、在体内混合而成。优选的是两种药剂分别在12、8、4、2或1小时内给予。
经鼻输送组合物通常包含直径为约50μm的水溶性聚合物，以用于削弱粘膜纤毛清除功能，并达到可重复的经鼻给药制剂的生物利用度。有益的是，经鼻输送组合物不需要如肠道输送所需的胃肠道抗性。包含聚合物的经鼻组合物是否适用其他赋形剂是需要慎重考虑的，以确保使肽佐剂结合于粘膜表面。
用于经鼻输送的鼻用制剂组合物是本领域中熟知的。此鼻用制剂组合物通常包含水溶性聚合物，该聚合物已被广泛用于制备作为经鼻给药(Davis，In：Delivery Systems for Peptide Drugs，125：4-21(1986))的肽的载体的药物剂型(Martin et al.，In：Physical ChemicalPrinciples of Pharmaceutical Science，3rd Ed.，pages592-638(1983))。包埋于聚合物骨架中的肽的经鼻吸收性可以通过延迟鼻粘膜纤毛清除功能而增强(Illum et al.，Int.J.Pharm.，46：261-265(1998))。其它可能的增强机制包括增加浓度梯度或减少肽吸收的分散路径(Ting et al.，Pharm.Res.，9：1330-1335(1992))。然而，减低粘膜纤毛排除率已经被预期成为一种即将成功的，使经鼻给予的全身性药物实现可重复性的生物利用率的好方法(Gonda et al.，Pharm.Res.7：69-75(1990))。直径约50μm的微粒可能会在鼻腔中沉积(Bjork et al，.Int.J.Pharm.，62：187-192(1990)；和Illum et al，Int.J.Pharm.，39：189-199(1987))，而直径小于10微米的微粒会通过鼻的过滤系统，沉淀于下呼吸道中。直径大于200微米的微粒经鼻给药后不会保留在鼻中(Lewis et al，Proc.Int.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.，17：280-190(1990))。
本发明中所用的特定水溶性聚合物并无严格要求，可以选自任何已熟知的用于经鼻剂型的水溶性聚合物。用于经鼻输送的水溶性聚合物的典型例子为聚乙烯醇(PVA)。该材料为可膨胀的亲水性聚合物，其物理特性取决于分子量、水解程度、交联度以及结晶性(Peppas et al.，In：Hydrogelsin Medicine and Pharmacy，3：109-131(1987))。PVA可以通过相分离、喷雾干燥、喷雾包埋以及喷雾凝集方式被用于分散材料的涂覆(Ting et al，supra)。
还可加入常规的药学上可接受的乳化剂、表面活性剂、悬浮剂、抗氧化剂、渗透促进剂、增量剂、稀释剂与防腐剂。水溶性聚合物也可用作载体。其它的药学上可接受的载体和/或稀释剂对于本领域的技术人员而言是熟知的(见，例如，Remington’s Pharmaceutical Science，16th Ed.，Eds.Osol，Mack Publishing Co.，Chapter 89(1980)；Digenis et al.，J.Pharm.Sci.，83：915-921(1994)；Vantini et al.，ClinicaTherapeutica，145：445-451(1993)；Yoshitomi et al.，Chem.Pharm.Bull.，40：1902-1905(1992)；Thoma et al.，Pharmazie，46：331-336(1991)；Morishita et al.，Drug Design and Delivery，7：309-319(1991)；和Lin et al.，Pharmaceutical Res.，8：919-924(1991))。在此引用上述每篇文献的全文以供参考。
用于本发明的方法的组合物可以以吸入剂、液体滴剂、气雾剂或其它剂型给予，从而使组合物与粘膜相接触。当以液体给予时，本发明的组合物可以以水溶液方式给予，例如，盐水溶液。必要时可以调节溶液的参数(例如：pH、渗透率、粘度等)，以促进本发明的组合物输送。例如，对于含有AT1002的水溶液，优选的是可以将pH值调整为酸性pH以增加肽佐剂的稳定性。
本发明使用的特定抗原没有严格要求，可以是例如任何的生物活性肽、脂质、多糖、疫苗，或任何其它不能经细胞间通路吸收的成分，无论其大小或带电性。
本发明所使用的疫苗的例子包括肽抗原和减毒微生物、病毒，寄生虫和/或真菌。本发明所使用的肽抗原的非限制性例子包括产肠毒素的大肠杆菌的热变性肠毒素的B亚单位、霍乱毒素B亚单位、白喉毒素、破伤风杆菌毒素、百日咳毒素、肠病原体荚膜抗原、肠病原体的纤毛或菌毛、HIV表面抗原、灰尘过敏原以及螨虫过敏原。其它本领域已知的例如流感、百日咳、HIV、脑膜炎球菌抗原、乳头瘤病毒、细菌、病毒、寄生虫、真菌以及类似物也可以使用。根据本发明制备的疫苗的其它例子包括但不限于，包含来自癌症的抗原(例如可溶性抗原)、来自病毒、细菌、寄生虫、真菌和/或蛋白感染素(prion)的抗原的疫苗。用于本发明疫苗的抗原可以是任何来源的，例如可以为重组的、合成的、天然的或修饰的抗原。抗原可以是减毒或去活的病毒、细菌、寄生虫和/或真菌。抗原可以是重组体病毒、细菌、寄生虫和/或真菌。抗原也可以是表达异种疫苗抗原的重组体病毒、细菌、寄生虫和/或真菌。抗原可以是过敏原。
本发明所使用的减毒和/或去活的微生物与病毒包括产肠毒素大肠杆菌、肠病原性大肠杆菌、霍乱弧菌、弗氏痢疾杆菌、伤寒沙门菌与轮状病毒(Fasano et al，In：Le Vaccinazioni in Pedistria，Eds.Vierucciet al，CSH，Milan，pages 109-121(1991)；Guandalini et al，In：Management of Digestive and Liver Disorders in Infants and Children，Elsevior，Eds.Butz et al，Amsterdam，Chapter 25(1993)；Levine etal，Sem.Ped.Infect.Dis.，5：243-250(1994)；与Kaper et al.Chin.Microbiol.Rev.，8：48-86(1995)。在此引用上述每篇文献的全文以供参考)。癌症的例子包括那些由感染原(例如幽门螺旋杆菌、乳头状瘤病毒、疱疹病毒)以及不同病因的癌症(例如黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌与其他)造成的癌症。
能够诱发保护性免疫反应的任何抗原都可以用于本发明的疫苗。适合的抗原的例子包括但不限于，麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原、流感病毒抗原以及癌症抗原。
本发明所使用的抗原的剂量并无严格限制，可根据所选择的特定成分、目标疾病或病情，以及受试者的年龄、体重与性别改变。
本发明所使用的ZOT肽的剂量并无严格限制，可根据受试者的年龄、体重与性别而改变。一般而言，本发明使用的用以经粘膜增强生物活性成分吸收的肽的最终浓度范围为约10-5M到10-10M，优选约10-6M到5.0×10-5M。在实施例中，为了达到这样的最终浓度，单一口服制剂组合物中肽的剂量，例如用于向肠粘膜给予的，通常为约4.0ng到2.5微克，或4.0ng到1000ng，优选40ng到80ng。在某些方案中，例如对于约20g的哺乳动物，抗原的给予剂量为约2.5微克，肽佐剂的剂量为约22.5微克(1∶10比例)。在其它方案中，例如对于约20g的哺乳动物，抗原的给予剂量为约2.5微克，肽的剂量为约22.5，或约15，或约7.5微克。
本发明所使用的抗原与肽的比例并无严格限制，可依据特定时间内被输送的生物活性成分的剂量，甚至还可依据目标粘膜的类型而变化。通常本发明中所用的治疗剂或免疫原性试剂与肽的重量比在约1∶100至约3∶1，或1∶10至约2∶1的范围内。申请人预期，佐剂肽相对于抗原的含量越高，能够引发的系统和/或目标粘膜的免疫反应越强烈。
保守取代，即将氨基酸以性质相似其它氨基酸取代，可以被应用于具有序列SEQ ID NO：1的肽中。保守取代的例子包括但不限于，GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln以及PheTrpTyr。典型的保守性氨基酸取代在约1到2个氨基酸残基范围内。使用本领域熟知的计算机程序如DNASTAR软件，或参考Dayhoff et al.，(1987)in Atlasof Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)，可以得到关于如何确定氨基酸残基被取代后不会丧失生物或免疫活性的指导。
氨基酸取代被定义为一对一的氨基酸替换。当取代的氨基酸具有相似的结构和/或化学性质时，它们的性质是保守的。保守性替换的例子是以异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或是色氨酸取代苏氨酸。
特别优选的肽的类似物包括性质保守的取代产物，例如具有相关侧链的氨基酸族中形成的取代产物。特别的是，氨基酸一般被分为以下的族：(1)酸性-天冬氨酸与谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；以及(5)芳香氨基酸-苯丙氨酸、色氨酸与酪氨酸。例如，可合理预期的，分别以异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，丝氨酸取代苏氨酸，或相似地以结构上相关的氨基酸相互间的保守取代不会对生物活性产生重大影响。
任何本领域已知的分析方法均可以用于确定本发明的肽的生物活性。例如，分析方法可以包括(1)根据Fasano et al.，Natl.Acad.Sci.USA，8：5242-5246(1991)一文中的记载，分析放置于尤斯灌流室(Ussing chamber)中的回肠的组织抗性(Rt)的减低结果；(2)如下文所述，分析尤斯灌流室(Ussing chamber)中的肠上皮细胞单层的组织抗性(Rt)的减低结果；或者(3)分析肠或鼻对治疗剂或免疫原性试剂吸收的增强效果，如在WO96/37196；美国专利申请第08/443,864号，1995年5月24日申请；美国专利申请第08/598,852号，1996年2月9日申请；以及美国专利申请第08/781,057号，1997年1月9日申请中的记载。
本发明的肽以可逆的和重复的方式快速打开闭合带，因此可以作为鼻抗原吸收促进剂来使用，ZOT也以同样方式来使用(见WO 96/37196；美国专利申请第08/443,86号，1995年5月24日申请；美国专利申请第08/598,852号，1996年2月9日申请；美国专利申请第08/781,057号，1997年1月9日申请)。
上述所揭示的内容概括描述了本发明。此处披露的所有参考文献都明确地被引用以供参考。通过参考下文所述的特定的实施例将更全面地理解本发明，此处提供的实施例仅是用于说明，并不作为本发明的保护范围的限制。
下列实施例证明：通过给予抗原和含有SEQ ID No：1的粘膜佐剂所诱发的粘膜免疫反应可以在不同粘膜区域诱发血清IgG以及粘膜IgA，与其它粘膜佐剂相比，其效果更好。因此，AT1002作为粘膜佐剂发挥作用，在受试者体内诱发了针对抗原的免疫反应。
实施例一
使用破伤风类毒素(TT)与ZOT肽(AT1002)进行鼻内免疫
四只C57BL/6雌性小鼠为一组，每组分别单独以破伤风类毒素(TT)2.5μg，或以TT加上所示剂量的AT1002，或以TT加上已知的热不稳定性肠毒素(LT)佐剂作为对照组经鼻进行免疫。
图1显示了四次免疫后，抗TT血清IgG的图示平均滴度。结果显示与单独用TT免疫的动物相比，AT1002作为佐剂发挥作用后，其对于TT的血清反应更强。结果还进一步显示了30纳摩尔剂量的AT1002相对最有效。
图2显示了在四次免疫后，抗TT血清IgG的图示平均滴度。结果显示了AT1002诱发的抗TT血清反应较四次免疫后的反应强。再次显示了30纳摩尔剂量的AT1002相对最有效。
以TT与不同剂量的佐剂AT1002进行六次免疫后，可以测定诱发出的血清抗TT IgA反应(图4)。四只C57BL/6雌性小鼠为一组，各组分别单独以破伤风类毒素(TT)2.5μg，或以TT加上所示的剂量的AT1002经鼻免疫。结果显示了抗TT的血清IgA的图示平均滴度。数据显示AT1002诱发了对抗一起给予的抗原的血清IgA。经过观察，申请人进一步研究，诱发的反应可以在一、二、三、四或五次免疫反应后发生。
在以TT和不同剂量的佐剂AT1002六次免疫后，申请人还在阴道分泌物中观察到被诱发的抗TT的IgA反应(图5)。结果显示抗TT的IgA的图示平均滴度，表明在远离免疫位置的粘膜区域，AT1002诱发了对抗共同给予的抗原的IgA。经过观察，申请人进一步研究，诱发的反应可以在一、二、三、四或五次免疫反应后发生。
可以按照上述应用AT1002的方式来使用商品化的肽SLIGRL(小鼠，SEQID No：23)和SLIGKV(人类，SEQ ID No：24)(两者均从Sigma公司购得)。简单来说，SEQ ID No：23或24之一的佐剂肽可与例如TT的抗原一起给予。免疫反应的次数可以为1、2、3、4、5或6次。免疫反应是可以测定的，特别是使用TT时，可以测定在血清和/或阴道分泌物中的抗TT的IgA以及抗TT的IgG滴度。
实施例二
作为粘膜佐剂的ZOT肽
这里的结果证明肽AT1002发挥了粘膜佐剂的作用。更具体的说，在哺乳动物的粘膜免疫反应中，其与AT1002共同给予会诱发血清中血清IgG、IgA以及阴道分泌物中的粘膜IgA。
实施例三
AT1002针对共同输送的抗原诱发保护性反应。
将破伤风类毒素(TT；1μg/单位剂量)单独或与AT1002(30μg/单位剂量)一起对小鼠(C57/BL6)进行鼻内给药四周，两个月后，以DP50剂量(经过预先实验测试，使50％动物麻痹剂量的50倍)的破伤风类毒素皮下刺激小鼠，并监视一周内发生麻痹和死亡的情况。表1中的结果显示，单独接受TT免疫的小鼠没有得到保护，但是接受了抗原和AT1002的小鼠全部得到很好的保护。另外，在进行刺激前，立即对每个小鼠体内针对于抗原的血清IgG滴度进行了分析。测量的滴度范围则列于表中。
表一
经鼻内免疫的小鼠在破伤风类毒素刺激下的存活率
  疫苗     存活数/小鼠数     抗TT IgG滴度范围
  单独TTTT+AT1002     0/78/8     256-4,09616,384-65,536
结果表明：a)AT1002对于共同给予的抗原诱发了保护性反应；b)以AT1002使粘膜(鼻内)免疫诱发了针对系统性(皮下)刺激的保护性反应；以及c)当在最后一次给予疫苗后两个月进行刺激时，AT1002诱发了“记忆性”保护反应。两个月后的抗TT血清IgG的滴度仍然很高(注意两个月的时间对于小鼠生命周期而言是相当长的时间)。
实施例4
AT1002诱发细胞介导的反应
参考图6，单独(白色条带)将破伤风类毒素(TT；1μg/单位剂量)或将TT+AT1002(22.5μg/剂量，条纹条带)对小鼠(C57BL/6)进行鼻内给药四周。在最后一次给药后一周摘除脾脏，对脾细胞进行增殖分析测试，其中在培养物中加入TT，并测定引入的氘代胸腺嘧啶核苷。刺激指数(含TT的培养物的cpm/无TT的培养物的cpm)数值显示以TT+AT1002免疫的小鼠针对抗原增殖，而单独以TT免疫的小鼠则没有(数值等于或大于4认为是阳性)。
这些结果证实AT1002诱发了对抗共同给予的抗原的细胞介导的反应。因此通过AT1002作为佐剂的粘膜性免疫反应，能够激活抗原特异性T淋巴细胞。
实施例5
来自于健康捐献者的外周血的人类单核细胞经纯化后，在完全培养基中进行培养。两个小时后向培养物中加入刺激原，18小时后收集细胞，以所示单克隆抗体染色，并以流式细胞仪(FACS)分析。结果见于图7。
图7证实了AT1002对于人类抗原呈递细胞，如单核细胞或巨嗜细胞具有免疫促进的效果。图7显示AT1002能够上调单核细胞(粗体数字代表平均荧光强度值)上的人类主要组织相容性I型与II型分子(HLA-I；HLA-DR)在膜上的表达。有趣的是，在20微克/ml时所呈现的活性竟与降低20倍剂量如1微克/ml时相同。单核细胞上的共同刺激分子CD-80(B7-1)与CD86(B7.2)没有被上调。
接着分析AT1002对人类巨嗜细胞的影响。来自于健康捐献者的外周血的人类单核细胞经纯化后，在完全培养基中培养5天，以保证分化成巨嗜细胞。然后向培养物中加入刺激原，18小时后收集细胞，经所示单克隆抗体染色后以FACS进行分析。结果显示在图8中。图8显示AT1002大幅度上调了HLA-I、HLA-DR以及CD86(粗体数字代表平均荧光强度数值)在膜上的表达。共同刺激分子CD-80也被上调，图中没有体现。此外，AT1002上调CD40的表达，该分子是对于天然淋巴细胞的激活相当重要的分子。脂多糖(LPS)被用作巨嗜细胞活化的阳性对照。关于这点，应注意AT1002在上调HLA-I、HLA-DR分子时比LPS更有效。
这些结果证实AT1002具有免疫促进活性。AT1002活化了单核球细胞与巨嗜细胞，它们是具有先天免疫性的抗原呈递细胞，对于刺激抗原特异性的免疫反应非常重要。因此，AT1002作为疫苗佐剂使用。再者，单核细胞与巨嗜细胞上上调的分子对于T淋巴细胞的刺激很重要。实际上，HLA I分子刺激CD8+T淋巴细胞(细胞毒性细胞)，其对于对抗细胞间病原体，如病毒和细胞间细菌(如结核杆菌)以及对抗肿瘤细胞是非常重要的；HLA-DR分子对刺激CD4+T淋巴细胞的刺激是相当重要的，它们作为：a)刺激B淋巴细胞产出各类的抗原特异性抗体：IgM、IgG与IgA的帮助细胞，以及b)作为对抗由细胞内与细胞外病原体引起的感染的效应细胞。共同刺激分子CD80与CD86则对于T淋巴细胞的最佳刺激是很重要的。CD40分子对抗原特异性T淋巴细胞的刺激，特别是对于表达CD40配体分子的内生T淋巴细胞的激活也是非常重要的。
不受任何理论的限制，本发明的肽的作用机理可以包含第一步骤，即肽与位于上皮细胞的受体结合。该结合作用调整闭合带，允许共同输送粘膜下的抗原进入。接着，肽可以与免疫系统的细胞相互作用，以促进/调节免疫反应。
闭合带上的AT1002的活性以及其对于抗原呈递细胞的作用表明，AT1002在作为输送系统的同时作为佐剂发挥作用。这对于粘膜免疫作用是相当重要的，实际上其中两个重要的问题是粘膜下抗原的输送以及对免疫反应的刺激和放大。一般而言，粘膜疫苗中需要包含两种不同化合物以实现这两种不同的功能，而AT1002则是一个分子同时具有两种活性。
本说明书中所提及的所有专利和文献均显示了本发明涉及的技术领域的技术人员的水平。在此作为参考的所有专利和文献的引用程度均达到每一篇文献被特别地和独立地显示为引用其全文作为参考。
序列表
<110>De Magistris，Maria Teresa
     Fasano，Alessio
<120>用于输送粘膜疫苗的肽
<130>22298.00018
<150>60/643,606
<151>2005-01-14
<160>24
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<400>1
Phe Cys Ile Gly Arg Leu
1               5
<210>2
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(1)..(1)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，Tyr，and Met
<400>2
Xaa Cys Ile Gly Arg Leu
1               5
<210>3
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(2)..(2)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，and Gln
<400>3
Phe Xaa Ile Gly Arg Leu
1               5
<210>4
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(3)..(3)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<400>4
Phe Cys Xaa Gly Arg Leu
1               5
<210>5
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(4)..(4)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，Ala，and Gln
<400>5
Phe Cys Ile Xaa Arg Leu
1               5
<210>6
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(5)..(5)
<223>Xaa can be Lys and His
<400>6
Phe Cys Ile Gly Xaa Leu
1               5
<210>7
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(6)..(6)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<400>7
Phe Cys Ile Gly Arg Xaa
1               5
<210>8
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(1)..(1)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，Tyr，and Met
<220>
<221>多特征的
<222>(2)..(2)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，and Gln
<400>8
Xaa Xaa Ile Gly Arg Leu
1               5
<210>9
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(1)..(1)
<223>Xaa can be，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，Tyr，and Met
<220>
<221>多特征的
<222>(3)..(3)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<400>9
Xaa Cys Xaa Gly Arg Leu
1               5
<210>10
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(1)..(1)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，Tyr，and Met
<220>
<221>多特征的
<222>(4)..(4)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，Ala，and Gln
<400>10
Xaa Cys Ile Xaa Arg Leu
1               5
<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(1)..(1)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，Tyr，and Met
<220>
<221>多特征的
<222>(5)..(5)
<223>Xaa can be Lys and His
<400>11
Xaa Cys Ile Gly Xaa Leu
1               5
<210>12
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(1)..(1)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，Tyr，and Met
<220>
<220>多特征的
<222>(6)..(6)
<223>Xaa can be，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<400>12
Xaa cys Ile Gly Arg Xaa
1               5
<210>13
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(2)..(2)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，and Gln
<220>
<221>多特征的
<222>(3)..(3)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<400>13
Phe Xaa Xaa Gly Arg Leu
1               5
<210>  14
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(2)．.(2)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，and Gln
<220>
<221>多特征的
<222>(4)..(4)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，Ala，and Gln
<400>14
Phe Xaa Ile Xaa Arg Leu
1               5
<210>15
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(2)..(2)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，and Gln
<220>
<221>多特征的
<222>(5)..(5)
<223>Xaa can be Lys and His
<400>15
Phe Xaa Ile Gly Xaa Leu
1               5
<210>16
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(2)..(2)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，and Gln
<220>
<221>多特征的
<222>(6)..(6)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<400>16
Phe Xaa Ile Gly Arg Xaa
1               5
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(3)..(3)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<220>
<221>多特征的
<222>(4)..(4)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，Ala，and Gln
<400>17
Phe Cys Xaa Xaa Arg Leu
1               5
<210>18
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(3)..(3)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<220>
<221>多特征的
<222>(5)..(5)
<223>Xaa can be Lys and His
<400>18
Phe Cys Xaa Gly Xaa Leu
1               5
<210>19
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(3)..(3)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<220>
<221>多特征的
<222>(6)..(6)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<400>19
Phe Cts Xaa Gly Arg Xaa
1               5
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(4)..(4)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，Ala，and Gln
<220>
<221>多特征的
<222>(5)..(5)
<223>Xaa can be Lys and His
<400>20
Phe Cys Ile Xaa Xaa Leu
1               5
<210>21
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(4)..(4)
<223>Xaa can be Gly，Ser，Thr，Tyr，Asn，Ala，and Gln
<220>
<221>多特征的
<222>(6)..(6)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<400>21
Phe Cys Ile Xaa Arg Xaa
1               5
<210>22
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<220>
<221>多特征的
<222>(5)..(5)
<223>Xaa can be Lys and His
<220>
<221>多特征的
<222>(6)..(6)
<223>Xaa can be Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，and Met
<400>22
Phe Cys Ile Gly Xaa Xaa
1               5
<210>23
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<400>23
Ser Leu Ile Gly Arg Leu
1               5
<210>24
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>闭合带激动肽
<400>24
Ser Leu Ile Gly Lys Val
1               5

Claims (37)

1.一种诱发动物体内免疫反应的方法，包括：
向动物粘膜给予一种或多种抗原，以及一种或多种肽佐剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中至少一种抗原和至少一种肽佐剂以组合物形式给予。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述动物为哺乳动物。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述动物为人。
5.如权利要求1所述的方法，其中至少一种肽佐剂包含序列FCIGRL。
6.如权利要求1所述的方法，其中至少一种肽佐剂包含约6到约50个氨基酸。
7.如权利要求1所述的方法，其中至少一种肽佐剂包含约6到约25个氨基酸。
8.如权利要求1所述的方法，其中至少一种肽佐剂包含约6到约15个氨基酸。
9.如权利要求1所述的方法，其中至少一种抗原选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原以及流感病毒抗原组成的组。
10.如权利要求2所述的方法，其中所述组合物存在于水溶液中。
11.如权利要求2所述的方法，其中所述组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
12.如权利要求2所述的方法，其中至少一种肽佐剂包含序列FCIGRL，所述组合物存在于水溶液中，所述组合物包含一种或多种选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原以及流感病毒抗原组成的组中的抗原。
13.一种用于粘膜给予的免疫原性组合物，包含：一种或多种抗原以及一种或多种肽佐剂。
14.如权利要求13所述的组合物，其中至少一种抗原选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原以及流感病毒抗原组成的组。
15.如权利要求13所述的组合物，其中至少一种肽佐剂包含序列FCIGRL。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述肽佐剂包含约6到约50个氨基酸。
17.如权利要求15所述的组合物，其中所述肽佐剂包含约6到约25个氨基酸。
18.如权利要求15所述的组合物，其中所述肽佐剂包含约6到约15个氨基酸。
19.如权利要求13所述的组合物，其中所述组合物存在于水溶液中。
20.如权利要求13所述的组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
21.如权利要求13所述的组合物，其中至少一种肽佐剂包含序列FCIGRL，所述组合物存在于水溶液中，所述组合物包含至少一种选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原以及流感病毒抗原组成的组中的抗原。
22.一种用于粘膜给予的疫苗，包含一种或多种抗原以及一种或多种肽佐剂。
23.如权利要求22所述的疫苗，其中至少一种抗原选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原以及流感病毒抗原组成的组。
24.如权利要求22所述的疫苗，其中至少一种肽佐剂包含序列FCIGRL。
25.如权利要求24所述的疫苗，其中所述肽佐剂包含约6到约50个氨基酸。
26.如权利要求24所述的疫苗，其中所述肽佐剂包含约6到约25个氨基酸。
27.如权利要求24所述的疫苗，其中所述肽佐剂包含约6到约15个氨基酸。
28.如权利要求22所述的疫苗，其中所述疫苗存在于水溶液中。
29.如权利要求28所述的疫苗，其中所述疫苗进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
30.如权利要求22所述的组合物，其中至少一种肽佐剂包含序列FCIGRL，所述疫苗存在于水溶液中，所述疫苗包含一种选自由麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、风疹病毒抗原、白喉棒状杆菌抗原、百日咳博德特氏菌抗原、破伤风杆菌抗原、炭疽杆菌抗原以及流感病毒抗原组成的组中的抗原。
31.一种刺激抗原呈递细胞的方法，包含：将一种佐剂肽与抗原呈现细胞相接触。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述抗原呈递细胞包括单核细胞。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述抗原呈递细胞包括巨噬细胞。
34.如权利要求31所述的方法，其中刺激导致人类主要组织相容性I型和II型分子的表达上调。
35.如权利要求31所述的方法，其中刺激导致CD40的表达上调。
36.如权利要求31所述的方法，其中所述佐剂肽包含序列FCIGRL。
37.如权利要求31所述的方法，其中所述佐剂肽存在的浓度范围为约1μg/ml到约20μg/ml。
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