KR20070122056A

KR20070122056A - 콜로이드 금의 아쥬반트로의 사용

Info

Publication number: KR20070122056A
Application number: KR1020060057040A
Authority: KR
Inventors: 염정선; 안병철; 문홍모
Original assignee: (주)두비엘
Priority date: 2006-06-23
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2007-12-28
Also published as: WO2007148924A1; KR100836893B1

Abstract

본 발명은 콜로이드 금을 포함하는 아쥬반트 조성물에 관한 것으로, 콜로이드 금은 항원과 함께 사용될 경우 세포성 면역을 현저하게 증가시키는 아쥬반트로서, 치료 백신의 아쥬반트로 매우 적합하다.

콜로이드 금, 콜로이드 금 결합체, 아쥬반트, 치료백신

Description

콜로이드 금의 아쥬반트로의 사용{Use of colloidal gold as an adjuvant}

도 1은 preS로 코팅된 콜로이드 금 결합체 (colloidal gold conjugate)의 전자현미경 사진을 보여준다.

도 2는 재조합 전체표면항원(S단백질, M 단백질, L 단백질)을 발현하는 발현벡터의 개요도이다.

도 3은 정제된 재조합 전체표면항원(S단백질, M 단백질, L 단백질)의 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 사진이다.

도 4는 정상 마우스에서 콜로이드 금에 의한 체액성 면역반응의 유도를 보여준다.

도 5는 정상 마우스에서 콜로이드 금에 의한 세포성 면역반응의 유도를 보여준다.

도 6은 정상 마우스에서 치료백신에 의한 체액성 면역반응의 유도를 보여준다.

도 7은 정상 마우스에서 치료백신에 의한 세포성 면역반응의 유도를 보여준다.

도 8은 형질전환 마우스(transgenic mouse)에서 치료백신에 의한 체액성 면 역반응의 유도를 보여준다.

도 9는 형질전환 마우스에서 치료백신에 의해 유도된 항체의 isotype비를 보여준다.

도 10은 형질전환 마우스에서 치료백신에 의한 세포성 면역반응의 유도를 ELISPOT법으로 보여준다.

도 11은 형질전환 마우스에서 치료백신에 의한 세포성 면역반응의 유도를 ELISA법으로 보여준다.

도 12은 치료 백신에 의한 혈중 표면항원 (virus-like particle)의 감소를 보여준다.

도 13은 치료 백신에 의한 바이러스 유전자 발현의 감소와 인터페론-g발현의 증가를 보여준다.

도 14는 형질전환 마우스(transgenic mouse)에서 치료백신에 의한 체액성 면역반응의 유도를 보여준다.

도 15는 형질전환 마우스에서 치료백신에 의해 유도된 항체의 isotype비를 보여준다.

도 16은 형질전환 마우스에서 치료백신에 의한 세포성 면역반응의 유도를 ELISPOT법으로 보여준다.

도 17은 형질전환 마우스에서 치료백신에 의한 세포성 면역반응의 유도를 ELISA법으로 보여준다.

도 18은 치료 백신에 의한 혈중 표면항원 (virus-like particle)의 감소를 보여준다.

본 발명은 콜로이드 금을 포함하는 아쥬반트 조성물에 관한 것이다.

후천성 면역반응 (Adaptive immune response)에는 크게 1) 체액성 면역반응 (Humoral immune response)과 2) 세포성 면역반응(Cell-mediated immune response)이 있다. 이 중 세포성 면역 반응(Cell-mediated immune response)은 암이나 바이러스 감염의 방어에 중요한 역할을 하는 면역 반응으로 면역원 특유의 세포독성 T 림파 세포 (Cytotoxic T Lymphocyte)의 형성과 IgG2a, IgG2b, IgG3의 선별적 생산으로 나타난다. 따라서 암이나 만성 바이러스 감염을 치료하는 면역제제를 개발하기 위해서는 강력하고 효과적인 세포성 면역 (Cell-mediated immune response)을 유도함이 중요하다.

면역 반응은 이물질이 몸 안에 들어 왔을 때 면역세포가 이를 항원으로 인식하여 일어나는 반응이다. Antigen Presenting Cell (APC)은 이러한 이물질을 세포 속에 삼킨 후에, 적당한 크기로 소화해서 MHC Class I 혹은 MHC Class II와 함께 세포 표면에 제시한다. 이렇게 제시된 항원 (Epitope)은 면역세포 중 특히 CD4 T 세포, CD8 T 세포에 존재하는 독특한 수용체 (T Cell Receptor)를 통해 항원으로 인식되는데, 이때 면역세포와 APC가 동시에 활성화되어 보조 신호전달을 일으키는 Costimulatory Molecule들이 유도되고 항원의 성격에 따라 독특한 싸이토카인을 만들게 된다. 이물질이 아닌 자기 몸의 성분이 항원으로 제시되었을 경우에는 필요한 Costimulatory Molecule이 유도되지 않으며 면역 반응은 무산 (Anergy) 된다. 또한 APC는 톨 유사 수용체 (Toll Like Receptor)와 같은 감염된 미생물 고유의 분자형태를 인식하는 수용체 (Pathogen Associated Molecular Pattern Recognition Receptor)를 가지고 있어 항원의 분자형태를 인식하고, 신호 정보를 발함으로써 특수한 싸이토카인을 생성해서 면역 반응의 성격, 즉 세포성 면역반응을 강하게 일으키느냐 또는 체액성 면역 반응을 강하게 일으키느냐를 결정한다.

면역치료제 (Immunotherapy)의 개발에 있어 면역반응의 성격은 매우 중요하며, 위에서 언급한대로 암이나 만성 바이러스 감염을 치료하기 위해서는 세포성 면역을 유도하는 것이 필수적이다. 세포성 면역반응은 인터페론 감마 (Interferon-gamma)를 만들어내는 Th1 (T helper cell 1) 면역 세포로의 분화증식과 독특한 항원을 인식하는 CD8 T 세포의 증식 확장으로 대표된다. 이는 항원을 경험하지 못한 Naive CD4 T 세포 혹은 Naive CD8 T 세포로부터 분화되어 만들어진다.

특히 Naive CD4 T 세포는 Th1, Th2, 등으로 분화될 수 있는 가능성을 가지고 있는 전구 세포인데, Th1 세포로의 분화는 세포성 면역 반응, Th2 세포로의 분화는 체액성 면역반응이 유도되었음을 나타낸다. 따라서 면역 치료제의 개발에는 Naive CD4 T 세포를 Th1 세포로 분화하도록 유도해야 한다. 면역 반응에서 Th1 세포로의 분화는 큰 의미가 있는데, 이는 CD8 T 세포 (세포 독성 T 림파 세포, CTL)의 형성 을 도울 뿐만 아니라 체액성 면역반응으로 유도되는 항체의 성격을 결정한다. Th1 세포에서 분비하는 인터페론 감마는 바이러스 감염을 방어하는데 중요한 역할을 하는 IgG2a, IgG2b, IgG3를 유도하는 것으로 알려져 있다 (T.R. Mosmann, R.L. Coffman, Annu Rev Immunol, 1989, 7:145).

Th1 세포로 분화되는 것은 항원의 성격에 의해 결정된다. 항원 특이적인 면역반응을 유도하는데는 항원을 이루는 단위 (Epitope; 단백질항원의 경우8-25개의 아미노산 단위) 구조와 분자 전체의 특성이 중요하다. 이 둘은 각각 다른 신호 전달을 일으키나, 서로 보완해서 결국 Naive CD4 T 세포의 분화의 방향을 결정하게 됨으로써 면역 반응의 성격을 결정하게 된다. 예를 들면, APC의 톨 유사 수용체 (Toll Like Receptor)가 인식하는 미생물 항원의 경우, APC가 IL-12, IL-18을 발현하도록 유도하여 Naive CD4 T 세포가 Th1 세포 쪽으로 분화 증식을 하게 한다. 또한 이와 같은 싸이토카인들은 CD8 T 세포의 분화에도 영향을 준다. 즉, 미생물 항원의 분자 패턴은 세포성 면역반응을 일으키는 중요한 요건이다. Th1 세포로의 분화와 CD8 T 세포의 증식은 모두 T-bet (S. J. Szabo et al, Cell, 2000, 100:655. E. L. Pearce et al, Science, 2003, 302:1041) 이란 유전자 전사요소 (Transcription Factor)의 발현이 결정적 역할을 하는데, 여기에 IL-12가 (A. C. Mullen et al, Science, 2001, 292:1907) 중요한 보조 역할을 한다.

치료백신은 면역관용 상태를 해소하여 감염원에 대한 인체 면역반응을 유도하여 감염된 상태를 회복시키는 면역치료제로서, 만성 감염성 질환에 적합한 치료방법이다. 치료백신의 요건으로는 면역관용 (immune tolerance) 상태를 해소시켜서 면역반응을 유도할 수 있어야 하며, 감염원을 제거할 수 있을 정도로 강력한 체액성 면역반응 (humoral immunity)과 세포성 면역반응 (cell mediated immunity)을 유도할 수 있어야 한다. 즉, 체액성 면역 반응뿐 아니라 세포성 면역 반응을 모두 유도할 수 있는 면역 보조제가 필수적이다.

현재 가장 일반적으로 사용되는 아쥬반트는 알루미늄 화합물(황산알루미늄, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 등)이다. 알륨미늄 화합물은 체액성 면역반응을 유도하여 항원특이적인 방어용 항체를 생산하는 기능을 하며 주로 예방백신용 아쥬반트로 사용된다. 그러나 알룸미늄 화합물은 체액성 면역반응을 잘 유도하는 반면 세포성 면역반응의 유도 효율이 낮다는 한계를 가진다. 이를 개선하고자, 세균 톡신(콜라레톡신 등), 계면활성 작용물질(사포닌류, 고급 지방산 등), 미생물 또는 식물성분(BCG, 무라밀펩티드), 싸이토카인류(인터루킨 등), 기능 단백질(heat shock protein 등), 합성 폴리음이온과 폴리양이온 등의 새로운 아쥬반트의 연구와 개발이 진행되었다. 그러나, 여전히 백신, 특히 치료백신에 적용할 수 있도록 체액성 면역반응 및 세포성 면역반응을 모두 유도할 수 있는 효과적이고 안전성이 높은 우수한 아쥬반트의 개발이 요구되고 있다.

한편, 종래 면역치료제나 백신조성물 또는 기타 약제학적 조성물에서 골드 입자를 사용한 예가 있었으나, 이때 골드 입자는 크기가 작은 펩타이드 항원이 그 자체만으로는 면역원성이 충분하지 못하므로 면역원성이 좋은 형태로 만들어 면역세포에 전달해 주기 위해 사용되었거나 (PCT WO 96/14855, US Patent Publication No.: US 2003/0180252 A1), 또는 DNA 백신 운반체로서 사용되었거나 (PCT WO2004/028560 A1), 또는 생물학적 활성이 있는 물질 (예 TNF 등)과 결합하여 이를 특정부위로 전달하는 약물전달물질로 사용되는 것 (US 2005/0267204, US 6989158)에 한정되었다. 나아가, PCT WO 94/21288 는 싸이토카인이나 성장인자와 같은 생물학적 활성인자 (biologically-active factors) 의 독성을 줄이고자 콜로이드 금을 포함하는 콜로이드 금속을 사용하는 기술을 개시하고 있다. 그러나, 여기서의 콜로이드 금속은 아쥬반트의 용도로 사용되는 것은 아니다.

이에, 본 발명자들은 세포성 면역을 유발하는 아쥬반트를 개발하고자 노력한 결과, 콜로이드 금을 바이러스 항원과 함께 투여할 경우, 콜로이드 금을 사용하지 않는 대조군에 비하여 면역 반응, 특히 세포성 면역반응이 증가하는 것을 확인함으로써 아쥬반트로서의 금 콜로이드의 새로운 용도를 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 콜로이드 금을 포함하는 아쥬반트 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 콜로이드 금과 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 콜로이드 금을 아쥬반트로 사용하여 항원에 의해 유도되는 세포성 면역을 증가시키는 방법을 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 콜로이드 금을 포함하는 아쥬반트 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “아쥬반트(adjuvant)"란 그 자신은 백신의 면역원에 대한 특이적인 면역을 유발할 수 없지만 항원과 함께 작용할 때 면역계를 자극하여 면역반응을 상승시키는 작용을 하는 기질 또는 첨가물을 의미한다. 즉, 항원과 아쥬반트를 함께 이용한 백신제제화는 항원 단독에 의해 유도되는 것보다 더 강력한 면역반응을 유도한다.

아쥬반트로 사용되는 콜로이드 금의 제조방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서는 Frens (Frens G, Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions. Nature Phys. Sci. 241: 20, 1973)에 의하여 개발된 Sodium citrate 치환법을 일부 변형하여 콜로이드 금을 제조하였다.

콜로이드 금 입자의 크기와 모양은 특별히 제한되지 않지만, 구형으로서 입자의 직경이 5 내지 100nm인 것, 보다 바람직하게는 10 내지 40nm인 것이 좋다.

콜로이드 금은 그 자체로 항원과 혼합하여 사용할 수 있다. 또는 BSA 또는 다른 단백질로 콜로이드 금 표면을 코팅한 콜로이드 금 결합체 (colloidal gold conjugate) 형태로 항원과 혼합하여 사용될 수 있다. 콜로이드 금 결합체를 만들 기 위해 콜로이드 금의 표면을 코팅하는 단백질은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 콜로이드 금 아쥬반트와 함께 사용되는 항원단백질, 그 단백질의 절편 또는 그 단백질로부터 유래하는 펩타이드 또는 BSA 이다. 본 발명에서의 콜로이드 금 아쥬반트는 상기의 콜로이드 금 자체 및 단백질로 코팅된 콜로이드 금 결합체를 모두 지칭하는 의미로 사용될 수 있다.

본 발명에서는 하나의 실시예로서, HBV의 S, M, L 단백질 형태의 표면항원과 코어항원을 백신으로서 마우스에 투여하고 면역 반응 정도를 살펴보았다. 백신을 콜로이드 금과 혼합한 형태로 투여한 마우스와 백신을 콜로이드 금을 혼합하지 않은 형태로 투여한 마우스에서의 면역반응 정도를 비교하였다. 그 결과, 항원을 콜로이드 금과 혼합한 형태로 투여한 마우스에서 체액성 면역과 세포성 면역이 모두 증가하였으며, 특히, 세포성 면역이 월등하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터, 콜로이드 금이 세포성 면역반응의 증대에 결정적인 역할을 수행하는 것을 알 수 있다.

나아가, 만성간염환자와 유사하게 표면항원을 지속적으로 혈액 내로 분비하지만 생성된 표면항원에 대해 면역관용이 생긴 형질전환 마우스에, HBV의 S, M, L 단백질 형태의 표면항원과 코어항원을 콜로이드 금과 혼합한 형태로 투여하여 면역화를 유도한 마우스와 콜로이드 금을 혼합하지 않은 형태로 투여하여 면역화를 유도한 마우스에서의 면역 반응 정도를 살펴보았다. 그 결과, 콜로이드 금을 항원과 함께 투여한 경우, 그렇지 않은 경우와 비교하여 항체 형성에 있어서는 큰 차이가 없었으나 항원 특이적인 세포성 면역반응이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 콜로이드 금을 항원과 함께 투여한 마우스에서는 INF-r 유전자의 발현이 그렇지 않은 경우에 비해 3-4배 가량 증가하며, 마우스에서 혈중 표면항원 수치도 콜로이드 금을 백신과 함께 투여할 경우 가장 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 실험 결과로부터 콜로이드 금이 아쥬반트 활성을 가짐을 밝혔고, 특히, 콜로이드 금은 질환의 치료에 중요하게 요구되는 세포성 면역을 증대시키는 특징을 가지는 아쥬반트임을 알 수 있었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 콜로이드 금 및 하나 이상의 항원을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 콜로이드 금은 단독으로, 또는 BSA 또는 다른 단백질로 콜로이드 금 표면을 코팅한 콜로이드 금 결합체 (colloidal gold conjugate) 형태로 항원과 혼합하여 사용될 수 있다.

상기한 바와 같이, 콜로이드 금은 항원 특이적인 면역반응을 증대시키므로 다양한 질병의 치료에 적용이 가능하다. 특히, 본 발명에서 제공하는 콜로이드 금 아쥬반트가 체액성 면역뿐만 아니라 세포성 면역을 강력하게 유도하는 특징을 가지므로, 본 발명의 콜로이드 금 아쥬반트를 기존에 사용되던 백신과 함께 투여할 경우, 만성 질환, 예를 들어 바이러스성 만성 감염을 위한 치료 백신으로 사용될 수 있다.

본 발명의 콜로이드 금을 아쥬반트로 하여 함께 사용될 수 있는 백신 항원은 특별히 제한되지 않는다. 항원은 천연 또는 재조합 정제 항원일 수 있으며, 바이러 스, 박테리아, 원충류 및 진균류를 비롯한 생, 약독화(비병원성) 또는 사멸된 병원체, 병원체로부터 유래한 단백질, 펩티드, 지질 또는 탄수화물 항원원이 포함될 수 있다. 바람직하게는 바이러스에서 기원한 단백질 항원이다. 바이러스는 피코르나바이러스, 칼리시바이러스, 코로나바이러스, 아레나바이러스, 파르보바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 코로나바이러스, 라브도바이러스, 필로바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 부니아바이러스, 레트로바이러스, 파포바바이러스, 아데노바이러스, 허피스바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스 등을 예시할 수 있다.

제조된 콜로이드 금은 10ug 내지 2000ug 사용할 수 있고, 항원은 0.5ug 내지 500ug 사용할 수 있다. 제조된 콜로이드 금과 항원의 혼합비는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 콜로이드 금과 항원은 4000:1, 바람직하게는 10:1의 비율로 혼합될 수 있다.

콜로이드 금을 아쥬반트로 사용하여 본 발명에서 제공하는 백신은 콜로이드 금 이외에도 기존에 사용된 아쥬반트를 추가로 사용하여 상승적 면역반응을 유도할 수 있다. 알루미늄 화합물(황산알루미늄, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 등), 세균 톡신(콜라레톡신 등), 계면활성 작용물질(사포닌류, 고급 지방산 등), 미생물 또는 식물성분(BCG, 무라밀펩티드), 사이토카인류(인터루킨 등), 기능 단백질(heat shock protein 등), 합성 폴리음이온과 폴리양이온 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시에서는 알루미늄 화합물(알룸)에 흡착된 백신 항원 을 콜로이드 금 결합체와 혼합하여 사용하였다. 백신 항원을 체액성 면역반응을 효과적으로 유도하는 것으로 알려진 아쥬반트인 알룸에 흡착시키고 동시에 콜로이드 금과 혼합하여 면역화하면, 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 최적화시킬 수 있기에 유용하다.

본 발명의 콜로이드 금을 아쥬반트로 이용하여 제조될 수 있는 백신 제제로는 인간 및 동물에 감염되는 바이러스, 세균, 진균, 원충, 그 밖의 미생물에 유효한 백신을 포함한다. 백신은 구체적으로, 인플루엔자 백신, 백일해 백신, 정제백일해 디프테리아 파상풍 혼합 백신, 일본뇌염 백신, A형간염 백신, B형간염 백신, 로타 백신, 홍역 백신, 풍진 백신, 유행성 이하선염 백신, 홍역 풍진 유행성이하선염 3종 혼합 백신, 홍역 풍진 2종 혼합 백신 및 헤모피루스 인플루엔자 백신 등의 각종 백신을 예시할 수 있다. 또한, 결핵 백신, 다제내성 황색포도상 구균(MRSA) 백신, 헬리코박터·피롤리 백신, 출혈성 대장균(EHEC) 백신, 살모넬라백신, 클라미디어 백신, 마이코플라즈마 백신, 에이즈 백신, 말라리아 백신, 콕시듐 백신 또는 주혈흡충 백신 등을 포함한다.

콜로이드 금을 포함하는 아쥬반트 조성물과 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등 을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 유효량으로 투여한다. 용어 "약제학적 유효량"이란 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 항원에 따라 달라지며, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 콜로이드 금을 아쥬반트로 사용하여 항원에 의해 유도되는 세포성 면역을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

콜로이드 금을 아쥬반트로서 항원과 함께 투여함으로써, 세포성 면역을 증가시켜 질병의 치료 효율을 증대시킬 수 있다. 구체적으로, 콜로이드 금을 바이러스 치료 백신의 아쥬반트로 사용하여 바이러스 감염 질환을 치료할 수 있다. 콜로이드 금은 인간뿐만 아니라 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 가축에게 투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것 일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 콜로이드 금 아쥬반트 ( adjuvant ) 제조

1.1. 콜로이드 금 (Colloidal gold)의 제조

Frens (Frens G, Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions. Nature Phys. Sci. 241: 20, 1973)에 의하여 개발된 소디움시트레이트법 (Sodium citrate procedure)을 기본으로 하여 콜로이드 금을 제조하였다. 염화금 (Gold chloride :HAuCl₄3H₂O) 0.2g을 10ml 증류수에 녹여 2% 금 스톡 용액 (gold stock solution)을 준비하였다. 100ml 증류수를 저어가면서 가열하여 끊였다. 여기에 2% 금 스톡 용액 1ml을 넣어 최종 농도 0.02% 금 용액을 만들어 가열과 저어감(stirring)을 약 5분간 지속하였다. 10% 소디움 시트레이트 (sodium citrate)용액을 최종농도가 0.032 - 0.036% 가 되도록 넣고, 5-10분간 가열과 저어감을 지속하였다. 이때 용액은 초기에는 회색을 띄나 점차 보라색으로 바뀌고 1-3분 후에 붉은 색을 띄었다. 이를 수욕조 (water bath)에 넣어 식히고, OD₅₄₀과 OD₆₀₀을 측정하였다. OD₅₄₀은 입자(particle)의 수 또는 금 입자의 농도를 의미하며 2-4 값을 보였고, OD₆₀₀은 입자 크기(particle size) 또는 입자의 질 (quality of particle)을 의미하며 0.55-0.75 의 값을 보였다. 제조된 콜로이드 금의 입자 크기는 약 10-40 nm 이었다.

1.2. 콜로이드 금 결합체 (Colloidal gold conjugate)의 제조

제조된 콜로이드 금 용액에 100mM 소디움 카보네이트 모노하이드레이트 (soduim carbonate monohydrate) (또는 다른 buffer)를 첨가하여 용액의 pH를 7.5로 적정한 후 콜로이드 금 용액을 저어가면서 용액 1ml (200ug의 콜로이드 금을 포함)당 20ug의 Bovine Serum Albumin (BSA)이나 10ug의 preS 항원을 첨가한 후 상온에서 15분간 지속적으로 저어주었다. 원심 분리 후 상등액을 제거하고 멸균된 PBS (Phosphate Buffered Saline) 버퍼로 3회 세척하여 흡착되지 않은 BSA 혹은 preS 항원을 제거한 후 PBS에 다시 희석하여 (resuspension)하여 4℃에 보관하였다. preS단백질이 코팅된 콜로이드 골드 결합체의 전자현미경 사진을 도 1에 나타내었다(JEM1010, 67.0k). 단백질의 흡착정도는 BSA나 preS 항원을 흡착시킨 후 원심 분리하여 상등액에 남아있는 단백질의 양을 정량하여 확인하였다 .

실시예 2. 백신 항원의 제조

2.1. 재조합 preS-S 항원

(1)-1 클로닝

HBV 게놈을 포함하는 벡터 (HBV315, Korean Biochem. J. 17: 70-79, 1984)를 주형으로 HBsAg의 코딩영역 (coding region) (preS1-preS2-S) 및 폴리아데닐레이션 부위 (polyadenylation site)를 포함하는 3’-UTR 전체를 PCR 법으로 증폭하여 발현벡터에 도입하였다. 이 때 PCR 반응은 Pfu DNA 폴리머라제를 사용하여 수행하였 으며, HBsAg의 코딩부위와 3’-UTR 전체가 증폭되도록 프라이머를 제작하였다. (전방(forward) 프라이머: 5’-GGA AGA TCT CAA TCT CGG GAA-3’(서열번호 1), 후방(reverse) 프라이머: 5’-GGA AGA TCT CGA ATA GAA GGA AAG-3’(서열번호 2), 밑줄친 부분은BglII 인식서열임). 약 2.75 kbp 크기의 PCR 산물을 얻어 BglII 효소로 선형화한 pMSG vector (대한민국 특허 출원 10-2000-0043996, PCT 출원PCT/KR01/01285) 와 리게이션 반응시켰다. 이렇게 제작한 벡터의 개요도를 도 2에 나타내었다. 이를 CHO 세포에 트랜스펙션하여 형질전환체를 얻었고, preS-S항원 (서열번호 3) 의 발현을 웨스턴 블랏법으로 비교하여 발현율이 높은 세포주를 선별하였다. 서열번호 3의 단백질을 코딩하는 핵산서열을 서열번호 4로 나타내었다.

(1)-2 부유배양 세포주 확립

선별된 세포주를 T-175 플라스크에 5×10⁵개의 세포를 접종하였다. T-플라스크에서 부착하여 10% 혈청배지 조건에서 성장한 세포를 0.25% 트립신으로 떼어낸 후, 1200 rpm에서 5분간 원심분리 하여 잔류 트립신을 제거하고 무단백질 배지 (HyQ SFM4CHO, Hyclone) 에 단일 세포로 잘 현탁하여 100ml 배양부피로 250ml spinner 플라스크에 접종하여 37℃에서 80 rpm속도로 배양하였다. 초기 세포농도는 5×10⁵cells/ml로 하여 접종하였고 세포성장이 1.5×10⁶cells/ml 정도에 도달할 때 같은 초기농도로 연속 계대배양 하여 부유배양에 적응된 세포주를 확보하였다.

(2) 배양

MCB (Master Cell Bank)로부터 계대배양하여 접종용 세포를 준비하였다. 이 때 배양 배지는 무혈청배지 (HyQ SFM4CHO, Hyclone)을 기본배지로 하여 250 ml spinner 플라스크에 5x10⁵ cells/ml의 농도로 접종한 후 34°C에서 80 rpm 속도로 배양하였다. 배양 3일 후 기본성분 (Transferrin, Selenium, Glucose) 등과 세포성장인자 (HyQ LS1000, Lipid), Fed batch supplement (Carbohydrate, Amino acid, Vitamin) 등을 첨가하였다. 배양된 세포를 1L Spinner 플라스크에서 계대배양하여 세포수를 늘린 후 이를 7.5L 생물배양기에 접종하여 pH7.2, 34℃, 교반속도 80rpm에서 배양하였고, 배양 3일 후 시트릭산과 HyQ LS1000을 첨가하여 3일간 더 배양하였다.

(3) 정제

생물배양기에서 배양된 배양액을 원심분리하여 회수한 후 0.45um 필터를 통과시켜 불순물을 제거하였다. 이를 평형화시켜놓은 페닐-세파로즈 크로마토그래피 (Phenyl-Sepharose chromatography), DEAE-세파로즈 크로마토그래피 (DEAE-Sepharose chromatography), 세파로즈 4 EF 크로마토그래피 (Sepharose 4 FF chromatography)를 거쳐 정제하였다. 정제된 전체 표면항원은 S 단백질, M 단백질, L 단백질로 구성되어 있고, 당쇄화 유무에 따라 6가지의 재조합 단백질로 이루어진 파티클 형태를 이루었다(도 3). 도 3의 A는 정제된 전체 표면항원의 SDS-PAGE 결과 이고, 도3의 B는 정제된 표면항원을 각각 항-S 항체 (레인1), 항-preS1 항체 (레인2) 그리고 항-preS2 항체 (레인3)로 웨스턴 블롯한 그림이다.

2.2 재조합 코어항원 (HBcAg)

(1) 클로닝

코어(Core)항원의 C-말단에 있는 아르기닌 클러스터(arginine cluster)를 제외한 아미노산 서열 1번부터 149번을 재조합 단백질 (서열번호 5) 로 발현하였다. 상기 단백질을 코딩하는 핵산서열을 서열번호 6으로 나타내었다. HBV 게놈을 포함하는 벡터 (HBV315)를 주형으로 이 부분에 해당하는 유전자를 PCR법으로 증폭하여 pET11a (Novagen)벡터의 제한효소 NdeI, BamHI 절단부위에 삽입하여 pET11a-core 발현벡터를 제작하였다. 코어 유전자의 PCR 증폭에는 전방(forward) 프라이머: 5’-CCC CAT ATG GAC ATT GAC CCG TA-3’ (서열번호 7)와 후방(reverse) 프라이머: 5’-CGC GGA TCC AAC AAC AGT AGT TTC CGG-3’(서열번호 8)이 사용되었다. pET11a-core 발현벡터를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하여 발현을 확인하고 발현율이 높은 생산클론을 선별하였다.

(2) 형질전환 생산균주 배양

생산균주를 5L 발효조를 이용하여 최적생산조건을 확립하였다. 배지는 2 % Bacto Tryptone, 1 % Yeast extract, 2 % NaCl, 2 % Glucose, 1.33 % KH₂PO₄, 0.4 % (NH₄)₂HPO₄, 0.17 % Citric acid, 0.12 % MgSO₄, 0.01 % Thiamine-HCl, 0.0371 % Ampicillin을 사용하였고, 11시간 동안 37℃에서 배양 후 0.05 mM/g cell 이 되는 조건으로 IPTG (Isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside)를 첨가하였다. IPTG 첨가 후 18시간 동안 유도시킨 후 세포를 수확하였다.

(3) 재조합 단백질 정제

세포를 수확한 후 용해(Lysis)버퍼 (50mM Tris-Cl pH7.6, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 10mM 2-mercaptoethanol, 0.2mM PMSF)로 3회 세척한 후 용해버퍼를 넣고 소니케이션을 통해 세포를 파쇄하였다. 원심분리를 통해서 상등액을 수거한 후 65℃에서 30분간 가열한 뒤 다시 원심분리하여 상등액을 분리하고 30% 암모니움 설페이트를 첨가하여 코어항원을 침전시켰다. 원심분리 후 침전물을 50mM Tris-Cl (pH7.6)에 녹인 뒤 부틸 세파로즈 컬럼 (Butyl sepharose column)을 통해 코어항원만을 순수 분리하였다. 정제된 재조합 코어항원은 바이러스와 유사한 파티클을 형성하며, 높은 면역원성을 보이고 세포성 면역을 강하게 유도하는 특징이 있었다.

실시예 3. 백신 조성 ( Preparation of the vaccine composition )

백신항원은 실시예 2에서 제조한 재조합 단백질로 생산된 HBV 전체 표면항원과 코어항원을 혼합하여 사용하였다. 치료백신용 아쥬반트 (adjuvant)는 실시예 1에서 제조한 BSA로 코팅된 콜로이드 금 결합체를 사용하였다. 이때 항원은 알룸에 흡착한 후 콜로이드 금 결합체와 혼합하여 면역투여하거나 알룸에 흡착하는 과정이 없이 재조합 단백질 상태로 콜로이드 금 결합체와 혼합하여 면역 투여하였다.

3.1 알룸흡착

재조합 전체표면항원 또는 재조합 코어항원은 150mM 소디움 클로라이드(Sodium Chloride)를 포함하는 용액에서 4°C에서 24시간 동안 각각 알룸과 흡착시켰다. 사용된 항원이 알룸에 모두 흡착되었는지 확인하기 위하여 알룸에 흡착된 항원을 포함하는 용액 200ul를 에펜도프 튜브에 넣고 원심분리 한 후 상등액을 분리하여 ELISA 법과 웨스턴 블랏을 수행하였다. 또한 흡착된 항원을 다시 분리하기 위해서 침전된 알룸에 20ul의 1M 소디움 포스페이트을 첨가하여 30분간 상온에서 보르텍싱(vortexing)을 하고, 여기에 30ul의 SDS-PAGE 샘플버퍼를 넣고 20분간 상온에서 보르텍싱(vortexing)을 하고 5분간 끓인 후 웨스턴 블랏을 수행하여 알룸에 흡착된 항원을 확인하였다. 완전히 흡착된 항원을 4℃에 보관하면서 동물모델을 이용한 치료백신 효능 실험에 사용하였다.

3.2 콜로이드 금 아쥬반트와 혼합

제조된 항원은 그 자체로 사용하거나 알룸에 흡착하여 0.5ug (정상 마우스에 면역한 경우) 또는 5ug (형질전환 마우스에 면역한 경우)을 실시예 1에서 준비한 BSA로 코팅된 콜로이드 금 복합체 200ug과 투여 전에 혼합하여 근육주사하였다.

실시예 4. 콜로이드 금 아쥬반트의 면역반응 유도효과

4.1 면역실험 조건 및 분석방법

(1) 목적 : 아쥬반트 (adjuvant)로서 콜로이드 금 복합체의 효능을 확인하기 위해 마우스에 면역하여 유도된 면역반응을 분석하였다.

(2) 재료 및 방법

(가) 실험동물 ; 6주된 C57BL/6 마우스 암컷 (female)을 사용.

(나) 시험백신

- 시험백신은 정제된 재조합 코어항원과 재조합 전체표면항원을 알룸에 흡착시켜 제조하였으며 dose당 각 항원 0.5ug을 사용하였다. 또한 알룸에 흡착되지 않은 자유 항원 (free antigen) 0.5ug을 200ug의 콜로이드 금 결합체와 혼합하여 사용하였다.

(다) 면역 그룹 및 면역조건

- 면역 그룹

1. 실험군 1: PBS (Phosphate buffered saline) 으로 면역한 음성대조군 (negative control)

2. 실험군 2: 알룸에 흡착한 재조합 전체표면항원과 재조합 코어항원으로 면역

3. 실험군 3: 알룸에 흡착하지 않은 재조합 전체표면항원과 재조합 코어항원을 콜로이드 금 결합체와 혼합하여 면역

- 투여방법: 각 시험백신을 2주 간격으로 2회에 걸쳐 근육 주사하였다.

(라) 면역반응 분석방법

1) 체액성 면역반응의 분석

면역 전 (pre-immune serum)과 1차 면역 후부터 매주 혈청 (serum)을 분리하여 혈청 내에 생성된 항체를 분석하였다. 항체를 분석하기 위해 먼저 정제된 각 항원을 96 well 마이크로플레이트에 100ng/well의 농도로 코팅한 뒤 Bovine Serum Albumin (1%)로 1시간동안 블로킹 하였다. 마이크로플레이트를 세척한 뒤 각 웰에 순차적으로 희석된 혈청을 넣고 2시간동안 37℃에서 반응시키고 난 후 2차 항체로서 anti-mouse IgG-HRP를 넣고 1시간 동안 동일한 조건에서 반응시킨다. 세척 후 발색시약을 넣고 20분간 상온에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 OD값을 측정하였다.

2) 세포성 면역반응의 분석

2차 면역 후 2주 이내에 모든 마우스로부터 비장(spleen)을 적출하여 전체 splenocyte를 분리 및 배양하여 세포성 면역반응을 확인하였다. 각각의 마우스로부터 분리한 비장을 세포 스트레이너(cell strainer)에 넣고 파쇄 후 RBC 용해버퍼(lysys buffer)이용하여 적혈구를 완전히 제거한 뒤 splenocyte만을 순수분리하였다. 분리된 splenocyte를 complete media (RPMI1640 medium에 1X glutamine과 1X antibiotics를 첨가)에서 배양하였다. 각 항원에 특이적인 면역반응을 관찰하기 위해 배양배지에 코어항원과 전체표면항원을 각각 1ug/ml의 농도로 첨가하여 항원 특 이적 면역세포만을 분화하도록 자극한 후 세포배양액으로 분비된 사이토카인 (세포성 면역반응의 지표로 인터페론-g를 분석)을 ELISA 방법으로 분석하였다 (BD Biosciences).

4.2 콜로이드 금 결합체의 아쥬반트 (adjuvant) 효능 확인

(1) 체액성 면역반응에 미치는 영향

백신항원을 투여한 실험군 (실험군 2, 3)은 모두 백신을 주지 않은 음성대조군(실험군 1)과 비교하여 항원특이적인 항체형성인 항-HBs 항체와 항-HBc 항체가 유도되었다. 그러나 유도된 항체가는 알룸을 아쥬반트로 사용한 경우 (실험군2)가 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 사용한 경우 (실험군 3)보다 높은 항체형성을 보였다(도 4). 알룸은 이미 알려진 바와 같이 체액성 면역반응을 강력하게 유도할 수 있는 아쥬반트이며, 본 특허에서 사용한 콜로이드 금 결합체도 체액성 면역반응을 유도할 수 있는 기능이 있음이 확인되었다. 그러나 치료백신용 아쥬반트는 세포성 면역반응을 유도해야 하므로 두 아쥬반트에 의하여 유도된 세포성 면역반응을 비교하였다.

(2) 세포성 면역반응에 미치는 영향

콜로이드 금 결합체에 의해 세포성 면역반응이 유도되었는가를 확인하기 위해서, 2차 면역 후 각각 마우스로부터 splenocyte를 분리하여 코어항원 혹은 표면항원 특이적인 인터페론-g의 생산을 ELISA 방법으로 확인하였다. 알룸을 아쥬반트 로 사용한 경우 (실험군 2)는 각 항원에 대한 인터페론-g의 생산이 면역하지 않은 대조군에 비해 2.5 배 증가하였지만, 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 사용한 경우에는 이보다 더 높게 나타났다 (도 5). 특히 표면항원에 특이적인 세포성 면역반응은 알룸을 사용하였을 때 보다 4 배 더 높게 나타났다. 즉 B형 간염바이러스 항원에 대한 면역반응이 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 사용하여 면역하였을 때 치료백신에 필요한 세포성 면역반응이 잘 유도되며, 바이러스의 제거에 필요한 인터페론-g 의 생산이 증가하였다. 따라서 콜로이드 금 결합체는 세포성 면역반응을 강력하게 유도할 수 있으며 이를 아쥬반트로 이용할 경우 효과적인 치료백신의 개발이 가능하다.

실시예 5. 치료백신의 면역반응 최적화

5.1 면역실험 조건 및 분석방법

(1) 목적 : 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 모두 최대로 유도하기 위하여 치료백신 조성을 비교하였다.

(2) 재료 및 방법

(가) 실험동물 ; 6주된 C57BL/6 마우스 암컷 (female)를 사용.

(나) 시험백신

- 정제된 재조합 코어항원과 재조합 전체표면항원을 알룸에 흡착하여 dose당 각 항원 0.5ug을 사용하였다. 또한 알룸에 흡착된 각 항원 0.5ug과 BSA로 코팅된 콜로이드 금 결합체 200ug을 혼합하여 면역하였다.

(다) 면역 그룹 및 면역조건

- 면역 그룹

1. 실험군 1: PBS 로 면역한 음성대조군 (negative control)

3. 실험군 3: 알룸에 흡착한 재조합 전체표면항원과 재조합 코어항원을 콜로이드 금 결합체와 혼합하여 면역

- 투여방법: 각 시험백신을 2주 간격으로 2회 근육주사하였다.

(라) 면역반응 분석방법

시험백신에 의해 유도된 체액성 및 세포성 면역반응은 위 실시예 4에 제시된 방법으로 분석하였다.

5.2 유도된 면역반응 분석

(1) 체액성 면역반응에 미치는 영향

백신항원을 투여한 실험 군(실험군 2, 3)은 백신을 주지 않은 음성대조군 (실험군 1)과 비교하여 항원특이적인 항체형성이 유도되었다. 이때 유도된 항체가 (antibody titer)는 알룸에 흡착된 시험백신만을 면역한 경우 (실험군 2)와 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 혼합하여 면역한 경우 (실험군 3)에 큰 차이가 없었다 (도 6). 즉, 이 실험결과, 알룸과 콜로이드 금 결합체를 같이 사용하여 체액성 면역반응을 높일 수 있었다.

(2) 세포성 면역반응에 미치는 영향

콜로이드 금 결합체가 세포성 면역반응을 유도하였는가를 확인하기 위해서, 2차 면역 후 각 마우스로부터 splenocyte를 분리하여 인터페론-g 의 생산을 ELISA 방법으로 확인하였다.

알룸에 흡착한 백신항원을 면역한 경우 (실험군 2)는 각 항원에 대한 인터페론-g의 생산이 음성대조군과 비교하여 약 2배 가량 증가하였지만, 콜로이드 금 결합체를 항원과 같이 면역한 경우 (실험군3)에는 코어항원에 대한 인터페론-g 생산은 2.5배 증가하였고, 표면항원에 대한 인터페론-g 생산은 4.5배 더 증가하였다 (도 7). 이로부터 알룸은 체액성 면역반응을 강력하게 유도하는 아쥬반트이고, 콜로이드 금 결합체는 위 실시예4에서와 같이 세포성 면역반응을 강력하게 유도할 수 있는 아쥬반트임이 확인되었다. 그러므로 백신항원을 알룸에 흡착한 후 콜로이드 금 결합체와 같이 면역하면 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 모두 최적화할 수 있는 치료백신 개발이 가능할 것으로 보인다.

실시예 6. 형질전환 마우스를 이용한 시험백신의 효능 확인 (1)

6.1 면역실험 조건 및 분석방법

(1) 목적 : 정상 마우스에서 확립된 치료백신 조성을 형질전환 마우스 (HBsAg/HLA-A2)를 사용하여 치료백신 효능을 분석하였다.

(2) 재료 및 방법

(가) 실험동물

6주된 HBsAg/HLA-A2 형질전화 마우스 암컷 (female)을 사용하였다 (Loirat D et al HBsAg/HLA-A2 transgenic mice: a model for T cell tolerance to hepatitis B surface antigen in chronic hepatitis B virus infection International Immunology 15: 1125-1136, 2003). 이 동물모델은 HBV 표면항원 (HBsAg)유전자가 전달 (transgenic)되어 지속적으로 발현하고, 혈액내로 표면항원으로 이루어진 바이러스 유사입자 (virus-like particle)을 분비한다. 또한 전달된 표면항원 유전자를 자체 유전자로 인식하여 이에 대한 면역반응을 유도하지 못하고 면역관용 (Immune Tolerance)상태를 보인다. 따라서 이 모델은 HBV 감염상태에서 이에 대한 충분한 면역반응을 유도하지 못하여 바이러스를 제거하지 못하고 감염상태가 지속되는 만성간염환자와 유사한 모델이다.

(나) 백신항원 및 아쥬반트

정제된 재조합 코어항원과 재조합 전체표면항원을 알룸에 흡착시켜 백신항원으로 사용하고, 치료백신용 아쥬반트로 BSA가 코팅된 콜로이드 금 결합체를 사용하였다.

(다) 면역 그룹 및 조건

- 면역 그룹

1. 실험군 1: PBS (Phosphate buffered saline)을 면역한 음성대조군 (negative control)

- 투여방법: 각 시험백신을 2주 간격으로 3회 근육주사하였다.

(라) 혈청 내의 바이러스 유사입자 분석

면역 전 (pre-immune serum)과 3차 면역 후 혈청을 분리하여 혈청내의 표면항원 (HBsAg)으로 이루어진 바이러스 유사입자의 양을 제네디아 HBsAg ELISA kit 3.0 (녹십자)을 이용하여 분석하였다.

(마) 체액성 면역반응 분석

면역 전 (pre-immune serum)과 3차 면역 후 혈청을 분리하여 항원 특이적인 항체 생성을 실시예4에 제시된 방법으로 분석하였다. 또한 유도된 항체의 서브타입 결정하여 IgG2a와 IgG1 비율을 결정하였다.

(바) 세포성 면역반응의 분석

실시예4에 제시된 방법으로 splenocyte를 분리, 배양하여 세포성 면역반응의 지표인 인터페론-g 가 유도됨을 ELISA법과 ELISPOT법으로 분석하였다.

(사) 간 (liver)에서 Interferon-g와 표면항원 유전자의 발현 분석

마우스 간에서 전체 RNA를 추출하여 유전자 발현정도를 RT-PCR법으로 분석하였다. Total RNA는 RNeasy Mini kit(Qiagen)을 이용하여 분리하였고, 아래의 프라이머와 One-step RT-PCR kit (Qiagen)을 사용하여 표면항원 유전자 (서열번호 9, 10 사용) 및 인터페론-g 유전자 (서열번호 11, 12 사용)의 발현정도를 확인하였다. 이때 β-actin 유전자 (서열번호 13, 14사용) 발현정도를 음성대조군 (control)로 사용하였다.

S-(F) 5'-ATG GAG AGC ACA ACA TCA GG-3' (서열번호 9)

S-(R) 5'-TTA AAT GTA TAC CCT AAG-3' (서열번호 10)

INF-γ(F) 5'-AGC GGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG-3' (서열번호 11)

INF-γ(R) 5'-GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG-3' (서열번호 12)

β-actin(F) 5'-TCC TGT GGC ATC CAT GAA AC-3' (서열번호 13)

β-actin(R) 5'-CTT CGT GAA CGC CAC GTG C-3' (서열번호 14)

6.2 콜로이드 금 결합체의 치료백신용 아쥬반트 효능 확인

1) 면역관용의 해소

사용된 형질전환 마우스 모델은 표면항원 유전자를 자체 유전자로 인식하여 이에 대한 면역반응을 유도하지 못하고 면역관용상태를 보인다. 여기에 치료백신을 투여한 결과 표면항원에 대한 면역관용을 해소하여, 체액성 및 세포성 면역반응이 유도되었다.

(가) 체액성 면역반응 유도

면역 전과 3차 면역 후에 분리한 혈청을 이용하여 표면항원에 대한 항체생성 정도를 확인하였다. 음성대조군 (실험군1)에서는 혈액 내에 항원의 농도가 높게 유지됨에도 불구하고, 표면항원에 대한 항체는 전혀 나타나지 않았다. 백신항원이 투여된 경우 (실험군2, 실험군3), 표면항원에 대한 면역관용이 해소되어 표면항원에 대한 항체가 생성된 것을 확인할 수 있었다. BSA가 코팅된 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 사용된한 경우 (실험군3)에 알룸에 흡착한 백신항원만 면역한 경우 (실험군2)와 비교하였을 때 유도된 항체이 약간 낮았으나 큰 차이가 없었다 (도 8). 그러나 유도된 항체의 isotype을 결정하여 IgG2a와 IgG1간의 비 (ratio)를 비교한 결과 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 사용한 실험군3이 알룸만 사용한 실험군2에 비하여 더 높게 나타났다 (도9). 즉, 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 사용하면 면역반응이 Th1 쪽으로 유도됨을 알 수 있었다.

(나) 세포성 면역반응 유도

감염된 바이러스를 제거하기 위해서는 강한 세포성 면역반응이 필수적인 것으로 알려져 있다. 따라서 치료백신이 면역관용을 해소하고 표면항원에 특이적인 세포성 면역반응을 유도할 수 있는지 확인하기 위해서 면역 후 splenocyte를 분리하여 세포성 면역반응의 지표인 인터페론-g 생성을 ELISPOT법과 ELISA법으로 비교하였다. 정상마우스를 사용한 실시예5에서와 마찬가지로 유전자조작 마우스를 사용한 동물면역실험에서도 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 사용한 실험군3에서 높은 세포성 면역반응이 유도되었다 (도 10, 11).

2) 혈중 표면항원 (HBsAg)으로 이루어진 바이러스 유사입자의 감소

면역 전과 3차 면역 후에 혈청을 분리하여 혈액내 표면항원 (HBsAg)으로 이루어진 바이러스 유사입자의 양을 분석하였다. 이미 보고된 바와 같이 음성대조군에서는 혈액 내 바이러스 유사입자의 양이 약 40% 가량 자연적인 감소가 일어났다. 그러나 치료백신을 면역한 경우에는 바이러스 유사입자의 양이 급격히 감소하였다. 또한 알룸에 흡착한 백신항원만 면역한 경우 (실험군2)보다 콜로이드 금 결합체를 같이 면역한 경우 (실험군 3) 3차 면역 후 가장 낮은 바이러스 유사입자의 양이 관찰되었다 (도 12). 알룸에 흡착한 백신항원만을 면역한 경우 (실험군 2) 일시적인 항원의 감소를 나타내었으나 바이러스가 감염된 세포를 제거하기 위한 세포성 면역반응을 유도하지 못하므로 바이러스의 완전한 제거가 어려울 것으로 사료된다.

3) 간에서 세포성 면역반응에 의한 바이러스 유전자 발현의 감소

B형 간염바이러스가 감염된 간세포로부터 바이러스를 제거하기 위해서는 interferon-g를 분비하고 세포용해활성 (cytolytic activity)를 가진 면역세포들이 간으로 이동하여 바이러스 유전자의 전사를 억제하거나 감염된 세포를 직접 파괴하는 과정이 필요하다. 따라서 항원 특이적인 세포성 면역반응이 실제로 마우스의 간에서도 일어나는지 확인하기 위해 마우스의 간에서 전체 RNA를 추출하여 인터페론-g 유전자의 발현 정도를 RT-PCR법으로 분석하였다. 대조군 (실험군 1)과 실험군 2에서는 인터페론-g 유전자의 발현율이 낮게 나타났으나, 콜로이드 금 결합체를 사용한 실험군 3에서는 인터페론-g 유전자가 3~4배 가량 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 13). 또한 생성된 인터페론-g에 의해 간세포내의 바이러스 유전자, 즉 표면항원 유전자의 발현이 억제되는지 확인하기 위해 동일한 방법으로 표면항원 유전자의 발현을 비교하였다. 대조군 (실험군 1)과 알룸에 흡착된 항원만을 면역한 실험군 2에서는 표면항원 유전자의 발현이 높게 유지되었으나, 실험군 3에서는 표면항원 유전자의 발현이 억제된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 13).

본 발명의 치료백신은 B형 간염바이러스 항원에 대해 면역관용을 나타내는 개체에서 면역관용을 극복하고, 체액성 및 세포성 면역반응을 유도할 수 있었다. 특히 아쥬반트로서 사용된 콜로이드 금에 의해 유도된 강력한 세포성 면역반응에 의해 간세포에서 바이러스 유전자의 발현이 억제되고 혈액 내의 바이러스 유사입자가 제거된다는 것을 확인하였다. 따라서 콜로이드 금을 아쥬반트로 사용한 치료백신은 만성간염 환자에 투여 시 면역관용을 해소하여 항원 특이적인 면역반응을 유 도하고, 감염된 바이러스를 제거할 수 있는 효능이 있을 것으로 사료된다.

실시예 7. 형질전환 마우스를 이용한 시험백신의 효능 확인 (2)

7.1 면역실험 조건 및 분석방법

치료백신용 아쥬반트로 HBV 표면항원 단백질의 일부인 preS단백질로 코팅된 콜로이드 금 결합체를 사용하였다. 그 외에 실험동물, 면역그룹 및 분석방법 등은 실시예 6과 동일하게 실시하였다.

7.2 preS로 코팅된 콜로이드 금 결합체의 치료백신용 아쥬반트 효능확인

1) 면역관용의 해소

preS로 코팅된 콜로이드 금 결합체를 치료백신용 아쥬반트로 사용한 경우에도 BSA로 코팅된 콜로이드 금 결합체를 사용한 실시예 6에서와 같이 면역관용이 해소되었고, 체액성 및 세포성 면역반응이 유도되었다.

(가) 체액성 면역반응 유도

면역 전과 3차 면역 후에 분리한 혈청을 이용하여 표면항원에 대한 항체생성 정도를 확인하였다. 음성대조군 (실험군1)에서는 혈액 내에 항원의 농도가 높게 유지됨에도 불구하고, 표면항원에 대한 항체는 전혀 나타나지 않았다. 백신항원이 투여된 경우 (실험군2, 실험군3), 표면항원에 대한 면역관용이 해소되어 표면항원에 대한 항체가 생성된 것을 확인할 수 있었다. BSA가 코팅된 콜로이드 금 결합체 를 아쥬반트로 사용된한 경우 (실험군3)에 알룸에 흡착한 백신항원만 면역한 경우 (실험군2)와 비교하였을 때 유도된 항체이 약간 낮았으나 큰 차이가 없었다 (도 14). 그러나 유도된 항체의 isotype을 결정하여 IgG2a와 IgG1간의 비 (ratio)를 비교한 결과 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 사용한 실험군3이 알룸만 사용한 실험군2에 비하여 더 높게 나타났다 (도15). 즉, 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 사용하면 면역반응이 Th1 쪽으로 유도됨을 알 수 있었다.

(나) 세포성 면역반응 유도

감염된 바이러스를 제거하기 위해서는 강한 세포성 면역반응이 필수적인 것으로 알려져 있다. 따라서 치료백신이 면역관용을 해소하고 표면항원에 특이적인 세포성 면역반응을 유도할 수 있는지 확인하기 위해서 면역 후 splenocyte를 분리하여 세포성 면역반응의 지표인 인터페론-g 생성을 ELISPOT법과 ELISA법으로 비교하였다. 정상마우스를 사용한 실시예5에서와 마찬가지로 유전자조작 마우스를 사용한 동물면역실험에서도 콜로이드 금 결합체를 아쥬반트로 사용한 실험군3에서 높은 세포성 면역반응이 유도되었다 (도 16, 17).

면역 전과 3차 면역 후에 혈청을 분리하여 혈액내 표면항원 (HBsAg)으로 이루어진 바이러스 유사입자의 양을 분석하였다. 이미 보고된 바와 같이 음성대조군에서는 혈액 내 바이러스 유사입자의 양이 자연적인 감소가 일어났다. 그러나 치 료백신을 면역한 경우에는 바이러스 유사입자의 양이 급격히 감소하였다. 또한 알룸에 흡착한 백신항원만 면역한 경우 (실험군2)보다 콜로이드 금 결합체를 같이 면역한 경우 (실험군 3) 3차 면역 후 가장 낮은 바이러스 유사입자의 양이 관찰되었다 (도 18). 알룸에 흡착한 백신항원만을 면역한 경우 (실험군 2) 일시적인 항원의 감소를 나타내었으나 바이러스가 감염된 세포를 제거하기 위한 세포성 면역반응을 유도하지 못하므로 바이러스의 완전한 제거가 어려울 것으로 사료된다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 콜로이드 금은 항원과 함께 투여될 경우 강력한 세포성 면역을 유발하므로, 치료 백신의 아쥬반트로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> DOBEEL CO., LTD <120> Use of collidal gold as an adjuvant <130> PA9511-764/KR <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of HBsAg <400> 1 ggaagatctc aatctcggga a 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of HBsAg <400> 2 ggaagatctc gaatagaagg aaag 24 <210> 3 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> preS-S antigen <400> 3 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro 20 25 30 Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn 35 40 45 Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly 50 55 60 Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln 65 70 75 80 Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser 85 90 95 Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu 100 105 110 Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His 115 120 125 Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro 145 150 155 160 Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu 165 170 175 Ser Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly 180 185 190 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser 195 200 205 Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly 210 215 220 Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro 225 230 235 240 Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile 245 250 255 Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Tyr Leu Leu 260 265 270 Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser 275 280 285 Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly 290 295 300 Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn 305 310 315 320 Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu 325 330 335 Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro 340 345 350 Phe Val Gln Trp Phe Ala Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val 355 360 365 Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser 370 375 380 Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile 385 390 395 400 <210> 4 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preS-S antigen <400> 4 atgggaggtt ggtcttccaa acctcgacaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60 cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120 ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagtg 180 ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggcggtc ttttggggtg gagccctcag 240 gctcagggca tattgacaac agtgccagca gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300 tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg 360 cagtggaact ccaccacatt ccaccaagct ctgctagatc ccagagtgag gggcctatat 420 tttcctgctg gtggctccag ttccggaaca gtaaaccctg ttccgactac tgcctcaccc 480 atatcgtcaa tcttctcgag gactggggac cctgcaccga acatggagag cacaacatca 540 ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc 600 acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggagcaccc 660 acgtgtcctg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct 720 ccaatttgtc ctggctatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatatt cctcttcatc 780 ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact accaaggtat gttgcccgtt 840 tgtcctctac ttccaggaac atcaactacc agcacgggac catgcaagac ctgcacgatt 900 cctgctcaag gaacctctat gtttccctct tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaac 960 tgcacttgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcgcaa gattcctatg ggagtgggcc 1020 tcagtccgtt tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgcagggctt 1080 tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140 aacatcttga gtcccttttt acctctatta ccaattttct tctgtctttg ggtatacatt 1200 taa 1203 <210> 5 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core antigen <400> 5 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val 145 <210> 6 <211> 447 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Core antigen <400> 6 atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60 tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag 120 gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg 180 tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca 240 tccagggaat tagtagtcag ctatgtcaac gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta 300 ttgtggtttc acatttcctg tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg 360 tcttttggag tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggaaactac tgttgtt 447 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of HBcAg <400> 7 ccccatatgg acattgaccc gta 23 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of HBcAg <400> 8 cgcggatcca acaacagtag tttccgg 27 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S-specific forward primer <400> 9 atggagagca caacatcagg 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S-specific reverse primer <400> 10 ttaaatgtat accctaag 18 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INF-gamma-specific forward primer <400> 11 agcggctgac tgaactcaga ttgtag 26 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INF-gamma-specific reverse primer <400> 12 gtcacagttt tcagctgtat aggg 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin-specific forward primer <400> 13 tcctgtggca tccatgaaac 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin-specific reverse primer <400> 14 cttcgtgaac gccacgtgc 19

Claims

콜로이드 금을 포함하는 아쥬반트 조성물.
제1항에 있어서, 콜로이드 금이 단백질로 코팅된 콜로이드 금 결합체 형태인 아쥬반트 조성물.
제2항에 있어서, 콜로이드 금이 BSA 또는 항원 단백질로 코팅된 콜로이드 금 결합체 형태인 아쥬반트 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 세포성 면역을 증가시키는 것인 아쥬반트 조성물.
제1항에 있어서, 치료 백신용의 아쥬반트 조성물.
제1항에 있어서, 콜로이드 금의 직경이 5 내지 100nm인 아쥬반트 조성물.
제6항에 있어서, 콜로이드 금의 직경이 10 내지 40nm인 아쥬반트 조성물.
제1항의 조성물과 항원을 포함하는 백신 조성물.
제8항에 있어서, 콜로이드 금 이외의 아쥬반트 성분을 추가로 포함하는 백신 조성물.
제9항에 있어서, 알룸을 추가로 포함하는 백신 조성물.
제8항에 있어서, 상기 항원이 바이러스에서 기원한 항원인 백신 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물이 세포성 면역을 증가시키는 것인 백신 조성물.
제8항에 있어서, 치료용 백신 조성물.
콜로이드 금을 아쥬반트로 사용하여 항원에 의해 유도되는 세포성 면역을 증가시키는 방법.