CN1852919A - Zot和连蛋白受体的激动剂多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明鉴别一种受体蛋白的激动剂多肽。该激动剂可用于促进药物和抗原的吸收。适当的给药途径包括口服、鼻、经皮、以及静脉内。药物配方可以包含与该激动剂多肽结合的治疗剂或免疫原性制剂。
Description
本申请要求2003年7月15日提交的临时申请第60/487,889号的优先权，在此特别引入其公开内容。
技术领域
本发明涉及诊断、治疗、药学、药物发现及免疫治疗领域。具体来说，它涉及操作和使用Zot/连蛋白/受体体系来改善健康。
背景技术
肠紧密连接机能障碍(intestinal tight junction dysfunction)发生在包括食物过敏、肠胃传染、自身免疫性疾病和炎症性肠病的多种临床状态中(42)。健康、成熟的肠黏膜及其完整的紧密连接充当着大分子通过的主要屏障。在健康状态期间，少量的免疫活性抗原穿过肠宿主屏障。这些抗原通过至少两种途径穿过黏膜得以吸收。大多数吸收的蛋白(多达90％)经由跨细胞途径穿过肠屏障，随后进行将蛋白转化成更小的非免疫原性肽的溶酶体降解。这些残余的肽作为完整的蛋白通过细胞旁(paracellular)途径被转运；它涉及对细胞间紧密连接的微妙但是复杂的调节，其导致了抗原耐受性。当紧密连接体系的完整性被损害时，如由于早熟或者在暴露于辐射、化学治疗和/或毒素后，可能引发有害的对环境抗原的免疫反应(包括自身免疫性疾病和食物过敏)。本领域一直需要诊断和治疗这样的疾病和状况。本领域一直需要鉴别治疗这种疾病的新药。
几种微生物对上皮细胞施加了不可逆的致细胞病变效应，其影响了细胞骨架组构和紧密连接功能。这些细菌或者直接改变肠的通透性(即EPEC)，或者通过毒素的精制来改变肠的通透性(例如Clostridiumdifficile，Bacteroides fragilis)(43)。霍乱弧菌噬菌体CXTΦ ZOT蛋白模拟人类蛋白连蛋白，并利用紧密连接调节的生理学机制。Zot具有多个结构域，其使得蛋白具有作为霍乱弧菌噬菌体CTXΦ的形态发生噬菌体肽和作为调节肠紧密连接的肠毒素的双重功能。Zot作用由细胞内活动的串联介导，该细胞内活动的串联导致关键处定位以调节细胞旁途径的肌动蛋白微丝发生依赖PKCα的聚合(38)。毒素通过与肠细胞表面的相互作用施加它的影响。Zot结合在肠内变化，其在空肠和回肠末端是可检测的，并沿着绒毛状隐窝轴降低，而在结肠中是检测不到的(44)。这一结合分布符合Zot对肠通透性的区域性效应(44)，并符合成熟绒毛细胞中的Zot诱发的优先F-肌动蛋白的重分配(38)。
发明内容
本发明第一个实施方式是连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽。该激动剂多肽包含氨基酸序列FCIGRL(SEQ ID NO：4)。多肽的长度小于100个氨基酸残基。
本发明的第二个实施方式是治疗疾病的药物组合物。该组合物包含治疗疾病的治疗剂、以及连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽。激动剂多肽包含氨基酸序列FCIGRL(SEQID NO：4)。多肽的长度小于100个氨基酸残基。
本发明的第三个实施方式是向靶组织输送治疗剂的方法。将治疗疾病的治疗剂、和连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽施用给患有疾病的患者。激动剂多肽包含氨基酸序列FCIGRL(SEQ ID NO：4)。多肽的长度小于100个氨基酸残基。
本发明的第四个实施方式是向靶组织输送治疗剂的方法。将治疗疾病的治疗剂、和连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽通过患病患者的鼻腔给药。激动剂多肽包含氨基酸序列FCIGRL(SEQ ID NO：4)。多肽的长度小于100个氨基酸残基。
本发明的第五个实施方式是向靶组织输送治疗剂的方法。将治疗疾病的治疗剂、和连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽通过患病患者的口腔给药。激动剂多肽包含氨基酸序列FCIGRL(SEQ ID NO：4)。多肽的长度小于100个氨基酸残基。
本发明的第六个实施方式是向靶组织输送治疗剂的方法。将治疗疾病的治疗剂、和连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽通过患病患者的皮肤给药。激动剂多肽包含氨基酸序列FCIGRL(SEQ ID NO：4)。多肽的长度小于100个氨基酸残基。
本发明的第七个实施方式是向靶组织输送治疗剂的方法。将治疗疾病的治疗剂、和连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽通过患病患者的血液给药。激动剂多肽包含氨基酸序列FCIGRL(SEQ ID NO：4)。多肽的长度小于100个氨基酸残基。
本发明的第八个实施方式是鉴别或提纯连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ Zot的人类受体的方法。在适于抗体抗原结合的条件下，使包含一种或多种蛋白的样本与抗体接触。培养针对如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸SLIGKVDGTSHVTG的抗体。除去样本中未与抗体结合的蛋白。将结合在抗体上的蛋白鉴别为连蛋白和Zot的人类受体，或者鉴别为形成富含所述受体的制剂。
本发明的第九个实施方式是筛选治疗疾病的药物候选物的方法。使抗体SAM11所识别的第一种人类蛋白与选自霍乱弧菌噬菌体CTXΦZot、人类连蛋白和MyD88的第二种蛋白相接触。在存在和不存在测试物质的情况下分别进行接触。将第一种蛋白在测试物质的存在下结合到第二种蛋白上的量，与不存在测试物质的情况下的结合量进行比较。如果测试物质降低了第一种蛋白在第二种蛋白上结合的量，则将该测试物质鉴别为药物候选物。
本发明的第十个实施方式是诱发免疫反应的疫苗组合物。该疫苗包含诱发免疫反应的免疫原性制剂、和连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂。激动剂多肽包含氨基酸序列FCIGRL(SEQ ID NO：4)。多肽的长度小于100个氨基酸残基。
本发明的第十一个实施方式是诊断患者体内自身免疫性疾病的方法。使来自患者的第一份人体样本与针对如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸SLIGKVDGTSHVTG培养的抗体相接触。将第一份人体样本所结合的抗体的量，与不患有自身免疫性疾病的健康对照的第二份人体样本所结合的量进行比较。如果第一份人体样本比第二份样本结合更多的抗体，则鉴别出患者的自身免疫性疾病。
本发明的第十二的实施方式是用相对于对照的健康个体增加的连蛋白表达来治疗患者的方法。用针对如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸SLIGKVDGTSHVTG培养的抗体为患者给药。由此减轻疾病的症状。
本发明的第十三个实施方式是针对如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸SLIGKVDGTSHVTG培养的抗体。该抗体与CaCo2细胞中表达的蛋白结合，该蛋白与合成抑制剂肽FZ1/0(如SEQ ID NO：3中所示)所结合的蛋白共同定位。该抗体不与表达重组人类PAR-2的人类或大鼠细胞结合。该抗体不是SAM11。
本发明的第十四个实施方式是与CaCo2细胞中表达的蛋白结合的抗体，该蛋白与合成抑制剂肽FZ1/0(如SEQ ID NO：3中所示)所结合的蛋白共同定位。该抗体不与表达重组人类PAR-2的人类或大鼠细胞结合。该抗体不是SAM11。
本发明的第十五个实施方式是连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽。该促效剂多肽含有选自Xaa1 CysIle Gly Arg Leu(SEQ ID NO：7)、Phe Xaa2 Ile Gly Arg Leu(SEQ ID NO：8)、Phe Cys Xaa3 Gly Arg Leu(SEQ ID NO：9)、Phe Cys Ile Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：10)、Phe Cys Ile Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：11)和Phe Cys Ile Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：12)的序列。多肽的长度小于100个氨基酸残基。Xaa1选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Tyr和Met；Xaa2选自Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn和Gln；Xaa3选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met；Xaa4选自Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Ala和Gln；Xaa5选自Lys和His；Xaa6选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met。
本发明的第十六个实施方式是连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽。该促效剂多肽含有选自Xaa1 Xaa2Ile Gly Arg Leu(SEQ ID NO：13)、Xaa1 Cys Xaa3 Gly Arg Leu(SEQ IDNO：14)、Xaa1 Cys Ile Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：15)、Xaa1 Cys Ile GlyXaa5 Leu(SEQ ID NO：16)、Xaa1 Cys Ile Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：17)、Phe Xaa2 Xaa3 Gly Arg Leu(SEQ ID NO：18)、Phe Xaa2 Ile Xaa4 ArgLeu(SEQ ID NO：19)、Phe Xaa2 Ile Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：20)、Phe Xaa2 Ile Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：21)、Phe Cys Xaa3 Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：22)、Phe Cys Xaa3 Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：23)、Phe Cys Xaa3 Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：24)、Phe Cys Ile Xaa4 Xaa5 Leu(SEQ ID NO：25)、Phe Cys 1le Xaa4 Arg Xaa6(SEQ ID NO：26)和Phe Cys Ile Gly Xaa5 Xaa6(SEQ ID NO：27)的序列。多肽的长度小于100个氨基酸残基。Xaa1选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Tyr和Met；Xaa2选自Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn和Gln；Xaa3选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met；Xaa4选自Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Ala和Gln；Xaa5选自Lys和His；Xaa6选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met。
经阅读本说明书，这些及其它实施方式对于本领域的技术人员将是显而易见的，它为本领域提供了治疗疾病、诊断疾病和发现药物的药剂和方法。
附图说明
图1A和1B.自肠组织溶解产物得到的六个HPLC组分的Comassie(图1A)和蛋白质免疫印迹(图1B)。连蛋白-阳性组分F5显示了其它五个组分中不存在的～23kDa。
图2A和2B.暴露于荧光标记的FZI/0(图2A)或FZI/1(图2B)的大鼠小肠的原位免疫荧光显微术。注意绒毛的上三之一处的荧光分布，最初对其中的Zot/连蛋白受体进行了描述(参见参考文献44)。
图3A-3C.PAR-2-FZI/0的共同定位。用FITC-FZI/0(图3A)或小鼠抗-人PAR2单克隆抗体(图3B)对Caco 2细胞进行免疫印迹。两个图像的重叠(图3C)显示了PAR-2和FZI/0免疫荧光微粒的共同定位。
图4A-4D.FZI/0-PAR-2AP竞争性结合实验。与暴露于培养基对照的细胞(图4A)相比，暴露于FITC-标记的FZI/0的Caco2细胞(图4B)显示出数目众多的荧光微粒。过量的PAR2-AP(100x)置换了FZI/0(图4C)，而100x的合成的肽则不会(图4D)。
图5A-5D.暴露于PAR2-AP(图5A)、BSA(图5B)、PAR2-AP+FZI/0(图5C)或PAR-2AP+FZI/1(图5D)的Caco2细胞中的肌动蛋白细胞骨架排列。
图6A-6B.MCP-II(图6A)和PAR-2AP(图6B)对小鼠肠TEER的影响。与对照组织(◇)相比，MCP-II(○)和PAR-2AP(△)二者均诱发了TEER的显著下降。这些变化与ΔG-诱发的变化(■)是可比较的，并且通过用FZI/0预温育完全防止了这些变化(x)。
图7A-7B.PAR-2AP对野生型(图7A)和MyD88KO(图7B)小鼠体内肠TEER的影响。在野生型小鼠体内，与对照组织(◇)相比，PAR-2 AP(Δ)和ΔG(■)二者均诱发了TEER的显著下降，通过用FZI/0预温育则完全防止了这种下降(x)。在任何处理条件下均未观察到MyD88 KO小鼠体内的TEER变化。
图8.提出的受体被Zot和连蛋白的激活。作为MCP-II类似物，连蛋白通过切割其N-端来激活受体，而Zot通过其PAR-2AP-同源的N-端基序直接结合并激活受体。PAR-2被MCP-II和PAR-2AP激活，或者连蛋白受体被连蛋白和ΔG激活，被竞争性结合抑制剂FZI/0所阻断。
具体实施方式
发明人开发了一种连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽。该激动剂多肽包含氨基酸序列FCIGRL(SEQ IDNO：4)。该多肽小于100个氨基酸残基，或者小于50、40、30、20、10或8个氨基酸残基。该多肽可以仅含6个氨基酸FCIGRL(SEQ IDNO：4)，或者它可以含有另外的氨基酸。其它的氨基酸可以提供其它的功能，例如利于提纯抗原标记。
该激动剂多肽可以用于促进治疗剂或免疫原性制剂的吸收。该激动剂多肽促进了穿过肠、血-脑屏障、皮肤和鼻黏膜的吸收。因此可以将该激动剂多肽与靶向肠、脑、皮肤和鼻的治疗剂或免疫原性制剂配制或者共同给药。根据本发明的药物组合物不需要在给药之前预先混合，而是能够在将两种制剂彼此给药的24小时之内在体内形成。优选将两种制剂彼此在12、8、4、2或1小时之内给药。
根据本发明的治疗剂是可以用于治疗人类或其它哺乳动物的任何治疗剂。举例来说，治疗剂可以是抗体或抗体片段(例如Fab、F(ab’)2、单链抗体(ScFv))、抗癌药物、抗生素、激素或者细胞因子。治疗剂可以是作用于身体任何器官的治疗剂，如心脏、脑、肠或者肾脏。根据本发明可以治疗的疾病包括但不限于食物过敏、肠胃传染、自身免疫性疾病、炎症性肠病、乳糜泻、胃肠炎症。
输送至脑的静脉内剂量组合物在本领域中是公知的。这样的静脉内剂量组合物主要包括生理稀释剂，例如蒸馏水或者0.9％(w/v)的NaCl。
“鼻”输送组合物与“肠”输送组合物的不同之处在于后者必须具有胃抵抗性质以防止活性物质(例如连蛋白受体激动剂和治疗剂)在胃中发生酸降解，而前者主要包含直径为大约50μm的水溶性聚合物，以降低黏液纤毛清除功能并达到经鼻腔给药的制剂可重复的生物利用率。“静脉内”输送组合物与“鼻”和“肠”输送组合物二者的不同之处在于“静脉内”输送组合物不需要胃抵抗性或水溶性聚合物。
给药的方式对于本发明并不关键。给药的方式可以是口服用于肠输送；鼻内用于鼻输送；和静脉内用于通过血脑屏障输送。也可使用其它本领域已知的给药方式，包括但不限于鞘内、肌肉内、支气管内、直肠内、眼内和阴道内给药。
用于小肠输送的口服剂量组合物在本领域中是公知的。这样的口服剂量组合物可以包括胃抵抗性药片或胶囊(Remington’sPharmaceutical Sciences，16th Ed.，Eds.Osol，Mack Publishing Co.，Chapter 89(1980)；Digenis等人，J.Pharm.Sci.，83：915-921(1994)；Vantini等人，Clinica Terapeutica，145：445-451(1993)；Yoshitomi等人，Chem.Pharm.Bull.，40：1902-1905(1992)；Thoma等人，Pharmazie，46：331-336(1991)；Morishita等人，Drug Design and Delivery，7：309-319(1991)；和Lin等人，Pharmaceutical Res.，8：919-924(1991)；在此引入各自的全部内容作为参考)。
可以通过加入诸如邻苯二甲酸醋酸纤维素或对苯二甲酸醋酸纤维素使药片具有胃抵抗性。
胶囊是将生物活性成分(或多种生物活性成分)包封在硬性或软性的可溶性外皮或明胶壳中的固体剂型。通过水解可以从胶原材料中得到用于胶囊制造的明胶。明胶有两种类型。通过酸处理从猪皮得到的类型A和通过碱处理从骨骼和动物皮得到的类型B。硬性明胶胶囊的使用使得人们可以选择被视为对个体受试者最佳精确剂量水平的单个生物活性成分或其组合。硬性明胶胶囊典型地由两部分组成，其一套接另一部分，从而将生物活性成分完全包围。通过向胶囊的较长一端中引入生物活性成分或者含有生物活性成分的胃抵抗性小珠，然后套上帽来填充这些胶囊。硬性明胶胶囊主要从明胶、FD&C着色剂制成，有时从例如二氧化钛的遮光剂制成。USP允许该用途的胶囊含有0.15％(w/v)的二氧化硫，以防止制造过程中的分解。
用于小肠输送的口服剂量组合物还包括可以任选地含有水相缓冲剂的液体组合物，所述的水相缓冲剂防止治疗剂和激动剂多肽由于胃中的胃液而严重失活，从而使得生物活性成分和激动剂多肽以活性形式抵达小肠。可以用于本发明的这种水相缓冲剂的例子包括碳酸氢盐缓冲液(pH5.5至8.7，优选大约pH7.4)。
当口服剂量组合物是液体组合物时，优选恰好在给药之前制备组合物，以使稳定性问题最小化。在这种情况下，可以通过将冻干的治疗剂和激动剂多肽溶于水相缓冲剂中来制备液体组合物。
用于鼻输送的鼻剂量组合物在本领域中是公知的。这种鼻剂量组合物通常包含已经广泛用于制备药物剂型的水溶性聚合物(Martin等人，In：Physical Chemical Principles of Pharmaceutical Sciences，3rd Ed.，第592-638页(1983))，所述的药物剂型可以用作鼻给药的肽的载体(Davis，In：Delivery Systems for Peptide Drugs，125：1-21(1986))。已经显示嵌入到聚合物基质中的肽的鼻吸收，通过鼻粘液纤毛清除功能的延滞而得以促进(Illum等人，Int.J.Pharm.，46：261-265(1988))。其它可能的促进机制包括浓度梯度增加或者肽吸收的扩散途径减少(Ting等人，Pharm.Res.，9：1330-1335(1992))。但是，已经预示降低粘液纤毛清除率是实现鼻给药体系药物的可重复生物利用率的良好方法(Gonda等人，Pharm.Res.，7：69-75(1990))。预计直径大约50μm的微粒沉积在鼻腔中(Bjork等人，Int.J.Pharm.，62：187-192(1990)；和Illum等人，Int.J.Pharm.，39：189-199(1987))，而直径小于10μm的微粒能够从鼻过滤体系中逃逸并沉积在下气道中。直径大于200μm的微粒将不会在鼻给药之后保留在鼻中(Lewis等人，Proc.Int.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.，17：280-290(1990))。
具体采用的水溶性聚合物对于本发明并不关键，可以选自任何公知的用于鼻剂型的水溶性聚合物。可用于鼻输送的水溶性聚合物的典型例子是聚乙烯醇(PVA)。该物质是可膨胀的亲水聚合物，它的物理性质取决于分子量、水解程度、交联密度和结晶度(Peppas等人，In：Hydrogels in Medicine and Pharmacy，3：109-131(1987))。PVC可以通过相分离、喷雾干燥、喷雾嵌入和喷雾-densation用于分散材料的涂覆(Ting等人，同上)。
本发明的“皮肤”输送组合物除了治疗剂或免疫原性制剂以外，可以包括香料、膏状物、软膏、染色剂和其它化合物，只要添加的成分不会对治疗剂或免疫原性制剂的经皮肤传递产生有害影响。还可以添加传统的药物可接受的乳化剂、表面活性剂、悬浮剂、抗氧化剂、渗透促进剂、膨胀剂、稀释剂和防腐剂。水溶性聚合物也可以用作载体。
具体采用的治疗剂或免疫原性试剂对本发明并不关键，其可以是例如任何药物化合物、生物活性肽、疫苗或者否则不论其大小或电荷，不会通过跨细胞途径吸收的其它部分。
本发明可以采用的药物化合物的例子包括作用于心血管系统的药物、作用于中枢神经系统的药物、抗肿瘤药物和抗生素。本发明可以采用的作用于心血管系统的药物的例子包括利多卡因、腺苷、多巴酚丁胺、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和酚妥拉明。也可以使用其它本领域公知的药物。
本发明可以采用的作用于中枢神经系统的药物的例子包括吗啉吡咯酮、阿尔芬太尼、氨甲苯环葵醇、环丁甲羟基吗啡、叔丁啡、烯丙羟吗啡酮、酮咯酸、咪达唑仑、普罗泼非、metacurine、醚洼科龙和琥珀酰碱。也可以使用其它本领域公知的药物。
本发明可以采用的抗肿瘤药物的例子包括阿糖胞苷、丝裂霉素、阿霉素、长春新碱和长春花碱。也可以使用其它本领域公知的药物。
本发明可以采用的抗生素的例子包括甲氧苯青霉素、美洛西林、哔哌青霉素、cetoxitin、头孢尼西、头孢美唑和氮噻酸单胺菌素。也可以使用其它本领域公知的药物。
本发明可以采用的生物活性肽的例子包括激素、淋巴因子、球蛋白、白蛋白。本发明可以采用的激素的例子包括睾酮、nandrolene、促卵泡激素、胰岛素和urofolltropin。也可以使用其它本领域公知的生物活性肽。当生物活性肽是胰岛素时，本发明的口服剂量组合物可用于糖尿病的治疗。本发明可以采用的淋巴因子的例子包括α干扰素、β干扰素、γ干扰素、白细胞介素1、白细胞介素2、白细胞介素4和白细胞介素8。
本发明可以采用的球蛋白的例子包括α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白(免疫球蛋白)。本发明可以采用的免疫球蛋白的例子包括多价IgG或特定的IgG、IgA和IgM，例如抗破伤风抗体。本发明可以采用的白蛋白的例子是人血清白蛋白。也可以使用本领域公知的其它球蛋白和白蛋白。
本发明可以采用的疫苗的例子包括肽抗原和减毒微生物和病毒。本发明可以采用的肽抗原的例子包括肠产毒性大肠杆菌的热不稳定肠毒素的B亚单位、霍乱毒素的B亚单位、肠道病原体的荚膜抗原、肠道病原体的菌毛或伞毛、HIV表面抗原、尘过敏原、和蜱螨过敏原。也可以使用本领域公知的其它疫苗。
本发明可以采用的减毒微生物和病毒的例子包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、霍乱弧菌、弗氏志贺菌、伤寒沙门氏菌和轮状病毒的减毒微生物和病毒(Fasano等人，In：Le Vaccinazioni inPediatria，Eds.Vierucci等人，CSH，Milan，第109-121页(1991)；Guandalini等人，In：Management of Digestive and Liver Disorders inInfants and Children，Elsevior，Eds.Butz等人，Amsterdam，第25章(1993)；Levine等人，Sem.Ped.Infect.Dis.，5：243-250(1994)；和Kaper等人，Clin.Micrbiol.Rev.，8：48-86(1995)，在此引入各自的全部内容作为参考)。
治疗剂或免疫原性制剂的用量对本发明并不关键，其取决于所选的具体成分、被治疗的疾病或症状以及被治疗的受试者的年龄、体重和性别而变化。
ZOT受体激动剂多肽的用量对于本发明也并不关键，其取决于被治疗的受试者的年龄、体重和性别而变化。通常，本发明采用的促进生物活性成分被肠吸收的ZOT受体激动剂多肽的最终浓度在大约10-5M至10-10M的范围之内，优选大约10-5M至5.0×10-5M。为了达到这样的最终肠内浓度，本发明单次口服剂量组合物中ZOT受体激动剂多肽的量通常为大约4.0ng至1000ng，优选大约40ng至80ng。
所用治疗剂或免疫原性制剂与ZOT受体激动剂多肽的比例对于本发明并不关键，其取决于选定的时间期间内被输送的生物活性成分的量而变化。通常，本发明采用的治疗剂或免疫原性制剂与ZOT受体激动剂多肽的重量比在大约1∶10至3∶1的范围之内，优选大约1∶5至2∶1。
可以诊断性、治疗性地、并且作为研究工具来使用与针对氨基酸SLIGKVDGTSHVTG(SEQ ID NO：5)培养的抗体所识别的蛋白结合的抗体。SAM11是一种这样的抗体，它自Zymed Laboratories，South SanFrancisco，California得到。使用培养单克隆或多克隆抗体的标准技术可以容易地制得其它这样的抗体。使用SAM11抗体或者其它与相同人类蛋白结合的抗体可以检测出疾病中连蛋白受体的增量调节。可以将抗体与诊断性可检测的标记结合。对于治疗用途，可以将抗体与包括放射性核素、抗肿瘤制剂等的治疗剂或毒性剂结合。
连蛋白和Zot受体蛋白的结合配偶体的识别使人们可以对干扰结合的测试物质进行化验。目前识别的结合配偶体包括MyD88、连蛋白、Zot和ΔG。可以使用两种蛋白的结合的任何化验。这些化验可以是体外或体内化验。化验可以采用抗体或固相结合底物。可以使用任何本领域公知的这样的化验。
具有SEQ ID NO：4序列的激动剂多肽中可以进行将一个氨基酸换成具有类似性质的另一氨基酸的保守替换。保守替换的例子包括但不限于GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln、和PheTrpTyr。保守性氨基酸替换典型地落入大约1至2个氨基酸残基的范围之内。使用本领域公知的计算机程序，例如DNASTAR软件，或者在Dayhoff等人(1978)的Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中可以找到指导，确定哪些氨基酸残基可以被替换而不丧失生物或免疫活性。
氨基酸替换定义为一对一的氨基酸置换。当替换的氨基酸具有相似的结构和/或化学性质时，它们在本质上是保守性的。保守替换的例子为用异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸、或者用丝氨酸替代苏氨酸。
尤其优选的寡肽类似物包括本质上为保守性的替换物，即那些发生在其侧链有关联的氨基酸种类之内的替换。具体来说，通常将氨基酸划分为以下几类：(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；不带电极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；和(5)芳香性氨基酸-苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，可以合理地预测亮氨酸与异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸与谷氨酸、苏氨酸与丝氨酸的单独置换，或者氨基酸与结构相关氨基酸的相似的保守置换，不会对生物活性产生主要影响。
可以使用任何本领域公知的检测来测定ZOT受体激动剂的生物活性。例如，检测可以涉及(1)如Fasano等人在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，8：5242-5246(1991)中所述，检测装在Ussing室中的回肠组织抗性(Rt)的降低；(2)如下文所述，检测Ussing室中肠上皮细胞单层组织抗性(Rt)的降低；或(3)如WO 96/37196；1995年5月24日提交的美国专利申请第08/443,864号；1996年2月9日提交的美国专利申请第08/598,852号；和1997年1月9日提交的美国专利申请第08/781,057号中所述，检测治疗剂或免疫原性制剂肠或鼻吸收的增加。
ZOT受体激动剂将会以可逆并且可重复的方式迅速打开紧密连接，因此可以将其以与ZOT用作肠或鼻吸收促进剂相同的方式用作治疗剂或免疫原性制剂的肠或鼻吸收促进剂，如WO 96/37196；1995年5月24日提交的美国专利申请第08/443,864号；1996年2月9日提交的美国专利申请第08/598,852号；和1997年1月9日提交的美国专利申请第08/781,057号中所述。
Zot/连蛋白受体的抗体可以用作治疗使增加的肠通透性升高的胃肠炎症的抗炎剂。因此，本发明的抗体可以用于治疗例如导致失蛋白性肠病的肠症状。失蛋白性肠病可能由于以下原因产生：感染，例如艰难梭状芽孢杆菌感染、小肠结肠炎、志贺菌病、病毒性胃肠炎、寄生物侵染、细菌生长过度、惠普耳氏病；伴有黏膜糜烂或溃疡的疾病，例如胃炎、胃癌、胶原性结肠炎、炎症性肠病；以淋巴管梗阻为标志的疾病，例如先天性肠淋巴管扩张、肉样瘤病-淋巴瘤、肠系膜结核、和用丰塔纳氏手术对先天性心脏病进行外科矫正之后；无溃疡的黏膜病，例如梅内特里埃氏病、乳糜泻、嗜酸性胃肠炎；和免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮或食物过敏，主要为对牛奶过敏(同样参见Pediatric Gastrointestinal Disease Pathophysiology DiagnosisManagement，Eds.Wyllie等人，Saunders Co.(1993)，第536-543页中的表40-2；在此引入其全部内容作为参考)。可以用该抗体为患有癌症、自身免疫性疾病、血管病、细菌感染、乳糜泻、哮喘和过敏性肠综合症的患者给药。
上文的公开内容主要描述了本发明。特别引入本文公开的所有参考文献作为参考。参考以下的具体实施例可以更全面地理解本发明，在此提供实施例仅仅是为了说明用途，而并非要对本发明的范围进行限定。
实施例1
通过结合凝胶过滤色谱和连蛋白ELISA对大鼠的小肠组织进行分析。将大鼠小肠匀浆装入聚丙烯酰胺葡聚糖柱(长度90cm，直径2.6em，用标准分子量标记物校准)，收集各组分并通过连蛋白ELISA对其进行分析，测定连蛋白浓度。在测试的6个组分(F1-F6)中，F5含有最高的连蛋白浓度。将各个组分通过SDS-PAGE分辨，转移，并用连蛋白-免疫反应性的抗Zot抗体进行免疫印迹(图1B)。蛋白质印迹分析显示连蛋白-阳性组分F5中有两条以24,000和23,000的近似表观Mr迁移的主要条带，而连蛋白-阴性组分F1-4、6显示各自仅有一条免疫反应性条带(～24kDa)。因此，将来自F5的～23kDa条带(见图1B箭头)从Comassie蓝染色的凝胶上切除，并进行基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱分析。使用Profound搜索引擎进行蛋白匹配搜索(域名129.85.19.192，目录profound_bin；程序WebProFound.exe？FORM＝1)，显示该蛋白(估计Z得分1.58)与大鼠肥大细胞蛋白酶II具有高度的相似性1。肥大细胞蛋白酶是肥大细胞颗粒体中含有的具有胰蛋白酶样(类胰蛋白酶)和胰凝乳蛋白酶样(类胰凝乳蛋白酶)性质的丝氨酸蛋白酶。黏膜肥大细胞(MMC)主要含有蛋白酶II(MCP-II)，而结缔组织肥大细胞主要含有蛋白酶I(46)。MCP-II尤其大量存在于肺部和胃肠(47)黏膜。在胃肠道中，MCP-II得到较好表征的生物活性之一是线虫侵染后对黏膜上皮通透性的调节(48)。体外研究显示，MCP-II通过干扰紧密结合复合体来打开上皮屏障。因此，我们提出的连蛋白体系假定模型与MCP-II已确立的功能是非常相容的。但是，我们检测到连蛋白和MCP-II之间的主要差异，包括它们的来源(连蛋白存在于肠细胞(49)和巨噬细胞中)和释放它们的刺激物(MCP-II为肠内寄生虫侵染[48]，连蛋白为细菌和麦醇溶蛋白[49])。
我们在生殖细胞、RBC’s和黏膜肥大细胞中具有多效性缺陷，并因此缺乏MCP-II的WBB6/F1-W/Wv小鼠中进行了microsnapwell实验(55)。安装在microsnapwell系统中并在递增的时间间隔(直至3小时)下暴露于释放连蛋白的刺激物的组织，显示出TEER的降低(-170±15.8Omhs/cm2对未处理的组织的-43±11)，以及平行的连蛋白释放的增加(10.0±0.8ng/mg蛋白对未处理的组织中的0.2±0.7)，这一结果与野生型动物中所观察到的相似(分别为-120±20和15.1±3.1)。
总之，我们的数据显示连蛋白与MCP-II不同，它可以代表PAR-2或者PAR-2变体的几种生理激活剂之一。胰腺胰蛋白酶是最有效的PAR-2激活剂，但是胰腺胰蛋白酶的有效性与PAR-2的分布之间存在差异(47)。生物活性的胰蛋白酶存在于小肠内腔中，在此它可以在肠细胞的顶膜处激活PAR-2(47)，但是在许多组织中也可以找到PAR-2，在其中它必须被一种迄今鉴别的生理激活剂激活(50)。连蛋白代表了这样的PAR-2激活剂的一种有力候选物，由于已经从肠内和肠外组织中将其分离出来，它可以调和这一明显差异(51)。
实施例2
之前我们已经阐述了Zot与家兔肠上皮细胞表面结合，并且这一结合沿着肠的不同区域而改变(44)。该结合分布与Zot对肠通透性的区域效应相一致，并与绒毛的成熟细胞中由Zot诱导的优先F-肌动蛋白的再分布相一致(38，44)。为了进一步对Zot受体进行表征，我们进行了下列实验。
A.结合实验
以若干上皮细胞系进行结合实验，包括IEC6(大鼠，肠)、CaCo2(人类，类绒毛状肠细胞)、T84(人类，类隐窝肠细胞)、MDCK(犬，肾脏)、和牛肺动脉(BPA)上皮细胞。为了进行免疫荧光分析，将载玻片上融合的单细胞层(2.0×105)在4℃或37℃下与5×10-9M Zot或者负对照一起以递增的时间间隔(5分钟，30分钟，60分钟)培养。单细胞层在37℃下与Zot(0.2μM)培养15分钟后，将细胞用冷的PBS洗涤10次，悬浮并溶解。将细胞溶解产物通过SDS-PAGE分辨，转移至PVDF膜，并用抗-Zot抗体探测。为了确立Zot结合的特异性，使用放射性同位素标记的Zot。在存在或不存在摩尔过量10倍或50倍的冷的未标记Zot的情况下进行这些实验。与暴露于负对照的细胞相比，当与Zot蛋白培养递增的时间间隔时，CaCo2和IEC6肠上皮细胞及内皮细胞显示了细胞表面上的结合。与此相反，在与His-Zot培养直至60分钟之后，T84或MDCK细胞上没有观察到染色。免疫印迹分析证实了Zot结合的细胞特异性。Zot与IEC6、CaCo2和BPA结合，但是不与T84和MDCK细胞结合。
B.Zot-结合蛋白的提纯
在室温下将1.0mg提纯的His-Zot在预活化的硅胶(Aminolink，Pierce)上固定化过夜，制备His-Zot亲和柱。将柱子用PBS洗涤，然后在其中装入使用106个IEC6细胞或CaCo2细胞得到的粗细胞溶解产物。在室温下培养90分钟后，将柱子用14ml PBS洗涤5次，用4.0ml 50mM的甘氨酸(pH 2.5)、150mM NaCl和0.1％(v/v)的TritonX-100将结合在His-Zot上的蛋白从柱子上洗脱。立刻用1.0N NaOH中和1.0ml洗脱组分的pH。将收集的组分在还原条件下进行6.0-15.0％(w/v)的梯度SDS-PAGE分析。将分开的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，使用Perkin-Elmer Applied Biosystems Apparatus Model 494进行NH2-端微量测序。自IEC6和CaCo2细胞得到的洗脱组分中均含有表观Mr为66kDa的单一蛋白质条带，如通过SDS-PAGE在还原条件下所观察到的。用神经氨酸酶处理将假定的Zot受体的大小降至35kDa，表明这一受体被唾液酸化(sialylated)(51)。
C.Zot/连蛋白受体的表征
我们最近的数据表明连蛋白在结构上与肥大细胞蛋白酶(MCP)-II相似，这一数据引导我们假设，Zot/连蛋白受体可能与MCP-II蛋白酶激活的受体(PAR-2)相似，如果不是相同的话。PAR-2有几点特征与我们对Zot/连蛋白受体描述过的特征是共同的。具体地说，成熟的PAR-2是68-80kDa的糖蛋白，其通过去糖基化被降低至36-40kDa(47)。类似地，Zot/连蛋白受体的分子量为66kDa，其通过去糖基化被降至35kDa(51)。PAR-2在肠胃道内的分布(47)与Zot/连蛋白受体在肠中的分布(44)相一致。PAR-2的细胞内信号传导涉及磷脂酶C(PLC)、蛋白激酶C(PKC)的激活(52)和导致细胞骨架重组的肌动蛋白聚合(53)。Zot和连蛋白通过共同的肠表面受体激活了这些相同的细胞内信号传导途径(38)。与Zot/连蛋白在肠中的效果类似，肠PAR-2的激活导致了肠通透性增加(54)。最后，PAR-2通过它的细胞外结构域被胰蛋白酶切割而激活，产生起“束缚配体”作用的新的N-端。外源加入肽SLIGRL(PAR-2AP)也不依赖于受体切割而激活了PAR-2(52)，该肽对应于蛋白水解激活的、新生成的N-端。12kDa的、生物活性的Zot片段(ΔG)的N-端含有在宿主肠道中被霍乱弧菌蛋白水解切割的Zot细胞外结构域(氨基酸残基288-399)。ΔG的N-端含有在结构上与PAR-2激动剂的配体基序相似的肽(FCIGRL氨基酸288-293)。为了更精确地定义靶受体结合和激活的结构要求，通过使假定的PAR-2结合基序(ΔG291)或者刚好该配体基序的下游区(ΔG298)发生变异，合成两种ΔG突变体。对这些肽与ΔG进行了与IEC-6细胞结合能力的比较，以及它们对安装在Ussing室中的大鼠小肠的生物活性的比较。同与ΔG培养的细胞相比，与ΔG291(G291V)培养的IEC6细胞显示出与IEC6细胞的结合降低，而与ΔG298肽(G298V)培养的细胞上则观察不到结合。Ussing室中的生物检验显示，ΔG291对tj分解(tj disassembly)具有残余的但是在统计学上不显著的影响，而ΔG298则不能引起任何可检测的通透效应。这些结果与结合检验中用这两种突变体得到的效应相应，并且表明291位上的G残基，更重要的是298位上的G残基可能通过蛋白构象的改变，在其靶受体的ΔG结合和激活中发挥着至关重要的作用。目前，在生理和病理环境下研究PAR-2功能的主要限制之一是缺乏特异性的PAR-2抑制剂(52)。基于我们的结构-功能分析，我们设计了一种合成八肽(对应于Zot氨基酸残基291-298)，其包含2个我们作为突变发生的目标的G残基，但是缺少假定配体基序的前3个氨基酸残基(288-290)。对该合成肽FZI/0在安装在Ussing室中的回肠组织上单独进行测试，或者与Zot、ΔG或连蛋白结合起来进行测试。暴露于FZI/0或合成八肽(FZI/1)的组织Rt中均没有观察到变化。在研究之前或者贯穿研究期间，用FZI/0对回肠组织进行处理防止了响应于Zot、ΔG和连蛋白的Rt变化，而这3种蛋白的通透效应则不受FZI/1预处理的影响。这些数据加强了我们关于Zot和连蛋白靶向相同受体的假设，并且表明FZI/0可能是通过结合在该受体上，而不是将其激活来施加它的抑制效应。为了检验最后这一假设，我们使用与荧光标记的FZI/0或FZI/1培养的大鼠小肠进行了原位结合实验。暴露于FZI/0的组织显示出大量的荧光颗粒，而与FZI/1培养的组织中则检测不到信号。
实施例3
Zot/连蛋白合成抑制剂FZI/0与PAR-2结合。为了确立FZI/0是否与PAR-2相结合，在CaCo2细胞单层中进行了双重标记、共同定位的免疫荧光显微术。简言之，将细胞与FITC-FZI/0或者与小鼠单克隆抗人类PAR-2抗体以递增的时间间隔培养，然后与罗丹明-标记的抗小鼠IgG抗体培养。然后将细胞用PBS洗涤3次，在室温下于PBS(pH 7.4)中的3.7％低聚甲醛中固定15分钟，在pH 8.0下将盖玻片用甘油-PBS(1∶1)安装，并用荧光显微镜(ZEISS)进行分析。FITC-FZI/0暴露和抗-PAR-2抗体暴露的细胞中均观察到了免疫荧光颗粒(图3)。两张图像的重叠显示PAR-2受体和FZI/0的共同定位是明显的(图3)。
实施例4
FZI/0-PAR-2AP竞争结合实验。PAR-2的激活要求其类胰蛋白酶生成的、断裂的N-端部分或合成肽的等价物PAR-2AP与受体的细胞外环2(ECL2)结合(47)。为了确定FZI/0是否与相同的受体结构域结合，在Caco2细胞中进行了竞争结合实验。将单细胞层在过量PAR-2AP(10-6M)或合成肽的存在下与FITC-FZI/0(2×10-8M)培养，然后通过荧光显微镜进行分析。与暴露于合成肽的单细胞层相比，暴露于过量PAR-2AP的细胞显示出FZI/0免疫荧光染色颗粒的显著降低(图4)，这表明FZI/0与PAR-2结合，并且能够竞争性地被PAR-2AP所取代。
Zot/连蛋白抑制剂FZI/0对PAR-2AP-诱导的肌动蛋白重排的影响。最近已经报道了PAR-2受体被PAR-2AP激活促进了细胞骨架的重组(53)。为了确定合成的Zot/连蛋白肽抑制剂FZI/0是否能够防止这一影响，在Caco2细胞单层中进行了免疫荧光研究。暴露于10-6M PAR-2AP的细胞(图5A)显示出应力纤维的溶解，而BSA-处理过的单细胞层则不会(图5B)。与2×10-6M FZI/0预温育阻断了这些细胞骨架的变化(图5C)，但是合成的肽FZI/1则不会(图5D)。因此，看起来PAR-2AP与FZI/0与肠细胞上的相同结构结合。
实施例5
PAR-2 AP和MCP-II对肠通透性的影响。PAR-2在肠细胞顶膜上得以高度表达，并推测其调节一种或多种肠细胞功能(52)。我们探询这些功能之一是否可以是连蛋白介导的、响应于细菌建群的肠通透性调节。为了探讨这一假设，我们在microsnapwell检测中测试了MCP-II和PAR-2AP处理对小鼠肠小肠的影响。与未经处理的组织相比，向肠的内腔方面加入10-6M PAR-2AP或MCP-II(10-8M)降低了TEER，而用FZI/0预处理则完全防止了这一依赖PAR2的递减(图6)。这些结果提供了更多的证据支持PAR-2是Zot和连蛋白二者的靶受体这一假设，而且表明这一受体也牵涉到细胞间紧密连接的调节。
实施例6
MyD88在PAR-2信号传导中的牵连。许多微生物结构，例如细菌脂多糖或者来自呼吸道合胞病毒的融合蛋白，以及某些内源蛋白，通过Toll样受体(TLRs；55)引发的胞质内信号传导激活了先天免疫系统的细胞。迄今已经鉴别了10种哺乳动物TLR。TLR、白细胞介素1和白细胞介素18受体的胞质内结构域当中是称为“Toll-IL-1受体”或“TIR”结构域的同源区。TIR结构域负责与例如髓样细胞分化因子88(MyD88)的关键性衔接分子结合。PAR-2激活参与的信号传导途径与TLRs(例如NF-κB等；52)参与的信号转导途径之间惊人的相似性，令我们猜测zot/连蛋白可能接合(engage)TLR家族或者密切相关的蛋白中的一员。因此，我们测试了野生型小鼠中和MyD88基因中具有靶突变(敲除，KO)的小鼠中，Zot和PAR-2AP诱发肠的跨上皮电阻(TEER)变化的能力(图7A和7B)。图7A中的数据表明PAR-2AP和ΔG均诱发了野生型组织中肠电阻随时间的可比较的下降，其通过与抑制性zot肽FZI/0预温育而逆转。与此相反，自MyD88基因敲除的小鼠中得到的肠组织则不能响应于任一刺激而表现出TEER的降低。
总之，这些结果显示Zot和连蛋白可能是通过两种不同的机制(图8)激活了相同的受体(PAR-2变体或同系物)。我们的数据支持以下观点，Zot与PAR-2(变体或同系物)ECL2直接结合并激活受体的信号传导，而连蛋白作为MCPII类似物则可以通过在其N-端切割而激活靶受体(图8)。而且，我们提出PAR-2(变体或同系物)可以通过TIR样结构域直接参与MyD88。
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在此特别引入所引用的各参考文献的公开内容。
序列表
<110>A.法萨诺
s.N.沃格尔
<120>ZOT和连蛋白受体的激动剂多肽
<130>006552.00097
<140>TBA
<141>2004-07-15
<150>60/487,889
<151>2003-07-15
<160>27
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>399
<212>PRT
<213>霍乱弧菌噬菌体CTXΦ
<400>1
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20 25 30
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Pro Leu Lys Ile Ala Tyr His Ile His Gly Asn Asn Trp Ile Tyr Gly
130 135 140
Glu Ala Leu Cys Asn Val Leu Ile Gly Phe Phe Tyr Gly Asn Met Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Gly Ile Ser Leu Ala Ile Trp Leu Leu Ile Leu Leu Val Thr Ile Pro
195 200 205
Leu Tyr Val Val Lys Gln Thr Ile Phe Ile Pro Ala Leu Asn Ile Thr
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245 250 255
Leu Thr Ala Ser Ala Tyr Val Leu Met Ile Arg Met Leu Arg Ser Ser
260 265 270
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275 280 285
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Leu Leu Leu Val Val His Tyr Phe Leu Ile Lys Ser Gln Gly Gln Ser
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His Val Tyr Ala Leu Tyr Ile Val Ala Leu Cys Leu Ser Thr Leu Asn
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<212>PRT
<213>智人
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<213>霍乱弧菌噬菌体CTXΦ
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Asp Glu Arg Tyr Arg Leu Val Asp Asn Leu Asp Ile Pro Tyr Arg Gly
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<220>
<223>霍乱弧菌噬菌体CXTΦ蛋白Zot寡肽的替代(susbstition)突变体
<221>变量
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<220>
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<220>
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<220>
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<211>6
<212>PRT
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<220>
<223>霍乱弧菌噬菌体CXTΦ蛋白Zot寡肽的替代(susbstition)突变体
<221>变量
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<212>PRT
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<220>
<223>霍乱弧菌噬菌体CXTΦ蛋白Zot寡肽的替代(susbstition)突变体
<221>变量
<222>(4)...(4)
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<213>人工序列
<220>
<223>霍乱弧菌噬菌体CXTΦ蛋白Zot寡肽的替代(susbstition)突变体
<221>变量
<222>(5)...(5)
<223>Xaa＝Lys or His
<221>变量
<222>(6)...(6)
<223>Xaa＝Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Trp，or Met
<400>27
Phe Cys Ile Gly Xaa Xaa
1 5
Claims (80)
1.一种连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽，所述的激动剂多肽包含FCIGRL(SEQ ID NO：4)，其中所述多肽的长度小于100个氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的激动剂多肽，其中所述的多肽由氨基酸残基FCIGRL(SEQ ID NO：4)组成。
3.根据权利要求1所述的激动剂多肽，其中所述的多肽不包含SEQ ID NO：1的残基294-298。
4.根据权利要求1所述的激动剂多肽，其中所述多肽的长度小于50个氨基酸残基。
5.根据权利要求1所述的激动剂多肽，其中所述多肽的长度小于40个氨基酸残基。
6.根据权利要求1所述的激动剂多肽，其中所述多肽的长度小于30个氨基酸残基。
7.根据权利要求1所述的激动剂多肽，其中所述多肽的长度小于20个氨基酸残基。
8.根据权利要求1所述的激动剂多肽，其中所述多肽的长度小于10个氨基酸残基。
9.根据权利要求1所述的激动剂多肽，其中所述多肽的长度小于8个氨基酸残基。
10.一种治疗疾病的药物组合物，其包括：
治疗所述疾病的治疗剂；和
根据权利要求1所述的激动剂多肽。
11.一种治疗疾病的药物组合物，其包括：
治疗所述疾病的治疗剂；和
根据权利要求2所述的激动剂多肽。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的疾病是食物过敏。
13.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的疾病是肠胃传染。
14.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的疾病是自身免疫性疾病。
15.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的疾病是炎症性肠病。
16.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的疾病是乳糜泻。
17.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的疾病是胃肠炎症。
18.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂是药物。
19.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂是生物活性肽。
20.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂是抗体。
21.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂是抗体片段。
22.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂是单链抗体(ScFv)。
23.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂是抗癌药物。
24.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂是抗生素。
25.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂是激素。
26.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂是细胞因子。
27.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述治疗剂与所述激动剂多肽的比例为1∶10至5∶1。
28.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述治疗剂与所述激动剂多肽的比例为1∶5至2∶1。
29.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂以心脏为目标。
30.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂以脑为目标。
31.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂以肠为目标。
32.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述的治疗剂以肾脏为目标。
33.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述激动剂多肽的存在量足以促进所述治疗剂在心脏中吸收。
34.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述激动剂多肽的存在量足以促进所述治疗剂在脑中吸收。
35.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述激动剂多肽的存在量足以促进所述治疗剂在肠中吸收。
36.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述激动剂多肽的存在量足以促进所述治疗剂在肾脏中吸收。
37.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求12所述的组合物为患有所述疾病的患者给药。
38.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求13所述的组合物为患有所述疾病的患者给药。
39.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求14所述的组合物为患有所述疾病的患者给药。
40.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求15所述的组合物为患有所述疾病的患者给药。
41.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求16所述的组合物为患有所述疾病的患者给药。
42.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求17所述的组合物为患有所述疾病的患者给药。
43.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求33所述的组合物为患有所述疾病的患者给药。
44.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求34所述的组合物为患有所述疾病的患者给药。
45.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求35所述的组合物为患有所述疾病的患者给药。
46.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求36所述的组合物为患有所述疾病的患者给药。
47.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求10所述的组合物通过患者的鼻腔为患有所述疾病的患者给药。
48.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求10所述的组合物通过患者的口腔为患有所述疾病的患者给药。
49.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求10所述的组合物通过患者的皮肤为患有所述疾病的患者给药。
50.一种向靶组织输送治疗剂的方法，其包括：
用根据权利要求10所述的组合物通过患者的血液为患有所述疾病的患者给药。
51.一种鉴别或提纯连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ Zot的人类受体的方法，其包括：
在适合抗体抗原结合的条件下，使包含一种或多种蛋白的样本与针对如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸SLIGKVDGTSHVTG培养的抗体接触；
除去样本中未与所述抗体结合的蛋白，其中将结合在所述抗体上的蛋白鉴别为连蛋白和Zot的人类受体，或者鉴别为形成富含所述受体的制剂。
52.根据权利要求51所述的方法，其进一步包括如下步骤：
用富含所述受体的制剂使哺乳动物免疫；
从所述哺乳动物中采集抗体以形成与所述受体结合的抗体制剂。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述的样本选自肠细胞、肠上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、及其溶解产物。
54.一种筛选治疗疾病的药物候选物的方法，其包括：
使抗体SAM11所识别的第一种人类蛋白与选自霍乱弧菌噬菌体CTXΦ Zot、人类连蛋白、和MyD88的第二种蛋白相接触，其中该接触在存在和不存在测试物质的情况下分别进行；
将存在测试物质的情况下第一种蛋白结合到第二种蛋白上的量与不存在测试物质的情况下的结合量进行比较；
如果测试物质降低了第一种蛋白在第二种蛋白上结合的量，则将该测试物质鉴别为药物候选物。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述的第二种蛋白是Zot。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述的第二种蛋白是连蛋白。
57.根据权利要求54所述的方法，其中所述的第二种蛋白是MyD88。
58.根据权利要求54所述的方法，其中所述的第二种蛋白是Zot的ΔG片段(SEQ ID NO：6)。
59.一种诱发免疫反应的疫苗组合物，其包含：
诱发免疫反应的免疫原性制剂；和
根据权利要求1所述的激动剂多肽。
60.一种诊断患者体内自身免疫性疾病的方法，其包括：
使来自患者的第一份人体样本与针对如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸SLIGKVDGTSHVTG培养的抗体相接触；
将所述第一份人体样本所结合的抗体的量，与不患有自身免疫性疾病的健康对照的第二份人体样本所结合的量进行比较；
如果所述第一份人体样本比所述第二份人体样本结合更多的抗体，则鉴别出自身免疫性疾病。
61.一种用相对于对照健康个体增加的连蛋白表达来治疗患者的方法，其包括：
用针对如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸SLIGKVDGTSHVTG培养的抗体为患者给药，从而减轻疾病的症状。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是癌症。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是自身免疫性疾病。
64.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是血管病。
65.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是细菌感染。
66.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是胃炎。
67.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是胃癌。
68.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是胶原性结肠炎。
69.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是炎症性肠病。
70.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是乳糜泻。
71.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是系统性红斑狼疮。
72.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是食物过敏。
73.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是哮喘。
74.根据权利要求61所述的方法，其中所述的疾病是过敏性肠综合症。
75.一种针对如SEQ ID NO：5中所示的氨基酸SLIGKVDGTSHVTG培养的抗体，其与CaCo2细胞中表达的蛋白结合，所述蛋白与合成抑制剂肽FZI/0(如SEQ ID NO：3中所示)所结合的蛋白共同定位，并且所述抗体不与表达重组人类PAR-2的人类或大鼠细胞结合，其中所述抗体不是SAM11。
76.一种抗体，其与CaCo2细胞中表达的蛋白结合，所述蛋白与合成抑制剂肽FZI/0(如SEQ ID NO：3中所示)所结合的蛋白共同定位，并且所述抗体不与表达重组人类PAR-2的人类或大鼠细胞结合，其中所述抗体不是SAM11。
77.一种连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽，所述的激动剂多肽含有选自如下的序列，
Xaa1 Cys Ile Gly Arg Leu(SEQ ID NO：7)，
Phe Xaa2 Ile Gly Arg Leu(SEQ ID NO：8)，
Phe Cys Xaa3 Gly Arg Leu(SEQ ID NO：9)，
Phe Cys Ile Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：10)，
Phe Cys Ile Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：11)，
Phe Cys Ile Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：12)，
其中所述多肽的长度小于100个氨基酸残基，其中Xaa1选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Tyr和Met；其中Xaa2选自Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn和Gln；Xaa3选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met；Xaa4选自Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Ala和Gln；Xaa5选自Lys和His；Xaa6选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met。
78.根据权利要求77所述的激动剂多肽，其中所述的多肽由6个氨基酸残基组成。
79.一种连蛋白和霍乱弧菌噬菌体CTXΦ ZOT蛋白的人类受体的激动剂多肽，所述的激动剂多肽含有选自如下的序列：
Xaa1 Xaa2 Ile Gly Arg Leu(SEQ ID NO：13)，
Xaa1 Cys Xaa3 Gly Arg Leu(SEQ ID NO：14)，
Xaa1 Cys Ile Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：15)，
Xaa1 Cys Ile Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：16)，
Xaa1 Cys Ile Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：17)，
Phe Xaa2 Xaa3 Gly Arg Leu(SEQ ID NO：18)，
Phe Xaa2 Ile Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：19)，
Phe Xaa2 Ile Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：20)，
Phe Xaa2 Ile Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：21)，
Phe Cys Xaa3 Xaa4 Arg Leu(SEQ ID NO：22)，
Phe Cys Xaa3 Gly Xaa5 Leu(SEQ ID NO：23)，
Phe Cys Xaa3 Gly Arg Xaa6(SEQ ID NO：24)，
Phe Cys Ile Xaa4 Xaa5 Leu(SEQ ID NO：25)，
Phe Cys Ile Xaa4 Arg Xaa6(SEQ ID NO：26)，和
Phe Cys Ile Gly Xaa5 Xaa6(SEQ ID NO：27)，
其中所述多肽的长度小于100个氨基酸残基，其中Xaa1选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Tyr和Met；其中Xaa2选自Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn和Gln；Xaa3选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met；Xaa4选自Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Ala和Gln；Xaa5选自Lys和His；Xaa6选自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp和Met。
80.根据权利要求79所述的激动剂多肽，其中所述的多肽由6个氨基酸残基组成。
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