CN107737334A - 一种预防a型链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防A型链球菌感染的疫苗。本发明提供的疫苗，其活性成分由成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己组成；所述成分甲为分选酶或具有所述分选酶的融合蛋白；所述成分乙为SCPA或具有所述SCPA的融合蛋白；所述成分丙为Spy0269或具有所述Spy0269的融合蛋白；所述成分丁为SCPC或具有所述SCPC的融合蛋白；所述成分戊为SLO或具有所述SLO的融合蛋白；所述成分己佐剂CpG或其他粘膜免疫佐剂。本发明提供的疫苗具有高效、广谱、和低价的优越性。同时本发明提供的疫苗采用粘膜免疫的途径，具有无组织损伤、无局部副作用和使用简便的特点，易于推广使用。

Description

一种预防A型链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及一种预防A型链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗。

背景技术

A型链球菌(Group A Streptococcus pyogenes,以下简称A链菌),又称A 族链球菌或A群链球菌，可引起多种疾病，轻者包括扁桃体炎、脓疱病、丹毒等 各种类型的皮肤及软组织感染，重者则为严重的侵袭性感染，可危及生命，如肺 炎、菌血症、中毒性休克和急性坏死性肌膜炎(Necrotizing Fasciitis)。后者 在12-24小时出现大片组织坏死导致死亡，死亡率高达60％。反复感染A链菌导致 自身免疫性后遗症，如急性风湿热、风湿性心脏病、肾小球肾炎以及牛皮癣等。 其中风湿性心脏病在世界心血管疾病死亡率中占首位，因此一直为世界卫生组织 和科学家所重视。

世界卫生组织统计表明全球每年有180万人严重感染A链菌，50多万人因A链 菌感染而死亡，约有1.1亿人表浅感染，6.1亿人扁桃体炎和咽炎，并有1800多万 人因A链菌感染导致自身免疫性疾病。此外，历史上造成人类死亡最多的流感， 其死亡原因的90％是继发细菌性肺炎导致的急性肺损伤，主要的致病菌是肺炎链 球菌和A链菌。

目前在国内外都没有A链菌的疫苗。由于A链菌有>150种菌型，并且决定 A链菌血清型的M蛋白与人组织蛋白有相似性，被认为是引起自身免疫性疾病的 原因。这些严重阻碍了A链菌疫苗的研发进程。因此，迫切需要开发安全、有效、 广谱和易于推广应用的A链菌疫苗。

细菌分选酶A(Sortase A)是普遍存在于革兰氏阳性菌中的成分，其功能 是介导细菌的毒力蛋白锚定在细菌表面，缺失分选酶A的细菌致病力显著降低。 分选酶A能够诱导以Th17为主的免疫反应，进而有效清除粘膜部位的A链菌。 分选酶A诱导的Th17反应对所测试的不同血清型的A链菌(M1、M49、M28、M12) 均具有显著保护作用。分选酶A免疫虽然也诱导抗体产生，但由于其位于细胞壁 内，抗体无法识别因而不能发挥免疫保护作用。

C5a蛋白酶(C5a peptidase)是A链菌表面的毒力蛋白，在所有血清型的A 链菌中普遍存在。引起新生儿严重感染的B型链球菌也表达C5a蛋白酶，与A 链菌的C5a蛋白酶其同源性高达97％-98％。研究已证明C5a蛋白酶对A链菌感染 可提供抗体依赖的免疫保护。被动转移C5a蛋白酶抗血清给未免疫小鼠显著增加 受体小鼠对A链菌的清除能力。

Spy0269表达于A链菌的表面，与A链菌的分裂增殖和A链菌粘附能力相关， 在各种A链菌的血清型中普遍存在，有高达97％-98％的同源性。免疫Spy0269可 诱导抗体生成，对A链菌提供免疫保护。

SCPC(streptococcal chemokine protease)是表达于各种血清型的A 链菌菌株表面的保守蛋白，通过降解IL-8抑制中性粒细胞在感染部位的迁移， 抑制宿主对A型链球菌的清除。SCPC在所有血清型A链菌中同源性高达97％-98％。 已证明SCPC免疫诱导抗体产生，并对A链菌提供免疫保护。

Streplysin O(SLO)是A型链球菌分泌型的毒力蛋白，通过破坏上皮细胞， 促进A链菌在巨噬细胞中的存活，抑制中心粒细胞的活性氧爆发等作用抑制机体 对A型链球菌的清除。SLO在所有血清型A链菌中普遍存在，同源性高达97％-98％。 免疫SLO可诱导抗体生成，对A链菌提供免疫保护。

然而，现有研究结果证实单一A链菌亚单位成分/或两种亚单位成分的混合 物不能对多种血清型A链菌提供全面有效的保护，本发明利用多种A链菌的保守 抗原粘膜免疫小鼠，有效诱导小鼠Th17和抗体的反应，对致死剂量的A链菌和 不同血清型的A链菌感染提供有效的保护作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防链球菌感染的疫苗。

本发明提供的疫苗，其活性成分由成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分 戊、成分己组成；

所述成分甲为分选酶A、具有所述分选酶A全长或部分氨基酸序列的融合 蛋白、所述分选酶A全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所 述分选酶A全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述分选酶A 全长或部分编码基因DNA表达载体；

所述成分乙为C5a蛋白酶、具有所述C5a蛋白酶全长或部分氨基酸序列 的融合蛋白、所述C5a蛋白酶全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的 蛋白、所述C5a蛋白酶全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所 述C5a蛋白酶全长或部分编码基因DNA表达载体；

所属成分丙为Spy0269，具有所述Spy0269全长或部分氨基酸序列的融合 蛋白、所述Spy0269全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所 述Spy0269全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述Spy0269 全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所属成分丁为SCPC，具有所述SCPC全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、 所述SCPC全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述SCPC全长 或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述SCPC全长或部分编码基因 的DNA表达载体；

所属成分戊为Streplysin O(SLO)，具有所述SLO全长或部分氨基酸序列 的融合蛋白、所述SLO全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所 述SLO全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述SLO全长或部分 编码基因的DNA表达载体；

成分己为免疫佐剂CpG。

所述疫苗的功能为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：(Ⅰ)抑制革兰氏 阳性致病菌；(Ⅱ)预防和/或治疗革兰氏阳性致病菌感染；(Ⅲ)预防革兰氏阳 性致病菌导致的人粘膜系统感染；(Ⅳ)降低或防止革兰氏阳性致病菌在人粘膜 系统的定居和感染。

所述成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己的质量配比为1： 1：1:1:1:1。

所述革兰氏阳性致病菌可为链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、粪肠球 菌或炭疽杆菌。所述链球菌可为A型链球菌、B型链球菌、C型链球菌、G型 链球菌、肺炎链球菌、猪链球菌或马链球菌。所述的A型链球菌具体可为A型 链球菌M1型、A型链球菌M12型或A型链球菌M49型。

所述人粘膜系统可为呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统或皮肤。

所述疫苗，其特征在于：所述疫苗的使用方式包括鼻腔吸入、口服、皮下注 射、皮内注射、生殖道注入或肛内注入。

本发明提供的疫苗的推荐使用方法：成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、 成分戊的蛋白用量均为10μg/次，成分己为CpG的用量为10μg/次，免疫次数 为3次，间隔一周。免疫方式为鼻腔吸入。

本发明还保护以上任一所述成分甲和以上任一所述成分乙在制备预防疫苗 中的应用；所述疫苗的功能为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：(Ⅰ)抑制 革兰氏阳性致病菌；(Ⅱ)预防和/或治疗革兰氏阳性致病菌感染；(Ⅲ)预防革 兰氏阳性致病菌导致的人粘膜系统感染；(Ⅳ)降低或防止革兰氏阳性致病菌在 人粘膜系统的定居和感染。

Th17细胞是近年来新发现的一类T细胞，粘膜免疫后产生的免疫记忆Th17 细胞能迅速迁移到感染的粘膜部位，在抗粘膜细菌感染起重要作用。与B细胞提 供的免疫不同，T细胞提供的免疫具有耐受抗原变异的特点，能提供对同种异型 细菌的交叉免疫保护，是新型疫苗构建的理论基础。Th17细胞活化后释放的细 胞因子IL-17激活中性粒细胞和巨噬细胞吞噬，有效地杀死进入机体的病原菌。 分选酶A诱导以Th17细胞为主的免疫反应，清除粘膜部位的A链菌，但是由于 分选酶A位于细菌细胞壁内部，特异性的抗体在免疫保护中不起作用。

C5a蛋白酶、Spy0269、SCPC、SLO位于A链菌表面或者分泌到胞外，可诱 导大量保护性的抗体，并对A链菌感染起到保护作用。本发明人经过长期深入研 究发现联合使用分选酶A和C5a蛋白酶、Spy0269、SCPC、SLO，既可诱导Th17 细胞的反应，又可诱导保护性抗体的反应，从而对A链菌起到更有效的保护作用。 分选酶A和C5a蛋白酶、Spy0269、SCPC、SLO均可提供交叉保护，因此联合使 用分选酶A和C5a蛋白酶理论上具有广谱的保护作用。粘膜佐剂可促进疫苗亚单 位在粘膜部位被抗原加工细胞摄取，显著增强其免疫原性和免疫效果，同时避免 肌肉或皮下免疫因佐剂会引起的局部组织反应本发明提供的疫苗的使用方式包括鼻腔吸入、口服、皮下注射、皮内注射、生殖道注入、肛内注入等。本发明提 供的疫苗可用于各种革兰氏阳性细菌导致的粘膜系统(呼吸系统、消化系统、泌 尿系统、生殖系统或皮肤)感染的预防和治疗。

本发明多联重组蛋白疫苗(以下简称Five Comp+CpG)所采用的抗原在链球 菌中普遍存在，同源性达90％以上。通过充分利用各种抗原在链球菌中的普遍 性和同源性、粘膜途径免疫、粘膜免疫佐剂增强抗原免疫原性，显著提高了Th17 细胞活化和抗体的水平，达到阻止病原菌定居和迅速清除病原菌的作用，并对不 同血清型A链菌均具有保护效果，具有高效、广谱、和低价的优越性。同时本发 明提供的疫苗采用粘膜免疫的途径，具有无组织损伤、无局部副作用和使用简便 的特点，易于推广使用。

附图说明

图1制备过程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

其中：GAS重组蛋白SrtA(Mw≈18kd),SCPA(Mw≈113kd)Spy0269(Mw≈ 90kd),SCPC(氨基酸序列：35-587，Mw≈60kd)，Streplysin O(SLO,Mw≈kd)。

图2鼻腔吸入Five Comp+CpG后对A型链球菌感染的免疫保护图。

图3鼻腔吸入Five Comp+CpG后对A型链球菌致死性感染的免疫保护图。

图4Five Comp+CpG免疫诱导小鼠产生对A型链球菌的Th17免疫记忆反应图。

图5Five Comp+CpG免疫诱导小鼠产生对A型链球菌的中和抗体反应图。

图6Five Comp+CpG免疫诱导小鼠产生的抗原特异性血清IgG反应。

图7Five Comp+CpG免疫诱导小鼠产生的抗原特异性分泌型IgA反应。

图8Five Comp+CpG免疫小鼠诱导产生对不同血清型GAS交叉免疫保护反应。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的 实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无 特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均 设置三次重复实验，结果取平均值。

A型链球菌M1型：来源于明尼苏达州立大学微生物系，参考文献：Wang B,Dileepan T,Briscoe S,Hyland KA,Kang J,Khoruts A,Cleary PP.Induction of TGF-beta1and TGF-beta1-dependent predominant Th17differentiation by group Astreptococcal infection.Proc Natl Acad Sci U S A. 2010；107(13):5937-42.。

CpG：参考文献Iho S,Maeyama J,Suzuki F.CpG oligodeoxynucleotides asmucosal adjuvants.Hum Vaccin Immunother.2015；11(3):755-60.

载体pET28a(+)：Novagen公司,Cat.No.69846-3。大肠杆菌BL21 gold(DE3)plysS：购自北京康为试剂生物技术有限公司,产品编号:CW0810A。 BALB/c小鼠：购自CharlesRiver；STRAIN CODE：028。无抗体小鼠：此种小鼠 没有B细胞，不能产生抗体；购自美国杰克森实验(Jackson Labs)，品系号002288。

实施例1

分选酶A(SrtA)的制备

1、以A型链球菌M1型的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-CTTACATATGGTCTTGCAAGCACAAATGG-3’；

R1：5’-ATGTTCTCGAGCTAGGTAGATACTTGGTTATAAGA-3’。

2、用限制性内切酶NdeI和XhoI，双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产 物。

3、用限制性内切酶NdeI和XhoI，双酶切载体pET28a(+)，回收约5400bp的 载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-SrtA。 根据测序结果，对重组质粒pET28a-SrtA进行结果描述如下：在载体pET28a(+) 的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列1自5’末端第244-750位核苷酸 所示的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的 序列2所示的融合基因，表达序列表的序列3所示的融合蛋白。

5、将重组质粒pET28a-SrtA导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到重 组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基， 37℃、220rpm振荡培养至OD_560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/ml， 37℃、220rpm振荡培养4小时。

7、取步骤6的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH7.4 的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒， 循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于GE公司Ni Sepharose 6Fast Flow，先用溶 液Ⅰ(pH为7.4，溶剂为水，含20mM Na₂HPO₄和500mM NaCl)进行10个柱体积的洗 脱以去除杂蛋白，然后用溶液Ⅱ(pH为7.4，溶剂为水，含200mM咪唑、20mM Na₂HPO₄和500mM NaCl)进行2个柱体积的洗脱以获得目的蛋白，收集采用溶液Ⅱ 洗脱时的过柱后溶液，将其命名为分选酶A(序列表2或3)溶液。

每升步骤6的培养体系可获得90％纯度以上的蛋白20毫克。

C5a蛋白酶的制备

1、以A型链球菌M1型的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5′-ATGACCATGGCGAATACTGTGACAGAAGACACTCCTGC-3′

R1：5′-ATGACTCGAGTTGTTCTGGTTTATTAGAGTGGCC-3′

2、使用PCR的方法进行点突变将活性中心的Asp130和Ser512突变为Ala， 以获得保留免疫原性但失去催化活性的SCPA，分别使用以下引物做点突变：

Asp-Ala(130)：

F1：5′-GTTGCAGTGATTGCTGCTGGTTTTGAT-3′

R1：5′-ATCAAAACCAGCAGCAATCACTGCAAC-3′

Ser-Ala(512)：

F1：5′-CTTTCTGGAACTGCTATGTCTGCGCCA-3′

R1：5′-TGGCGCAGACATAGCAGTTCCAGAAAG-3′

3、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切载体pET28a(+)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-SCPA。

6、将重组质粒pET28a-SCPA导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到重 组菌。

7、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD_560nm＝0.6时加入IPTG诱导，37℃、220rpm振荡培养4小时。

8、取步骤7的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH7.4 的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒， 循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

9、将步骤7得到的上清液上样于Ni Sepharose 6Fast Flow，先用平衡缓冲 液进行10个柱体积的洗脱以去除杂蛋白，然后分别用0、20、50、100、150mM的 咪唑洗脱以获得目的蛋白，收集采用150mM咪唑洗脱时的过柱后溶液。

10、将步骤八所的洗脱液经过AKTA purifier进一步纯化，得到较纯的目的 C5a蛋白酶(序列5或6)。

Spy0269的制备

1、以A型链球菌M1型的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-GGAATTCATATGGATGATAGAGCCTCAGGAGAAACGAA-3’；

R1：5’-ACGCGGATCCCTATCTTTGAGTACTTTCATCAACATCAGA-3’。

2、用限制性内切酶NdeI和BamHI，双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产 物。

3、用限制性内切酶NdeI和BamHI，双酶切载体pET28a(+)，回收约5400bp的 载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒 pET28a-Spy0269。根据测序结果，对重组质粒pET28a-Spy0269进行结果描述如 下：在载体pET28a(+)的NdeI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列7自5’末 端第849-2547位核苷酸所示的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的 部分DNA形成序列表的序列8所示的融合基因，表达序列表的序列9所示的融合蛋 白。

5、将重组质粒pET28a-Spy0269导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到 重组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基， 37℃、220rpm振荡培养至OD_560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/ml， 37℃、220rpm振荡培养4小时。

7、取步骤6的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH7.4 的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒， 循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于GE公司Ni Sepharose 6Fast Flow，先用溶 液Ⅰ(pH为7.4，溶剂为水，含20mM Na₂HPO₄和500mM NaCl)进行10个柱体积的洗 脱以去除杂蛋白，然后用溶液Ⅱ(pH为7.4，溶剂为水，含200mM咪唑、20mM Na₂HPO₄和500mM NaCl)进行2个柱体积的洗脱以获得目的蛋白，收集采用溶液Ⅱ 洗脱时的过柱后溶液，将其命名为Spy0269(序列表8或9)溶液。

每升步骤6的培养体系可获得90％纯度以上的蛋白10毫克。

SCPC的制备

1、以A型链球菌M1型的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-GGAATTCCATATGGATGAGCTAACCACAACGAGTGAACCAACA-3’；

R1：5’-CCGCTCGAGATCAGAGGTTAGGCCCCAATTTGAAAAATG-3’。

2、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切载体pET30a(+)，回收约5400bp的载 体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET30a-SCPC。 测序结果，对重组质粒pET30a-SCPC进行结果描述如下：在载体pET30a(+)的NdeI 和XhoI酶切位点之间插入了序列表10的序列自5’末端第103-1761位核苷酸所示 的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列 11所示的融合基因，表达序列表的序列12所示的融合蛋白。

5、将重组质粒pET30a-SCPC导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到重 组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基， 37℃、220rpm振荡培养至OD_560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/ml， 37℃、220rpm振荡培养4小时。

7、取步骤6的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH7.4 的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒， 循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于GE公司Ni Sepharose 6Fast Flow，先用溶 液Ⅰ(pH为7.4，溶剂为水，含20mM Na₂HPO₄和500mM NaCl)进行10个柱体积的洗 脱以去除杂蛋白，然后用溶液Ⅱ(pH为7.4，溶剂为水，含200mM咪唑、20mM Na₂HPO₄和500mM NaCl)进行2个柱体积的洗脱以获得目的蛋白，收集采用溶液Ⅱ 洗脱时的过柱后溶液，将其命名为SCPC(序列表11或12)溶液。

每升步骤6的培养体系可获得90％纯度以上的蛋白10毫克。

SLO的制备

1、以A型链球菌M1型的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5′-GTGCGTCCATGGGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC-3′

R1：5′-GCATTCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG-3′

2、使用PCR的方法进行点突变将活性中心的P427突变为L和W535突变为 F，以获得保留免疫原性但失去活性的SLO，分别使用以下引物做点突变：

P427L：

F1：5′-

ATGCTACCTTCAGTAGAAAAAACCCTGCTTATCCTATTTCATACACCA-3′

R1：5′-

TGGTGTATGAAATAGGATAAGCAGGGTTTTTTCTACTGAAGGTAGCAT-3′

W535F：

F1：5′-GAGTGCACTGGCTTAGCTTTCGAATGGTGGCGAAAAGTGATC-3′

R1：5′-GATCACTTTTCGCCACCATTCGAAAGCTAAGCCAGTGCACTC-3′

3、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切载体pET28a(+),回收约5400bp的载体 骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，在载体pET28a(+)的NcoI 和XhoI酶切位点之间插入了序列表13的序列自5’末端第94-1713位核苷酸所示 的双链DNA分子，得到重组质粒pET28a-SLO。插入的双链DNA分子与载体骨架上的 部分DNA形成序列表的序列14所示的融合基因，表达序列表的序列15所示的融合 蛋白。

6、将重组质粒pET28a-SLO导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到重组 菌。

7、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD_560nm＝0.6时加入IPTG诱导，37℃、220rpm振荡培养4小时。

8、取步骤7的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH7.4 的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒， 循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

9、将步骤7得到的上清液上样于Ni Sepharose 6Fast Flow，先用平衡缓冲 液进行10个柱体积的洗脱以去除杂蛋白，然后分别用0、20、50、100、150mM的 咪唑洗脱以获得目的蛋白，收集采用150mM咪唑洗脱时的过柱后溶液。

10、将步骤八所的洗脱液经过AKTA purifier进一步纯化，得到较纯的目的 SLO蛋白(序列表14或15)。

实施例2、鼻腔吸入Five Comp+CpG促进小鼠对鼻腔感染部位A型链球菌的清除

一、将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为三组，分组处理如下：

PBS组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液；

Five Comp+CpG组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗 液是将实施例1制备的5种重组蛋白和CpG溶液混合得到的，每只小鼠每次给予5 种重组蛋白各10μg和10μg CpG)。

GAS组:实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入GAS(菌液的浓度为 5×10⁷CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)

实验第21天，用活菌(A型链球菌M1型)通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒(菌 液的浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)。攻毒24小时后处死小鼠， 分离鼻相关淋巴组织(Nasal Associated Lymphoid Tissue或简称NALT),制成 单细胞悬液，用血平板培养检测NALT中的A型链球菌活菌数。

结果见图2，每个黑点代表1只小鼠(纵坐标指的是每只小鼠的整个NALT中A 链菌的CFU数量)。A型链球菌M1型攻击后，Five Comp+CpG组小鼠NALT中的活菌 数明显比PBS组少，与GAS免疫组无差异，表明本发明提供的疫苗经呼吸道粘膜免 疫能有效地清除A型链球菌M1型的感染。

实施例3、鼻腔吸入Five Comp+CpG促进小鼠对致死剂量A型链球菌的免疫保护。

将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为三组，分组处理如下：

PBS组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液；

Five Comp+CpG组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗 液是将实施例1制备的5种重组蛋白和CpG溶液混合得到的，每只小鼠每次给予5 种重组蛋白各10μg和10μg CpG)。

GAS组:实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入GAS(菌液的浓度为 5×10⁷CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)

实验第21天，用活菌(A型链球菌M1型)通过鼻腔滴注对小鼠进行致死剂量 攻毒(菌液的浓度为3×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)。攻毒后观察小 鼠的存活

结果见图3，与PBS组相比，Five Comp+CpG组显著提高了小鼠的生存率(90％)， 表明Five Comp+CpG免疫小鼠提供对致死剂量的GAS的免疫保护作用。

实施例4、鼻腔免疫Five Comp+CpG诱导Th17细胞反应

将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为三组，分组处理如下：

PBS组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液；

Five Comp+CpG组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗 液是将实施例1制备的5种重组蛋白和CpG溶液混合得到的，每只小鼠每次给予5 种重组蛋白各10μg和10μg CpG)。

GAS组:实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入GAS(菌液的浓度为 5×10⁷CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)。

实验第24天，用活菌(A型链球菌M1型)通过鼻腔滴注对小鼠进行致死剂量 攻毒(菌液的浓度为1.5～2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)。攻毒后5 天处死小鼠，取NALT流式细胞术检测Th17细胞(CD4+，CD3+,IL-17A+的淋巴细胞)， ELISA检测NALT上清中IL-17A的量。

结果见图4。与PBS组相比，Five Comp+CpG组显著诱导了NALT中Th17细胞的 比例，和NALT上清中IL-17A的量，与GAS组无差异。表明Five Comp+CpG鼻腔免疫 小鼠诱导Th17的反应。

实施例5、分选酶A和CTB免疫诱导小鼠产生的抗体反应

将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为三组，分组处理如下：

PBS组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液；

Five Comp+CpG组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗 液是将实施例1制备的5种重组蛋白和CpG溶液混合得到的，每只小鼠每次给予5 种重组蛋白各10μg和10μg CpG)。

GAS组:实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入GAS(菌液的浓度为 5×10⁷CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)

实验第21-24天，用A型链球菌M1型通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒(菌液的浓 度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)。攻毒24小时后处死小鼠，取血 ELIAS测血清IgG。

与PBS组相比，Five Comp+CpG组显著诱导了抗GAS血清IgG和分泌型IgA的量， 结果见图5(抗GAS的血清IgG)，图5(抗GAS的分泌型IgA)。Five Comp+CpG组 显著诱导了抗原特异性血清IgG和分泌型IgA的量，结果见图6(抗原特异性血清 IgG)，图7(抗原特异性分泌型IgA)。表明Five Comp+CpG鼻腔免疫小鼠诱导抗 体反应。

实施例6:Five Comp+CpG免疫小鼠诱导产生对不同血清型GAS的交叉免疫保护 反应。

将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为4组，分组处理如下：

PBS-GAS M1组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液；

Five Comp+CpG-GAS M1组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗 液(疫苗液是将实施例1制备的5种重组蛋白和CpG溶液混合得到的，每只小鼠每次 给予5种重组蛋白各10μg和10μg CpG)。

PBS-GAS M12组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液；

Five Comp+CpG-GAS M12组:实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入GAS (菌液的浓度为5×10⁷CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)

实验第21-24天，用GAS M1型通过鼻腔滴注对PBS-GAS M1组和Five Comp+CpG-GASM1组小鼠进行攻毒(菌液的浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠 滴注10μl)。用GAS M12型通过鼻腔滴注对PBS-GAS M12组和Five Comp+CpG-GAS M12组小鼠进行攻毒(菌液的浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl)。

攻毒24小时后处死小鼠，取NALT测CFU。

结果见图8，Five Comp+CpG组不但产生对GAS M1的保护，并且对不同血清的 GAS(GAS M12)也有保护作用，表明Five Comp+CpG免疫小鼠诱导产生对不同血 清型GAS的交叉免疫保护反应。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种预防A型链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 750

<212> DNA

<213> 链球菌(Streptococcus pyogenes)

<400> 1

atggtaaaaa aacaaaagcg tcgaaaaata aaatccatgt cttgggcaag aaaactacta 60

atagctgtac ttttaattct aggtttagca ttgcttttta acaaacctat ccgaaataca 120

ttaattgctc gaaactctaa taaatatcaa gtaacgaaag tttcgaaaaa acaaatcaaa 180

aagaataaag aggctaagtc aacatttgat ttccaggccg tagagccagt tagtacagag 240

agtgtcttgc aagcacaaat ggcggctcag caacttcctg ttataggggg cattgccata 300

ccagagcttg gcattaattt accaattttt aaaggtttag gaaatactga gcttatttat 360

ggcgcaggaa cgatgaaaga agaacaagtt atgggaggag aaaataatta ttctcttgcc 420

agtcatcata tttttggaat tacaggttca tctcaaatgc tcttttcgcc gcttgaaaga 480

gcacaaaatg ggatgtccat ctatttaaca gataaagaaa aaatttacga atacatcata 540

aaagatgttt tcacggtagc tcctgaacgc gttgatgtta tcgatgatac agctggtctc 600

aaagaagtga ctttagtgac ttgtacagat atcgaagcaa cagaacgtat tattgtcaaa 660

ggagaactaa aaacagaata cgattttgat aaagcgcccg ccgatgtatt gaaagctttt 720

aatcattctt ataaccaagt atctacctag 750

<210> 2

<211> 570

<212> DNA

<213> 分选酶A(Sortase A)

<400> 2

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggtcttgc aagcacaaat ggcggctcag caacttcctg ttataggggg cattgccata 120

ccagagcttg gcattaattt accaattttt aaaggtttag gaaatactga gcttatttat 180

ggcgcaggaa cgatgaaaga agaacaagtt atgggaggag aaaataatta ttctcttgcc 240

agtcatcata tttttggaat tacaggttca tctcaaatgc tcttttcgcc gcttgaaaga 300

gcacaaaatg ggatgtccat ctatttaaca gataaagaaa aaatttacga atacatcata 360

aaagatgttt tcacggtagc tcctgaacgc gttgatgtta tcgatgatac agctggtctc 420

aaagaagtga ctttagtgac ttgtacagat atcgaagcaa cagaacgtat tattgtcaaa 480

ggagaactaa aaacagaata cgattttgat aaagcgcccg ccgatgtatt gaaagctttt 540

aatcattctt ataaccaagt atctacctag 570

<210> 3

<211> 189

<212> PRT

<213> 分选酶A(Sortase A)

<400> 3

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Val Leu Gln Ala Gln Met Ala Ala Gln Gln Leu

20 25 30

Pro Val Ile Gly Gly Ile Ala Ile Pro Glu Leu Gly Ile Asn Leu Pro

35 40 45

Ile Phe Lys Gly Leu Gly Asn Thr Glu Leu Ile Tyr Gly Ala Gly Thr

50 55 60

Met Lys Glu Glu Gln Val Met Gly Gly Glu Asn Asn Tyr Ser Leu Ala

65 70 75 80

Ser His His Ile Phe Gly Ile Thr Gly Ser Ser Gln Met Leu Phe Ser

85 90 95

Pro Leu Glu Arg Ala Gln Asn Gly Met Ser Ile Tyr Leu Thr Asp Lys

100 105 110

Glu Lys Ile Tyr Glu Tyr Ile Ile Lys Asp Val Phe Thr Val Ala Pro

115 120 125

Glu Arg Val Asp Val Ile Asp Asp Thr Ala Gly Leu Lys Glu Val Thr

130 135 140

Leu Val Thr Cys Thr Asp Ile Glu Ala Thr Glu Arg Ile Ile Val Lys

145 150 155 160

Gly Glu Leu Lys Thr Glu Tyr Asp Phe Asp Lys Ala Pro Ala Asp Val

165 170 175

Leu Lys Ala Phe Asn His Ser Tyr Asn Gln Val Ser Thr

180 185

<210> 4

<211> 3024

<212> DNA

<213> C5a蛋白酶(C5a peptidase)

<400> 4

atgaatactg tgacagaaga cactcctgct accgaacaag ctgtagaaac cccacaacca 60

acagcggttt ctgaggaagc accatcatca aaggaaacca aaaccccaca aactcctgat 120

gacgcagaag aaacaatagc agatgacgct aatgatctag cccctcaagc tcctgctaaa 180

actgctgata caccagcaac ctcaaaagcg actattaggg atttgaacga cccttctcag 240

gtcaaaaccc tgcaggaaaa agcaggcaaa ggagctggga ctgttgttgc agtgattgct 300

gctggttttg ataaaaatca tgaagcgtgg cgcttaacag acaaaaccaa agcacgttac 360

caatcaaaag aagatcttga aaaagctaaa aaagagcacg gtattaccta tggcgagtgg 420

gtcaatgata aggttgctta ttaccacgac tatagtaaag atggtaaaac cgctgtcgat 480

caagagcacg gcacacacgt gtcagggatc ttgtcaggaa atgctccatc tgaaacgaaa 540

gaaccttacc gcctagaagg tgcgatgcct gaggctcaat tgcttttgat gcgtgtcgaa 600

attgtaaatg gactagcaga ctatgctcgt aactacgctc aagctatcat agatgctgtc 660

aacttgggag ctaaggtgat taatatgagc tttggtaatg ctgcactagc ctatgccaac 720

cttccagacg aaaccaaaaa agcctttgac tatgccaaat caaaaggtgt tagcattgtg 780

acctcagctg gtaatgatag tagctttggg ggcaagaccc gtctacctct agcagatcat 840

cctgattatg gggtggttgg gacacctgca gcggcagact caacattgac agttgcttct 900

tacagcccag ataaacagct cactgaaact gctacggtca aaacagccga tcagcaagat 960

aaagaaatgc ctgttctttc aacaaaccgt tttgagccaa acaaggctta cgactatgct 1020

tatgctaatc gtgggatgaa agaggatgat tttaaggatg tcaaaggtaa gattgccctt 1080

attgaacgtg gcgatattga tttcaaagat aagattgcaa acgctaaaaa agctggtgct 1140

gtaggagtct tgatctatga caatcaggac aagggcttcc cgattgaatt gccaaatgtt 1200

gatcagatgc ctgcggcctt tatcagtcga aaagatggtc tcttattaaa agagaatccc 1260

caaaaaacca tcaccttcaa tgcgacacct aaggtattgc caacagcaag tggcaccaaa 1320

ctaagccgct tctcaagctg gggtctgaca gctgacggca atattaagcc agatattgca 1380

gcacccggcc aagatatttt gtcatcagtg gctaacaaca agtatgccaa actttctgga 1440

actgctatgt ctgcgccatt agtagcgggt atcatgggac tgttgcaaaa gcaatatgag 1500

acacagtatc ctgatatgac accatcagag cgtcttgatt tagctaaaaa agtattgatg 1560

agctcagcaa ctgccttata tgatgaagat gaaaaagctt atttttctcc tcgccaacaa 1620

ggagcaggag cagtcgatgc taaaaaagct tcagcagcaa cgatgtatgt gacagataag 1680

gataatacct caagcaaggt tcacctgaac aatgtttctg ataaatttga agtaacagta 1740

acagttcaca acaaatctga taaacctcaa gagttgtatt accaagcaac tgttcaaaca 1800

gataaagtag atggaaaact ctttgccttg gctcctaaag cattgtatga gacatcatgg 1860

caaaaaatca caattccagc caatagcagc aaacaagtca ccattccaat cgatgttagt 1920

caatttagca aggacttgct tgccccaatg aaaaatggct atttcttaga aggttttgtt 1980

cgtttcaaac aagatcctac aaaagaagag cttatgagta ttccctatat tggtttccga 2040

ggtgattttg gcaatctgtc agccttagaa aaaccaatct atgatagcaa agacggtagc 2100

agctactatc atgaagcaaa tagtgatgcc aaagaccaat tagatggtga tggattacag 2160

ttttacgctc tgaaaaataa ctttacagca cttactacag agtctaatcc atggacgatt 2220

attaaagctg tcaaagaagg ggttgaaaac atagaggata tcgaatcttc agagatcaca 2280

gaaaccattt ttgcaggtac ttttgcaaaa caagacgatg atagccacta ctatatccac 2340

cgtcacgcta atggcaagcc atatgctgcg atctctccaa atggggacgg taacagagat 2400

tatgtccaat tccaaggtac tttcttgcgt aatgctaaaa accttgtggc tgaagtcttg 2460

gacaaagaag gaaatgttgt ttggacaagt gaggtaaccg agcaagttgt taaaaactac 2520

aacaatgact tggcaagcac acttggttca acccgttttg aaaaaacgcg ttgggacggt 2580

aaagataaag acggcaaagt tgttgctaac ggaacataca cctatcgtgt tcgctacact 2640

ccgattagct caggtgcaaa agaacaacac actgattttg atgtgattgt agacaatacg 2700

acacctgaag tcgcaacatc ggcaacattc tcaacagaag atcgtcgttt gacacttgca 2760

tctaaaccaa aaaccagcca accggtttac cgtgagcgta ttgcttacac ttatatggat 2820

gaggatctgc caacaacaga gtatatttct ccaaatgaag atggtacctt tactcttcct 2880

gaagaggctg aaacaatgga aggcgctact gttccattga aaatgtcaga ctttacttat 2940

gttgttgaag atatggctgg taacatcact tatacaccag tgactaagct attggaaggc 3000

cactctaata aaccagaaca ataa 3024

<210> 5

<211> 3054

<212> DNA

<213> C5a蛋白酶(C5a peptidase)

<400> 5

atgggcatga atactgtgac agaagacact cctgctaccg aacaagctgt agaaacccca 60

caaccaacag cggtttctga ggaagcacca tcatcaaagg aaaccaaaac cccacaaact 120

cctgatgacg cagaagaaac aatagcagat gacgctaatg atctagcccc tcaagctcct 180

gctaaaactg ctgatacacc agcaacctca aaagcgacta ttagggattt gaacgaccct 240

tctcaggtca aaaccctgca ggaaaaagca ggcaaaggag ctgggactgt tgttgcagtg 300

attgctgctg gttttgataa aaatcatgaa gcgtggcgct taacagacaa aaccaaagca 360

cgttaccaat caaaagaaga tcttgaaaaa gctaaaaaag agcacggtat tacctatggc 420

gagtgggtca atgataaggt tgcttattac cacgactata gtaaagatgg taaaaccgct 480

gtcgatcaag agcacggcac acacgtgtca gggatcttgt caggaaatgc tccatctgaa 540

acgaaagaac cttaccgcct agaaggtgcg atgcctgagg ctcaattgct tttgatgcgt 600

gtcgaaattg taaatggact agcagactat gctcgtaact acgctcaagc tatcatagat 660

gctgtcaact tgggagctaa ggtgattaat atgagctttg gtaatgctgc actagcctat 720

gccaaccttc cagacgaaac caaaaaagcc tttgactatg ccaaatcaaa aggtgttagc 780

attgtgacct cagctggtaa tgatagtagc tttgggggca agacccgtct acctctagca 840

gatcatcctg attatggggt ggttgggaca cctgcagcgg cagactcaac attgacagtt 900

gcttcttaca gcccagataa acagctcact gaaactgcta cggtcaaaac agccgatcag 960

caagataaag aaatgcctgt tctttcaaca aaccgttttg agccaaacaa ggcttacgac 1020

tatgcttatg ctaatcgtgg gatgaaagag gatgatttta aggatgtcaa aggtaagatt 1080

gcccttattg aacgtggcga tattgatttc aaagataaga ttgcaaacgc taaaaaagct 1140

ggtgctgtag gagtcttgat ctatgacaat caggacaagg gcttcccgat tgaattgcca 1200

aatgttgatc agatgcctgc ggcctttatc agtcgaaaag atggtctctt attaaaagag 1260

aatccccaaa aaaccatcac cttcaatgcg acacctaagg tattgccaac agcaagtggc 1320

accaaactaa gccgcttctc aagctggggt ctgacagctg acggcaatat taagccagat 1380

attgcagcac ccggccaaga tattttgtca tcagtggcta acaacaagta tgccaaactt 1440

tctggaactg ctatgtctgc gccattagta gcgggtatca tgggactgtt gcaaaagcaa 1500

tatgagacac agtatcctga tatgacacca tcagagcgtc ttgatttagc taaaaaagta 1560

ttgatgagct cagcaactgc cttatatgat gaagatgaaa aagcttattt ttctcctcgc 1620

caacaaggag caggagcagt cgatgctaaa aaagcttcag cagcaacgat gtatgtgaca 1680

gataaggata atacctcaag caaggttcac ctgaacaatg tttctgataa atttgaagta 1740

acagtaacag ttcacaacaa atctgataaa cctcaagagt tgtattacca agcaactgtt 1800

caaacagata aagtagatgg aaaactcttt gccttggctc ctaaagcatt gtatgagaca 1860

tcatggcaaa aaatcacaat tccagccaat agcagcaaac aagtcaccat tccaatcgat 1920

gttagtcaat ttagcaagga cttgcttgcc ccaatgaaaa atggctattt cttagaaggt 1980

tttgttcgtt tcaaacaaga tcctacaaaa gaagagctta tgagtattcc ctatattggt 2040

ttccgaggtg attttggcaa tctgtcagcc ttagaaaaac caatctatga tagcaaagac 2100

ggtagcagct actatcatga agcaaatagt gatgccaaag accaattaga tggtgatgga 2160

ttacagtttt acgctctgaa aaataacttt acagcactta ctacagagtc taatccatgg 2220

acgattatta aagctgtcaa agaaggggtt gaaaacatag aggatatcga atcttcagag 2280

atcacagaaa ccatttttgc aggtactttt gcaaaacaag acgatgatag ccactactat 2340

atccaccgtc acgctaatgg caagccatat gctgcgatct ctccaaatgg ggacggtaac 2400

agagattatg tccaattcca aggtactttc ttgcgtaatg ctaaaaacct tgtggctgaa 2460

gtcttggaca aagaaggaaa tgttgtttgg acaagtgagg taaccgagca agttgttaaa 2520

aactacaaca atgacttggc aagcacactt ggttcaaccc gttttgaaaa aacgcgttgg 2580

gacggtaaag ataaagacgg caaagttgtt gctaacggaa catacaccta tcgtgttcgc 2640

tacactccga ttagctcagg tgcaaaagaa caacacactg attttgatgt gattgtagac 2700

aatacgacac ctgaagtcgc aacatcggca acattctcaa cagaagatcg tcgtttgaca 2760

cttgcatcta aaccaaaaac cagccaaccg gtttaccgtg agcgtattgc ttacacttat 2820

atggatgagg atctgccaac aacagagtat atttctccaa atgaagatgg tacctttact 2880

cttcctgaag aggctgaaac aatggaaggc gctactgttc cattgaaaat gtcagacttt 2940

acttatgttg ttgaagatat ggctggtaac atcacttata caccagtgac taagctattg 3000

gaaggccact ctaataaacc agaacaactc gagcaccacc accaccacca ctga 3054

<210> 6

<211> 1017

<212> PRT

<213> C5a蛋白酶(C5a peptidase)

<400> 6

Met Gly Met Asn Thr Val Thr Glu Asp Thr Pro Ala Thr Glu Gln Ala

1 5 10 15

Val Glu Thr Pro Gln Pro Thr Ala Val Ser Glu Glu Ala Pro Ser Ser

20 25 30

Lys Glu Thr Lys Thr Pro Gln Thr Pro Asp Asp Ala Glu Glu Thr Ile

35 40 45

Ala Asp Asp Ala Asn Asp Leu Ala Pro Gln Ala Pro Ala Lys Thr Ala

50 55 60

Asp Thr Pro Ala Thr Ser Lys Ala Thr Ile Arg Asp Leu Asn Asp Pro

65 70 75 80

Ser Gln Val Lys Thr Leu Gln Glu Lys Ala Gly Lys Gly Ala Gly Thr

85 90 95

Val Val Ala Val Ile Ala Ala Gly Phe Asp Lys Asn His Glu Ala Trp

100 105 110

Arg Leu Thr Asp Lys Thr Lys Ala Arg Tyr Gln Ser Lys Glu Asp Leu

115 120 125

Glu Lys Ala Lys Lys Glu His Gly Ile Thr Tyr Gly Glu Trp Val Asn

130 135 140

Asp Lys Val Ala Tyr Tyr His Asp Tyr Ser Lys Asp Gly Lys Thr Ala

145 150 155 160

Val Asp Gln Glu His Gly Thr His Val Ser Gly Ile Leu Ser Gly Asn

165 170 175

Ala Pro Ser Glu Thr Lys Glu Pro Tyr Arg Leu Glu Gly Ala Met Pro

180 185 190

Glu Ala Gln Leu Leu Leu Met Arg Val Glu Ile Val Asn Gly Leu Ala

195 200 205

Asp Tyr Ala Arg Asn Tyr Ala Gln Ala Ile Ile Asp Ala Val Asn Leu

210 215 220

Gly Ala Lys Val Ile Asn Met Ser Phe Gly Asn Ala Ala Leu Ala Tyr

225 230 235 240

Ala Asn Leu Pro Asp Glu Thr Lys Lys Ala Phe Asp Tyr Ala Lys Ser

245 250 255

Lys Gly Val Ser Ile Val Thr Ser Ala Gly Asn Asp Ser Ser Phe Gly

260 265 270

Gly Lys Thr Arg Leu Pro Leu Ala Asp His Pro Asp Tyr Gly Val Val

275 280 285

Gly Thr Pro Ala Ala Ala Asp Ser Thr Leu Thr Val Ala Ser Tyr Ser

290 295 300

Pro Asp Lys Gln Leu Thr Glu Thr Ala Thr Val Lys Thr Ala Asp Gln

305 310 315 320

Gln Asp Lys Glu Met Pro Val Leu Ser Thr Asn Arg Phe Glu Pro Asn

325 330 335

Lys Ala Tyr Asp Tyr Ala Tyr Ala Asn Arg Gly Met Lys Glu Asp Asp

340 345 350

Phe Lys Asp Val Lys Gly Lys Ile Ala Leu Ile Glu Arg Gly Asp Ile

355 360 365

Asp Phe Lys Asp Lys Ile Ala Asn Ala Lys Lys Ala Gly Ala Val Gly

370 375 380

Val Leu Ile Tyr Asp Asn Gln Asp Lys Gly Phe Pro Ile Glu Leu Pro

385 390 395 400

Asn Val Asp Gln Met Pro Ala Ala Phe Ile Ser Arg Lys Asp Gly Leu

405 410 415

Leu Leu Lys Glu Asn Pro Gln Lys Thr Ile Thr Phe Asn Ala Thr Pro

420 425 430

Lys Val Leu Pro Thr Ala Ser Gly Thr Lys Leu Ser Arg Phe Ser Ser

435 440 445

Trp Gly Leu Thr Ala Asp Gly Asn Ile Lys Pro Asp Ile Ala Ala Pro

450 455 460

Gly Gln Asp Ile Leu Ser Ser Val Ala Asn Asn Lys Tyr Ala Lys Leu

465 470 475 480

Ser Gly Thr Ala Met Ser Ala Pro Leu Val Ala Gly Ile Met Gly Leu

485 490 495

Leu Gln Lys Gln Tyr Glu Thr Gln Tyr Pro Asp Met Thr Pro Ser Glu

500 505 510

Arg Leu Asp Leu Ala Lys Lys Val Leu Met Ser Ser Ala Thr Ala Leu

515 520 525

Tyr Asp Glu Asp Glu Lys Ala Tyr Phe Ser Pro Arg Gln Gln Gly Ala

530 535 540

Gly Ala Val Asp Ala Lys Lys Ala Ser Ala Ala Thr Met Tyr Val Thr

545 550 555 560

Asp Lys Asp Asn Thr Ser Ser Lys Val His Leu Asn Asn Val Ser Asp

565 570 575

Lys Phe Glu Val Thr Val Thr Val His Asn Lys Ser Asp Lys Pro Gln

580 585 590

Glu Leu Tyr Tyr Gln Ala Thr Val Gln Thr Asp Lys Val Asp Gly Lys

595 600 605

Leu Phe Ala Leu Ala Pro Lys Ala Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Gln Lys

610 615 620

Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ser Ser Lys Gln Val Thr Ile Pro Ile Asp

625 630 635 640

Val Ser Gln Phe Ser Lys Asp Leu Leu Ala Pro Met Lys Asn Gly Tyr

645 650 655

Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Phe Lys Gln Asp Pro Thr Lys Glu Glu

660 665 670

Leu Met Ser Ile Pro Tyr Ile Gly Phe Arg Gly Asp Phe Gly Asn Leu

675 680 685

Ser Ala Leu Glu Lys Pro Ile Tyr Asp Ser Lys Asp Gly Ser Ser Tyr

690 695 700

Tyr His Glu Ala Asn Ser Asp Ala Lys Asp Gln Leu Asp Gly Asp Gly

705 710 715 720

Leu Gln Phe Tyr Ala Leu Lys Asn Asn Phe Thr Ala Leu Thr Thr Glu

725 730 735

Ser Asn Pro Trp Thr Ile Ile Lys Ala Val Lys Glu Gly Val Glu Asn

740 745 750

Ile Glu Asp Ile Glu Ser Ser Glu Ile Thr Glu Thr Ile Phe Ala Gly

755 760 765

Thr Phe Ala Lys Gln Asp Asp Asp Ser His Tyr Tyr Ile His Arg His

770 775 780

Ala Asn Gly Lys Pro Tyr Ala Ala Ile Ser Pro Asn Gly Asp Gly Asn

785 790 795 800

Arg Asp Tyr Val Gln Phe Gln Gly Thr Phe Leu Arg Asn Ala Lys Asn

805 810 815

Leu Val Ala Glu Val Leu Asp Lys Glu Gly Asn Val Val Trp Thr Ser

820 825 830

Glu Val Thr Glu Gln Val Val Lys Asn Tyr Asn Asn Asp Leu Ala Ser

835 840 845

Thr Leu Gly Ser Thr Arg Phe Glu Lys Thr Arg Trp Asp Gly Lys Asp

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Lys Asp Gly Lys Val Val Ala Asn Gly Thr Tyr Thr Tyr Arg Val Arg

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Tyr Thr Pro Ile Ser Ser Gly Ala Lys Glu Gln His Thr Asp Phe Asp

885 890 895

Val Ile Val Asp Asn Thr Thr Pro Glu Val Ala Thr Ser Ala Thr Phe

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Ser Thr Glu Asp Arg Arg Leu Thr Leu Ala Ser Lys Pro Lys Thr Ser

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Gln Pro Val Tyr Arg Glu Arg Ile Ala Tyr Thr Tyr Met Asp Glu Asp

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Leu Pro Thr Thr Glu Tyr Ile Ser Pro Asn Glu Asp Gly Thr Phe Thr

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Leu Pro Glu Glu Ala Glu Thr Met Glu Gly Ala Thr Val Pro Leu Lys

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Met Ser Asp Phe Thr Tyr Val Val Glu Asp Met Ala Gly Asn Ile Thr

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Tyr Thr Pro Val Thr Lys Leu Leu Glu Gly His Ser Asn Lys Pro Glu

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cgaaaaaaat caaccaaaga ttga 4944

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caacatctca ccaatacaga gttgagctca gctgaatcaa aacctcaaga cacatcacaa 120

atcactctca agacaaatcg tgaaaaagag caaccacaag gtctagtctc tgagccaacc 180

acaactgagc tagctgacac agatgcagca ccaatggcta atacaggtcc tgatgcgact 240

caaaaaagcg cttctttacc gccagtcaat acagatgttc acgattgggt aaaaaccaaa 300

ggagcttggg acaagggata caaaggacaa ggcaaggttg tcgcagttat tgacacaggg 360

atcgatccgg cccatcaaag catgcgcatc agtgatgtat caactgctaa agtaaaatca 420

aaagaagaca tgctagcacg ccaaaaagcc gccggtatta attatgggag ttggataaat 480

gataaagttg tttttgcaca taattatgtg gaaaatagcg ataatatcaa agaaaatcaa 540

ttcgaggatt ttgatgagga ctgggaaaac tttgagtttg atgcagaggc agagccaaaa 600

gccatcaaaa aacacaagat ctatcgtccc caatcaaccc aggcaccgaa agaaactgtt 660

atcaaaacag aagaaacaga tggttcacat gatattgact ggacacaaac agacgatgac 720

accaaatacg agtcacacgg tatgcatgtg acaggtattg tagccggtaa tagcaaagaa 780

gccgctgcta ctggagaacg ctttttagga attgcaccag aggcccaagt catgttcatg 840

cgtgtttttg ccaacgacgt catgggatca gctgaatcac tctttatcaa agctatcgaa 900

gatgccgtgg ctttaggagc agatgtgatc aacctgagtc ttggaaccgc taatggggca 960

cagcttagtg gcagcaagcc tctaatggaa gcaattgaaa aagctaaaaa agccggtgta 1020

tcagttgttg tagcagcagg aaatgagcgc gtctatggat ctgaccatga tgatccattg 1080

gcaacaaatc cagactatgg tttggtcggt tctccctcaa caggtcgaac accaacatca 1140

gtggcagcta taaacagtaa gtgggtgatt caacgtctaa tgacggtcaa agaattagaa 1200

aaccgtgccg atttaaacca tggtaaagcc atctattcag agtctgtcga ctttaaaaac 1260

ataaaagata gcctaggtta tgataaatcg catcaatttg cttatgtcaa agagtcaact 1320

gatgcgggtt ataacgcaca aaacgttaaa ggtaaaattg ctttaattga acgtgatccc 1380

aataaaacct atgacgaaat gattgctttg gctaagaaac atggagccct gggagtactt 1440

atttttaata acaagcctgg tcaatcaaac cgctcaatgc gcctaacagc taatgggatg 1500

gggataccat ctgctttcat atcgcacgaa tttggtaagg ccatgtccca attaaatggc 1560

aatggtacag gaagtttaga gtttgacagt gtggtctcaa aagcaccgag tcaaaaaggc 1620

aatgaaatga atcatttttc aaattggggc ctaacctctg atctcgagca ccaccaccac 1680

caccactga 1689

<210> 12

<211> 562

<212> PRT

<213> SCPC

<400> 12

Met Asp Glu Leu Thr Thr Thr Ser Glu Pro Thr Ile Thr Asn His Thr

1 5 10 15

Gln Gln Gln Ala Gln His Leu Thr Asn Thr Glu Leu Ser Ser Ala Glu

20 25 30

Ser Lys Pro Gln Asp Thr Ser Gln Ile Thr Leu Lys Thr Asn Arg Glu

35 40 45

Lys Glu Gln Pro Gln Gly Leu Val Ser Glu Pro Thr Thr Thr Glu Leu

50 55 60

Ala Asp Thr Asp Ala Ala Pro Met Ala Asn Thr Gly Pro Asp Ala Thr

65 70 75 80

Gln Lys Ser Ala Ser Leu Pro Pro Val Asn Thr Asp Val His Asp Trp

85 90 95

Val Lys Thr Lys Gly Ala Trp Asp Lys Gly Tyr Lys Gly Gln Gly Lys

100 105 110

Val Val Ala Val Ile Asp Thr Gly Ile Asp Pro Ala His Gln Ser Met

115 120 125

Arg Ile Ser Asp Val Ser Thr Ala Lys Val Lys Ser Lys Glu Asp Met

130 135 140

Leu Ala Arg Gln Lys Ala Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Ser Trp Ile Asn

145 150 155 160

Asp Lys Val Val Phe Ala His Asn Tyr Val Glu Asn Ser Asp Asn Ile

165 170 175

Lys Glu Asn Gln Phe Glu Asp Phe Asp Glu Asp Trp Glu Asn Phe Glu

180 185 190

Phe Asp Ala Glu Ala Glu Pro Lys Ala Ile Lys Lys His Lys Ile Tyr

195 200 205

Arg Pro Gln Ser Thr Gln Ala Pro Lys Glu Thr Val Ile Lys Thr Glu

210 215 220

Glu Thr Asp Gly Ser His Asp Ile Asp Trp Thr Gln Thr Asp Asp Asp

225 230 235 240

Thr Lys Tyr Glu Ser His Gly Met His Val Thr Gly Ile Val Ala Gly

245 250 255

Asn Ser Lys Glu Ala Ala Ala Thr Gly Glu Arg Phe Leu Gly Ile Ala

260 265 270

Pro Glu Ala Gln Val Met Phe Met Arg Val Phe Ala Asn Asp Val Met

275 280 285

Gly Ser Ala Glu Ser Leu Phe Ile Lys Ala Ile Glu Asp Ala Val Ala

290 295 300

Leu Gly Ala Asp Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Thr Ala Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gln Leu Ser Gly Ser Lys Pro Leu Met Glu Ala Ile Glu Lys Ala Lys

325 330 335

Lys Ala Gly Val Ser Val Val Val Ala Ala Gly Asn Glu Arg Val Tyr

340 345 350

Gly Ser Asp His Asp Asp Pro Leu Ala Thr Asn Pro Asp Tyr Gly Leu

355 360 365

Val Gly Ser Pro Ser Thr Gly Arg Thr Pro Thr Ser Val Ala Ala Ile

370 375 380

Asn Ser Lys Trp Val Ile Gln Arg Leu Met Thr Val Lys Glu Leu Glu

385 390 395 400

Asn Arg Ala Asp Leu Asn His Gly Lys Ala Ile Tyr Ser Glu Ser Val

405 410 415

Asp Phe Lys Asn Ile Lys Asp Ser Leu Gly Tyr Asp Lys Ser His Gln

420 425 430

Phe Ala Tyr Val Lys Glu Ser Thr Asp Ala Gly Tyr Asn Ala Gln Asn

435 440 445

Val Lys Gly Lys Ile Ala Leu Ile Glu Arg Asp Pro Asn Lys Thr Tyr

450 455 460

Asp Glu Met Ile Ala Leu Ala Lys Lys His Gly Ala Leu Gly Val Leu

465 470 475 480

Ile Phe Asn Asn Lys Pro Gly Gln Ser Asn Arg Ser Met Arg Leu Thr

485 490 495

Ala Asn Gly Met Gly Ile Pro Ser Ala Phe Ile Ser His Glu Phe Gly

500 505 510

Lys Ala Met Ser Gln Leu Asn Gly Asn Gly Thr Gly Ser Leu Glu Phe

515 520 525

Asp Ser Val Val Ser Lys Ala Pro Ser Gln Lys Gly Asn Glu Met Asn

530 535 540

His Phe Ser Asn Trp Gly Leu Thr Ser Asp Leu Glu His His His His

545 550 555 560

His His

<210> 13

<211> 1713

<212> DNA

<213> SLO

<400> 13

atgtctaata aaaaaacatt taaaaaatac agtcgcgtcg ctgggctact gacggcagct 60

cttatcattg gtaaccttgt tactgctaat gctgaatcga acaaacaaaa cactgctagt 120

acagaaacca caacgacaaa tgagcaacca aagccagaaa gtagtgagct aactactgaa 180

aaagcaggtc agaaaacgga tgatatgctt aactctaacg atatgattaa gcttgctccc 240

aaagaaatgc cactagaatc tgcagaaaaa gaagaaaaaa agtcagaaga caaaaaaaag 300

agcgaagaag atcacactga agaaatcaat gacaagattt attcactaaa ttataatgag 360

cttgaagtac ttgctaaaaa tggtgaaacc attgaaaatt ttgttcctaa agaaggcgtt 420

aagaaagctg ataaatttat tgtcattgaa agaaagaaaa aaaatatcaa cactacacca 480

gtcgatattt ccattattga ctctgtcact gataggacct atccagcagc ccttcagctg 540

gctaataaag gttttaccga aaacaaacca gacgcggtag tcaccaagcg aaacccacaa 600

aaaatccata ttgatttacc aggtatggga gacaaagcaa cggttgaggt caatgaccct 660

acctatgcca atgtttcaac agctattgat aatcttgtta accaatggca tgataattat 720

tctggtggta atacgcttcc tgccagaaca caatatactg aatcaatggt atattctaag 780

tcacagattg aagcagctct aaatgttaat agcaaaatct tagatggtac tttaggcatt 840

gatttcaagt cgatttcaaa aggtgaaaag aaggtgatga ttgcagcata caagcaaatt 900

ttttacaccg tatcagcaaa ccttcctaat aatcctgcgg atgtgtttga taaatcggtg 960

acctttaaag agttgcaacg aaaaggtgtc agcaatgaag ctccgccact ctttgtgagt 1020

aacgtagcct atggtcgaac tgtttttgtc aaactagaaa caagttctaa aagtaatgat 1080

gttgaagcgg cctttagtgc agctctaaaa ggaacagatg ttaaaactaa tggaaaatat 1140

tctgatatct tagaaaatag ctcatttaca gctgtcgttt taggaggaga tgctgcagag 1200

cacaataagg tagtcacaaa agactttgat gttattagaa acgttatcaa agacaatgct 1260

accttcagta gaaaaaaccc agcttatcct atttcataca ccagtgtttt ccttaaaaat 1320

aataaaattg cgggtgtcaa taacagaact gaatacgttg aaacaacatc taccgagtac 1380

actagtggaa aaattaacct gtctcatcaa ggcgcgtatg ttgctcaata tgaaatcctt 1440

tgggatgaaa tcaattatga tgacaaagga aaagaagtga ttacaaaacg acgttgggac 1500

aacaactggt atagtaagac atcaccattt agcacagtta tcccactagg agctaattca 1560

cgaaatatcc gtatcatggc tagagagtgc actggcttag cttgggaatg gtggcgaaaa 1620

gtgatcgacg aaagagatgt gaaactgtct aaagaaatca atgtcaatat ctcaggatca 1680

accttgagcc catatggttc gattacttat aag 1713

<210> 14

<211> 1653

<212> DNA

<213> SLO

<400> 14

atgggcgaat cgaacaaaca aaacactgct agtacagaaa ccacaacgac aaatgagcaa 60

ccaaagccag aaagtagtga gctaactact gaaaaagcag gtcagaaaac ggatgatatg 120

cttaactcta acgatatgat taagcttgct cccaaagaaa tgccactaga atctgcagaa 180

aaagaagaaa aaaagtcaga agacaaaaaa aagagcgaag aagatcacac tgaagaaatc 240

aatgacaaga tttattcact aaattataat gagcttgaag tacttgctaa aaatggtgaa 300

accattgaaa attttgttcc taaagaaggc gttaagaaag ctgataaatt tattgtcatt 360

gaaagaaaga aaaaaaatat caacactaca ccagtcgata tttccattat tgactctgtc 420

actgatagga cctatccagc agcccttcag ctggctaata aaggttttac cgaaaacaaa 480

ccagacgcgg tagtcaccaa gcgaaaccca caaaaaatcc atattgattt accaggtatg 540

ggagacaaag caacggttga ggtcaatgac cctacctatg ccaatgtttc aacagctatt 600

gataatcttg ttaaccaatg gcatgataat tattctggtg gtaatacgct tcctgccaga 660

acacaatata ctgaatcaat ggtatattct aagtcacaga ttgaagcagc tctaaatgtt 720

aatagcaaaa tcttagatgg tactttaggc attgatttca agtcgatttc aaaaggtgaa 780

aagaaggtga tgattgcagc atacaagcaa attttttaca ccgtatcagc aaaccttcct 840

aataatcctg cggatgtgtt tgataaatcg gtgaccttta aagagttgca acgaaaaggt 900

gtcagcaatg aagctccgcc actctttgtg agtaacgtag cctatggtcg aactgttttt 960

gtcaaactag aaacaagttc taaaagtaat gatgttgaag cggcctttag tgcagctcta 1020

aaaggaacag atgttaaaac taatggaaaa tattctgata tcttagaaaa tagctcattt 1080

acagctgtcg ttttaggagg agatgctgca gagcacaata aggtagtcac aaaagacttt 1140

gatgttatta gaaacgttat caaagacaat gctaccttca gtagaaaaaa cccagcttat 1200

cctatttcat acaccagtgt tttccttaaa aataataaaa ttgcgggtgt caataacaga 1260

actgaatacg ttgaaacaac atctaccgag tacactagtg gaaaaattaa cctgtctcat 1320

caaggcgcgt atgttgctca atatgaaatc ctttgggatg aaatcaatta tgatgacaaa 1380

ggaaaagaag tgattacaaa acgacgttgg gacaacaact ggtatagtaa gacatcacca 1440

tttagcacag ttatcccact aggagctaat tcacgaaata tccgtatcat ggctagagag 1500

tgcactggct tagcttggga atggtggcga aaagtgatcg acgaaagaga tgtgaaactg 1560

tctaaagaaa tcaatgtcaa tatctcagga tcaaccttga gcccatatgg ttcgattact 1620

tataagctcg agcaccacca ccaccaccac tga 1653

<210> 15

<211> 550

<212> PRT

<213> SLO

<400> 15

Met Gly Glu Ser Asn Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr

1 5 10 15

Thr Asn Glu Gln Pro Lys Pro Glu Ser Ser Glu Leu Thr Thr Glu Lys

20 25 30

Ala Gly Gln Lys Thr Asp Asp Met Leu Asn Ser Asn Asp Met Ile Lys

35 40 45

Leu Ala Pro Lys Glu Met Pro Leu Glu Ser Ala Glu Lys Glu Glu Lys

50 55 60

Lys Ser Glu Asp Lys Lys Lys Ser Glu Glu Asp His Thr Glu Glu Ile

65 70 75 80

Asn Asp Lys Ile Tyr Ser Leu Asn Tyr Asn Glu Leu Glu Val Leu Ala

85 90 95

Lys Asn Gly Glu Thr Ile Glu Asn Phe Val Pro Lys Glu Gly Val Lys

100 105 110

Lys Ala Asp Lys Phe Ile Val Ile Glu Arg Lys Lys Lys Asn Ile Asn

115 120 125

Thr Thr Pro Val Asp Ile Ser Ile Ile Asp Ser Val Thr Asp Arg Thr

130 135 140

Tyr Pro Ala Ala Leu Gln Leu Ala Asn Lys Gly Phe Thr Glu Asn Lys

145 150 155 160

Pro Asp Ala Val Val Thr Lys Arg Asn Pro Gln Lys Ile His Ile Asp

165 170 175

Leu Pro Gly Met Gly Asp Lys Ala Thr Val Glu Val Asn Asp Pro Thr

180 185 190

Tyr Ala Asn Val Ser Thr Ala Ile Asp Asn Leu Val Asn Gln Trp His

195 200 205

Asp Asn Tyr Ser Gly Gly Asn Thr Leu Pro Ala Arg Thr Gln Tyr Thr

210 215 220

Glu Ser Met Val Tyr Ser Lys Ser Gln Ile Glu Ala Ala Leu Asn Val

225 230 235 240

Asn Ser Lys Ile Leu Asp Gly Thr Leu Gly Ile Asp Phe Lys Ser Ile

245 250 255

Ser Lys Gly Glu Lys Lys Val Met Ile Ala Ala Tyr Lys Gln Ile Phe

260 265 270

Tyr Thr Val Ser Ala Asn Leu Pro Asn Asn Pro Ala Asp Val Phe Asp

275 280 285

Lys Ser Val Thr Phe Lys Glu Leu Gln Arg Lys Gly Val Ser Asn Glu

290 295 300

Ala Pro Pro Leu Phe Val Ser Asn Val Ala Tyr Gly Arg Thr Val Phe

305 310 315 320

Val Lys Leu Glu Thr Ser Ser Lys Ser Asn Asp Val Glu Ala Ala Phe

325 330 335

Ser Ala Ala Leu Lys Gly Thr Asp Val Lys Thr Asn Gly Lys Tyr Ser

340 345 350

Asp Ile Leu Glu Asn Ser Ser Phe Thr Ala Val Val Leu Gly Gly Asp

355 360 365

Ala Ala Glu His Asn Lys Val Val Thr Lys Asp Phe Asp Val Ile Arg

370 375 380

Asn Val Ile Lys Asp Asn Ala Thr Phe Ser Arg Lys Asn Pro Ala Tyr

385 390 395 400

Pro Ile Ser Tyr Thr Ser Val Phe Leu Lys Asn Asn Lys Ile Ala Gly

405 410 415

Val Asn Asn Arg Thr Glu Tyr Val Glu Thr Thr Ser Thr Glu Tyr Thr

420 425 430

Ser Gly Lys Ile Asn Leu Ser His Gln Gly Ala Tyr Val Ala Gln Tyr

435 440 445

Glu Ile Leu Trp Asp Glu Ile Asn Tyr Asp Asp Lys Gly Lys Glu Val

450 455 460

Ile Thr Lys Arg Arg Trp Asp Asn Asn Trp Tyr Ser Lys Thr Ser Pro

465 470 475 480

Phe Ser Thr Val Ile Pro Leu Gly Ala Asn Ser Arg Asn Ile Arg Ile

485 490 495

Met Ala Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Lys Val

500 505 510

Ile Asp Glu Arg Asp Val Lys Leu Ser Lys Glu Ile Asn Val Asn Ile

515 520 525

Ser Gly Ser Thr Leu Ser Pro Tyr Gly Ser Ile Thr Tyr Lys Leu Glu

530 535 540

His His His His His His

545 550

Claims (10)

1.一种疫苗，其活性成分由成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己组成；

所述成分甲为分选酶A、具有所述分选酶A全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述分选酶A全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述分选酶A全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述分选酶A全长或部分编码基因DNA表达载体；

所述成分乙为C5a蛋白酶、具有所述C5a蛋白酶全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述C5a蛋白酶全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述C5a蛋白酶全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述C5a蛋白酶全长或部分编码基因DNA表达载体；

所述成分丙为Spy0269、具有所述Spy0269全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述Spy0269全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述Spy0269全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述Spy0269全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分丁为SCPC、具有所述SCPC全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述SCPC全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述SCPC全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述SCPC全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分戊为SLO、具有所述SLO全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述SLO全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述SLO全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述SLO全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分己为免疫佐剂CpG；

所述疫苗的功能为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：

(Ⅰ)预防A型链球菌感染；

(Ⅱ)预防A型链球菌导致的人粘膜系统感染；

(Ⅲ)降低或防止A型链球菌在人粘膜系统的定居和感染；

所述成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己的质量配比为1:1:1:1:1:1。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：

所述分选酶A、Spy0269、SCPC、SLO为从革兰氏阳性菌中提取的分选酶A、Spy0269、SCPC、SLO；

或大肠杆菌表达的分选酶A、Spy0269、SCPC、SLO；

或酵母表达的分选酶A、SCPA、Spy0269、SCPC、SLO；

或哺乳动物细胞表达的分选酶A、SCPA、Spy0269、SCPC、SLO。

3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述分选酶A为大肠杆菌表达的重组蛋白、酵母表达的重组蛋白或哺乳动物细胞表达的重组蛋白形式的分选酶A。

4.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述酵母表达为酿酒酵母表达、汉逊酵母表达或毕氏酵母表达。

5.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述分选酶A、Spy0269、SCPC、SLO源自A型链球菌但不限于A型链球菌。

6.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述多糖为A型链球菌的多糖、B型链球菌的荚膜多糖或肺炎球菌的荚膜多糖。

7.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：

所述分选酶A为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1自N末端第22至189位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

所述具有所述分选酶A全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为如下(c)或(d)：

(c)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

所述Spy0269为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列3自N末端第37至849位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

所述具有所述Spy0269全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为如下(c)或(d)：

(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

所述SCPC为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列4自N末端第37至587位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

所述具有所述SCPC全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为如下(c)或(d)：

(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

所述SLO为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列5自N末端第32至571位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

所述具有所述SLO全长或部分氨基酸序列的融合蛋白为如下(c)或(d)：

(c)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。

8.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述人粘膜系统为呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统或皮肤。

9.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗的使用方式包括鼻腔吸入、口服、皮下注射、皮内注射、生殖道注入或肛内注入。

10.一种疫苗在制备预防A型链球菌感染的疾病药物中用途。