MX2011002760A - Vacunas y terapeuticos de combinacion contra el estreptococo del grupo a. - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones útiles para reducir el riesgo de, prevenir, y/o tratar infecciones de S. pyogenes (GAS) que comprenden combinaciones de antígenos de GAS, moléculas de ácido nucleico que codifican los antígenos, o anticuerpos que se enlazan específicamente a los antígenos.

Description

VACUNAS Y TERAPEUTICOS DE COMBINACION CONTRA EL ESTREPTOCOCO DEL GRUPO A Campo de la Invención La invención se refiere a los campos de inmunología y vacunología.

Antecedentes de la Invención El estreptococo del grupo A ("GAS" por sus siglas en inglés, S. pyogenes) es un patógeno humano frecuente, estimado para estar presente entre 5-15% de los individuos normales sin signos de enfermedad. Una infección aguda ocurre, sin embargo, cuando las defensas del hospedero están comprometidas, cuando el organismo es capaz de ejercer su virulencia, o cuando el organismo se introduce a tejidos vulnerables o a los hospederos. Las enfermedades relacionadas incluyen fiebre puerperal, escarlatina, erisipelas, faringitis, impétigo, fascitis necrotizante , miositis y síndrome de choque tóxico estreptocócico .

Los esfuerzos para desarrollar una vacuna profiláctica para el uso contra el GAS han estado en marcha desde hace muchas décadas. Actualmente, sin embargo, no existen vacunas contra el GAS disponibles al público. Existe una necesidad en la técnica por tales vacunas.

REF. :218598 Breve Descripción de las Figuras FIGURA 1. Gráfica que muestra la capacidad protectora de combinaciones de antígenos de GAS en un modelo de ratón de estimulación subcutánea. "GAS57", Spy0416; "GAS25" , Spy0167; "GAS40" , Spy0269 (SEQ ID NO: 177); "dGAS57", mutante de Spy0167 D151A/S617A (SEQ ID NO: 198); "dGAS25", mutante P427L/W535F de Spy0167 (SEQ ID NO: 125).

FIGURA 2. Fotomicrografía en geles de SDS-poliacrilamida que muestran el mutante puntual del Spy0416 D151A que tiene perdida la capacidad de escindir la IL-8. "57" , Spy0416 (GAS57 ) .

FIGURA 3. Gráfica que muestra los resultados de un ensayo ELISA que muestra el mutante puntual del Spy0416 D151A que tiene perdida la capacidad de escindir la IL-8.

FIGURA 4A-FIGURA 4B. Fotomicrografías de geles de SDS-poliacrilamida que muestran los mutantes únicos del Spy0416 D151A y S617A y el mutante D151A + S617A que tienen perdida la actividad proteolítica del Spy0416.

FIGURA 5. Gráfica que muestra los resultados de un ensayo ELISA que muestra los mutantes únicos D151A y S617A y el mutante de Spy0416 D151A + S617A que tienen perdida la actividad proteolítica del Spy0416 ("57") .

FIGURA 6. Fotomicrografía de un gel de SDS-poliacrilamida que muestra que el Spy0416 de tipo silvestre se modifica pos-traduccionalmente en dos fragmentos de polipéptido de 150.5 kDa y 23.4 kDa.

FIGURA 7. Fotomicrografía en gel de SDS-poliacrilamida que muestra los mutantes D251A, S617A, y D151A + S617A de Spy0416 que no se modifican pos-traduccionalmente en dos fragmentos de polipéptido de 150.5 kDa y 23.4 kDa comparados con el de tipo silvestre (flechas negras) . Una banda principal de 174 kDa corresponde a la proteína no procesadas en cambio está presente en las líneas que corresponden a las cepas mutantes inactivas (flecha gris) . "57", Spy0416.

FIGURA 8A-Figura 8B . Los resultados del ensayo ELISA muestran la inhibición dependiente de dosis de la escisión de la IL-8 mediada por Spy0416 por antisueros policlonales contra el Spy0416 ("57") en dos condiciones experimentales diferentes. FIGURA 8A, incubación de 8 horas, 0.1 pg/ml de Spy0416. FIGURA 8B, incubación de 24 horas, 0.05 g/ml de Spy0416.

FIGURA 9. Gráfica que muestra los resultados del ensayo hemolítico usando extractos de E. coli que contienen Spy0167 de tipo silvestre y mutante P427L de Spy0167.

FIGURA 10. Fotomicrografía en gel de SDS-poliacrilamida que muestra el mutante P427L de Spy0167 purificado .

FIGURA 11. Gráfica que muestra los resultados del ensayo hemolítico usando el Spy0167 de tipo silvestre y el mutante P427L de Spy0167.

FIGURA 12. Fotomicrografía en gel de SDS-poliacrilamida de sobrenadantes del lisado de E. coli. Línea A, control negativo de E. coli; línea B, rSpy0167 de tipo silvestre, sin etiqueta; línea C, rSpy0167 P427L, sin etiqueta; y línea D, rSpy0167 purificado de tipo silvestre, sin etiqueta (5 mg) .

FIGURA 13. Gráfica que muestra que bajo las mismas condiciones, el mutante P427L de Spy0167 es 1000 veces menos hemolítico que el Spy0167 de tipo silvestre.

FIGURA 14. Gráfica que muestra los efectos del colesterol en la hemolisis por el Spy0167 de tipo silvestre y el mutante P427L de Spy0167.

FIGURAS 15A-15B. Fotomicrografías del análisis SDS-PAGE de proteínas sin etiqueta totales en los extractos celulares. FIGURA 15A, expresión del Spy0167 de tipo silvestre y las proteínas sin etiqueta P427L; FIGURA 15B, expresión del P427L de Spy0167 + W535, P427L + C530G, y P427L + C530G + proteínas sin etiqueta 535F.

FIGURA 16. Fotomicrografía del análisis SDS-PAGE de las proteínas etiquetadas con His totales en los extractos celulares .

FIGURA 17. Fotomicrografía del análisis SDS-PAGE de las proteínas etiquetadas con His purificadas.

FIGURAS 18A-18B. Fotomicrografías del análisis SDS- PAGE de las proteínas sin etiqueta purificadas. FIGURA 18A, Líneas: A, Spy0167 de tipo silvestre sin etiqueta; B, Spy0167 P427L sin etiqueta; marcadores de peso molecular (116-66.2-45-35-25-18.4-14.4); la flecha negra indica la proteína de Spy0167 purificada de clones mutantes y de tipo silvestre. FIGURA 18B, línea A, Spy0167 de tipo silvestre sin etiqueta (3 g) , línea B, P427L-W535F de Spy0167 sin etiqueta (3yg) ; marcadores de peso molecular (116-66.2-45-35-25-18.4-14.4); la flecha negra indica la proteína de Spy0167 purificada de clores mutantes y de tipo silvestre.

FIGURA 19. Fotomicrografía del análisis SDS-PAGE de la proteína de Spy0167 de tipo silvestre sin etiqueta purificada ( "GAS25" ) . Las muestras de diferentes lotes de purificación del Spy0167 de tipo silvestre se analizaron bajo condiciones de reducción y no de reducción.

FIGURA 20. Gráfica que muestra los resultados de las pruebas de hemolisis de los mutantes de Spy0167 etiquetado con His.

FIGURA 21. Gráfica que muestra la inhibición de la actividad hemolítica inducida por Spy0167 por el antisuero anti-Spy0167.

FIGURA 22. Gráfica que muestra la titulación de la inhibición del antisuero anti-Spy0167 de la hemolisis del Spy0167.

FIGURA 23. Gráfica que muestra la titulación de la actividad hemolítica del Spy0167.

FIGURA 24. Gráfica que muestra la titulación de la actividad hemolítica del Spy0167 de tipo silvestre, Spy0167 de tipo silvestre químicamente destoxificado y mutantes de Spy0167 (P427L; P427L + W535F) .

FIGURA 25. Gráfica que muestra la titulación de la actividad hemolítica del Spy0167 de tipo silvestre y los mutantes de Spy0167 (P427L; P427L + 535F) .

FIGURA 26. Gráfica que muestra la titulación de la actividad hemolítica del Spy0167 de tipo silvestre y el Spy0167 de tipo silvestre químicamente destoxificado .

FIGURA 27. Gráfica que muestra la dilución del antisuero contra el mutante de Spy0167 ("gas25") P427L + W535F requerido para obtener 50% de reducción de la actividad hemolítica del Spy0167 (50 ng/ml de Spy0167) .

FIGURA 28. Gráfica que muestra la dilución del antisuero contra el mutante de Spy0167 ("gas25") P427L + W535F requerida para obtener 50% de reducción de la actividad hemolítica del Spy0167 (100 ng/ml de Spy0167) .

FIGURA 29. Curva de titulación que muestra que los ensayos de inhibición de hemolisis se realizaron con concentraciones de toxinas que permiten 100% de hemolisis.

FIGURA 30. Es una gráfica que muestra el porcentaje de supervivencia contra el mutante de Spy0167 P427L-W535F, con ya sea Alumbre o MF59 como adyuvantes, y se estimularon intranasalmente con una cepa de GAS MI .

FIGURA 31A-31GG. Alineaciones de los antígenos de Spy0416 ("gas57") de diferentes cepas/tipos M. la triada catalítica (D, H, S) está en carácteres en negritas. FIGURA 31A, aminoácidos 1-50 (número de aminoácidos en la parte superior de cada una de la FIGURA 10A y Figura 10-GG se refiere a la secuencia de aminoácidos de Spy0416Ml_SF370, SEQ ID NO: 1); FIGURA 31B, aminoácidos 51-100; FIGURA 31C, aminoácidos 101-150 FIGURA 31C; FIGURA 31D, aminoácidos 151-200 FIGURA 31C; FIGURA 31E, aminoácidos 201-250 FIGURA 31C; FIGURA 31F, aminoácidos 251-300 FIGURA 31C; FIGURA 31G, aminoácidos 301-350; FIGURA 31H, aminoácidos 351-400, FIGURA 311, aminoácidos 401-450; FIGURA 31J, aminoácidos 451-500; FIGURA 31K, aminoácidos 501-550; FIGURA 31L, aminoácidos 551-600; FIGURA 31M, aminoácidos 601-650; FIGURA 31N, aminoácidos 651-700; FIGURA 310, aminoácidos 701-750; FIGURA 31P, aminoácidos 751-800; FIGURA 31Q, aminoácidos 801-850; FIGURA 3IR, aminoácidos 851-900; FIGURA 31S, aminoácidos 901-950; FIGURA 3IT, aminoácidos 951-1000; FIGURA 31U, aminoácidos 1001-1050; FIGURA 31V, aminoácidos 1051-1100; FIGURA 31W, aminoácidos 1101-1150; FIGURA 31X, aminoácidos 1151-1200; FIGURA 31Y, aminoácidos 1201-1250; FIGURA 31Z, aminoácidos 1251-1300; FIGURA 31AA, aminoácidos 1301-1350; FIGURA 31BB, aminoácidos 1351-1400; FIGURA 31CC, aminoácidos 1401-1450; FIGURA 31DD, aminoácidos 1451-1500; FIGURA 31EE, aminoácidos 1501-1550; FIGURA 31FF, aminoácidos 1551-1600; FIGURA 31GG, aminoácidos 1601-1650. M1_SF37Ú, SEQ ID NO:l; Ml_31075, SEQ ID NO: 2; Ml_31237, SEQ ID NO: 3; Ml_3348, SEQ ID NO:4; M2 34585, SEQ ID NO:5; 3,l_21398, SEQ ID NO:6; M44-61 20839, SEQ ID NO: 7; M6,31_20022, SEQ ID NO: 8; Mll_20648, SEQ ID NO: 9; M23_2071, SEQ ID NO: 10; M18 , 3_40128, SEQ ID NO: 11; 4_10092, SEQ ID NO: 12; M4_30968, SEQ ID NO: 13; M6,31_22692, SEQ ID NO: 14; M68,5_22814, SEQ ID NO.15; M68_23623, SEQ ID NO: 16; 2_10064, SEQ ID NO: 17; M2_10065, SEQ ID NO: 18; M77_10251, SEQ ID NO: 19; M77J0527, SEQ ID NO: 20; M77_20696, SEQ ID NO: 21; M89_21915, SEQ ID NO: 22; M89_23717, SEQ ID NO: 23; M94_10134, SEQ ID NO: 24; M28_10164, SEQ ID NO:25; M28_10218, SEQ ID NO:26; M29J0266, SEQ ID NO: 27; M28J0299, SEQ ID NO: 28; M28_30176, SEQ ID NO: 29; M28_30574, SEQ ID NO: 30; M6,9_21802, SEQ ID NO: 31; M75_10012, SEQ ID NO: 32; M75_20671, SEQ ID NO:33; M75_30603, SEQ ID NO:34; M75_30207, SEQ ID NO:35; M22_20641, SEQ ID NO:36; M22 23465, SEQ ID NO:37; M3,l_30610, SEQ ID NO:38; M3,l_40603, SEQ ID NO:39; M3,28_24214, SEQ ID NO:40; M3,34_10307, SEQ ID NO:41; M4_40427, SEQ ID NO:42; M3_2721, SEQ ID NO:43; M12 10296, SEQ ID NO:44; M12_10035, SEQ ID NO:45; M12_20069, SEQ ID NO:46; M12_22432, SEQ ID NO:47; M440499, SEQ ID NO:48; y M6, 1_21259, SEQ ID NO:49.

FIGURAS 32A-32R Alineaciones de antígenos de Spy0269 ("gas40'") de diferentes cepas/tipos M. FIGURA 32A, aminoácidos 1-50 (números de aminoácidos en la parte superior de cada una de las FIGURAS 10A-GG se refieren a la secuencia de aminoácidos de Spy0269Ml_SF370 , SEQ ID NO:50); FIGURA 32B, aminoácidos 51-100; FIGURA 32C, aminoácidos 101-150; FIGURA 32D, aminoácidos 151-200; FIGURA 32E, aminoácidos 201-250; FIGURA 32F( aminoácidos 251-300; FIGURA 32G, aminoácidos 301-350; FIGURA 32H, aminoácidos 351-400, FIGURA 321, aminoácidos 401-450; FIGURA 32J, aminoácidos 451-500; FIGURA 32K, aminoácidos 501-550; FIGURA32L, aminoácidos 551- 600; FIGURA 32M, aminoácidos 601-650; FIGURA 32N, aminoácidos 651-700; FIGURA 320, aminoácidos 701-750; FIGURA 32P, aminoácidos 751-800; FIGURA 32Q, aminoácidos 801-850; FIGURA 32R, aminoácidos 851-874. M1_SF370, SEQ ID NO: 50; clinicalisolato_40s88 , SEQ ID NO: 51; Mll_2727, SEQ ID NO:52; M22_20641, SEQ ID NO:53; M22_23465, SEQ ID NO:54; M22_23621, SEQ ID NO:55; M3.1_30610, SEQ ID NO: 56; M3.1_40603, SEQ ID NO: 57; M3.34_10307, SEQ ID NO: 58; M3 MGAS315, SEQ ID NO: 59; M4_40427, SEQ ID NO: 60; M3_2721, SEQ ID NO:61; M3_3040, SEQ ID NO:62; M3_3135, SEQ ID NO: 63; M12_10035, SEQ ID NO: 64; M12_22432, SEQ ID NO: 65; 4_40499, SEQ ID NO:66; M78_3789, SEQ ID NO:67; M89J0070, SEQ ID NO:68; M89_21915, SEQ ID NO:69; M89_23717, SEQ ID NO:70; M89_5476, SEQ ID NO:71; M23_DSM2071, SEQ ID NO: 72; M4_2722, SEQ ID NO: 73; M4J0092, SEQ ID NO: 74; M4_30968, SEQ ID NO: 75; M4_2634, SEQ ID NO: 76; M28J0164, SEQ ID NO: 77; M28_10218, SEQ ID NO:78; M28_10266, SEQ ID NO:79; M28J0299, SEQ IDNO:80; M28_30176, SEQ ID NO: 81; M28_4436, SEQ ID NO: 82; M8_2725, SEQ ID NO: 83; M44_3776, SEQ ID NO: 84; M6_2724, SEQ ID NO: 85; M6_2894, SEQ ID NO: 86; M6_3650, SEQ ID NO: 87; M6_5529, SEQ ID NO: 88; M5 , SEQ ID NO: 89; M77 4959, SEQ ID NO: 90; M2J0064, SEQ ID NO: 91; M2_10065, SEQ ID NO: 92; M75_5531, SEQ ID NO: 93; M504538, SEQ ID NO : 94 ; M62 5455, SEQ ID NO: 95; 44 5481, SEQ ID NO: 96; M5 4883, SEQ ID NO: 97; M97 2720, SEQ ID NO: 98; M2 2726, SEQ ID NO:99; M12 20296, SEQ ID NO:100; Ml_2580, SEQ ID NO: 101; Ml_2913, SEQ ID NO: 102; MI 3280, SEQ ID NO: 103; Ml_3348, SEQ ID NO:104; M78_3789, SEQ ID NO: 105; M?_2719, SEQ ID NO: 106.

FIGURA 33A-FIGURA 33C. Alineaciones de antígenos de Spy0167 ("gas25") de diferentes cepas/tipos M. FIGURA 33A, aminoácidos 1-150 (números de aminoácidos en la parte superior de cada una de las FIGURAS 31A-31GG se refiere a la secuencia de aminoácidos de Spy0167Ml_SF370 , SEQ ID NO: 107) ; FIGURA 33B, aminoácidos 151-300; FIGURA 33C, aminoácidos 301- 500. M12_2096, SEQ ID NO: 108; M12_9429, SEQ ID NO : 109; Ml_5005, SEQ ID NO: 110; Ml_3348, SEQ ID NO: 111; M2J0270, SEQ IDNO:112; M28_6180, SEQ IDNO:13; M6J0394, SEQ ID NO: 114; M18_8232, SEQ ID NO: 115; M5_Manfredo, SEQ ID NO: 116; M3_315, SEQ ID NO: 117; M3 SSI, SEQ ID NO: 119; M4_10750, SEQ ID NO: 119.

FIGURA 34. Gráfica que muestra los resultados de los ensayos bactericidas de sangre entera que muestran que los anticuerpos anti-glicoconjugados (GC) median el extermino del S. pyogenes .

FIGURA 35. Gráfica que muestra los resultados de ios ensayos bactericidas de sangre entera que muestran que la combinación de los anticuerpos anti-glicoconjugados (GC) y anticuerpos generados contra las combinaciones de antígenos de GAS mejoran el exterminio del S. pyogenes . "Freund" , adyuvante de Freund; "MI", proteína MI de S. pyogenes; "COMBO", mutante de D151A/S617A de Spy0416, mutante P427L/W535F de Spy01675, y Spy0269 de tipo silvestre; "GC" , antígeno de polisacárido de GAS conjugado a CRM 197.

FIGURA 36A-36D.' Gráficas que muestran los resultados de los ensayos de toxicidad celular que compara varios antígenos con los controles positivos (factor de necrosis tumoral a, TNF-a) y negativos (NT, no tratado) . FIGURA 36A, Spy0269 (GAS40, SEQ ID NO: 177); FIGURA 36B, Spy0416 (GAS57 ) y mutante de GAS57 D151A/S617A (GAS57 DM, SEQ ID NO: 198); FIGURA 36C, Spy0167 (GAS25) y mutante de GAS25 P427L/W535F (GAS25 DM, SEQ ID NO: 125); FIGURA 36D, glicoconjugado (GC) .

FIGURA 37A-37D. Gráficas que muestran la validación del ensayo ELISA. FIGURA 37A, Spy0167 (GAS25) ; FIGURA 37B, Spy0269 (GAS40) ; FIGURA 37C, Spy0416 (GAS57 ) ; FIGURA 37D, glicoconjugado (GC) .

FIGURA 38A-38F. Gráficas que muestran los resultados de los ensayos ELISA que someten a prueba las dosis de antígenos individuales. FIGURA 38A, FIGURA 38D, dos experimentos de Spy0167 (GAS25) ; FIGURA, FIGURA 38E, Spy0416 (GAS57 ) (dos experimentos) ; FIGURA 38C, FIGURA 38F, Spy0269 (GAS40) (dos experimentos). "GMT" , títulos medios geométricos .

FIGURA 39. Gráfica que muestra los resultados de los ensayos ELISA y de estimulación que someten a prueba las combinaciones del mutante de Spy0416 D151 A/S617A (GAS57) , Spy0269 de tipo silvestre (GAS40) e intervalos de dosis del mutante P427L/W535F de Spy0167 (GAS25) en alumbre.

FIGURA 40. Análisis del modelo LogNormal adoptado como una primera aproximación del análisis de tiempo de supervivencia medio (MST; Mu) , que muestra que el Mu disminuye con la disminución de las dosis de Spy0167 (GAS25) .

FIGURA 41A-41B. Gráficas de barras que demuestran que los anticuerpos para Spy0419 y Spy0167 bloquean la actividad tóxica. FIGURA 41A, Spy0419 (GAS57) . FIGURA 41B, Spy0167 (GAS25) . El título se define como el factor de dilución requerido para neutralizar 50% de la hemolisis máxima .

Descripción Detallada de la Invención La invención proporciona composiciones de múltiples componentes que son útiles para tratar, reducir el riesgo de, y/o prevenir las infecciones de S. pyogenes. En algunas modalidades las composiciones de la invención son composiciones de vacuna que proporcionan profilaxis efectiva contra la faringitis causada por las infecciones de S. pyogenes en niños .

Composiciones de la invención son útiles para prevenir y/o tratar infecciones por S. pyogenes. Las composiciones de la invención comprenden combinaciones de antígenos de GAS, combinaciones de moléculas de ácido nucleico que codifican los antígenos de GAS, o combinaciones de anticuerpos que se enlazan específicamente a los antígenos de GAS. Composiciones de la invención comprenden combinaciones de dos o más antígenos de GAS, combinaciones de una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican los antígenos de GAS, o combinaciones de anticuerpos que se enlazan específicamente a los antígenos de GAS. Los antígenos de GAS son antígenos proteínicos del GAS. "Antígeno proteínico de GAS" , a menos que se define de otra manera abarca una proteína de GAS de longitud total así como también fragmentos, fusiones y mutantes de la proteína de GAS como se describe posteriormente. Algunas composiciones comprenden además un antígeno polisacárido de grupo A como se define posteriormente. La invención también incluye composiciones que comprenden mezclas de combinaciones de antígenos de GAS, combinaciones de moléculas de ácido nucleico que codifican los antígenos de GAS y combinaciones de anticuerpos que se enlazan específicamente a los antígenos de GAS.

Composiciones de la invención tienen preferiblemente una o más de las siguientes propiedades: • confieren estadísticamente protección significativa contra una o más cepas de S. pyogenes (por ejemplo. MI 3348, M12 EM5 , M23 2071, M6 S43); • inducen anticuerpos que median el exterminio bacteriano in vítro (exterminio opsonofagocítico) ; • inducen anticuerpos que inactivan la actividad hemolítica de la estreptolisina O; • inducen anticuerpos que bloquean la actividad de la proteasa del Spy0416; y/o • inducen anticuerpos que previenen la adición celular y/o división celular.

Como se describe en los ejemplos posteriormente, las composiciones de la invención proporcionan protección contra diferentes cepas de S. pyogenes adaptadas a ratones en modelos de estimulación letal; inducen anticuerpos funcionales que neutralizan toxinas potentes expresadas por un mayoría de cepas de S. pyogenes; y median el exterminio bacteriano in vitro.

Algunas composiciones de la invención comprenden una combinación de tres o más antígenos de GAS diferentes seleccionados de Spy0167 (también referido como estreptolisina O, Spy0167, o "GAS25" ) ; Spy0269 (también referido como "GAS40"); Spy0416 (también referido como "GAS57" ) ; Spy0714 (también referido como "GAS67" ) ; Spyl390 (también referido como "GAS89" ) ; Spy2000 (también referido como "GAS100"); una proteína de Spy0167 mutante como se define posteriormente; y un Spy0416 mutante como se define posteriormente .

En otras modalidades, las composiciones de la invención comprenden únicamente dos antígenos de GAS, aunque las composiciones pueden comprender antígenos de otros organismos así como también otros componentes, como se describe posteriormente. Algunas composiciones comprenden los dos antígenos de GAS, de Spy0167 y un segundo antígeno de GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0269; Spy0416; una proteína Spy0167 mutante como se describe posteriormente una proteína de Spy04l6 mutante como se describe posteriormente; Spy0714; Spyl390; y Spy2000.

Otras composiciones comprenden como los dos antígenos de GAS Spy0269 y un segundo antígeno de GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167, la proteína de Spy0167 mutante, la proteína de Spy0416 mutante, Spy0714, Spyl390 y Spy2000.

Algunas composiciones comprenden como los dos antígenos de GAS Spy0416 y un segundo antígeno de GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167, la proteína de Spy0167 mutante, la proteína de Spy0416 mutante, Spy0714, Spyl390 y Spy2000.

Otras composiciones comprenden como los dos antígeno de GAS la proteína de Spy0167 mutante y un segundo antígeno de GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167, Spy0269, Spy0416, la proteína de Spy0416 mutante, Spy0714, Spyl390, y Spy2000.

Otras composiciones comprenden como los dos antígenos de GAS la proteína de Spy0416 mutante y un segundo antígeno de GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167, Spy0269, Spy0416, la proteína de Spy0167 mutante, Spy0714, Spyl390, y Spy2000.

Algunas composiciones comprenden como los dos antígenos de GAS Spy0714 y un segundo antígeno de GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167, Spy0269, Spy0416, la proteína de Spy0167 mutante, la proteína de Spy0416 mutante, Spyl390 y Spy2000.

Algunas composiciones comprenden como los dos antígenos de GAS Spyl390 y un segundo antígeno de GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167, Spy0269, Spy0416, la proteína de Spy0167 mutante, la proteína de Spy0416 mutante, Spy0714 y Spy2000.

Otras composiciones comprenden como los dos antígenos de GAS Spy2000 y un segundo antígeno de GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167, Spy0269, Spy0416, la proteína de Spy0167 mutante, la proteína de Spy0416 mutante, Spy0714 y Spyl390.

Otros antígenos de GAS los cuales se pueden incluir en las composiciones de la invención incluyen Spy0019 (GAS5) , Spy0163 (GAS23 ) , Spy0385 (GAS56) , Spy0714 (GAS67) , Spy0737 (GAS68) , Spyl274 (GAS84 ) , Spyl361 (GAS88) , Spyl390 (GAS89), Spyl733 (GAS95) , Spyl882 (GAS98) , Spyl979 (GAS99) , Spy2000 (GAS100), Spy2016 (GAS102), Spy0591 (GAS 130), Spyll05 (GAS 159), Spyl718 (GAS179) , Spy2025 (GAS193) , Spy2043 (GAS195) , Spyl939 (GAS277) , Spyl625 (GAS372) , y Spyll34 (GAS561) .

Combinaciones preferidas de los antígenos de GAS incluyen lo siguiente, cada uno de los cuales también puede incluir un antígeno polisacárido de GAS, como se describe posteriormente y/o un adyuvante, tal como alumbre: i . Spy0167 y Spy0269; ii . Spy0167 , Spy0269, y Spy0416 ; iii . Spy0167 y Spy0416; iv . mutante P427L/ 535F de Spy0167 y Spy0269; V . mutante P427L/W535F de Spy0167, Spy0269, y Spy0416; vi . mutante P427L/W535F de Spy0167 y Spy0416; vii . mutante D151A/S617A de Spy0416y y Spy0269; viii. mutante D151A/S617A de Spy0167, Spy0269, Spy0416; ix. mutante de D151A/S617A de Spy0167 y Spy0416; x. mutante P427L/W535F de Spy0167, Spy0269, y mutante D151A/S617A de Spy0416; y xi . mutante P427L/W535F de Spy0167 y mutante D151A/S617A de Spy0416.

Las composiciones pueden contener otros componentes, tales como vehículos farmacéuticamente aceptables, antígenos de otros microorganismos, adyuvantes, etcétera. En particular, cualquiera de las composiciones descritas en este documento pueden comprender además un antígeno polisacárido del Grupo A como se describe posteriormente y/o un adyuvante, tal como alumbre.

Ya que existe una variación entre los antígenos de GAS de tipo silvestre entre los tipos GAS M y aislados de la cepa del GAS, las referencias a las secuencias de aminoácidos o polinucleótidos del GAS en este documento incluyen secuencias de aminoácidos o polinucleótidos equivalentes que tienen algún grado de identidad de secuencia a las mismas, típicamente debido a sustituciones de aminoácidos conservadores (véase el Ejemplo 30 y la FIGURA 31-FIGURA 33.

En algunas modalidades, las variantes de Spy0167, Spy0269, Spy0416, Spy0714, Spyl390, Spy2000, y los mutantes dados a conocer de los mismos tienen secuencias de aminoácidos que son por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idénticas a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de Spy0167, Spy0269, Spy0416, Spy0714, Spyl390, Spy2000 dadas a conocer en este documento, respectivamente. Típicamente cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácidos de un antígeno de GAS y la secuencia de aminoácidos de una variante del antígeno de GAS es debido a una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras. Como se indica en la FIGURA 31 por ejemplo, uno, dos o tres supresiones de aminoácidos también son posibles.

En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos conservadoras se basan en las propiedades químicas e incluyen sustitución de un . aminoácido positivamente cargado por otro aminoácido positivamente cargado (por ejemplo, H, K, R) ; un aminoácido negativamente cargado por otro aminoácido negativamente cargado (por ejemplo, D, E) ; un aminoácido muy hidrofóbico por otro aminoácido muy hidrofóbico (por ejemplo, C, F, I, L, M, V, w) ; un aminoácido menos hidrofóbico por otro aminoácido menos hidrofóbico (por ejemplo, A, G, H, P, S, T, Y) ; un aminoácido parcialmente hidrofóbico por otro aminoácido parcialmente hidrofóbico (por ejemplo, K, R) ; un aminoácido alifático por otro aminoácido alifático (por ejemplo, A, I, L, M, P, V) ; un aminoácido polar por otro aminoácido polar (por ejemplo, A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T, Y) ; un aminoácido aromático por otro aminoácido aromático (por ejemplo, F, H, W, Y) ; y un aminoácido pequeño para otro aminoácido pequeño (por ejemplo, D, N, T) .

En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos conservadoras se determinan usando la tabla BLOSUM62. La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2,000 alineaciones múltiples locales de segmentos de secuencia de proteínas, que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: 10915, 1992) . Las frecuencias de la sustitución BLOSU 62 se pueden usar para definir sustituciones de aminoácidos conservadoras que se pueden introducir en las secuencias de aminoácidos de los antígenos de Spy0167, Spy0269, Spy0416, Spy0714, Spyl390, y Spy2000. En estas modalidades, una sustitución conservadora se refiere preferiblemente a una sustitución representada por un valor BLOSUM62 de mayor que -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos es conservadora si la sustitución se caracteriza por un valor BLOSUM62 de 0, 1, 2, o 3. De acuerdo con este sistema, las sustituciones de aminoácidos conservadoras preferidas se caracterizan por un valor BLOSU 62 de por lo menos 1 (por ejemplo, 1, 2 o 3), mientras que las sustituciones de aminoácidos conservadoras más preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de por lo menos 2 (por ejemplo, 2 o 3 ) .

Sustituciones o alteraciones de aminoácidos particulares se pueden identificar al alinear las diversas secuencias de aminoácidos del Spy0167, Spy0269, Spy0416, Spy0714, Spyl390, y Spy2000 como se muestra para el Spy0416 de tipo silvestre en la FIGURA 31, el Spy0269 de tipo silvestre en la FIGURA 32, y el Spy0167 de tipo silvestre en la FIGURA 33. Por ejemplo, con base en la alineación en la FIGURA 31, la Tabla 1 indica algunos algunas opciones particulares de ciertas posiciones de aminoácidos con respeto a la secuencia de aminoácidos del Spy0 16 mostrada en la SEQ ID NO: 1. Similarmente , las opciones para las variaciones de aminoácidos en la secuencias de aminoácidos del Spy0269 y Spy0167 se pueden identificar mediante la inspección de la FIGURA 32 y la FIGURA 33, respectivamente.

Tabla 1.

Las variantes de los antígenos de GAS descritos posteriormente son preferiblemente inmunogénicos y confieren protección contra la estimulación letal del GAS en un modelo de ratón (véase los Ejemplos, posteriormente) .

En algunas modalidades las composiciones comprende una o más moléculas de ácido nucleico que codifica los antígenos proteínicos del GAS dados a conocer anteriormente.

En otras modalidades, las composiciones comprenden no más de dos moléculas de ácido nucleico que codifican dos antígenos proteínicos del GAS. En otras modalidades, las composiciones comprenden combinaciones de anticuerpos, en donde cada anticuerpo se enlaza selectivamente a un antígeno de GAS seleccionado de los antígenos proteínicos del GAS dados a conocer anteriormente.

Spy0167 y mutantes inmunogénicos del mismo El Spy0167 (estreptolisina, SLO, GAS25) es una toxina formadora de poros potente que induce la lisis celular en el hospedero y se describe, inter alia, en el documento WO 02/34771. Las secuencias de aminoácidos para el Spy0167 de tipo silvestre se muestran en SEQ ID NOS: 107-119. A menos que se defina de otra manera, un "antígeno de Spy0167" incluye el Spy0167 de longitud completa y mutantes de Spy0167, fragmentos, y fusiones, como se describe posteriormente .

En algunas modalidades, un antígeno de Spy0167 consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 174 ("péptido 1"), la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 175 ("péptido 2"), o la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 176 ("péptido 3") . En algunas modalidades, un antígeno de Spy0167 consiste esencialmente de, de la terminal N a la C, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 175 ("péptido 2") y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 176 ("péptido 3") covalentemente unidos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 175. "Unido covalentemente" como se usa en este documento incluye el enlace covalente directo así como también el enlace por la vía de uno o más aminoácidos adicionales. En otras modalidades, un antígeno de Spy0167 consiste esencialmente de, de la termina N a la C, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 174; un residuo de glicina covalentemente unido a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 174; la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 175 covalente unida a la glicina; y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 176 covalentemente unida a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 175.

Otros antígenos de Spy0167 son fragmentos del Spy0167 los cuales son menores que el Spy0167 de longitud completa mediante por lo menos un aminoácido. Preferiblemente los fragmentos retienen una propiedad inmunológica del antígeno, tal como la capacidad de enlazarse a anticuerpos específicos. Los fragmentos de aminoácidos preferidos comprenden 7 o más aminoácidos (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o más).

En algunas modalidades, un antígeno de Spy0167 es un monomero el cual comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 174. En otras modalidades, un antígeno de Spy0167 es un monomero el cual comprende, de la terminal N a la C, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 175 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 176 covalentemente unida a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 175. En otras modalidades, un antígeno de Spy0167 es un monomero el cual comprende, de la terminal N a la C, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 174; un residuo de glicina covalentemente unido a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 174; la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 175 covalentemente unida a la glicina; y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 176 covalentemente unida a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 175.

Proteínas de fusión Como se da a conocer anteriormente, los antígenos de Spy0167 usados en la invención pueden estar presentes en la composición como polipéptidos separados e individuales (por ejemplo, "péptido 1", "péptido 2", "péptido 3", "péptido 1+2+3", "péptido 2+3"), pero también hay modalidades en las cuales por lo menos dos (es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) antígenos se expresan como una cadena de polipéptido individual (una "proteína de fusión" o "polipéptido híbrido"). Los polipéptidos híbridos ofrecen dos ventajas principales. Primera, un polipéptido que puede ser inestable o se expresa deficientemente por sí mismo se puede ayudar al agregar un socio híbrido adecuado que supere el problema. Segunda, la manufactura comercial se simplifica ya que solamente una expresión y purificación necesitan ser empleadas a fin de producir dos polipéptidos que ambos son antigénicamente útiles .

Formas mutantes de Spy0167 Las formas mutantes de Spy0167 tienen por lo menos 50% menos actividad hemolítica que el Spy0167 de tipo silvestre (por ejemplo, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%) relativo que el Spy0167 de tipo silvestre como se determina por un ensayo de hemolisis (por ejemplo, véase el Ejemplo 1) pero son inmunogénicos y confieren preferiblemente protección contra la estimulación letal del GAS en un modelo de ratón (véase los Ejemplos 4, 7, 8) . Los mutantes de Spy0167 incluyen aquellos con una alteración de aminoácidos (es decir, una sustitución, supresión o inserción) en uno o más de los aminoácidos P427, 535, C53, A248, y D482 numerados de acuerdo con la secuencia de Spy0167 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 107. Ejemplos de tales mutantes incluyen P427L (SEQ ID NO: 120) , W535F (SEQ ID NO: 121), C530G (SEQ ID NO: 122), ??248 (SEQ ID NO: 123), 535F/D482N (SEQ ID NO: 124), P427L/W535F (SEQ ID NO: 125), P427L/C530G (SEQ ID NO: 126), y P427L/C530G/W535F (SEQ ID NO: 127) .

Los mutantes de Spy0167 para el uso en la invención incluyen alteraciones de aminoácidos individuales, dobles o triples ("mutantes individuales", "mutantes dobles", "mutantes triples") en las posiciones P427, W535, C530, A248, y/o D482. De esta manera, los mutantes de Spy0l67 pueden comprender lo siguiente: i. P427L (SEQ ID NO: 120), P427R, P427N, P427C, P427Q, P427E, P427G, P427H, P427I, P427L, P427K, P427M, P427F, P427A, P427S, P427T, P427W, P427Y, o P427V; ii. 535F (SEQ ID NO: 121), W535R, W535N, W535D, W535C, W535Q, W535E, W535G, W535I, W535L, W535K, 535M, 535A, W535P, 535S, 535T, W535Y, o W535V; iii. C530G (SEQ ID NO: 122), C530R, C530N, C530D, C530S, C530Q, C530E, C530A, C530H, C530I, C530L, C530K, C530M, C530F, C530P, C530T, C530W, C530Y, o C530V; iv. D482L, D482R, D482N, D482C, D482Q, D482E, D482G, D482H, D482I, D482L, D482K, D482M, D482F, D482A, D482S, D482T, D482W, D482Y, o D482V; y. A248L, A248R, A248N, A248C, A248Q, A248E, A248G, A248H, A248I, A248L, A248K, A248M, A248F, A248S, A248T, A248W, A248Y, o A248V vi. ??427; o AW535; o AC530; o AD482; o ??248 (SEQ ID NO: 123) ; y vii. combinaciones de los mismos, tales como: 1. mutantes dobles W535F/D482N (SEQ ID NO: 124), P427L/ 535F (SEQ ID NO: 125) , y P427L/C530G (SEQ ID NO: 126) , P427L/A248L, P427L/D482L, 535F/C530G, 535F/A248L, W535F/D482L, C530G/A248L, y A248L/D482L ; y 2. mutantes triples P427L/C530G/A248L, P427L/C530G/D482L, P427L/A248L/D482L, P427L/C530G/ 535F (SEQ ID NO: 127), W535F/C530G/A248L, W535F/C530G/D482L, W535F/A248L/D482L, y C530G/A248L/D482L Las proteínas de Spy0167 mutante también incluyen polipéptidos de fusión que comprenden una proteína de Spy0167 mutante como se da a conocer anteriormente y otro antígeno de gas. Los antígenos de GAS se dan a conocer, por ejemplo, en el documento O 02/34771 y incluyen, pero no se limitan a, GAS39 (Spy0266 gi 13621542), GAS40 (Spy0269; planteado posteriormente) , GAS42 (Spy0287; gi 13621559) GAS45 (M5005_Spy0249; gi71910063), GAS57 (Spy0416; planteado posteriormente), GAS58 (Spy0430; gil3621663) , GAS67 (Spy0714; gil3621898) , GAS68 (Spy0163; gil3621456) , GAS84 (SPyl274; gil3622398) , GAS88 (Spyl361; gil3622470) , GAS 89 (Spyl390; gil3622493) , GAS95 (SPyl733 ; gil3622787) , GAS98 (Spyl882 ; gil3622916) , GAS99 (Spy 1979; gil3622993) , GAS100 (Spy2000 ; gil3623012) , GAS102 (Spy2016, gil3623025) , GAS117 (Spy0448 ; gil3621679) , GAS130 (Spy0591 , gil3621794) , GAS137 (Spy0652 ; gil3621842) , GAS146 (Spy0763 ; gil3621942) , GAS159 (Spyll05; gil3622244) , GAS179 (Spyl718, gil3622773) , GAS193 (Spy2025 ; gi3623029) , GAS195 (Spy2043 ; gil3623043) , GAS202 (Spyl309; gil3622431) , GAS217 (Spy0925, gil362208) , GAS236 (Spyll26; gil3622264) , GAS277 (Spyl939; gil3622962) , GAS290 (SPyl959; gil3622978) , GAS290 (SPyl959; gil3622978) , GAS294 (Spyll73 ; gil3622306) , GAS309 (Spy0124; gil3621426) , GAS366 (Spyl525; gil3622612) , GAS372 (Spyl625 ; gil3622698) , GAS384 (Spyl874 ; gil3622908) , GAS389 (Spyl981; gil3622996) , GAS504 (Spyl751; gil3622806) , GAS509 (Spyl618; gil3622692) , GAS511 (Spyl743; gil3622798) , GAS527 (Spyl 204; gi3622332), GAS529 (Spyll 280; gi3622403) , GAS533 (Spyl877; gil3622912), GAS561 (Spyll34; gil3622269) , GAS613 (Spy01673; gil3622736), y GAS681 (spyll52; gil362228) , así como también otros antígenos listados en las Tablas A-D, posteriormente. Los números gi para estos antígenos son para la cepa Mil, donde es disponible, pero se apreciará que también se pueden usar proteínas equivalentes de otras cepas M.

Los antígenos de Spy0167 preferidos de acuerdo con la invención son inmunogénicos pero no tóxicos. "No tóxico" como se usa en este documento significa que el antígeno de Spy0167 no se puede enlazar al colesterol o no puede formar oligómeros y, más en general, no promueve la lisis de las membranas que contienen colesterol. Una proteína de Spy0167 se puede volver no tóxica, por ejemplo, al suprimir por lo menos el residuo de cisteína individual, localizado en una región altamente conservada en la sección C-terminal del Spy0167 que se puede usar como un patrón de firma para la citolisinas activadas con tiol .

Las composiciones de la invención también pueden comprender equivalentes de los mutantes de Spy0167 los cuales son polipéptidos individuales, que tienen por lo menos 50% o menos actividad hemolítica que el Spy0167 de tipo silvestre (por ejemplo, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%) relativo con el Spy0167 de tipo silvestre como se determina por un ensayo hemolítico, que son inmunogénicos, y que confieren preferiblemente protección contra la estimulación letal del GAS en un modelo de ratón. Tales equivalentes pueden incluir los antígenos de Spy0167 mutante con supresiones, inserciones y/o sustituciones de aminoácidos en las posiciones diferentes a P427, W535, C530, A248, y D482, que incluyen supresiones de hasta aproximadamente 40 aminoácidos en la terminal N o C (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 aminoácidos) .

Spy0269 El GAS40, también conocido como "Spy0269" (MI) , "SpyM3_0197" (M3), aSpyM18_0256" (M18) y "prgA" , se describe, por ejemplo, en el documento WO 02/34771 y en el documento WO 2005/032582. La secuencias de aminoácidos del Spy0269 de tipo silvestre se proporcionan en la SEQ ID NOS : 50-106 y 128-130. Los antígenos de Spy0269 son particularmente útiles en las composiciones de la invención debido a que las proteínas de Spy0269 se conservan sumamente tanto en los Tipos M como en las cepas múltiples de estos Tipos M (véase el documento WO 2006/042027) . El Spy0269 proporciona consistentemente protección en el modelo animal de la inmunización sistémica y la estimulación e inducción de los anticuerpos bacterianos.

Una proteína de Spy0269 contiene típicamente una secuencia líder de péptidos (por ejemplo, aminoácidos 1 - 26 de SEQ ID NO:50), una primera región espiral enrollada (por ejemplo, 58 - 261 aminoácidos de SEQ ID NO:50), una segunda región espiral enrollada (por ejemplo, 556 - 733 aminoácidos de SEQ ID NO:50), una región de cremallera de leucina (por ejemplo 673 - 701 aminoácidos de SEQ ID NO: 50) y una región transmembrana (por ejemplo, 855 - 866 de aminoácidos de SEQ ID NO: 50) . En algunas modalidades la secuencia líder se remueve (por ejemplo, SEQ ID NO: 177) .

Composiciones de la invención también pueden comprender equivalentes del Spy0269 que son polipéptidos individuales, que son inmunogénicos , y que confieren preferiblemente protección contra la estimulación letal del GAS en un modelo de ratón (por ejemplo, Ejemplos 4, 7, 8) . Spy0416 y mutantes inmunogénicos del mismo El Spy0416 (MI) también se refiere como "GAS57" , "SpyM3_0298" (M3), "SpyM18_0464" (M18) , y "prtS" . El Spy0416 se ha identificado como una proteinasa de envoltura celular putativa. Véase el documento WO 02/34771 y US 2006/0258849. Existen 49 secuencias de Spy0416 de 17 tipos M diferentes (1, 2, 3, 4, 6, 11, 12, 18, 22, 23, 28, 44/61, 68, 75, 77, 89, 94) ; de acuerdo con los Centro para el Control de Enfermedades, los 17 Tipos M diferentes representan más del 95% de casos de faringitis y aproximadamente 68% de aislados de GAS invasivos en los Estados Unidos. Las secuencias de aminoácidos de Spy0416 de tipo silvestre de varios Tipos M se exponen en el listado de secuencia como SEQ ID NOS: 1-49. Las composiciones de la invención también pueden comprender equivalentes del Spy0416 los cuales son polipéptidos individuales, que son inmunogénicos , y que confieren preferiblemente protección contra la estimulación letal del GAS en un modelo de ratón.

Los antígenos de Spy0416 mutante de acuerdo con la invención tienen una actividad proteolítica contra la interleucina 8 (IL-8) que se reduce por lo menos 50% (por ejemplo, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%) relativo con el Spy0416 de tipo silvestre como se detectar por ya sea por el SDS-PAGE o ELISA (véase el Ejemplo 3) , pero son inmunogénicos, por ejemplo, confieren protección contra la estimulación letal del GAS en un modelo de ratón. Preferiblemente, un Spy0416 mutante de la invención tampoco escisa otras citocinas humanas, tal como CXCLl/GRO (por ejemplo, SEQ ID NO: 131), CXCL2/GR0p [por ejemplo, SEQ ID NO: 132), CXCL3/GR0y (por ejemplo, SEQ ID NO: 133), CXCL4 (por ejemplo, SEQ ID NO: 134) , CXCL12/SDF-la (por ejemplo, SEQ ID NO: 135), CXCL12/SDF-l (por ejemplo, SEQ ID NO: 136), CXCL12/SDF- 1? (por ejemplo, SEQ ID NO: 137), CXCL5/ENA78 (por ejemplo, SEQ ID NO: 138), CXCL6/GCP-2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 139) , CXCL7/NAP-2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 140) , CXCL9/MIG (por ejemplo, SEQ ID NO: 141), CXCL10/IP10 (por ejemplo, SEQ ID NO: 142), CXCL11 (por ejemplo, SEQ ID NO: 143), CXCL13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 144), CXCL14 (por ejemplo, SEQ ID NO: 145), y CXCL16 (por ejemplo, SEQ ID NO: 146) .

Los mutantes de Spy0416 útiles en la invención incluyen aquellos con una alteración de aminoácidos (es decir, una sustitución, supresión, o inserción) en uno o más de aminoácidos D151, H279, o S617, numerados de acuerdo con la secuencia de Spy0416 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 1, que incluyen alteraciones de aminoácidos individuales, dobles o triples ("mutantes individuales", "mutantes dobles", "mutantes triples") en las posiciones D151, H279, y/o S617. De esta manera, los mutantes de Spy0416 pueden comprender lo siguiente : i. D151A (SEQ ID NO: 147), D151R, 151N, D151C, D151Q, D151E, D151G, D151H, D1511, D151L, D151K, D151M, D151F, D151P, D151S, D151T, D151W, D151Y, O D151V; ii. H279A, H279R, H279N, H279D, H279C, H279Q, H279E, H279G, H279I, H279L, H279K, H279M, H279F, H279P, H279S, H279T, H279W, H279Y, o H279V; iii. S617A (SEQ ID NO: 148), S617R, S617N, S617D, S617C, S617Q, S617E, S617G, S617H, S617I, S617L, S617K, S617M, S617F, S617P, S617T, S617W, S617Y, o S617V; iv. ??151; o ??279; o AS617; y v. combinaciones de los mismos, tal como D151 A/S617A (SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:198) .

Los antígenos del mutante Spy0416 de la invención también incluyen polipéptidos de fusión que comprenden un antígeno del mutante de Spy0416 como se da a conocer anteriormente y otro antígeno de gas. Los antígenos de GAS se dan a conocer, por ejemplo, en el documento WO 02/34771 e incluyen, pero no se limitan a, todo o una porción del Spy0019 (GAS5 ; gil5675086), Spy0163 (GAS23; gil5675077) , Spy0167 (GAS25, planteado anteriormente) , Spy0266 (GAS39; gil3621542) , Spy0269 (GAS40, planteado anteriormente) , Spy0287 (GAS42; gil3621559) , M5005_Spy0249 (GAS45; gi71910063) , Spy0385 (GAS56; gil5675097) , SpyO430 (GAS58 ; gil 3621663) , Spy0714 (GAS67 ; gil3621898) , Spy0163 (GAS68; gil3621456) , Spyl274 (GAS84 ; gil3622398) , Spyl361 (GAS88; gil3622470) , Spyl.390 (GAS89; gil3622493) , Spyl733 (GAS95; 13622787) , Spyl882 (GAS98 ; gil3622916) , Spyl979 (GAS99 ; gil3622993) , Spy2000 (GAS100; gil3623012) , Spy2016 (GAS102; gil5675798) , Spy0448 (GAS117; gil3621679) , Spy0591 (GAS130; gil3621794) , Spy0652 (GAS137,· gil3621842) , Spy0763 (GAS146 ; gil5674811) , Spyl05 (GAS159; gil3622244) , Spyl718 (GAS179, gil3622773) , Spy2025 (GAS193 ; gi3623029) , Spy2043 (GAS195; gil5675815) , Spyl309 (GAS202; gil3622431) , Spy0925 (GAS217; gil362208) , Spyll26 (GAS236; gil3622264) , Spyl939 (GAS277; gil3622962) , Spyl959 (GAS290; gil3622978) , Spyll73 (GAS294 ; gil3622306) , Spy0124 (GAS309; gil3621426) , Spyl525 (GAS366 gil3622612) , Spyl625 (GAS372 ; gil3622698) , Spyl874 (GAS384 gil3622908) , Spyl981 (GAS389; gil3622996)., Spyl751 (GAS504 gil3622806) , Spyl618 (GAS509; gil3622692) , Spyl743 (GAS511 gil3622798), Spyl204 (GAS527; gi3622332) , Spyl280 (GAS529 gi3622403) , Spyl877 (GAS533 ; gil3622912) , Spyll34 (GAS561 gil3622269) , Spy01673 (GAS613 ; gil3622736) , Spyll52 (GAS681 gil362228) u otros antígenos dados a conocer en las Tablas A-D posteriormente. Los números gi para estos antígenos son para la cepa MI, donde son disponibles, pero se apreciará que las proteínas equivalentes de otras cepas M también se pueden usar .

La invención también incluye equivalentes de los mutantes de Spy0416 que son polipéptidos individuales, que no escisan IL-8 como se determina por el SDS-PAGE o ELISA, que son inmunogénicos , y que confieren preferiblemente protección contra la estimulación letal el GAS en un modelo de ratón (por ejemplo, Ejemplos 4, 7, 8). Tales equivalentes pueden incluir los antígenos de Spy0416 mutante con supresiones, inserciones y/o sustituciones de aminoácidos en las posiciones diferentes a D151, H279, o S617, que incluyen supresiones de hasta aproximadamente 40 aminoácidos en la terminal N o C (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 aminoácidos) .

Otros antigenos de GAS Uno o más de otros antígenos de GAS se pueden incluir en composiciones de la invención. Los antígenos de GAS se dan a conocer, por ejemplo, en el documento WO 02/34771. Antígenos de GAS útiles incluyen todo o porciones de Spy0737, Spy0019, Spy0163, Spy0266, Spy0287 Spy0249 , Spy0385 , Spy0430 , Spy0714 , Spy0163 , Spyl274 , Spyl361 , Spyl390 , Spyl733 , Spyl882 , Spyl979 , Spy2000 , Spy2016, Spy0448 , Spy.0591 , Spy0652 , Spy0763 , Spyll05 , Spyl718, Spy2025 , Spy2043 , Spyl309 , Spy0925 , Spyll26 , Spyl939, Spyl959 , Spyll73 , Spy0124 , Spyl525 , Spyl625 , Spyl874 , Spyl981 , Spyl-751 , Spyl618 , Spyl743 , Spyl204 , Spyl280 , Spyl877 , Spyll34 , y Spy01673 Composiciones de la invención también pueden comprender equivalentes a estos antígenos de GAS que son polipéptidos individuales, que son inmunogénicos , y que confieren preferiblemente protección contra la estimulación letal del GAS en un modelo de ratón (por ejemplo Ejemplos 4, 7, 8) . Por ejemplo, cada uno de Spy0763 (GAS146) y Spyll34 (GAS561) protege a los ratones contra la estimulación con el Mi 3348 S. pyogenes (70% de Supervivencia comparado con 20% de supervivencia de los controles negativos; n = 20) . Véase también las Tablas A-D, a continuación.

Tabla A.

Tabla B PROTECCIÓN SEQ ID NO: ANTÍGENO Hl M12 M23 + + - 17B spy0019 + nd nd 179 spy0163 180 spy0385 181 spy0714 182 spy0737 183 spyl274 184 spyl361 + - nd 185 spyl390 nd + nd 186 spyl733 + - - 187 spyl882 + - + 188 spyl9 9 - + - 189 spy2000 190 spy2016 + - + 191 spy0591 192 spy1105 nd - + 193 spyl718 194 spy202S + + - 195 spy2043 - nd 196 spyl939 197 spyl625 Tabla D.

Fragmentos La longitud de los fragmentos de las proteínas del GAS de tipo silvestre o mutante descritas anteriormente pueden variar dependiendo de la secuencia de aminoácidos del antígeno de GAS específico o mutante de mismo, pero el fragmento es preferiblemente por lo menos siete aminoácidos consecutivos, por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o más, hasta un aminoácido menor que una proteína del GAS del tipo silvestre de longitud completa o mutante. Preferiblemente el fragmento es inmunogénico y comprende uno o más epítopos de la secuencia. Otros fragmentos preferidos incluyen (1) los polipéptidos de señal N-terminal de cada proteína del GAS identificada, (2) la proteína del GAS identificada sin sus péptidos de señal N-terminal, y (3) cada proteína del GAS identificada en la cual hasta 10 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) se suprimen de la N-terminal y/o C-terminal (por ejemplo, el residuo de aminoácido N-terminal se puede suprimir) . Otros fragmentos emiten uno o más dominios de la proteína (por ejemplo, omisión de un péptido de señal, un dominio citoplásmico, un dominio transmembrana o un dominio extracelular) . En algunas modalidades el fragmento tiene 33-324 aminoácidos de Spy0269.

Antígeno polisacárido de GAS El polisacárido de GAS (PS) es un polisacárido de pared celular presente en todas las cepas de GAS. Las concentraciones de anticuerpo a PS se correlacionan inversamente con la enfermedad y colonización en los niños. En algunas modalidades las composiciones de la invención comprenden un antígeno polisacárido de GAS. El carbohidrato de GAS de S. pyogenes representa una estructura ramificada con una cadena principal de L-ramnopiranosa (Rhap) que consiste de enlaces alfa- (1—>2) y alfa- (1—>3) alternantes y residuos de D-N-acetilglucosamina (GlcpNAc) beta-(l—>3)-conectados a anillos de ramnosa alternantes (Kreis y colaboradores, Int. J. Biol . Macromol . 17, 117-30, 1995). Los antígenos polisacáridos del GAS útiles en las composiciones de la invención tienen la fórmula: I ^:)-a-L-Rh;ip-(l ¦^?)- -L-Rhap-(J ß-D-GlcpNAc (1), en donde R es una terminal que reduce la L-Ramnosa o D-GlcpNAc y n es un número de aproximadamente 3 a aproximadamente 30.

El antígeno polisacárido de GAS usado de acuerdo con la invención puede ser un carbohidrato de GAS de longitud sustancialmente completa, como se encuentra en la naturaleza, o puede ser más corto que la longitud natural . Los polisacáridos de longitud completa se pueden despolimerizar para dar fragmentos más cortos para el uso con la invención, por ejemplo, mediante la hidrólisis en ácido leve, mediante calentamiento, mediante cromatografía de dimensionamiento, etcétera. Sin embargo, se prefiere usar sacáridos de longitud sustancialmente completa. En particular, se prefiere usar sacáridos con un peso molecular de aproximadamente 10 kDa. Las muestras moleculares se pueden medir mediante filtración en gel relativas con los estándares de dextrano.

El sacárido se puede modificar químicamente relativo con el carbohidrato de GAS como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, el sacárido se puede N acetilar (parcial o totalmente) , N propionar (parcial o completamente), etcétera. El efecto de la des-acetilación etcétera., por ejemplo, en la inmunogenicidad, se puede evaluar mediante ensayos de rutina.

En algunas modalidades el antígeno polisacárido de GAS se conjuga a un portador, tal como la toxina de la difteria mutada CR 197 (y otros portadores descritos anteriormente. Como se describe en los Ejemplos, posteriormente, los anticuerpos al PS conjugados con CRM197 ("GC") inducen al exterminio opsonofagocítico del GAS.

Producción de antígenos proteínicos de GAS Producción recombinante La redundancia del código genético es bien conocida. De esta manera, cualquier molécula de ácido nucleico (polinucleótidos) que codifica uno de los antígenos de GAS descritos en este documento se pueden usar para producir esa proteína recombinantemente . Las moléculas de ácido nucleico que codifican los antígenos de GAS del tipo silvestre también se pueden aislar de la bacteria S. pyogenes apropiada usando técnicas de purificación de ácido nucleico estándares o se pueden sintetizar usando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o al usar un sintetizador automático. Véase Caruthers y colaboradores, Nitcl. Acids Res. Sym . Ser. 215, 223, 1980; Horn y colaboradores, Nitcl. Acids Res. Symp. Ser. 225, 232, 1980; Hunkapiller y colaboradores, Nature 310, 105-11, 1984; Grantham y colaboradores, Nucleic Acids Res. 9, r43-r74, 1981.

Las moléculas de ADNc se pueden hacer con técnicas de biología molecular estándar, usando el ARNm como una plantilla. Las moléculas de ADNc después se pueden replicar usando técnicas de biología molecular bien conocidas en el campo. Una técnica de amplificación, tal como PCR, se puede usar para obtener copias adicionales de polinucleótidos de la invención, usando ya sea ADN genómico o ADNc como una plantilla .

Si se desea, los polinucleótidos se pueden diseñar usando métodos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican antígenos por una variedad de razones, que incluyen pero no se limitan a alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, y/o expresión del polipéptido o producto ARNm. El entrelazado de ADN mediante fragmentación aleatoria y reensamblaje de PCR de los fragmentos de genes y los oligonucleótidos sintéticos se pueden usar para diseñar las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio se puede usar para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia del codón, producir variantes de empalme, introducir mutaciones, y así sucesivamente .

Las modificaciones de secuencia, tal como la adición de una secuencia de etiqueta de purificación u optimización del codón, se pueden usar para facilitar la expresión. Por ejemplo, la secuencia líder N-terminal se puede reemplazar con una secuencia que codifica una proteína de etiqueta tal como polihistidina ("HIS") o glutationa S-transferasa ("GST") . Tales proteínas de etiqueta se pueden usar para facilitar la purificación, detección, y estabilidad de la proteína expresada. Los codones preferidos por un hospedero procariótico o eucariótico particular se pueden seleccionar par incrementar la velocidad de expresión proteínica o para producir un trascripto de ARN que tiene propiedades deseables, tal como una vida media que es más prolongada que aquella de un trascripto generado de la secuencia de origen natural. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en el documento WO 05/032582.

Vectores de expresión Una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno de GAS para el uso en la invención se puede insertar en un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la trascripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Los métodos que son bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen secuencias de codificación y elementos de control transcripcionales y traduccionales apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo.

Células hospederas Las células hospederas para producir antígenos de GAS pueden ser procarióticas o eucarióticas . El E. coli es una célula hospedera preferida, pero otros hospederos adecuados incluyen Lactococciis lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, ' Salmonella typhi, Salmonella typhinuirium, Neisseria lactamica, Neisseria cinérea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis) , levaduras, baculovirus, células de mamífero, etcétera.

Una cepa de célula hospedera se puede seleccionar por su capacidad de modular la expresión de las secuencias insertadas o de procesar el polipéptido expresado en la forma deseada. Tales modificaciones del polipéptido, incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. El procesamiento post traduccional que escinde una forma "prepro" del polipéptido también se puede usar para facilitar la inserción, plegamiento y/o función correcta. Diferentes células hospederas que tienen una maquinaria celular especifica y mecanismos de característica para actividades post traduccionales son disponibles de American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209) y se pueden seleccionar para asegurar la modificación y procesamiento correctos de una proteína extraña. Véase el documento WO 01/98340.

Los constructos de expresión se pueden introducir en células hospederas que usan técnicas bien establecidas que incluyen, pero no se limitan a, transferencia de ADN mediada por transíerina-policatión, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados , fusión celular mediada por liposomas, transportación intracelular de perlas de látex recubiertas con ADN, fusión de protoplastos, infección viral, electroporación, métodos de "pistola génica" , y transfección mediada por DEAE o fosfato de calcio.

Las células hospederas transformadas con vectores de expresión se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo celular. La proteína producida por una célula transformada se puede secretar o contener intracelularmente dependiendo de la secuencia de nucleótidos y/o el vector de expresión usado. Aquellas personas expertas en la técnica entienden que los vectores de expresión se pueden diseñar para contener secuencias de señal que dirigen la secreción de antígenos solubles a través de una membrana celular procariótica o eucariótica.

Purificaeion Se pueden incluir secuencias de exportación de señal en un antígeno de GAS recombinantemente producido de modo que el antígeno se puede purificar del medio de cultivo celular usando métodos conocidos. Alternativamente, los antígenos de GAS recombinantemente producidos se pueden aislar de células hospederas diseñas y separadas de otros componentes en la célula, tales como proteínas, carbohidratos, o lípidos, usando métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión de tamaño, fraccionamiento de sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y electroforesis en gel preparativo. Una preparación de antígeno de GAS purificado es por lo menos 80% pura; preferiblemente las preparaciones son 90%, 95%, o 99% puras. La pureza de las preparaciones se puede evaluar por cualquier medio conocido en la técnica, tal como electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida o análisis RP-HPLC. Donde es apropiado, las proteínas de Spy0167 mutantes se pueden solubilizar, por ejemplo, con urea.

Síntesis química Los antígenos de GAS se pueden sintetizar, por ejemplo, usando técnicas de fase sólida. Véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc . 85, 2149 54, 1963; Roberge y colaboradores, Science 269, 202 04, 1995. Las síntesis de la proteína se pueden realizar usando técnicas manuales o mediante automatización. Las síntesis automatizadas se pueden lograr, por ejemplo, usando un Sintetizador de Péptido Biosystems 431A Aplicado (Perkin Elmer) . Opcionalmente , los fragmentos de los antígenos de GAS se pueden sintetizar y combinar separadamente usando métodos químicos para producir üna molécula de longitud completa.

Anticuerpos Algunas composiciones de la invención comprenden combinaciones de anticuerpos que se enlazan específicamente a los antígenos de GAS descritos en este documento. Un anticuerpo "se enlaza específicamente" a un antígeno de GAS si proporciona una señal de detección de por lo menos 5-, 10-o 20- veces más alta que una señal de detección proporcionada con una protección diferente cuando se usa en un ensayo inmunoquímico . Preferiblemente, los anticuerpos que se enlazan específicamente a un antígeno de GAS no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y puede inmunoprecipitar el antígeno de GAS de la solución.

El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como también fragmentos de las mismas que son capaces de enlazar un antígeno. Estas incluyen moléculas de anticuerpo híbridas (quiméricas) y (por ejemplo, inter y colaboradores, Nature 349, 293-99, 1991; Patente de E.U.A. 4,816,567); fragmentos F(ab')2 y F(ab) y moléculas Fv; heterodímeros no covalentes (por ejemplo, Inbar y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . U.S.A. 69, 2659-62, 1972; Ehrlich y colaboradores, Biochem 19, 4091-96, 1980); moléculas Fv de cadena individual (sFv) (por ejemplo, Huston y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5897-83, 1988) ; constructos de fragmento de anticuerpo dimérico y trimérico; mini cuerpos (por ejemplo, Pack y colaboradores, Biochem 31, 1579-84, 1992; Cumber y colaboradores, J. Immunology 149B, 120-26, 1992); moléculas de anticuerpo humanizado (por ejemplo, Riechmann y colaboradores, Nature 332, 323-27, 1988; Verhoeyan y colaboradores, Science 239, 1534-36, 1988; y Publicación de Patente del Reino Unido No. GB 2,276,169, publicada el 21 de Septiembre de 1994); y cualquiera de los fragmentos funcionales obtenidos de tales moléculas, así como también anticuerpos obtenidos a través de procesos no convencionales tal como expresión en fago. Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales . Los métodos para obtener los anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica.

Típicamente, por lo menos 6, 7, 8, 10, o 12 aminoácidos contiguos son requeridos para formar un epítopo. Sin embargo, los epítopos que implican aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, por lo menos 15, 25, ó 50 amino ácidos. Varios inmunoensayos (por ejemplo, técnicas de Western blot, ELISAs, radioinmunoensayos , ensayos inmunohistoquímicos , inmunoprecipitaciones , u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la técnica) se pueden usar para identificar anticuerpos que tiene la especificidad deseada. Numerosos protocolos para el enlace competitivo o ensayos inmunoradiométricos son bien conocidos en la técnica. Tales inmunoensayos implican típicamente la medición de la formación de complejos entre un inmunógeno y un anticuerpo que se enlaza específicamente al inmunógeno. Una preparación de anticuerpos que se enlazan específicamente a un antígeno de GAS proporciona típicamente una señal de detección por lo menos 5-, 10-, o 20- veces más alta que una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se usa en un ensayo inmunoquímico y no proporciona una señal detectable si se pone en contacto con una proteína "irrelevante" . Preferiblemente, los anticuerpos no detectan otras proteínas en los ensayos inmunoquímicos y puede inmunoprecipitar el antígeno particular de la solución.

Anticuerpos que se enlazan específicamente al Spy0167 del tipo silvestre reducen sustancialmente (por ejemplo, mediante por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, o 99%) o eliminan su actividad hemolítica. Algunos anticuerpos también se enlazan específicamente a las proteínas de Spy0167 mutante descritos anteriormente.

Los anticuerpos que se enlazan específicamente al Spy0416 de tipo silvestre reducen sustancialmente (por ejemplo, mediante por lo menos 50%) o eliminan la capacidad del Spy0416 de escindir la IL-8 (Ejemplo 5) . Los anticuerpos pueden reducir la capacidad del Spy0416 de escindir la IL-8 mediante por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, o 99%. Algunos anticuerpos también se enlazan específicamente a la proteína de Spy0416 mutante descritos anteriormente. Los anticuerpos preferidos también reducen la capacidad del Spy0416 de escindir otros sustratos tales como homólogos de la IL-8 {por ejemplo, CXCLl/GROa, CXCL2/GROp, CXCL3/GR0y, CXCL4, CXCL12/SDF-la, CXCL12/SDF- 1ß , CXCL12/SDF- 1?, CXCL5/ENA 78, CXCL6/GCP-2 , CXCL7/NAP-2, CXCL9/MIG, CXCL10/IP10, CXCLII, CXCL13, CXCL14, y CXCL16. Algunos anticuerpos bloquean la progresión de lesiones necróticas en animales inmunizados con el antígeno recombinante del Spy0416 de tipo silvestre o mutante y estimulado con GAS.

Los anticuerpos que se enlazan específicamente al Spy0269 reducen sustancialmente (por ejemplo, mediante por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, o 99%) o eliminan el enlace de Spy0269 a las células epiteliales como es medido por el ensayo de enlace celular descrito en el Ejemplo 25.

Generación de anticuerpos Los antígenos de GAS se pueden usar para inmunizar un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, caballo, mono, o humano, para producir anticuerpos policlonales . Si se desea, un antígeno se puede conjugar a una proteína portadora, tal como albúmina de suero bovino, tiroglobulina, y hemocianina de lapa californiana . Dependiendo de las especies de hospederos, se pueden usar varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica . Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio) , y sustancias activas de superficie (por ejemplo, lisolicitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol) . Entre los adyuvantes usados en los humanos, BCG (bacilli Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son especialmente útiles.

Los anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a un antígeno se pueden preparar usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas de células continuas en el cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de células B humanas, y la técnica de hibridoma EBV (Kohler y colaboradores, Nature 256, 495 497, 1985; Kozbor y colaboradores, J. Immunol . Methods 81, 31 42, 1985; Cote y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. 80, 2026 2030, 1983; Colé y colaboradores, Mol. Cell Biol . 62, 109 120, 1984).

Además, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el empalme de genes de anticuerpo de ratón a genes de anticuerpo humano para obtener una molécula con especificidad de antígeno apropiada y actividad biológica, se pueden usar (Morrison y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . 81, 6851 6855, 1984; Neuberger 312, 604 608, 1984; Takeda y colaboradores, Nature 314, 452 454, 1985). Anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos también se pueden "humanizar" para prevenir o reducir el riesgo de que un paciente presente una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo cuando se usa terapéuticamente. Tales anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a los anticuerpos humanos que se usan directamente en la terapia o pueden requerir la alteración de pocos residuos claves. Las diferencias de secuencias entre los anticuerpos de roedor y las secuencias humanas se pueden minimizar al reemplazar los residuos que difieren de aquellos en las secuencias humanas por la mutagénesis dirigida al sitio de los residuos individuales o mediante el injerto de las regiones de determinación de cotnplementariedad enteras .

Alternativamente, los anticuerpos humanizados se pueden producir usando métodos recombinantes , como se describe posteriormente. Los anticuerpos que se enlazan específicamente a un antígeno particular puede contener sitios de enlace al antígeno que son ya sea parcial o completamente humanizados, como se da a conocer en el documento de EUA 5,565,332.

Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena individual se pueden adaptar usando métodos conocidos en la técnica para producir anticuerpos de cadena individual que se enlazan específicamente a un antígeno particular. Anticuerpos con especificidad relacionada, pero de distinta composición idiotípica, se pueden generar mediante el mezclado de cadenas de bibliotecas de inmunoglobulina combinatoria aleatorias (Burton, Proc . Nati. Acad. Sci . 88, 1112023, 1991).

Anticuerpos de cadena individual también se pueden construir usando un método de amplificación de ADN, tal como PCR, usado ADNc de hibridoma como una plantilla (Thirion y colaboradores 1996, Eur. J. Cáncer Prev. 5,507-11). Anticuerpos de cadena individual pueden ser mono o biespecífieos , y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos de cadena individual biespecíficos , tetravalentes se enseña, por ejemplo, en Coloma & Morrison, Nat . Biotechnol . 15, 159-63, 1997. La construcción de anticuerpos de cadena individual biespecífieos , bivalentes se enseña en Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206, 1994.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de cadena individual se puede construir usando síntesis de nucleótidos manual o automatizada, se clona en un constructo de expresión que usa métodos de ADN recombinante estándares, y se introduce en una célula para expresar la secuencia de codificación, como se describe posteriormente. Alternativamente, los anticuerpos de cadena individual se pueden producir directamente usando, por ejemplo, la tecnología en fago filamentoso (Verhaar y colaboradores, Int. J. Cáncer 61,497-501, 1995; Nicholls y colaboradores, J". Immunol. Meth. 165, 81-91, 1993).

Los anticuerpos que se enlazan específicamente a un antígeno particular también se pueden producir al inducir la producción in vivo en la población de linfocitos o al clasificar las bibliotecas o paneles de inmunoglobulina de reactivos de enlace altamente específicos como se da a conocer en la literatura (Orlandi y colaboradores, Proc . Nati, Acad. Sci. 86, 3833 3837, 1989; Winter y colaboradores, Nature 349, 293 299, 1991) .

Anticuerpos quiméricos también se pueden construir como se da a conocer en el documento O 93/03151. Las proteínas de enlace que se derivan de inmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespecíficas , tales como los "diacuerpos" descritas en el documento WO 94/13804, también se pueden preparar.

Los anticuerpos se pueden purificar mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden purificar por afinidad por la circulación sobre una columna a la cual el antígeno relevante se enlaza. Los anticuerpos enlazados luego se pueden eluír de la columna usando una solución amortiguadora con una concentración con alto contenido de sal.

Composiciones farmacéuticas La invención también proporciona composiciones para el uso como medicamentos (por ejemplo, como composiciones o vacunas inmunogénicas) . Las composiciones de la invención son útiles para prevenir la infección por S. pyogenes, para reducir el riesgo de la infección por S. pyogenes, y/o para tratar la enfermedad causada por un resultado de la infección por S. Diógenes, tal como bacteriemia, meningitis, fiebre puerperal, escarlatina, erisipelas, faringitis, impétigo, fascitis necrotizante , miositis o síndrome de choque tóxico.

Las composiciones que contienen antígenos de GAS son preferiblemente composiciones inmunogénicas, y son más preferiblemente composiciones de vacuna. El pH de tales composiciones está preferiblemente entre 6 y 8, preferiblemente de manera aproximada 7. El pH se puede mantener mediante el uso de una solución amortiguadora. La composición puede ser estéril y/o sin pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a los humanos.

Las vacunas de acuerdo con la invención se pueden usar ya sea profiláctica o terapéuticamente, pero serán típicamente profilácticas. Por consiguiente, la invención incluye un método para el tratamiento terapéutico o profiláctico de una infección por Streptococcus pyogenes. El animal es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano. Los métodos implican administrar al animal una cantidad terapéutica o profiláctica de las composiciones inmunogénicas de la invención. La invención también proporciona las composiciones inmunogénicas de la invención para tratar, reducir el riesgo o, y/o prevenir una infección por S. pyogenes.

Algunas composiciones de la invención comprenden dos antígenos de GAS diferentes, como se describe anteriormente. Otras composiciones de la invención comprenden por lo menos una molécula de ácido nucleico que codifica los dos antígenos diferentes. Véase, por ejemplo, Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271 -283; Donnelly y colaboradores (1997) Ann. Rev Immunol 15:617-648; Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9:471-480; Apostolopoulos & Plebanski (2000) Curr Opin Mol Ther 2:441-447; lian (1999) Curr Opin Mol Ther 1:116-120; Dubensky y colaboradores (2000) Mol Med 6:723-732; Robinson & Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74; Donnelly y colaboradores (2000) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2):S190-193; Davis (1999) Mt . Sinai J. Med. 66:84-90. Típicamente la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN, por ejemplo, en la forma de un plásmido.

Otras composiciones de la invención, las cuales son útiles terapéuticamente, comprenden dos anticuerpos diferentes, cada uno de los cuales se enlaza específicamente a uno de los dos antígenos de GAS diferentes.

En algunas modalidades, las composiciones de la invención pueden incluir uno o más agentes activos adicionales. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a, (a) un antígeno polipéptido que es útil en una vacuna pediátrica, (b) un antígeno polipéptido que es útil en una vacuna para individuos de edad avanzada o inmunocomprometidos , (c) una molécula de ácido nucleico que codifica (a) o (b) , y (d) un anticuerpo que se enlaza específicamente a (a) o (b) .

Antígenos adicionales Composiciones de la invención se pueden administrar en conjunto con uno o más antígenos adicionales para el uso en métodos terapéuticos o profilácticos de la presente invención. Antígenos adecuados incluyen aquellos listados posteriormente. Adicionalmente , las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar, reducir el riesgo de, o prevenir infecciones causadas por cualquiera de los patógenos listados posteriormente. Además de la combinación con los antígenos posteriormente, las composiciones de la invención también se pueden combinar con un adyuvante como se describe en este documento.

Antígenos adicionales para el uso incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes antígenos expuestos posteriormente, o antígenos derivados de uno o más de los patógenos expuestos a continuación: A. Antígenos Bacterianos Los antígenos bacterianos adecuados para el uso de la invención incluyen proteínas, polisacáridos , lipopolisacáridos , y vesículas de membrana exterior que se pueden aislar, purificar o derivar de una bacteria. Además, los antígenos bacterianos pueden incluir lisados bacterianos y formulaciones de bacterias inactivadas. Los antígenos de bacterias se pueden producir mediante expresión recombinante . Antígenos bacterianos incluyen preferiblemente epítopos que se exponen sobre la superficie de las bacterias durante por lo menos una etapa de su ciclo de vida. Los antígenos bacterianos se conservan preferiblemente a través de múltiples serotipos. Los antígenos bacterianos incluyen antígenos derivados de una o más de las bacterias expuestas a continuación así como también los ejemplos de antígenos específicos identificados a continuación.

Neisseria meningitides : Los antígenos de Meningitides pueden producir proteínas (tales como aquellas identificadas en las referencias 1-7) , sacáridos (que incluyen un polisacárido, oligosacárido o lipopolisacárido) , o vesículas de membrana exterior (referencias 8, 9, 10, 11) purificadas o derivadas del serogrupo N. meningitides tal como A, C, 135, Y, y/o B. Los antígenos de proteína de Meningitides se pueden seleccionar de adhesiones, autotransportadores , toxinas, proteínas de adquisición Fe, y proteínas asociadas con membrana (proteína de membrana exterior preferiblemente integra) .

Streptococcus pneumoniae: Los antígenos de S reptococcus pneumoniae pueden incluir un sacárido (que incluye un polisacárido o un oligosacárido) y/o proteína de Streptococcus pneumoniae. Antígenos de los sacáridos se pueden seleccionar de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, y 33F. Los antígenos de próteína se pueden seleccionar de una proteína identificada en el documento O 98/18931, WO 98/18930, Patente de E.U.A. No. 6,699,703, Patente de E.U.A. No. 6,800,744, WO 97/43303, y WO 97/37026. Las proteínas de Streptococcus pneumoniae se pueden seleccionar de la familia de Triada de Poli Histidina (PhtX) , la familia de la Proteína de Enlace de Colina (CbpX) , truncados de CbpX, familia LytX, truncados LytX, proteínas quiméricas de truncado CbpX-truncado-LytX, neumolisina (Ply) , PspA, PsaA, Spl28, SplOl , Spl30, Spl25 o Spl33.

Streptococcus pyogenes (Estreptococo de grupo A) : Los antígenos de Estreptococo del grupo A pueden incluir una proteína identificada en el documento WO 02/34771 o WO 2005/032582 (que incluyen, pero no se limitan a, GAS39 (Spy0266) , GAS40 (Spy0269, planeado anteriormente), GAS42 (Spy0287) , GAS45 (M5005_Spy0249) , GAS57 (Spy0416) , GAS58 (Spy0430) , GAS67 (Spy0714), GAS68 (Spy0163), GAS84 (Spyl274), GAS88 (Spyl361) , GAS89 (Spyl390) GAS95 (SPyl733) , GAS98 (Spyl882) , GAS99 (Spyl979) , GAS100 (Spy2000) , GAS102 (Spy2016) , GAS117 (Spy0448) , GAS130 (Spy0591) , GAS137 (Spy0652) , GAS146 (Spy0763) , GAS159 (Spyll05) , GAS179 (Spyl718) , GAS193 (Spy2025) , GAS195 (Spy2043) , GAS202 (Spyl309) , GAS217 (Spy0925) , GAS236 (Spyll26) , GAS277 (Spyl939) , GAS294 (Spyll73) , GAS309 (Spy0l24) , GAS366 (Spyl525) , GAS372 (Spyl625) , GAS384 (Spyl874) , GAS389 (Spyl981) , GAS504 (Spyl751) , GAS509 (Spyl618) , GAS290 (SPyl959) , GAS511 (Spyl743) , GAS527 (Spyl204) , GAS529 (Spyl280) , GAS533 (Spyl877) , GAS561 (Spyll34) , GAS613 (Spy01673) y GAS681 (spyll52) otros antígenos de GAS descritos anteriormente en las Tablas A-D, fusiones de fragmentos de proteínas M del GAS (que incluyen aquellas descritas en el documento WO 02/094851, y Dale, Vaccine (1999) 17: 193-200, y Dale, Vaccine 14(10): 944-948) , proteína de enlace a la fibronectina (Sfbl) , proteína hemo-asociada Estr.eptococica (Shp) , y Estreptolisina S (SagA) .

Moraxella catarrhalis Antígenos de Moraxella incluyen antígenos identificados en el documento WO 02/18595 y WO 99/58562, antígenos de proteína de membrana exterior (H W-O P) , C-antígeno, y/o LPS .

Bordetella pertussis: antígenos del tosferina incluyen holotoxina de tosferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también la combinación con el antígeno de pertactina y/o aglutinógenos 2 Y 3.

Staphylococcus aureus : Antígenos de Staphylococcus aureus incluyen polisacáridos capsulares del tipo 5 y 8 del S. aureus conjugados opcionalmente a la exotoxina A de las Pseudomonas aeruginosa recombinante no toxica, tal como StaphVAX™, o antígenos derivados de las proteínas de superficie, invasinas (leucocidina, sinasas, hialuronidasas) , factores de superficie que inhiben la inmersión fagocítica (cápsula, Proteína A), carotenoides , producción de catalasa, Proteína A, coagulasa, factor de coagulación, y/o toxinas que dañan membranas (opcionalmente destoxificadas) que lisan las membranas celulares eucarióticas (hemolisinas , leucotoxinas , leucocidinas) .

Staphylococcus epidermis: Antígenos de S. epidermidis incluyen el antígeno asociado con el limo (SAA) .

Clostridium tetani (Tétanos) : Antígenos del tétanos incluyen toxoide del tétanos (TT) , usado preferiblemente como una proteína portadora en conj nción/conjugado con las composiciones de la presente invención.

Cornynebacterium diphtheriae (Difteria) : Antígenos de difteria incluyen toxina de la difteria, preferiblemente detoxificada, tal como CRM 197. Adicionalmente los antígenos capaces de modular, inhibir o asociarse con la ribosilación de ADP se contemplan para la combinación/co-administración/conjugación con las composiciones de la presente invención. Los toxoides de la difteria se pueden usar como proteínas portadoras.

Haemophilus influenzae B (Hib) : Antígenos de Hib incluyen un antígeno sacárido de Hib.

Pseudomonas aeruginosa: Antígenos de Pseudomonas incluyen endotoxina A, proteína Wzz, LPS de P. aeruginosa, más particularmente LPS aislado de PAOl (serotipo 05) , y/o Proteínas de la Membrana Exterior, que incluyen Proteínas F de la Membrana Exterior (OprF) (Infect Immun. Mayo de 2001; 69(5) : 3510-3515) .

Legionella pneumophila. Antígenos bacterianos se pueden derivar de la Legionella pneumophila .

Streptococcus agalactiae (Estreptococo de grupo B) : Los antígenos del Estreptococo del grupo B incluyen una proteína o antígeno sacárido identificado en los documentos WO 02/34771, WO 03/093306, WO 04/041 157, o WO 2005/002619 (que incluyen proteínas GBS 80, GBS 104, GBS 276 y GBS 322, e incluyen antígenos sacáridos derivados de los serotipos la, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII y VIII).

Neiserria gonorrhoeae : Antígenos de Gonorrhoeae incluyen proteína Por (o porina) tal como PorB (véase Zhu y colaboradores, Vaccine (2004) 22:660 - 669), una proteína de enlace a la transferina, tal TbpA y TbpB (véase Price y colaboradores, Infection e Immunity (2004) 71(1) :277 - 283), una proteína de opacidad (tal como Opa) , una proteína modificable por reducción (Rmp) , y reparaciones de vesículas de membrana exterior (OMV) (véase Plante y colaboradores, J. Infectious Disease 182, 848-55, 2000) , también véase por ejemplo los documentos W099/24578, 099/36544, O99/57280, WO02/079243) .

Chlamydia trachomatis: Antígenos de Chlamydia trachomatis incluyen antígenos derivados de los serotipos A, B, Ba y C (agentes de tracoma, una causa de ceguera) , serotipos Ll, L2 y L3 (asociados con la Lymphogranuloma venereura) , y serotipos D-K. Los antígenos de tracomas de clamidia también pueden incluir un antígeno identificado en los documentos WO 00/37494, WO 03/049762, WO 03/068811, o WO 05/0026Í19, que incluyen PepA (CT045) , LcrE (CT089) , ArtJ (CT381) , DnaK (CT396), CT398, similar a OmpH (CT242), L7/L12 (CT316) , OmcA (CT444), AtosS (CT467), CT547, Eno (CT587), HrtA (CT823), y MurG (CT761) .

Treponema pallidum (Sífilis) : Antígenos de sífilis incluyen el antígeno TmpA.

Haemophilus ducreyi (que causa chancros) : Antígenos de Ducreyi incluyen la proteína de la membrana exterior (DsrA) .

Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium: Antígenos incluyen una repetición de trisacáridos u otros antígenos derivados de Enterococcus proporcionados en la Patente de E.U.A. No. 6,756,361.

Helicobacter pylori: Antígenos de H. pilori incluyen Cag, Vac, Nap, HopX, HopY y/o antígenos de ureasa.

Staphylococcus saprophyticus : Antígenos incluyen la hemaglutinina de 160 kDa del antígeno de S. saprophyticus.

Antígenos de Yersinia enterocolitica incluyen LPS (Infect Immun. Agosto de 2002; 70(8): 4414).

E. coli: Antígenos de E. coli se pueden derivar de E. coli enteroxigénico (ETEC) , E. coli enteroagregativo (EAggEC) , E. coli que se adhiere difusamente (DAEC) , E. coli enteropatogénico (EPEC) , y/o E. coli enterohemorrágico (EHEC) .

Bacillus anthracis (ántrax) : Antígenos de B. anthracis se destoxifican opcionalmente y se pueden seleccionar de componentes A (factor letal (LF) y factor de edema (EF) ) , ambos de los cuales pueden compartir un componente B común conocido como antígeno protector (PA) .

Yersinia pestis (plaga) : Antígenos de plaga incluyen antígeno capsular Fl (Infect Immun. 2003 Jan; 71(1)): 374-383, LPS (Infect Immun. Octubre de 1999; 67(10): 5395) , Antígeno V de Yersinia pestis (Infect Immun. Noviembre de 1997; 65(11): 4476-4482).

Mycobacterium tuberculosis: Antígenos de tuberculosis incluyen lipoproteínas , LPS, antígenos de BCG, una proteína de fusión del antígeno 85B (Ag85B) y/o ESAT-6 opcionalmente formulado en vesículas de lípido catiónico (Infect Immun. Octubre 2004; 72(10): 6148), isocitrato deshidrogenasa de Mycojacte ium tuberculosis (Mtb) asociada con antígenos (Proc Nati Acad Sci EUA. 24 de Agosto de 2004; 101(34): 12652), y/o antígenos MPT51 (Infect Immun. Julio de 2004 ; 72 (7) : 3829) .

Rickettsia : Antígenos incluyen proteína de la membrana exterior, que incluyen la proteína A y/o B de la membrana exterior (OmpB) (Biochim Biophys Acta. 1 de>Noviembre de 2004 ; 1702 (2) : 145), LPS, y antígeno de a proteína de superficie (SPA) (J Autoimmun. Junio de 1989; 2 Suppl: 81) .

Listeria monocytogenes. Antígenos bacterianos se pueden derivar de la Listeria monocytogenes.

Chlamydia pneumoniae: Antígenos incluyen aquellos identificados en el documento WO 02/02606.

Vibrio cholerae : Antígenos incluyen antígenos de proteinasa, LPS, particularmente lipopolisacáridos de Vibrio cholerae II, polisacáridos específicos de Inaba 01, cólera V 0139, antígenos de vacuna IEM 108 (Infect Immun. 2003 Oct; 71 (10) : 5498-504) , y/o toxina de la Zonula occludens (Zot) .

Salmonella typhi (fiebre tifoidea) : Antígenos incluyen polisacáridos capsulares preferiblemente conjugados (Vi, es decir vax-TyVi) .

Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lime) : Antígenos incluyen lipoproteínas (tal como OspA, OspB, Osp C y Osp D) , otras proteínas de superficie tales como proteínas relacionadas con OspE (Erps) , proteínas de enlace a la decorina (tal como DbpA) , y proteínas VI antigénicamente variables, tal como antígenos asociados con P39 y P13 (una proteína de la membrana integral, Infect Immun. Mayo de 2001; 69(5): 3323-3334), Proteína de Variación Antigénica VIsE (J Clin Microbiol. Diciembre de 1999; 37(12): 3997).

Porphyromonas gingivalis : Antígenos incluyen la proteína de membrana exterior de la P. gingivalis (OMP) .

Klebsiella: Antígenos incluyen una OMP, que incluyen OMP A, o un polisacárido conjugado opcionalmente al toxoide del tétanos.

Antígenos bacterianos adicionales de la invención pueden ser antígenos capsulares, antígenos polisacáridos o antígenos proteínicos de cualquiera de lo anterior. Antígenos bacterianos adicionales también pueden incluir una preparación de la vesícula de la membrana exterior (OMV) . Adicionalmente , los antígenos incluyen versiones vivas, atenuadas y/o purificadas de cualquiera de las bacterias mencionadas anteriormente. Los antígenos de presente invención se pueden derivar de bacterias gram positivas o gram negativas. Los antígenos de presente invención se pueden derivar de bacterias aeróbicas o anaeróbicas .

Adicionalmente , cualquiera de los sacáridos derivados de las bacterias anteriores (polisacáridos , LPS, LOS ü oligosacáridos) se pueden conjugar a otro agente o antígeno, tal como una proteína portadora (por ejemplo CRM 197) . Tal conjugación puede ser una conjugación directa efectuada por la aminación reductora de las porciones de carbonilo sobre el sacárido a los grupos amino en la proteína, como se proporciona en la Patente de E.U.A. No. 5,360,897 y Can J Biochem Cell Biol . Mayo de 1984 ; 62 (5) : 270-5. Alternativamente, los sacáridos se pueden conjugar a través de un enlazador, tal como, con succinamidas u otros enlaces proporcionados en Bioconjugate Techniques, 1996 y CRC, Chemistry of Protein Conjugation y Cross-Linking, 1993.

B. Antígenos Virales Antígenos virales adecuados para el uso en la invención incluyen virus inactivado (o exterminado) , virus atenuado, formulaciones de virus fraccionados, formulaciones de sub-unidad purificadas, proteínas virales que se pueden aislar, purificar o derivar de un virus, y partículas similares a virus (VLPs) . Antígenos virales se pueden derivar de virus propagados en el cultivo celular u otro sustrato.

Alternativamente, los antígenos virales se pueden expresar recombinantemente . Los antígenos virales incluyen preferiblemente epítopos que se exponen sobre la superficie del virus durante por lo menos una etapa de su ciclo de vida. Los antígenos virales se conservan preferiblemente a través de múltiples serotipos o aislados. Los antígenos virales incluyen antígenos derivados de uno o más de los virus expuestos a continuación así como también ejemplos de antígenos específicos identificados a continuación.

Orthomyxovirus : Antígenos virales se pueden derivar de un Orthomyxovirus, tal como Influenza A, B y C. Antígenos de Orthomyxovirus se pueden seleccionar de uno o más de las proteínas virales, que incluyen hemaglutinina (HA) , neuraminidasa (NA) , nucleoproteína (NP) , proteína de matriz (Mi), proteína de membrana (M2), uno o más de los componentes de transcriptasa (PB1, PB2 y PA) . Antígenos preferidos incluyen HA y NA.

Antígenos de influenza se pueden derivar de cepas de la gripa interpandémica (anual) . Alternativamente los antígenos de influenza se pueden derivar de cepas con el potencial de causar una epidemia pandémica (es decir, cepas de la influenza con nueva hemaglutinina comparada con la hemaglutinina en cepas actualmente circulantes, o cepas de la influenza que son patogénicas en sujetos aviarios y tienen la potencial de ser transmitidas horizontalmente en la población humana, o cepas de la influenza que son patogénicas a los humanos) .

Virus paramixoviridae : Antígenos virales se pueden derivar de los virus Paramixoviridae, tal como neumovirus (RSV) , Paramyxovirus (PIV) y Morbilivirus (Sarampión) .

Neumovirus: Antígenos virales se pueden derivar de un neumovirus, tal como virus sincitial respiratorio (RSV) , virus sincitial respiratorio bovino, virus neumonía de ratón, y virus de rinotraceitis de pavo. Preferiblemente, el neumovirus es RSV. Los antígenos del neumovirus se pueden seleccionar de uno o más de las siguientes proteínas, que incluyen proteínas de superficie de Fusión (F) , Glicoproteína (G) y proteína Hidrofóbica Pequeña (SH) , proteínas de matriz M y M2 , proteínas de nucleocápside N, P y L y proteínas no estructurales NS1 y NS2. Antígenos del neumovirus preferidos incluyen F, G y M. Véase por ejemplo, J Gen Virol. Noviembre de 2004; 85 (Pt 11) :3229) . Antígenos del neumovirus también se pueden formular en o derivar de virus quiméricos. Por ejemplo, los virus RSV/PIV quiméricos pueden comprender componentes de tanto RSV como PIV.

Paramyxovirus: Antígenos virales se pueden derivar de un Paramyxovirus, tal como virus de la Parainfluenza tipos 1 - 4 (PIV), Paperas, virus Sendai, virus de Simios 5, virus de la parainfluenza de Bovino y virus de la enfermedad de Newcastle. Preferiblemente, el Paramyxovirus es PIV o Paperas. Los antígenos del Paramyxovirus se pueden seleccionar de uno o más de las siguientes proteínas: Hemaglutinina-Neuraminidasa (HN) , Proteínas de fusión Fl y F2 , Nucleoproteína (NP) , Fosfoproteína (P) , proteína grande (L) , y proteína de Matriz (M) . Proteínas de Paramyxovirus preferidas incluyen HN, Fl y F2. Los antígenos del Paramyxovirus también se pueden formular en o derivar de virus quiméricos. Por ejemplo los virus RSV/PFV quiméricos pueden comprender componentes de tanto RSV como PIV. Las vacunas de paperas comercialmente disponibles incluyen virus paperas atenuados vivos, en ya sea una forma monovalente o en combinación con vacunas del sarampión y rubéola (MMR) .

Morbilluvirus : Antígenos virales se pueden derivar de un Morbilluvirus, tal como sarampión. Antígenos de Morbilluvirus se pueden seleccionar de uno o más de las siguientes proteínas: hemaglutinina (H) , Glicoproteína (G) , factor de Fusión (F) , proteína Grande (L) , Nucleoproteína (NP) , fosfoproteína de Polimerasa (P) , y Matriz (M) . Vacunas de sarampión comercialmente disponibles incluyen virus de sarampión atenuado vivo, típicamente en combinación con paperas y rubéola (MMR) .

Picornavirus : Antígenos virales se pueden derivar de Picornavirus, tal como Enterovirus, Rinovirus, Heparnavirus , Cardiovirus y Aftovirus. Antígenos derivados de Enterovirus, tal como Poliovirus son preferidos.

Enterovirus : Antígenos virales se pueden derivar de un Enterovirus, tal como Poliovirus de tipos 1, 2 o 3, virus A Coxsaquie tipos 1 a 22 y 24, virus B Coxsaquie tipos 1 a 6, virus Ecovirus (ECHO)) tipos 1 a 9, 11 a 27 y 29 a 34 y Enterovirus 68 a 71. Preferiblemente, el Enterovirus es poliovirus. Los antígenos del Enterovirus se seleccionan preferiblemente de una o más de las siguientes proteínas de la Cápside VPl , VP2 , VP3 y VP4. Vacunas de polio comercialmente disponibles incluyen Vacuna de Polio Inactivada (IPV) y vacuna de poliovirus oral (OPV) .

Heparnavirus : Antígenos virales se pueden derivar de un Heparnavirus, tal como virus de Hepatitis A (HAV) . Vacunas de HAV comercialmente disponibles que incluyen vacunas de HAV inactivada.

Togavirus : Antígenos virales se pueden derivar de un Togavirus, tal como un Rubivirus, un Alfavirus, o un Arterivirus. Antígenos derivados de Rubivirus, tal como virus de Rubéola, son preferidos. Antígenos de Togavirus se pueden seleccionar de El, E2 , E3 , C, NSP-1, NSPO-2, NSP-3 o NSP-4. Los antígenos de Togavirus se seleccionan preferiblemente de El, E2 o E3. Vacunas de Rubéola comercialmente disponible incluyen un virus adaptado al frío vivo, típicamente en combinación con vacunas de paperas y sarampión (M R) .

Flavivirus: Antígenos virales se pueden derivar de un Flavivirus, tal como encefalitis transmitida por Garrapatas ( BE) , Dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), Fiebre Amarilla, encefalitis Japonesa, encefalitis del Nilo del Oeste, encefalitis de San Luis, encefalitis de primavera-verano Rusa, encefalitis Powassan. Antígenos de Flavivirus se pueden seleccionar de PrM, M, C, E, NS-1, NS-2a, NS2b, NS3 , NS4a, NS4b, y NS5. Antígenos de Flavivirus se seleccionan preferiblemente de PrM, M y E. La vacuna de TBE comercialmente disponible incluye vacunas de virus inactivado .

Pestivirus: Antígenos virales se pueden derivar de un Pestivirus, tal como diarrea viral Bovina (BVDV) , fiebre porcina Clásica (CSFV) o enfermedad de la Frontera (BDV) .

Hepadnavirus: Antígenos virales se pueden derivar de un Hepadnavirus, tal como virus de la Hepatitis B. Los antígenos de Hepadnavirus se pueden seleccionar de antígenos de superficie (L, M y S) , antígenos de núcleo (HBc, HBe) . Las vacunas de HBV comercialmente disponibles incluyen vacunas de sub-unidades que comprenden la proteína S del antígeno de superficie .

Virus de Hepatitis C: Antígenos virales se pueden derivar de un virus de Hepatitis C (HCV) . Los antígenos de HCV se pueden seleccionar de uno o más de El, E2, E1/E2, poliproteína NS345, poliprotéína de núcleo NS 345, núcleo y/o péptidos de las regiones no estructurales (Houghton y colaboradores, Hepatology (1991) 14:381).

Rabdovirus: Antígenos virales se pueden derivar de un Rabdovirus, tal como un Lisavirus (virus de la Rabia) y Vesiculovirus (VSV) . Los antígenos de Rabdovirus se pueden seleccionar de glicoproteína (G) , nucleoproteína (N) , proteína grande (L) , proteínas no estructurales (NS) . Vacuna de virus de la Rabia comercialmente disponible comprende virus exterminados desarrollados en células diploides humanas o células del pulmón de resus fetal .

Caliciviridae : Antígenos virales se pueden derivar de Calciviridae , tal como virus de Norwalk, y Virus similares a Norwalk, tal como Virus de Hawaii y Virus de las Montañas Nevadas .

Coronavirus: Antígenos virales se pueden derivar de un Coronavirus, SARS, Coronavirus respiratorio Humano, bronquitis infecciosa Aviar (IBV), virus de hepatitis de Ratón (MHV) , y virus de gastroenteritis transmisible Porcino (TGEV) . Antígenos de Coronavirus se pueden seleccionar de pico (S) , envoltura (E) , Matriz (M) , nucleocápside (N) , y glicoproteína de Hemaglutinina-esterasa (HE) . Preferiblemente el antígeno de Coronavirus se deriva de un virus de SARS. Los antígenos virales de SARS se describen en el documento WO 04/92360.

Retrovirus: Antígenos virales se pueden derivar de un Retrovirus, tal como un Oncovirus, un Lentivirus o un Espumavirus . Antígenos de Oncovirus se pueden derivar de HTLV-1, HTLV-2 o HTLV-5. Antígenos de Lentivirus se pueden derivar de HIV-1 o HIV-2. Antígenos de Retrovirus se pueden seleccionar de gag, pol, env, tax, tat, rex, rev, nef, vif, vpu, y vpr. Antígenos de HIV se pueden seleccionar de gag (p24gag y p55gag) , env (gpl60 y gp41) , pol, tat, nef, rev vpu, miniproteínas , (preferiblemente supresión de p55 gag y gpl40v) . Antígenos de HIV se pueden derivar de una o más de las siguientes cepas: HlVIIIb, HIVSF2, HIVLAV, HIVLAI, HIVMN, HIV-1CM235, HIV-1US4.

Reovirus: Antígenos virales se pueden derivar de un Reovirus, tal como un Ortoreovirus , un Rotavirus, un Orbivirus, o un Coltivirus. Antígenos de Reovirus se pueden seleccionar de proteínas estructurales ??, ?2 , ?3 , µ?, µ2, s? , s2 , o s3 , o proteínas no estructurales oNS, µ??, o oís. Antígenos de Reovirus preferidos se pueden derivar de un Rotavirus. Antígenos de Rotavirus se pueden seleccionar de VP1, VP2, VP3, VP4 (o el producto escindido VP5 y VP8) , NSP1, VP6, NSP3, NSP2, VP7 , NSP4 , o NSP5. Antígenos de Rotavirus preferidos incluyen VP4 (o el producto escindido VP5 y VP8) , y VP7.

Parvovirus: Antígenos virales se pueden derivar de un Parvovirus, tal como Parvo virus B 19. Antígenos de Parvovirus se pueden seleccionar de VP-1, VP-2, VP-3, NS-1 y NS-2. Preferiblemente, el antígeno de Parvovirus es la proteína de la cápside VP-2.

Virus de hepatitis Delta (HDV) : Antígenos virales se pueden derivar de HDV, particularmente d-antígeno de HDV (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,378,814).

Virus de Hepatitis E (HEV) : Antígenos virales se pueden derivar de HEV.

Virus de Hepatitis G (HGV) : Antígenos virales se pueden derivar de HGV.

Virus humano del herpes: Antígenos virales se pueden derivar de un Virus humano del herpes, tal como Virus Simple de Herpes (HSV) , virus de Varicela- zoster (VZV) , virus de Epstein-Barr (EBV) , Citomegalovirus (CMV) , Virus humano del herpes 6 (HHV6) , Virus humano del herpes 7 (HHV7) , y Virus humano del herpes 8 (HHV8) . Los antígenos de Virus humano del herpes se pueden seleccionar de proteínas tempranas inmediatas (a), proteínas tempranas (ß), y proteínas posteriores (?) . Antígenos de HSV se pueden derivar de las cepas HSV-1 o HSV-2. Antígenos de HSV se pueden seleccionar de glicoproteínas gB, gC, gD y gH, proteína de fusión (gB) , o proteínas de escape inmunes (gC, gE, o gl) . Antígenos de VZV se seleccionar de proteínas de núcleo, de nucleocápside , del tegumento, o de envoltura. Una vacuna de VZV atenuada viva es comercialmente disponible. Antígenos de EBV se pueden seleccionar de proteínas del antígeno temprano (EA) , antígeno de la cápside viral (VCA) , y glicoproteínas del antígeno de membrana (MA) . Antígenos de CMV se pueden seleccionar de proteínas de la cápside, glicoproteínas de envoltura (tal como gB y gH) , y proteínas del tegumento.

Papovavirus : Antígenos se pueden derivar de Papovavirus, tal como Papilomavirus y Poliomavirus . Los Papilomavirus incluyen serotipos de HPV 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51 , 57, 58, 63 y 65. Preferiblemente, los antígenos de HPV se derivan de serotipos 6, 11, 16 o 18. Los antígenos de HPV se pueden seleccionar de proteínas de la cápside (Ll) y (L2) o El - E7, o fusiones de las mismas. Antígenos de HPV se formulan preferiblemente en partículas similares a virus (VLPs) . Virus de Poliomavirus incluyen virus BK y virus JK. Antígenos de Poliomavirus se pueden seleccionar de VPl, VP2 o VP3.

Se proporcionan adicionalmente antígenos, composiciones, métodos, y microbios incluidos en las Vacunas 4th Edition (Plotkin y Orenstein ed. 2004) ; Medical Microbiology 4th Edition (Murray y colaboradores ed. 2002); Virology, 3rd Edition (W.K. Joklik ed. 1988) ; Fundamental Virology, 2nd Edition (B.N. Fields y D. M. Knipe, eds . 1991), los cuales se contemplan en conjunto con las composiciones de la presente invención.

C. Antígenos Fúngicos.

Los antígenos fúngicos por el uso en la invención se pueden derivar de uno o más de los hongos expuestos a continuación.

Antígenos fúngicos se pueden derivar de Dermatofitos , que incluyen: E idermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes , Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. álbum, var . discoides, var . ochraceum, Trichophyton violaceum, y/o Trichophyton faviforme.

Patógenos fúngicos se pueden derivar de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi , Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis , Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis , Candida guilliermondi , Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neofonnans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporotrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix sp . , Basidiobolus spp . , Conidiobolus spp . , Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp . , Alternaría spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, y Cladosporium spp.

Procesos para producir antígenos fúngicos son bien conocidos en la técnica (véase la Patente de E.U.A. No. 6,333, 164). En un método preferido una fracción solubilizada extraída y separada de una fracción insoluble obtenible de células fúngicas de las cuales la pared celular se ha removido sustancialmente o por lo menos removido parcialmente, se caracterizan en que el proceso comprende las etapas de: obtener células fúngicas vivas, obtener células de las cuales la pared celular se ha removido sustancialmente o se ha removido por lo menos parcialmente; estallido de las células fúngicas de las cuales la pared celular se ha removido sustancialmente o se ha removido por lo menos parcialmente; obtener una fracción insoluble; y extraer y separar una fracción solubilizada de la fracción insoluble.

D. Antígenos de STD Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos derivados de una enfermedad sexualmente transmitida (STD) . Tales antígenos pueden proporcionar profilaxis o terapia para las STD ' s tales como clamidia, herpes genital, hepatitis (tal como HCV) , verrugas genitales, gonorrea, sífilis y/o chancros (véase, el documento WO00/ 15255) . Los antígenos se pueden derivar de una o más STD 1 s virales o bacterianas. Los antígenos de STD virales para el uso en la invención se pueden derivar de, por ejemplo, HIV, virus de herpes simple (HSV-1 y HSV-2) , virus del papiloma humano (HPV) , y hepatitis (HCV) . Antígenos de STD bacterianos para el uso en la invención se pueden derivar de, por ejemplo, Neiserria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema palidum, Hemofilus ducreyi, E. coli, y Streptococcus agalactiae. Ejemplos de antígenos específicos derivados de estos patógenos se describen anteriormente.

E. Antígenos Respiratorios Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos derivados de un patógeno que causa enfermedad respiratoria. Por ejemplo, los antígenos respiratorios se pueden derivar de un virus respiratorio tal como Orthomyxovirus (influenza) , Pneumovirus (RSV) , Paramyxovirus (PIV) , Morbilivirus (sarampión) , Togavirus (Rubéola) , VZV, y Coronavirus (SARS) . Antígenos respiratorios se pueden derivar de una bacteria que causa enfermedad respiratoria, tal como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Bacillus anthracis, y Moraxella catarrhalis. Ejemplos de antígenos específicos derivados de estos patógenos se describen anteriormente .

F. Antígenos de Vacuna Pediátrica Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos adecuados para el uso en sujetos pediátricos. Los sujetos pediátricos son típicamente menor de aproximadamente 3 años de edad, o menores de aproximadamente 2 años de edad, o menor de aproximadamente 1 año de edad. Los antígenos pediátricos se pueden administrar múltiples veces durante el curso de 6 meses, 1, 2 o 3 años. Los antígenos pediátricos se pueden derivar de un virus que puede fijar como objetivo poblaciones pediátricas y/o virus de los cuales las poblaciones pediátricas son susceptibles a infección. Antígenos virales pediátricos incluyen antígenos derivados de uno o más de Orthomyxovirus (influenza) , Pneumovirus (RSV) , Paramyxovirus (PIV y Paperas) , Morbillivirus (sarampión) , Togavirus (Rubéola) , Enterovirus (polio) , HBV, Coronavirus (SARS) , y virus de Varicela- zoster (VZV) , Virus de Epstein Barr (EBV) . Antígenos bacterianos pediátricos incluyen antígenos derivados de uno o más de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides , Streptococcus pyogenes (Estreptococo del Grupo A), Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani (Tétanos), Cornynebacterium diphtheriae (Difteria) , Haemofilus influenzae B (Hib) , Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae (Estreptococo del Grupo B) , y E. coli. Ejemplos de antígenos específicos derivados de estos patógenos se describen anteriormente.

G. Antígenos adecuados para el uso en individuos de Edad Avanzada o Inmunocomprornetidos .

Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos adecuados para el uso en individuos de edad avanzada o inmunocomprornetidos . Tales individuos pueden necesitar ser vacunados más frecuentemente, con dosis más altas o con formulaciones adyuvadas para mejorar su respuesta inmunitaria a los antígenos objetivos. Los antígenos que se pueden fijar como objetivo para el uso en individuos de Edad Avanzada o Inmunocomprometidos incluyen antígenos derivados de uno o más de los siguientes patógenos: Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (Estreptococo de Grupo A) , Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Clostridium tetani (Tétanos) , Cornynebacterium diphtheriae (Difteria) , Haemofilus influenza B (Hib) , Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Streptococcus agalactiae (Estreptococo de Grupo B) , Enterococcus faecalis, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Orthomyxovirus (influenza), Pneumovirus (RSV) , Paramyxovirus (PIV y Paperas) , Morbillivirus (sarampión) , Togavirus (Rubéola) , Enterovirus (polio) , HBV, Coronavirus (SARS) , virus de Varicella-zoster (VZV) , virus de Epstein Barr (EBV) , Cytomegalovirus (CMV) . Ejemplos de antígenos específicos derivados de estos patógenos se describen anteriormente.

H. Antígenos adecuados para el uso en Vacunas para Adolescentes.

Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos adecuados para el uso en sujetos adolescentes. Los adolescentes pueden estar en necesidad de un refuerzo de un antígeno pediátrico previamente administrado. Los antígenos pediátricos que pueden ser adecuados para el uso en adolescentes se describen anteriormente. Además, los adolescentes se pueden fijar como objetivo para recibir antígenos derivados de un patógeno de STD a fin de asegurar una inmunidad protectora o terapéutica antes del comienzo de la actividad sexual. Los antígenos de STD que pueden ser adecuados para el uso en adolescentes se describen anteriormente.

I. Formulaciones de Antígenos.

En otros aspectos de la invención, se proporcionan métodos para producir micros partículas que tienen antígenos adsorbidos, los métodos comprenden: (a) proporcionar una emulsión al dispersar una mezcla que comprende (i) agua, (ii) un detergente, (iii) un solvente orgánico y (iv) un polímero biodegradable seleccionado de grupo que consiste de un poli (a-hidroxi ácido) , un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, una poliortoéster, un polianhidrido, y un policianoacrilato . El polímero esta típicamente presente en la mezcla en una concentración de aproximadamente 1% a aproximadamente 30% relativo al solvente orgánico, mientras que el detergente esta típicamente presente en la mezcla en una relación de detergente a polímero de peso a peso de aproximadamente 0.00001:1 a aproximadamente 0.1:1 (más típicamente de manera aproximada 0.0001:1 a aproximadamente 0.1:1 , aproximadamente 0.001:1 a aproximadamente 0.1:1 , o de aproximadamente 0.005:1 a aproximadamente 0.1:1); (b) remover el solvente orgánico de emulsión; y (c) adsorber un antígeno sobre la superficie de las micro partículas. En ciertas modalidades, el polímero biodegradable está presente en una concentración de aproximadamente 3% a aproximadamente 10% relativo al solvente orgánico.

Las micropartículas para el uso en este documento se formaran a partir de materiales que son esterilizables , no tóxicos y biodegradables . Tales materiales incluyen, sin limitación, poli (cx-hidroxi ácido), ácido polihidroxibutirico, policaprolactona, poliortoéster, polianhidrido, PACA, y policianoacrilato . Preferiblemente, las micro partículas para el uso con la presente invención se derivan del un poli(a-hidroxi ácido), en particular, de un poli (lacturo) ("PLA") o un copolímero de D,L-lacturo y glicólido o ácido glicólico, tal como un poli (D, L-lacturo-co-glicólido) ( "PLG" o "PLGA" ) , 0 un copolímero de D,L-lacturo y caprolactona . Las micro partículas se pueden derivar de cualquiera de diversos materiales de partida poliméricos que tienen una variedad de pesos moleculares y, en el caso de los copolímeros tal como as PLG, una variedad de relaciones de lacturo :gliclólido, la selección de las cuales será grandemente un tema de selección, dependiendo en parte en la macro molécula coadministrada. Estos parámetros se plantean más completamente a continuación.

Antígenos adicionales también pueden incluir una preparación de vesícula de membrana exterior (OMV) .

Métodos de formulación adicionales y antígenos (especialmente antígenos tumorales) se proporcionan en la Patente de E.U.A. No. De serie 09/581,772.

J. Referencias del Antígeno Las siguientes referencias incluyen antígenos útiles en conjunto con las composiciones de la presente invención : 1 Solicitud de Patente Internacional W099/24578. 2 Solicitud de Patente Internacional W099/36544. 3 Solicitud de Patente Internacional WO99/57280. 4 Solicitud de Patente Internacional WOOO/22430. 5 Tettelin y colaboradores (2000) Science 287: 1809- 1815. 6 Solicitud de Patente Internacional W096/29412. 7 Pizza y colaboradores (2000) Science 287: 1816- 1820. 8 PCT WO 01/52885. 9 Bjune y colaboradores (1991) Lancet 338(8775). 10 Fuskasawa y colaboradores (1999) Vaccine 17:2951-2958. 11 Rosenqist y colaboradores (1998) Dev. Biol . Strand 92:323-333. 12 Constantino y colaboradores (1992) Vaccine 10:691 -698. 13 Constantino y colaboradores (1999) Vaccine 17: 1251- 1263. 14 Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331 -332. 15 Rubín (20000) Pediatr Clin North Am 47 : 269-285 , v. 16 Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65: 187-207. 17 Solicitud de patente Internacional presentada el 3 de Julio del 2001 que reclama la prioridad de GB- 0016363.4 ;WO 02/02606; PCT IB/Ol/00166. 18 Kalman y colaboradores (1999) Nature Genetics 21:385- 389. 19 Read y colaboradores (2000) Nucleic Acids Res 28:1397- 406. 20 Shirai y colaboradores (2000) J. Infect. Dis 181(Suppl 3) ¡S524-S527. 21 Solicitud de Patente Internacional O99/27105. 22 Solicitud de Patente Internacional O00/27994. 23 Solicitud de Patente Internacional WO00/37494. 24 Solicitud de Patente Internacional W099/28475. 25 Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187- 1188. 26 Iwarson (1995) APMIS 103:321-326. 27 Gerlich y colaboradores (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80. 28 Hsu y colaboradores (1999) Clin Liver Dis 3:901-915. 29 Gastofsson y colaboradores (1996) N. Engl . J. Med. 334- :349-355. 30 Rappuoli y colaboradores (1991) TIBTECH 9:232-238. 31 Vaccines (1988) eds . Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216- 1946-0. 32 Del Guidice y colaboradores (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70. 33 Solicitud de Patente Internacional WO93/018150. 34 Solicitud de Patente Internacional WO99/53310. 35 Solicitud de Patente Internacional O98/04702. 36 Ross y colaboradores (2001) Vaccine 19: 135- 142. 37 Sutter y colaboradores (2000) Pediatr Clin North Am 47 : 287-308. 38 Zimmerraan & Spann (1999) Am Fan Physician 59: 1 13-1 18, 125-126. 39 Dreensen (1997) Vaccine 15 Suppl"S2-6. 40 MMWR Morb Mortal Wkly rep 1998 Jan 16:47(1): 12:9. 41 McMichael (2000) Vaccinel9 Suppl 1:S101-107. 42 Schuchat (1999) Lancer 353 (9146) : 51-6. 43 Solicitudes de patente de Gran Bretaña 0026333.5, 0028727.6 & 0105640.7. 44 Dale (1999) Infect Disclin North Am 13:227-43, viii. 45 Ferretti y colaboradores (2001) PNAS USA 98:4658-4663. 46 Kuroda y colaboradores (2001) Lancet 35 (9264) : 1225-1240 ; see also pages 1218-1219. 47 Rarasay y colaboradores (2001) Lancet 357 ( 9251) : 195-196. 48 .Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36. 49 Buttery & Moxon (2000) J R Coil Physicians Long 34:163-168. 50 Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:1 13-133, vii. 51 Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol . 47:663-567. 52 Patente Europea 0 477 508. 53 Patente de E.U.A. No. 5,306,492. 54 Solicitud de Patente Internacional W098/42721. 55 Conjúgate Vaccines (eds. Cruse y colaboradores) ISBN 3805549326, particularmente vol . 10:48-114. 56 Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISB : 012323368 & 012342335X. 57 Solicitud de patente Europea 0372501. 58 Solicitud de patente Europea 0378881. 59 Solicitud de patente Europea 0427347. 60 Solicitud de Patente Internacional W093/17712. 61 Solicitud de Patente Internacional W098/58668. 62 Solicitud de patente Europea 0471177. 63 Solicitud de Patente Internacional WOOO/56360. 64 Solicitud de Patente Internacional WOOO/67161.

Los contenidos de todas las patentes citadas anteriormente, solicitudes de patentes, y artículos de revistas se incorporan a manera de referencia como si se expusiera completamente en este documento.

Donde se usa, un antígeno sacárido o carbohidrato, se conjuga preferiblemente a una proteína portadora a fin de mejorar la inmunogenicidad. Véase Ramsay y colaboradores (2001) Lancet 357 (9251) : 195-196 ; Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36; Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34:163-168; Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:1 13-133, vii; Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol . 47:563-567; Patente Europea 0 477 508; Patente de E.U.A. No. 5,306,492; W098/42721; Conjúgate Vaccines (eds. Cruse y colaboradores) ISBN 3805549326, particularmente volumen 10:48-114; Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 0123423368 o 012342335X. Proteínas portadoras preferidas son toxinas bacterianas o toxoides, tales como toxoides de difteria o tétanos. El toxoide de difteria CRM 197 es particularmente preferido.

Otros polipéptidos portadores incluyen la proteína de membrana exterior N. meningitidis (EP-A-0372501) , péptidos sintéticos (EP-A-0378881 y EP-A 0427347) , proteínas de choque de calor ( O 93/17712 y O 94/03208) , proteínas de tosferina (WO 98/58668 y EP A 0471 177) , proteína D de influenza H (WO 00/56360) , citocinas (WO 91/01 146) , linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, toxina A o B de C. difíciles (WO 00/61761) , proteínas de captación de hierro (WO 01/72337) , etc. Donde una mezcla comprende un sacárido capsular de ambas serigrafías A y C, se pueden preferir que la relación (p/p) de sacárido MenA sacárido : MenC es mayor que 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Se pueden conjugar diferentes sacáridos al mismo o diferente tipo de proteína portadora. Cualquier razón de conjugación adecuada se puede usar, con cualquier enlazador adecuado donde sea necesario.

Los antígenos de proteína tóxica se pueden destoxificar donde sea necesario por ejemplo, destoxificación de la toxina de tosferina por medios químicos y/o genéticos.

Portadores farmacéuticamente aceptables Las composiciones de la invención típicamente, además de los componentes mencionados anteriormente, comprenderán uno o más "portadores farmacéuticamente aceptables" . Estos incluyen cualquier portador que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos nocivos al individuo que recibe la composición. Portadores adecuados típicos son macro moléculas lentamente metabolizadas , grandes tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, y agregados de lípidos (tales como gotitas de aceite o liposomas) . Tales portadores son bien conocidos por aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnica. Una composición también puede contener un diluyente, tal como agua, solución salina, glicerol, etcétera. Adicionalmente , una sustancia auxiliar, tal como un agente de humectación o emulsionante, sustancia amortiguadora de pH y los similares, pueden estar presentes. En un planteamiento a fondo de los componentes farmacéuticamente aceptables está disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science y Practice of Pharmacy. 20th ed., ISBN: 0683306472.

Agentes Inmunorreguladores Adyuvantes Las vacunas de la invención se pueden administrar en conjunto con otros agentes inmunoreguladores . En particular, las composiciones incluirán usualmente un adyuvante. Los adyuvantes para el uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes expuestos a continuación: A. Composiciones que Contienen Minerales Las composiciones que contienen minerales adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo hidroxifosfatos , ortofosfatos) , sulfatos, etc. (por ejemplo véase los capítulos 8 y 9 de Vaccine Design... (1995) eds . Powell & Newman. ISBN: 030644867X, Plenum Press) , o mezclas de diferentes compuestos minerales (por ejemplo, una mezcla de un fosfato y un adyuvante de hidróxido, opcionalmente con un exceso del fosfato) con los compuestos que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo gel, cristalino, amorfo, etc.) y con adsorción a la (s) sal(s) que se prefieren. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal de metal (WO00/23105) .

Las sales de aluminio se pueden incluir en las vacunas de la invención tal que la dosis de Al3+ está entre 0.2 y 1.0 mg por dosis.

En una modalidad el adyuvante basado en aluminio para el uso de la presente invención es alumbre (sulfato de potasio de aluminio (A1K(S04) 2) ) ; o un derivado de alumbre, tal como aquel formado in situ al mezclar un antígeno en solución amortiguadora de fosfato con alumbre, seguido por la titulación y precipitación con una base tal como hidróxido de amonio o hidróxido de sodio.

Otro adyuvante basado en aluminio para el uso en las formulaciones de vacunas de la presente invención es adyuvante de hidróxido de aluminio (A1(0H)3) u oxihidróxido de aluminio cristalino (A100H) , el cual es un adsorbente excelente, que tiene un área superficial de aproximadamente 500m2/g. Alternativamente, se proporciona el adyuvante de fosfato de aluminio (AIP04) o hidroxifosfato de aluminio, que contiene grupos fosfato en lugar en lugar de alguno o todos los grupos hidroxilo del adyuvante de hidróxido de aluminio. Los adyuvantes de fosfato de aluminio preferidos proporcionados en este documento son amorfos y solubles en medios ácidos, básicos y neutros.

En otra modalidad el adyuvante de la invención comprende tanto fosfato de aluminio como hidróxido de aluminio. En una modalidad más particular de la misma, el adyuvante tiene una mayor cantidad de fosfato de aluminio que hidróxido de aluminio tal como una relación de 2:1 , 3:1 , 4:1 , 5:1 , 6:1, 7:1, 8:1 , 9:1 o mayor que 9:1, en peso de fosfato de aluminio a hidróxido de aluminio. Más particularmente aún, las áreas de aluminio en la vacuna están presentes en 0.4 a 1.0 mg por dosis de vacuna, o 0.4 a 0.8 mg por dosis de vacuna, o 0.5 a 0.7 mg por dosis de vacuna o aproximadamente 0.6 mg por dosis de vacuna.

Generalmente, el (los) adyuvante (s) basado (s) en aluminio preferido (s) , o relación de múltiples adyuvantes basados en aluminio, tal como fosfato de aluminio a hidróxido de aluminio se selecciona mediante la optimización de la atracción electrostática entre las moléculas tal que el antígeno lleva una carga opuesta como el adyuvante como el pH deseado. Por ejemplo, el adyuvante de fosfato de aluminio (punto isoeléctrico = 4) adsorbe lisozimas, pero no albúmina en pH 7.4. La albúmina debe ser el objetivo, el adyuvante de hidróxido de aluminio se seleccionaría (iep 11.4) Alternativamente, el pre-tratamiento de hidróxido de aluminio con fosfato baja su punto isoeléctrico, haciéndolo un adyuvante preferido para antígenos más básicos.

B. Emulsiones en Aceite.

Las composiciones de emulsión en aceite adecuadas para el uso como adyuvantes de la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua , tal como MF59 (5% de Escualeno, 0.5% TWEEN 80MR, y 0.5% de Span 85, formulados en partículas de sub-micra que usan un microfluidizador) . Véase el documento WO90/14837. También véase, Podda, Vaccine (2001) 19:2673-2680; Frey y colaboradores, Vaccine (2003) 21:4234-4237. MF59 se usa como el adyuvante en la vacuna de sub-unidad trivalente de virus de la influenza FLUADMR.

Adyuvantes particularmente preferidos para el uso en las composiciones son emulsiones de aceite en agua de sub-micra. Las emulsiones de aceite en agua de sub-micra preferidas para el uso en este documento son emulsiones de escualeno/agua que contienen opcionalmente cantidades variantes de MTP-PE, tal como una emulsión de aceite en agua de sub-micra que contienen 4-5% p/v de escualeno, 0.25-1.0% p/v de TWEEN 80MR (monoleato de polioxietilensorbitan) , y/o 0.25-1.0% de SPAN 85™ (trioleato de sorbitan) , y, opcionalmente , N-acetilmuramil -L-alanil-D- isogluatininil-L-alanina-2- (11 -21 - dipalmitoil-sn-glicero-3-huidroxifosfoforiloxi) -etilamina (MTP-PE) , por ejemplo, la emulsión de aceite en agua de sub-micra conocida como "MF59" (Publicación Internacional No. WO90/14837; Patentes de EUA Nos. 6,299,884 y 6,451,325, y Ott y colaboradores, in Vaccine Design: The Subunit y Adjuvant Approach (Powell, M. F. y Newman, MJ. eds . ) Plenum Press, New York, 1995, p . 277-296). El MF59 contiene 4-5% p/v de escualeno (por ejemplo 4.3%), 0.25-0.5% p/v de TWEEMR 8, y 0.5% p/v SPAN 85MR y contiene opcionalmente varias cantidades de MTP-PE, formulados en partículas de sub-micras que usan un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo HOY (Microfluidics , Newton, MA) . Por ejemplo, el MTP-PE puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0-500 µg/dosis, más preferiblemente 0-250 µg/dosis y mucho más preferiblemente, 0-100 µg/dosis. Como se usa en este documento, el término "MF59-0" se refiere a la emulsión de aceite en agua de sub-micra anterior que carece de MTP-PE, mientras que el término MF59-MTP indica una formulación que contiene MTP-PE. Por ejemplo, el "MF59-100" contiene 100 µ MTP-PE por dosis y así sucesivamente. El MF69, otra emulsión de aceite en agua de sub-micra para el uso en este documento, contiene 4.3% p/v de escualeno, 0.25% p/v TWEE80MR, y 0.75% p/v de SPA 85MR y opcionalmente MTP-PE. Todavía otra emulsión de aceite en agua de sub-micra es MF75, también conocida como SAF, que contiene 10% de escualeno, 0.4% de TWEENMR 80, 5% de polímero bloqueado con pluronic L121, y thr-MDP, también microfluidizado en una emulsión de sub-micra. La MF75- TP indica una formulación de MF75 que incluye MTP, tal como de 100-400 g de MTP-PE por dosis .

Las emulsiones de aceite en agua de sub-micras, métodos para elaborar las mismas y agentes inmunoestimulantes , tales como péptidos de muramilo, para el uso en las composiciones, se describen en detalle en el documento WO90/14837 y en las Patentes de EUA 6,299,884 y 6,451,325.

El adyuvante de Freund completo (CFA) y el adyuvante de Freund incompleto (IFA) también se pueden usar como adyuvantes en la invención.

C. Formulaciones de Saponina Las formulaciones de saponina también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glicósidos de esterol y glicósidos de triterpenoide que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces y aún en las flores de una amplia gama de especie de plantas. Las saponinas aisladas de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina se han estudiado ampliamente como adyuvantes. Las saponinas también se pueden obtener comercialmente de la Smilax omata (zarzaparrilla) , Gypsophilla paniculata (velo de las novias) , y Saponaria officianalis (raíz de saponaria) . Las formulaciones de adyuvante de Saponina incluyen formulaciones purificadas, tal como as QS21, así como también formulaciones de lípidos, tal como ISCOMs.

Las composiciones de saponina se han purificado usando la Cromatografía de Capa Delgada de Alto Desempeño (HP-TLC) y cromatografía Liquida de Alto Desempeño de Fase Inversa (RP-HPLC) . Las fracciones purificadas especificas que usan estas técnicas se han identificado, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferiblemente, la saponina es QS21. Un método de producción de la QS21 se da a conocer en la Patente de E.U.A. 5,057,540. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol (véase el documento W096/33739) .

Combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para formar partículas únicas llamadas Complejos Inmunoestimulantes (ISCOMs). Los ISCOMs también incluyen típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina . Cualquier saponina conocida se puede usar en ISCOMs. Preferiblemente, el ISCOM incluye uno o más de Quil A, QHA y QHC. Los ISCOMs se describen adicionalmente en los documentos EP0109942, W096/11711 y W096/33739. Opcionalmente , los ISCOMS pueden carecer de (un) detergente (s) adicional (es) . Véase el documento WOOO/07621.

Una revisión del desarrollo de los adyuvantes basados en saponina se pueden encontrar por Barr, y colaboradores, Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32:247-271. Véase también Sjolander, y colaboradores, Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32:321-338.

D. Virosomas y Partículas Similares a Virus (VLPs) Los Virosomas y las Partículas Similares a (VLPs) también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen generalmente una o más proteínas de un virus combinado o formulado opcionalmente con un fosfolípido. Son generalmente no patogénicos, no de replicación y no contienen generalmente nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales se pueden producir o aislar recombinantemente de virus enteros. Estas proteínas virales adecuadas para el uso en virosomas o VLPs incluyen proteínas derivadas del virus de la influenza (tal como HA o NA) , virus de Hepatitis- B (tal como proteínas de núcleo o de la cápside) , virus de Hepatitis E, virus de sarampión, virus Sindbis, Rotavirus, virus de Enfermedad de Pies y Boca Retrovirus, virus de Norwalk, virus de Papiloma humano, HIV, ARN-fagos, ?ß-fago (tal como proteínas de la cubierta), GA- fago, fr-fago, AP205 fago, y Ty (tal como proteína pl de retrotransposón Ty) . Las VLPs se plantean adicionalmente en lso documentos WO03/024480, O03/024481, y Niikura y colaboradores, Virology (2002) 293:273-280; Lenz y col j oradores, Journal of Immunology (2001) 5246-5355; Pinto, y colaboradores, Journal of Infectious Diseases (2003) 188:327-338; y Gerber y colaboradores, Journal of Virology (2001) 75 (10) : 4752-4760. Los Virosomas se planatean adicionalmente en, por ejemplo, _ Gluck y colaboradores, Vaccine (2002) 20 :B 10-B 16. Los virosomas de influenza reconstituidos inmunopotenciadores (IRIV) se usan como el sistema de suministro de antígenos de sub-unidad en el producto INFLEXALMR trivalente intranasal {Mischler & Metcalfe (2002) Vaccine 20 Suppl 5:B 17-23} el producto INFLUVAC PLUSMR.

E. Derivados Bacterianos o Microbianos.

Los adyuvantes necesarios para el uso de la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como : (1) Derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) Tales derivados incluyen un lípido A de Monofosforilo (MPL) y MPL 3 -O-desacilado (3dMPL) . El 3dMPL es una mezcla de lípido A de monofosforilo 3 De-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma "partícula pequeña" preferida de lípido A de monofosforilo 3 De-O-acilado se da a conocer en el documento EP 0 689 454. Tales "partículas pequeñas" de 3dMPL son suficientemente pequeñas para ser filtradas estériles a través de una membrana de 0.22 mieras (véase el documento EP 0 689 454) . Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen . imitaciones de lípido A de monofosforilo, tal como derivados de fosfato de aminoalquil-glucosaminida por ejemplo RC 529. Véase Johnson y colaboradores (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278. (2) Derivados de Lípido A.

Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípidos A de Escherichia coli tal como OM-174. El OM-174 se describe por ejemplo por Meraldi y colaboradores, Vaccine (2003) 21:2485-2491; y Pajak, y colaboradores, Vaccine (2003) 21:836-842. (3) Oligonucleótidos Inmunoestimuladores Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia que contiene una citoquina no metilada seguida por guanosina y enlazada por un enlace de fosfato) . El AR de hebra doble bacteriano u oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli (dG) también se han mostrado que son inmunoestimuladoras .

Los CpGs pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de hebra doble o hebra individual . Opcionalmente , la guanosina se puede reemplazar con un análogo tal · como 2 ' -desoxi -7 -deazaguanosina . Véase Kandimalla, y colaboradores, Nucleic Acids Research (2003) 31(9): 2393-2400; documento WO02/26757 y 099/62923 para ejemplos de posibles sustituciones de análogos. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se plantea adicionalmente en Krieg, Nature Medicine (2003) 9(7) : 831-835; McCluskie, y colaboradores, FEMS Immunology y Medical Microbiology (2002) 32: 179-185; WO98/40100; Patente de EUA No. 6,207,646; Patente de EUA No. 6,239,116 y Patente de EUA No. 6,429,199.

La secuencia de CpG se puede dirigir a TLR9 , tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT. Véase Kandimalla, y colaboradores, Biochemical Society Transactions (2003) 31 (part 3) : 654-658. La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria Thl, tal como un CpG-A ODN, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como CpG-B ODN. Los CpG-A y los CpG-B ODNs se plantean por Blackwell, y colaboradores, J. Immunol . (2003) 170 (8) :4061-4068; Krieg, TRENDS in Immunology (2002) 23(2): 64-65 y O01/95935. Preferiblemente, el CpG es un CpG-A ODN.

Preferiblemente, se construye el oligonucleótido CpG de modo que el extremo 5' es accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos CpG se pueden unir a sus extremos 3 ' para formar "inmunómeros" . Véase, por ejemplo, Kandimalla, y colaboradores, BBRC (2003) 306:948-953; Kandimalla, y colaboradores, Biochemical Society Transactions (2003) 31 (part 3):664-658; Bhagat y colaboradores, BBRC (2003) 300:853-861 y WO03/035836. (4) Toxinas de ADP-ribosilación y derivados destoxificados de las mismas.

Las toxinas de ADP-ribosilación bacterianas y derivados destoxificados de las mismas se pueden usar como adyuvantes en la invención. Preferiblemente, la proteína se deriva de E. coli [es decir, enterotoxina lábil al calor de la E. coli "LT"), cólera ("CT"), o tosferina ("PT"). El uso de toxinas de ADP-riboslación de destoxificadas como adyuvantes de la mucosa se describe en el documento W095/17211 y como adyuvantes parenterales en el documento W098/42375. Preferiblemente, el adyuvante es un mutante LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72, y LTR192G. El uso de toxinas de ADP-ribosilación y derivados destoxificados de la mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se puede encontrar en la siguiente referencia: Beignon, y colaboradores, Infection e Immunity (2002) 70 ( 6 ) : 3012 -3019 ; Pizza, y colaboradores, Vaccine (2001) 19:2534-2541; Pizza, y colaboradores, Int. J. Med. Microbiol (2000) 290 (4 -5 ) : 455 - 461; Scharton-Kersten y colaboradores, Infection e Immunity (2000) 68(9):5306- 5313; Ryan y colaboradores, Infection e Immunity (1999) 67 (12) : 6270-6280; Partidos y colaboradores, Immunol. Lett . (1999) 67 (3 ): 209-216 ; Peppoloni y colaboradores, Vaccines (2003) 2 (2) : 285-293 ; y Pine y colaboradores, (2002) J. Control Reléase (2002) 85(1-3) :263 270. La referencia numérica para la sustitución de aminoácidos se basa preferiblemente en las alineaciones de las sub-unidades A y B de las toxinas de ADP-ribosilación expuestas por Domenighini y colaboradores, MoL. Microbiol (1995) 15 (6) .1165-1167.

F Bioadhesivos y Mucoadhesivos Los bioadhesivos y los muchoadhesivos también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Bioadhesivos adecuados incluyen micro esferas de ácido hialuronico esterificadas (Singh et a (2001) J. Cont . Relé. 70:267-276) o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de ácido poliacrílico, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosan y derivados del mismo también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Véase el documento WO99/27960.

G. Micropartículas También se pueden usar micropartículas como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir una partícula de -lOOnrn a ~150µp? en diámetro, más preferiblemente ~200nm a ~30µp\ en diámetro, y mucho más preferiblemente ~500nm a ~10 m en diámetro) Formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli (a-hidroxi ácido) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etcétera) , con poli (lacturo-glicólido) son preferidos, se tratar opcionalmente para tener una superficie negativamente cargada (por ejemplo con SDS) o una superficie positivamente cargada (por e emplo con un detergente catiónico, tal como CTAB) .

H. Liposomas Ejemplos de liposomas adecuados para el uso como adyuvantes se describen en la Patente de EUA No. 6,090,406, Patente de EUA No. 5,916,588, y documento EP 0 626 169.

I. Formulaciones de Éter de Polioxietileno y Ester de Polioxietileno Adyuvantes adecuados para el uso de la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno. Documento W099/52549. Tales formulaciones incluyen además surfactantes de éster de sorbitan de polioxietileno en combinación con un octoxinol ( O01/21207) así como también surfactantes de éteres o ésteres de alquilo de polioxietileno en combinación con por lo menos un surfactante no iónico adicional tal como un octoxinol (WO0 1/21 152) . Éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietileno-9-laurilo (laureth 9) , éter de polioxietileno-9-estiorilo, éter de polioxietileno-8-estiorilo, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo, y éter de polioxietileno-23-laurilo.

J. Polifosfazeno (PCPP) Se describen formulaciones de PCPP, por ejemplo, por Andrianov y colaboradores, "Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions", Biomaterials (1998) 19(1-3) : 109-1 15 y Payne y colaboradores, "Protein Reléase from Polyphosphazene Matrices", Adv. Drug. Delivery Review (1998) 31 (3) : 185-196.

K. Péptidos de Muramilo Ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetil-muramil-L-trionil-D-isoglutamina. (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-l-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP) , y N-acetilmuramil-l-alanil-d-isoglutaminil-l-alanina-2- (11 -21 dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxy) -etilamina MTP-PE) .

L. Compuestos de Imidazoquinolina .

Ejemplos de compuestos de imidazoquinolina adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquimod y sus análogos, descritos adicionalmente en Stanley, Clin Exp Dermatol (2002) 27 (7) : 571-577 ; Jones, Curr Opin Investig Drugs (2003) 4 (2) : 214-218 ; y Patentes de 4,689,338, 5,389,640, 5,268,376, 4,929,624, 5,266,575, 5,352,784, 5,494,916, 5,482,936, 5,346,905, 5,395,937, 5,238, 944, y 5, 525, 612.

M. Compuestos de Tiosemicarbazona .

Ejemplos de compuestos de tiosemicarbazona, así como también métodos de formulación, manufactura y clasificación para compuestos todos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen aquellos descritos en el documento O04/60308. Las tiosemicarbazonas son particularmente efectivas en la estimación de las células mononucleares de sangre periférica humanas para la producción de citoquinas, tal como TNF-a.

N. Compuestos de Triptantrina .

Ejemplos de compuestos de triptantrina, así como también métodos de formulación, manufactura, y clasificación para compuestos adecuados como el uso adyuvantes en la invención incluyen aquellos descritos en el documento WO04/64759. Los compuestos de triptantrina son particularmente efectivos en la estimulación de las células mononucleares de sangre periférica humanas para la producción de citocinas, tal como TNF-a.

La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente, por ejemplo, las siguientes composiciones de adyuvantes se pueden usar en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua (W099/ 11241) ; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) (véase el documento WO94/00153) ; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) + un esterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL 12 (opcionalmente + un esterol) (W098/57659) ; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (Véase las solicitudes de patente Europea 0835318, 0735898 y 0761231); (6) SAF, que contienen 10% de Escualeno, 0.4% de Tween 80, 5% de polímero bloque plurónico L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizados en una emulsión de sub-micra o sometido a agitación vorticial para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) Sistema adyuvante RIBI (RAS) , (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno, 0.2% de Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforilípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y esqueleto de pared celular (CWS) , preferiblemente MPL + CWS (DET0XMR) ; y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dPML) . (9) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) + un oligonucleótido inmunoestimulador (tal como una secuencia de nucleótidos que incluye un motivo CpG) . 0. Inmunomoduladores Humanos Inmunomoduladores humanos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen citoquinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etcétera), interferones (por ejemplo interferón-?) , factor estimulador de la colonia de macrófagos, factor de necrosis tumoral .

Sales de aluminio y MF59 son adyuvantes preferidos para el uso con las vacunas de influenza inyectables. Las toxinas bacterianas y los bioadhesivos son adyuvantes preferidos para el uso con las vacunas suministradas en la mucosa, tal como vacunas nasales.

Los contenidos de todas las patentes citadas anteriormente, solicitudes de patente y artículos de revistas se incorporan a manera de referencia como si se expusieran completamente en este documento.

Métodos Terapéuticos La invención proporciona métodos para inducir o incrementar una respuesta inmunitaria al S. pyogenes usando l s composiciones descritas anteriormente. La respuesta inmunitaria es preferiblemente protectora y puede incluir anticuerpos y/o inmunidad mediada por células (que incluyen inmunidad sistémica y de la mucosa) . Las respuestas inmunitarias incluyen respuestas de refuerzo.

Las combinaciones de antígenos de GAS, moléculas del ácido nucleico o anticuerpos descritos anteriormente se pueden incluir en una sola composición para administración simultánea. Alternativamente, las combinaciones de los antígenos de GAS, moléculas de ácido nucleico o anticuerpos se pueden administrar secuencialmente . Por ejemplo, donde la combinación comprende Spy0167, Spy0269, y Spy0416 o mutantes o fragmentos de los mismos, estos 3 antígenos se pueden administrar simultáneamente en una sola composición o secuencialmente en composiciones separadas. En esta situación, la invención proporciona: Spy0167 para la administración a un animal que ya ha recibido el Spy0269 y/o Spy416; Spy0269 para la administración a un animal que ya ha recibido el Spy0167 y/o Spy0416; y Spy0416 para la administración a un animal que ya ha recibido el Spy0167 y/o Spy0269.

Los adolescentes y niños, que incluyen niños pequeños e infantes, pueden recibir una vacuna par uso profiláctico, las vacunas terapéuticas se administran típicamente a adolescentes o adultos. Una vacuna propuesta para niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etcétera.

Las enfermedades causadas por Streptococcus pyogenes las composiciones de la invención que pueden reducir el riesgo de, prevenir, o tratar incluyen pero no se listan a, faringitis (tal como dolor de garganta estreptocócico) , escarlatina, impétigo, erisipelas, celulitis, septicemia, síndrome de choque toxico, fascitis necrotizante , y secuelas tales como fiebre reumática y glomerulonefritis aguda. Las composiciones también pueden ser efectivas contra otras bacterias estreptocócicas , por ejemplo, GBS.

Pruebas para verificar la eficacia de la respuesta inmunitaria .

Una manera de evaluar la eficacia del tratamiento terapéutico implica supervisar la infección por GAS después de la administración de la composición de la invención. Una manera de evaluar la eficacia del tratamiento profiláctico implica supervisar las respuestas inmunitarias contra los antígenos de GAS en las composiciones de la invención después de la administración de la composición.

Otra manera de evaluar la inmunogenicidad de las proteínas componentes de las composiciones inmunogénicas de la presente invención es expresar los antígenos de GAS recombinantemente y clasificar los sueros de pacientes o secreciones de la mucosa mediante inmunotinción . Una reacción positiva entre la proteína y el suero del paciente indica que el paciente ha montado previamente una respuesta inmunitaria a la proteína en cuestión; es decir, la proteína es un inmunógeno. Este método también se puede usar para identificar proteínas inmunodominantes y/o epítopos.

Otra manera de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico implica supervisar la infección por GAS después de la administración de las composiciones de la invención. Una manera de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico implica supervisar respuestas inmunitarias tanto sistémicamente (tal como supervisar el nivel de la producción de IgGl e IgG2a) y de la mucosa (tal como supervisar el nivel de la producción de IgA) contra la estimulación del GAS después de la administración de la composición. Típicamente, las respuestas de anticuerpos específicos de suero se determinan post-inmunización pero con pre-estimulación mientras que las respuestas del anticuerpo específico de la mucosa se determinan post-inmunización y post-estimulación .

Las composiciones de vacuna de la presente invención se pueden evaluar en modelos animal in vitro e in vivo antes del hospedero, por ejemplo, humano, administración. Los modelos de ratón particularmente útiles incluyen aquellos en los cuales la inmunización intraperitoneal es seguida por ya sea la estimulación intra- peritoneal o estimulación intra-nasal.

La eficacia de las composiciones inmunogénicas de la invención también se pueden determinar in vivo al inmunizar modelos animales, (por ejemplo, caballos o ratones) con las composiciones inmunogénicas y evaluar el nivel de protección obtenido después de la estimulación con el GAS.

Los modelos de eficacia in vivo incluyen pero no se limitan a: (i) un modelo de infección por murino que usa serotipos de GAS humanos; (ii) un modelo de enfermedad de murino que es un modelo de murino que usa una cepa del GAS adaptado a ratones, tal como la cepa M23 que es particularmente virulenta en los ratones, y (iii) un modelo de primate que usa aislados de GAS humanos.

La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria TH1 y una respuesta TH2. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria mejorada o una aumentada o una alterada. La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica y de la mucosa. Preferiblemente la respuesta inmunitaria es un sistema mejorado y/o respuesta de la mucosa.

Una inmunidad sistémica y/o de la mucosa mejorada se refleja en una respuesta inmunitaria de TH1 y/o TH2 mejorada. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria mejorada incluye un incremento en la producción del IgGl y/o IgG2a y/o igA.

Preferiblemente la respuesta inmunitaria de la mucosa es una respuesta inmunitaria TH2. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria de la mucosa incluye un incremento en la producción de IgA.

Las células TH2 activadas mejoran la producción de anticuerpos y por lo tanto son de valor en responder a infecciones intracelulares . Las células TH2 activadas pueden secretar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10. Una respuesta inmunitaria TH2 puede dar por resultado la producción de IgGl, IgE, IgA células B de memoria para protección adicional.

Una respuesta inmunitaria TH2 puede incluir uno o más de un incremento en una o más de la citoquinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH2 (tal como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) , o un incremento en la producción de IgGl , IgE, IgA y células B de memoria. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria TH2 mejorada incluirá un incremento en la producción de IgGl.

Una respuesta inmunitaria TH1 puede incluir uno o más de un incremento en los CTLs, un incremento en una o más de la citoquinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH1 (tal como IL-2, IFNy, y ? ?ß) , un incremento en los macrófagos activados, un incremento en la actividad K, o un incremento en la producción de IgG2a. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria TH1 mejorada incluirá un incremento en la producción de IgG2a.

Composiciones inmunogénicas de la invención se pueden usar ya sea solas o en combinación con otros antígenos de GAS opcionalmente con un agente inmunorregulador capaz de inducir una respuesta Thl y/o Th2.

La invención también comprende una composición inmunogénica que comprende uno o más agentes inmunorreguladores , tal como una sal mineral, tal como una sal de aluminio y un oligonucleótido que comprende un motivo CpG. Más preferiblemente, la composición inmunogénica incluye tanto una sal de aluminio como un oligonucleótido que contiene un CpG. Alternativamente, la composición inmunogénica incluye una toxina de ADP ribosilación, tal como una toxina de ADP ribosilación detoxificada y un oligonucleótido que contiene un motivo CpG. Preferiblemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen un adyuvante. El adyuvante se puede seleccionar de uno o más de grupo que consiste de un adyuvante TH1 y adyuvante TH2.

Las composiciones de la invención inducirán preferiblemente tanto una respuesta inmunitaria mediada por células así como también una respuesta inmunitaria humoral a fin de tratar efectivamente una infección por GAS. Esta respuesta inmunitaria inducirá preferiblemente anticuerpos de larga duración (por ejemplo, neutralizantes) y una inmunidad mediada por células que puede responder rápidamente en la exposición a uno o más antígenos de GAS.

En una modalidad particularmente preferida, la composición inmunogénica comprende uno o más antígenos de GAS los cuales inducen una respuesta de anticuerpos neutralizantes o uñó o más de antígenos de GAS que inducen a una respuesta inmunitaria mediada por células. De esta manera, la respuesta de anticuerpos neutralizantes previene o inhibe una infección por GAS inicial mientras que la respuesta inmunitaria mediada por células capaz de inducir una respuesta celular Thl mejorada previene la propagación adicional de la infección por GAS.

Composiciones de la invención se administrarán generalmente de manera directa a un paciente. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar, ya sea solas o como parte de una composición, por la vía de una variedad de vías diferentes. Ciertas vías se pueden favorecer para ciertas composiciones, como resultado en la generación de una respuesta inmunitaria más efectiva, preferiblemente una respuesta CMI , o por ser menos probable de inducir efectos secundarios, o por ser más fácil para la administración .

Métodos de suministro incluyen inyección parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intraperitoneal , intravenosa, intramuscular o intersticial) y rectal, oral (por ejemplo, tableta, pulverización), vaginal, tópica, transdérmica (por ejemplo, véase el documento O 99/27961) , transcutánea (por ejemplo, véase los documentos WO02/074244 y WO02/064162) , intranasal (por ejemplo, véase el documento WO03/028760) , ocular, aural, y pulmonar u otra administración de la mucosa.

A manera de ejemplo, las composiciones de la presente invención se pueden administrar por medio de una vía sistémica o una vía de la mucosa o una vía transdérmica o se pueden administrar directamente en un tejido específico. Como se usa en este documento, el término "administración sistémica" incluye pero no se limita a cualquier de las vías parenterales de la administración. En particular la administración parenteral incluye pero no se limita a subcutánea, intraperitoneal , intravenosa, intraarterial , intramuscular, o inyección intraesternal , intravenosa, intraarterial, o técnicas de infusión dialítica de los ríñones. Preferiblemente, la administración parenteral, sistémica es la inyección intramuscular. Como se usa en este documento el término "administración de la mucosa" incluye pero no se limita a administración oral, intranasal, intravaginal , intrarectal, intratraqueal , intestinal y oftálmica .

El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una sola dosis o un programa de múltiples dosis.

Se pueden usar múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de múltiples dosis las diversas dosis se pueden administrar por las mismas o diferentes vías por ejemplo, un refuerzo principal y de la mucosa parenteral un refuerzo principal y parenteral de la mucosa, etcétera.

Las composiciones de la invención se pueden preparar en varias formas. Por ejemplo, una composición se puede preparar como un inyectable, ya sea como una solución líquida o una suspensión. Formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección también se pueden preparar (por ejemplo, una composición liofilizada) . Una composición se puede preparar para la administración oral, tal como una tableta o cápsula, como una pulverización, o como un jarabe (opcionalmente saborizado) . Una composición se puede preparar para la administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o una pulverización. Una composición se puede preparar como un supositorio o un pesario. Una composición se puede preparar para la administración nasal, aural u ocular por ejemplo como gotas. Una composición puede estar en la forma de un kit, diseñado tal que una composición combinada se reconstituye justo antes de la administración a un paciente. Tales Kits pueden comprende uno o más de Spy0167 de mutante u otros antígenos en forma líquida o uno o más agentes liofilizados .

Composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de los antígenos de GAS u otros antígenos, así como también cualquiera de otros componentes, como sea necesario, tales como antibióticos. Una "cantidad inmunológicamente efectiva" es una cantidad que, cuando se administra a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, incrementa una respuesta inmunitaria medible o previene o reduce un síntoma clínico.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención se puede administrar en combinación con un régimen de tratamiento de antibióticos. .. En una modalidad, el antibiótico se administra antes de la administración de una composición de la invención. En otra modalidad, el antibiótico se administra subsecuente a la administración de una composición de la invención. Ejemplos de antibióticos adecuados para el uso del tratamiento de una infección por GAS incluyen pero no se limitan a penicilina o un derivado de la misma o clindamicina, cefalosporinas, glicopéptidos (por ejemplo, vancomicina) y cicloserina.

La cantidad de agentes activos en una composición varia dependiendo de la salud y condición física del individuo que se trata, edad, grupo taxonómico del individuo que se trata (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.) la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la valoración del doctor tratante de la citación médica y otros factores relevantes. La cantidad se encontrará en un intervalo relativamente amplio el cual se puede determinar a través de ensayos de rutina.

Kits La invención también proporciona Kits que comprenden uno o más recipientes de composiciones de la invención. Las composiciones pueden estar en forma líquida o se pueden liofilizar, como pueden ser antígenos individuales. Recipientes adecuados para las composiciones incluyen, por ejemplo, botellas, frasquitos, jeringas, y tubos de prueba. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, que incluyen vidrio o plástico. Un recipiente puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasquito que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) .

El kit puede comprender adicionalmente un segundo recipiente que comprende una solución amortiguadora farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer, o solución de dextrosa. También puede contener otros materiales útiles para el usuario final, que incluyen otras soluciones amortiguadoras, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. El kit también puede comprender un segundo o tercer recipiente con otro agente activo, por ejemplo un antibiótico.

El kit también puede comprender una hoja impresa de paquete que contiene instrucciones escritas para métodos de inducir inmunidad contra el S. pyogenes o para el tratamiento de infecciones de S. pyogenes. La hoja impresa de paquete puede ser una hoja impresa de paquete de proyecto no aprobado o puede ser una hoja impresa de paquete aprobada por la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) u otro cuerpo regulador .

Todas las patentes, solicitudes de patente, y referencias citadas en esta descripción se incorporan expresamente en este documento a manera de referencia. La descripción anterior describe generalmente la presente invención. Se puede obtener un entendimiento más completo por referencia a los siguientes ejemplos específicos, los cuales se proporcionan para propósitos de ilustración solamente y no se proponen para limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Ensayos de Hemolisis Diluciones en serie de Spy0167 o un mutante de Spy0167 se preparan en placas de 96 pocilios con fondos en forma de U que usan PBS + 0.5% de BSA. Uno de mi de sangre de oveja se lava tres veces en PBS (con centrifugación a 3000 x g) , y células sanguíneas se suspenden en 5 mi de PBS. Un volumen igual de suspensión se agrega a 50 µ? de cada dilución de toxinas y se incuba a 37°C durante 30 min. Se usa Tritón (2% en agua) para proporcionar 100% de hemolisis y PBS + 0.5% de BSA se usa como control negativo. Las placas luego se centrifugan durante 5 min a 1,000 x g, el sobrenadante se transfiere cuidadosamente a las placas de fondo plano de 96 pocilios. La absorbancia se lee a 540 nm. Una unidad hemolítica (HU) se define como la cantidad de Spy0167 o mutahte de Spy0167 requeridos para obtener 50% de lisis máxima obtenida tratando las células sanguíneas con Tritón al 2% .

EJEMPLO 2 Evaluación de la toxicidad in vivo de los antígenos del mutante de Spy0167 Inyección intravenosa de antígeno. Una solución de ya sea antígeno de Spy0167 de tipo silvestre o mutante en PBS se diluye en una solución de PBS + DTT 2 mM, luego 100 mi se inyectan en la vena de la cola de un ratón. Los ratones se observaron durante 2-3 días. La inyección del Spy0167 de tipo silvestre da por resultado típicamente la muerte dentro de pocos minutos.

Ensayo de la inhibición de la letalidad in vivo. Para la inhibición de la letalidad mediada por sueros inmunitarios , 10 pg/ratón de Spy0167 de tipo silvestre (una solución de 100 ug/ml en PBS, DTT 2 mM) se incuban durante 20 minutos con rotación "en forma continua" a temperatura ambiente con ya sea suero anti-Spy0167 o suero de control (obtenido de ratones inmunizados con adyuvantes solos) . Después de la incubación, las muestras se inoculan en los ratones mediante la inyección intravenosa en la vena de la cola. Los ratones se observan durante 2-3 días.

Toxicidad in vivo aguda. La toxicidad in vivo aguda se evalúa usando una dosis de 10 g/ratón de Spy0167 de tipo silvestre como un control positivo e inyección de adyuvante de Freund sola como un control negativo. Diez pg/ratón de Spy0167 de tipo silvestre se incuban con ya sea anti-suero de Spy0167 de tipo silvestre o con suero de control y se inoculan en los ratones como se describe anteriormente.

EJEMPLO 3 Inactivación de la actividad proteolítica del Spy0416.

SDS-PAGE. IL-8 se incuba con Spy0416 de tipo silvestre o un mutante de Spy0416. Las mezclas de incubación se cargan en el SDS-PAGE y se revelan por la tinción de plata. El Spy0416 de tipo silvestre libera dos bandas: 8 kDa (forma activa) y 6 kDa (IL-8 escindida inactiva IL-8) . Un mutante de Spy0416 libera solamente una banda, la cual corresponde a la IL-8 no escindida como en la reacción de control (sin enzima) .

ELISA. La IL-8 se incuba con Spy0416 de tipo silvestre o un mutante Spy0416 en tres concentraciones diferentes, y las mezclas de incubación se someten a prueba para la presencia de la IL-8 no escindida usando un anticuerpo que es específico para la citoquina pero que es incapaz de reconocer la forma inactiva escindida. Los resultados se expresan como porcentaje en la IL-8 no escindida después de reacciones de 0, 8 y 24 h y se calcularon como sigue: [IL-8 en la prueba de reacción] X 100 [IL-8 en la mezcla de control] donde "mezcla de control" es la mezcla de reacción sin la enzima en el punto de tiempo 0.

EJEMPLO 4 La capacidad protectora de los antígenos de GAS Un antígeno del GAS se usa para inmunizar ratones para someter a prueba su capacidad de conferir protección contra la estimulación letal del GAS. El antígeno se administra intraperitonealmente , opcionalmente con un adyuvante, en los días 0, 21 y 35. Las muestras de sangre se tomas dos semanas después de la tercera inmunización. Los ratones luego se estimulan intranasalmente con una cepa de GAS (por ejemplo, 108 cfu de cepa de GAS 3348 MI en 50 µ?) .

La supervivencia se supervisa durante un periodo de 10-14 días. EJEMPLO 5 Inhibición dependiente de dosis de la escisión de IL-8 mediada por Spy0416 por anticuerpos de Spy0416 Antisueros específicos para Spy0416, de tipo silvestre y mutantes inactivos, se producen al inmunizar ratones CD1 con proteínas recombinantes purificadas. La IL-8 (10 g/ml) se incuba con Spy0416 de tipo silvestre con o sin anti-suero de Spy0416 (1:50 y 1:5000), o con anticuerpos monoclonales formulados contra el Spy0416 de tipo silvestre, en dos condiciones diferentes: (1) incubación de 8 horas, 0.1 µg/ml de Spy0416 y (2) incubación de 24 horas, 0.05 ug/ml de Spy0416. Las mezclas de incubación luego se someten a prueba para la presencia de la IL-8 no escindida por el ELISA. Los resultados demuestran una inhibición dependiente de dosis de la escisión de la IL-8 mediada por Spy0416 por anti-suero de Spy0416 o anticuerpos monoclonales.

EJEMPLO 6 Inhibición de la hemolisis del Spy0167 por anticuerpos contra Spy0167 de tipo silvestre o mutante (Spy0167) Usando 50 ng/ml (3.5 HU) de toxina, la concentración del anticuerpo requerida para obtener 50% de reducción de la actividad hemolítica del Spy0167 se somete a prueba usando un adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund, alumbre o MF59 ) . El adyuvante solo se usa como un control negativo.

EJEMPLO 7 Capacidad protectora de la combinación de los antígenos de GAS en un modelo de estimulación subcutánea Ratones se inmunizaron con antígenos de GAS individuales (Spy0167, Spy0416, o Spy0269) o con combinaciones de antígenos de GAS (Spy0167 + Spy0416 + Spy0269; o Spy0416 + Spy0269) . Los ratones luego se infectaron subcutáneamente con la cepa SF370 MI del GAS, la cual causa lesiones en la piel. El efecto protector de los antígenos de GAS o las combinaciones de antígenos se determinó al medir el tamaño de la lesión.

En este modelo, existe un efecto protector sinérgico obtenido al usar la combinación de Spy0167 + Spy0416 + Spy0269 la combinación de Spy0416 + Spy0269 comparados con el efecto protector obtenido al usar cualquiera de estos antígenos de GAS solos. De hecho, el efecto protector proporcionado por las combinaciones sometidas a prueba es comparable a aquel proporcionado usando la proteína GAS MI. Véase la FIGURA 1.

EJEMPLO 8 Capacidad protectora de la combinación de los antígenos de GAS mutante.

La capacidad protectora de una combinación de antígenos del mutante de GAS (antígeno del mutante de (Spy0167 P427L/W535F y antígeno del mutante D151A/S617A de Spy0416) contra la estimulación intranasal con varias cepas de gas se sometió a prueba esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 EJEMPLO 9 Preparación de los mutantes de Spy0416 Por comparación con la proteasa C5a, se identificaron tres aminoácidos en el Spy0416 que constituyen putativamente el sitio catalítico de la proteasa: D151, H279 y S617. A fin de obtener una forma inactiva de la enzima, las sustituciones de nucleótidos que dan por resultado cambios de aminoácidos D151A y/o S617A se introdujeron en la secuencia de codificación de Spy0416 mediante la división por la PCR de extensión de solapamiento (SOE-PCR) .

Sustitución D151A Se llevaron a cabo tres reacciones de PCR: se introdujo en pET21_57his digerido con las mismas enzimas. Los clones que contienen las sustituciones dentro del marco correctas (pET21_57his_D151A) se seleccionaron por la secuenciación de ADN.

Sustitución S617A Se llevaron a cabo tres reacciones de PCR: reacción PCR Plantilla Cebadores PCR1 (360 SF370 genómico 57F, GTGCGTCA TA TGGCAGATGAGCTAAGCA; SEQ ID bps) NO: 150 57mutDRl, CCCTGTGGCAATAACTGCGAC; SEQ ID NO : 151 PCR2 (910 SF370 genómico 57mutDFl, cgCAGTTATTGcCACAGGGAT, SEQ ID bp) NO:152 57mutSalR, CTGACTGAGTCGACAGACTCTGAATAGATG, SEQ ID NO : 153 PCR3 (1270 PCR1, PCR2 57F bps) 57rautSalR El producto de PCR luego se digirió con sal Sal-Xho y se introdujo en pET21_57his digerido con las mismas enzimas. Los clones que contienen las sustituciones dentro del marco correctas (pET21_57his_S617A) se seleccionaron por la secuenciación de ADN.

Sustitución D151A+S617A El producto 6 de PCR se digirió con Sal-Xho y se introdujo en pET21_57his_D151A digerido con las mismas enzimas. Los clones que contienen las sustituciones dentro del marco correctas (pET21_57his_D151A+S617A) se seleccionaron por la secuenciación de ADN.

Las proteínas imitantes individuales y dobles se expresaron y se purificaron usando tres etapas cromatográficas : cromatografía de intercambio iónico (Q Sefarosa HP) , cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de filtración de gel.

EJEMPLO 10 La mutación puntual del D151A da por resultado la inactivación de la actividad proteolítica del Spy0416 El mutante de Spy0416 D151A se expresó como una proteína etiquetada con His recombinante . Dos tipos de ensayo demostraron que este mutante tiene perdida la capacidad de escindir la IL-8 SDS-PAGE La IL-8 se incubó con Spy0416 de tipo silvestre o el mutante de Spy0416 D251A. Las mezclas de incubación se cargaron en SDS-PAGE y se revelaron por la tinción de plata. Los resultados se muestran en la FIGURA 12. El Spy0416 de tipo silvestre (líneas 2 y 3) liberó dos bandas: 8 kDa (forma activa) y 6 kDa (IL-8 escindida inactiva) . En contraste, el mutante Spy0416 D151A liberó solamente una banda, que corresponde a la IL-8 no escindida, como en la reacción de control (sin enzima) .

ELISA La IL-8 se incubó con Spy0416 de tipo silvestre o el mutante Spy0416 D151A en tres concentraciones diferentes, y las mezclas de incubación se sometieron a prueba para la presencia de la IL-8 no escindida usando un anticuerpo que es específico para la citoquina pero que es incapaz de reconocer la forma inactiva escindida. Los resultados se muestran en la FIGURA 4, expresados como porcentaje en la IL-8 no escindida después de reacciones de 0 , 8 y 24 h, y se calcularon como sigue : [IL-8 en la mezcla de reacción] X 100 [IL-8 en la mezcla de control] donde "mezcla de control" es la mezcla de reacción sin la enzima en el punto de tiempo 0.

Como se muestra en la FIGURA 3, el Spy0416 de tipo silvestre casi inactivo completamente la IL-8 desoyes de 8 horas, aún en la concentración más baja, mientras que no se observó Inactivación para la IL-8 tratada con la enzima mutante .

EJEMPLO 11 Mutante S617A de Spy0416 y mutante doble D151A + S617A de Spy0416 no escisan la IL-8.

El mutante S617A de Spy0416 y el mutante doble D151A + S617A de Spy0416 se expresaron como proteínas etiquetadas con His y se sometieron a prueba en experimentos de Inactivación de la IL-8 como se describe en el Ejemplo 2. SDS-PAGE La IL-8 se incubó con ya sea Spy0416 (etiquetado con His o sin etiqueta) , o cada uno de los mutantes D151A, S617A y D151AS+S617A de Spy0416 durante 24 horas. Las mezclas de incubación se cargaron sobre un gel de SDS-poliacrilamida y se revelaron por la tinción de plata. Los resultados de los dos experimentos se muestran en la FIGURA 4A y la FIGURA 4B. Tanto el mutante S617A de Spy0416 y el mutante GAS D151 + S617A fueron incapaces de escindir la IL-8, aún en una concentración más alta de 100 veces que el Spy0416 de tipo silvestre .

ELISA Las mismas muestras se usaron para realizar un ensayo ELISA el cual confirmó que las sustituciones de aminoácidos individuales y dobles eliminan la capacidad del Spy0416 de escindir la IL-8. Los resultados, los cuales se muestran en la FIGURA 5, muestran que los mutantes liberan 100% de la IL-8 después de una incubación de 24 horas, comparado con 20-40% liberado por el Spy0416 de tipo silvestre .

EJEMPLO 12 La capacidad protectora de los mutantes de Spy0416 es similar a aquella obtenida con el Spy0416 de tipo silvestre .

Los mutantes de Spy0416 D 151A y D151 A + S617A se usaron para inmunizar ratones para someter a prueba su capacidad de conferir protección contra la estimulación letal de GAS en comparación a la Spy0416 de tipo silvestre. Los resultados de dos experimentos (cada uno de 20 ratones) se resumen a continuación y se expresan como % promedio de supervivencia .

Tabla 3.

No de RATONES NO. de MUERTES % de SUPERVIVENCIA PBS + Freund 40 26 35 192 MI + Freund 20 0 100 57 WT + Freund 40 12 70 57 D151A + Freund 40 6 85 57 D151A-S617A + 40 9 9 78 Freund EJEMPLO 13 Los mutantes inactivos purificados se presentan como un péptido individual comparado con el Spy0416 de tipo silvestre, el cual existe solamente en la forma de dos fragmentos de proteínas no covalentemente asociadas .

El Spy0416 de tipo silvestre se obtiene principalmente en la forma de dos fragmentos, uno de aproximadamente 23 kDa y uno de 150 kDa. Los dos fragmentos no se separan en la purificación por afinidad Ni-quelante o por la filtración en gel, sino se presentan como dos bandas diferentes en el SDS-PAGE (FIGURA 6) . Las secuenciación N-terminal confirmó que el fragmento de 23 kDa es la porción N-terminal del Spy0416 (aminoácidos 34-244 de SEQ ID NO: 50) mientras que el fragmento de 150 kDa es la región C-terminal (aminoácidos 245-1603 of SEQ ID NO:50).

En contraste al Spy0416 de tipo silvestre, los mutantes de Spy0416 de la invención se obtienen como proteínas de peso molecular más alto (174 kDa) , y la banda de 23 kDa está ausente (véase la FIGURA 7, la cual muestra los resultados en un experimento en el cual el Spy0416 de tipo silvestre parcialmente purificado y los mutantes de Spy0416 se cargaron sobre geles de SDS-poliacrilamida) .

EJEMPLO 14 Inhibición dependiente de dosis de la escisión de la IL-8 mediada por Spy0416 por antisueros policlonales Antisueros de ratón específicos para Spy0416, de tipo silvestre y mutantes inactivos, se produjeron al inmunizar ratones CD1 con las proteínas recombinantes purificadas .

La IL-8 (10 µ9/??1) se incubó con Spy0416 de tipo silvestre con o sin antisuero Spy0416 (1:50 y 1:5000) en dos condiciones diferentes: (1) incubación de 8 horas, 0.1 yg/ml de Spy0416 y (2) incubación de 24, 0.05 µ9/?t?1 de Spy0416. Las mezclas de incubación luego se sometieron a prueba para la presencia de la IL-8 no escindida por el ELISA. Los resultados mostrados en la FIGURA 8A y la FIGURA 8B muestran una . inhibición dependiente de dosis de la escisión de la IL-8 mediada por py0416 por el antisuero de ratón.

EJEMPLO 15 Clonación de las proteínas del Spy0167 de tipo silvestre y mutante Genes que codifican las proteínas del Spy0167 de tipo silvestre y mutante se amplificaron por PCR usando los cebadores del genoma SF370 mostrado en la Tabla 4.

Los productos de PCR se digirieron con Nhel-Xhol y se ligaron con el vector pet24b+ (Novagen) cortado con las mismas enzimas. Células electrocompetentes DH5a de E. coli se transformaron con las reacciones de ligación. El medio LBPTK se agregó y, después de la incubación durante 1 hora a 37 °C, con agitación a 250 rpm, las bacterias se colocaron en placas sobre placas LBPTK que contienen 50 ug/ml de canamicina. Se identificaron colonias positivas por la PCR de colonia.

Plásmidos de colonias positivas se prepararon de un cultivo durante toda la noche en el medio LBPTK que contiene 50 µ9/??1 de canamicina y se analizaron por la secuenciación de DNA, la cual confirmó el gen de inserto esperado bajo el promotor de polimerasa T7. Las secuencias de ADN y de proteínas de los genes clonados se muestran en el listado de secuencias. Véase la Tabla 5.

Tabla 4. gen cebadores Spy0167 de 2SF Nhel, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEQ ID NO: 157) tipo 25rev = GCATTCGATCCTCGAGCTACTTATAAGTAATCG AACCATATG (SEQ ID silvestre NO: 158) sin etiqueta P427L de Cebadores externos : Spy0167 sin 2SF Nhel, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEQ ID NO: 157) etiqueta 25rev, GCATTCGATCCTCGAGCTACTTATAAGTAATCGAACCATATG (SEQ ID NO: 158) Cebadores internos: PL42 _for, GCTACCTTCAGTAGAAAAAACCTAGCTTATCCTATTTCATACACC (SEQ ID NO:159) PL427rev, GGTGTATGAAATAGGATAAGCTAGGTTTTTTCTACTG AAGGTAGC (SEQ ID NO:160) Spy0167 de 2SF Nhel, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEQ ID NO: 157) tipo 25revhis, GCATFCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEQ ID silvestre NO: 161) etiquetado gen cebadores con His W535F de Cebadores externos Spy0167 25F Nhel, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEQ ID NO: 157) etiquetado 25revhis , GCATI ' CGATCCTCGAGCTFATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEQ ID con His NO: 161) Cebadores internos : WF535_for, GAGTGCACTGGCT] AGCTTCGAATGGTGGCGAAAAGTGATC (SEQ ID NO: 162) WF53 5_rey, GATCACTY fCGCCACCATFCGAÁAGCTAÁGCCAGTGCACTC (SEQ ID NO: 163) W535F-D482N Cebadores externos : de Spy0167 25F Nhel, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAÁACAAAACACTGC (SEQ ID NO: 157) etiquetado 25 revhis GCAHCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEQ ID NO: con His 161) Cebadores internos : WF53. 5_for, GAGTGCACTGGCTTAGCTFTCGAATGGTGGCGAAAAGTGATC (SEQ ID NO: 162) WF535rev, GATCACTTYI ' CGCCACCAT1 ' CGAÁAGCTAAGCCAGTGCACTC (SEQ ID NO: 163) y DN482_for GTTGCTCAATATGAAATCCf1TGGAATGAAATCAATTATGATGACAAAGGAAAG (SEQ IDNO:164) DN482 ev, C [TTCCTTTGTCATCATAATTG ATTTCATTCCAAAGGATTTCATATTGAGCAAC (SEQ IDNO:165) C530G de Cebadores externos : Spy0167 25F Nhel, GTGCGTGCTAGCGAÁTCGAACAAACAAAACACTGC (SEQ ID NO: 157) etiquetado 25revhis, GCATTCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEQ ID NO: con His 161) Cebadores internos : CG530_for CCGTATCATGGCTAGAGAGGGCACTGGCTTAGCTTGGGAATG (SEQ ID gen cebadores NO: 166) CG530rev, CATTCCCAAGCTAAGCCAGTGCCCTCTCTAGCCATGATACGG (SEQ ID NO: 167) P427L de Cebadores externos: Spy0167 25F Nhel, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEQ ID NO : 157) etiquetado 25 revhis, GCATTCGATCCTCGAGCTTATAAGTAATCGAACCATATGGG (SEQ ID con His NO: 161) Cebadores internos : PL427for, CTACCTTCAGTAGAAAAAACCTAGCTTATCCTATTTCATACACC (SEQ ID NO: 149) PL427_rev, GGTGTATGAAATAGGATAAGCTAGGTTTTTTCTACTGAAGGTAGC (SEQ IDNO: 150) P427L- Cebadores externos : W535F-C535G 25 F, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAAC (SEQ ID NO: 168) de Spy0167 25 StopR, GCGTCTCGAGTCACTTATAAGTAATCGAACCATA (SEQ ID NO: 17450) sin Cebadores internos : etiqueta W-C_for, CCGTATCATGGCTAGAGAGGGCACTGGCTTAGCTTTCGAATG (SEQ ID NO: 170) W-C_rev, CATT' CGAAAGCTAÁGCCAGTGCCCTCTCTAGCCATGATACGG (SEQ ID NO: 171) P427L-W535F Cebadores externos : de Spy0167 25 F, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAAC (SEQ ID NO : 168) sin 25 StopR, GCGTCTCGAGTCACTTATAAGTAATCGAACCATA (SEQ ID NO: 169) etiqueta Cebadores internos: WF5 3 5for, GAGTGCACTGGCTTAGCTFTCGAATGGTGGCGAAAAGTGATC (SEQ ID NO: 162) WF5 35_rey, GATCACTTTTCGCCACCAEFCGAAAGCTAAGCCAGTGCACTC (SEQ ID NO: 163) P427L-C530G Cebadores externos: de Spy01G7 25 F, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAAC (SEQ ID NO: 168) sin 25 StopR, GCGTCTCGAGTCACTTATAAGTAATCGAACCATA (SEQ ID NO: 169) gen cebadores etiqueta Cebadores internos : CG530for, CCGTATCATGGCTAGAGAGGGCACTGGCTTAGCTTGGGAATG SEQ ID NO: 166) CG530rev, CATTCCCAAGCTAAGCCAGTGCCCTCTCTAGCCATGATACGG (SEQ ID NO: 167) ??248 de Cebadores externos : Spy0167 25F Nhel, GTGCGTGCTAGCGAATCGAACAAACAAAACACTGC (SEQ ID NO: 157) etiquetado 25 revhis, GCATTCX¾TCCTCGAGCITATAAGTAATCX3AACC¾TATGGG (SEQ ID NO: 161 ) con his Cebadores internos : A248for, TGGTGGTAATACGCTTCCTAGAACACAATATACTGAATCAATGG (SEQ ID NO: 172) A248rev, CCATTGATTCAGTATATTGTGTTCTAGGAAGCGTATTACCACCAG (SEQ ID NO: 173) Tabla 5.

Células competentes BL21(DE3) de E. coli (Novagen) se transformaron con el constructo correcto. Se agregó el medio LBPTK y, después de la incubación durante 1 hora a 37 °C, con agitación a 250 rpm, las bacterias se colocaron en placas sobre placas LBPTK que contienen 50 vg/ml de canamicina. Se desarrollaron células sin etiqueta de tipo silvestre de BL21(DE3) pet24b+ Spy0167 a 25°C y se indujeron con IPTG 1 mM. La expresión del clon se verificó por el SDS PAGE (sin etiqueta, FIGURA 15A y FIGURA 15B; etiquetado con His, FIGURA 16) .

EJEMPLO 16 Purificación de las proteínas etiquetadas con His Granulos de E. coli se suspendieron en solución amortiguadora de lisis y se mezclaron durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. Los Usados se centrifugaron a 30-40000 x g durante 20-25 minutos y los sobrenadantes se cargaron sobre columnas equilibradas con solución amortiguadora A de lavado (Poli-Prep con 1 mi de resina de Flujo Rápido Sepharose Quelante Activada con Ni) . La resina cargada se lavó tres veces con solución amortiguadora A de lavado y tres veces con solución amortiguadora B de lavado. Las proteínas se eluyeron con solución amortiguadora de elución en tubos Eppendorf que contienen 2mM final de DTT. Las proteínas de elución total se cuantificaron con el reactivo de Bradford y luego se analizaron por la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (FIGURAS 15A-15B y FIGURA 16) .

Soluciones amortiguadores: Solución amortiguadora de lisis: 10 mi de B-PERMR (Reactivo de Extracción de Proteínas bacterianas, Pierce cat. 78266) Concentración final de MgCl2 de 0.1 mM 100 unidades de ADNsi I (Sigma cat. D-4263) Concentración final de lisozimas (Sigma cat. L- 7651) de 1 mg/ml Solución amortiguadora de lavado A: NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8.0 Solución amortiguadora B de lavado: imidazol 20 mM, NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8.0 Solución amortiguadora de elución: imidazol 250 mM, NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8.0.

EJEMPLO 17 Purificación de las proteínas sin etiqueta Preparación del Usado Aproximadamente 80-110 g de gránulos de cultivo bacteriano se suspendieron en 200-280 mi de reactivo B-PERMR (Pierce) suplementado con 6 tabletas de inhibidor de proteasa COMPLETEMR, 10 mi de EDTA 0.2 M pH 7.5 (concentración final 5 mM) , 10 mi de una solución de lisozima de 100 mg/ml, 8 mi de una solución de DNAsa I de 10000 K unidades/ml y 1 mi de 50 solución MgCl2 50 mM. La lisis bacteriana se logró al agitar la suspensión bacteriana durante 60 minutos hasta que se obtuvo una suspensión homogénea.

Después de la centrifugación durante 60 minutos a 13000 rpm (25400 x g) , el sobrenadante se filtró usando un filtro de 0.22 µ?? y se diluyó con H20 hasta que se obtuvo una conductividad de 1.8-1.9 mS . El pH se ajustó a 8.0. La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford .

Cromatografía de intercambio aniónico El sobrenadante derivado del lisado tratado como se describe anteriormente se cargó sobre una columna HP 50/10 Q Sepharose (-200 mi), equilibrada previamente con TRIS 30 mM, pH 8.0. Se recolectó el flujo continuo. Las reacciones que contienen la proteína de Spy0167 se agruparon y se dializaron contra fosfato Na 10 mM, pH 6.8. La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford.

Solución amortiguadora A: TRIS 30mM, pH 8.0 Solución amortiguadora B: TRIS 30mM, NaCl 1 M, pH 8.0 Equilibrio y Carga: 0% de B Gradiente: 0-25% de B en 5 CV - 25% de B en 2 CV Lavado: 100% de B en 2 CV + 3 CV Flujo: 20 ml/min Volumen de la fracción: 14 mi Cromatografía de hidroxilapatita La agrupación previamente obtenida se cargó sobre una columna CHT20 equilibrada previamente con fosfato Na 10 mM pH 6.8. Se recolectó el flujo continuo.

Solución amortiguadora A: fosfato N alOmM, pH 6.8 Solución amortiguadora B: fosfato Na 500 mM, pH 6.8 Lavado: 8 CV Lavado: 30% de B en 6 CV Gradiente: 30-100% de B (10 CV) Lavado: 100% de B Flujo: 5 ml/min.

Volumen de la fracción: 5 mi Se cargaron alícuotas de fracción sobre gel Criterion al 12% bajo condiciones de reducción y no de reducción. Las fracciones que contienen la proteína de Spy0167 se agruparon y la concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford.

Cromatografía de filtración en gel La agrupación recolectada se concentró usando un filtro Amicon a fin de obtener un volumen < 10 mi. El material concentrado se cargó sobre un HiLoad Superdex 200 26/60 equilibrado con por lo menos 3-4 volúmenes de columna de PBS.

Solución amortiguadora: PBS Elución: Isocrática Flujo: 2.5 ml/min.

Volumen de la fracción: 5 mi Se agruparon las fracciones que contienen la proteína de Spy0167 y la concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford. Una estimación adicional de la concentración de proteínas se realizó por la medición de UV que considera Abs 0.1% (=1 g/1) 1.119. La pureza de la proteína se analiza por la electroforesis en gel de poliacrilamida gel (FIGURAS 18A-18B) .

EJEMPLO 18 Ensayos hemolíticos Protocolo para el ensayo hemolítico cuantitativo Diluciones en serie de toxinas se prepararon en placas de 96 pocilios con fondos en forma de U usando PBS + BSA al 0.5%. Uno mi de sangre de oveja se lavó tres veces en PBS (con centrifugación a 3000 x g) , y las células sanguíneas se suspendieron en 5 mi de PBS. Un volumen igual de suspensión se agregó a 50 µ? de cada dilución de toxinas y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Tritón (2%) en agua se usó para proporcionar la hemolisis al 100%, y el PBS + BSA al 0.5% se usó como control negativo. Las placas luego se centrifugaron durante 5 minutos a 1,000 x g, y el sobrenadante se transfirió cuidadosamente a las placas de fondo plano de 96 pocilios. La absorbancia se leyó a 540 nm.

Comparación de los extractos de E. coli que contienen Spy0167 de tipo silvestre y mutante de Spy0167 P427L El gen que codifica Spy0167 P427L se amplificó usando la PCR del genoma SF370 MI y se clonó en el vector pET21b+, el cual permitió la expresión en el BL21DE3 E. coli de la proteína etiquetada con His. Los extractos solubles de la E. coli que expresan cantidades similares de las proteínas de estreptolisina 0 de tipo silvestre y mutadas (véase la FIGURA 12) se usaron para realizar un ensayo hemolítico para comparar las propiedades citolíticas de los dos antígenos. El resultado del ensayo se muestra en la FIGURA 9, el cual muestra que la proteína mutada es por lo menos 100 veces menos tóxica que la de tipo silvestre.

Comparación de Spy0167 de tipo silvestre purificado y el mutante de Spy0167 P427L El mutante Spy0167 P427L se purificó de acuerdo con los procedimientos de estándares de purificación para las proteínas recombinantes etiquetadas con His (FIGURA 10) . Diferentes concentraciones de las proteínas wt y mutadas y purificadas se usaron para repetir el ensayo hemolítico, el cual confirmó la actividad citolítica disminuida (FIGURA 11) .

Actividad hemolítica de extractos de E. coli en Spy0167 de tipo silvestre etiquetado con His y sin etiqueta y el mutante de Spy0167 P427L Se comparó la actividad hemolítica de los lisados de E. coli transformados con el Spy0167 recombinante de tipo silvestre (rSpy0167) sin una etiqueta de His (BL21 DE3, Novagen No. 71382-pET24) y el mutante P427L de rSpy0167 sin una etiqueta de His (BL21 DE3, Novagen No. 71382-pET24) . El BL21 DE3 de E . coli (Novagen, No. 71382) transformado con pET24 sin inserto se usó como un control negativo. El control positivo fue una solución hipotónica que contiene Tritón al 2% en agua. El control negativo fue la solución amortiguadora de dilución de proteínas (PBS que contiene BSA al 0.5%, pH 7.4).

La hemolisis se determinó al medir la absorbancia a 540 nm (A54onm) de los sobrenadantes. El título se calculó como la dilución con 50% de A54onm máxima.

Los resultados se muestran en las Tablas 6 y 7 y en la FIGURA 13. Estos datos muestran que, bajo las mismas condiciones, el mutante P427L es 1000 veces menos hemolítico que el Spy0167 de tipo silvestre.

Tabla 6.

Tabla 7.

Comparación del Spy0167 de tipo silvestre y varios mutantes de Spy0167 La actividad hemolítica del Spy0167 de tipo silvestre se comparó con la actividad hemolítica de varios mutantes de Spy0167 diferentes. Los resultados se muestran en la FIGURA 20 y en la Tabla 8, a continuación. Una unidad hemolítica (HU) se define como la cantidad de toxina requerida para obtener 50% de lisis máxima obtenida tratando las células sanguíneas con Tritón al 2%.

Tabla 8.

Debido a las diferencias en la pureza de proteína, las unidades/mg de hemolisis de los mutantes indicadas en la sangre se sobre-estimaron; sin embargo, es claro que (1) el mutante W535F es menos hemolítico que el mutante C530G; (2) el mutante P427L es aproximadamente 1000 veces menos hemolítico que el de tipo silvestre y aproximadamente 6-25 veces menos hemolítico que de los otros dos mutantes W535F y C530G; y (3) el mutante ?248 es ciertamente menos hemolítico que el de tipo silvestre) .

Efecto del colesterol Diluciones en serie de dos-cinco veces en PBS- BSA al 0.5% de lisado de E . coli o lisado de E . coli con 200 mg/ml de colesterol obtenidos después del desarrollo de las células a 30°C e inducción con IPTG 1 mM a 25°C y OD60onm a aproximadamente 0.4-0.6, se sometieron a ensayo para su actividad hemolítica. Cincuenta microlitros de una solución de eritrocitos de oveja al 2% en PBS se trataron con un volumen igual de preparaciones de proteínas obtenidas al lisar las bacterias, 3 horas después de la inducción, con solución amortiguadora de lisis (solución B- PER- PIERCE -MgCl2 1 mM, 100K unidades/ml de DNAsa (Sigma) y lisozima (Sigma) durante 30-40 minutos. La fracción insoluble luego se centrifugó (15 minutos, 21000 x g, 4°C) , y el sobrenadante (lisado de E. coli) se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf que contiene DTT en una concentración final de 5 mM .

Bajo esta condición, el colesterol no inhibió el Spy0167 ya sea de tipo silvestre o mutante hasta que se usó un factor de dilución de 100 veces; de esta manera, no hubo efecto en la lisis inducida por mutante. En contraste, la lisis inducida por tipo silvestre se redujo grandemente. La lisis inducida por el control negativo no se afectó por el colesterol, lo cual sugiere que la inhibición inducida por colesterol es específica. Véase la Tabla 9 y la FIGURA 14.

Tabla 9 EJEMPLO 19 Inhibición de la hemólisis Protocolo Diluciones de dos veces en serie de sueros de ratón inmunizados con proteínas de Spy0167 de tipo silvestre o mutante (sin adyuvantes o con Alumbre o MF59MR como adyuvantes) se prepararon en placas de 96 pocilios con fondos en forma de U usando PBS + BSA al 0.5%. Los sueros de los ratones inmunizados con PBS o con adyuvantes solo como sea apropiado, se usaron como controles negativos. Se agregó un volumen igual de una solución de toxina de 50-100 ng/ml (3.5-7 de HU) en PBS + BSA al 0.5%, y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos bajo agitación (800 rpm) . Después de la incubación, 50 mi de esta solución se transfirieron a una nueva placa de 96 pocilios, y un volumen igual de una suspensión de glóbulos rojos de oveja (lavada 3 x en PBS) se agregaron y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Las placas luego se centrifugaron durante 1 minuto a 1,000 x g, el sobrenadante se transfirió cuidadosamente a placas de fondo plano de 96 pocilios, y la absorbancia se leyó a 540 nra. En los resultados descritos a continuación, el título de inhibición se expresa como la dilución de sueros que redujo la hemolisis inducida por Tritón al 50%.

Inhibición de la hemolisis de la Spy0167 por los antisueros de Spy0167 de tipo silvestre La inhibición de la hemolisis de la Spy0167 por los antisuero de el Spy0167 de tipo silvestre se muestra en la FIGURA 21 - FIGURA 23 y las Tablas 10-12. Los títulos de los sueros anti-Spy0167se incluyeron entre 1/7,000 y 1/14,000 (media aritmética, 1/12,167 ± 2,714. Títulos de suero de control negativo (adyuvante de Freund) se incluyen entre 1/375 y 1/4,000 (media aritmética, 1/1,854 ± 1,384).

Tabla 10 mostradas gráficamente en la FIGURA 22) .

Media aritmética - % de hemolisis factor de anti-Spy0167 sueros de control dilución/sueros negativo 125 9 250 10 500 19 1, 000 2 38 2,000 2 69 4, 000 2 84 8,000 19 93 16,000 78 97 32, 000 99 64,000 97 128,000 100 Tabla 11 Tabla 12 (mostrado gráficamente en la FIGURA 23) Titulación de la actividad hemolítica del Spy0167 de tipo silvestre, Spy0167 de tipo silvestre químicamente destoxificado y mutantes de Spy0167 La titulación de la actividad hemolítica del Spy0167 de tipo silvestre, Spy0167 de tipo silvestre químicamente destoxificado, y mutantes de Spy0167 (P427L; P427L + 535F) se muestra en la Tabla 13.

Tabla 13 Inhibición de la hemolisis de Spy0167 por el antisuero contra las proteínas de Spy0167 mutante La inhibición de la hemolisis del Spy0167 por los antisueros contra las proteínas de Spy0167 mutante se muestra en la FIGURA 27 - FIGURA 29 y las Tablas 14-16. Usando 50 ng/ml (3.5 de HU) de toxina, la dilución de sueros requerida para obtener una reducción del 50% de la actividad hemolítica del Spy0167 para el mutante de Spy0167 535-P427L es 1/17,860 usando adyuvante de Alumbre y 1/7991 usando adyuvante MF59M . Los títulos de control negativo (adyuvante solo) son 1/1,000 (Alumbre) y 1/125 (MF59 ) .

Tabla 14 (mostrada gráficamente en la FIGURA 27) .

Tabla 15 (mostrada gráficamente en la FIGURA 28) Tabla 16 (mostrada gráficamente en la FIGURA 29) EJEMPLO 20 Experimentos de protección in vivo La proteína Spy0167 P427L purificada, junto con el adyuvante de Freund, se administró intraperitonealmente a 40 ratones. Los ratones luego se estimularon intranasalmente con la cepa de GAS 3348 MI. La Tabla 17 reporta los datos obtenidos en 3 experimentos separados, que muestran que la protección del 100% se logró consistentemente en todos los supervivencia Grupos de 10-20 ratones se inmunizaron con 20 g de la proteína recombinante en los días 0, 21 y 35. Los ratones de los grupos de control negativo se inmunizaron ya sea con GST solo o con contaminantes de E. coli, dependiendo de la versión de la proteína usada recombinante de GAS. Dos semanas después de la tercera inmunización, se tomaron muestras de sangre. Pocos días después, los ratones inmunizados se estimularon intranasalmente con 108 cfu (50 µ?) de las cepas de GAS Ml 3348. La supervivencia de los ratones se supervisó durante un periodo de 10-14 días. Los sueros inmunes obtenidos de los diferentes grupos se sometieron a prueba para inmunogenicidad en la proteína recombinante de Spy0167 entera (análisis western blot) . Los resultados se muestran en las Tablas 18 y 19.

Tabla 18 Tabla 19 Proteína # de ratones % de % de supervivencia de supervivencia control negativo Spy0167 WT 20 100 45 etiquetada con His C530G etiguetada 20 100 45 con His W535 etiguetada 20 100 45 con His W535F-D482 20 100 45 etiguetada con His P427L etiguetada 20 95 45 con His Aala248 20 100 45 etiguetada con His EJEMPLO 21 Experimentos de toxicidad in vivo Protocolos Inyección intravenosa de Spy0167. Una solución de Spy0167 ya sea de tipo silvestre o mutante en PBS se diluye en una solución de PBS + 2 mM DTT, luego 100 mi se inyectan en la vena de la cola de un ratón. Los ratones se observaron durante 2-3 días. La inyección del Spy0167 de tipo silvestre da por resultado típicamente la muerte dentro de pocos minutos .

Ensayo de inhibición de letal idad in vivo. Para la inhibición de letalidad mediada por suero inmunes, 10 g/ratón de Spy0167 de tipo silvestre (una' solución de 100 pg/ml en PBS, DTT 2 mM) se incuban durante 20 minutos con rotación a temperatura ambiente con ya sea suero anti-Spy0167 o suero de control (obtenidos de ratones inmunizados con adyuvante solo) . Después de la incubación, las muestras se inoculan en los ratones mediante inyección intravenosa en la vena de la cola. Los ratones se observan durante 2-3 días.

Los resultados para el Spy0167 de tipo silvestre y el Spy0167 P427L-W535F mutante se muestran en la Tabla 20.

Tabla 20.

Se evaluó la toxicidad aguda in vivo usando una dosis de 10 g/ratón de Spy0167 de tipo silvestre como un control positivo e inyección de adyuvante de Freund solo como un control negativo. Diez g/ratón de Spy0167 de tipo silvestre se incubaron con ya sea antisuero de Spy0167 de tipo silvestre o con suero de control y se inocularon en los ratones como se describe anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 21.

Tabla 21.

Los resultados de otro conjunto de experimentos realizados como se describe anteriormente se muestran en las Tablas 22 y 23. La toxicidad aguda in vivo se evaluó usando ya sea 5 o 10 g/ratón de Spy0167 de tipo silvestre. En particular, 10 µg/ratón de Spy0167 de tipo silvestre se pre-incubaron ya sea con sueros de ratones inmunizados con Spy0167 P427L-W535F o únicamente PBS (sin suero) . Además, 5 µg/ratón de Spy0167 de tipo silvestre se pre- incubaron ya sea con sueros de ratones inmunizados con Spy0167 P427L-W535F o sueros de ratones inmunizados con PBS más adyuvante (Alumbre), como suero de control negativo.

Los resultados demuestran que las dosis letales del Spy0167 de tipo silvestre se neutralizaron por sueros anti-Spy0167 P427L-W535F pero no por sueros de control negativo en la misma dilución.

Tabla 22.

Tabla 23 Spy0167 de tipo silvestre (5 ug/ratón) sueros dilución del muerto/tratado suero antiSpy0167 P427L-W535F, adyuvante de 1/5 0/4 alumbre Control negativo (solo alumbre) 1/5 4/4 EJEMPLO 22 Inmunización con Spy0167 P427L-W535F protege a los ratones contra la inyección intravenosa del Spy0167 de tipo silvestre Ratones se inmunizaron intraperitonealmente tres veces (día 0, día 21, y día 35) con ya sea Spy0167 de tipo silvestre o con el mutante de Spy0167 P427L-W535F usando alumbre como un adyuvante (20 g de proteína en 2 mg/ml de hidróxido de aluminio) . Los ratones que se inmunizaron con adyuvantes solo se usaron como un control negativo. En el día 55 a los ratones se les inyectó intravenosamente con diferentes concentraciones de una solución de Spy0167 de tipo silvestre en PBS, DTT 2 mM y se supervisaron durante por lo menos 72 horas. Los resultados se muestran en la Tabla 24.

Tabla 24 Cinco yg/ratón de Spy0167 de tipo silvestre es letal para los ratones inmunizados con adyuvante solo; estos ratones murieron dentro de pocos minutos después de la inyección de Spy0167. Sin embargo, aún 20 g/ratón de la misma preparación de Spy0167 de tipo silvestre no exterminó los ratones inmunizados con ya sea Spy0167 de tipo silvestre o con el mutante de P427L-W535F Spy0167.

EJEMPLO 23 Protección contra la estimulación intranasal con la cepa GAS MI por el mutante de Spy0167 P427L-W535F Treinta ratones se inmunizaron intraperitonealmente con el mutante de Spy0167 P427L-W535F, con ya sea Alumbre o MF59 como adyuvantes, y se estimularon intranasalmente con una cepa de GAS MI . Los resultados se muestran en la FIGURA 30. Setenta y siete por ciento de los ratones inmunizados con el mutante de Spy0167 P427L-W535F y Alumbre se protegieron contra la estimulación intranasal con una cepa de GAS MI, como es comparado con 3% de los ratones de control negativo (inmunizados con adyuvantes solamente) . Noventa por ciento de los ratones inmunizados con el mutante de Spy0167 P427L-W535F y MF59 se protegieron contra la estimulación intranasal con una cepa de GAS MI, como es comparado con 10% de los ratones de control negativo (inmunizados con adyuvante solamente) . Estos niveles de protección son comparables con aquellos obtenidos al inmunizar ratones con Spy0167 de tipo silvestre.

EJEMPLO 24 Estudios de protección in vivo en ratones inmunizados con antígenos de GAS Este ejemplo proporciona los resultados de pruebas de inmunogenicidad / protección llevadas a cabo con varias combinaciones de antígenos de GAS y/o polisacárido específico de GAS conjugado con CRM197 (GC) después de la estimulación con cepas de GAS de diferentes tipos M. las proteínas de GAS y GC se formularon ya sea con el adyuvante de Freund, hidróxido de aluminio, o MF59. Las dosis de antígeno proteínico fueron 20 µg cuando se usaron solas; las formulaciones de combinación de proteínas contuvieron 20 ug cada una de Spy0269 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 177) y Spy0416 D151 A/S617A (SEQ ID NO: 198) y 10 g de P427L/W535F de Spy0617 (SEQ ID NO: 125) . Las dosis de GC se indican en las tablas.

El programa de inmunización implicó tres dosis en los días 0, 21, y 35. Los sangrados se hicieron antes de la primera inmunización y dos semanas después de la tercera inmunización. Los grupos de control negativo se inmunizaron con adyuvantes solamente. Los grupos de control positivos se inmunizaron con homólogos de la proteína M a la cepa de estimulación .

Dos semanas después de la tercera inmunización, los ratones se infectaron con dosis letales que varían de 2.5 x 106 a 2.5 x 108 (infección intranasal) o 20 a 2.5 x 106 (infección intraperitoneal) , dependiendo de la cepa de estimulación usadas. Las tasas de supervivencia se determinaron y se reportaron en las Tablas 25 y 26. El valor p se calculó con la prueba de Fisher.

La inmunogenicidad se sometió a prueba por el ELISA.

Protección por antígenos únicos y su combinación en el adyuvante de Freund contra la infección intranasal con MI, M12 y M23 La Tabla 25 reporta los resultados de los experimentos en los cuales los ratones se inmunizaron con Spy0269 (SEQ ID NO: 177), D151A/S617A de Spy0416 (SEQ ID NO:198), o P427L/W535F de Spy0617 (SEQ ID NO: 125), o una combinación de estos antígenos ("combo") formulados con adyuvante de Freund y luego se estimularon intranasalmente con las cepas MI, M12 y M23. Los resultados indican que: a. el Spy0269 confiere protección estadísticamente significativa contra la infección por MI, M12 y M23; b. D151A/S617A de Spy0416 y P427L/ 535F de Spy0617 confieren protección significativa contra la infección intranasal con el serotipo MI; y c. la combinación de Spy0269, D151A/S617A de Spy0416 y P427L/W535F de Spy0617 confiere >40% de protección contra los serotipos MI, M12 y M23 GAS.

Tabla 25 Protección por la combinación de antigenos de GAS25, GAS40, y GAS 57 mas GC, formulados con alumbre contra la infección intraperitoneal con MI La Tabla 26 reporta los resultados de los experimentos en los cuales los ratones se inmunizaron con la combinación del mutante de Spy0167 P427L/W535F, Spy0269 de tipo silvestre, y el mutante de D151A/S617A de Spy0416 ("combo") con o sin GC formulados con Alumbre y luego estimulados intraperitonealmente con MI. Los resultados indican que la protección estadísticamente significativa se obtuvo tanto con la combinación de proteínas sola y con la combinación de proteínas más GC . De esta manera, aún en la combinación, se mantiene la inmunogenicidad excepcional de estos antígenos de GAS.

Tabla 26 MI 3348 Antígeno ita/total % Surv Pval Combo 45/92 49 0, 0001 GC 82/168 49 0, 0001 Combo + GC 36/72 50 0, 0001 Proteína M 51/58 88 0, 0001 Negativo 36/52 14 EJEMPLO 25 Ensayo del enlace celular Líneas de células epiteliales humanas (A549, HeLa, 293, Detroit, ME 180) o de mono (LLCMK2) se separan no enzimáticamente de su soporte usando una solución de disociación celular (Sigma) , se cosechan y se suspenden en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) . Aproximadamente 2 x 10s células se mezclan con ya se el medio solo o con diferentes concentraciones de proteínas recombinantes de Spy0269 ( g/ml) en un volumen total de 200 mi en placas de 96 pocilios con fondos en forma de U. La incubación a 4°C se lleva a cabo durante 1 hora. Después de dos lavados con PBS, las células se incuban con anticuerpos de Spy0269 o antisuero (por ejemplo, para el antisuero, 1:200 en PBS/BSA al 1%) durante 1 hora a 4°C. Después de dos lavados, las muestras se incuban a 4°C durante 30 minutos con un anticuerpo secundario (por ejemplo, para un antisuero Spy0269 de ratón, el anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo F(ab)2 de cabra conjugado con R- ficoeritrina específico para la inmunoglobulina de ratón diluido 1:100 en PBS/BSA al 1%). Las reacciones del enlace se analizan por la citometría de flujo. Se calcula la intensidad de fluorescencia media para cada población.

EJEMPLO 26 Ensayo de opsonofagocitosis Este ejemplo describe el ensayo de opsonofagocitosis usado en los ejemplos a continuación. Brevemente, las bacterias (10-50 unidades formadoras de colonias CFUs, 25 µ? en PBS) se incuban con 225 µ? de sangre entera de conejos inmunizados ya sea con adyuvante solo o con el (los) antígeno(s) sometido a prueba. Las muestras se incuban 5 horas a 37° con rotación en forma continua. Después de la dilución, las muestras se colocan en placas sobre placas de agar de sangre y se estima el número de CFU.

En este ensayo, el exterminio de fondo por los sueros de los animales inmunizados con el adyuvante solo varía de 7-36%. La actividad de exterminio por los antígenos varía pero es consistentemente positiva (por ejemplo, 72-97% para anticuerpos MI, 47-64% para anticuerpos GC, y 76-85% para anticuerpos formulados contra la combinación del Spy0269 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 177) , mutante doble de Spy0167 P427L/ 535F (SEQ ID NO: 125), y mutante doble de D151A/S617A de Spy0416 (SEQ ID NO: 198) .

EJEMPLO 27 Ensayos bactericidas de sangre entera que demuestran que los anticuerpos anti -glicoconjugados (GC) median el exterminio del S. pyogenes El ensayo descrito en el Ejemplo 26 se llevó a cabo usando sangre entera obtenida de conejos inmunizados con 100 µ9 de GC) . Los resultados, mostrados en la FIGURA 34, muestran que los anticuerpos anti-GC median el extermino del S. pyogenes.

EJEMPLO 28 Ensayos bactericidas de sangre entera que muestran que la combinación de los anticuerpos anti -glicoconjugados (GC) y anticuerpos generados contra las combinaciones de antígenos de GAS mejoran el exterminio del S. pyogenes El ensayo descrito en el Ejemplo 26 se llevó a cabo con sangre entera obtenida de conejos inmunizados con (a) adyuvante de Freund, (b) proteína MI, (c) una combinación de Spy0269 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 177), mutante doble de Spy0167 P427L/ 535F (SEQ ID NO: 125), y mutante doble de D151A/S617A de Spy0416 (SEQ ID NO: 198) (100 yg cada uno), (d) GC, y (e) la combinación del Spy0269 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 177) , Spy0167 mutante doble de P427L/W535F (SEQ ID NO: 125) , mutante doble de D151A/S617A de Spy0416 (SEQ ID NO: 198) , y GC. Los resultados se muestran en la FIGURA 35.

Es deseable para una vacuna de GAS que sea bactericida así como también inmuñogénica . Estos resultados muestran que, aún en combinación, estos antígenos de GAS tienen actividad bactericida. Los resultados también muestran un efecto bactericida superior de la combinación de los antígenos de GAS y el antígeno del GC comparado con aquel de ya sea la combinación de antígeno del GAS o el antígeno del GC solo.

EJEMPLO 29 Experimentos que demuestran la falta de toxicidad celular de los antígenos de GAS Células endoteliales microvasculares de cerebro humano (HBMECs) se trataron in vitro durante 24 horas con varias concentraciones de antígenos de GAS recombinantes en un medio RPMI 1640. Los controles negativos no se trataron ("NT") , y las células tratadas con 1 pg/ml de TNF se usaron como controles positivos. Se usó anexina V y tinción de yoduro de propidio paira medir el porcentaje de las células apoptóticas por la citometría de flujo. Los resultados indican nada de toxicidad significativa en las concentraciones del Spy0269 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 177), mutante doble Spy0167 P427L/W535F (SEQ ID NO: 125), mutante doble Spy0416 D151 A/S617A (SEQ ID NO: 198) , y glicoconjugado ("GAS GC" ) usados en estos ejemplos. Véase la FIGURA 36A- FIGURA 36D.

EJEMPLO 30 Conservación y expresión del antigeno proteínico La Tabla a continuación muestra el porcentaje de identidad promedio para cada uno de Spy0269, Spy0416, y Spy0167 entre 57, 49, y 13 cepas de S. pyogenes, respectivamente .

EJEMPLO 31 Ensayos ELISA Brevemente, las placas se recubrieron con antígeno (0.1-0.3 yg/pocillo) y se bloquean con albúmina de suero bovino al 2% (BSA) en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Después de la incubación con diluciones en serie de dos veces de los sueros sometidos a prueba, las placas se lavan con albúmina de suero bovino al 2% (BSA) en solución salina amortiguada con fosfato (PBS), y TWEEN20M al 0.05% y se incuban con anticuerpo secundario (IgG anti-total, 1:2000) conjugado con fosfatasa alcalina. Después de la incubación con el substrato de fosfato de p-nitrofenilo (pNPP, 3 yg/ml) , la absorbancia se mide a 405 nm. Los títulos de suero se calculan al interpolar ODs de una curva estándar. Este ensayo es lineal y reproducible, como se muestra en la FIGURA 37A - FIGURA 37D.

EJEMPLO 32 Experimentos de estimulación in vivo Ratones hembras de 5-6 semanas de edad CD1 se inmunizaron intraperitonealmente 3 veces en los días 0, 21 y 35 con varias dosis de antígenos de GAS adyuvados con alumbre en PBS y estimulados ya sea intranasalmente (50-ml de Todd Hewitt que contiene una dosis bacteriana LD90) o intraperitonealmente (200 µ? de Todd Hewitt que contiene una dosis bacteriana LD90 con varias cepas de) con varias cepas de S. pyogenes . Los resultados se muestran en las Tablas 27 y 28. En las Tablas 27 y 28, "40", "25", y "57", respectivamente, son el Spy0269 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 177), mutante doble P427L/W535F de Spy0167 (SEQ ID NO: 125), y mutante doble D151A/S617A de Spy0416 (SEQ ID NO: 198) .

Tabla 27. Protección conferida con los antígenos de GAS y combinaciones de los antígenos de GAS en un modelo de estimulación intraperitoneal .

Serotipos/cepas de estimulación MI 3348 M23 2071 M6 S43 adyuantígeno % de P % de P % de P vante supervi - supervi - supervivencía vencía vencia GC 47 (176) <0. o o : 30 (80) < o . o o : 33 (104) < o . 0 0 : 25+40+57 79 (156) < o . o o : 36 (64) < o . o o : 36 ,88) < o . 00 : 25+40+57 +GC 74 (80) < o . o o : 48 (64) <0.00 48 (88) < o . 00 : alumbre solo 14 (>100) 10 (>100) 11 (>100) Tabla 28. Protección conferida por los antígenos de GAS y combinaciones de los antígenos de GAS en un modelo de estimulación intranasal.

EJEMPLO 33 Inclusión de alumbre proporciona protección contra la cepa MI 3348 Este ejemplo muestra que la inclusión de alumbre en tanto el Spy0167 y en formulaciones de combinación proporciona protección contra la cepa de S. pyogenes MI 3348.

Ratones hembras de 5-6 semanas de edad CD1 se inmunizaron con 10 µg de Spy0167 (GAS25) o con una combinación de Spy0167 (10 ig) junto con Spy0269 (GAS40, 20 \ig) y Spy0416 (GAS57, 20 g) ("combinación"), con o sin alumbre. Los animales se inmunizaron intraperitonealmente con 3 dosis en los días 0, 21 y 35. La estimulación intranasal con MI 3348 se llevó a cabo esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se muestran en la Tabla 29.

Tabla 29. Efecto de incluir alumbre en la supervivencia después de la estimulación intranasal con MI 3348.

EJEMPLO 34 Estabilidad de las formulaciones de antígeno del GAS La estabilidad y la potencia in vivo de una formulación de antígeno del GAS de combinación que contiene 100 g/ml Spy0269 (1 mg/ml de solución en PBS) , 100 µg de mutante doble D151A/S617A de Spy0416 (1 mg/ml de solución en PBS), 50 g de mutante doble de Spy0167 P427L/ 535F (1 mg/ml de solución en PBS) , 2 mg/ml de hidróxido de aluminio, solución amortiguadora de histidina 10 mM (pH 7.0), 9 g/1 de cloruro de sodio, con un pH de 7.0 +/- 0.3, con un osmolaridad de 300 +/- 20 mOsm/kg se sometió a prueba por el análisis de SDS-PAGE para la integridad del antígeno. La formulación es estable hasta 1 año has 4°C. La estabilidad del antígeno se evalúo al incubar 2-8°C durante un período de un año. Los tres componentes de proteínas parecieron muy estables después de un año como se avalúa por el SDS-PAGE. Los antígenos proteínicos permanecieron absorbidos al alumbre (>97.5 %) durante por lo menos 36 semanas a 2-8°C.

EJEMPLO 35 Efecto de los anticuerpos Spy0416 y Spy0167 Este ejemplo muestra que los anticuerpos Spy0416 y Spy0167 bloquean la actividad tóxica.

Spy0416 : El Spy0416 se pre-incubó con agrupaciones de sueros específicos de ratón o con un suero humano con títulos altos de ELISA a Spy0416. La mezcla luego se incubó con IL-8 (10 pg/ml) , y luego se sometió a prueba para la presencia de la IL-8 no escindida usando un anticuerpo que es específico para la citocina pero es incapaz de reconocer la forma inactiva escindida. Los resultados se expresan como un porcentaje de la IL-8 no escindida calculado como sigue: [IL-8 en la mezcla de reacción] x ico [IL-8 en la mezcla de control] , donde "mezcla de control" es la mezcla de reacción sin la enzima en el punto de tiempo 0.

Spy0167: el Spy0167 de tipo silvestre se pre-incubó con una agrupación de sueros de ratones inmunizados ya sea con 20 µ9 de Spy0167 P427L/ 535 F o con adyuvante solo y con sueros humanos de respondedores y no respondedores. La mezcla se agregó a una suspensión de células sanguíneas de oveja y se determinó la disminución de OD540 nm del sobrenadante de reacción. El título de inhibición se expresa como la dilución de suero requerida para reducir la hemolisis inducida por Spy0167 por 50%.

Los resultados se muestran en la FIGURA 41A -FIGURA 41B.

EJEMPLO 36 Experimentos de intervalo de dosis Ratones CD1 hembras de cinco semanas de edad se inmunizaron con dosis variantes de Spy0269 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 177), mutante D151A/S617A de Spy0416 (SEQ ID NO: 198) , y mutante P427LAV535F de Spy0167 (SEQ ID NO: 125) en los días 0, 21, y 35. Las respuestas de IgG dependiente de dosis en los ratones se midieron por el ELISA como se describe en el Ejemplo 31. Los resultados se muestran en la FIGURA 38A FIGURA 38C.

Los ratones se inmunizaron con antígenos proteínicos del GAS individuales en varias concentraciones y se estimularon intranasalmente con S. pyogenes I. Los resultados se muestran en la Tabla 30. Tabla 30.

Como se muestra en la Tabla 30, no es clara la protección dependiente de dosis, que indica que una variedad de concentraciones de estos antígenos son útiles para lograr la protección contra la estimulación de S. pyogenes.

Los ratones se inmunizaron con la combinación de 20 yg de Spy0269 de tipo silvestre ( SEQ ID NO: 177), 10 g de mutante doble P427L/W535F de Spy0167 (SEQ ID NO: 125), y 20 g de mutante doble D151A/S617A de Spy0416 (SEQ ID NO: 198) en varias concentraciones y se estimularon intranasalmente con S. pyogenes MI. Los resultados se muestran en la Tabla 31.

Tabla 31.

Como con los experimentos de dosis de antígeno único descritos anteriormente, no es clara la protección dependiente de dosis, indicando que, aún en combinación, una variedad de concentraciones de estos antígenos son útiles para lograr la protección contra la estimulación de S. pyogenes .

Los resultados se resumen en la FIGURA 39. La FIGURA 40 muestra un análisis de un modelo LogNormal adoptado como una primera aproximación de tiempo de supervivencia medio (MST; Mu) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (32)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición, caracterizada porque comprende: (a) una combinación de tres o más antígenos proteínicos de S. pyogenes (GAS) diferentes seleccionados del grupo que consiste de: (1) Spy0167; (2) Spy0269; (3) Spy0416; (4) Spy0714; (5) Spyl390; (6) Spy2000; (7) una proteína de Spy0167 mutante que comprende una alteración de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de aminoácidos P427, W535, C530, A248, y D482, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con SEQ ID NO: 107 y en donde la actividad hemolítica de la proteína de Spy0167 mutante se reduce por lo menos 50% relativa con el Spy0167 de tipo silvestre; y (8) una proteína de Spy0416 mutante que comprende una alteración de aminoácido en una o más posiciones de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de aminoácidos D151, H279, y S617, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con SEQ ID NO: l y en donde la actividad proteolítica del antígeno de Spy0416 mutante purificado contra la interleucina 8 (IL-8) se reduce por lo menos 50% relativo con el Spy0416 de tipo silvestre como se detecta por la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida o por un ensayo ELISA; (b) una o más moléculas de ácido nucleico que codifican (l)-(8); o (c) tres o más anticuerpos diferentes, en donde cada anticuerpo se enlaza selectivamente a un antígeno proteínico del GAS seleccionado del grupo que consiste de (l)-(8), en donde cada antígeno proteínico del GAS es diferente.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque los tres antígenos proteínicos del GAS son: Spy0167, Spy0269, y Spy0416; mutante P427L/W535F de Spy0167, Spy0269, y Spy0416; Spy0167, Spy0269, y mutante D151A/S617A de Spy0416; o mutante P427L/ 535F de Spy0167, Spy0269, y mutante D151 A/S617A de Spy0 16.

3. Una composición, caracterizada porque comprende: (a) solamente dos antígenos proteínicos del GAS en donde la composición comprende: (1) Spy0167 y un segundo antígeno del GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0269; Spy0416; una proteína de Spy0167 mutante que comprende una alteración de aminoácido en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de aminoácidos P427, W535, C530, A248, y D482, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con SEQ ID NO: 107 y en donde la actividad hemolítica de la proteína de Spy0167 mutante se reduce por lo menos 50% relativo con el Spy0167 de tipo silvestre; una proteína de Spy0416 mutante que comprende una alteración de aminoácido en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de aminoácidos D151, H279, y S617, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y en donde la actividad proteolítica del antígeno de Spy0416 mutante purificado contra la interleucina 8 (IL-8) se reduce por lo menos 50% relativo con el Spy0416 de tipo silvestre como es detectado por la electroforesis sin gel de SDS-poliacrilamida o por un ensayo ELISA; Spy0714; Spyl390; y Spy2000; (2) Spy0269 y un segundo antígeno del Gas seleccionado del grupo que consiste de Spy0167; la proteína de Spy0167 mutante; la proteína de Spy0416 mutante; Spy0714; Spyl390; y Spy2000; (3) Spy0416 y un segundo antígeno del GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167; la proteína de Spy0167 mutante; la proteína de Spy0416 mutante; Spy0714; Spyl390; y Spy2000; (4) la proteína de Spy0167 mutante y un segundo antígeno del GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167; Spy0269; Spy0416; la proteína del Spy0416 mutante; Spy0714; Spyl390; y Spy2000; (5) la proteína de Spy0416 mutante y ion segundo antígeno del GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167; Spy0269; Spy0416; la proteína de Spy0167 mutante; Spy0714; Spyl390; y Spy2000; (6) Spy0714 y un segundo antígeno del GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167; Spy0269; Spy0416; la proteína de Spy0167 mutante; la proteína de Spy0416 mutante; Spyl390; y Spy2000; (7) Spyl390 y un segundo antígeno del GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167; Spy0269; Spy0416; la proteína de Spy0167 mütante; la proteína de Spy0416 mutante; Spy0714; y Spy2000; y (8) Spy2000 y un segundo antígeno del GAS seleccionado del grupo que consiste de Spy0167; Spy0269; Spy0416; la proteína de Spy0167 mutante; la proteína de Spy0416 mutante; Spy0714; y Spyl390; (b) una o más moléculas de ácido nucleico que codifican los dos antígenos proteínicos del GAS; y (c) dos o más anticuerpos diferentes, en donde cada anticuerpo se enlaza selectivamente a uno de los dos antígenos proteínicos de GAS.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 3 caracterizada porque los dos antígenos proteínicos del GAS son: Spy0167 y Spy0269; Spy0167 y Spy0416; mutante P427L/ 535F de Spy0167 y Spy0269; mutante P427L/ 535F de Spy0167 y Spy0416; mutante D151A/S617A de Spy0269 y Spy0416; mutante D151 A/S617A de Spy0167 y Spy0416; o mutante P427L/W535F de Spy0167 y mutante D151A/S617A.

5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque comprende el antígeno de Spy0416 mutante.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5 caracterizada porque el antígeno de Spy0416 mutante comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de D151A y S617A.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 5 caracterizada porque el antígeno de Spy0416 mutante comprende SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, O SEQ ID NO: 198.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el antígeno de Spy0269 comprende SEQ ID NO: 177.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el antígeno de Spy0416 mutante es una proteína de fusión que comprende un segundo el antígeno del GAS .

10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque comprende el antígeno de Spy0167 mutante.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el antígeno de Spy0167 mutante comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, y SEQ ID NO: 127.

12. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 caracterizada porque por lo menos uno de los antígenos de GAS se acopla a una proteína portadora.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 12 caracterizada porque la proteína portadora se selecciona del grupo que consiste de una toxina bacteriana, un toxoide bacteriano, una proteína de membrana exterior de N. meningitidis, una proteína de choque de calor, una proteína de tosferina, una proteína de H. influenzae D, una citocina, una linfocina, una hormona, un factor de crecimiento, toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile y una proteína de captación de hierro.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 3, caracterizada porque comprende los tres o más anticuerpos diferentes, en donde los anticuerpos son anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, fragmentos de F(ab')2/ fragmentos F(ab), moléculas Fv, heterodímeros no covalentes, moléculas Fv de cadena individual (sFv) , constructos de fragmentos de anticuerpo diméricos, constructos de fragmento triméricos, minicuerpos o mezclas de los mismos .

15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque los anticuerpos se enlazan específicamente al Spy0416 de tipo silvestre e inhibe la capacidad del Spy0416 de tipo silvestre de escindir la IL-8 humana.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el anticuerpo inhibe la capacidad del Spy0416 de tipo silvestre de escindir una quimiocina humana del grupo que consiste de CXCLl/GROa, CXCL2/GR0 , CXCL3/GRO/, CXCL4 , CXCL 12/SDF-la, CXCL12/SDF-lp, CXCL12/SDF-ly, CXCL5/ENA78 , CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL9/MIG, CXCL10/IP10, CXCL11, CXCL13, CXCL14 , y CXCL16.

17. La composición de conformidad con la reivindicación 1, o reivindicación 3, caracterizada porque comprende la una o más moléculas de ácido nucleico.

18. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 17, caracterizada porque además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

19. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- 13, 17, o 18, caracterizada porque además comprende un agente activo que es útil en una vacuna pediátrica.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el agente activo se selecciona del grupo que consiste de: (a) un antígeno polipéptido seleccionado del grupo que consiste de N. meningitidis, S. pneumoniae, Bordella pertussis, Moraxella catarrhalis, Clostridium tetani, Chorinebacterium diphteriae, virus sincitial respiratorio, virus de la polio, virus de sarampión, virus de paperas, virus de rubéola, y antígenos polipéptidos de rotavirus; y (b) una molécula de ácido nucleico que codifica el antígeno polipéptido.

21. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- 13, 17, o 18, caracterizada porque además comprende un segundo agente activo que es útil en una vacuna para individuos de edad avanzada o inmunocomprometidos .

22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el segundo activo se selecciona del grupo que consiste de: (a) un antígeno polipéptido seleccionado del grupo que consiste de Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureaus, Staphylococcus epidermis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria onocytogenes, virus de influenza, y antígenos polipéptidos del virus de parainfluenza; y (b) una molécula de ácido nucleico que codifica el antígeno polipéptido.

23. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l - 13 o 16-22, caracterizada porque además comprende un polisacarido de grupo A de la fórmula [ ^ 2)-ci-L- hap-(l ^ 3)-ct-L-Rhap-(l > ]„— R 3 3 ß-Q-GlcpNAL- ... V v> en donde R es una terminal que reduce la L-ramnosa o D-GlcpNAc y n es un número de aproximadamente 3 a aproximadamente 30.

24. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13 o 17-23, caracterizada porque además comprende un adyuvante.

25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el adyuvante es alumbre.

26. Un método para reducir el riesgo de infección por Streptococcus pyogenes caracterizado porque comprende administrar a un individuo en necesidad de la misma una cantidad efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -13 o 17-25.

27. Un método para tratar la infección por Streptococcus pyogenes, caracterizado porque comprende administrar a un individuo en necesidad de la misma una cantidad efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 14- 16, o 18.

28. Un kit, caracterizado porque comprende: (a) un recipiente que comprende la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25; y (b) instrucciones para usar la composición para tratar o reducir el riesgo de infección por el Streptococcus pyogenes.

29. Un método para hacer una vacuna para reducir el riesgo de infección por el Streptococcus pyogenes, caracterizado porque comprende combinar: (a) la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- 13 o 17-25; y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.

30. Un método para hacer un terapéutico para tratar la infección por Streptococcus pyogenes, caracterizado porque comprende combinar: (a) la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 14- 16, o 18; y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.

31. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13 o 17-25, caracterizada porque es para el uso como una vacuna.

32. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 14- 16, o 18, caracterizada porque es para el uso en el tratamiento de una infección por Streptococcus pyogenes.