JP2015038156A - 組み合わせgasワクチンおよび治療法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】GAS抗原、前記抗原をコードする核酸分子、または前記抗原に特異的に結合する抗体の組み合わせを含む、S.pyogenes(GAS)感染のリスクを減少させる、S.pyogenes(GAS)感染を予防する、および/またはS.pyogenes(GAS)感染を処置するのに有用な組成物。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、子供においてS.pyogenes感染により引き起こされる咽頭炎に対して効果的な予防を提供するワクチン組成物である。
【選択図】図1
Description
本発明は、免疫学およびワクチン学の分野に関する。
A群連鎖球菌(「GAS」、S.pyogenes)はよく見られるヒト病原体であり、疾患の徴候なく、正常な個人の5〜15%間に存在すると推定されている。しかし、宿主防衛が損なわれる場合、その生物が毒力を発現することができる場合、またはその生物が脆弱な組織もしくは宿主に導入される場合、急性感染症が生じる。関連する疾患には、産褥熱、猩紅熱、丹毒、咽喉炎、膿痂疹、壊死性筋膜炎、筋炎、および連鎖球菌毒素ショック症候群が挙げられる。
本発明は、S.pyogenes感染を処置する、前記感染のリスクを軽減するおよび/または前記感染を予防するのに有用な多成分組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、子供においてS.pyogenes感染により引き起こされる咽頭炎に対して効果的な予防を提供するワクチン組成物である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
(a)(1)Spy0167;
(2)Spy0269;
(3)Spy0416;
(4)Spy0714;
(5)Spy1390;
(6)Spy2000;
(7)アミノ酸P427、W535、C530、A248、およびD482からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸変化を含む変異体Spy0167タンパク質であって、前記アミノ酸位置が配列番号107に従って番号付けされ、前記変異体Spy0167タンパク質の溶血活性が、野生型Spy0167に対して少なくとも50%低下している、変異体Spy0167タンパク質;ならびに
(8)アミノ酸D151、H279、およびS617からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸変化を含む変異体Spy0416タンパク質であって、前記アミノ酸位置が配列番号1に従って番号付けされ、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはELISAアッセイにより検出される場合、インターロイキン8(IL−8)に対する精製された変異体Spy0416抗原のタンパク質分解活性が、野生型Spy0416に対して少なくとも50%低下している、変異体Spy0416タンパク質
からなる群より選択される3つまたはそれを超える異なるS.pyogenes(GAS)タンパク質抗原の組み合わせ、
(b)(1)〜(8)をコードする1つまたは複数の核酸分子、または
(c)各抗体が、(1)〜(8)からなる群より選択されるGASタンパク質抗原に選択的に結合し、各GASタンパク質抗原が異なっている、3つまたはそれを超える異なる抗体
を含む、組成物。
(項目2)
前記3つのGASタンパク質抗原が、
Spy0167、Spy0269、およびSpy0416;
Spy0167変異体P427L/W535F、Spy0269、およびSpy0416;
Spy0167、Spy0269、およびSpy0416変異体D151A/S617A;または
Spy0167変異体P427L/W535F、Spy0269、およびSpy0416変異体D151A/S617A
である、項目1に記載の組成物。
(項目3)
組成物であって、
(a)2つだけのGASタンパク質抗原であって、前記組成物は
(1)Spy0167ならびに、Spy0269;Spy0416;アミノ酸P427、W535、C530、A248、およびD482からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸変化を含む変異体Spy0167タンパク質であって、前記アミノ酸位置が配列番号107に従って番号付けされ、前記変異体Spy0167タンパク質の溶血活性が、野生型Spy0167に対して少なくとも50%低下している、変異体Spy0167タンパク質;アミノ酸D151、H279、およびS617からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸変化を含む変異体Spy0416タンパク質であって、前記アミノ酸位置が配列番号1に従って番号付けされ、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、またはELISAアッセイにより検出される場合、インターロイキン8(IL−8)に対する精製された変異体Spy0416抗原のタンパク質分解活性が、野生型Spy0416に対して、少なくとも50%低下している、変異体Spy0416タンパク質;Spy0714;Spy1390;およびSpy2000からなる群より選択される第2のGAS抗原;
(2)Spy0269ならびに、Spy0167;前記変異体Spy0167タンパク質;前記変異体Spy0416タンパク質;Spy0714;Spy1390;およびSpy2000からなる群より選択される第2のGAS抗原;
(3)Spy0416ならびに、Spy0167;前記変異体Spy0167タンパク質;前記変異体Spy0416タンパク質;Spy0714;Spy1390;およびSpy2000からなる群より選択される第2のGAS抗原;
(4)前記変異体Spy0167タンパク質ならびに、Spy0167;Spy0269;Spy0416;前記変異体Spy0416タンパク質;Spy0714;Spy1390;およびSpy2000からなる群より選択される第2のGAS抗原;
(5)前記変異体Spy0416タンパク質ならびに、Spy0167;Spy0269;Spy0416;前記変異体Spy0167タンパク質;Spy0714;Spy1390;およびSpy2000からなる群より選択される第2のGAS抗原;
(6)Spy0714ならびに、Spy0167;Spy0269;Spy0416;前記変異体Spy0167タンパク質;前記変異体Spy0416タンパク質;Spy1390;およびSpy2000からなる群より選択される第2のGAS抗原;
(7)Spy1390ならびに、Spy0167;Spy0269;Spy0416;前記変異体Spy0167タンパク質;前記変異体Spy0416タンパク質;Spy0714;およびSpy2000からなる群より選択される第2のGAS抗原;ならびに
(8)Spy2000ならびに、Spy0167;Spy0269;Spy0416;前記変異体Spy0167タンパク質;前記変異体Spy0416タンパク質;Spy0714;およびSpy1390からなる群より選択される第2のGAS抗原
を含む、2つだけのGASタンパク質抗原;
(b)前記2つのGASタンパク質抗原をコードする1つまたは複数の核酸分子;ならびに
(c)各抗体が、前記2つのGASタンパク質抗原のうちの1つに選択的に結合する、2つまたはそれを超える異なる抗体
を含む、組成物。
(項目4)
前記2つのGASタンパク質抗原が、
Spy0167およびSpy0269;
Spy0167およびSpy0416;
Spy0167変異体P427L/W535FおよびSpy0269;
Spy0167変異体P427L/W535FおよびSpy0416;
Spy0269およびSpy0416変異体D151A/S617A;
Spy0167およびSpy0416変異体D151A/S617A;または
Spy0167変異体P427L/W535FおよびSpy0416変異体D151A/S617A
である、項目3に記載の組成物。
(項目5)
前記変異体Spy0416抗原を含む、項目1から4のいずれかに記載の組成物。
(項目6)
前記変異体Spy0416抗原が、D151AおよびS617Aからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、項目5に記載の組成物。
(項目7)
前記変異体Spy0416抗原が、配列番号147、配列番号148、配列番号149、または配列番号198を含む、項目5に記載の組成物。
(項目8)
前記Spy0269抗原が配列番号177を含む、項目7に記載の組成物。
(項目9)
前記変異体Spy0416抗原が、第2のGAS抗原を含む融合タンパク質である、項目5に記載の組成物。
(項目10)
前記変異体Spy0167抗原を含む、項目1から4のいずれかに記載の組成物。
(項目11)
前記変異体Spy0167抗原が、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、および配列番号127からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目10に記載の組成物。
(項目12)
前記GAS抗原のうちの少なくとも1つが担体タンパク質にカップリングされている、項目1から11のいずれかに記載の組成物。
(項目13)
前記担体タンパク質が、細菌毒素、細菌トキソイド、N.meningitidis外膜タンパク質、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、H.influenzaeタンパク質D、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、C.difficile毒素A、C.difficile毒素B、および鉄取り込みタンパク質からなる群より選択される、項目12に記載の組成物。
(項目14)
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、F(ab’)2フラグメント、F(ab)フラグメント、Fv分子、非共有結合性ヘテロ二量体単鎖Fv分子(sFv)、二量体抗体フラグメント構築物、三量体抗体フラグメント構築物、ミニボディ、またはその混合物である前記3つまたはそれを超える異なる抗体を含む、項目1または項目3に記載の組成物。
(項目15)
前記抗体の1つが野生型Spy0416に特異的に結合し、ヒトIL−8を切断する前記野生型Spy0416の能力を阻害する、項目14に記載の組成物。
(項目16)
前記抗体が、CXCL1/GROα、CXCL2/GROβ、CXCL3/GROγ、CXCL4、CXCL12/SDF−1α、CXCL12/SDF−1β、CXCL12/SDF−1γ、CXCL5/ENA78、CXCL6/GCP−2、CXCL7/NAP−2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP10、CXCL11、CXCL13、CXCL14、およびCXCL16からなる群より選択されるヒトケモカインを切断する野生型Spy0416の能力を阻害する、項目15に記載の組成物。
(項目17)
前記1つまたは複数の核酸分子を含む、項目1または項目3に記載の組成物。
(項目18)
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、項目1から17のいずれかに記載の組成物。
(項目19)
小児用ワクチンで有用である活性剤をさらに含む、項目1から13、17、または18のいずれかに記載の組成物。
(項目20)
前記活性剤が、
(a)N.meningitidis、S.pneumoniae、Bordetella pertussis、Moraxella catarrhalis、Clostridium tetani、Chorinebacterim diphteriae、呼吸器合胞体ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、およびロタウイルスのポリペプチド抗原からなる群より選択されるポリペプチド抗原、ならびに
(b)前記ポリペプチド抗原をコードする核酸分子
からなる群より選択される、項目19に記載の組成物。
(項目21)
高齢者または免疫無防備状態の個体のためのワクチンで有用な第2の活性剤をさらに含む、項目1から13、17、または18のいずれかに記載の組成物。
(項目22)
前記第2の活性剤が、
(a)Enterococcus faecalis、Staphylococcus aureaus、Staphylococcus epidermis、Pseudomonas aeruginosa、Legionella pneumophila、Listeria monocytogenes、インフルエンザウイルス、およびパラインフルエンザウイルスのポリペプチド抗原からなる群より選択されるポリペプチド抗原;ならびに
(b)前記ポリペプチド抗原をコードする核酸分子
からなる群より選択される、項目21に記載の組成物。
(項目23)
式:
のA群多糖であって、式中、Rは末端還元L−ラムノースまたはD−GlcpNAcであり、nは約3から約30までの数である、A群多糖をさらに含む、項目1から13または76から22のいずれかに記載の組成物。
(項目24)
アジュバントをさらに含む項目1から13または17から23のいずれかに記載の組成物。
(項目25)
前記アジュバントがミョウバンである、項目24に記載の組成物。
(項目26)
項目1から13または17から25のいずれかに記載の組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを含む、Streptococcus pyogenesによる感染のリスクを減少させる、方法。
(項目27)
項目1、4、14から16、または18のいずれかに記載の組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを含む、Streptococcus pyogenesによる感染を処置する、方法。
(項目28)
(a)項目1から25のいずれかに記載の組成物を含む容器;および
(b)Streptococcus pyogenesによる感染を処置するかまたは感染のリスクを減少させる組成物を使用するための説明書
を含む、キット。
(項目29)
(a)項目1から13または17から25のいずれかに記載の組成物;および
(b)薬学的に許容可能な担体
を組み合わせることを含む、Streptococcus pyogenesによる感染のリスクを減少させるためのワクチンを作製する、方法。
(項目30)
(a)項目1から4、14から16、または18のいずれかに記載の組成物;および(b)薬学的に許容可能な担体
を組み合わせることを含む、Streptococcus pyogenes感染を処置するための治療薬を作製する、方法。
(項目31)
ワクチンとして使用するための項目1から13または17から25のいずれかに記載の組成物。
(項目32)
Streptococcus pyogenes感染の処置に使用するための項目1から4、14から16、または18のいずれかに記載の組成物。
・1つまたは複数のS.pyogenes株(例えば、M1 3348、M12EM5、M23 2071、M6 S43)に対する統計的に有意な防御を与える;
・インビトロの細菌死滅(オプソニン作用性(opsonophagocytic)死滅)を媒介する抗体を誘発する;
・ストレプトリジンO溶血活性を不活化する抗体を誘発する;
・Spy0416プロテアーゼ活性を遮断する抗体を誘発する;ならびに/または
・細胞接着および/もしくは細胞分裂を妨げる抗体を誘発する;
のうちの1つまたは複数を有する。
i.Spy0167およびSpy0269;
ii.Spy0167、Spy0269、およびSpy0416;
iii.Spy0167およびSpy0416;
iv.Spy0167変異体P427L/W535FおよびSpy0269;
v.Spy0167変異体P427L/W535F、Spy0269、およびSpy0416;
vi.Spy0167変異体P427L/W535FおよびSpy0416;
vii.Spy0269およびSpy0416変異体D151A/S617A;
viii.Spy0167、Spy0269、およびSpy0416変異体D151A/S617A;
ix.Spy0167およびSpy0416変異体D151A/S617A;
x.Spy0167変異体P427L/W535F、Spy0269、およびSpy0416変異体D151A/S617A;および
xi.Spy0167変異体P427L/W535FおよびSpy0416変異体D151A/S617A
が挙げられ、そのそれぞれが、下に記載されるGAS多糖抗原および/またはミョウバンなどのアジュバントも含み得る。
Spy0167(ストレプトリジン、SLO、GAS25)は、宿主細胞溶解を誘導する強力なポア形成毒素であり、なかでもWO02/34771に記載されている。野生型Spy0167のアミノ酸配列は配列番号107〜119に示されている。異なって定義されない限り、「Spy0167抗原」は、下に記載されるように完全長Spy0167ならびにSpy0167変異体、フラグメントおよび融合体を含む。
上で開示されるように、本発明で使用されるSpy0167抗原は、個々の別々のポリペプチド(例えば、「ペプチド1」、「ペプチド2」、「ペプチド3」、「ペプチド1+2+3」、「ペプチド2+3」)として組成物中に存在してよいが、少なくとも2つ(すなわち、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20)の抗原が単一のポリペプチド鎖(「融合タンパク質」または「ハイブリッドポリペプチド」)として発現される実施形態もある。ハイブリッドポリペプチドは2つの主要な利点を提供する。第1に、それだけでは不安定かまたは発現が不十分であり得るポリペプチドを、この問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを加えることにより支援することができる。第2に、両方とも抗原的に有用である2つのポリペプチドを作製するために1つの発現および精製のみを用いればよいので、商業的生産は簡素化される。
変異体形態のSpy0167は、溶血アッセイにより決定される場合、野生型Spy0167と比べて、野生型Spy0167より溶血活性が少なくとも50%(例えば、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100%)低い(例えば、実施例1参照)が、免疫原性であり、好ましくはマウスモデルにおいてGASの致死的チャレンジに対する防御を提供する(実施例4、7、8参照)。Spy0167変異体は、配列番号107に示される野生型Spy0167配列に従って番号付けされたアミノ酸P427、W535、C530、A248、およびD482のうちの1つまたは複数にアミノ酸変化(すなわち、置換、欠失、または挿入)を有する変異体を含む。かかる変異体の例にはP427L(配列番号120)、W535F(配列番号121)、C530G(配列番号122)、ΔA248(配列番号123)、W535F/D482N(配列番号124)、P427L/W535F(配列番号125)、P427L/C530G(配列番号126)、およびP427L/C530G/W535F(配列番号127)が挙げられる。
GAS40は、「Spy0269」(M1)、「SpyM3_0197」(M3)、「SpyM18_0256」(M18)および「prgA」としても知られるが、例えば、WO02/34771におよびWO2005/032582に記載されている。野生型Spy0269のアミノ酸配列は、配列番号50〜106および128〜130に提供されている。Spy0269抗原は、Spy0269タンパク質が多くのM型でもこれらのM型の複数の株でも高度に保存されているために本発明の組成物において特に有用である(WO2006/042027参照)。Spy0269は、全身免疫化およびチャレンジおよび殺菌抗体の誘導の動物モデルにおいて一貫して防御を与える。
Spy0416(M1)は、「GAS57」、「SpyM3_0298」(M3)、「SpyM18_0464」(M18)、および「prtS」とも呼ばれる。Spy0416は推定上の細胞エンベローププロテイナーゼとして同定された。WO02/34771およびUS2006/0258849を参照のこと。17の異なるM型(1、2、3、4、6、11、12、18、22、23、28、44/61、68、75、77、89、94)由来の49のSpy0416配列があり、疾病管理センター(Centers for Disease Control)によれば、17の異なるM型が米国での咽頭炎症例の95%超を占め、侵襲性GAS単離物の約68%を占める。様々なM型由来の野生型Spy0416抗原のアミノ酸配列は、配列番号1〜49として配列表に記載されている。本発明の組成物は、Spy0416の等価物(これは、単一のポリペプチドであり、免疫原性であり、好ましくはマウスモデルにおいてGASの致死的チャレンジに対する防御を与える)も含むことができる。
1つまたは複数の他のGAS抗原は、本発明の組成物に含めることができる。GAS抗原は、例えば、WO02/34771に開示されている。有用なGAS抗原は、
上に記載される野生型または変異体GASタンパク質のフラグメントの長さは、特定のGAS抗原またはその変異体のアミノ酸配列に応じて変わり得るが、前記フラグメントは、好ましくは少なくとも7個の連続アミノ酸、例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200個またはそれを超える連続アミノ酸であり、完全長野生型または変異体GASタンパク質よりアミノ酸1個が少ないものまでである。好ましくは、前記フラグメントは免疫原性であり、前記配列由来の1つまたは複数のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントには、(1)各同定されたGASタンパク質のN末端シグナルペプチド、(2)そのN末端シグナルペプチドがない同定されたGASタンパク質、および(3)最大10個のアミノ酸残基(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個またはそれを超える)がN末端および/またはC末端から欠失している(例えば、N末端アミノ酸残基が欠失し得る)各同定されたGASタンパク質が挙げられる。他のフラグメントは、前記タンパク質の1つまたは複数のドメインを脱落させている(例えば、シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの脱落)。いくつかの実施形態では、前記フラグメントは、Spy0269のアミノ酸33〜324である。
GAS多糖(PS)は、すべてのGAS菌株に存在する細胞壁多糖である。PSに対する抗体力価は、子供において疾患およびコロニー形成に逆相関する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物はGAS多糖抗原を含む。S.pyogenesGAS炭水化物は、典型的には、交互のアルファ(1→2)およびアルファ(1→3)結合からなるL−ラムノピラノース(Rhap)骨格ならびに一つおきのラムノース環にベータ(1→3)結合しているD−N−アセチルグルコサミン(GlcpNAc)残基を有する分岐構造を特色とする(Kreisら、Int. J. Biol. Macromol. 17巻、117〜30頁、1995年)。本発明の組成物に有用なGAS多糖抗原は、式:
組換え産生
遺伝暗号の重複性は周知である。したがって、本明細書に記載されるGAS抗原のうちの1つをコードする任意の核酸分子(ポリヌクレオチド)を用いて、そのタンパク質を組換えで産生することができる。野生型GAS抗原をコードする核酸分子はまた、標準核酸精製技術を用いて適当なS.pyogenes細菌から単離することができ、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの増幅技術を用いて、もしくは自動合成機を用いることによって、合成することができる。Caruthersら、Nucl. Acids Res. Symp. Ser.215巻、223頁、1980年;Hornら、Nucl. Acids Res. Symp. Ser.225巻、232頁、1980年;Hunkapillerら、Naure 310巻、105〜11頁、1984年;Granthamら、Nucleic Acids Res.9巻、r43〜r74頁、1981年参照。
本発明で使用するためのGAS抗原をコードする核酸分子を、挿入するコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む発現ベクターに挿入することができる。当業者に周知の方法を使用して、コード配列ならびに適切な転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。
GAS抗原を産生するための宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。大腸菌は好ましい宿主細胞であるが、他の適切な宿主には、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・クレモリス、枯草菌、コレラ菌、チフス菌、ネズミチフス菌、ナイセリア・ラクタミカ、ナイセリア・シネレア、マイコバクテリア属(例えば、結核菌)、酵母、バキュロウイルス、哺乳動物細胞などが含まれる。
シグナル輸出(export)配列は、組換え産生されるGAS抗原に含められ得、その結果、抗原は、公知の方法を使用して細胞培養培地から精製され得る。あるいは、組換え産生されるGAS抗原を、操作した宿主細胞から単離することができ、当該分野で周知の方法を使用して、細胞中の他の成分(タンパク質、炭水化物、または脂質など)から分離し得る。かかる方法には、サイズ排除クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、および分取ゲル電気泳動が含まれるが、これらに限定されない。精製GAS抗原の調製物の純度は少なくとも80%であり、好ましくは、調製物の純度は、90%、95%、または99%である。調製物の純度を、当該分野で公知の任意の手段(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはRP−HPLC分析など)によって評価することができる。適切な場合には、変異体Spy0167タンパク質を、例えば、尿素を使用して可溶化することができる。
GAS抗原を、例えば、固相技術を使用して合成することができる。例えば、Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85,2149 54,1963;Robergeら、Science 269,202 04,1995を参照のこと。手動技術の使用または自動化によりタンパク質合成を行うことができる。例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)を使用して、自動化された合成を行うことができる。任意選択的に、GAS抗原のフラグメントを個別に合成し、化学的方法を使用して合わせて全長分子を産生することができる。
本発明のいくつかの組成物は、本明細書に記載されるGAS抗原に特異的に結合する抗体の組み合わせを含む。抗体は、免疫化学的アッセイにおいて使用したときに、別のタンパク質による検出シグナルの少なくとも5倍、10倍または20倍の高い検出シグナルを与える場合、GAS抗原に「特異的に結合する」。好ましくは、GAS抗原に特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、溶液からGAS抗原を免疫沈降することができる。
GAS抗原を使用して哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトなど)を免疫化して、ポリクローナル抗体を産生することができる。必要に応じて、抗原を、担体タンパク質(ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、およびキーホールリンペットヘモシアニンなど)に接合することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを使用して、免疫学的応答を増大させることができる。かかるアジュバントには、フロイントアジュバント、ミネラルゲル(例えば、水酸化アルミニウム)、および界面活性物質(例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール)が含まれるが、これらに限定されない。ヒトで使用されるアジュバントのうち、BCG(カルメット・ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・パルバムが特に有用である。
2030,1983;Coleら、Mol.Cell Biol.62,109 120,1984)。
本発明はまた、薬物として(例えば、免疫原性組成物またはワクチンとして)用いる組成物を提供する。本発明の組成物は、S.pyogenes感染を予防するか、S.pyogenes感染のリスクを低減するか、および/またはS.pyogenes感染の結果として引き起こされる疾患(例えば、菌血症、髄膜炎、産褥熱、猩紅熱、丹毒、咽頭炎、膿痂疹、壊死性筋膜炎、筋炎、または毒素性ショック症候群)を処置するのに有用である。
本発明の組成物を、本発明の治療方法、または予防方法で使用するための1つまたは複数の追加の抗原と組み合わせて投与することができる。適切な抗原には、以下に列挙した抗原が含まれる。さらに、本発明の組成物を使用して、任意の以下に列挙の病原体に起因する感染を処置するか、そのリスクを低減するかまたは防止することができる。下記の抗原との組み合わせに加えて、本発明の組成物を、本明細書中に記載のアジュバントと組み合わせることもできる。
本発明での使用に適切な細菌抗原には、細菌から単離、精製、または由来することができるタンパク質、多糖類、リポ多糖類、外膜小胞が含まれる。さらに、細菌抗原には、細菌溶解物および不活化細菌処方物が含まれ得る。細菌抗原を、組換え発現によって産生することができる。細菌抗原には、好ましくは、その生活環の少なくとも1段階に細菌表面に曝露されるエピトープが含まれる。細菌抗原は、好ましくは、複数の血清型で保存される。細菌抗原には、下記の1つまたは複数の細菌由来の抗原および以下で同定した特定の抗原例が含まれる。
Techniques,1996およびCRC,Chemistry of Protein Conjugation and Cross−Linking,1993に記載のスクシンアミドまたは他の結合などを介して接合することができる。
本発明での使用に適切なウイルス抗原には、不活化(または死滅)ウイルス、弱毒化ウイルス、スプリットウイルス処方物、精製サブユニット処方物、ウイルスから単離、精製、または由来することができるウイルスタンパク質、ウイルス様粒子(VLP)が含まれる。ウイルス抗原は、細胞培養物または他の基質上に増殖したウイルスに由来し得る。あるいは、ウイルス抗原を、組換え的に発現することができる。ウイルス抗原には、好ましくは、その生活環の少なくとも1段階に細菌表面に曝露されるエピトープが含まれる。細菌抗原は、好ましくは、複数の血清型または単離物で保存される。細菌抗原には、下記の1つまたは複数の細菌由来の抗原および以下で同定した特定の抗原例が含まれる。
本発明で用いる真菌抗原は、1つまたは複数の下記の真菌に由来し得る。
本発明の組成物は、1つまたは複数の性感染症(STD)由来の抗原を含むことができる。かかる抗原は、STD(クラミジア、陰部ヘルペス、肝炎(HCVなど)、陰部疣贅、淋病、梅毒、および/または軟性下疳など)を予防または治療することができる(WO00/15255号を参照のこと)。抗原は、1つまたは複数のウイルスまたは細菌のSTDに由来し得る。本発明で用いるウイルスSTD抗原は、例えば、HIV、単純ヘルペスウイルス(HSV−1およびHSV−2)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、および肝炎(HCV)に由来し得る。本発明で用いる細菌STD抗原は、例えば、淋菌、トラコーマクラミジア、梅毒トレポネーマ、軟性下疳菌、大腸菌、およびストレプトコッカス・アガラクチアに由来し得る。これらの病原体由来の特異的抗原の例は、上に記載している。
本発明の組成物は、呼吸器疾患を引き起こす病原体由来の1つまたは複数の抗原を含むことができる。例えば、呼吸器抗原は、呼吸器ウイルス(オルソミクソウイルス(インフルエンザ)、ニューモウイルス(RSV)、パラミクソウイルス(PIV)、モルビリウイルス(麻疹)、トガウイルス(風疹)、VZV、およびコロナウイルス(SARS)など)に由来し得る。呼吸器抗原は、呼吸器疾患を引き起こす細菌(肺炎連鎖球菌、緑膿菌、百日咳菌、結核菌、肺炎マイコプラズマ、クラミジア・ニューモニエ、炭疽菌、およびカタル球菌など)に由来し得る。これらの病原体由来の特異的抗原の例は、上に記載している。
本発明の組成物は、小児被験体での使用に適切な1つまたは複数の抗原を含むことができる。小児被験体は、典型的には、約3歳未満、約2歳未満、または約1歳未満である。小児抗原を、6ヶ月、1年、2年、または3年にわたって複数回投与することができる。小児抗原は、小児集団を標的にすることができるウイルスおよび/または小児集団が感染に感受性を示すウイルスに由来し得る。小児ウイルス抗原には、1つまたは複数のオルソミクソウイルス(インフルエンザ)、ニューモウイルス(RSV)、パラミクソウイルス(PIVおよびムンプス)、モルビリウイルス(麻疹)、トガウイルス(風疹)、エンテロウイルス(ポリオ)、HBV、コロナウイルス(SARS)、および水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)由来の抗原が含まれる。小児細菌抗原には、1つまたは複数の肺炎連鎖球菌、ナイセリア・メニンギティディス、化膿連鎖球菌(A群連鎖球菌)、カタル球菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌、破傷風菌(破傷風)、ジフテリア菌(ジフテリア)、インフルエンザ菌B(Hib)、緑膿菌、ストレプトコッカス・アガラクチア(B群連鎖球菌)、および大腸菌由来の抗原が含まれる。これらの病原体由来の特異的抗原の例は、上に記載している。
本発明の組成物は、高齢者または免疫無防備状態の個体での使用に適切な1つまたは複数の抗原を含むことができる。かかる個体に、より頻繁に、標的化抗原に対するその免疫応答を改良するためにより高い用量またはアジュバント化(adjuvanted)処方物でワクチン接種することが必要であり得る。高齢者または免疫無防備状態の個体での使用のために標的化することができる抗原には、1つまたは複数の以下の病原体由来の抗原が含まれる:ナイセリア・メニンギティディス、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌(A群連鎖球菌)、カタル球菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、破傷風菌(破傷風)、ジフテリア菌(ジフテリア)、インフルエンザ菌B(Hib)、緑膿菌、レジオネラ・ニューモフィラ、ストレプトコッカス・アガラクチア(B群連鎖球菌)、フェカリス菌、ピロリ菌、肺炎クラミジア(Clamydia pneumoniae)、オルソミクソウイルス(インフルエンザ)、ニューモウイルス(RSV)、パラミクソウイルス(PIVおよびムンプス)、モルビリウイルス(麻疹)、トガウイルス(風疹)、エンテロウイルス(ポリオ)、HBV、コロナウイルス(SARS)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)。これらの病原体由来の特異的抗原の例は、上に記載している。
本発明の組成物は、青年期被験体での使用に適切な1つまたは複数の抗原を含むことができる。青年期は、以前に投与した小児ワクチンの追加免疫が必要であり得る。青年期での使用に適切であり得る小児抗原は、上に記載されている。さらに、性行為の開始前に防御免疫または治療的免疫を確実にするために、STD病原体由来の抗原を投与するために青年期を標的化することができる。青年期での使用に適切であり得るSTD抗原は、上に記載されている。
本発明の他の態様では、吸着抗原を有する微粒子の生成方法を提供する。本方法は、(a)(i)水、(ii)界面活性剤、(iii)有機溶媒、および(iv)ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルソエステル、ポリ酸無水物、およびポリシアノアクリラートからなる群より選択される生分解性ポリマーを含む混合物の分散によって乳濁液を準備する工程を含む。ポリマーは、典型的には、有機溶媒と比較して約1%〜約3%の濃度の混合物で存在する一方で、界面活性剤は、典型的には、約0.00001:1〜約0.1:1(より典型的には、約0.0001:1〜約0.1:1、約0.001:1〜約0.1:1、または約0.005:1〜約0.1:1)の水:水、界面活性剤:ポリマー比で混合物中に存在する、準備する工程、(b)乳濁液から有機溶媒を除去する工程、および(c)微粒子表面上に抗原を吸着させる工程を含む。一定の実施形態では、生分解性ポリマーは、有機溶媒と比較して約3%〜約10%の濃度で存在する。
以下の参考文献は、本発明の組成物と併せて有用な抗原を含む。
本発明の組成物は、典型的には、上記成分に加えて、1つまたは複数の「薬学的に許容可能な担体」を含むであろう。これらには、担体自体が組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体が含まれる。適切な担体は、典型的には、巨大でゆっくり代謝される高分子(タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体(油滴またはリポソームなど)など)である。かかる担体は、当業者に周知である。組成物はまた、希釈剤(水、生理食塩水、グリセロールなど)を含むことができる。さらに、補助剤(湿潤剤または乳化剤およびpH緩衝物質など)が存在し得る。薬学的に許容可能な成分の徹底的な考察は、Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice
of Pharmacy.20th ed.,ISBN:0683306472で得られる。
アジュバント
本発明のワクチンを、他の免疫調節薬と併せて投与することができる。特に、組成物は、通常、アジュバントを含むであろう。本発明と共に使用するためのアジュバントには、1つまたは複数の下記のアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なミネラル含有組成物は、ミネラル塩(アルミニウム塩およびカルシウム塩など)を含む。本発明は、水酸化物(例えば、オキシヒドロキシド)、リン酸塩(例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート)、硫酸塩などのミネラル塩(例えば、chapters8 & 9 of Vaccine Design…(1995)eds.Powell & Newman.ISBN:030644867X.Plenum.Press)または異なるミネラル化合物の混合物(例えば、リン酸塩アジュバントと水酸化物アジュバントとの混合物(任意選択的にリン酸塩が過剰))を含み、この化合物は任意の適切な形態(例えば、ゲル、血漿、無定形など)をとり、塩に吸着していることが好ましい。ミネラル含有組成物を、金属塩の粒子として処方することもできる(WO00/23105号)。
本発明でのアジュバントとしての使用に適切な油性乳濁液組成物には、スクアレン−水乳濁液(MF59(ミクロフルイダイザー(microfluidizer)を使用して、5%スクアレン、0.5%TWEEN(商標)80、および0.5%Span85をサブミクロン粒子に処方したもの)など)が含まれる。WO90/14837号を参照のこと。Podda,Vaccine(2001)19:2673−2680;Freyら、Vaccine(2003)21:4234−4237も参照のこと。MF59を、FLUAD(商標)インフルエンザウイルス3価サブユニットワクチンにおけるアジュバントとして使用する。
サポニン処方物を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。サポニンは、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群であり、広範な植物種の樹皮、葉、幹、根、さらに花弁中で見出される。キラヤサポナリア モリナ(Quillalaia saponaria Molina)の木の樹皮から単離したサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。スミラックス・オルナタ(Smilax ornata)(サルサパリラ(sarsaprilla))、シュッコンカスミソウ(Gypsophilla paniculata)(ブライドベール(brides veil))、およびサボンソウ(ソープルート(soap root))由来のサポニンを購入することもできる。サポニンアジュバント処方物には、精製処方物(QS21など)および脂質処方物(ISCOMなど)が含まれる。
ビロソームおよびウイルス様粒子(VLP)を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。これらの構造物は、一般に、任意選択的にリン脂質と組み合わせた、またはこれを用いて処方したウイルス由来の1つまたは複数のタンパク質を含む。これらは、一般に、非病原性で複製せず、一般に、任意の未変性のウイルスゲノムを含まない。ウイルスタンパク質を、組換え的に産生し、または全ウイルスから単離することができる。ビロソームまたはVLPでの使用に適切なこれらのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス(HAまたはNA)、B型肝炎ウイルス(コアタンパク質またはキャプシドタンパク質)、E型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビス・ウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、HIV、RNA−ファージ、Qβ−ファージ(コートタンパク質など)、GA−ファージ、fr−ファージ、AP205ファージ、およびTy(レトロトランスポゾンTyタンパク質p1など)由来のタンパク質が含まれる。VLPは、WO03/024480号、WO03/024481号、Niikuraら、Virology(2002)293:273−280;Lenzら、Journal of Immunology(2001)5246−5355;Pinto,ら、Journal of Infectious Diseases(2003)188:327−338;およびGerberら、Journal of Virology(2001)75(10):4752−4760でさらに考察されている。ビロソームは、例えば、Gluckら、Vaccine(2002)20:B10−B16でさらに考察されている。免疫増強する再構築されたインフルエンザビロソーム(IRIV)を、鼻腔内3価INFLEXAL(商標)製品(Mischler & Metcalfe(2002)Vaccine 20 Suppl 5:B17−23)およびINFLUVAC PLUS(商標)製品におけるサブユニット抗原送達系として使用する。
本発明での使用に適切なアジュバントには、以下などの細菌または微生物誘導体が含まれる。
かかる誘導体には、モノホスホリル脂質A(MPL)および3−O−脱アシル化MPL(3dMPL)が含まれる。3dMPLは、3−O−脱アシル化モノホスホリル脂質Aと4、5、または6アシル化鎖との混合物である。3−O−脱アシル化モノホスホリル脂質Aの好ましい「小粒子」形態は、EP0689454号に開示されている。かかる3dMPLの「小粒子」は、0.22ミクロン膜で濾過滅菌するのに十分に小さい(EP0689454号)。他の非毒性LPS誘導体には、モノホスホリル脂質A模倣物(アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体(例えば、RC529)など)が含まれる。Johnsonら(1999)Bioorg Med Chem Lett 9:2273−2278を参照のこと。
脂質A誘導体には、大腸菌(OM−174)由来の脂質A誘導体が含まれる。OM−174は、例えば、Meraldiら、Vaccine(2003)21:2485−2491およびPajak,ら、Vaccine(2003)21:836−842に記載されている。
本発明でのアジュバントとしての使用に適切な免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、CpGモチーフ(非メチル化シトシンの後にグアノシンを含み、リン酸結合によって結合した配列)を含むヌクレオチド配列が含まれる。回分配列またはポリ(dG)配列を含む細菌二本鎖RNAまたはオリゴヌクレオチドも免疫刺激性を示すことが示されている。
Immunology(2002)23(2):64−65およびWO01/95935号で考察されている。好ましくは、CpGはCpG−A ODNである。
細菌ADP−リボシル化毒素およびその解毒誘導体を、本発明でアジュバントとして使用することができる。好ましくは、タンパク質は、大腸菌(すなわち、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン(「LT」)、コレラ菌(「CT」)、または百日咳菌(「PT」)に由来する。粘膜アジュバントとしての解毒ADP−リボシル化毒素の使用は、WO95/17211号に記載されており、非経口アジュバントとしてはWO98/42375号に記載されている。好ましくは、アジュバントは、解毒LT変異体(LT−K63、LT−R72、およびLTR192Gなど)である。ADP−リボシル化毒素およびその解毒誘導体(特に、LT−K63およびLT−R72)のアジュバントとしての使用を、以下の参考文献で見出すことができる:Beignon,ら、Infection and Immunity(2002)70(6):3012−3019;Pizza,ら、Vaccine(2001)19:2534−2541;Pizza,ら、Int.J.Med.Microbiol(2000)290(4−5):455−461;Scharton−Kerstenら、Infection and Immunity(2000)68(9):5306−5313;Ryanら、Infection and Immunity(1999)67(12):6270−6280;Partidosら、Immunol.Lett.(1999)67(3):209−216;Peppoloniら、Vaccines(2003)2(2):285−293;およびPineら、(2002)J.Control Release(2002)85(1−3):263−270。アミノ酸置換についての数値の基準は、好ましくは、Domenighiniら、Mol.Microbiol(1995)15(6):1165−1167に記載のADP−リボシル化毒素のAおよびBサブユニットのアラインメントに基づく。
生体接着剤および粘膜接着剤を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。適切な生体接着剤には、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフィア(Singhら(2001)J.Cont.Rele.70:267−276)または粘膜接着剤(ポリアクリル酸の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類、およびカルボキシメチルセルロースなど)が含まれる。キトサンおよびその誘導体を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。WO99/27960を参照のこと。
微粒子を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。微粒子(すなわち、直径約100nm〜約150μm、より好ましくは直径約200nm〜約30μm、最も好ましくは直径約500nm〜約10μmの粒子)を、生分解性且つ非毒性の材料(例えば、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど)(ポリ(ラクチドコグリコリド)が好ましい)から形成し、任意選択的に、負電荷の表面(例えば、SDS)または正電荷の表面(例えば、CTABなどの陽イオン性界面活性剤)を有するように処理する。
アジュバントとしての使用に適切なリポソーム処方物の例は、米国特許第6,090,406号、米国特許第5,916,588号、および欧州特許第0626169号に記載されている。
本発明での使用に適切なアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが含まれる。WO99/52549号。かかる処方物には、さらに、オクトキシノール(WO01/21207)と組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤および少なくとも1つのさらなる非イオン性界面活性剤(オクトキシノールなど)と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤(WO01/21152号)が含まれる。
PCPP処方物は、例えば、Andrianovら、“Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions”,Biomaterials(1998)19(1−3):109−115 and Payneら、“Protein Release from Polyphosphazene Matrices”,Adv.Drug.Delivery Review(1998)31(3):185−196に記載されている。
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なムラミルペプチドの例には、N−アセチル−ムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−l−アラニル−d−イソグルタミン(nor−MDP)、およびNアセチルムラミル−l−アラニル−d−イソグルタミニル−l−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミンMTP−PE)が含まれる。
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なイミダゾキノリン化合物の例には、イミキモドおよびそのアナログが含まれ、Stanley,Clin Exp Dermatol(2002)27(7):571−577;Jones,Curr Opin Investig Drugs(2003)4(2):214−218;米国特許第4,689,338号、同第5,389,640号、同第5,268,376号、同第4,929,624号、同第5,266,575号、同第5,352,784号、同第5,494,916号、同第5,482,936号、同第5,346,905号、同第5,395,937号、同第5,238,944号、および同第5,525,612号にさらに記載されている。
チオセミカルバゾン化合物、ならびに本発明でのアジュバントとしての使用に適切な全ての化合物の処方、製造、およびスクリーニング方法の例には、WO04/60308号に記載のものが含まれる。チオセミカルバゾンは、TNF−αなどのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激で特に有効である。
トリプタントリン化合物、ならびに本発明でのアジュバントとしての使用に適切な全ての化合物の処方、製造、およびスクリーニング方法の例には、WO04/64759号に記載のものが含まれる。トリプタントリン化合物は、TNF−αなどのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激で特に有効である。
(2)サポニン(例えば、QS21)+非毒性LPS誘導体(例えば、3dMPL)(WO94/00153号を参照のこと);
(3)サポニン(例えば、QS21)+非毒性LPS誘導体(例えば、3dMPL)+コレステロール;
(4)サポニン(例えば、QS21)+3dMPL+IL12(任意選択的に、+ステロール)(WO98/57659号);
(5)3dMPLと、例えば、QS21および/または水中油型乳濁液との組み合わせ(欧州特許出願第0835318号、0735898号、および0761231号を参照のこと);
(6)10%スクアラン、0.4%Tween80、5%プロニック−ブロック重合体L121、およびthr−MDPを含み、サブミクロン乳濁液にミクロ流体化されているか、ボルテックスしてより大きな粒子サイズの乳濁液を生成したSAF。
(8)1つまたは複数のミネラル塩(アルミニウム塩など)+LPSの非毒性誘導体(3dPMLなど)。
本発明でアジュバントとしての使用に適切なヒト免疫調節薬には、サイトカイン(インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12など)、インターフェロン(例えば、インターフェロン−γ)、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子など)が含まれる。
本発明は、上記組成物を使用して化膿連鎖球菌に対する免疫応答を誘導または増大させる方法を提供する。免疫応答は、好ましくは防御的であり、抗体および/または細胞−媒介性免疫(全身免疫および粘膜免疫が含まれる)が含まれ得る。免疫応答には、ブースター応答が含まれる。
治療上の処置の有効性を評価する1つの方法は、本発明の組成物の投与後にGAS感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の有効性を評価する1つの方法は、組成物の投与後に本発明の組成物におけるGAS抗原に対する免疫応答をモニタリングすることを含む。
本発明はまた、本発明の1つまたは複数の容器を含むキットを提供する。組成物は、個別の抗原と同様に、液体形態であり得るか凍結乾燥させることができる。組成物に適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器を、種々の材料(ガラスまたはプラスチックが含まれる)から形成することができる。容器は、滅菌アクセスポートを有することができる(例えば、容器は、静脈内注射用溶液のバッグまたは皮下注射針によって突き刺すことができるストッパを有するバイアルであり得る)。
溶血アッセイ
Spy0167またはSpy0167変異体の段階希釈物を、PBS+0.5%BSAを用いて、U字形底の96ウェルプレートに調製する。1mlのヒツジ血液を、PBS中で3回洗浄し(3000×gの遠心分離で)、血球を5mlのPBSに懸濁する。等容積の懸濁物を、50μlの各毒素希釈物に加え、37℃で30分間インキュベートする。Triton(2%)水溶液を用いて100%溶血を得、PBS+0.5%BSAをネガティブコントロールとして使用する。その後、プレートを1000×gで5分間遠心分離し、上清を96ウェル平底プレートに慎重に移す。吸光度を540nmで読み取る。1溶血単位(HU)は、血球を2%Tritonを用いて処理して得られる最大溶解の50%を得るのに必要とされるSpy0167またはSpy0167変異体の量と定義される。
Spy0167変異体抗原のインビボ毒性の評価
抗原の静脈内注射。PBS中の野生型または変異体Spy0167抗原のどちらかの溶液を、PBS+2mM DTTの溶液に希釈し、次に100mlをマウスの尾静脈に注射する。マウスを2〜3日間観察する。野生型Spy0167を注射すると、典型的には数分以内に死亡する。
Spy0416タンパク質分解活性の不活化
SDS−PAGE。IL−8を野生型Spy0416またはSpy0416変異体と共にインキュベートする。インキュベーション混合物をSDS−PAGEにロードし、銀染色により顕色化する。野生型Spy0416は2つのバンド:8kDa(活性型)および6kDa(不活性切断IL−8)を放出する。Spy0416変異体は1バンドのみを放出し、このバンドは、コントロール反応(酵素なし)と同じく、切断されていないIL−8に対応する。
GAS抗原の防御能力
GAS抗原を使用して、マウスを免疫化し、GASの致死的チャレンジに対する防御を与えるその能力を試験する。抗原を、0日目、21日目、および35日目に、任意選択でアジュバントと共に、腹腔内投与する。血液試料を、3回目の免疫化の2週間後に採取する。次に、マウスをGAS菌株(例えば、50μl中GAS菌株3348 M1の108cfu)を用いて鼻腔内チャレンジする。生存を10〜14日間モニターする。
Spy0416抗体によるSpy0416媒介IL−8切断の用量依存的阻害
Spy0416の野生型および不活性変異体に特異的な抗血清は、CD1マウスを精製された組換えタンパク質で免疫化することにより作製する。IL−8(10μg/ml)を、Spy0416抗血清と共にもしくはそれなしで(1対50および1対5000)、または野生型Spy0416に対して産生されたモノクローナル抗体と共に、野生型Spy0416と2つの異なる条件:(1)8時間インキュベーション、0.1μg/mlのSpy0416、および(2)24時間インキュベーション、0.05μg/mlのSpy0416でインキュベートする。次に、インキュベーション混合物を、ELISAにより切断されていないIL−8の存在について試験する。結果は、Spy0416抗血清またはモノクローナル抗体によるSpy0416媒介IL−8切断の用量依存的阻害を実証している。
野生型または変異体Spy0167(Spy0167)に対する抗体によるSpy0167溶血の阻害
50ng/ml(3.5HU)の毒素を使用して、Spy0167溶血活性の50%減少を得るのに必要とされる抗体力価をアジュバント(例えば、フロイントアジュバント、ミョウバン、またはMF59(商標))を使用して試験する。アジュバントのみはネガティブコントロールとして使用する。
皮下チャレンジモデルにおけるGAS抗原の組み合わせの防御能力
マウスを、単一GAS抗原(Spy0167、Spy0416、もしくはSpy0269)を用いてまたはGAS抗原GASの組み合わせ(Spy0167+Spy0416+Spy0269;もしくはSpy0416+Spy0269)を用いて免疫化した。次に、マウスを、皮膚病変を引き起こすGASのSF370 M1株に皮下感染させた。GAS抗原または抗原組み合わせの防御効果は、病変のサイズを測定することにより決定した。
変異体GAS抗原の組み合わせの防御能力
GASの様々な株を用いた鼻腔内チャレンジに対するGAS変異体抗原(Spy0167変異体抗原P427L/W535FおよびSpy0416変異体抗原D151A/S617A)の組み合わせの防御能力を、基本的に実施例4に記載される通りに試験した。結果は表2に示している。
Spy0416変異体の調製
C5aプロテアーゼとの比較により、推定的にプロテアーゼの触媒部位の構成要素となるSpy0416中の3つのアミノ酸:D151、H279およびS617を同定した。前記酵素の不活型を得るために、アミノ酸変化D151Aおよび/またはS617Aをもたらすヌクレオチド置換を、オーバーラッピング伸張PCRによるスプライシング(SOE−PCR)によりSpy0416コード配列に導入した。
3つのPCR反応を実施した。
3つのPCR反応を実施した。
PCR産物6をSaI−Xhoで消化し、その同じ酵素で消化されたpET21_57his_D151Aに導入した。DNAシーケンシングにより、正確なインフレーム置換体(pET21_57his_D151A+S617A)を含有するクローンを選択した。
点変異D151Aは、Spy0416タンパク質分解活性を不活化する
Spy0416変異体D151Aを、組換えHisタグ付きタンパク質として発現させた。2種類のアッセイは、この変異体がIL−8を切断する能力を失っていることを実証した。
IL−8を、野生型Spy0416またはSpy0416変異体D151Aと共にインキュベートした。インキュベーション混合物をSDS−PAGEにロードし、銀染色により顕色化した。結果は図12に示している。野生型Spy0416(レーン2および3)は、2つのバンド:8kDa(活性型)および6kDa(不活性切断IL−8)を放出した。これとは対照的に、Spy0416 D151A変異体は1つのバンドのみを放出し、このバンドはコントロール反応(酵素なし)の場合と同様に、切断されていないIL−8に対応していた。
IL−8を、3つの異なる濃度で野生型Spy0416またはSpy0416変異体D151Aと共にインキュベートし、インキュベーション混合物を、サイトカインに特異的であるが切断された不活性型を認識することはできない抗体を使用して、切断されていないIL−8の存在について試験した。その結果は図4に示しており、0時間、8時間および24時間反応後の切断されていないIL−8の割合として表され、以下の通りに計算した。
Spy0416変異体S617AおよびSpy0416二重変異体D151A+S617AはIL−8を切断しない
Spy0416変異体S617AおよびSpy0416二重変異体D151A+S617AをHisタグ付きタンパク質として発現させ、実施例2に記載される通りにIL−8不活化実験において試験した。
IL−8を、野生型Spy0416(Hisタグ付きもしくはタグなし)、またはSpy0416変異体D151A、S617AおよびD151AS+S617Aのそれぞれと共に24時間インキュベートした。インキュベーション混合物をSDS−ポリアクリルアミドゲルにロードし、銀染色により顕色化した。2つの実験の結果は図4Aおよび4Bに示している。Spy0416 S617A変異体とGAS D151+S617A変異体いずれも、野生型Spy0416の100倍の濃度でも、IL−8を切断することはできない。
同じ試料を使用してELISAアッセイを実施し、単一アミノ酸置換および二重アミノ酸置換がIL−8を切断するSpy0416の能力を除去することを確認した。結果は、図5に示しているが、野生型Spy0416により放出される20〜40%に比べて、変異体が24時間インキュベーション後切断されていないIL−8を100%放出することを実証している。
Spy0416変異体の防御能力は野生型Spy0416を用いて得られる防御能力に類似している
Spy0416変異体D151AおよびD151A+S617Aを使用してマウスを免疫化し、野生型Spy0416と比べた、GASの致死的チャレンジに対する防御を提供するその能力を試験した。2つの実験(それぞれ20マウス)の結果を下に要約しており平均生存率(%)として表している。
精製された不活性変異体は、2つの非共有結合タンパク質フラグメントの形態でのみ存在する野生型Spy0416と比べると単一ペプチドとして出現する
野生型Spy0416は、主に2つのフラグメント、すなわち約23kDaのフラグメントおよび150kDaのフラグメントの形態で得られる。前記2つのフラグメントは、Niキレートアフィニティ精製においてまたはゲル濾過により分離されることはないが、SDS−PAGE上では2つの異なるバンドとして出現する(図6)。N末端シーケンシングによれば、23kDaフラグメントはSpy0416のN末端部分(配列番号50のアミノ酸34〜244)であり、150kDaフラグメントはC末端領域(配列番号50のアミノ酸245〜1603)であることが確証された。
ポリクローナル抗血清によるSpy0416媒介IL−8切断の用量依存的阻害
Spy0416の野生型および不活性変異体に特異的なマウス抗血清を、CD1マウスを精製された組換えタンパク質で免疫化することにより作製した。
野生型および変異体Spy0167タンパク質のクローニング
野生型および変異体Spy0167タンパク質をコードする遺伝子を、表4に示されるSF370ゲノム由来のプライマーを使用してPCRにより増幅した。
Hisタグ付きタンパク質の精製
E.coliペレットを溶解緩衝液に懸濁し、室温で30〜40分間混合した。溶解物を、30〜40000×gで20〜25分間遠心分離し、上清を洗浄緩衝液Aで平衡化したカラムにロードした(1mlのNi活性化キレートセファロースファストフロー樹脂を含むPoly−Prep)。ロードされた樹脂を、洗浄緩衝液Aで3回、洗浄緩衝液Bで3回洗浄した。最終2mMのDTTを含有するEppendorfチューブにおいて溶出緩衝液でタンパク質を溶出した。全溶出タンパク質を、Bradford試薬で定量し、その後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する(図15および16)。
溶解緩衝液
10mlのB−PER(商標)(細菌タンパク質抽出試薬、Pierceカタログ78266)
MgCl2 0.1mMの最終濃度
DNAsi I(SigmaカタログD−4263)100ユニット
リゾチーム(SigmaカタログL−7651)1mg/mlの最終濃度
洗浄緩衝液A:50mMのNaH2PO4、300mMのNaCl、pH8.0
洗浄緩衝液B:20mMのイミダゾール、50mMのNaH2PO4、300mMのNaCl、pH8.0
溶出緩衝液:250mMのイミダゾール、50mMのNaH2PO4、300mMのNaCl、pH8.0。
タグなしタンパク質の精製
溶解物調製
約80〜110gの細菌培養ペレットを、6錠のCOMPLETE(登録商標)プロテアーゼインヒビター、10mlの0.2M EDTA pH7.5(5mMの最終濃度)、10mlの100mg/mlリゾチーム溶液、8mlの10000Kユニット/ml DNAse I溶液および1mlの50mM MgCl2溶液を追加した200〜280ml B−PER(商標)試薬(Pierce)に懸濁した。細菌懸濁物を60分間、均一な懸濁物が得られるまで振盪することによって細菌溶解を達成した。
上記のように処理された溶解物由来の上清を、30mMのTRIS、pH8.0であらかじめ平衡化したHP50/10Qセファロースカラム(約200ml)にロードした。フロースルー(flow−through)を収集した。Spy0167タンパク質を含有する画分をプールし、10mMのNaホスフェート、pH6.8に対して透析した。タンパク質濃度を、Bradford法により決定した。
緩衝液B:30mMのTRIS、1MのNaCl、pH8.0
平衡およびローディング:0%B
勾配:0〜25%Bの5CV−25%Bの2CV
洗浄:100%B 2CV+3CV
流量:20ml/分
画分容積:14ml。
前に得たプールを、10mMのNaホスフェート、pH6.8であらかじめ平衡化したCHT20カラムにロードした。フロースルーを収集した。
緩衝液B:500mMのNaホスフェート、pH6.8
洗浄:8CV
洗浄:30%Bの6CV
勾配:30〜100%B(10CV)
洗浄:100%B
流量:5ml/分
画分容積:5ml。
収集されたプールを、10ml未満の容積を得るためのAmiconフィルターを用いて濃縮した。濃縮した材料を、少なくとも3〜4カラム容積のPBSで平衡化したHiLoad Superdex200 26/60にロードした。
溶出:アイソクラチック(Isocratic)
流量:2.5ml/分
画分容積:5ml。
溶血アッセイ
定量的溶血アッセイについてのプロトコール
毒素の段階希釈物を、PBS+0.5%BSAを使用して、U字形底の96ウェルプレートに調製した。1mlのヒツジ血液をPBS中で3回洗浄し(3000×gで遠心分離して)、血球細胞を5mlのPBSに懸濁した。等容積の懸濁物を50μlの各毒素希釈物に添加し、37℃で30分間インキュベートした。Triton(2%)水溶液を使用して100%溶血を得、PBS+0.5%BSAをネガティブコントロールとして使用した。次に、プレートを1000×gで5分間遠心分離し、上清を96ウェル平底プレートに慎重に移した。吸光度は540nmで読み取った。
Spy0167 P427Lをコードする遺伝子を、SF370 M1ゲノムからPCRを使用して増幅し、Hisタグ付きタンパク質のE.coli BL21DE3における発現を可能にするベクターpET21b+へクローニングした。類似した量の野生型および変異型ストレプトリジンOタンパク質を発現するE.coliの可溶性抽出物(図12参照)を使用して、溶血アッセイを実施し、その2つの抗原の細胞溶解特性を比較した。アッセイの結果は図9に示しており、変異型タンパク質は、毒性が野生型の多くとも100分の1であることを実証している。
Spy0167 P427L変異体を、Hisタグ付き組換えタンパク質についての精製標準手順に従って精製した(図10)。様々な濃度の精製されたwtおよび変異型タンパク質を使用して、溶血アッセイを繰り返し、これにより細胞溶解活性の減少を確認した(図11)。
本発明者らは、Hisタグなしの野生型組換えSpy0167(rSpy0167)(BL21 DE3、Novagen No.71382−pET24)およびHisタグなしP427L変異体rSpy0167(BL21 DE3、Novagen No.71382−pET24)で形質転換されたE.coli溶解物の溶血活性を比較した。挿入なしのpET24で形質転換されたE.coli BL21 DE3(Novagen
No.71382)をネガティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロールは、水中2%Tritonを含む低張性液であった。ネガティブコントロールはタンパク質希釈緩衝液(0.5%BSAを含むPBS、pH7.4)であった。
野生型Spy0167の溶血活性を、いくつかの異なるSpy0167変異体の溶血活性と比較した。結果は図20および下の表8に示している。1溶血単位(HU)は、血球を2%Tritonで処理して得られた最大溶解の50%を得るために必要とされる毒素量として定義される。
30℃での細胞増殖、および25℃での1mM IPTGでの誘導、およびOD600nm約0.4〜0.6の後に得られた、E.coli溶解物またはコレステロール200mg/mlを含むE.coli溶解物のPBS−BSA0.5%における2〜5倍段階希釈物を、それらの溶血活性についてアッセイした。誘導の3時間後、溶解緩衝液(B−PER溶液−PIERCE)、1mMのMgCl2、100Kユニット/mlのDNAse(Sigma)およびリゾチーム(Sigma)で30〜40分間細菌を溶解することにより得られた等容積のタンパク質調製物で、PBS中2%ヒツジ赤血球溶液の50マイクロリットルを処理した。その後、不溶性画分を遠心分離し(15分間、21000×g、4℃)、上清(E.coli溶解物)を、最終濃度5mMでDTTを含有する新しいEppendorfチューブに移した。
溶血の阻害
プロトコール
(アジュバントを含まない、またはアジュバントとしてミョウバンもしくはMF59(商標)を含む)野生型または変異体Spy0167タンパク質で免疫化したマウス由来の血清の段階2倍希釈物を、U字形底の96ウェルプレートでPBS+0.5%BSAを用いて、調製した。必要に応じて、PBSでまたはアジュバントのみで免疫化したマウスの血清をネガティブコントロールとして使用した。PBS+0.5%BSA中の50〜100ng/ml(3.5〜7 HU)の毒素溶液を等容積加え、プレートを撹拌(800rpm)しながら、室温で20分間インキュベートした。インキュベーション後、この溶液の50mlを新しい96ウェルプレートに移し、(PBSで3回洗浄した)等容積のヒツジ赤血球懸濁物を添加し、37℃で30分間インキュベートした。その後、プレートを1000×gで1分間遠心分離し、上清を96ウェル平底プレートに慎重に移し、吸光度を540nmで読み取った。下記の結果では、阻害力価は、Triton誘導溶血を50%低下させた血清希釈度として表される。
抗野生型Spy0167抗血清によるSpy0167溶血の阻害は、図21〜23および表10〜12に示している。抗Spy0167血清力価は、1/7,000〜1/14,000の間に含まれる(相加平均、1/12,167±2,714)。ネガティブコントロール血清(フロイントアジュバント)力価は、1/375と1/4,000との間に含まれる(相加平均、1/1,854±1,384)。
野生型Spy0167、化学的に解毒された野生型Spy0167およびSpy0167変異体(P427L;P427L+W535F)の溶血活性の力価測定は表13に示している。
変異体Spy0167タンパク質に対する抗血清によるSpy0167溶血の阻害は、図27〜29および表14〜16に示している。50ng/ml(3.5 HU)の毒素を使用して、Spy0167変異体W535−P427LについてのSpy0167溶血活性の50%低下を得るために必要とされる血清希釈度は、ミョウバンアジュバントを使用して1/17,860であり、MF59(商標)アジュバントを使用して1/7991である。ネガティブコントロール(アジュバントのみ)力価は1/1,000(ミョウバン)および1/125(MF59(商標))である。
インビボ防御実験
精製されたSpy0167 P427Lタンパク質を、フロイントアジュバントと共に、40匹のマウスへ腹腔内投与した。その後、3348M1 GAS菌株でマウスを鼻腔内でチャレンジした。表17は3つの別々の実験で得られたデータを報告し、100%防御がすべての実験で一貫して達成されたことを示している。
インビボの毒性試験
プロトコール
Spy0167の静脈内注射。野生型または変異体Spy0167のいずれかのPBS中の溶液を、PBS+2mM DTTの溶液中に希釈し、その後、マウスの尾静脈に100mlを注射する。マウスを2〜3日間観察する。野生型Spy0167の注射は、典型的には数分以内で死をもたらす。
急性のインビボの急性毒性を、ポジティブコントロールとして10μg/マウスの用量の野生型Spy0167およびネガティブコントロールとしてフロイントアジュバントのみの注射を使用して評価した。10μg/マウスの野生型Spy0167を、野生型Spy0167抗血清かまたはコントロール血清のいずれかと共にインキュベートし、上記のようにマウスに接種した。結果は表21に示している。
Spy0167 P427L−W535Fでの免疫化は野生型Spy0167の静脈内注射からマウスを防御する
マウスに、野生型Spy0167かまたはSpy0167変異体P427L−W535Fのいずれかで、アジュバントとしてミョウバンを使用して(2mg/ml水酸化アルミニウム中20μgのタンパク質)、腹腔内に3回(0日目、21日目および35日目)免疫処置を行った。アジュバントのみで免疫化したマウスをネガティブコントロールとして使用した。55日目に、マウスに、PBS、2mM DTT中の様々な濃度の野生型Spy0167の溶液を静脈内注射し、少なくとも72時間モニターした。結果は表24に示している。
GAS M1株を用いた鼻腔内チャレンジに対するSpy0167変異体P427L−W535Fによる防御
30匹のマウスを、Spy0167変異体P427L−W535Fで、アジュバントとしてのミョウバンまたはMF59のいずれかと共に、腹腔内で免疫化し、GAS M1株で鼻腔内チャレンジした。結果は図30に示している。Spy0167変異体P427L−W535Fとミョウバンで免疫化されたマウスの77%は、ネガティブコントロールマウス(アジュバントのみで免疫化された)の3%と比べて、GAS M1株での鼻腔内チャレンジから防御された。Spy0167変異体P427L−W535FとMF59で免疫化されたマウスの90%は、ネガティブコントロールマウス(アジュバントのみで免疫化された)の10%と比べて、GAS M1株での鼻腔内チャレンジから防御された。これらの防御レベルは、野生型Spy0167でマウスを免疫化することにより得られる防御レベルに匹敵する。
GAS抗原で免疫されたマウスのインビボ防御研究
本実施例は、異なるM型のGAS菌株を用いたチャレンジが続く、GAS抗原の様々な組み合わせおよび/またはCRM197(GC)と結合体化されたGAS特異的多糖を用いて実施した免疫原性/防御試験の結果を提供する。GASタンパク質およびGCは、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、またはMF59のいずれかと共に処方した。タンパク質抗原の用量は、単独で使用される場合は20μgであり、タンパク質組み合わせ処方物は、野生型Spy0269(配列番号177)およびSpy0416 D151A/S617A(配列番号198)をそれぞれ20μgならびにSpy0617 P427L/W535F(配列番号125)を10μg含有していた。GC用量は表に示している。
表25は、マウスを、フロイントアジュバントと共に処方したSpy0269(配列番号177)、Spy0416 D151A/S617A(配列番号198)、もしくはSpy0617 P427L/W535F(配列番号125)、またはこれらの抗原の組み合わせ(「コンボ」)で免疫化し、次に、M1、M12およびM23株で鼻腔内でチャレンジした実験の結果を報告している。結果は、
a.Spy0269は、M1、M12およびM23感染に対して統計的に有意な防御を与える;
b.Spy0416 D151A/S617AおよびSpy0617 P427L/W535FはM1血清型での鼻腔内感染に対して顕著な防御を与える、ならびに、
c.Spy0269、Spy0416 D151A/S617AおよびSpy0617 P427L/W535Fの組み合わせは、M1、M12およびM23GAS血清型に対して40%を超える防御を与える
ことを示している。
M1での腹腔内感染に対するミョウバンと共に処方したGAS25、GAS40、およびGAS57抗原プラスGCの組み合わせによる防御
表26は、マウスを、ミョウバンと共に処方したGCを伴なうかまたはそれなしでのSpy0167変異体P427L/W535F、野生型Spy0269、およびSpy0416変異体D151A/S617Aの組み合わせ(「コンボ」)で免疫化し、次に、M1で腹腔内チャレンジした実験の結果を報告している。結果は、タンパク質の組み合わせだけでもタンパク質の組み合わせプラスGCでも統計的に有意な防御が得られたことを示している。したがって、組み合わせにおいてでさえ、これらのGAS抗原の並はずれた免疫原性が維持されている。
細胞結合アッセイ
ヒト(A549、HeLa、293、Detroit、ME180)またはサル(LLCMK2)上皮細胞系統を、細胞解離溶液(Sigma)を使用してその担体から非酵素的に引き離し、収集し、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に懸濁する。ほぼ2×105細胞を、U字形底の96ウェルプレートで、培地のみと、または様々なSpy0269組換えタンパク質濃度(μg/ml)の培地と200mlの全容積で混合する。4℃でのインキュベーションを1時間実施する。PBSで2回洗浄した後に、細胞をSpy0269抗体または抗血清(例えば、抗血清は;PBS/BSA1%中1対200)と共に4℃で1時間インキュベートする。2回の洗浄後、試料を、二次抗体と共に4℃で30分間インキュベートする(例えば、マウスSpy0269抗血清では、二次抗体は、PBS/BSA1%中1対100に希釈されたマウス免疫グロブリンに特異的なR−フィコエリトリン−結合体化ヤギF(ab)2抗体であり得る)。結合反応はフローサイトメトリーにより分析する。集団ごとの平均蛍光強度を計算する。
オプソニン作用アッセイ
本実施例は、下の実施例において使用されるオプソニン作用アッセイを記載している。手短に言えば、細菌(10〜50コロニー形成ユニット、CFU、PBS中25μl)を、アジュバントだけでまたは試験される抗原(単数または複数)でのいずれかで免疫化したウサギ由来の全血225μlと共にインキュベートする。試料を37℃で5時間、転倒回転させながらインキュベートする。希釈に続いて、試料を血液寒天プレート上に蒔き、CFU数を評価する。
抗複合糖質(GC)抗体がS.pyogenesの死滅を媒介することを実証する全血殺菌アッセイ
実施例26に記載されるアッセイは、100μgGCで免疫化したウサギから得られた全血を使用して実施した。その結果は、図34に示しているが、抗GC抗体がS.pyogenesの死滅を媒介することを実証している。
抗複合糖質(GC)抗体とGAS抗原組み合わせに対して産生された抗体との組み合わせがS.pyogenesの死滅を増強することを実証する全血殺菌アッセイ
実施例26に記載されるアッセイは、(a)フロイントアジュバント、(b)M1タンパク質、(c)野生型Spy0269(配列番号177)、Spy0167二重変異体P427L/W535F(配列番号125)およびSpy0416二重変異体D151A/S617A(配列番号198)(それぞれ100μg)の組み合わせ、(d)GC、ならびに(e)野生型Spy0269(配列番号177)、Spy0167二重変異体P427L/W535F(配列番号125)、Spy0416二重変異体D151A/S617A(配列番号198)およびGCの組み合わせで免疫化されたウサギから得られた全血を用いて実施した。結果は図35に示している。
GAS抗原の細胞毒性の欠如を実証する実験
ヒト脳微小血管内皮細胞(HBMEC)を、RPM1 1640培地において様々な濃度の組換えGAS抗原を用いてインビトロで24時間処理した。ネガティブコントロールは無処置であり(「NT」)、TNFα 1μg/mlで処理した細胞をポジティブコントロールとして使用した。アネキシンVおよびヨウ化プロピジウム染色を使用して、フローサイトメトリーによりアポトーシス細胞の割合を測定した。これらの実施例において使用された野生型Spy0269(配列番号177)、Spy0167二重変異体P427L/W535F(配列番号125)、Spy0416二重変異体D151A/S617A(配列番号198)および複合糖質(「GAS GC」)の濃度では顕著な毒性はないことを結果は示している。図36A〜Dを参照のこと。
タンパク質抗原保存および発現
下の表は、57、49、および13S.pyogenes株間のそれぞれSpy0269、Spy0416、Spy0167ごとの平均同一性割合を示している。
ELISAアッセイ
簡単に述べると、プレートを抗原(0.1〜0.3μg/ウェル)でコーティングし、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中2%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックする。試験される血清の2倍段階希釈物とのインキュベーション後、プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中2%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.05%TWEEN20(登録商標)で洗浄し、アルカリホスファターゼに結合体化された二次抗体(抗全IgG、1対2000)と共にインキュベートする。基質のp−ニトロフェニルホスフェート(pNPP、3μg/ml)とインキュベートした後、吸光度を405nmで測定する。血清力価を、標準曲線からODを内挿することにより計算する。図37A〜Dに示されるように、このアッセイは線形であり再現性がある。
インビボチャレンジ実験
5〜6週齢の雌性CD1マウスを、0日目、21日目、および35日目に3回、PBS中のミョウバンをアジュバントとする様々な用量のGAS抗原で腹腔内で免疫化し、S.pyogenesの様々な菌株で、鼻腔内(LD90細菌量を含有する50ml Todd Hewitt)または腹腔内(LD90細菌量を含有する200μl Todd Hewitt)のいずれかでチャレンジした。結果は表27および28に示している。表27および28では、「40」、「25」、および「57」はそれぞれ野生型Spy0269(配列番号177)、Spy0167二重変異体P427L/W535F(配列番号125)、およびSpy0416二重変異体D151A/S617A(配列番号198)である。
ミョウバンの含有は菌株M1 3348に対する防御を与える
本実施例は、Spy0167と組み合わせ処方物の両方におけるミョウバンの含有がS.pyogenes株M1 3348に対する防御を与えることを実証している。
GAS抗原処方物の安定性
100μg/ml Spy0269(PBS中1mg/ml溶液)、100μg Spy0416二重変異体D151A/S617A(PBS中1mg/ml溶液)、50μg
Spy0167二重変異体P427L/W535F(PBS中1mg/ml溶液)、2mg/ml水酸化アルミニウム、10mM ヒスチジン緩衝液(pH7.0)、9g/l
塩化ナトリウムを含有する組み合わせGAS抗原処方物のpH7.0+/−0.3、重量オスモル濃度300+/−20 mOsm/kgでの安定性およびインビボでの効力は、抗原完全性のSDS−PAGE分析により試験した。処方物は4℃で1年まで安定である。抗原の安定性を、1年の期間にわたり2〜8℃でインキュベートすることにより評価した。SDS−PAGEで評価した場合、3種のタンパク質成分すべてが1年後極めて安定であることが分かった。タンパク質抗原は、2〜8℃で少なくとも36週間の間、ミョウバンに吸着されたままである(>97.5%)。
Spy0416抗体およびSpy0167抗体の効果
本実施例は、Spy0416およびSpy0167に対する抗体が毒性活性をブロックすることを実証している。
用量範囲実験
5週間齢の雌性CD1マウスを、0日目、21日目、および35日目に、野生型Spy0269(配列番号177)、Spy0416変異体D151A/S617A(配列番号198)、およびSpy0167変異体P427L/W535F(配列番号125)の様々な用量で免疫化した。マウスにおける用量依存性IgG応答を、実施例31に記載される通りに、ELISAにより測定した。結果は、図38A〜Cに示している。
M1を用いて鼻腔内でチャレンジした。結果は、表30に示している。
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