CN102356090A

CN102356090A - 组合gas疫苗和治疗方法

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Publication number: CN102356090A
Application number: CN2009801423049A
Authority: CN
Inventors: A·曼尼蒂; S·卡波; G·本斯; G·格兰迪; I·马格里特伊若斯
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2008-09-17
Filing date: 2009-09-17
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2029-09-17
Also published as: HUE027618T2; EP2344523B1; PL2344523T3; WO2010076618A1; JP2012502969A; NZ591633A; CN102356090B; HRP20160306T1; SMT201600125B; ZA201102005B; DK2344523T3; US20100136041A1; BRPI0919236A2; AU2009334428A1; MX2011002760A; CA2737453A1; BRPI0919236A8; EP2344523A1; ES2566740T3; SI2344523T1

Abstract

可用于降低酿脓链球菌(S.pyogenes)(GAS)感染风险、对其进行预防和/或治疗的组合物，其包含GAS抗原、编码所述抗原的核酸分子或与所述抗原特异性结合的抗体的组合。

Description

组合GAS疫苗和治疗方法

发明领域

本发明涉及免疫学和疫苗学领域。

发明背景

A组链球菌(“GAS”，酿脓链球菌(S.pyogenes))是常见的人病原体，估计其存在于5-15％的正常个体中而不显示疾病病征。然而，在宿主防御受到损害时，在所述生物体能够发挥其毒力时，或在所述生物体被引入易感组织或宿主时，会发生急性感染。相关疾病包括产褥热、猩红热、丹毒、咽炎、脓疱病、坏死性筋膜炎、肌炎和链球菌中毒性休克综合征。几十年来人们在一直致力于开发针对GAS的预防性疫苗。然而目前还没有通过公众可得的GAS疫苗。本领域需要这样的疫苗。

附图简要说明

图1显示GAS抗原组合在皮下攻击小鼠模型中的保护能力。“GAS57，”Spy0416；“GAS25，”Spy0167；“GAS40，”Spy0269(SEQ ID NO：177)；“dGAS57，”Spy0167突变体D151A/S617A(SEQ ID NO：198)；“dGAS25，”Spy0167突变体P427L/W535F(SEQ ID NO：125)。

图2为SDS-聚丙烯酰胺凝胶的显微照片，其表明Spy0416点突变体D151A已丧失切割IL-8的能力。“57，”Spy0416(GAS57)。

图3显示ELISA鉴定结果，其表明Spy0416点突变体D151A已丧失切割IL-8的能力。

图4A-B为SDS-聚丙烯酰胺凝胶的显微照片，其表明Spy0416单突变体D151A和S617A以及突变体D151A+S617A均已丧失Spy0416的蛋白水解活性。

图5显示ELISA鉴定结果，其表明单突变体D151A和S617A以及Spy0416突变体D151A+S617A均已丧失Spy0416(“57”)的蛋白水解活性。

图6为SDS-聚丙烯酰胺凝胶的显微照片，其表明野生型Spy0416经翻译后修饰形成150.5kDa和23.4kDa的两个多肽片段。

图7为SDS-聚丙烯酰胺凝胶的显微照片，其表明与野生型(黑色箭头)相比，Spy0416突变体D151A、S617A和D151A+S617A不经翻译后修饰形成150.5kDa和23.4kDa的两个多肽片段。与未加工蛋白质对应的174kDa的主要条带存在于失活突变株(灰色箭头)的对应泳道。“57，”Spy0416。

图8A-B为ELISA鉴定结果，其表明两种不同实验条件下针对Spy0416(“57”)的多克隆抗血清对Spy0416介导的IL-8切割作用的剂量依赖性抑制作用。图8A显示8小时培育，0.1μg/ml Spy0416。图8B显示24小时培育，0.05μg/ml Spy0416。

图9显示采用包含野生型Spy0167和Spy0167突变体P427L的大肠杆菌(E.coli)提取物的溶血鉴定结果。

图10为显示纯化的Spy0167突变体P427L的SDS-聚丙烯酰胺凝胶显微照片。

图11显示采用纯化的野生型Spy0167和Spy0167突变体P427L的溶血鉴定结果。

图12为大肠杆菌裂解物上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶显微照片。泳道A，大肠杆菌阴性对照；泳道B，rSpy0167野生型，不含标记；泳道C，rSpy0167P427L，不含标记；泳道D，纯化的rSpy0167野生型，不含标记(5mg)。

图13显示在相同条件下Spy0167突变体P427L的溶血性比野生型Spy0167低1000倍。

图14通过野生型Spy0167和Spy0167突变体P427L显示胆固醇对溶血作用的影响。

图15为对细胞提取物中总的无标记蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。图15A显示Spy0167野生型和P427L的无标记蛋白质的表达；图15B显示Spy0167P427L+W535、P427L+C530G和P427L+C530G+W535F的无标记蛋白质的表达。

图16为对细胞提取物中总的组氨酸标记蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。

图17为对纯化的组氨酸标记蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。

图18为对纯化的无标记蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。图18A显示：泳道A，无标记Spy0167野生型；B，无标记Spy0167P427L；分子量标记(116-66.2-45-35-25-18.4-14.4)；黑色箭头显示从突变体和野生型克隆纯化的Spy0167蛋白。图18B显示：泳道A，无标记Spy0167野生型(3μg)；泳道B，无标记Spy0167P427L-W535F(3μg)；分子量标记(116-66.2-45-35-25-18.4-14.4)；黑色箭头显示从突变体和野生型克隆纯化的Spy0167蛋白。

图19为对纯化的无标记Spy0167(“GAS25”)野生型蛋白的SDS-PAGE分析的显微照片。在还原和非还原条件下分析野生型Spy0167不同纯化批次的样品。

图20显示组氨酸标记的Spy0167突变体的溶血作用测试结果。

图21显示抗Spy0167抗血清抑制Spy0167诱导的溶血活性。

图22显示抗Spy0167抗血清抑制Spy0167溶血作用的滴定分析。

图23显示Spy0167溶血活性的滴定分析。

图24显示野生型Spy0167、化学去毒野生型Spy0167和Spy0167突变体(P427L，P427L+W535F)的溶血活性的滴定分析。

图25显示野生型Spy0167和Spy0167突变体(P427L，P427L+W535F)的溶血活性的滴定分析。

图26显示野生型Spy0167和化学去毒野生型Spy0167的溶血活性的滴定分析。

图27显示达到Spy0167溶血活性降低50％(50ng/ml Spy0167)所需的针对Spy0167(“gas25”)突变体P427L+W535F的抗血清稀释度。

图28显示达到Spy0167溶血活性降低50％(100ng/ml Spy0167)所需的针对Spy0167(“gas25”)突变体P427L+W535F的抗血清稀释度。

图29为显示用允许100％溶血作用的毒素浓度进行溶血抑制作用试验的滴定曲线。

图31A-GG为来自不同菌株/M型的Spy0416(“gas57”)抗原的比对。催化三联体(D、H、S)用粗黑字体表示。图31A，氨基酸1-50(图10A-GG各图顶部的氨基酸编号指Spy0416M1_SF370，SEQ ID NO：1的氨基酸序列)；图31B，氨基酸51-100；图31C，氨基酸101-150；图31D，氨基酸151-200；图31E，氨基酸201-250；图31F，氨基酸251-300；图31G，氨基酸301-350；图31H，氨基酸351-400，图31I，氨基酸401-450；图31J，氨基酸451-500；图31K，氨基酸501-550；图31L，氨基酸551-600；图31M，氨基酸601-650；图31N，氨基酸651-700；图31O，氨基酸701-750；图31P，氨基酸751-800；图31Q，氨基酸801-850；图31R，氨基酸851-900；图31S，氨基酸901-950；图31T，氨基酸951-1000；图31U，氨基酸1001-1050；图31V，氨基酸1051-1100；图31W，氨基酸1101-1150；图31X，氨基酸1151-1200；图31Y，氨基酸1201-1250；图31Z，氨基酸1251-1300；图31AA，氨基酸1301-1350；图31BB，氨基酸1351-1400；图31CC，氨基酸1401-1450；图31DD，氨基酸1451-1500；图31EE，氨基酸1501-1550；图31FF，氨基酸1551-1600；图31GG，氨基酸1601-1650。M1_SF370，SEQ ID NO：1；M1_31075，SEQ ID NO：2；M1_31237，SEQ ID NO：3；M1_3348，SEQ IDNO：4；M2_34585，SEQ ID NO：5；M3，1_21398，SEQ ID NO：6；M44-61_20839，SEQ ID NO：7；M6，31_20022，SEQ ID NO：8；M11_20648，SEQ ID NO：9；M23_2071，SEQ ID NO：10；M18，3_40128，SEQ ID NO：11；M4_10092，SEQID NO：12；M4_30968，SEQ ID NO：13；M6，31_22692，SEQ ID NO：14；M68，5_22814，SEQ ID NO：15；M68_23623，SEQ ID NO：16；M2_10064，SEQ ID NO：17；M2_10065，SEQ ID NO：18；M77_10251，SEQ ID NO：19；M77_10527，SEQ ID NO：20；M77_20696，SEQ ID NO：21；M89_21915，SEQ ID NO：22；M89_23717，SEQ ID NO：23；M94_10134，SEQ ID NO：24；M28_10164，SEQ ID NO：25；M28_10218，SEQ ID NO：26；M29_10266，SEQ ID NO：27；M28_10299，SEQ ID NO：28；M28_30176，SEQ ID NO：29；M28_30574，SEQ ID NO：30；M6，9_21802，SEQ ID NO：31；M75_10012，SEQ ID NO：32；M75_20671，SEQ ID NO：33；M75_30603，SEQ ID NO：34；M75_30207，SEQ ID NO：35；M22_20641，SEQ ID NO：36；M22_23465，SEQ ID NO：37；M3，1_30610，SEQ ID NO：38；M3，1_40603，SEQ ID NO：39；M3，28_24214，SEQ ID NO：40；M3，34_10307，SEQ ID NO：41；M4_40427，SEQ ID NO：42；M3_2721，SEQ ID NO：43；M12_10296，SEQ ID NO：44；M12_10035，SEQ ID NO：45；M12_20069，SEQ ID NO：46；M12_22432，SEQ ID NO：47；M4_40499，SEQ ID NO：48；和M6，1_21259，SEQ ID NO：49。

图32A-GG为来自不同菌株/M型的Spy0269(“gas40”)抗原的比对。图32A，氨基酸1-50(图10A-GG各图顶部的氨基酸编号指Spy0269M1_SF370，SEQ ID NO：50的氨基酸序列)；图32B，氨基酸51-100；图32C，氨基酸101-150；图32D，氨基酸151-200；图32E，氨基酸201-250；图32F，氨基酸251-300；图32G，氨基酸301-350；图32H，氨基酸351-400，图32I，氨基酸401-450；图32J，氨基酸451-500；图32K，氨基酸501-550；图32L，氨基酸551-600；图32M，氨基酸601-650；图32N，氨基酸651-700；图32O，氨基酸701-750；图32P，氨基酸751-800；图32Q，氨基酸801-850；图32R，氨基酸851-874。M1_SF370，SEQ ID NO：50；临床分离株_40s88，SEQ ID NO：51；M11_2727，SEQ ID NO：52；M22_20641，SEQ ID NO：53；M22_23465，SEQ ID NO：54；M22_23621，SEQ ID NO：55；M3.1_30610，SEQ ID NO：56；M3.1_40603，SEQ ID NO：57；M3.34_10307，SEQ ID NO：58；M3_MGAS315，SEQ ID NO：59；M4_40427，SEQ ID NO：60；M3_2721，SEQ ID NO：61；M3_3040，SEQ ID NO：62；M3_3135，SEQ ID NO：63；M12_10035，SEQ ID NO：64；M12_22432，SEQ ID NO：65；M4_40499，SEQID NO：66；M78_3789，SEQ ID NO：67；M89_10070，SEQ ID NO：68；M89_21915，SEQ ID NO：69；M89_23717，SEQ ID NO：70；M89_5476，SEQID NO：71；M23_DSM2071，SEQ ID NO：72；M4_2722，SEQ ID NO：73；M4_10092，SEQ ID NO：74；M4_30968，SEQ ID NO：75；M4_2634，SEQ IDNO：76；M28_10164，SEQ ID NO：77；M28_10218，SEQ ID NO：78；M28_10266，SEQ ID NO：79；M28_10299，SEQ ID NO：80；M28_30176，SEQ ID NO：81；M28_4436，SEQ ID NO：82；M8_2725，SEQ ID NO：83；M44_3776，SEQ ID NO：84；M6_2724，SEQ ID NO：85；M6_2894，SEQ IDNO：86；M6_3650，SEQ ID NO：87；M6_5529，SEQ ID NO：88；M5，SEQ IDNO：89；M77_4959，SEQ ID NO：90；M2_10064，SEQ ID NO：91；M2_10065，SEQ ID NO：92；M75_5531，SEQ ID NO：93；M50_4538，SEQ ID NO：94；M62_5455，SEQ ID NO：95；M44_5481，SEQ ID NO：96；M5_4883，SEQ IDNO：97；M9？_2720，SEQ ID NO：98；M2_2726，SEQ ID NO：99；M12_20296，SEQ ID NO：100；M1_2580，SEQ ID NO：101；M1_2913，SEQ ID NO：102；M1_3280，SEQ ID NO：103；M1_3348，SEQ ID NO：104；M78_3789，SEQ IDNO：105；M？_2719，SEQ ID NO：106。

图33A-C为来自不同菌株/M型的Spy0167(“gas25”)抗原的比对。图33A，氨基酸1-150(图10A-GG各图顶部的氨基酸编号指Spy0167M1_SF370，SEQ ID NO：107的氨基酸序列)；图33B，氨基酸151-300；图33C，氨基酸301-500。M12_2096，SEQ ID NO：108；M12_9429，SEQ ID NO：109；M1_5005，SEQ ID NO：110；M1_3348，SEQ ID NO：111；M2_10270，SEQ IDNO：112；M28_6180，SEQ ID NO：13；M6_10394，SEQ ID NO：114；M18_8232，SEQ ID NO：115；M5_曼菲多(Manfredo)，SEQ ID NO：116；M3_315，SEQID NO：117；M3_SSI，SEQ ID NO：119；M4_10750，SEQ ID NO：119。

图34显示全血杀菌试验结果，表明抗复合糖(GC)抗体介导对酿脓链球菌的杀伤作用。

图35显示全血杀菌试验结果，表明抗复合糖(GC)抗体和GAS抗原组合产生的抗体的组合增强对酿脓链球菌的杀伤作用。“弗氏”，弗氏佐剂；“M1”，酿脓链球菌M1蛋白；“COMBO”，Spy0416突变体D151A/S617A、Spy0617突变体P427L/W535F5和野生型Spy0269；“GC”，与CRM197偶联的GAS多糖抗原。

图36A-D显示比较各种抗原与阳性(肿瘤坏死因子α，TNF-α)和阴性(NT，未处理)对照的细胞毒性试验结果。图36A，Spy0269(GAS40，SEQID NO：177)；图36B，Spy0416(GAS57)和GAS57突变体D151A/S617A(GAS57DM，SEQ ID NO：198)；图36C，Spy0167(GAS25)和GAS25突变体P427L/W535F(GAS25DM，SEQ ID NO：125)；图36D，复合糖(GC)。

图37A-D显示ELISA试验验证。图37A，Spy0167(GAS25)；图37B，Spy0269(GAS40)；图37C，Spy0416(GAS57)；图37D，复合糖(GC)。

图38A-F显示测试单个抗原剂量的ELISA试验结果。图38A和38D，Spy0167(GAS25)的两个实验；图38B和38E，Spy0416(GAS57)(两个实验)；图38C和38F，Spy0269(GAS40)(两个实验)。“GMT”，几何平均效价。

图39显示ELISA和攻击试验结果，所述试验测试Spy0416突变体D151A/S617A(GAS57)和野生型Spy0269(GAS40)的组合以及以明矾为佐剂的Spy0167突变体P427L/W535F(GAS25)的剂量范围。

图40为适合用作平均存活时间(MST，Mu)分析的一级近似的对数正态模型分析，表明Mu随Spy0167(GAS25)剂量降低而减少。

图41A-B为显示针对Spy0419和Spy0167的抗体阻断毒素活性的柱状图。图41A，Spy0419(GAS57)。图41B，Spy0167(GAS25)。所述效价定义为中和50％最大溶血作用所需的稀释倍数。

发明详述

本发明提供可用于治疗酿脓链球菌感染、降低其风险和/或对其进行预防的多组分组合物。在一些实施方式中，本发明的组合物为在儿童中针对由酿脓链球菌感染引起的咽炎提供有效预防的疫苗组合物。

本发明的组合物可用于预防和/或治疗酿脓链球菌感染。本发明的组合物包含GAS抗原组合、编码所述GAS抗原的核酸分子组合或与所述GAS抗原特异性结合的抗体组合。本发明的组合物包含两种或更多种GAS抗原的组合、编码所述GAS抗原的一种或多种核酸分子的组合或与所述GAS抗原特异性结合的抗体的组合。所述GAS抗原为GAS蛋白抗原。除非另有定义，“GAS蛋白抗原”包括全长GAS蛋白以及如下所述的GAS蛋白的片段、融合体和突变体。一些组合物还包含如下定义的A组多糖抗原。本发明还包括包含以下混合物的组合物：GAS抗原的组合、编码所述GAS抗原的核酸分子的组合和特异性结合所述GAS抗原的抗体的组合。

本发明的组合物优选具有一种或多种以下性质：

■产生针对一种或多种酿脓链球菌菌株(例如，M13348、M12EM5、M232071、M6S43)的统计学显著性保护作用；

■引发介导体外细菌杀伤作用(调理吞噬杀伤)的抗体；

■引发使链球菌溶血素O溶血活性失活的抗体；

■引发阻断Spy0416蛋白酶活性的抗体；和/或

■引发防止细胞粘着和/或细胞分裂的抗体。

如以下实施例所述，本发明的组合物在致死攻击模型中提供针对不同小鼠适应性酿脓链球菌菌株的保护作用，引发中和多数酿脓链球菌菌株表达的强效毒素的功能性抗体，并介导体外细菌杀伤作用。

本发明的一些组合物包含选自下组的三种或更多种不同的GAS抗原的组合：Spy0167(也称为链球菌溶血素O、Spy0167或“GAS25”)、Spy0269(也称为“GAS40”)、Spy0416(也称为“GAS57”)、Spy0714(也称为“GAS67”)、Spy1390(也称为“GAS89”)、Spy2000(也称为“GAS100”)、如下定义的突变型Spy0167蛋白和如下定义的突变型Spy0416。

在其它实施方式中，如下所述，本发明的组合物仅包含两种GAS抗原，虽然所述组合物可包含来自其它生物的抗原以及其它组分。一些组合物包含两种GAS抗原，为Spy0167和选自下组的第二GAS抗原：Spy0269、Spy0416、如下所述的突变型Spy0167蛋白、如下所述的突变型Spy0416蛋白、Spy0714、Spy1390和Spy2000。

其它组合物包含两种GAS抗原，为Spy0269和选自下组的第二GAS抗原：Spy0167、突变型Spy0167蛋白、突变型Spy0416蛋白、Spy0714、Spy1390和Spy2000。

一些组合物包含两种GAS抗原，为Spy0416和选自下组的第二GAS抗原：Spy0167、突变型Spy0167蛋白、突变型Spy0416蛋白、Spy0714、Spy1390和Spy2000。

其它组合物包含两种GAS抗原，为突变型Spy0167蛋白和选自下组的第二GAS抗原：Spy0167、Spy0269、Spy0416、突变型Spy0416蛋白、Spy0714、Spy1390和Spy2000。

其它组合物包含两种GAS抗原，为突变型Spy0416蛋白和选自下组的第二GAS抗原：Spy0167、Spy0269、Spy0416、突变型Spy0167蛋白、Spy0714、Spy1390和Spy2000。

一些组合物包含两种GAS抗原，为Spy0714和选自下组的第二GAS抗原：Spy0167、Spy0269、Spy0416、突变型Spy0167蛋白、突变型Spy0416蛋白、Spy1390和Spy2000。

一些组合物包含两种GAS抗原，为Spy1390和选自下组的第二GAS抗原：Spy0167、Spy0269、Spy0416、突变型Spy0167蛋白、突变型Spy0416蛋白、Spy0714和Spy2000。

其它组合物包含两种GAS抗原，为Spy2000和选自下组的第二GAS抗原：Spy0167、Spy0269、Spy0416、突变型Spy0167蛋白、突变型Spy0416蛋白、Spy0714和Spy1390。

可包含于本发明组合物中的其它GAS抗原包括：Spy0019(GAS5)、Spy0163(GAS23)、Spy0385(GAS56)、Spy0714(GAS67)、Spy0737(GAS68)、Spy1274(GAS84)、Spy1361(GAS88)、Spy1390(GAS89)、Spy1733(GAS95)、Spy1882(GAS98)、Spy1979(GAS99)、Spy2000(GAS100)、Spy2016(GAS102)、Spy0591(GAS130)、Spy1105(GAS159)、Spy1718(GAS179)、Spy2025(GAS193)、Spy2043(GAS195)、Spy1939(GAS277)、Spy1625(GAS372)和Spy1134(GAS561)。

GAS抗原的优选组合包括以下组合，各组合还可如下所述包含GAS多糖抗原和/或佐剂如明矾：

i.Spy0167和Spy0269；

ii.Spy0167、Spy0269和Spy0416；

iii.Spy0167和Spy0416；

iv.Spy0167突变体P427L/W535F和Spy0269；

v.Spy0167突变体P427L/W535F、Spy0269和Spy0416；

vi.Spy0167突变体P427L/W535F和Spy0416；

vii.Spy0269和Spy0416突变体D151A/S617A；

viii.Spy0167、Spy0269和Spy0416突变体D151A/S617A；

ix.Spy0167和Spy0416突变体D151A/S617A；

x.Spy0167突变体P427L/W535F、Spy0269和Spy0416突变体

D151A/S617A；和

xi.Spy0167突变体P427L/W535F和Spy0416突变体D151A/S617A。

所述组合物可包含其它组分，如药学上可接受的运载体、其它微生物抗原、佐剂等。具体而言，本文所述任何组合物还可包含如下所述的A组多糖抗原和/或佐剂如明矾。

由于野生型GAS抗原中的GAS M型和GAS分离株之间存在通常由保守氨基酸取代造成的差异，本文提到的GAS氨基酸或多核苷酸序列包括具有某种程度序列相同性的等效氨基酸或多核苷酸序列(参见实施例30和图31-33)。

在一些实施方式中，Spy0167、Spy0269、Spy0416、Spy0714、Spy1390、Spy2000的变体及其公开的突变体的氨基酸序列分别与本文公开的Spy0167、Spy0269、Spy0416、Spy0714、Spy1390、Spy2000氨基酸序列中的任何一个序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。GAS抗原的氨基酸序列和所述GAS抗原变体的氨基酸序列之间的任何差异通常由一个或多个保守氨基酸取代造成。如图31所示，例如，也可能是一个、两个或三个氨基酸缺失。

在一些实施方式中，保守氨基酸取代基于化学性质，包括用一个带正电荷的氨基酸取代另一个带正电荷的氨基酸(例如，H、K、R)、用一个带负电荷的氨基酸取代另一个带负电荷的氨基酸(例如，D、E)、用一个疏水性很高的氨基酸取代另一个疏水性很高的氨基酸(例如，C、F、I、L、M、V、W)、用一个疏水性较低的氨基酸取代另一个疏水性较低的氨基酸(例如，A、G、H、P、S、T、Y)、用一个具有部分疏水性的氨基酸取代另一个具有部分疏水性的氨基酸(例如，K、R)、用一个脂族氨基酸取代另一个脂族氨基酸(例如，A、I、L、M、P、V)、用一个极性氨基酸取代另一个极性氨基酸(例如，A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y)、用一个芳族氨基酸取代另一个芳族氨基酸(例如，F、H、W、Y)以及用一个小氨基酸取代另一个小氨基酸(例如，D、N、T)。

在一些实施方式中，采用BLOSUM62表确定保守氨基酸取代。所述BLOSUM62表是从蛋白质序列区段的约2000个局部多次比对得到的氨基酸取代矩阵，显示超过500组相关蛋白质的高度保守区域(Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1992)。BLOSUM62取代频率可用来限定可引入Spy0167、Spy0269、Spy0416、Spy0714、Spy1390和Spy2000抗原氨基酸序列的保守氨基酸取代。在这些实施方式中，保守取代优选指由大于-1的BLOSUM62值代表的取代。例如，如果氨基酸取代的特征为BLOSUM62值为0、1、2或3，则所述取代具有保守性。根据该系统，优选的保守氨基酸取代的特征为BLOSUM62值至少为1(例如，1、2或3)，而更优选的保守氨基酸取代的特征为BLOSUM62值至少为2(例如，2或3)。

可通过比对Spy0167、Spy0269、Spy0416、Spy0714、Spy1390和Spy2000的各氨基酸序列来鉴定具体的氨基酸取代或改变，如图31中对野生型Spy0416、图32中对野生型Spy0269和图33中对野生型Spy0167所示。例如，根据图31中的比对，表1显示关于SEQ ID NO：1所示的Spy0416氨基酸序列在某些氨基酸位置的一些具体选择。类似地，Spy0269和Spy0167的氨基酸序列中氨基酸差异的选择可分别通过检查图32和图33鉴定。

表1

位置	选择	位置	选择	位置	选择
						38	S，T	74	I，V	104	S，P
40	M，S，T	77	E，K	110	S，P
						49	A，T	85	S，P	228	A或缺失
55	H，P	87	D，G	229	D、E或缺失
						67	K，Q	91	E，K	749	H，R
68	S，P	93	T或缺失
						69	Q，P	102	A，S

以下所述GAS抗原变体优选具有免疫原性和在小鼠模型中赋予抵御GAS致死攻击的保护作用(参见以下实施例)。

在一些实施方式中，组合物包含编码以上公开的GAS蛋白抗原的一种或多种核酸分子。在其它实施方式中，组合物包含编码两种GAS蛋白抗原的不多于两种核酸分子。在其它实施方式中，组合物包含抗体组合，其中各抗体与选自以上公开的GAS蛋白抗原的GAS抗原选择性结合。

Spy0167及其免疫原性突变体

Spy0167(链球菌溶血素，SLO，GAS25)是一种诱导宿主细胞裂解的强效成孔毒素，在WO 02/34771等中有描述。野生型Spy0167的氨基酸序列如SEQ ID NOS：107-119所示。除非另外定义，如下所述，“Spy0167抗原”包括全长Spy0167和Spy0167突变体、片段和融合体。

在一些实施方式中，Spy0167抗原主要由氨基酸序列SEQ ID NO：174(“肽1”)、氨基酸序列SEQ ID NO：175(“肽2”)或氨基酸序列SEQID NO：176(“肽3”)组成。在一些实施方式中，Spy0167抗原从N末端到C末端主要由氨基酸序列SEQ ID NO：175(“肽2”)和与氨基酸序列SEQ ID NO：175共价连接的氨基酸序列SEQ ID NO：176(“肽3”)组成。本文所用的“共价连接”包括直接共价连接键以及通过一个或多个额外氨基酸形成的连接键。在其它实施方式中，Spy0167抗原从N末端到C末端主要由氨基酸序列SEQ ID NO：174、与氨基酸序列SEQ ID NO：174共价连接的甘氨酸残基、与所述甘氨酸共价连接的氨基酸序列SEQ ID NO：175和与氨基酸序列SEQ ID NO：175共价连接的氨基酸序列SEQ ID NO：176组成。

其它Spy0167抗原为比全长Spy0167至少少一个氨基酸的Spy0167片段。优选所述片段保持所述抗原的免疫学性质，如与特异性抗体结合的能力。优选的氨基酸片段包含7个或更多个氨基酸(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50或更多)。

在一些实施方式中，Spy0167抗原为包含氨基酸序列SEQ ID NO：174的单体。在其它实施方式中，Spy0167抗原为从N末端到C末端包含氨基酸序列SEQ ID NO：175和与氨基酸序列SEQ ID NO：175共价连接的氨基酸序列SEQ ID NO：176的单体。在其它实施方式中，Spy0167抗原为从N末端到C末端包含以下的单体：氨基酸序列SEQ ID NO：174、与氨基酸序列SEQ ID NO：174共价连接的甘氨酸残基、与所述甘氨酸共价连接的氨基酸序列SEQ ID NO：175和与氨基酸序列SEQ ID NO：175共价连接的氨基酸序列SEQ ID NO：176。

融合蛋白

如上所讨论，用于本发明的Spy0167抗原可作为单独独立多肽(例如，“肽1”、“肽2”、“肽3”、“肽1+2+3”、“肽2+3”)的形式存在于所述组合物中，但也有实施方式中存在至少两种(即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)抗原以单一多肽链(“融合蛋白”或“杂合多肽”)的形式表达。杂合多肽提供两个主要优点。首先，本身不稳定或者表达较差的多肽可通过加入能够克服该问题的合适杂交伴侣得到改善。其次，商业生产得到简化，因为仅需利用一次表达和纯化即可生产可作抗原应用的两种多肽。

Spy0167的突变形式

溶血试验测定到(例如，参见实施例1)，相对于野生型Spy0167，Spy0167突变形式的溶血活性比野生型Spy0167至少低50％(例如，50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％)，但其具有免疫原性，并优选在小鼠模型中赋予抵御GAS致死攻击的保护作用(参见实施例4、7、8)。Spy0167突变体包括在根据SEQ ID NO：107所示野生型Spy0167序列进行编号的氨基酸P427、W535、C530、A248和D482中的一个或多个位置具有氨基酸改变(即取代、缺失或插入)的突变体。这样的突变体的例子包括P427L(SEQ ID NO：120)、W535F(SEQ IDNO：121)、C530G(SEQ ID NO：122)、ΔA248(SEQ ID NO：123)、W535F/D482N(SEQ ID NO：124)、P427L/W535F(SEQ ID NO：125)、P427L/C530G(SEQ IDNO：126)和P427L/C530G/W535F(SEQ ID NO：127)。

用于本发明的Spy0167突变体包括在位置P427、W535、C530、A248和/或D482的单个、双重、三重氨基酸改变(“单突变体”、“双重突变体”、“三重突变体”)。因此，Spy0167突变体可包含以下突变体：

i.P427L(SEQ ID NO：120)、P427R、P427N、P427C、P427Q、P427E、P427G、P427H、P427I、P427L、P427K、P427M、P427F、P427A、P427S、P427T、P427W、P427Y或P427V；

ii.W535F(SEQ ID NO：121)、W535R、W535N、W535D、W535C、W535Q、W535E、W535G、W535I、W535L、W535K、W535M、W535A、W535P、W535S、W535T、W535Y或W535V；

iii.C530G(SEQ ID NO：122)、C530R、C530N、C530D、C530S、C530Q、C530E、C530A、C530H、C530I、C530L、C530K、C530M、C530F、C530P、C530T、C530W、C530Y或C530V；

iv.D482L、D482R、D482N、D482C、D482Q、D482E、D482G、D482H、D482I、D482L、D482K、D482M、D482F、D482A、D482S、D482T、D482W、D482Y或D482V；

v.A248L、A248R、A248N、A248C、A248Q、A248E、A248G、A248H、A248I、A248L、A248K、A248M、A248F、A248S、A248T、A248W、A248Y或A248V

vi.ΔP427或ΔW535或ΔC530或ΔD482或ΔA248(SEQ ID NO：123)；

和

vii.其组合，如：

1.双重突变体W535F/D482N(SEQ ID NO：124)、P427L/W535F(SEQ ID NO：125)、P427L/C530G(SEQ ID NO：126)、P427L/A248L、P427L/D482L、W535F/C530G、W535F/A248L、W535F/D482L、C530G/A248L和A248L/D482L；以及

2.三重突变体P427L/C530G/A248L、P427L/C530G/D482L、P427L/A248L/D482L、P427L/C530G/W535F(SEQ ID NO：127)、W535F/C530G/A248L、W535F/C530G/D482L、W535F/A248L/D482L和C530G/A248L/D482L

突变型Spy0167蛋白还包括包含如上所述的突变型Spy0167蛋白和另一种GAS抗原的融合多肽。GAS抗原在例如WO 02/34771中公开，包括但不限于GAS39(Spy0266；gi13621542)、GAS40(Spy0269；以下讨论)、GAS42(Spy0287；gi13621559)、GAS45(M5005_Spy0249；gi71910063)、GAS57(Spy0416；以下讨论)、GAS58(Spy0430；gi13621663)、GAS67(Spy0714；gi13621898)、GAS68(Spy0163；gi13621456)、GAS84(SPy1274；gi13622398)、GAS88(Spy1361；gi13622470)、GAS89(Spy1390；gi13622493)、GAS95(SPy1733；gi13622787)、GAS98(Spy1882；gi13622916)、GAS99(Spy1979；gi13622993)、GAS100(Spy2000；gi13623012)、GAS102(Spy2016、gi13623025)、GAS117(Spy0448；gi13621679)、GAS130(Spy0591；gi13621794)、GAS137(Spy0652；gi13621842)、GAS146(Spy0763；gi13621942)、GAS159(Spy1105；gi13622244)、GAS179(Spy1718、gi13622773)、GAS193(Spy2025；gi3623029)、GAS195(Spy2043；gi13623043)、GAS202(Spy1309；gi13622431)、GAS217(Spy0925、gi1362208)、GAS236(Spy1126；gi13622264)、GAS277(Spy1939；gi13622962)、GAS290(SPy1959；gi13622978)、GAS290(SPy1959；gi13622978)、GAS294(Spy1173；gi13622306)、GAS309(Spy0124；gi13621426)、GAS366(Spy1525；gi13622612)、GAS372(Spy1625；gi13622698)、GAS384(Spy1874；gi13622908)、GAS389(Spy1981；gi13622996)、GAS504(Spy1751；gi13622806)、GAS509(Spy1618；gi13622692)、GAS511(Spy1743；gi13622798)、GAS527(Spy1204；gi3622332)、GAS529(Spy1280；gi3622403)、GAS533(Spy1877；gi13622912)、GAS561(Spy1134；gi13622269)、GAS613(Spy01673；gi13622736)和GAS681(spy1152；gi1362228)，以及在下表A-D中列出的其它抗原。这些抗原的gi号用于M1菌株(在可获得时)，但应理解，也可采用来自其它M菌株的等效蛋白质。

本发明的优选Spy0167具有免疫原性但不具有毒性。本文所用的“无毒”表示Spy0167抗原无法与胆固醇结合或无法形成寡聚体，更通常的情况下不促进含胆固醇膜的裂解。可通过例如去掉至少单个半胱氨酸残基使Spy0167蛋白无毒，所述半胱氨酸残基位于可作为巯基激活性溶细胞素特征模式的Spy0167的C末端区段的高度保守区。

本发明的组合物还可包含单个多肽形式的Spy0167突变体的等效物，根据溶血试验确定，相对于野生型Spy0167，所述等效物的溶血活性比野生型Spy0167至少低50％(例如，50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％)，其具有免疫原性，并优选在小鼠模型中赋予抵御GAS致死攻击的保护作用。这样的等效物可包括在除P427、W535、C530、A248和D482以外的位置具有氨基酸缺失、插入和/或取代的突变型Spy0167抗原，包括在N或C末端最多缺失约40个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸)。

Spy0269

GAS40也称为“Spy0269”(M1)、“SpyM3_0197”(M3)、“SpyM18_0256”(M18)和“prgA”，在例如WO 02/34771和WO 2005/032582中有描述。野生型Spy0269的氨基酸序列如SEQ ID NO：50-106和128-130所示。Spy0269抗原特别可用于本发明的组合物，因为Spy0269蛋白在很多M型和这些M型的多个菌株中具有高度保守性(参见WO 2006/042027)。Spy0269始终在全身免疫、攻击和杀菌抗体诱导的动物模型中提供保护作用。

Spy0269蛋白通常包含前导肽序列(例如SEQ ID NO：50的氨基酸1-26)、第一卷曲螺旋区(例如SEQ ID NO：50的氨基酸58-261)、第二卷曲螺旋区(例如SEQ ID NO：50的氨基酸556-733)、亮氨酸拉链区(例如SEQ ID NO：50的氨基酸673-701)和跨膜区(例如SEQ ID NO：50的氨基酸855-866)。在一些实施方式中，前导序列被去除(例如SEQ ID NO：177)。

本发明的组合物还可包含作为单个多肽、具有免疫原性、并优选在小鼠模型中赋予抵御GAS致死攻击的保护作用的Spy0269等效物(例如实施例4、7、8)。

Spy0416及其免疫原性突变体

Spy0416(M1)也称为“GAS57”、“SpyM3_0298”(M3)、“SpyM18_0464”(M18)和“prtS”。Spy0416已鉴定为推定的胞外被膜蛋白酶。参见WO02/34771和US 2006/0258849。17个不同M型(1、2、3、4、6、11、12、18、22、23、28、44/61、68、75、77、89、94)有49个Spy0416序列；根据疾病控制中心(Centers for Disease Control)，在美国所述17个不同M型咽炎病例中占95％以上，占侵染性GAS分离株的约68％。来自各M型的野生型Spy0416抗原的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NOS：1-49所示。本发明的组合物还可包含作为单个多肽、具有免疫原性、并优选在小鼠模型中赋予抵御GAS致死攻击的保护作用的Spy0416等效物。

根据SDS-PAGE或ELISA所检测，相对于野生型Spy0416，本发明的突变型Spy0416抗原对白细胞介素8(IL-8)的蛋白水解活性降低至少50％(例如，50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％)(参见实施例3)，但其具有免疫原性，例如，其在小鼠模型中赋予抵御GAS致死攻击的保护作用。优选的本发明突变型Spy0416不切割其它人细胞因子，如CXCL1/GROα(例如，SEQ ID NO：131)、CXCL2/GROβ(例如，SEQ ID NO：132)、CXCL3/GROγ(例如，SEQ ID NO：133)、CXCL4(例如，SEQ ID NO：134)、CXCL12/SDF-1α(例如，SEQ ID NO：135)、CXCL12/SDF-1β(例如，SEQ ID NO：136)、CXCL12/SDF-1γ(例如，SEQID NO：137)、CXCL5/ENA78(e.g、SEQ ID NO：138)、CXCL6/GCP-2(例如，SEQ ID NO：139)、CXCL7/NAP-2(例如，SEQ ID NO：140)、CXCL9/MIG(例如，SEQ ID NO：141)、CXCL10/IP10(例如，SEQ ID NO：142)、CXCL11(例如，SEQ ID NO：143)、CXCL13(例如，SEQ ID NO：144)、CXCL14(例如，SEQ ID NO：145)和CXCL16(例如，SEQ ID NO：146)。

可用于本发明的Spy0416突变体包括在根据SEQ ID NO：1所示野生型Spy0416序列进行编号的氨基酸D151、H279或S617中的一个或多个位置具有氨基酸改变(即取代、缺失或插入)的突变体，所述氨基酸改变包括在位置D151、H279和/或S617的单个、双重或三重氨基酸改变(“单突变体”、“双重突变体”、“三重突变体”)。因此，Spy0416突变体可包含以下突变体：

i.D151A(SEQ ID NO：147)、D151R、151N、D151C、D151Q、D151E、D151G、D151H、D151I、D151L、D151K、D151M、D151F、D151P、D151S、D151T、D151W、D151Y或D151V；

ii.H279A、H279R、H279N、H279D、H279C、H279Q、H279E、H279G、H279I、H279L、H279K、H279M、H279F、H279P、H279S、H279T、H279W、H279Y或H279V；

iii.S617A(SEQ ID NO：148)、S617R、S617N、S617D、S617C、S617Q、S617E、S617G、S617H、S617I、S617L、S617K、S617M、S617F、S617P、S617T、S617W、S617Y或S617V；

iv.ΔD151或ΔH279或ΔS617；和

v.其组合，如D151A/S617A(SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：198)。

本发明的Spy0416突变体抗原还包括包含如上公开的Spy0416突变体和另一种GAS抗原的融合多肽。GAS抗原在例如WO 02/34771中公开，包括但不限于以下抗原的全部或一部分：Spy0019(GAS5；gi15675086)、Spy0163(GAS23；gi15675077)、Spy0167(GAS25、以上讨论)、Spy0266(GAS39；gi13621542)、Spy0269(GAS40、以上讨论)、Spy0287(GAS42；gi13621559)、M5005_Spy0249(GAS45；gi71910063)、Spy0385(GAS56；gi15675097)、Spy0430(GAS58；gi13621663)、Spy0714(GAS67；gi13621898)、Spy0163(GAS68；gi13621456)、Spy1274(GAS84；gi13622398)、Spy1361(GAS88；gi13622470)、Spy1390(GAS89；gi13622493)、Spy1733(GAS95；13622787)、Spy1882(GAS98；gi13622916)、Spy1979(GAS99；gi13622993)、Spy2000(GAS100；gi13623012)、Spy2016(GAS102；gi15675798)、Spy0448(GAS117；gi13621679)、Spy0591(GAS130；gi13621794)、Spy0652(GAS137；gi13621842)、Spy0763(GAS146；gi15674811)、Spy1105(GAS159；gi13622244)、Spy1718(GAS179、gi13622773)、Spy2025(GAS193；gi3623029)、Spy2043(GAS195；gi15675815)、Spy1309(GAS202；gi13622431)、Spy0925(GAS217；gi1362208)、Spy1126(GAS236；gi13622264)、Spy1939(GAS277；gi13622962)、Spy1959(GAS290；gi13622978)、Spy1173(GAS294；gi13622306)、Spy0124(GAS309；gi13621426)、Spy1525(GAS366；gi13622612)、Spy1625(GAS372；gi13622698)、Spy1874(GAS384；gi13622908)、Spy1981(GAS389；gi13622996)、Spy1751(GAS504；gi13622806)、Spy1618(GAS509；gi13622692)、Spy1743(GAS511；gi13622798)、Spy1204(GAS527；gi3622332)、Spy1280(GAS529；gi3622403)、Spy1877(GAS533；gi13622912)、Spy1134(GAS561；gi13622269)、Spy01673(GAS613；gi13622736)、Spy1152(GAS681；gi1362228)或在下表A-D中公开的其它抗原。这些抗原的gi号用于M1菌株(在可获得时)，但应理解，也可采用来自其它M菌株的等效蛋白质。

本发明还包括作为单个多肽、由SDS-PAGE或ELISA确定不切割IL-8、具有免疫原性并优选在小鼠模型中赋予抵御GAS致死攻击的保护作用的Spy0416突变体等效物(例如实施例4、7、8)。这样的等效物可包括在除D151、H279或S617以外的位置具有氨基酸缺失、插入和/或取代的突变型Spy0416抗原，包括在N或C末端最多缺失约40个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸)。

其它GAS抗原

本发明组合物可包含一种或多种其它GAS抗原。GAS抗原在例如WO02/34771中公开。可用的GAS抗原包括以下抗原的全部或一部分：Spy0737、Spy0019、Spy0163、Spy0266、Spy0287Spy0249、Spy0385、Spy0430、Spy0714、Spy0163、Spy1274、Spy1361、Spy1390、Spy1733、Spy1882、Spy1979、Spy2000、Spy2016、Spy0448、Spy0591、Spy0652、Spy0763、Spy1105、Spy1718、Spy2025、Spy2043、Spy1309、Spy0925、Spy1126、Spy1939、Spy1959、Spy1173、Spy0124、Spy1525、Spy1625、Spy1874、Spy1981、Spy1751、Spy1618、Spy1743、Spy1204、Spy1280、Spy1877、Spy1134和Spy01673。本发明的组合物还可包含作为单个多肽、具有免疫原性、并优选在小鼠模型中赋予抵御GAS致死攻击的保护作用的这些GAS抗原的等效物(例如实施例4、7、8)。例如，Spy0763(GAS146)和Spy1134(GAS561)各保护小鼠免受酿脓链球菌M13348的攻击(与阴性对照20％的存活率相比，其存活率为70％，n＝20)。还参见下表A-D。

表C

表D

片段

上述野生型或突变型GAS蛋白的片段长度可根据特定GAS抗原或其突变体的氨基酸序列而不同，但所述片段优选具有至少7个连续氨基酸，例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多个，最多为比全长野生型或突变型GAS蛋白少一个氨基酸。优选所述片段具有免疫原性，并包含来自所述序列的一种或多种表位。其它优选的片段包括：(1)所鉴定GAS蛋白各自的N末端信号肽，(2)不含N末端信号肽的所鉴定GAS蛋白，和(3)N末端和/或C末端最多缺失(例如可缺失N末端氨基酸残基)10个氨基酸残基(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)的所鉴定的各GAS蛋白。其它片段缺少所述蛋白质的一个或多个结构域(例如，缺少信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。在一些实施方式中，所述片段是Spy0269的氨基酸33-324。

GAS多糖抗原

GAS多糖(PS)是存在于所有GAS菌株中的细胞壁多糖。PS的抗体效价与儿童中的疾病和建群(colonization)反相关。在一些实施方式中，本发明的组合物包含GAS多糖抗原。酿脓链球菌GAS碳水化合物通常的特征是含L-吡喃型鼠李糖(Rhap)骨架的支链结构，所述骨架由交替的α-(1→2)和α-(1→3)键和与交替的鼠李糖环β-(1→3)-连接的D-N-乙酰葡糖胺(GlcpNAc)残基构成(Kreis等，Int.J.Biol.Macromol.17，117-30，1995)。可用于本发明组合物的GAS多糖抗原具有下式：

其中R是末端还原L-鼠李糖或D-GlcpNAc，n是从约3到约30的数字。

本发明所用的GAS多糖抗原可以是如天然情况发现的基本全长的GAS碳水化合物，或可短于天然长度。可解聚全长多糖以产生用于本发明的较短片段，例如，通过在温和酸中水解、通过加热、通过尺寸色谱等。然而，优选采用基本全长的糖。具体而言，优选采用分子量为约10kDa的糖。可通过凝胶过滤测定相对于葡聚糖标准品的分子量。

可相对于天然情况下发现的GAS碳水化合物对所述糖进行化学修饰。例如，可对所述糖进行去-N-乙酰化(部分或完全)、N-丙酰化(部分或完全)等。可通过常规试验评价去乙酰化等例如对免疫原性的作用。

在一些实施方式中，所述GAS多糖抗原与载体如突变的白喉毒素CRM197(和下述其它载体)偶联。如以下实施例所述，PS的CRM197偶联抗体(“GC”)诱导GAS调理吞噬杀伤作用。

GAS蛋白抗原的生产

重组生产

遗传密码的冗余性众所周知。因此，编码本文所述GAS抗原中一种的任何核酸分子(多核苷酸)均可用来重组生产该蛋白质。编码野生型GAS抗原的核酸分子也可采用标准核酸纯化技术从合适的酿脓链球菌分离，或可采用扩增技术如聚合酶链反应(PCR)或通过采用自动合成仪合成。参见Caruthers等，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215，223，1980；Horn等，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225，232，1980；Hunkapiller等，Nature 310，105-11，1984；Grantham等，Nucleic Acids Res.9，r43-r74，1981。

可采用标准分子生物学技术以mRNA为模板制备cDNA分子。之后可采用本领域熟知的分子生物学技术复制cDNA分子。扩增技术如PCR可用来以基因组DNA或cDNA为模板获得本发明多核苷酸的额外拷贝。

如果需要，可使用本领域通常所知方法工程改造多核苷酸以根据各种原因改变抗原编码序列，包括但不限于改变克隆、加工和/或多肽或mRNA产物表达的变化。可采用通过随机片段化进行的DNA改组以及对基因片段和合成寡核苷酸的PCR组装工程改造所述核苷酸序列。例如，可采用定点诱变插入新的限制性位点、改变糖基化形式、改变密码子偏好、产生剪接变体、引入突变等。

序列修饰如加入纯化标记序列或密码子优化可用来促进表达。例如，可用编码标记蛋白如聚组氨酸(“HIS”)或谷胱甘肽S-转移酶(“GST”)的序列取代N末端前导序列。这样的标记蛋白可用来促进表达的蛋白质的纯化、检测和稳定性。可选择特定原核或真核宿主偏好的密码子以提高蛋白质表达率或产生具有所需性质如半衰期长于从天然产生序列生成的转录物的半衰期的RNA转录物。这些方法为本领域熟知，在WO05/032582中有进一步描述。

表达载体

可将编码用于本发明的GAS抗原的核酸分子插入包含插入编码序列转录和翻译必需元件的表达载体。可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有编码序列及合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。

宿主细胞

产生GAS抗原的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆菌是优选的宿主细胞，但其它合适的宿主包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis))、酵母、杆状病毒、哺乳动物细胞等。

可根据宿主细胞株以所需方式调节插入序列表达或加工表达多肽的能力对其进行选择。这样的多肽修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。也可采用切割多肽“前体”形式的翻译后加工以促进正确的插入、折叠和/或发挥功能。可从美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号，20110-2209)获取具有特定细胞机器或翻译后活性的特征性机制的不同宿主细胞，可对其进行选择以确保外源蛋白质的正确修饰和加工。参见WO 01/98340。

可采用公知技术将表达构建体引入宿主细胞，所述技术包括但不限于：运铁蛋白-聚阳离子介导的DNA转移、用裸露或包封核酸进行的转染、脂质体介导的细胞融合、DNA包被胶乳珠的胞内转运、原生质体融合、病毒感染、电穿孔、“基因枪”法和DEAE或磷酸钙介导的转染。

可在适合表达和从细胞培养物回收所述蛋白质的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞。根据所述核苷酸序列和/或所用的表达载体，由转化细胞产生的蛋白质可被分泌出或包含于胞内。本领域技术人员应理解，可将表达载体设计为包含指导可溶性抗原通过原核或真核细胞膜进行分泌的信号序列。

纯化

信号输出序列可包含于重组产生的GAS抗原中，从而可采用已知方法从细胞培养培养基中纯化所述抗原。或者可采用本领域熟知的方法从工程改造的宿主细胞分离重组产生的GAS抗原，并将其与细胞中的其它组分如蛋白质、碳水化合物或脂质分离。这样的方法包括但不限于：尺寸排阻色谱、硫酸铵分级分离、离子交换色谱、亲和色谱和制备型凝胶电泳。纯化GAS抗原的制备物的纯度为至少80％，优选所述制备物的纯度为90％、95％或99％.可通过本领域已知的任何手段如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或RP-HPLC分析来评价所述制备物的纯度。在适当的情况下，可用例如尿素溶解突变型Spy0167蛋白。

化学合成

可采用例如固相技术合成GAS抗原。参见例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，2149 54，1963；Roberge等，Science 269，202 04，1995。可采用人工技术或自动化方法进行蛋白质合成。可采用例如应用生物系统431A肽合成仪(帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))来达到自动化合成。任选地，可单独合成GAS抗原片段并采用化学方法进行结合以产生全长分子。

抗体

本发明的一些组合物包含与本文所述GAS抗原特异性结合的抗体组合。如果在用于免疫化学试验时某抗体提供的检测信号比不同蛋白质提供的检测信号高至少5、10或20倍，则所述抗体与GAS抗原“特异性结合”。与GAS抗原特异性结合的抗体优选不检测免疫化学试验中的其它蛋白质，并可从溶液中免疫沉淀所述GAS抗原。

术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子及其能结合抗原的片段。这些包括杂合(嵌合)抗体分子(例如，Winter等，Nature 349，293-99，1991；美国专利4,816,567)、F(ab′)2和F(ab)片段以及Fv分子、非共价异源二聚体(例如，Inbar等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69，2659-62，1972；Ehrlich等，Biochem 19，4091-96，1980)、单链Fv分子(sFv)(例如，Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，5897-83，1988)、二聚和三聚抗体片段构建体、小体(minibody)(例如，Pack等，Biochem 31，1579-84，1992；Cumber等，J.Immunology 149B，120-26，1992)；人源化抗体分子(例如，Riechmann等，Nature 332，323-27，1988；Verhoeyan等，Science 239，1534-36，1988；和于1994年9月21日公开的英国专利申请公开第GB 2,276,169号)和从这些分子获得的任何功能片段，以及通过非常规方法如噬菌体展示获得的抗体。优选所述抗体为单克隆抗体。获取单克隆抗体的方法为本领域熟知。

通常，需要至少6、7、8、10或12个毗邻的氨基酸以形成表位。然而，包括非毗邻氨基酸的表位可需要更多例如至少15、25或50个氨基酸。可采用各种免疫测定(例如，蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定、免疫组化测定、免疫沉淀或本领域已知的其它免疫化学试验)来鉴定具有所需特异性的抗体。竞争性结合或免疫放射试验的大量实验方案为本领域熟知。这样的免疫测定通常包括检测免疫原和与所述免疫原特异性结合的抗体之间复合体的形成。与GAS抗原特异性结合的抗体制备物在用于免疫化学试验中时通常提供的检测信号比其它蛋白质提供的检测信号高至少5、10或20倍，其如果与“不相关”蛋白质接触则不提供可检测信号。优选所述抗体在免疫化学试验中不检测其它蛋白质，并可从溶液中免疫沉淀所述特定抗原。

与野生型Spy0167特异性结合的抗体显著降低(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％)或消除野生型Spy0167的溶血活性。一些抗体也与上述突变型Spy0167蛋白特异性结合。

与野生型Spy0416特异性结合的抗体显著降低(例如至少50％)或消除Spy0416切割IL-8的能力(实施例5)。抗体可将Spy0416切割IL-8的能力降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％。一些抗体也与上述突变型Spy0416蛋白特异性结合。优选的抗体也降低或消除Spy0416切割其它底物的能力，所述其它底物如IL-8的同源物(例如，CXCL1/GROα、CXCL2/GROβ、CXCL3/GROγ、CXCL4、CXCL12/SDF-1α、CXCL12/SDF-1β、CXCL12/SDF-1γ、CXCL5/ENA78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP10、CXCL11、CXCL13、CXCL14和CXCL16)。一些抗体在用野生型或突变Spy0416重组抗原免疫并用GAS攻击的动物中阻断坏死病损的进展。

根据实施例25中所述的细胞结合试验测定，与Spy0269特异性结合的抗体显著降低(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％)或消除Spy0269与上皮细胞的结合。

抗体生成

GAS抗原可用来免疫哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人，以产生多克隆抗体。如果需要，可将抗原与载体蛋白如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和匙孔

血蓝蛋白偶联。根据宿主种类，可使用各种佐剂以提高免疫应答。这样的佐剂包括但不限于：弗氏佐剂、矿物凝胶(例如氢氧化铝)和表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、普流罗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔

血蓝蛋白和二硝基酚)。在用于人的佐剂中，特别可用BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。

可采用通过连续培养细胞系产生抗体分子的任何技术制备与抗原特异性结合的单克隆抗体。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术(Kohler等，Nature 256，495497，1985；Kozbor等，J.Immunol.Methods 81，3142，1985；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.80，20262030，1983；Cole等，Mol.Cell Biol.62，109120，1984)。

此外，可采用为生产“嵌合抗体”开发的技术，如将小鼠抗体基因和人抗体基因剪接以获得具有合适抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81，68516855，1984；Neuberger等，Nature 312，604608，1984；Takeda等，Nature 314，452454，1985)。也可将单克隆和其它抗体进行“人源化”以防止或降低治疗性使用抗体时，患者对其产生免疫应答的风险。这样的抗体可能与直接用于治疗的人抗体具有显著序列相似性或可能需要改变几个关键残基。可通过定点诱变单个残基来取代不同于人序列的残基或通过嫁接整个互补性决定区域来最大程度减少啮齿动物抗体和人抗体之间的序列差异。

或者，可如下所述采用重组方法生产人源化抗体。与特定抗原特异性结合的抗体可包含部分或完全人源化的抗原结合位点，如U.S.5,565,332中所公开。

或者，可采用本领域已知方法改进用于生产单链抗体的技术，以产生与特定抗原特异性结合的单链抗体。可通过随机组合免疫球蛋白文库的链改组产生具有相关特异性但独特型组成不同的抗体(Burton，Proc.Natl.Acad.Sci.88，1112023，1991)。

也可利用杂交瘤cDNA为模板，采用DNA扩增方法如PCR构建单链抗体(Thirion等，1996，Eur.J.Cancer Prev.5，507-11)。单链抗体可为单特异性或双特异性，可为双价或四价。四价双特异性单链抗体的构建的说明见例如Coloma和Morrison，Nat.Biotechnol.15，159-63，1997。双价双特异性单链抗体的构建的说明见Mallender&Voss，J.Biol.Chem.269，199-206，1994。

如下所述，可采用人工或自动化核苷酸合成来构建编码单链抗体的核苷酸序列，采用标准重组DNA方法将其克隆到表达构建体中，引入细胞以表达所述编码序列。或者，可直接采用例如丝状噬菌体技术产生单链抗体(Verhaar等，Int.J.Cancer 61，497-501，1995；Nicholls等，J.Immunol.Meth.165，81-91，1993)。

也可通过在淋巴细胞群中诱导体内生产或通过如文献所公开方法筛选免疫球蛋白文库或高特异性结合试剂群体来产生与特定抗原特异性结合的抗体(Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.86，38333837，1989；Winter等，Nature 349，293299，1991)。

可如WO 93/03151所公开方法构建嵌合抗体。也可制备衍生自免疫球蛋白的多价多特异性结合蛋白，如WO 94/13804所述的“双抗体”。

可通过本领域熟知的方法纯化抗体。例如，可通过使抗体经过结合相关抗原的柱对抗体进行亲和纯化。然后可采用高盐浓度的缓冲液从所述柱洗脱结合的抗体。

药物组合物

本发明还提供用作药物(例如，用作免疫原性组合物或疫苗)的组合物。本发明的组合物可用于预防酿脓链球菌感染、降低酿脓链球菌感染的风险和/或治疗由酿脓链球菌感染引起的疾病，如菌血症、脑膜炎、产褥热、猩红热、丹毒、咽炎、脓疱病、坏死性筋膜炎、肌炎或中毒性休克综合征。

包含GAS抗原的组合物优选是免疫原性组合物，更优选是疫苗组合物。这样的组合物的pH优选为6-8，优选约为7。可使用缓冲液来维持pH。所述组合物可以是无菌和/或无热原的。所述组合物与人体等张。

本发明疫苗可用于预防或治疗，但通常用于预防。因此，本发明包括酿脓链球菌感染的治疗或预防方法。所述动物优选哺乳动物，最优选人。所述方法包括给予所述动物治疗或预防量的本发明免疫原性组合物。本发明还提供用于治疗酿脓链球菌感染、降低其风险和/或对其进行预防的本发明免疫原性组合物。

如上所述，本发明的一些组合物包含两种不同的GAS抗原。本发明的其它组合物包含编码所述两种抗原的至少一种核酸分子。参见例如，Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology 9：271-283；Donnelly等(1997)Ann.Rev Immunol 15：617-648；Scott-Taylor和Dalgleish(2000)ExpertOpin Investig Drugs 9：471-480；Apostolopoulos和Plebanski(2000)Curr OpinMol Ther 2：441-447；Ilan(1999)Curr Opin Mol Ther 1：116-120；Dubensky等(2000)Mol Med 6：723-732；Robinson和Pertmer(2000)Adv Virus Res55：1-74；Donnelly等(2000)Am J Respir Crit Care Med 162(4Pt 2)：S190-193；Davis(1999)Mt.Sinai J.Med.66：84-90。所述核酸通常为DNA分子，例如质粒形式的。

可用于治疗的本发明的其它组合物包含两种不同抗体，各与所述两种不同GAS抗原其中一种特异性结合。

在一些实施方式中，本发明的组合物可包括一种或多种其它活性试剂。这样的试剂包括但不限于：(a)可用于儿科疫苗的多肽抗原，(b)可用于老年人或免疫受损个体的疫苗中的多肽抗原，(c)编码(a)或(b)的核酸分子，和(d)与(a)或(b)特异性结合的抗体。

其它抗原

本发明的组合物可与一种或多种其它抗原联合给药用于本发明的治疗或预防方法。合适的抗原包括以下列出的抗原。此外，本发明的组合物可用来治疗任何下列病原体引起的感染、降低其风险或对其进行预防。除与下述抗原联用以外，本发明的组合物还可与本文所述的佐剂组合使用。

用于本发明的其它抗原包括但不限于一种或多种以下列出的抗原，或来自一种或多种以下列出的病原体的抗原。

A.细菌抗原

适用于本发明的细菌抗原包括可从细菌分离、纯化或衍生的蛋白质、多糖、脂多糖和外膜囊泡。此外，细菌抗原可包括细菌裂解物和灭活的细菌制剂。细菌抗原可通过重组表达产生。细菌抗原优选包括在细菌生命周期的至少一个阶段中暴露于细菌表面的表位。细菌抗原优选在多种血清型之间具有保守性。细菌抗原包括来自一种或多种下述细菌的抗原以及以下鉴定的特定抗原例子。

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)：脑膜炎抗原可包括纯化或来自脑膜炎奈瑟球菌血清群如A、C、W135、Y和/或B的蛋白质(如参考文献1-7中鉴定的蛋白质)、糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡(参考文献8、9、10、11)。脑膜炎蛋白质抗原可选自粘附蛋白、自身转运蛋白、毒素、获铁蛋白(Fe acquisition protein)或膜相关蛋白(优选完整的外膜蛋白)。

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)：肺炎链球菌抗原可包括来自肺炎链球菌的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白质。糖抗原可选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F。蛋白质抗原可选自WO 98/18931、WO 98/18930、美国专利第6,699,703号、美国专利第6,800,744号、WO97/43303或WO 97/37026中鉴定的蛋白质。肺炎链球菌蛋白可选自聚组氨酸三聚体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125或Sp133。

酿脓链球菌(A组链球菌)：A组链球菌抗原可包括WO 02/34771或WO 2005/032582中鉴定的蛋白质(包括但不限于GAS39(Spy0266)、GAS40(Spy0269，以上讨论)、GAS42(Spy0287)、GAS45(M5005_Spy0249)、GAS57(Spy0416)、GAS58(Spy0430)、GAS67(Spy0714)、GAS68(Spy0163)、GAS84(SPy1274)、GAS88(Spy1361)、GAS 89(Spy1390)GAS95(SPy1733)、GAS98(Spy1882)、GAS99(Spy1979)、GAS100(Spy2000)、GAS102(Spy2016)、GAS117(Spy0448)、GAS130(Spy0591)、GAS137(Spy0652)、GAS146(Spy0763)、GAS159(Spy1105)、GAS179(Spy1718)、GAS193(Spy2025)、GAS195(Spy2043)、GAS202(Spy1309)、GAS217(Spy0925)、GAS236(Spy1126)、GAS277(Spy1939)、GAS294(Spy1173)、GAS309(Spy0124)、GAS366(Spy1525)、GAS372(Spy1625)、GAS384(Spy1874)、GAS389(Spy1981)、GAS504(Spy1751)、GAS509(Spy1618)、GAS290(SPy1959)、GAS511(Spy1743)、GAS527(Spy1204)、GAS529(Spy1280)、GAS533(Spy1877)、GAS561(Spy1134)、GAS613(Spy01673)和GAS681(spy1152))、上述和表A-D中的其它GAS抗原、GAS M蛋白片段的融合物(包括在WO 02/094851、Dale，Vaccine(1999)17：193-200和Dale，Vaccine14(10)：944-948中所述蛋白)、纤连蛋白结合蛋白(Sfb1)、链球菌血红素相关蛋白(Shp)和链球菌溶血素S(SagA)。

粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)：莫拉菌抗原包括WO 02/18595和WO 99/58562中鉴定的抗原、外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。

百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)：百日咳抗原包括来自百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，还任选与百日咳杆菌外膜蛋白(pertactin)和/或凝集原2和3抗原联用。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：金黄色葡萄球菌抗原包括任选地偶联于无毒重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A的5型和8型金黄色葡萄球菌荚膜多糖，如StaphVAX^TM，或衍生自表面蛋白、侵袭素(杀白细胞素、激酶、透明质酸酶)、抑制吞噬细胞吞噬(被膜、A蛋白)、类胡萝卜素、过氧化氢酶产生的表面因子、A蛋白、凝固酶、凝血因子和/或裂解真核细胞膜的膜损伤性毒素(任选地去毒)(溶血素、白细胞毒素、杀白细胞素)的抗原。

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)：表皮葡萄球菌抗原包括黏液相关性抗原(SAA)。

破伤风梭菌(Clostridium tetani)(破伤风)：破伤风抗原包括破伤风类毒素(TT)，优选用作与本发明组合物联用/偶联的载体蛋白。

白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉)：白喉抗原包括白喉毒素，优选去毒，如CRM197。此外，考虑将能够调节、抑制ADP核糖基化或与其相关的抗原与本发明组合物组合/共同给予/偶联。所述白喉类毒素可用作载体蛋白。

流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B(Hib)：Hib抗原包括Hib糖抗原。

铜绿假单胞菌：假单胞菌抗原包括外毒素A、Wzz蛋白、铜绿假单胞菌LPS，更特别是分离自PAO1(O5血清型)的LPS、和/或外膜蛋白包括外膜蛋白F(OprF)(Infect Immun.2001年5月；69(5)：3510-3515)。

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。细菌抗原可来自嗜肺军团菌。

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)：B组链球菌抗原包括WO 02/34771、WO 03/093306、WO 04/041157或WO 2005/002619中鉴定的蛋白质或糖抗原(包括蛋白质GBS 80、GBS 104、GBS 276或GBS322，和来自血清型Ia、Ib、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII和VIII的糖抗原)。

淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)：淋病抗原包括Por蛋白(或膜孔蛋白)如PorB(参见Zhu等，Vaccine(2004)22：660-669)、转移结合蛋白如TbpA和TbpB(参见Price等，Infection and Immunity(2004)71(1)：277-283)、混浊蛋白(opacity protein)(如Opa)、还原可修饰蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制备物(参见Plante等，J.Infectious Disease 182，848-55，2000；另参见例如WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280、WO02/079243)。

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)：沙眼衣原体抗原包括来自血清型A、B、Ba和C(沙眼病原体，引起失明)，血清型L1、L2和L3(与性病淋巴肉芽肿有关)和血清型D-K的抗原。沙眼衣原体抗原也可包括WO 00/37494、WO 03/049762、WO 03/068811或WO 05/0026f19中鉴定的抗原，包括PepA(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH-样(CT242)、L7/L12(CT316)、OmcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)和MurG(CT761)。

苍白密螺旋体(Treponema pallidum)(梅毒)：梅毒抗原包括TmpA抗原。

杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)(引起软下疳)：杜氏嗜血菌抗原包括外膜蛋白(DsrA)。

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)：抗原包括三糖重复或美国专利第6,756,361号中提供的其它肠球菌衍生抗原。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)：幽门螺杆菌抗原包括Cag、Vac、Nap、HopX、HopY和/或脲酶抗原。

腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)：抗原包括腐生性葡萄球菌抗原的160kDa血凝素。

小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)抗原包括LPS(InfectImmun.2002年8月；70(8)：4414)。

大肠杆菌：大肠杆菌抗原可来自肠毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散粘着性大肠杆菌(diffusely adhering E.coli)(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)。

炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)：炭疽杆菌抗原任选去毒，可选自A组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF))，二者可共享共同的B组分，称为保护性抗原(PA)。

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)：鼠疫抗原包括F1荚膜抗原(Infect Immun.2003年1月；71(1)：374-383)、LPS(Infect Immun.1999年10月；67(10)：5395)、鼠疫耶尔森菌V抗原(Infect Immun.1997年11月；65(11)：4476-4482)。

结合分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)：结核病抗原包括脂蛋白、LPS、BCG抗原、抗原85B(Ag85B)的融合蛋白和/或任选配制到阳离子脂质囊泡中的ESAT-6(Infect Immun.2004年10月；72(10)：6148)、结核分枝杆菌(Mtb)异柠檬酸脱氢酶相关抗原(Proc Natl Acad Sci USA.2004年8月24日；101(34)：12652)和/或MPT51抗原(Infect Immun.2004年7月；72(7)：3829)。

立克次体(Rickettsia)：抗原包括外膜蛋白，包括外膜蛋白A和/或B(OmpB)(Biochim Biophys Acta.2004年11月1日；1702(2)：145)、LPS和表面蛋白抗原(SPA)(J Autoimmun.1989年6月；增刊2：81)。

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)：细菌抗原可来自单核细胞增生李斯特菌。

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)：抗原包括WO 02/02606中鉴定的抗原。

霍乱弧菌：抗原包括蛋白酶抗原、LPS，特别是霍乱弧菌II脂多糖、O1Inaba O-特异性多糖、霍乱弧菌O139、IEM108疫苗抗原(Infect Immun.2003年10月；71(10)：5498-504)和/或密闭小带毒素(Zot)。

伤寒沙门菌(伤寒)：抗原包括荚膜多糖，优选偶联物(Vi，即vax-TyVi)。

布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)：抗原包括脂蛋白(如OspA、OspB、OspC和OspD)，其它表面蛋白如OspE相关蛋白(Erps)，饰胶蛋白聚糖结合蛋白(如DbpA)，和抗原性可变的VI蛋白，如与P39和P13相关的抗原(完整的膜蛋白，Infect Immun.2001年5月；69(5)：3323-3334)，以及VlsE抗原性可变蛋白(J Clin Microbiol.1999年12月；37(12)：3997)。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)：抗原包括牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白(OMP)。

克雷伯菌(Klebsiella)：抗原包括OMP包括OMP A，或任选偶联于破伤风类毒素的多糖。

本发明的其它细菌抗原可以是上述任何一种荚膜抗原、多糖抗原或蛋白质抗原。其它细菌抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制备物。此外，抗原包括活、减毒和/或纯化形式的任何上述细菌。本发明的抗原可来自革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。本发明的抗原可来自好氧或厌氧细菌。

此外，任何上述细菌来源的糖(多糖、LPS、LOS或寡糖)可与另一种试剂或抗原如载体蛋白(例如CRM197)偶联。这种偶联可以是糖上羰基部分与蛋白质氨基基团还原胺化实现的直接偶联，如美国专利5,360,897和Can J Biochem Cell Biol.1984年5月；62(5)：270-5所述。或者，糖可以通过接头，如采用《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)，1996和CRC，《蛋白质偶联与交联化学》(Chemistry of Protein Conjugation andCross-Linking)，1993中提供的琥珀酰胺或其它连接键偶联。

B.病毒抗原

适用于本发明的病毒抗原包括灭活(或杀伤的)病毒，减毒病毒，裂解的病毒制剂，纯化的亚单位制剂，可分离、纯化或来自病毒的病毒蛋白，以及病毒样颗粒(VLP)。病毒抗原可来自在细胞培养物或其它基质上增殖的病毒。或者，可重组表达病毒抗原。病毒抗原优选包含在病毒生命周期的至少一个阶段中暴露于病毒表面的表位。病毒抗原优选在多种血清型或分离物之间具有保守性。病毒抗原包括来自一种或多种下述病毒的抗原以及下面鉴定的特定抗原例子。

正粘病毒：病毒抗原可来自正粘病毒，如甲型、乙型和丙型流感病毒。正粘病毒抗原可选自一种或多种以下病毒蛋白，包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、一种或多种转录酶组分(PB1、PB2和PA)。优选的抗原包括HA和NA。

流感抗原可来自暴发流行期之间(一年一次)的流感毒株。或者，流感抗原可来自可能引起流行爆发的毒株(即与目前流行毒株的血凝素相比具有新型血凝素的流感毒株，或对禽类对象具有致病性并可能水平传播给人群的流感毒株，或对人具有致病性的流感毒株)。

副粘病毒科病毒：病毒抗原可来自副粘病毒，如肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)和麻疹病毒(麻疹)。

肺炎病毒：病毒抗原可来自肺炎病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒、小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒。肺炎病毒优选为RSV。肺炎病毒抗原可选自一种或多种以下蛋白，包括表面蛋白融合物(F)，糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)，基质蛋白M和M2，核衣壳蛋白N、P和L，以及非结构蛋白NS1和NS2。优选肺炎病毒抗原包括F、G和M。参见例如J Gen Virol.2004年11月；85(Pt 11)：3229。肺炎病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或来自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PIV二者的组分。

副粘病毒：病毒抗原可来自副粘病毒，如1-4型副流感病毒(PIV)、流行性腮腺炎、仙台病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒优选PIV或流行性腮腺炎。副粘病毒抗原可选自一种或多种以下蛋白质：血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基质蛋白(M)。优选的副粘病毒蛋白包括HN、F1和F2。副粘病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或来自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PIV二者的组分。市售流行性腮腺炎疫苗包括单价形式或与麻疹和风疹疫苗(MMR)联用的减毒活流行性腮腺炎病毒。

麻疹病毒：病毒抗原可来自麻疹病毒，如麻疹。麻疹病毒抗原可选自一种或多种以下蛋白质：血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基质(M)。市售麻疹疫苗包括减毒的活麻疹病毒，通常与流行性腮腺炎和风疹(MMR)联用。

小核糖核酸病毒：病毒抗原可来自小核糖核酸病毒，如肠道病毒、鼻病毒、肝RNA病毒、心病毒和口蹄疫病毒。优选来自肠道病毒，如脊髓灰质炎病毒的抗原。

肠道病毒：病毒抗原可来自肠道病毒，如1、2或3型脊髓灰质炎病毒，1-22型和24型柯萨奇病毒A，1-6型柯萨奇病毒B，1-9、11-27和29-34型埃可(ECHO)病毒和68-71型肠道病毒。肠道病毒优选脊髓灰质炎病毒。肠道病毒抗原优选选自一种或多种以下衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4。市售脊髓灰质炎疫苗包括灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。

肝RNA病毒：病毒抗原可来自肝RNA病毒，如甲型肝炎病毒(HAV)。市售HAV疫苗包括灭活的HAV疫苗。

披膜病毒：病毒抗原可来自披膜病毒，如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒。优选来自风疹病毒(rubivirus)，如风疹(Rubella)病毒的抗原。披膜病毒抗原可选自E1、E2、E3、C、NSP-1、NSPO-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原优选选自E1、E2或E3。市售风疹疫苗含有冷适应活病毒，通常与流行性腮腺炎和麻疹疫苗(MMR)联用。

黄病毒：病毒抗原可来自黄病毒，如蜱传脑炎(TBE)、登革热(1、2、3或4型)、黄热病、日本脑炎、西尼罗河脑炎、圣路易脑炎、俄国春夏脑炎、波瓦生脑炎。黄病毒抗原可选自PrM、M、C、E、NS-I、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b或NS5。黄病毒抗原优选选自PrM、M和E。市售TBE疫苗包括灭活病毒疫苗。

瘟病毒：病毒抗原可来自瘟病毒，如牛病毒性腹泻(BVDV)、经典猪霍乱(CSFV)或边界病(BDV)病毒。

肝DNA病毒：病毒抗原可来自肝DNA病毒，如乙型肝炎病毒。肝DNA病毒抗原可选自表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。市售HBV疫苗包含含有表面抗原S蛋白的亚单位疫苗。

丙型肝炎病毒：病毒抗原可来自丙型肝炎病毒(HCV)。HCV抗原可选自E1、E2、E1/E2、NS 345聚蛋白、NS 345-核心聚蛋白、核心和/或非结构区肽中的一种或多种(Houghton等，Hepatology(1991)14：381)。

杆状病毒：病毒抗原可来自杆状病毒，如狂犬病病毒(Lyssavirus)(狂犬病(Rabies)病毒)和水泡病毒(VSV)。杆状病毒抗原可选自糖蛋白(G)、核蛋白(N)、大蛋白(L)、非结构蛋白(NS)。市售狂犬病病毒疫苗包含用人双倍体细胞或胎猕猴肺细胞培养的杀伤病毒。

杯状病毒科：病毒抗原可来自杯状病毒科，如诺沃克病毒和诺沃克样病毒，如夏威夷病毒和雪山病毒。

冠状病毒：病毒抗原可来自冠状病毒、SARS、人呼吸道冠状病毒、禽感染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)。冠状病毒抗原可选自刺突(S)、包膜(E)、基质(M)、核衣壳(N)或血凝素-酯酶糖蛋白(HE)。冠状病毒抗原优选来自SARS病毒。SARS病毒抗原在WO 04/92360中有描述。

逆转录病毒：病毒抗原可来自逆转录病毒，如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。肿瘤病毒抗原可来自HTLV-1、HTLV-2或HTLV-5。慢病毒抗原可来自HIV-1或HIV-2。逆转录病毒抗原可选自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu或vpr。HIV抗原可选自gag(p24gag和p55gag)、env(gp160和gp41)、pol、tat、nef、rev vpu、小蛋白(优选p55gag和gp140v缺失)。HIV抗原可来自一种或多种以下毒株：HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-1US4。

呼肠孤病毒：病毒抗原可来自呼肠孤病毒，如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多壁虱热病毒(Coltivirus)。呼肠孤病毒抗原可选自结构蛋白λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、σ1、σ2或σ3，或非结构蛋白σNS、μNS或σ1s。优选的呼肠孤病毒抗原可来自轮状病毒。轮状病毒抗原可选自VP1、VP2、VP3、VP4(或切割产物VP5和VP8)、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSP5。优选的轮状病毒抗原包括VP4(或切割产物VP5和VP8)和VP7。

细小病毒：病毒抗原可来自细小病毒，如细小病毒B19。细小病毒抗原可选自VP-1、VP-2、VP-3、NS-1或NS-2。细小病毒抗原优选衣壳蛋白VP-2。

丁型肝炎病毒(HDV)：病毒抗原可来自HDV，特别是源自HDV的δ-抗原(参见例如，美国专利第5,378,814号)。

戊型肝炎病毒(HEV)：病毒抗原可来自HEV。

庚型肝炎病毒(HGV)：病毒抗原可来自HGV。

人疱疹病毒：病毒抗原可来自人疱疹病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)。人疱疹病毒抗原可选自立即早期蛋白(α)、早期蛋白(β)和晚期蛋白(γ)。HSV抗原可来自HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原可选自糖蛋白gB、gC、gD或gH，融合蛋白(gB)，或免疫逃避蛋白(gC、gE或gI)。VZV抗原可选自核心、核衣壳、间层(tegument)或包膜蛋白。可购得减毒的活VZV疫苗。EBV抗原可选自早期抗原(EA)蛋白、病毒衣壳抗原(VCA)或膜抗原(MA)的糖蛋白。CMV抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(如gB和gH)或间层蛋白。

乳头多瘤空泡病毒：抗原可来自乳头多瘤空泡病毒，如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原优选来自血清型6、11、16或18。HPV抗原可选自衣壳蛋白(L1)和(L2)或E1-E7，或其融合物。优选将HPV抗原配制成病毒样颗粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原可选自VP1、VP2或VP3。

还提供了包括在《疫苗(Vaccines)》第4版(Plotkin和Orenstein编，2004)；《医学微生物学(Medical Microbiology)》第4版(Murray等编，2002)；《病毒学(Virology)》第3版(W.K.Joklik编，1988)；《基础病毒学(Fundamental Virology)》第2版(B.N.Fields和D.M.Knipe，编，1991)中的抗原、组合物、方法和微生物，考虑将它们与本文所述组合物联用。

C.真菌抗原

用于本发明的真菌抗原可来自一种或多种下述真菌。

真菌抗原可来自皮肤真菌，包括絮状表皮霉菌(Epidermophytonfloccusum)，奥杜安氏小孢子菌(Microsporum audouini)，犬小孢子菌(Microsporum canis)，扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)，马小孢子菌(Microsporum equinum)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypsum)，矮小小孢子菌(Microsporum nanum)，同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)，石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum)，麦格毛癣菌(Trichophyton megnini)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，小鼠毛癣菌(Trichophyton quinckeanum)，红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)，断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)，疣状毛癣菌(Trichophytonverrucosum)，疣状毛癣菌(T.verrucosum)白色(album)变种、盘形(discoides)变种、赭色(ochraceum)变种，紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和/或蜜块状毛癣菌(Trichophyton faviforme)。

真菌病原体可来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲霉(Aspergillusflavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽裂殖菌(Blastoschizomycescapitatus)、白假丝酵母(Candida albicans)、烯醇酶假丝酵母(Candidaenolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假丝酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、苜蓿腐酶(Pythiumn insidiosum)、皮屑芽胞菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌(Malassezia spp.)、着色真菌(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌(Wangiella spp.)、孢子丝菌(Sporothrix spp.)、蛙粪霉(Basidiobolus spp.)、耳霉(Conidiobolusspp.)、根霉(Rhizopus spp.)、毛霉(Mucor spp.)、犁头霉(Absidia spp.)、被孢霉(Mortierella spp.)、小克银汉霉(Cunninghamella spp.)、瓶霉(Saksenaeaspp.)、链格孢菌(Alternaria spp.)、弯孢菌(Curvularia spp.)、长蠕孢菌(Helminthosporium spp.)、镰胞菌(Fusarium spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)、青霉(Penicillium spp.)、链核霉菌(Monolinia spp.)、丝核菌(Rhizoctonia spp.)、拟青霉(Paecilomyces spp.)、皮司霉(Pithomyces spp.)和枝孢霉(Cladosporiumspp.)。

本领域熟知产生真菌抗原的方法(参见美国专利第6,333,164号)。在优选的方法中，提取溶解组分并与真菌细胞获得的不溶性组分分离，所述真菌细胞已基本除去或至少部分除去细胞壁，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获得活真菌细胞；获得已基本除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞；破碎已基本除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞；获得不溶性组分；以及从所述不溶性组分中提取和分离溶解组分。

D.STD抗原

本发明组合物可包含来自性传播疾病(STD)的一种或多种抗原。这样的抗原可预防或治疗STD，如衣原体、生殖器疱疹、肝炎(如HCV)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或软下疳(参见WO00/15255)。抗原可来自一种或多种病毒或细菌STD。用于本发明的病毒STD抗原可来自例如HIV、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳头瘤病毒(HPV)和肝炎(HCV)。用于本发明的细菌STD抗原可来自例如淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体、苍白密螺旋体、杜氏嗜血菌、大肠杆菌和无乳链球菌。以上描述了来自这些病原体的特定抗原的例子。

E.呼吸道抗原

本发明组合物可包含来自引起呼吸道疾病的病原体的一种或多种抗原。例如，呼吸道抗原可来自呼吸道病毒，如正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、VZV和冠状病毒(SARS)。呼吸道抗原可来自引起呼吸道疾病的细菌，如肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、百日咳博德特菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、肺炎衣原体、炭疽杆菌和粘膜炎莫拉菌。以上描述了来自这些病原体的特定抗原的例子。

F.儿科疫苗抗原

本发明组合物可包含适用于儿童对象的一种或多种抗原。儿童对象通常年龄小于约3岁，或小于约2岁，或小于约1岁。儿童用抗原可在6个月、1年、2年或3年的时间中多次给药。儿童用抗原可来自可靶向儿童群体的病毒和/或儿童群体易感的病毒。儿童用病毒抗原包括来自正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和流行性腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠道病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)和水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)中一种或多种的抗原。儿童用细菌抗原包括来自肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、酿脓链球菌(A组链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、流感嗜血杆菌B(Hib)、铜绿假单胞菌、无乳链球菌(B组链球菌)和大肠杆菌中一种或多种的抗原。以上描述了来自这些病原体的特定抗原的例子。

G.适用于老年人或免疫受损个体的抗原

本发明组合物可包含适用于老年人或免疫受损个体的一种或多种抗原。这样的个体可能需要更频繁地接种较高剂量或用佐剂配制的疫苗，以提高他们对靶抗原的免疫应答。目标用于老年人或免疫受损个体的抗原包括来自一种或多种以下病原体的抗原：脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌(A组链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、流感嗜血杆菌B(Hib)、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、无乳链球菌(B组链球菌)、粪肠球菌、幽门螺杆菌、肺炎衣原体、正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和流行性腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠道病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)。以上描述了来自这些病原体的特定抗原的例子。

H.适用于青少年疫苗的抗原

本发明组合物可包含适用于青少年对象的一种或多种抗原。青少年可能需要用先前已给予的儿童用抗原作加强接种。以上描述了可能适用于青少年的儿童用抗原。此外，青少年可以是接受来自STD病原体抗原的目标人群，以保证在性行为开始之前产生保护性或治疗性免疫力。以上描述了可能适用于青少年的STD抗原。

I.抗原制剂

在本发明的其它方面，提供了产生已吸附抗原的微粒的方法。所述方法包括：(a)通过分散含有(i)水、(ii)去污剂、(iii)有机溶剂和(iv)生物可降解聚合物的混合物提供乳液，所述生物可降解聚合物选自聚(α-羟酸)、多羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐或聚氰基丙烯酸酯。相对于有机溶剂，所述聚合物在混合物中存在的浓度通常为约1％到约30％，而所述去污剂在混合物中存在的去污剂-聚合物的重量比通常为约0.00001∶1到约0.1∶1(更通常为约0.0001∶1到约0.1∶1，约0.001∶1到约0.1∶1，或约0.005∶1到约0.1∶1)；(b)除去乳液中的有机溶剂；和(c)使抗原吸附于微粒表面上。在某些实施方式中，相对于有机溶剂，所述生物可降解聚合物存在的浓度为约3％到约10％。

本文使用的微粒由可灭菌、无毒且生物可降解的材料形成。这样的材料包括但不限于聚(α-羟酸)、多羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。优选地，本发明所用微粒衍生自聚(α-羟酸)，具体而言，衍生自聚(丙交酯)(″PLA″)或D，L-丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，如D，L-丙交酯-乙交酯共聚物(″PLG″或″PLGA″)，或D，L-丙交酯和己内酯的共聚物。所述微粒可衍生自具有各种分子量的各种聚合物原料，在共聚物，例如PLG的情况下，各种丙交酯∶乙交酯比例的选择是主要问题，部分取决于共同给药的大分子。以下更全面地讨论这些参数。

其它抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制备物。

美国专利序列号09/581，772中提供了其它配制方法和抗原(特别是肿瘤抗原)。

J.抗原参考文献

以下参考文献包括可与本发明组合物联用的抗原：

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64国际专利申请WO00/67161.

以上所有引用的专利、专利申请和期刊论文的内容均如完全列出那样通过引用纳入本文。

在采用糖或碳水化合物抗原时，优选与载体蛋白偶联以增强免疫原性。参见Ramsay等(2001)Lancet 357(9251)：195-196；Lindberg(1999)Vaccine17增刊2：S28-36；Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond34：163-168；Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13：113-133，vii；Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47：563-567；欧洲专利0477508；美国专利第5,306,492号；WO98/42721；《偶联疫苗(Conjugate Vaccines)》(Cruse等编)ISBN 3805549326，特别是在卷10：48-114；Hermanson(1996)《生物偶联技术(Bioconjugate Techniques)》ISBN：0123423368或012342335X。优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。特别优选CRM197白喉类毒素。

其它载体多肽包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白(EP-A-0372501)、合成肽(EP-A-0378881和EP-A 0427347)、热休克蛋白(WO 93/17712和WO94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668和EP A 0471177)、来自流感嗜血杆菌的蛋白D(WO 00/56360)、细胞因子(WO 91/01146)、淋巴因子、激素、生长因子、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(WO 00/61761)、摄铁蛋白(iron-uptake protein)(WO 01/72337)等。在混合物包含血清群A和C的荚膜糖时，可优选MenA糖∶MenC糖的比例(w/w)大于1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。不同的糖可与相同或不同类型的载体蛋白偶联。可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。

必要时可对有毒的蛋白质抗原去毒，例如通过化学和/或遗传手段对百日咳毒素去毒。

药学上可接受的载体

除上述组分以外，本发明的组合物通常包含一种或多种“药学上可接受的载体”。这些包括本身不诱导有害于接受所述组合物的个体的抗体产生的任何载体。合适的载体通常是代谢慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。这样的载体为本领域普通技术人员熟知。组合物也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。关于药学上可接受组分的充分讨论参见Gennaro(2000)《雷明登：药物科学与实践(Remington：The Science andPractice of Pharmacy)》，第20版，ISBN：0683306472。

免疫调节剂

佐剂

本发明的疫苗可与其它免疫调节剂联合给药。具体而言，组合物通常含有佐剂。用于本发明的佐剂包括但不限于一种或多种以下所述试剂：

A.含矿物质的组合物

本发明中适合用作佐剂的含矿物质的组合物包括无机盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括无机盐，如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等(例如参见《疫苗设计……(VaccineDesign…)》(1995)的第8和9章，Powell和Newman编ISBN：030644867X，Plenum出版社)，或不同矿物质化合物的混合物(例如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选磷酸盐过量)，这些化合物可采取任何合适的形式(例如，凝胶、晶体、无定形等)，优选吸附于盐。所述含矿物质的组合物也可配制为金属盐颗粒(WO00/23105)。

本发明的疫苗中可包含铝盐，使Al³⁺剂量为每剂0.2-1.0mg。

在一个实施方式中，用于本发明的基于铝的佐剂是明矾(硫酸钾铝(AlK(SO₄)₂))，或明矾衍生物，其通过将抗原与明矾在磷酸盐缓冲液中混合在原位形成，之后用碱如氢氧化铵或氢氧化钠滴定和沉淀。

用于本发明疫苗制剂的另一种基于铝的佐剂是氢氧化铝佐剂(Al(OH)₃)，或晶体羟基氧化铝(AlOOH)，其为极佳的吸附剂，表面积约为500m²/g。或者提供磷酸铝佐剂(AlPO₄)或羟基磷酸铝，其包含磷酸根基团代替氢氧化铝佐剂的一些或所有羟基基团。本文提供的优选的磷酸铝佐剂为无定形形式，并可溶于酸性、碱性和中性介质。

在另一个实施方式中，本发明的佐剂同时包含磷酸铝和氢氧化铝。在其一个更具体的实施方式中，所述佐剂中磷酸铝的含量大于氢氧化铝，如磷酸铝和氢氧化铝的重量比例为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或大于9∶1。更具体而言，疫苗中存在的铝盐为每剂疫苗0.4-1.0mg，或每剂疫苗0.4-0.8mg，或每剂疫苗0.5-0.7mg，或每剂疫苗约0.6mg。

通常，优选的基于铝的佐剂或多种基于铝的佐剂如磷酸铝和氢氧化铝的比例通过优化分子之间的静电吸引力进行选择，使抗原在所需pH下携带与佐剂相反的电荷。例如，磷酸铝佐剂(等电点＝4)在pH 7.4时吸附溶菌酶，但不吸附清蛋白。如果清蛋白是吸附靶，则选择氢氧化铝佐剂(等电点为11.4)。或者用磷酸盐预处理氢氧化铝降低其等电点，使其成为碱性更大抗原的优选佐剂。

B.油乳液

适合用作本发明佐剂的油乳液组合物包含角鲨烯-水乳液，如MF59(5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％斯盘85，用微流化仪配制成亚微米颗粒)。参见WO90/14837。另参见Podda，Vaccine(2001)19：2673-2680；Frey等，Vaccine(2003)21：4234-4237。将MF59用作FLUAD^TM流感病毒三价亚单位疫苗的佐剂。

用于组合物的特别优选的佐剂是亚微米水包油乳液。本文所用的优选亚微米水包油乳液是任选包含各种量MTP-PE的角鲨烯/水乳液，如包含4-5％w/v角鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)和/或0.25-1.0％斯盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)，并任选包含N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳液，例如，被称为“MF59”的亚微米水包油乳液(国际公开第WO90/14837号；美国专利第6,299,884和6,451,325号；Ott等，刊于《疫苗设计：亚单位和佐剂方法(Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach)》(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)Plenum出版社，纽约，1995，277-296页)。MF59包含4-5％w/v角鲨烯(例如4.3％)、0.25-0.5％w/v吐温80和0.5％w/v斯盘85，并任选包含各种量的MTP-PE，采用微流化仪如110Y型微流化仪(马萨诸塞州纽顿的微流体公司(Microfluidics，Newton，MA))配制为亚微米颗粒。例如，MTP-PE存在的量为约0-500μg/剂，更优选0-250μg/剂，最优选0-100μg/剂。本文所用的术语“MF59-0”指以上缺乏MTP-PE的亚微米水包油乳液，而术语MF59-MTP指包含MTP-PE的制剂。例如，“MF59-100”每剂包含100μgMTP-PE，依此类推。MF69是本文所用的另一种亚微米水包油乳液，其包含4.3％w/v角鲨烯、0.25％w/v吐温80和0.75％w/v斯盘85，并任选包含MTP-PE。另一种亚微米水包油乳液是MF75，也称为SAF，其包含10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普流罗尼克-嵌段聚合物(pluronic-blocked polymer)L121和thr-MDP，也微流化形成亚微米乳液。MF75-MTP指包含MTP如每剂100-400μg MTP-PE的MF75制剂。

WO90/14837和美国专利6,299,884和6,451,325详细描述了用于所述组合物的亚微米水包油乳液、其制备方法和免疫刺激剂如胞壁酰肽。

也可将完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)用作本发明中的佐剂。

C.皂苷制剂

也可将皂苷制剂用作本发明中的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的分离自皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophillapaniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。

已采用高效薄层色谱(HP-TLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对皂苷组合物进行纯化。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选QS21。美国专利5,057,540公开了制备QS21的方法。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇(参见WO96/33739)。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可以用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。对ISCOM的进一步描述见EP0109942、WO 96/11711和WO96/33739。ISCOM可任选不含其它去污剂。参见WO00/07621。

开发基于皂苷的佐剂的综述可参见Barr等，Advanced Drug DeliveryReviews(1998)32：247-271。另参见Sjolander等，Advanced Drug DeliveryReviews(1998)32：321-338。

D.病毒体和病毒样颗粒(VLP)

也可将病毒体和病毒样颗粒(VLP)用作本发明中的佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白质。其通常无病原性，不能复制，且通常不含任何天然病毒基因组。可用重组方法产生或从全病毒分离得到所述病毒蛋白。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括来自流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。对VLP的进一步讨论见WO03/024480、WO03/024481和Niikura等，Virology(2002)293：273-280；Lenz等，Journal ofImmunology(2001)5246-5355；Pinto等，Journal of Infectious Diseases(2003)188：327-338；和Gerber等，Journal of Virology(2001)75(10)：4752-4760。对病毒体的进一步讨论见例如，Gluck等，Vaccine(2002)20：B10-B16。免疫强化重建的流感病毒体(IRIV)可用作鼻内三价INFLEXAL^TM产品{Mischler和Metcalfe(2002)Vaccine 20增刊5：B 17-23}和INFLUVAC PLUS^TM产品的亚单位抗原递送系统。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如：

(1)肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物

这样的衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是含4、5或6条酰化链的3脱-O-酰基单磷酰脂质A混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见EP 0689454中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以通过0.22微米膜过滤除菌(参见EP 0689454)。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC 529。参见Johnson等(1999)Bioorg Med Chem Lett9：2273-2278。

(2)脂质A衍生物

脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。对OM-174的描述见例如Meraldi等，Vaccine(2003)21：2485-2491和Pajak等，Vaccine(2003)21：836-842。

(3)免疫刺激性寡核苷酸

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与之后的鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的序列)。含有回文或聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也显示出免疫刺激性。

CpG可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。鸟苷可任选地被类似物如2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代。参见Kandimalla等，Nucleic Acids Research(2003)31(9)：2393-2400；WO02/26757和WO99/62923中可能的类似物取代的例子。CpG寡核苷酸的佐剂作用详见Krieg，Nature Medicine(2003)9(7)：831-835；McCluskie等，FEMSImmunology and Medical Microbiology(2002)32：179-185；WO98/40100；美国专利第6,207,646号；美国专利第6,239,116号和美国专利第6,429,199号。

CpG序列可能导向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla等，Biochemical Society Transactions(2003)31(第3部分)：654-658。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞应答，如CpG-B ODN。对CpG-A和CpG-B ODN的讨论见Blackwell等，J.Immunol.(2003)170(8)：4061-4068；Krieg，TRENDS inImmunology(2002)23(2)：64-65和WO01/95935。优选CpG为CpG-A ODN。

优选将CpG寡核苷酸构建成其5’端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，Kandimalla等BBRC(2003)306：948-953；Kandimalla等，Biochemical Society Transactions(2003)31(第3部分)：664-658；Bhagat等BBRC(2003)300：853-861和WO03/035836。

(4)ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物

细菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所述蛋白获自大肠杆菌(即大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。将去毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂的描述见WO95/17211，将其用作胃肠道外佐剂的描述见WO98/42375。所述佐剂优选去毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LTR192G。将ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72用作佐剂的描述可见于以下参考文献：Beignon等，Infection and Immunity(2002)70(6)：3012-3019；Pizza等，Vaccine(2001)19：2534-2541；Pizza等，Int.J.Med.Microbiol(2000)290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten等，Infection and Immunity(2000)68(9)：5306-5313；Ryan等，Infection and Immunity(1999)67(12)：6270-6280；Partidos等，Immunol.Lett.(1999)67(3)：209-216；Peppoloni等，Vaccines(2003)2(2)：285-293；和Pine等，(2002)J.Control Release(2002)85(1-3)：263-270。优选根据Domenighini等，Mol.Microbiol(1995)15(6)：1165-1167中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的比对进行氨基酸取代编号。

F.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球(Singh等(2001)J.Cont.Rele.70：267-276)或粘膜粘着剂如聚丙烯酸的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂。参见WO99/27960。

G.微粒

微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径为～100nm至～150μm，更优选～200nm至～30μm，最优选～500nm至～10μm的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选丙交酯-乙交酯共聚物，并任选经处理而具有带负电荷的表面(例如用SDS处理)或带正电荷的表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。

H.脂质体

对适合用作佐剂的脂质体制剂的例子的描述见美国专利第6,090,406号、美国专利第5,916,588号和EP 0626169。

I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。WO99/52549。这样的制剂还包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇(WO01/21207)的组合，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇(WO 01/21152)的组合。

优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。

J.聚磷腈(PCPP)

对PCPP制剂的描述见例如，Andrianov等，“通过聚磷腈水溶液的凝聚制备水凝胶微球(Preparation of hydrogel microspheres by coacervation ofaqueous polyphophazene solutions)”，Biomaterials(1998)19(1-3)：109-115和Payne等，“从聚磷腈基质释放蛋白质(Protein Release from PolyphosphazeneMatrices)”，Adv.Drug.Delivery Review(1998)31(3)：185-196。

K.胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺去甲-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。

L.咪唑并喹啉化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹啉化合物的例子包括咪喹莫德及其类似物，对其进一步的描述见Stanley，Clin Exp Dermatol(2002)27(7)：571-577；Jones，Curr Opin Investig Drugs(2003)4(2)：214-218；和美国专利4,689,338、5,389,640、5,268,376、4,929,624、5,266,575、5,352,784、5,494,916、5,482,936、5,346,905、5,395,937、5,238,944和5,525,612。

M.缩氨基硫脲化合物

缩氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和筛选所有适合用作本发明佐剂的化合物的方法包括WO04/60308所述内容。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

N.色胺酮化合物

色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和筛选所有适合用作本发明佐剂的化合物的方法包括WO04/64759所述内容。色胺酮化合物在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

本发明也可包含以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明：

(1)皂苷和水包油乳液(WO 99/11241)；

(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO94/00153)；

(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；

(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL 12(任选+固醇)(WO98/57659)；

(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；

(6)SAF，含10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普流罗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化形成亚微米乳液或涡旋形成较大粒径的乳液；

(7)RIBI^TM佐剂系统(RAS)(瑞比免疫化学公司(Ribi Immunochem))，含2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述细胞壁组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DETOX^TM)；和

(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+无毒LPS衍生物(如3dPML)。

(9)一种或多种无机盐(如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(如包含CpG基序的核苷酸序列)。

O.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

铝盐和MF59是用于可注射流感疫苗的优选佐剂。细菌毒素和生物粘着剂是用于粘膜递送疫苗如鼻腔疫苗的优选佐剂。

治疗方法

本发明提供采用上述组合物诱导或增强对酿脓链球菌的免疫应答的方法。所述免疫应答优选为保护性，并可包括抗体和/或细胞介导的免疫(包括全身和粘膜免疫)。免疫应答包括加强应答。

上述GAS抗原、核酸分子或抗体的组合可包含于单个组合物中以便同时给药。或者，GAS抗原、核酸分子或抗体的组合可依次给药。例如，在所述组合包含Spy0167、Spy0269和Spy0416或其突变体或片段时，这3个抗原可在单个组合物中同时给药或在不同的组合物中依次给药。在该情况中，本发明提供：用于给予已接受Spy0269和/或Spy0416的动物的Spy0167；用于给予已接受Spy0167和/或Spy0416的动物的Spy0269；和用于给予已接受Spy0167和/或Spy0269的动物的Spy0416。

青少年和儿童(包括幼童和婴儿)可接受用于预防的疫苗，治疗性疫苗通常给予青少年或成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，例如，以评价其安全性、剂量、免疫原性等。

由酿脓链球菌引起且本发明组合物可降低其风险、对其进行预防或治疗的疾病包括但不限于：咽炎(如链球菌性扁桃体炎)、猩红热、脓疱病、丹毒、蜂窝组织炎、败血症、中毒性休克综合征、坏死性筋膜炎和后遗症如风湿热和急性肾小球肾炎。所述组合物也可有效抵御其他链球菌，例如GBS。

确定免疫应答功效的测试

评价治疗性治疗的功效的一种方式包括在给予本发明组合物之后监测GAS感染。评价预防性治疗的功效的一种方式包括在给予所述组合物之后监测针对本发明组合物中GAS抗原的免疫应答。

评价本发明免疫原性组合物中组分蛋白质的免疫原性的另一种方式是重组表达GAS抗原并通过免疫印迹方法筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者血清之间的阳性反应表明该患者已对所研究的蛋白质产生免疫应答，即所述蛋白质是免疫原。也可利用该方法鉴定优势免疫蛋白质和/或表位。

检测治疗性治疗的功效的另一种方式包括在给予本发明组合物之后监测GAS感染。检测预防性治疗的功效的一种方式包括在给予所述组合物之后同时监测针对GAS攻击的全身免疫应答(如监测IgG1和IgG2a产生水平)和粘膜免疫应答(如监测IgA产生水平)。通常，血清特异性抗体应答在免疫后但攻击前进行测定，而粘膜特异性抗体应答在免疫后且攻击后测定。

本发明的疫苗组合物可在给予宿主例如人之前在体外和体内动物模型中评价。特别有用的小鼠模型包括腹膜内免疫之后进行腹膜内攻击或鼻内攻击的模型。

本发明免疫原性组合物的功效也可通过用所述免疫原性组合物接种动物模型(例如，豚鼠或小鼠)并确定GAS攻击之后获得的保护作用的水平来进行体内测定。

体内功效模型包括但不限于：(i)采用人GAS血清型的小鼠感染模型；(ii)小鼠疾病模型，其为一种采用小鼠适应性GAS菌株，如在小鼠中特别具有毒力的M23菌株的小鼠模型；和(iii)采用人GAS分离物的灵长类模型。

所述免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答其中之一或两者兼有。所述免疫应答可以是改善的、或增强的、或改变的免疫应答。所述免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答其中之一或两者兼有。优选所述免疫应答为增强的全身和/或粘膜应答。

增强的全身和/或粘膜免疫力表现为增强的TH1和/或TH2免疫应答。增强的免疫应答优选包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA的产生增加。

优选粘膜免疫应答为TH2免疫应答。粘膜免疫应答优选包括IgA产生增加。

活化的TH2细胞增强抗体产生，因此在应对胞外感染方面具有价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可导致产生IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞，用于将来的保护作用。

TH2免疫应答可包括以下一种或多种：TH2免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)增加，或者IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞产生增加。增强的TH2免疫应答优选包括IgG1产生增加。

TH1免疫应答可包括以下一种或多种：CTL增加，与TH1免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-2、IFNγ和TNFβ)增加，活化的巨噬细胞增加，NK活性增加，或者IgG2a产生增加。增强的TH1免疫应答优选包括IgG2a产生增加。

本发明的免疫原性组合物可单独使用或与其它GAS抗原联用，并任选与能引发Th1和/或Th2应答的免疫调节剂联用。

本发明还包括包含一种或多种免疫调节剂例如无机盐如铝盐和含CpG基序的寡核苷酸的免疫原性组合物。更优选所述免疫原性组合物同时包含铝盐和含CpG基序的寡核苷酸。或者所述免疫原性组合物包含ADP核糖基化毒素，如去毒的ADP核糖基化毒素和含CpG基序的寡核苷酸。优选地，一种或多种免疫调节剂包括佐剂。所述佐剂可选自TH1佐剂和TH2佐剂中的一种或多种。

本发明的组合物优选同时引发细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答，以有效抵御GAS感染。该免疫应答优选诱导持久(如中和)抗体和细胞介导的免疫力，可在接触一种或多种GAS抗原时迅速作出反应。

在一个特别优选的实施方式中，所述免疫原性组合物包含引发中和抗体应答的一种或多种GAS抗原和引发细胞介导免疫应答的一种或多种GAS抗原。通过该方式，中和抗体应答预防或抑制初始GAS感染，而能够引发增强的Th1细胞应答的细胞介导免疫应答预防GAS感染的进一步扩散。

本发明的组合物通常直接给予患者。本发明的组合物可经各种不同途径单独或作为组合物的一部分给药。对某些组合物可能宜采用某些途径，导致产生更有效的免疫应答，优选CMI应答，或引起副作用的可能性较低，或者更易于给药。

递送方法包括胃肠道外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌内或组织间隙注射)和直肠、口服(例如，片剂或喷雾剂)、阴道、局部、透皮(例如参见WO 99/279610)、经皮(例如参见WO02/074244和WO02/064162)、鼻内(例如参见WO03/028760)、眼部、耳部和肺部或其它粘膜给药。

例如，本发明的组合物可经全身途径或粘膜途径或透皮途径给药，或其可将其直接给予特定组织。本文所用的术语“全身给药”包括但不限于任何胃肠道外给药途径。具体而言，胃肠道外给药包括但不限于皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌内或胸骨内注射，静脉内、动脉内或肾脏透析输注技术。所述全身胃肠道外给药优选为肌内注射。本文所用的术语“粘膜给药”包括但不限于口服、鼻内、阴道内、直肠内、气管内、肠部和眼部给药。

剂量治疗可采用单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径如胃肠道外初次和粘膜加强、粘膜初次和胃肠道外加强等给予各剂量。

本发明组合物可以各种形式制备。例如，可将组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的可注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体运载体的固体形式(例如冻干组合物)。可将组合物制备为口服给药制剂，如片剂或胶囊、喷雾剂或糖浆(任选调味)。可将组合物制备为采用细粉或喷雾的肺部给药制剂，例如吸入剂。可将组合物制备为栓剂或阴道栓。可将组合物制备为鼻部、耳部或眼部给药制剂，例如滴剂。组合物可以是试剂盒形式，设计成恰在给予患者之前重建结合组合物。这样的试剂盒可包含一种或多种突变型Spy0167或液体形式的其它抗原以及一种或多种冻干抗原。

用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的GAS抗原或其它抗原，以及所需的任何其它组分，如抗生素。“免疫有效量”指在以单剂量或一系列剂量的一部分给予个体时可增强可测定免疫应答，或预防或减少临床症状的量。

本发明的免疫原性组合物可与抗生素治疗方案联合给予。在一个实施方式中，在给予本发明组合物之前给予抗生素。在另一个实施方式中，在给予本发明组合物之后给予抗生素。适用于治疗GAS感染的抗生素的例子包括但不限于：青霉素或其衍生物或氯林肯霉素、头孢菌素、糖肽类(例如万古霉素)和环丝氨酸。

组合物中活性试剂的量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如，非人灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。所述量会落入可通过常规试验确定的较宽范围。

试剂盒

本发明还提供包括一个或多个本发明组合物容器的试剂盒。组合物可为液体形式或可为冻干形式，各个抗原也可如此。合适的组合物容器包括例如，瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由各种材料，包括玻璃或塑料制成。容器可具有无菌存取口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液包或小瓶)。

所述试剂盒还可包括含有药学上可接受的缓冲剂如磷酸盐缓冲盐水、林格溶液或右旋糖溶液的第二容器。其还可包括最终使用者可用的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、填充剂、针和注射器。所述试剂盒还可包括含另一种活性试剂例如抗生素的第二或第三容器。

所述试剂盒还可包括包装插页，其包含诱导针对酿脓链球菌的免疫力或者用于治疗酿脓链球菌感染的方法的书面说明。所述包装插页可以是未经批准的包装插页草稿，或可以是经食品药物管理局(FDA)或其他管理机构批准的包装插页。

本文中引用的所有专利、专利申请和参考文献均明确地通过引用纳入本文。以上内容在总体上描述了本发明。参照以下具体实施例可获得更全面的理解，所述实施例仅用于说明的目的，不意在对本发明的范围构成限制。

实施例1

溶血试验

采用PBS+0.5％BSA在具有U型底的96孔板中制备Spy0167或Spy0167突变体的连续稀释液。用PBS将1ml绵羊血液洗涤三次(3000xg离心)，将血细胞悬浮在5ml PBS中。将等体积的悬浮液加入50μl的各毒素稀释液中，37℃温育30分钟。采用溶于水的曲通(Triton)(2％)产生100％溶血作用，将PBS+0.5％BSA用作阴性对照。然后将孔板在1000xg离心5分钟，小心将上清液转移到96孔平底板。在540nm读出吸光度。将一个溶血单位(HU)定义为用2％曲通处理血细胞获得50％最大裂解度所需的Spy0167或Spy0167突变体的量。

实施例2

对Spy0167突变型抗原体内毒性的评价

静脉内注射抗原.用PBS+2mM DTT溶液稀释野生型或突变型Spy0167抗原的PBS溶液，然后注射100ml到小鼠尾静脉内。观察小鼠2-3天。注射野生型Spy0167通常在几分钟内导致死亡。

体内致死率抑制试验.就免疫血清介导的致死率抑制而言，将每只小鼠10μg的野生型Spy0167(100μg/ml PBS溶液，2mM DTT)与抗Spy0167血清或对照血清(获自仅接种佐剂的小鼠)在室温下“颠倒式(end over end)”旋转温育20分钟。温育之后，通过向尾静脉内进行静脉内注射将样品接种到小鼠中。观察小鼠2-3天。

急性体内毒性.采用每只小鼠10μg剂量的野生型Spy0167作为阳性对照，将仅注射弗氏佐剂作为阴性对照，评价急性体内毒性。将每只小鼠10μg的野生型Spy0167与野生型Spy0167抗血清或对照血清温育，并如上所述接种到小鼠内。

实施例3

Spy0416蛋白水解活性的失活

SDS-PAGE.将IL-8与野生型Spy0416或Spy0416突变体温育。将温育混合物上样到SDS-PAGE，通过银染色显示。野生型Spy0416释放两个条带：8kDa(活性形式)和6kDa(失活被切割的IL-8)。Spy0416突变体仅释放一个条带，其对应于未切割的IL-8，如对照反应中的情况(不含酶)。

ELISA。将IL-8与野生型Spy0416或Spy0416突变体以三种不同浓度温育，采用对所述细胞因子具有特异性但无法识别被切割失活形式的抗体测试温育混合物中未切割IL-8的存在。将结果表示为反应0、8和24小时后未切割IL-8的百分比，计算如下：

其中“对照混合物”是在时间点0不含酶的反应混合物。

实施例4

GAS抗原的保护能力

将GAS抗原用来免疫小鼠以测试其赋予抵御GAS致死攻击的保护作用的能力。在第0、21和35天腹膜内给予所述抗原，任选与佐剂一起给予。在第三次免疫两周后取血样。然后用GAS菌株对小鼠进行鼻内攻击(例如，50μl中10⁸cfu GAS菌株3348M1)。在10-14天的时间段内监测存活状况。

实施例5

Spy0416抗体对Spy0416介导的IL-8切割的剂量依赖性抑制作用

通过用纯化的重组蛋白免疫CD1小鼠产生Spy0416野生型和失活突变体的特异性抗血清。在存在或缺乏Spy0416抗血清(1∶50和1∶5000)或存在针对野生型Spy0416形成的单克隆抗体的情况下，将IL-8(10μg/ml)与野生型Spy0416以两种不同条件温育：(1)温育8小时，0.1μg/ml Spy0416和(2)温育24小时，0.05μg/ml Spy0416。然后通过ELISA测试温育混合物中未切割IL-8是否存在。结果显示Spy0416抗血清或单克隆抗体对Spy0416介导的IL-8切割具有剂量依赖性抑制作用。

实施例6

针对野生型或突变型Spy0167(Spy0167)的抗体抑制Spy0167溶血作用

采用50ng/ml(3.5HU)毒素，使用佐剂(例如，弗氏佐剂、明矾或MF59^TM)测试实现Spy0167溶血活性降低50％所需的抗体效价。将单独的佐剂作为阴性对照。

实施例7

皮下攻击模型中GAS抗原组合的保护能力

用单一GAS抗原(Spy0167、Spy0416或Spy0269)或GAS抗原组合(Spy0167+Spy0416+Spy0269或Spy0416+Spy0269)免疫小鼠。然后用GAS的SF370M1菌株皮下感染小鼠，引起皮肤损伤。通过测定损伤大小来确定GAS抗原或抗原组合的保护作用。

在该模型中，采用Spy0167+Spy0416+Spy0269组合或Spy0416+Spy0269组合相比于单独采用任何这些GAS抗原获得的保护作用，可获得协同保护作用。实际上，所述测试组合提供的保护作用与采用GAS M1蛋白提供的保护作用相当。参见图1。

实施例8

突变型GAS抗原组合的保护能力

基本如实施例4所述测试GAS突变体抗原组合(Spy0167突变体抗原P427L/W535F和Spy0416突变体抗原D151A/S617A)针对GAS各菌株鼻内攻击的保护能力。结果见表2所示。

表2

实施例9

Spy0416突变体的制备

通过与C5a蛋白酶进行比较，鉴定了Spy0416中推定构成蛋白酶催化位点的三个氨基酸：D151、H279和S617。为获得所述酶的失活形式，通过重叠序列延伸PCR(SOE-PCR)进行剪接向Spy0416编码序列中引入造成D151A和/或S617A氨基酸改变的核苷酸取代。

D151A取代

进行三个PCR反应：

然后用Nde-Sal消化PCR产物3，并将其引入用相同酶消化的pET21_57his。通过DNA测序选择包含正确的符合读框取代的克隆(pET21_57his_D151A)。

S617A取代

进行三个PCR反应：

然后用Sal-Xho消化PCR产物6，并将其引入用相同酶消化的pET21_57his。通过DNA测序选择包含正确的符合读框取代的克隆(pET21_57his_S617A)。

D151A+S617A取代

用Sal-Xho消化PCR产物6，并将其引入用相同酶消化的pET21_57his_D151A。通过DNA测序选择包含正确的符合读框取代的克隆(pET21_57his_D151A+S617A)。

表达单突变和双突变蛋白，并采用三个色谱步骤进行纯化：离子交换色谱(Q琼脂糖(Sepharose)HP)、羟基磷灰石色谱和凝胶过滤色谱。

实施例10

D151A点突变引起Spy0416蛋白水解活性失活

Spy0416突变体D151A表达为重组组氨酸标记蛋白。两种类试验表明该突变体已丧失切割IL-8的能力。

SDS-PAGE

将IL-8与野生型Spy0416或Spy0416突变体D151A温育。将温育混合物上样到SDS-PAGE，通过银染色显示。结果见图12所示。野生型Spy0416(泳道2和3)释放两个条带：8kDa(活性形式)和6kDa(失活被切割的IL-8)。相比之下，Spy0416突变体D151A仅释放一个条带，其对应于未切割的IL-8，如对照反应中的情况(不含酶)。

ELISA

将IL-8与野生型Spy0416或Spy0416突变体D151A以三种不同浓度温育，采用对所述细胞因子具有特异性但无法识别被切割失活形式的抗体测试温育混合物中未切割IL-8是否存在。结果见图4所示，将其表示为反应0、8和24小时后未切割IL-8的百分比，计算如下：

其中“对照混合物”是在时间点0不含酶的反应混合物。

如图3所示，野生型Spy0416在8小时后几乎完全使IL-8失活，即使在较低浓度也如此，而用突变酶处理的IL-8则观察不到失活作用。

实施例11

Spy0416突变体S617A和Spy0416双突变体D151A+S617A不切割IL-8

Spy0416突变体S617A和Spy0416双突变体D151A+S617A表达为组氨酸标记蛋白，如实施例2所述在IL-8失活实验中进行测试。

SDS-PAGE

将IL-8与野生型Spy0416(组氨酸标记或未标记)或各Spy0416突变体D151A、S617A和D151AS+S617A温育24小时。将温育混合物上样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶，通过银染色显示。两个实验的结果见图4A和4B所示。Spy0416S617A突变体和GAS D151+S617A突变体二者均无法切割IL-8，即使在浓度比野生型Spy0416高100倍的浓度下也是如此。

ELISA

采用相同样品进行ELISA试验，以证实单个和双重氨基酸取代消除Spy0416切割IL-8的能力。图5所示结果表明，与野生型Spy0416释放20-40％的未切割IL-8相比，所述突变体在温育24小时之后释放100％的未切割IL-8。

实施例12

Spy0416突变体的保护能力与用野生型Spy0416获得的保护能力类似。

采用Spy0416突变体D151A和D151A+S617A免疫小鼠以测试其相比于野生型Spy0416赋予抵御GAS致死攻击的保护作用的能力。两个实验(各20只小鼠)的结果总结于下，以平均存活率百分比表示。

表3

	小鼠数量	死亡数量	存活率％
				PBS+弗氏佐剂	40	26	35
192M1+弗氏佐剂	20	0	100
				57野生型+弗氏佐剂	40	12	70
57D151A+弗氏佐剂	40	6	85
				57D151A-S617A+弗氏佐剂	40	9	78

实施例13

纯化的失活突变体显示为单个肽，相比之下，野生型Spy0416仅存在两个非共价连接的蛋白质片段的形式。

获得的野生型Spy0416主要有两个片段的形式，其中一个约23kDa，一个为150kDa。所述两个片段在Ni螯合亲和纯化或凝胶过滤中不分离，但在SDS-PAGE上显示为两个不同条带(图6)。N末端测序证实所述23kDa片段是Spy0416的N末端部分(SEQ ID NO：50的氨基酸34-244)，而所述150kDa片段是C末端区域(SEQ ID NO：50的氨基酸245-1603)。

与野生型Spy0416相比，所获得的本发明Spy0416突变体是分子量更高(174kDa)的蛋白质，缺乏所述23kDa条带(参见图7，其显示部分纯化的野生型Spy0416和Spy0416突变体上样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的实验结果)。

实施例14

多克隆抗血清对Spy0416介导的IL-8切割的剂量依赖性抑制作用

通过用纯化的重组蛋白免疫CD1小鼠产生Spy0416野生型和失活突变体的特异性小鼠抗血清。

在存在或缺乏Spy0416抗血清(1∶50和1∶5000)的情况下，将IL-8(10μg/ml)与野生型Spy0416以两种不同条件温育：(1)温育8小时，0.1μg/mlSpy0416和(2)温育24小时，0.05μg/ml Spy0416。然后通过ELISA测试温育混合物中未切割IL-8是否存在。图8A和8B所示结果表明小鼠抗血清对Spy0416介导的IL-8切割具有剂量依赖性抑制作用。

实施例15

野生型和突变Spy0167蛋白的克隆

通过PCR采用表4所示SF370基因组的引物扩增编码野生型和突变型Spy0167蛋白的基因。

用NheI-XhoI消化PCR产物，将其与用相同酶切割的pet24b+载体(诺瓦基公司(Novagen))连接。用连接反应转化大肠杆菌DH5α电感受态细胞。加入LBPTK培养基，在37℃温育1小时后，在250rpm搅拌，将细菌接种到含50μg/ml卡那霉素的LBPTK平板上。通过菌落PCR鉴定阳性菌落。

从含50μg/ml卡那霉素的LBPTK培养基中的过夜培养物制备阳性菌落的质粒，通过DNA测序进行分析，证实了T7聚合酶启动子之下的预期插入基因。所述克隆基因的最终DNA和蛋白质序列见序列表所示。参见表5。

表4

表5

用正确构建体转化大肠杆菌BL21(DE3)(诺瓦基公司)感受态细胞。加入LBPTK培养基，在37℃温育1小时后，在250rpm搅拌，将细菌接种到含50μg/ml卡那霉素的LBPTK平板上。在25℃培养BL21(DE3)pet24b+Spy0167野生型无标记细胞，用1mM IPTG进行诱导。通过SDS-PAGE验证克隆表达(无标记，图15A和15B；组氨酸标记，图16)。

实施例16

组氨酸标记蛋白的纯化

将大肠杆菌沉淀悬浮在裂解缓冲液中，在室温混合30-40分钟。在30-40000xg将裂解物离心20-25分钟，将上清液上样到洗涤缓冲液A平衡的柱(含1ml Ni活化螯合琼脂糖快流树脂的Poly-Prep柱)。将上样树脂用洗涤缓冲液A洗涤三次并用洗涤缓冲液B洗涤三次。用洗脱缓冲液将蛋白质洗脱在含终浓度为2mM的DTT的Eppendorf管中。用Bradford试剂对总洗脱蛋白质进行定量测定，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析(图15和16)。

缓冲液

裂解缓冲液：

10ml B-PER^TM(细菌蛋白提取试剂，皮尔斯公司(Pierce)，目录号78266)

终浓度为0.1mM的MgCl₂

100单位的DNAsi I(西格玛公司(Sigma)，目录号D-4263)

终浓度为1mg/ml的溶菌酶(西格玛公司，目录号L-7651)

洗涤缓冲液A：50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 8.0

洗涤缓冲液B：20mM咪唑，50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 8.0

洗脱缓冲液：250mM咪唑，50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 8.0

实施例17

无标记蛋白的纯化

裂解物制备

将约80-110g细菌培养物沉淀悬浮在补充有6片COMPLETE

蛋白酶抑制剂、10ml 0.2M EDTA pH 7.5(终浓度5mM)、10ml 100mg/ml溶菌酶溶液、8ml 10000K单位/ml DNA酶I溶液和1ml 50mM MgCl₂溶液的200-280ml B-PER^TM试剂(皮尔斯公司)中。通过将细菌悬浮液振荡60分钟直至获得均匀悬浮液来达到细菌裂解。

在13000rpm(25400xg)离心60分钟之后，采用0.22μm过滤器过滤上清液，并用H₂O稀释直至获得1.8-1.9mS的电导率。将pH调整到8.0。通过Bradford法测定蛋白质浓度。

阴离子交换色谱

将如上所述处理的来自裂解物的上清液上样到之前用30mM Tris，pH8.0平衡的HP 50/10Q琼脂糖柱(约200ml)。收集流通物。合并包含Spy0167蛋白的组分，用10mM磷酸钠，pH 6.8透析。通过Bradford法测定蛋白质浓度。

缓冲液A：30mM TRIS，pH 8.0

缓冲液B：30mM TRIS，1M NaCl，pH 8.0

平衡和上样：0％B

梯度：0-25％B5CV-25％B2CV

洗涤：100％B2CV+3CV

通量：20ml/分钟

组分体积：14ml

羟基磷灰石色谱

将之前获得的合并物上样到之前用10mM磷酸钠，pH 6.8平衡的CHT20柱。收集流通物。

缓冲液A：10mM磷酸钠，pH 6.8

缓冲液B：500mM磷酸钠，pH 6.8

洗涤：8CV

洗涤：30％B6CV

梯度：30-100％B(10CV)

洗涤：100％B

通量：5ml/分钟

组分体积：5ml

将组分等份上样到还原和非还原条件下的12％Criterion凝胶。合并包含Spy0167蛋白的组分，通过Bradford法测定蛋白质浓度。

凝胶过滤色谱

采用Amicon过滤器浓缩收集的合并物以获得＜10ml的体积。将浓缩的材料上样到用至少3-4柱体积的PBS平衡的HiLoad Superdex 200 26/60.

缓冲液：PBS

洗脱：等度

通量：2.5ml/分钟

组分体积：5ml

合并包含Spy0167蛋白的组分，通过Bradford法测定蛋白质浓度。根据Abs 0.1％(＝1g/l)1.119采用紫外测定法另外估计蛋白质浓度。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质纯度(图18)。

实施例18

溶血试验

定量溶血试验的方案

采用PBS+0.5％BSA在具有U型底的96孔板中制备毒素的连续稀释液。用PBS将1ml绵羊血液洗涤三次(3000xg离心)，将血细胞悬浮在5ml PBS中。将等体积的悬浮液加入50μl的各毒素稀释液中，37℃温育30分钟。采用溶于水的曲通(2％)产生100％溶血作用，将PBS+0.5％BSA用作阴性对照。然后将孔板在1000xg离心5分钟，小心将上清液转移到96孔平底板。在540nm读出吸光度。

包含野生型Spy0167和Spy0167突变体P427L的大肠杆菌提取物的比较

采用PCR从SF370M1基因组扩增编码Spy0167P427L的基因，将其克隆到载体pET21b+中，使组氨酸标记蛋白在大肠杆菌BL21DE3中表达。采用表达类似量野生型和突变型链球菌溶血素O蛋白的大肠杆菌的可溶性提取物(参见图12)进行溶血试验以比较所述两种抗原的细胞溶解性质。试验的结果如图9所示，其表明突变蛋白质的毒性比野生型至少低100倍。

纯化野生型Spy0167和Spy0167突变体P427L的比较

根据组氨酸标记重组蛋白的纯化标准方案纯化Spy0167P427L突变体(图10)。采用不同浓度的纯化的野生型和突变蛋白重复溶血试验，证实细胞溶解活性降低。

包含组氨酸标记和无标记的野生型Spy0167和Spy0167突变体P427L的大肠杆菌提取物的溶血活性

我们比较了用无组氨酸标记的野生型重组Spy0167(rSpy0167)转化的大肠杆菌(BL21DE3，诺瓦基公司，编号71382-pET24)和无组氨酸标记的P427L突变体rSpy0167转化的大肠杆菌(BL21 DE3，诺瓦基公司，编号71382-pET24)的裂解物溶血活性。将用不含插入基因的pET24转化的大肠杆菌BL21 DE3(诺瓦基公司，编号71382)作为阴性对照。阳性对照是包含2％曲通的低渗水溶液。阴性对照是蛋白质稀释缓冲液(包含0.5％BSA的PBS，pH 7.4)。

通过测定上清液在540nm的吸光度(A_540nm)确定溶血作用。效价计算为具有50％最大A_540nm的稀释度。

结果见表6和7以及图13所示。这些数据表明，在相同条件下突变体P427L的溶血性比野生型Spy0167低1000倍。

表6

大肠杆菌	CFU/ml
		阴性对照	3.9x10⁸
野生型rSpy0167(无标记)	1.2x10⁹
		P427L rSpy0167(无标记)	1.03x10⁹

表7

野生型Spy0167和各种Spy0167突变体的比较

将野生型Spy0167的溶血活性与若干不同Spy0167突变体的溶血活性进行比较。结果见以下图20和表8所示。将一个溶血单位(HU)定义为用2％曲通处理血细胞获得50％最大裂解度所需的毒素的量。

表8

蛋白质	HU/mg	HU/mg-Spy0167/突变体
			rSpy0167野生型	22760	1
C530G	620	37
			W535F	160	146
W535F-D482N	＜＜20	＞＞1000
			P427L	约20	约1000
Δala248	＜＜20	＞＞1000
			阴性对照	＜＜20	＞＞1000

由于蛋白质纯度存在差异，对黑体显示的溶血单位/mg突变体估计过高；然而，很明显：(1)突变体W535F的溶血性低于突变体C530G；(2)突变体P427L的溶血性比野生型低约1000倍，比其它两种突变体W535F和C530G低约6-25倍；和(3)突变体Δ248的溶血性肯定低于野生型。

胆固醇的作用

细胞在30℃生长，用1mM IPTG在25℃进行诱导以及OD_600nm达到约0.4-0.6后，检验获得的两份PBS-BSA 0.5％五倍连续稀释液：大肠杆菌裂解物或含200mg/ml胆固醇的大肠杆菌裂解物的溶血活性。用获自裂解细菌的50微升蛋白质制备物处理等体积的2％绵羊红细胞的PBS溶液，诱导3小时后，用裂解缓冲液(B-PER溶液-皮尔斯公司、1mM MgCl₂、100K单位/ml DNA酶(西格玛公司)和溶菌酶(西格玛公司))理30-40分钟。然后离心不溶性组分(15分钟，21000xg，4℃)，将上清液(大肠杆菌裂解物)转移到含终浓度为5mM的DTT的新Eppendorf管中。

在该条件下，胆固醇直到采用100倍稀释倍数才抑制野生型或突变Spy0167，因此，对突变体诱导裂解无影响。相比之下，野生型诱导裂解显著降低。阴性对照诱导的裂解不受胆固醇影响，表明胆固醇诱导的抑制作用具有特异性。参见表9和图14。

表9

实施例19

对溶血作用的抑制作用

方案

采用PBS+0.5％BSA在具有U型底的96孔板中制备野生型或突变型Spy0167蛋白(不含佐剂或含明矾或MF59^TM作为佐剂)免疫的小鼠血清的连续两倍稀释液。适当时将用PBS或仅用佐剂免疫的小鼠血清作为阴性对照。加入等体积的50-100ng/ml(3.5-7HU)毒素的PBS+0.5％BSA溶液，在室温将孔板搅拌(800rpm)温育20分钟。温育之后，将50ml该溶液转移到新的96孔板，加入等体积的绵羊血细胞悬浮液(用PBS洗涤3次)，在37℃温育30分钟。然后将孔板在1000xg离心1分钟，将上清液小心转移到96孔平底板，在540nm读出吸光度。在下述结果中，抑制效价表示为将曲通诱导的溶血作用降低50％的血清稀释度。

野生型Spy0167抗血清对Spy0167溶血作用的抑制作用

抗野生型Spy0167抗血清对Spy0167溶血作用的抑制作用如图21-23和表10-12所示。抗Spy0167血清效价在1/7,000到1/14,000之间(算术平均数，1/12,167±2,714)。阴性对照血清(弗氏佐剂)效价在1/375到1/4,000之间(算术平均数，1/1,854±1,384)。

表10(图示见图22)

表11

表12(图示见图23)

ng/ml Spy0167	溶血作用％
		1.6	4
3.1	3
		6.3	6
12.5	30
		25	94
50	100
		100	100
200	100

野生型Spy0167、化学去毒野生型Spy0167和Spy0167突变体溶血活性的滴定

野生型Spy0167、化学去毒野生型Spy0167和Spy0167突变体(P427L；P427L+W535F)溶血活性的滴定如表13所示。

表13

针对突变型Spy0167蛋白的抗血清抑制Spy0167溶血作用

抗突变型Spy0167的抗血清对Spy0167溶血作用的抑制作用如图27-29和表14-16所示。采用50ng/ml(3.5HU)毒素，就Spy0167突变体W535-P427L而言，实现Spy0167溶血活性降低50％所需的血清稀释度在使用明矾佐剂时为1/17,860，使用MF59^TM佐剂时为1/7991。阴性对照(仅有佐剂)效价为1/1,000(明矾)和1/125(MF59^TM)。

表14(图示见图27)

表15(图示见图28)

表16(图示见图29)

ng/ml Spy0167	溶血作用％
		1.6	3.5
3.1	5.8
		6.3	13
12.5	42
		25	86
50	100
		100	100
200	100

实施例20

体内保护实验

将纯化的Spy0167 P427L蛋白连同弗氏佐剂腹膜内给予40只小鼠。然后用3348 M1 GAS菌株鼻内攻击小鼠。表17报道了在3个独立实验中获得的数据，显示所有实验中一致达到100％保护。

表17小鼠感染存活率

用20μg重组蛋白在第0、21和35天免疫各组10-20只小鼠。根据所用GAS重组蛋白的形式，仅用GST或用大肠杆菌污染物免疫阴性对照组的小鼠。第三次免疫两周后取血样。几天后，用10⁸cfu(50μl)M1 3348 GAS菌株鼻内攻击免疫的小鼠。在10-14天的时间段内监测小鼠的存活状况。用完整的Spy0167重组蛋白测试获自不同组的免疫血清的免疫原性(蛋白质印迹分析)。结果见表18和19所示。

表18

表19

蛋白质	小鼠数量	存活率％	阴性对照存活率％
				组氨酸标记rSpy0167野生型	20	100	45
组氨酸标记C530G	20	100	45
				组氨酸标记W535F	20	100	45
组氨酸标记W535F-D482N	20	100	45
				组氨酸标记P427L	20	95	45
组氨酸标记Δala248	20	100	45

实施例21

体内毒性实验

方案

静脉内注射Spy0167用PBS+2mM DTT溶液稀释野生型或突变型Spy0167的PBS溶液，然后注射100ml到小鼠尾静脉内。观察小鼠2-3天。注射野生型Spy0167通常在几分钟内导致死亡。

体内致死率抑制试验.就免疫血清介导的致死率抑制作用而言，将每只小鼠10μg的野生型Spy0167(100μg/ml PBS溶液，2mM DTT)与抗Spy0167血清或对照血清(获自仅佐剂免疫的小鼠)在室温下旋转温育20分钟。温育之后，通过向尾静脉内进行静脉内注射将样品接种到小鼠中。观察小鼠2-3天。

野生型Spy0167和突变型Spy0167 P427L-W535F的结果见表20所示。

表20

采用每只小鼠10μg剂量的野生型Spy0167作为阳性对照，将仅注射弗氏佐剂作为阴性对照，评价急性体内毒性。将每只小鼠10μg的野生型Spy0167与野生型Spy0167抗血清或对照血清温育，并如上所述接种到小鼠内。结果见表21所示。

表21

如上所述进行的另一组实验的结果见表22和23所示。采用每只小鼠5或10μg的野生型Spy0167评价体内急性毒性。具体而言，将每只小鼠10μg的野生型Spy0167与用Spy0167P427L-W535F或仅用PBS(无血清)免疫的小鼠血清预温育。此外，将每只小鼠5μg的野生型Spy0167与Spy0167P427L-W535F免疫的小鼠血清或作为阴性对照血清的PBS加佐剂(明矾)免疫小鼠的血清预温育。

结果表明，致死剂量的野生型Spy0167被抗Spy0167P427L-W535F血清中和，但未被相同稀释度的阴性对照血清中和。

表22

表23

实施例22

用Spy0167 P427L-W535F进行免疫保护小鼠免受静脉内注射野生型Spy0167攻击

用野生型Spy0167或Spy0167突变体P427L-W535F，以明矾为佐剂(20μg蛋白质，2mg/ml氢氧化铝中)对小鼠作三次腹膜内免疫(第0、21和35天)。仅用佐剂免疫的小鼠作为阴性对照。在第55天对小鼠静脉内注射不同浓度的野生型Spy0167的PBS，2mM DTT溶液，监测至少72小时。结果见表24所示。

表24

每只小鼠5μg的野生型Spy0167对仅用佐剂免疫的小鼠具有致死作用，这些小鼠在注射Spy0167后几分钟内死亡。然而，即使每只小鼠20μg的相同野生型Spy0167制备物也无法杀死用野生型Spy0167或P427L-W535F Spy0167突变体免疫的小鼠。

实施例23

Spy0167突变体P427L-W535F对GAS M1菌株鼻内攻击的保护作用

用Spy0167突变体P427L-W535F连同明矾或MF59作为佐剂腹膜内免疫30只小鼠，并用GAS M1菌株鼻内攻击。结果见图30所示。77％用Spy0167突变体P427L-W535F和明矾免疫的小鼠受到保护免遭GAS M1菌株鼻内攻击，相比之下阴性对照小鼠(仅用佐剂免疫)是3％。90％用Spy0167突变体P427L-W535F和MF59免疫的小鼠受到保护免遭GAS M1菌株鼻内攻击，相比之下阴性对照小鼠(仅用佐剂免疫)是10％。这些保护水平与用野生型Spy0167免疫小鼠获得的水平相当。

实施例24

用GAS抗原免疫小鼠的体内保护作用研究

该实施例提供用不同M型GAS菌株攻击之后，用各种GAS抗原组合和/或与CRM197(GC)偶联的GAS特异性多糖进行的免疫原性/保护作用测试的结果。GAS蛋白和GC用弗氏佐剂、氢氧化铝或MF59配制。蛋白质抗原剂量在单独使用时为20μg，蛋白质组合制剂包含野生型Spy0269(SEQID NO：177)和Spy0416 D151A/S617A(SEQ ID NO：198)各20μg以及10μg Spy0617 P427L/W535F(SEQ ID NO：125)。GC剂量见表格所示。

免疫方案包括在第0、21和35天的三个剂量。在第一次免疫前和第三次免疫两周后采血。阴性对照组仅用佐剂免疫。阳性对照组用攻击菌株同源的M蛋白免疫。

第三次免疫两周后，根据所用的攻击菌株，用范围在2.5x10⁶到2.5x10⁸(鼻内感染)或20到2.5x10⁶(腹膜内感染)的致死剂量感染小鼠。测定存活率，见表25和26所报道。p值用费舍尔检验(Fisher’s test)计算。

免疫原性用ELISA测试。

用弗氏佐剂配制的单个抗原及其组合对M1、M12和M23鼻内感染的保护作用

表25报道了用弗氏佐剂配制的Spy0269(SEQ ID NO：177)、Spy0416D151A/S617A(SEQ ID NO：198)或Spy0617 P427L/W535F(SEQ ID NO：125)或这些蛋白的组合(“combo”)免疫，随后接受M1、M12和M23菌株鼻内攻击的小鼠的实验结果。所述结果显示：

a.Spy0269赋予抵御M1、M12和M23感染的统计学显著的保护

作用；

b.Spy0416 D151A/S617A和Spy0617 P427L/W535F赋予抵御M1血清型鼻内感染的统计学显著的保护作用；

c.Spy0269、Spy0416 D151A/S617A和Spy0617 P427L/W535F的组合赋予针对M1、M12和M23 GAS血清型的＞40％的保护作用。

用明矾配制的GAS25、GAS40和GAS57抗原组合加GC对M1腹膜内感染的保护作用

表26报道了用明矾配制的含或不含GC的Spy0167突变体P427L/W535F、野生型Spy0269和Spy0416突变体D151A/S617A(“combo”)免疫，随后接受M1腹膜内攻击的小鼠的实验结果。所述结果显示单用蛋白质组合和使用蛋白质组合加GC均可获得具有统计学显著性的保护作用。因此，即使采用组合形式，这些GAS抗原突出的免疫原性也可得到保持。

表26

实施例25

细胞结合试验

采用细胞解离溶液(西格玛公司)以非酶方式将人(A549，HeLa，293，底特律(Detroit)，ME180)或猴(LLCMK2)上皮细胞系从其支持物上分离，收获并悬浮在杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eaglemedium)(DMEM)中。将约2x10⁵个细胞与单独的培养基或不同浓度(μg/ml)的Spy0269重组蛋白以200ml的总体积在具有U型底的96孔板中混合。在4℃温育1小时。用PBS洗涤两次后，将细胞与Spy0269抗体或抗血清(例如，就抗血清而言，用PBS/BSA 1％作1∶200稀释)在4℃温育1小时。两次洗涤后，将所述样品与第二抗体(例如，就小鼠Spy0269抗血清而言，所述第二抗体可以是用PBS/BSA 1％作1∶100稀释的小鼠免疫球蛋白的特异性R-藻红蛋白偶联山羊F(ab)₂抗体)在4℃温育30分钟。通过流式细胞术分析结合反应。计算各细胞群的平均荧光强度。

实施例26

调理吞噬试验

该实施例描述用于以下实施例的调理吞噬试验。简言之，将细菌(10-50个集落形成单位，CFU，25μl PBS溶液)与225μl仅用佐剂或一种或多种测试抗原免疫的兔全血温育。将样品在37℃颠倒式旋转温育5小时。稀释后，将样品接种到血琼脂平板上，估算CFU数量。

在该试验中，仅用佐剂免疫的动物血清的本底杀伤作用(backgroundkilling)的范围在7-36％。抗原杀伤活性存在变化但一致显示阳性(例如，M1抗体为72-97％，GC抗体为47-64％，针对野生型Spy0269(SEQ IDNO：177)、Spy0167双突变体P427L/W535F(SEQ ID NO：125)和Spy0416双突变体D151A/S617A(SEQ ID NO：198)的组合产生的抗体为76-85％)。

实施例27

显示抗复合糖(GC)抗体介导酿脓链球菌杀伤作用的全血杀菌试验

采用获自100μg GC免疫的兔的全血进行实施例26所述试验。图34所示结果表明抗GC抗体介导对酿脓链球菌的杀伤作用。

实施例28

全血杀菌试验显示抗复合糖(GC)抗体和针对GAS抗原组合产生的抗体的组合增强酿脓链球菌的杀伤作用

用获自以下成分免疫的兔的全血进行实施例26所述试验：(a)弗氏佐剂，(b)M1蛋白，(c)野生型Spy0269(SEQ ID NO：177)、Spy0167双突变体P427L/W535F(SEQ ID NO：125)和Spy0416双突变体D151A/S617A(SEQID NO：198)(各100μg)的组合，(d)GC和(e)野生型Spy0269(SEQ IDNO：177)、Spy0167双突变体P427L/W535F(SEQ ID NO：125)、Spy0416双突变体D151A/S617A(SEQ ID NO：198)和GC的组合。结果见图35所示。

希望GAS疫苗具有杀菌作用以及免疫原性。这些结果表明，即使采用组合形式，这些GAS抗原也具有杀菌活性。所述结果还表明，与GAS抗原组合或单独的GC抗原相比，GAS抗原和GC抗原的组合具有更强的杀菌作用。

实施例29

实验显示GAS抗原缺乏细胞毒性

在RPMI 1640培养基中用各种浓度的重组GAS抗原体外处理内皮细胞人脑微血管内皮细胞(HBMEC)24小时。不处理(“NT”)阴性对照，用1μg/ml TNFα处理的细胞作为阳性对照。采用膜联蛋白V和碘化丙锭染色通过流式细胞术测定凋亡细胞的百分比。结果显示在这些实施例所用的野生型Spy0269(SEQ ID NO：177)、Spy0167双突变体P427L/W535F(SEQ IDNO：125)、Spy0416双突变体D151A/S617A(SEQ ID NO：198)和复合糖(“GASGC”)的浓度下没有显著毒性。参见图36A-D。

实施例30

蛋白质抗原的保守性和表达

下表显示在57、49和13个酿脓链球菌菌株中Spy0269、Spy0416和Spy0167各自的平均相同性百分比。

抗原	同源性％(分析菌株的数量)	FACS阳性
			Spy0269	93％(57株)	119/188(63.3％)
Spy0416	95％(49株)	98/174(56.3％)
			Spy0167	97％(13株)	32/60(53.3％)

实施例31

ELISA鉴定

简言之，用抗原包被孔板(0.1-0.3μg/孔)，用2％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液封闭。在与测试血清的两倍连续稀释液温育后，用2％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液和0.05％吐温20洗涤平板，并与碱性磷酸酶偶联的第二抗体(抗总IgG，1∶2000)温育。在与底物对硝基苯基磷酸酯(pNPP，3μg/ml)温育之后，测定405nm的吸光度。通过标准曲线的内插OD计算血清效价。该试验为线性且可重复，如图37A-D所示。

实施例32

体内攻击实验

用含明矾的PBS溶液为佐剂的各种剂量的GAS抗原在第0、21和35天三次腹膜内免疫CD15-6周龄雌性小鼠，并用酿脓链球菌各菌株进行鼻内(50ml含LD90细菌剂量的Todd-Hewitt培养基)或腹膜内(200μl含LD90细菌剂量的Todd-Hewitt培养基)攻击。结果见表27和28所示。在表27和28中，“40”、“25”和“57”分别是野生型Spy0269(SEQ ID NO：177)、Spy0167双突变体P427L/W535F(SEQ ID NO：125)和Spy0416双突变体D151A/S617A(SEQ ID NO：198)。

表27GAS抗原和GAS抗原组合在腹膜内攻击模型中产生的保护作用

表28GAS抗原和GAS抗原组合在鼻内攻击模型中产生的保护作用

实施例33

加入明矾提供针对M13348菌株的保护作用

该实施例表明，在Spy0167和组合制剂中加入明矾可提供针对酿脓链球菌菌株M13348的保护作用

用含或不含明矾的Spy0167(GAS25)10μg或Spy0167(10μg)连同Spy0269(GAS40，20μg)和Spy0416(GAS57，20μg)的组合(“组合”)免疫CD15-6周龄雌性小鼠。用3个剂量在第0、21和35天腹膜内免疫动物。基本如实施例4所述进行M13348鼻内攻击。结果见表29所示。

表29加入明矾对M13348鼻内攻击后存活率的影响

抗原	佐剂	M13348攻击后存活率％(动物数量)
			Spy0167	明矾	84(32)
Spy0167	--	29(32)
			--	明矾	14(31)
组合	明矾	66(32)
			组合		23(32)
--	明矾	14(29)

实施例34

GAS抗原制剂的稳定性

通过SDS-PAGE分析抗原完整性来检验组合GAS抗原制剂的稳定性和体内效能，该制剂包含100μg/ml Spy0269(1mg/ml PBS溶液)、100μgSpy0416双突变体D151A/S617A(1mg/ml PBS溶液)、50μg Spy0167双突变体P427L/W535F(1mg/ml PBS溶液)、2mg/ml氢氧化铝、10mM组氨酸缓冲液(pH 7.0)、9g/l氯化钠，pH为7.0+/-0.3，摩尔渗透压浓度为300+/-20mOsm/kg。所述制剂在4℃保持稳定最长达1年。通过在2-8℃温育超过一年的时间评价抗原稳定性。通过SDS-PAGE评价，所有三种蛋白质组分在一年后均显示非常稳定。所述蛋白质抗原在2-8℃保持吸附于明矾(＞97.5％)至少36周。

实施例35

Spy0416和Spy0167抗体的作用

该实施例表明Spy0416和Spy0167的抗体可阻断毒性活性。

Spy0416：将Spy0416与小鼠特异性血清合并物或对Spy0416具有高ELISA效价的人血清预温育。然后将所述混合物与IL-8(10μg/ml)温育，然后采用对所述细胞因子具有特异性但无法识别被切割失活形式的抗体检验未切割IL-8是否存在。结果表示为如下计算的未切割IL-8的百分比：

其中“对照混合物”是在时间点0不含酶的反应混合物。

Spy0167：将野生型Spy0167与用20μg Spy0167P427L/W535F或仅用佐剂免疫的小鼠的血清合并物和反应者和无反应者的人血清预温育。将所述混合物加入绵羊血细胞悬浮液，测定反应上清液OD540nm的减小值。抑制效价表示为使Spy0167诱导的溶血作用降低50％所需的血清稀释度。

结果见图41A-B所示。

实施例36

剂量范围实验

在第0、21和35天用各种剂量的野生型Spy0269(SEQ ID NO：177)、Spy0416突变体D151A/S617A(SEQ ID NO：198)和Spy0167突变体P427L/W535F(SEQ ID NO：125)免疫5周龄雌性CD1小鼠。如实施例31所述通过ELISA测定小鼠中的剂量依赖性IgG应答。结果见图38A-C所示。

用单个GAS蛋白抗原以各种浓度免疫小鼠，并用酿脓链球菌M1鼻内攻击。结果见表30所示。

表30

如表30所示，不存在明显的剂量依赖性保护作用，表明各种浓度的这些抗原均可用于获得抵御酿脓链球菌攻击的保护作用。

用20μg野生型Spy0269(SEQ ID NO：177)、10μg Spy0167双突变体P427L/W535F(SEQ ID NO：125)和20μg Spy0416双突变体D151A/S617A(SEQ ID NO：198)的组合以各种浓度免疫小鼠，并用酿脓链球菌M1进行鼻内攻击。结果见表31所示。

表31

如上述单抗原剂量实验的情况，不存在明显的剂量依赖性保护作用，表明即使采用组合形式，各种浓度的这些抗原均可用于获得抵御酿脓链球菌攻击的保护作用。

结果总结于图39中。图40显示适合用作平均存活时间(MST，Mu)的一级近似的对数正态模型的分析。

Claims

1.一种组合物，其包含：

(a)选自下组的三种或更多种不同酿脓链球菌(S.pyogenes)(GAS)蛋白抗原的组合：

(1)Spy0167；

(2)Spy0269；

(3)Spy0416；

(4)Spy0714；

(5)Spy1390；

(6)Spy2000；

(7)在选自氨基酸P427、W535、C530、A248和D482中的一个或多个氨基酸位置包含氨基酸改变的突变型Spy0167蛋白，其中所述氨基酸位置根据SEQ ID NO：107进行编号，且所述突变型Spy0167蛋白的溶血活性相对于野生型Spy0167降低至少50％；和

(8)在选自氨基酸D151、H279和S617中的一个或多个氨基酸位置包含氨基酸改变的突变型Spy0416蛋白，其中所述氨基酸位置根据SEQ ID NO：1进行编号，且根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或ELISA试验所检测，纯化的突变型Spy0416抗原针对白介素8(IL-8)的蛋白水解活性相对于野生型Spy0416降低至少50％；

(b)编码(1)-(8)的一种或多种核酸分子；或

(c)三种或更多种不同抗体，其中各抗体与选自(1)-(8)的GAS蛋白抗原选择性结合，各GAS蛋白抗原不同。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述三种GAS蛋白抗原是：

Spy0167、Spy0269和Spy0416；

Spy0167突变体P427L/W535F、Spy0269和Spy0416；

Spy0167、Spy0269和Spy0416突变体D151A/S617A；或

Spy0167突变体P427L/W535F、Spy0269和Spy0416突变体D151A/S617A。

3.一种组合物，其包含：

(a)仅两种GAS蛋白抗原，其中所述组合物包含：

(1)Spy0167和选自下组的第二GAS抗原：Spy0269；Spy0416；在选自氨基酸P427、W535、C530、A248和D482中的一个或多个氨基酸位置包含氨基酸改变的突变型Spy0167蛋白，其中所述氨基酸位置根据SEQ IDNO：107进行编号，且所述突变型Spy0167蛋白的溶血活性相对于野生型Spy0167降低至少50％；在选自氨基酸D151、H279和S617中的一个或多个氨基酸位置包含的氨基酸改变的突变型Spy0416蛋白，其中所述氨基酸位置根据SEQ ID NO：1进行编号，且根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或ELISA试验所检测，纯化的突变型Spy0416抗原针对白细胞介素8(IL-8)的蛋白水解活性相对于野生型Spy0416降低至少50％；Spy0714；Spy1390和Spy2000；

(2)Spy0269和选自Spy0167、突变型Spy0167蛋白、突变型Spy0416蛋白、Spy0714、Spy1390或Spy2000的第二GAS抗原；

(3)Spy0416和选自Spy0167、突变型Spy0167蛋白、突变型Spy0416蛋白、Spy0714、Spy1390或Spy2000的第二GAS抗原；

(4)突变型Spy0167蛋白和选自Spy0167、Spy0269、Spy0416、突变型Spy0416蛋白、Spy0714、Spy1390或Spy2000的第二GAS抗原；

(5)突变型Spy0416蛋白和选自Spy0167、Spy0269、Spy0416、突变型Spy0167蛋白、Spy0714、Spy1390或Spy2000的第二GAS抗原；

(6)Spy0714和选自Spy0167、Spy0269、Spy0416、突变型Spy0167蛋白、突变型Spy0416蛋白、Spy1390或Spy2000的第二GAS抗原；

(7)Spy1390和选自Spy0167、Spy0269、Spy0416、突变型Spy0167蛋白、突变型Spy0416蛋白、Spy0714或Spy2000的第二GAS抗原；和

(8)Spy2000和选自Spy0167、Spy0269、Spy0416、突变型Spy0167蛋白、突变型Spy0416蛋白、Spy0714或Spy1390的第二GAS抗原；

(b)编码所述两种GAS蛋白抗原的一种或多种核酸分子；和

(c)两种或更多种不同抗体，其中各抗体与所述两种GAS蛋白抗原中的一种选择性结合。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述两种GAS蛋白抗原是：

Spy0167和Spy0269；

Spy0167和Spy0416；

Spy0167突变体P427L/W535F和Spy0269；

Spy0167突变体P427L/W535F和Spy0416；

Spy0269和Spy0416突变体D151A/S617A；

Spy0167和Spy0416突变体D151A/S617A；或

Spy0167突变体P427L/W535F和Spy0416突变体D151A/S617A。

5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含所述突变型Spy0416抗原。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述突变型Spy0416抗原包含选自D151A和S617A中的至少一个氨基酸取代。

7.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述突变型Spy0416抗原包含SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：198。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述Spy0269抗原包含SEQID NO：177。

9.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述突变型Spy0416抗原是包含第二GAS抗原的融合蛋白。

10.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含突变型Spy0617抗原。

11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述突变型Spy0167抗原包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ IDNO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：127。

12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述GAS抗原中至少有一种与载体蛋白偶联。

13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述载体蛋白选自细菌毒素、细菌类毒素、脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白、热休克蛋白、百日咳蛋白、流感嗜血杆菌(H.influenzae)蛋白D、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、艰难梭菌(C.difficile)毒素A、艰难梭菌毒素B或摄铁蛋白。

14.如权利要求1或权利要求3所述的包含三种或更多种不同抗体的组合物，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、F(ab′)₂片段、F(ab)片段、Fv分子、非共价异源二聚体、单链Fv分子(sFv)、二聚抗体片段构建体、三聚抗体片段构建体、小体或它们的混合物。

15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述抗体中的一种与野生型Spy0416特异性结合并抑制所述野生型Spy0416切割人IL-8的能力。

16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述抗体抑制野生型Spy0416切割选自下组的人趋化因子的能力：CXCL1/GROα、CXCL2/GROβ、CXCL3/GROγ、CXCL4、CXCL12/SDF-1α、CXCL12/SDF-1β、CXCL12/SDF-1γ、CXCL5/ENA 78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP10、CXCL11、CXCL13、CXCL14和CXCL16。

17.如权利要求1或权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含所述一种或多种核酸分子。

18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

19.如权利要求1-13、17或18中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含用于儿科疫苗的活性试剂。

20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述活性试剂选自下组：

(a)选自下组的多肽抗原：脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Chorinebacterimdiphteriae)、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、风疹病毒和轮状病毒多肽抗原；和

(b)编码所述多肽抗原的核酸分子。

21.如权利要求1-13、17或18中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含用于针对老年人或免疫受损个体的疫苗的第二活性试剂。

22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述第二活性试剂选自下组：

(a)选自下组的多肽抗原：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、流感病毒和副流感病毒多肽抗原；和

(b)编码所述多肽抗原的核酸分子。

23.如权利要求1-13或76-22中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含具有式(I)的A组多糖：

其中R是末端还原L-鼠李糖或D-GlcpNAc，n是从约3到约30的数值。

24.如权利要求1-13或17-23中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。

25.如权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述佐剂是明矾。

26.一种降低酿脓链球菌感染风险的方法，包括给予有此需求的个体有效量的如权利要求1-13或17-25中任一项所述的组合物。

27.一种治疗酿脓链球菌感染的方法，包括给予有此需求的个体有效量的如权利要求1、4、14-16或18中任一项所述的组合物。

28.一种试剂盒，其包括：

(a)包含如权利要求1-25中任一项所述组合物的容器；和

(b)采用所述组合物治疗酿脓链球菌感染或降低其风险的说明书。

29.一种制备降低酿脓链球菌感染风险的疫苗的方法，包括将以下成分组合：

(a)如权利要求1-13或17-25中任一项所述的组合物；和

(b)药学上可接受的载体。

30.一种制备治疗酿脓链球菌感染的治疗剂的方法，包括将以下成分组合：

(a)如权利要求1-4、14-16或18中任一项所述的组合物；和

(b)药学上可接受的载体。

31.用作疫苗的如权利要求1-13或17-25中任一项所述的组合物。

32.用于治疗酿脓链球菌感染的如权利要求1-4、14-16或18中任一项所述的组合物。