TWI554610B - 蝦淋巴細胞及其純化方法與用於體外評估先天免疫反應的方法 - Google Patents

Description

蝦淋巴細胞及其純化方法與用於體外評 估先天免疫反應的方法

本發明是有關於一種無脊椎動物淋巴細胞及其純化方法，特別是有關於一種蝦淋巴細胞及其純化方法與利用蝦淋巴細胞於體外評估先天免疫反應的方法。

蝦類屬於無脊椎動物，而無脊椎動物的免疫系統一般是運用體液凝固機制(coagulation)，也就是以體液凝集成團塊，形成物理屏障，作為其防禦病原入侵的第一道防線，防止微生物病原體進入到體內。

由於蝦僅具有先天性免疫力(innate immunity)，並不具備脊椎動物對病原發展出的適應性免疫力(adaptive immunity)，無法產生針對特定病原感染後誘發的特異性記憶性免疫細胞，因此無法發展出蝦的疫苗。

對於增加蝦抗病力最有效的策略，就是開發具有促進蝦先天性免疫力的免疫調節劑。然而，至今尚未建立能維持較長時間培養的蝦細胞株。

有鑑於此，亟需開發一種蝦淋巴細胞初代細胞，以提供體外(in vitro)篩選平台所需。

因此，本發明之一態樣是在提供一種蝦淋巴細胞的純化方法，其係利用含有葡萄糖胺以及低濃度的鈉離子之抗凝集劑對蝦體液樣本進行前處理後，再利用含有低濃度的鈉離子的細胞培養液進行培養步驟，可獲得細胞存活率、細胞產量及細胞純度皆較高之蝦淋巴細胞。

本發明之另一態樣係在提供一種蝦淋巴細胞的抗凝集劑，其包含葡萄糖胺以及低濃度的鈉離子，藉此抑制蝦淋巴細胞之細胞凝集率並提高其體外細胞存活率。

本發明之又一態樣係在提供一種蝦淋巴細胞的細胞培養液，包含L-15培養液、胎牛血清以及低濃度的鈉離子，藉此提高蝦淋巴細胞之細胞存活率及體外培養的時間。

本發明之又另一態樣係在提供一種體外評估蝦類先天免疫反應的方法，其包含利用上述方法獲得之蝦淋巴細胞與待測樣本共同培養，以評估待測樣本是否具有刺激蝦類先天免疫反應之活性。

根據本發明之上述態樣，提出一種蝦淋巴細胞的純化方法。在一實施例中，首先提供蝦體液樣本，其中蝦體液樣本是源自於白蝦(Litopenaeus vannamei)。接著，進行前處理，使蝦體液樣本與抗凝集劑均勻混合，以形成單 細胞懸浮液，其中抗凝集劑可包含例如低於10.0g/L之氯化鈉、5.5g/L之檸檬酸、8.0至10.0g/L之檸檬酸鈉、19.8至20.0g/L之葡萄糖以及21.563g/L之葡萄糖胺，且抗凝集劑具有pH 7.0之酸鹼值。然後，進行離心步驟，以去除單細胞懸浮液之上清液並獲得細胞沉澱物(cell pellet)。之後，進行培養步驟，使細胞沉澱物均勻懸浮並培養於細胞培養液中，以獲得蝦淋巴細胞，其中細胞培養液可包含例如2倍濃度(2X)的L-15培養液、5g/L之氯化鈉、10g/L之葡萄糖、15%(v/v)之胎牛血清且具有pH 7.0之酸鹼值。

根據本發明之另一態樣，提出一種蝦淋巴細胞的細胞培養液，其中抗凝集劑可包含例如低於10.0g/L之氯化鈉、5.5g/L之檸檬酸、8.0至10.0g/L之檸檬酸鈉、19.8至20.0g/L之葡萄糖以及21.563g/L之葡萄糖胺，且抗凝集劑具有pH 7.0之酸鹼值。

依據本發明一實施例，上述抗凝集劑更可包含2.5g/L之乙二胺四乙酸。

根據本發明之又另一態樣，提出一種種體外評估蝦類先天免疫反應的方法。在一實施例中，首先進行共同培養步驟，將上述方法獲得之蝦淋巴細胞，培養於上述細胞培養液中30分鐘至72小時，其中細胞培養液包含或不包含待測樣本。接著，檢測蝦淋巴細胞之細胞存活率，其中未與待測樣本培養的蝦淋巴細胞之細胞存活率為參考值，而與待測樣本培養的蝦淋巴細胞之細胞存活率為測量值。然後，進行判斷步驟，若測量值高於參考值，則判斷待測樣本具有刺 激蝦類先天免疫反應之活性。

依據本發明一實施例，在上述共同培養步驟之前，更可選擇性進行前培養步驟，使蝦淋巴細胞培養於不含待測樣本之細胞培養液中至少24小時。

應用本發明之蝦淋巴細胞的純化方法，其利用含有葡萄糖胺以及低濃度的鈉離子之抗凝集劑對蝦體液樣本進行前處理後，再利用含有低濃度的鈉離子的細胞培養液進行培養步驟，可有效提高蝦淋巴細胞的細胞存活率，提升細胞產量及細胞純度。所得之蝦淋巴細胞可作為體外篩選平台，評估待測樣本之先天免疫刺激活性。

101‧‧‧曲線

103/105‧‧‧採集點

201‧‧‧蝦體

203‧‧‧腹部表面延伸線

205‧‧‧針體

θ‧‧‧夾角

401/403/405/407/409/411/501/503/505‧‧‧曲線

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：

【圖1】係繪示根據本發明一實施例之蝦體採集點的示意圖。

【圖2】係繪示根據本發明一實施例以特定角度抽取蝦體液的示意圖。

【圖3】係顯示根據本發明一實施例之蝦淋巴細胞之流式細胞儀的二維散點圖。

【圖4】係顯示根據本發明製備例1至5及製備比較例1之抗凝集劑處理蝦淋巴細胞後之細胞存活率。

【圖5】係顯示根據本發明製備例1至5及製備比較例2之抗凝集劑處理蝦淋巴細胞後之細胞存活率。

【圖6A】與【圖6B】係分別顯示蝦淋巴細胞經製備比較例3(圖6A)與製備例7(圖6B)的細胞培養液培養120分鐘之光學顯微鏡照片。

承前所述，本發明提供一種蝦淋巴細胞的純化方法，其係利用含有葡萄糖胺以及低濃度的鈉離子之抗凝集劑對蝦體液樣本進行前處理後，再利用含有低濃度的鈉離子的細胞培養液進行培養步驟，可獲得較高細胞存活率、較高細胞產量及較高細胞純度之蝦淋巴細胞。

申言之，本發明此處所稱的「蝦淋巴細胞」，可例如由白蝦(Litopenaeus vannamei)體內純化的初代培養之淋巴細胞，惟本發明適用的蝦科種類不限於此處所舉。一般而言，本發明的蝦淋巴細胞可包含較高細胞純度之三群細胞，分別為顆粒球(granular cells)、半顆粒球(semigranular cells)以及透明球(hyaline cells)，其中顆粒球(granular cells)的比例可分別例如為36%、9%及55%，惟上述三群蝦淋巴細胞的各細胞比例並不侷限上述所舉，三群體液細胞之任一群的比例可以更多或更少，端視所使用的蝦科種類而定。

除了蝦科種類會影響所得的蝦淋巴細胞之外，不同的採集點也會影響取得之細胞數量、細胞純度。本發明由特定的採集點，可取得較多細胞及較高細胞純度之蝦淋巴細胞。請同時參閱圖1與圖2，其中圖1係繪示根據本發明一 實施例之蝦體採集點的示意圖，圖2係繪示根據本發明一實施例以特定角度抽取蝦體液的示意圖。

在圖1中，從採集點103的採集方法，可先將蝦體的胸節與第一對腹節撐開，以暴露出蝦頭胸甲與蝦身連接處101。然後，如圖2所示，把蝦子頭部朝下，將針頭(圖未繪示)對準連接處101的採集點103，以圖2之小於45度角(如θ)下針，其中夾角θ是定義為蝦體201之腹部表面203與針體205之夾角。針頭前端插入0.3cm至約0.5cm的深度後，緩慢抽出蝦體液(呈透明或些許藍色)。根據本發明一些實施例，由採集點103可取得約0.4mL之體液。根據本發明其他實施例，由採集點105則僅取得約0.2mL之體液。

另外一項影響因素則在於蝦體液成分具有凝塊因子及蝦循環血中的酚氧化酶活化系統(prophenoloxidase activating system)，其去顆粒化作用會引起蝦體液之凝集活性，凝集作用會造成細胞聚集成團，進而造成細胞於試管內快速死亡。過去在活體內(in vivo)研究發現，蝦體液成分之轉胺酶(transglutaminase；TGase)活性，會誘發血漿凝固蛋白(plasma clotting protein；CP)產生凝固機制。轉胺酶在作用時需要有輔因子(例如鈣離子)的存在。倘若蝦之轉胺酶基因具有缺失，則其淋巴內的細菌數相對會較高。此外，一些研究結果也顯示，用於分離哺乳動物細胞之蛋白質分解酶(例如胰蛋白酶)，可增加由蝦組織分離出的細胞產率(yield rate)。

本發明此處所稱的「抗凝集劑」是指包含葡萄 糖胺以及低濃度的鈉離子者。在一實施例中，前述抗凝集劑可包含例如低於10.0g/L之氯化鈉、5.5g/L之檸檬酸、8.0至10.0g/L之檸檬酸鈉、19.8至20.0g/L之葡萄糖以及21.563g/L之葡萄糖胺，且抗凝集劑具有pH 7.0之酸鹼值。在一例示中，前述抗凝集劑可包含8.2g/L之氯化鈉、5.5g/L之檸檬酸、8.8g/L之檸檬酸鈉、19.8g/L之葡萄糖以及21.563g/L之葡萄糖胺，且抗凝集劑具有pH 7.0之酸鹼值。在另一例示中，前述抗凝集劑更可選擇性包含乙二胺四乙酸，以進一步提升蝦淋巴細胞的細胞存活率，其中乙二胺四乙酸的濃度可例如為2.5g/L。

在一些實施例中，經上述抗凝集劑處理之蝦淋巴細胞經30分鐘培養後之細胞存活率可例如為至少90%。在其他實施例中，經上述抗凝集劑處理之蝦淋巴細胞經60分鐘培養後之細胞存活率可例如為至少85%。在另一些實施例中，經上述抗凝集劑處理之蝦淋巴細胞經120分鐘培養後之細胞存活率可例如為至少73%。

本發明此處所稱的「細胞培養液」是指包含L-15培養液、胎牛血清以及低濃度的鈉離子者。在一實施例中，前述細胞培養液可包含例如2倍濃度(2X)的L-15培養液、低於10.0g/L之氯化鈉、10g/L之葡萄糖以及15%(v/v)之胎牛血清，且細胞培養液具有pH 7.0之酸鹼值。在一例示中，前述細胞培養液之氯化鈉的濃度可例如5g/L。在另一例示中，前述細胞培養液更可包含抗生素，其中抗生素可包含例如鏈黴素(streptomycin)、青黴素(penicillin)以及 兩性黴素(amphotericin)。在前述例示中，前述細胞培養液可選擇性包含100μg/mL之鏈黴素、100I.U./mL之青黴素以及0.25mg/mL之兩性黴素。

在一些實施例中，前述獲得的蝦淋巴細胞經上述細胞培養液24小時培養後，其細胞存活率可例如為至少90%。

上述方法可獲得細胞存活率、細胞產量及細胞純度皆較高之蝦淋巴細胞，可進一步應用於體外評估蝦類先天免疫反應。在一實施例中，前述所稱的「體外評估蝦類先天免疫反應」，其方法包括進行共同培養步驟，將上述所得之蝦淋巴細胞，培養於上述細胞培養液中30分鐘至72小時，其中細胞培養液包含或不包含待測樣本。接著，檢測蝦淋巴細胞之細胞存活率，其中未與待測樣本培養的蝦淋巴細胞之細胞存活率為參考值，而與待測樣本培養的蝦淋巴細胞之細胞存活率為測量值。然後，進行判斷步驟，若前述測量值高於參考值，則判斷前述待測樣本具有刺激蝦類先天免疫反應之活性。

在其他實施例中，前述共同培養步驟之前，更可選擇性進行前培養步驟，使蝦淋巴細胞培養於不含待測樣本之細胞培養液中至少24小時。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例1：純化蝦淋巴細胞

1.製備例1至6與製備比較例1至2

製備例1至6與製備比較例1至2是根據表1配製抗凝集劑，其中製備比較例1至2為習知配方的抗凝集劑，製備例1至6為根據本發明數個實施例的抗凝集劑。上述成分係溶解於無菌水中，並以1N的氫氧化鈉水溶液調整pH至7.0後，利用孔徑大小為0.22μm之濾膜過濾去除細菌，置於4℃備用。

2.製備例7與製備比較例3

製備例7與製備比較例3是根據表2配製細胞培養液，其中製備比較例3為習知配方的培養液，製備例7為根據本發明一實施例的細胞培養液。上述成分係溶解於無菌水中，並以1N的氫氧化鈉水溶液調整pH至7.0後，利用孔徑大小為0.22μm之濾膜過濾去除細菌，置於4℃備用。

製備例7與製備比較例3的細胞培養液的配方如表2所示。在配製時，可先將葡萄糖加入800mL的滅菌水並完全溶解後，再加入氯化鈉以及2包Leibovitz’s L-15粉末〔相當於2倍濃度(2X)的L-15〕。上述成分完全溶解後，以無菌水調整總體積至840mL，以1N HCl調整pH值至7.0，再加入10mL(1%,v/v)的抗生素，最後再加入150mL(15%,v/v)胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)，並無菌水調整總體積至1000mL。配製完成後的細胞培養液使用孔徑大小0.22μm之濾膜過濾去除細菌，置於4℃備用。

上述製備例7與製備比較例3的細胞培養液包含100μg/mL之鏈黴素(streptomycin)、100I.U./mL之青黴素(penicillin)以及0.25mg/mL之兩性黴素(amphotericin)(CORNING)。

3.分離蝦淋巴細胞

取10隻白蝦(Litopenaeus vannamei)，依據不同採集點，取得蝦體液細胞。

在分離蝦淋巴細胞時，首先，準備至少二個打氣幫浦，以及新鮮海水，隨時確保蝦子存活。同時，以不同針筒吸取0.4mL之製備例1至6以及製備比較例1至2的抗凝集劑至個別針筒(針筒總容積為1mL)，置於冰上。

將白蝦移到操作台後，靜置1小時讓蝦子穩定，隨時注意打氣情況以及蝦子狀態，並適時添加新鮮海水。接著，適當固定蝦子後，露出蝦腹部，如圖1所示，分別由如圖號103、105所示二個採集點，採集上述蝦體之體液。

請同時參閱圖1與圖2。在圖1中，從採集點103的採集方法，可先將蝦體的胸節與第一對腹節撐開，以暴露出蝦頭胸甲與蝦身連接處101。然後，如圖2所示，把蝦子頭部朝下，將針頭〔例如26G x 1/2”(0.45 x 13mm)〕(圖未繪示)對準連接處101的採集點103，以圖2之小於45度角(如夾角θ)下針，其中夾角θ是定義為蝦身表面延伸線203與針體205之夾角。針頭前端插入0.3cm至約0.5cm的深度後，緩慢抽出蝦體液(呈透明或些許藍色)。由採集點103可取得約0.4mL之體液。

至於由採集點105的採集方法與上述採集點103的採集方法相同，不同處在於將針頭對準連接處101的採集點105，以如圖2小於45度角(如圖號θ)下針。由採集點105僅能取得約0.2mL之體液。

上述取得的蝦體液，隨即與針筒裡的抗凝集劑以1：1之體積比例，均勻混合成混合液。然後，取10μL的混合液，加上90μL之0.5%錐蟲藍(Trypan blue)溶液 (Biological Industries)，計算細胞數及細胞存活率。上述取得之淋巴細胞，其平均細胞數為1×10⁷細胞/蝦。之後，隨即利用市售之流式細胞儀分析其細胞亞群，其結果如圖3所示。

請參閱圖3，其係顯示根據本發明一實施例之蝦淋巴細胞之流式細胞儀(FACScan flow cytometer)的(FSC/SSC)二維散點圖，其中橫軸代表側向散射光(forward scatter；FSC)訊號強度(x1,000)，縱軸為側向散射光(side scatter；SSC)訊號強度(x1,000)。

由圖3的結果可知，實施例1取得之蝦體液細胞含有三群高純度之淋巴細胞，分別為36%顆粒球(granular cells；G)、9%半顆粒球(semigranular cells；SG)以及55%透明球(hyaline cells；H)。

實施例2：評估抗凝集劑對蝦淋巴細胞之抗凝集效果

1.評估抗凝集劑之葡萄糖胺或/及胰蛋白酶對蝦淋巴細胞之抗凝集效果

此實施例以18隻白蝦，利用製備例1至5及製備比較例1之抗凝集劑配方，評估含或不含葡萄糖胺或/及胰蛋白酶對於蝦淋巴細胞抗凝集及細胞存活率之影響。

將由採集點B(如圖1之圖號103所示)取得之蝦體液細胞，快速與針筒裡的製備例1至5及製備比較例1之抗凝集劑，以1：1之體積比例混合均勻成混合液後，取10μL的混合液，加上90μL之0.5%錐蟲藍溶液，每隔10分鐘計算 細胞數及細胞存活率，其結果如下表3以及圖4。

請參閱表3及圖4，其係分別顯示根據本發明製備例1至5及製備比較例1之抗凝集劑處理蝦淋巴細胞後之細胞數(表3)與細胞存活率(圖4)。圖4之曲線403、曲線405、曲線407、曲線409、曲線411分別代表經製備例1至5之抗凝集劑處理後的蝦淋巴細胞數，而曲線401則代表經製備比較例1之抗凝集劑處理後的蝦淋巴細胞數。

由表3及圖4結果可知，相較於製備比較例1之習知抗凝集劑(曲線401)，經製備例1至5之抗凝集劑處理後，其細胞存活率較高，如圖4之曲線403、曲線405、曲線407、曲線409、曲線411所示。

其次，經製備例2之抗凝集劑處理後，經培養0至60分鐘後，可以獲得9.38x10⁶細胞/蝦之平均淋巴細胞數，更優於製備例1、3至5之效果，如表3所示。再者，經製備例2之抗凝集劑處理後，亦可維持較長時間的細胞存活率，在培養20分鐘後之細胞存活率達90%，於培養60分鐘後之細胞存活率達70%，更優於製備例1、3至5之效果，如 圖4之曲線405所示。

2.評估抗凝集劑之葡萄糖胺及/或乙二胺四乙酸對蝦淋巴細胞之抗凝集效果

此實施例以9隻白蝦，利用製備例2、6以及製備比較例2之抗凝集劑配方，評估含或不含葡萄糖胺或/及乙二胺四乙酸(EDTA)對於蝦淋巴細胞之抗凝集與細胞存活率之影響。

將由採集點B(如圖1之圖號103所示)取得之蝦體液細胞，快速與針筒裡的製備例2、6以及製備比較例2之抗凝集劑，以1：1之體積比例混合均勻成混合液後，取10μL的混合液，加上90μL之0.5%錐蟲藍溶液，每隔10分鐘計算細胞數及細胞存活率，其結果如圖5。

請參閱圖5，其係顯示根據本發明製備例1至5及製備比較例2之抗凝集劑處理蝦淋巴細胞後之細胞存活率。圖5之曲線501以及曲線503分別代表經製備例2及6之抗凝集劑處理後的蝦淋巴細胞數，而曲線505則代表經製備比較例2之抗凝集劑處理後的蝦淋巴細胞數。其中製備例6之抗凝集劑是於製備例2之抗凝集劑中再添加EDTA。

由圖5結果可知，相較於製備比較例2之習知抗凝集劑，經製備例2及6之抗凝集劑處理後，細胞存活率較高，如曲線503及曲線501所示。其次，經製備例6之抗凝集劑處理後的細胞存活率(曲線501)，又優於製備例2之抗凝集劑的效果(曲線503)，其中經製備例6之抗凝集劑處理後，經培養30分鐘後之細胞存活率達90%，經培養60分鐘 後之細胞存活率達85%，經培養120分鐘後之細胞存活率達73%。因此，製備例6之抗凝集劑的效果更佳，且可維持細胞更長時間且更高的存活率。

實施例3：評估細胞培養液對初代培養之蝦淋巴細胞之培養效果

此實施例以20隻白蝦，依據實施例1之方法，取得蝦淋巴細胞，並分別於離開活體之後10分鐘內，立即分別置入兩管內含20mL製備例7與製備比較例3之細胞培養液中，並使細胞均勻分散。

依據上述方法計數細胞後，以1×10⁶cells/mL之細胞濃度，取10mL種入10cm dish中，緩慢搖晃至均勻後，放置於室溫25℃下待其貼附。之後，經培養24小時、36小時以及72小時後，其結果如圖6A及圖6B所示。

請參閱圖6A及圖6B，其係分別顯示蝦淋巴細胞經製備比較例3(圖6A)與製備例7(圖6B)的細胞培養液培養120分鐘之光學顯微鏡照片。由圖6A及圖6B之結果可知，以製備例7之細胞培養液培養之蝦淋巴細胞，於24小時之細胞存活率仍高達90%，如圖6B所示。相較之下，以製備比較例3之細胞培養液培養之蝦淋巴細胞，培養效果較不理想，於24小時全數死亡，如圖6A所示。

綜言之，由上述數個實施例證實，本發明之蝦淋巴細胞的純化方法，成功由特定的採集點，利用含有葡萄糖胺以及低濃度的鈉離子之抗凝集劑對蝦體液樣本進行前 處理後，再利用含有低濃度的鈉離子的細胞培養液進行培養步驟，可有效提高蝦淋巴細胞的細胞存活率，提升細胞產量及細胞純度。所得之蝦淋巴細胞可進一步作為體外篩選平台，評估待測樣本之先天免疫刺激活性。

舉例而言，上述蝦淋巴細胞在作為體外篩選平台時，可先進行共同培養步驟，將上述獲得之蝦淋巴細胞，培養於上述細胞培養液中30分鐘至72小時，其中細胞培養液包含或不包含待測樣本。接著，檢測蝦淋巴細胞之細胞存活率，其中未與待測樣本培養的蝦淋巴細胞之細胞存活率為參考值，而與待測樣本培養的蝦淋巴細胞之細胞存活率為測量值。然後，進行判斷步驟，若測量值高於參考值，則判斷待測樣本具有刺激蝦類先天免疫反應之活性。在其他實施例，在共同培養步驟之前，更可選擇性進行前培養步驟，使蝦淋巴細胞培養於不含待測樣本之細胞培養液中至少24小時。

需補充的是，本發明雖以特定的製程、特定配方的試劑、特定的分析方法或特定儀器作為例示，說明本發明之蝦淋巴細胞及其純化方法與用於體外評估先天免疫反應的方法，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之蝦淋巴細胞及其純化方法與用於體外評估先天免疫反應的方法亦可使用其他製程、其他配方的試劑、其他的分析方法或其他儀器進行。

由上述實施例可知，本發明的蝦淋巴細胞及其 純化方法與用於體外評估先天免疫反應的方法，其優點在於使用豬鏈球菌之溶血素重組蛋白(rSly)作為生物型佐劑，可結合其他動物疾病之抗原製得動物用疫苗組成物，以誘發至少一種受免疫動物之體內產生抗體，同時刺激細胞性及體液性免疫反應，以保護受免疫動物免於病原菌感染。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

501/503/505‧‧‧曲線

Claims (12)

1. 一種蝦淋巴細胞的純化方法，包含：提供一蝦體液樣本，其中該蝦體液樣本是源自於白蝦(Litopenaeus vannamei)；進行一前處理，使該蝦體液樣本與一抗凝集劑均勻混合，以形成一單細胞懸浮液，其中該抗凝集劑包含低於10.0g/L之氯化鈉、5.5g/L之檸檬酸、8.0至10.0g/L之檸檬酸鈉、19.8至20.0g/L之葡萄糖以及21.563g/L之葡萄糖胺，且該抗凝集劑具有pH 7.0之酸鹼值；進行一離心步驟，以去除該單細胞懸浮液之一上清液並獲得一細胞沉澱物(cell pellet)；以及進行一培養步驟，使該細胞沉澱物均勻懸浮並培養於一細胞培養液中，以獲得蝦淋巴細胞，其中該細胞培養液包含2倍濃度的L-15培養液、低於10g/L之該氯化鈉、10g/L之該葡萄糖以及15%(v/v)之該胎牛血清，且該細胞培養液具有pH 7.0之該酸鹼值。
2. 根據申請專利範圍第1項所述之蝦淋巴細胞的純化方法，其中該抗凝集劑之該氯化鈉的濃度為8.2g/L，該檸檬酸鈉的濃度為8.8g/L，且該葡萄糖的濃度為19.8g/L。
3. 根據申請專利範圍第1項或第2項所述之蝦淋巴細胞的純化方法，其中該抗凝集劑更包含2.5g/L之乙二胺四乙酸。
4. 根據申請專利範圍第1項所述之蝦淋巴細胞的純化方法，其中該細胞培養液之該氯化鈉的濃度為5 g/L。
5. 根據申請專利範圍第1項所述之蝦淋巴細胞的純化方法，其中該蝦淋巴細胞經該細胞培養液24小時培養後之一細胞存活率為至少90%。
6. 一種蝦淋巴細胞的抗凝集劑，包含低於10.0g/L之氯化鈉、5.5g/L之檸檬酸、8.0至10.0g/L之檸檬酸鈉、19.8至20.0g/L之葡萄糖以及21.563g/L之葡萄糖胺，且該抗凝集劑具有pH 7.0之酸鹼值。
7. 根據申請專利範圍第6項所述之蝦淋巴細胞的抗凝集劑，其中該氯化鈉的濃度為8.2g/L，該檸檬酸鈉的濃度為8.8g/L，且該葡萄糖的濃度為19.8g/L。
8. 根據申請專利範圍第6項或第7項所述之蝦淋巴細胞的抗凝集劑，其中該抗凝集劑更包含2.5g/L之乙二胺四乙酸。
9. 根據申請專利範圍第6項所述之蝦淋巴細胞的抗凝集劑，其中經該抗凝集劑處理之一蝦淋巴細胞經30分鐘培養後之一細胞存活率為至少90%。
10. 根據申請專利範圍第6項所述之蝦淋巴細胞的抗凝集劑，其中經該抗凝集劑處理之一蝦淋巴細胞經60分鐘培養後之一細胞存活率為至少85%。
11. 一種體外評估蝦類先天免疫反應的方法，包含：提供一蝦淋巴細胞，其中該蝦淋巴細胞係利用如申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之蝦淋巴細胞的抗凝集劑處理白蝦(Litopenaeus vannamei)之一體液樣本 而得；進行一前培養步驟，使該蝦淋巴細胞經一細胞培養液培養24小時後之一細胞存活率為至少90%，其中該細胞培養液包含2倍濃度的L-15培養液、低於10.0g/L之氯化鈉、10g/L之葡萄糖、15%(v/v)之胎牛血清且具有pH 7.0之酸鹼值；進行一共同培養步驟，將一蝦淋巴細胞，培養於該細胞培養液中30分鐘至72小時，且該細胞培養液包含或不包含一待測樣本；以及檢測該蝦淋巴細胞之一細胞存活率，其中未與該待測樣本培養的該蝦淋巴細胞之該細胞存活率為一參考值，而與該待測樣本培養的該蝦淋巴細胞之該細胞存活率為一測量值；以及進行一判斷步驟，若該測量值高於該參考值，則判斷該待測樣本具有刺激蝦類先天免疫反應之活性。
12. 根據申請專利範圍第11項所述之體外評估蝦類先天免疫反應的方法，在該共同培養步驟之前，更包含：進行一前培養步驟，使該蝦淋巴細胞培養於不含該待測樣本之該細胞培養液中至少24小時。