CN117599211A - 一种靶向肿瘤的药物递送系统及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物递送系统及抗肿瘤药物领域，具体涉及一种靶向肿瘤的药物递送系统及其制备方法和用途。本发明的靶向肿瘤的药物递送系统中，将多肽18‑4修饰后的牛奶细胞外囊泡作为靶向载体用于递送基因药物CRISPR/Cas9和化疗药物，从而构建新型的靶向肿瘤的药物递送系统。本发明采用的载体生物安全性良好，能够有效的递送CRISPR/Cas9基因药物和化疗药物；装载的基因药物CRISPR/Cas9能够永久的改变基因的表达，并且与化疗药物的联合使用能够发挥协同作用，显著提高对肿瘤细胞的杀伤作用，更有利于发挥抗肿瘤治疗作用。本发明能够为基因药物与化疗药物联合使用以提高疗效、降低药物的毒副作用提供新的思路。

Description

一种靶向肿瘤的药物递送系统及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于药物递送系统及抗肿瘤药物领域，具体涉及一种靶向肿瘤的药物递送系统及其制备方法和用途。
背景技术
乳腺癌(Breast cancer)是一种常见的恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤的30％以上。目前，全世界的乳腺癌发病率还保持着增长趋势，严重危害女性健康。乳腺癌的治疗方法与其他肿瘤的治疗方法类似，有手术治疗、放射疗法和化学药物治疗。目前，治疗乳腺癌的主要方法仍然是手术，有乳腺癌根治手术、改良根治手术、保乳手术等，其中乳腺癌根治手术由于切除部份太大，目前已经很少使用此方法。放射疗法是乳腺癌综合治疗的重要部分，可以辅助手术治疗和化疗，提高治疗效果。化学药物治疗简称为化疗，是一种经过局部治疗后的全身治疗手段，临床上应用广泛的药物有紫杉醇类药物、阿霉素等。除了上述集中治疗方法以外，也陆续出现了其他的治疗方法，如中医中药治疗、生物免疫治疗等。这些方法仍然存在很大的局限性和不良反应，因此有必要寻找一种新的有效的治疗方法，以提高乳腺癌治疗的效果。
与正常组织相比，实体肿瘤组织的血管丰富，血管壁的间隙较宽，结构的完整性较弱，使得一些特定大小的颗粒和分子物质具有长滞留性和高通透性，肿瘤组织的这种特性被简称为EPR效应。在肿瘤治疗研究方面，纳米递送系统仍然是研究的热点。将材料加工制备成0.1～100nm粒径范围的纳米粒的方法称为纳米技术，这种技术能够使材料获得新的功能和特殊性质，在肿瘤治疗方面具有巨大的优势。目前，纳米药物递送体系应用非常广泛，将纳米材料加工制备成药物递送载体可以应用于肿瘤治疗方面。已经出现了许多对递送载体的研究，如金纳米棒、胶束、碳纳米管等。但是这些纳米递送载体的材料容易引起机体的免疫，并且毒性、生物安全性均不能保证，在体内的清除速率也较快，无法将药物有效递送到肿瘤靶向部位，以上问题的存在导致治疗效果大大降低。
CRISPR/Cas9作为新型的基因编辑技术，能够有针对性的对肿瘤相关基因进行敲除、敲入、基因修饰等，以达到治疗肿瘤的目的。CRISPR/Cas9系统对DNA进行永久性编辑的过程，具有脱靶效率低、操作简单、编辑效率高的特点，在肿瘤治疗领域展现出广阔的应用前景。但是由于缺乏合适的递送系统，极大的限制了CRISPR/Cas9在临床上的应用。
因此，亟需构建一种低毒、生物相容性良好，且靶向性和药物疗效好的新型递送系统，以提高CRISPR/Cas9基因药物的递送效率，增强对乳腺癌的治疗效果。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种靶向肿瘤的药物递送系统，其生物安全性好，能够主动靶向乳腺癌肿瘤部位递送CRISPR/Cas9和化疗药物，实现基因药物和化疗联合治疗，降低药物的毒副作用并提高治疗疗效。
本发明的目的之二在于提供一种靶向肿瘤的药物递送系统的制备方法，其采用电穿孔技术实现CRISPR/Cas9和化疗药物的装载，不仅不会破坏牛奶细胞外囊泡以及CRISPR/Cas9的结构，并且所得药物递送系统具有良好的稳定性和递送效率。
本发明的目的之三在于提供一种靶向肿瘤的药物递送系统在制备靶向抗肿瘤药物中的用途，将该药物递送系统用于抗肿瘤药物的制备，有利于实现基因药物与化疗药物联合使用以提高疗效、降低药物的毒副作用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种靶向肿瘤的药物递送系统，以基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体同时装载CRISPR/Cas9质粒和化疗药物构建得到；所述基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体为表面化学偶联有多肽18-4的牛奶细胞外囊泡；所述CRISPR/Cas9质粒具有针对目的基因CD24的敲除功能。
本发明将多肽18-4修饰后的牛奶细胞外囊泡作为靶向载体用于递送基因药物CRISPR/Cas9和化疗药物，从而构建新型的靶向肿瘤的药物递送系统。其中，本发明采用的牛奶细胞外囊泡载体具有天然的信息传递功能，且生物安全性良好，能够有效的递送CRISPR/Cas9基因药物和化疗药物；装载的基因药物CRISPR/Cas9能够永久的改变基因的表达，并且与化疗药物的联合使用能够发挥协同作用，显著提高对肿瘤细胞的杀伤作用，更有利于发挥抗肿瘤治疗作用。体内外试验均证实，本发明的药物递送系统具有良好的生物安全性和抗肿瘤治疗效果，能够为基因药物与化疗药物联合使用以提高疗效、降低药物的毒副作用提供新的思路。
作为进一步优选的方案，所述牛奶细胞外囊泡是以脱脂牛奶为原料，经酸处理法和差速离心法提取纯化得到；所述牛奶细胞外囊泡的水合粒径为120～130nm。本发明采用上述方法提取mEVs，通过该方法提取得到的mEVs体积小，粒径分布均匀，且产率高，杂蛋白含量大大降低，具有更好的生物安全性。
进一步地，对于化疗药物的选择，本发明不进行特殊限定。作为优选地，所述化疗药物为多烯紫杉醇、阿霉素、甲氨蝶呤、顺铂、长春新碱中的一种或多种。更优选地，所述化疗药物为多烯紫杉醇；所述肿瘤为乳腺癌。
本发明采用的牛奶细胞外囊泡(mEVs)，来源于牛奶，牛奶来源广泛，且价格低廉，可以大批量生产，且mEVs与其他种类的细胞囊泡一样，易穿透生物膜、免疫原性低、生物相容性良好、能够携带生物活性物质传递信息，具有良好的生物安全性。然而，实际应用时发现，mEVs虽然具有良好的生物相容性以及一定的载药能力，但是其靶向性较差，且靶向给药的效果较低。多肽18-4是基于P160肽作为先导肽设计开发的一种新型多肽，现有研究证实多肽18-4能够靶向乳腺癌中高表达的角蛋白1(KRT1)受体。然而，如何采用多肽18-4对mEVs进行有效的结构修饰，现有技术中并未见相关报道。
本发明中，为了实现牛奶细胞外囊泡的结构修饰，并保证其结构稳定性，优选地，所述基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体，采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
(1)将牛奶细胞外囊泡与3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯混合，孵育，得到混合液A；另将多肽18-4与Traut’s试剂混合，孵育，得到混合液B；
(2)将步骤(1)所得混合液A、混合液B进行共孵育，然后离心，即得基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体，记为mEVs18-4。
本发明利用Traut's试剂在多肽18-4上生成巯基(-SH)，并利用交联剂3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)在mEVs表面上生成马来酰亚胺基团，然后将两者进行共孵育，从而使mEVs表面的马来酰亚胺基团与多肽18-4上的巯基反应，生成稳定的硫醚键，以成功将多肽18-4连接到mEVs，得到结构稳定性良好的靶向肿瘤载体mEVs18-4。本发明的上述靶向肿瘤载体的制备方法，相较于其他偶联方式(如将多肽18-4表面的马来酰亚胺基团与mEVs上的巯基反应生成稳定的硫醚键的方法)，能够有效避免制备所得靶向载体的聚集现象，提高偶联成功率并改善mEVs的靶向乳腺癌的效果。并且，本发明采用上述化学偶联方法制备靶向性囊泡，偶联过程不会对囊泡的形态和结构产生影响，因此不会影响囊泡的功能。偶联后所得载体mEVs18-4对于乳腺癌细胞有良好的靶向性，能够有效进行基因药物CRISPR/Cas9和化疗药物的装载和递送。细胞摄取和转染试验均证明，本发明采用上述方法制备得到的靶向载体mEVs18-4的摄取率和转染效率最高，表明靶向多肽的偶联显著增加了mEVs对乳腺癌的靶向性，有利于将药物递送到细胞中发挥作用。
优选地，所述3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯为浓度为8～12mg/mL的3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯溶液，3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯的浓度更优选为10mg/mL，溶液中采用的溶剂优选为二甲基亚砜。所述Traut’s试剂中2-亚氨基硫烷盐酸盐的浓度为1.5～2.5mg/mL，更优选为2mg/mL。
基于提高化学偶联成功率以及偶联效率的考虑，进一步地，步骤(1)中，牛奶细胞外囊泡与3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯溶液的质量比为1∶(8～12)，两者孵育的时间为20～40min；所述多肽18-4与Traut’s试剂的质量比为1∶(8～12)，两者孵育的时间为50～80min；步骤(1)中，所述孵育在室温下进行。进一步优选地，步骤(2)中，所述共孵育的时间为20～40min，共孵育在室温下进行；所述离心的转速为100000×g～150000×g，离心时间为1～2h。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
本发明的靶向肿瘤的药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：采用电穿孔技术将CRISPR/Cas9质粒和化疗药物同时载入到所述基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体中，即得所述靶向肿瘤的药物递送系统。
本发明采用电穿孔技术实现基因药物和化疗药物在mEVs18-4中的装载，不仅不会破坏CRISPR/Cas9的结构，并且靶向多肽仍然与囊泡相连，所得载药系统的稳定性更高。
优选地，所述电穿孔的电压为500～900V；电穿孔时，基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体、CRISPR/Cas9质粒和化疗药物的质量比为1～2∶1～2∶2～4。
更优选地，所述电穿孔的电压为700V；电穿孔时，基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体、CRISPR/Cas9质粒和化疗药物的质量比为2∶1∶2。采用该电穿孔条件进行药物递送系统的制备，能够更好地兼顾载药率和包封率，达到最佳的载药效果，避免造成药物的浪费。
进一步地，电穿孔后所得靶向肿瘤的药物递送系统为载药纳米粒子；载药纳米粒子的水合粒径为135～150nm。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
如上所述的靶向肿瘤的药物递送系统在制备靶向抗肿瘤药物中的用途。
进一步地，所述抗肿瘤药物为乳腺癌治疗药物。
试验证实，本发明采用基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体通过装载CRISPR/Cas9和化疗药物构建得到的靶向肿瘤的药物递送系统，能够有效的将CRISPR/Cas9和化疗药物递送到肿瘤细胞中从而有效诱导肿瘤细胞凋亡，显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，发挥显著的抗肿瘤协同治疗作用。活体成像结果表明，本发明的靶向肿瘤载体能够浓集于肿瘤部位，具有良好的肿瘤靶向性。且根据小鼠的体重变化、血常规和肝肾功能指标以及组织切片表明mEVs18-4装载CRISPR/Cas9和化疗药物所得靶向肿瘤的药物递送系统具有良好的生物安全性。
因此，本发明的靶向肿瘤的药物递送系统，具有良好的生物安全性，能够有效主动靶向肿瘤部位递送CRISPR/Cas9和化疗药物，实现基因药物和化疗药物联合治疗肿瘤，降低对人体的毒性和副作用，更好的发挥肿瘤治疗的协同效果。因此，本发明能够为CRISPR/Cas9的递送提供新的研究方向，并为基因药物与化疗药物联合使用以提高疗效、降低药物的毒副作用提供新的思路。
附图说明
图1为本发明实施例1中牛奶细胞外囊泡(mEVs)与多肽18-4的化学偶联示意图；
图2本发明实施例1制备所得牛奶细胞外囊泡(mEVs)的产率；
图3为本发明实施例1所得牛奶细胞外囊泡(mEVs)的粒径、电位、标志性蛋白、TEM微观形貌的分析结果；其中图A为mEVs的粒径图，图B为mEVs电位图，图C为TSG101标志蛋白条带，图D为mEVs的TEM图；
图4为本发明实施例1所得牛奶细胞外囊泡(mEVs)在PBS中的稳定性结果图；
图5为本发明实施例1所得牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体(mEVs18-4)在激光共聚焦显微镜下mEVs和多肽的荧光共定位图；
图6为对比例1所得牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体在激光共聚焦显微镜下mEVs和多肽的荧光共定位图；
图7为本发明实施例1所得牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体(mEVs18-4)的TEM图；
图8为本发明试验例3中质粒转染293T细胞后的测序结果图；
图9为本发明试验例4中CRISPR/Cas9和DTX最佳电穿孔电压的考察结果图；其中(A)CRISPR；(B)DTX(n＝3，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001)；
图10为本发明试验例4中mEVs、CRISPR、DTX最佳质量比的考察结果图；其中(A)载体与CRISPR/Cas9的质量比考察；(B)载体与DTX的质量比考察(n＝3，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001)；
图11为本发明试验例4中不同环境下CRISPR/Cas9和DTX的体外药物累计释放曲线图；其中(A)CRISPR/Cas9；(B)DTX(n＝3，*P<0.05，**P<0.01)；
图12为本发明试验例4中包载药物前后的粒径电位的变化分析图；其中(A)粒径；(B)电位(n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；
图13为本发明试验例4中载药后mEVs18-4/CRISPR/DTX的TEM图；
图14为本发明试验例4中电穿孔后囊泡中CRISPR/Cas9质粒完整性检测结果图；
图15为本发明试验例4中mEVs18-4/CRISPR/DTX在血清中的药物粒径稳定性分析结果图；
图16为本发明试验例4中mEVs18-4/CRISPR/DTX与DNaseⅠ孵育后的琼脂糖凝胶电泳图；
图17为本发明试验例6中不同制剂对乳腺癌细胞的细胞毒性试验结果图；
图18为本发明试验例6中不同制剂对乳腺癌细胞的定量摄取结果分析图；
图19为本发明试验例6中不同制剂与乳腺癌细胞孵育后的荧光定量转染结果图；
图20为本发明试验例6中不同制剂对乳腺癌细胞内CD24蛋白表达的影响及其量化分析结果图；其中，A为定性结果，B为定量结果，(n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；
图21为本发明试验例6中不同制剂对乳腺癌细胞凋亡率测试结果图；
图22为本发明试验例6中不同制剂对乳腺癌细胞侵袭能力的影响图；
图23为本发明试验例6中不同制剂对乳腺癌细胞迁移率的影响图；
图24为本发明试验例7中不同制剂处理后裸鼠肿瘤体积的生长曲线；
图25为本发明试验例7中经过不同制剂治疗后小鼠肿瘤的瘤重结果图；
图26为本发明试验例7中不同制剂组处理后肿瘤切片的TUNEL染色结果图；
图27为本发明试验例7中巨噬细胞含量测定分析图；
图28为本发明试验例7中不同制剂对CD24蛋白表达的影响图；
图29为本发明试验例7中肿瘤炎症因子水平图；
图30为本发明试验例7中体内安全性评价结果图；其中，(A)体重变化(n＝5)；(B)血常规参数(n＝3)；(C)肝功能指标ALT和AST(n＝3)；(D)肾功能指标BUN和Cr(n＝3)。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明的技术方案进行进一步的详细说明，但不构成对本发明保护范围的限制。
以下实施例中，采用的多肽18-4、Traut’s试剂、3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)购自上海生工生物工程股份有限公司；CRISPR/Cas9质粒来自上海吉玛制药技术有限公司；脱脂牛奶来自内蒙古某品牌。Traut’s试剂中2-亚氨基硫烷盐酸盐的浓度为2mg/mL。多烯紫杉醇(DTX)来自成都曼斯特生物科技有限公司。PicoGreen dsDNA定量试剂盒来自翌圣生物科技股份有限公司。其他未做特殊说明的试剂和材料，均为可以从商业途径获取的常规材料。
实施例1
本实施例的靶向肿瘤的药物递送系统，以基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体同时装载CRISPR/Cas9质粒和化疗药物构建得到；所述基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体为表面化学偶联有多肽18-4的牛奶细胞外囊泡；所述CRISPR/Cas9质粒具有针对目的基因CD24的敲除功能。所述肿瘤为乳腺癌。
本实施例的靶向肿瘤的药物递送系统的制备方法，采用电穿孔技术将CRISPR/Cas9质粒和化疗药物同时载入到所述基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体中，即得所述靶向肿瘤的药物递送系统。所述电穿孔的电压为700V；电穿孔时，基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体、CRISPR/Cas9质粒和化疗药物的质量比为2∶1∶2。本实施例采用的化疗药物具体为多烯紫杉醇(DTX)，制备得到的同时装载CRISPR/Cas9质粒和化疗药物多烯紫杉醇的靶向载药体系记为mEVs18-4/CRISPR/DTX。
在其他的实施例中，装载的化疗药物也可以是其他的化疗药物，如阿霉素、甲氨蝶呤、顺铂、长春新碱等。
本实施例的靶向肿瘤的药物递送系统的用途，具体是在制备靶向抗肿瘤药物中的用途。所述抗肿瘤药物为乳腺癌治疗药物。
本实施例中，涉及的牛奶细胞外囊泡(mEVs)，采用酸处理法和差速离心法进行提取和纯化，具体过程是：将脱脂牛奶(分别为750mL、1000mL、1500mL)于37℃水浴中加热10min，然后将牛奶与纯醋酸进行混合(牛奶∶纯醋酸的体积比为100∶1)，于室温下用玻璃棒搅拌5min，然后使用高速离心机于25℃下以5000×g的离心力共离心20min，离心后弃去下层沉淀。然后将上层液体于4℃下10000×g离心40min，弃去下层浑浊液体及上层液体，收集中间液体，再采用0.45μm的抽滤瓶抽滤，滤液进一步使用超滤管浓缩。然后将浓缩液于4℃下以150000×g的离心力离心90min，收集沉淀，其中，离心、收集沉淀的过程共重复3次，最后合并沉淀并重悬于PBS中，采用0.22μm的过滤器过滤重悬液，即得牛奶细胞外囊泡mEVs。
所述牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体(mEVs18-4)是通过化学偶联方法将多肽18-4连接到牛奶细胞外囊泡(mEVs)上。偶联后使用激光共聚焦对mEVs进行荧光共定位来判断囊泡与多肽是否成功偶联。牛奶细胞外囊泡(mEVs)与多肽18-4的化学偶联示意图如图1所示，偶联的具体步骤如下：
(1)将mEVs与DiD(化学名称为1,1-十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚二碳菁)避光孵育30min，然后在15000×g下超高速离心1.5h，得到荧光标记的mEVs，记为D-mEVs)。将D-mEVs与10倍质量的3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液(MBS，浓度为10mg/mL)混合，室温下孵育30min，得到混合液A。另将化学合成的荧光标记的FITC-多肽18-4(生物公司合成)与10倍质量的Traut’s试剂于室温下共同孵育1h，孵育过程加入EDTA防止巯基氧化，得到混合液B。
(2)将混合液A与混合液B于室温下孵育30min，孵育期间加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)防止巯基氧化。反应完成后在超高速离心机中进行离心，设置转速为150000×g，离心1.5h，去除游离的未反应的试剂，即得基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体(mEVs18 -4)。得到载体后使用激光共聚焦显微镜来观察不同通道中的荧光共定位情况。
该实施例中，由于要证实本发明的制备方法能够将牛奶细胞外囊泡(mEVs)与多肽18-4成功偶联，因此对牛奶细胞外囊泡以及多肽18-4均进行了荧光标记，从而方便后续通过荧光共定位直观判断囊泡与多肽是否成功偶联。在其他的实施例中，可以不对mEVs与多肽18-4进行荧光标记，其同样能够实现mEVs与多肽18-4的成功偶联。
本实施例中CRISPR/Cas9质粒的构建过程如下：
一、细菌培养及CRISPR/Cas9质粒的提取
首先按照说明书配置LB液体培养基，用超纯水溶解培养基，于121℃，30min条件下进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，按比例加入氨苄卡那霉素，吸取2mL培养基加入到摇菌管中。将CRISPR/Cas9质粒转化到大肠杆菌中，然后取500μL大肠杆菌菌液加入到摇菌管中活化，于37℃摇床上过夜培养。剩下的未使用的培养基封口放入4℃冰箱保存。活化后的菌液按1:100的比例加入到未使用的培养基中，在摇床上37℃过夜扩大培养。使用去内毒素质粒大提试剂盒的来提取扩增后的CRISPR/Cas9质粒，使用核酸定量仪测定在260nm时的吸光度，记录、分析CRISPR/Cas9质粒的浓度与纯度。
二、CRISPR/Cas9质粒基因敲除验证
2.1 293T细胞培养
选择293T细胞专用完全培养基作为细胞培养液，复苏293T细胞，将293T细胞专用培养基加入到293T细胞中后，放到37℃，CO2浓度为5％的细胞培养箱中培养，待细胞生长至80％以上时消化传代。
2.2细胞转染
使用Lip3000(细胞转染试剂，脂质体)将空白质粒和扩增得到的CRISPR/Cas9质粒转染到293T细胞中，具体操作步骤如下：(1)将细胞以适当的密度接种到6孔板中，加入完全培养基孵育过夜；(2)待细胞长到50％～70％时，按照每孔加入的剂量配制转染液；(3)用PBS清洗细胞后加入新鲜的完全培养基，将转染液缓慢滴加到六孔板中，37℃孵育4h；(4)4h后更换新的细胞培养液，于培养箱中继续培养细胞；(5)24h后在荧光显微镜下观察细胞转染情况。
2.3提取细胞基因组DNA
根据细胞DNA提取试剂盒的说明书提取转染后的细胞DNA。
2.4PCR试验
将从细胞中提取的DNA进行PCR扩增，具体条件如下：PCR反应体系：ddH2O 50μL；2×Quick Extend Hi-Fi Master Mix 25μL；模板DNA 100ng～1μg；引物1(10μΜ)2μL；引物2(10μΜ)2μL。PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火20s，72℃延伸1min；变性、退火和延伸过程循环30～35次；最后72℃终延伸7min。然后将PCR产物置于-20℃保存，防止DNA发生降解。其中，引物1和引物2为根据CD24基因敲除靶点位置设计的引物序列。靶向CD24基因的双gRNA的序列为：
gRNA1：GAGTACTTCCAACTCTGGGT；gRNA2：AATGCCACCACCAAGGCGGC。
2.5纯化PCR产物
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用普通琼脂糖凝胶回收试剂盒回收胶中的PCR产物，将其与引物一起进行Sanger测序，最终得到测序结果图，从而验证CRISPR/Cas9质粒是否具有CD24基因的敲除功能。
基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体的制备对比例1
本对比例的靶向肿瘤载体(mEVs18-4)是通过化学偶联方法将多肽18-4连接到牛奶细胞外囊泡(mEVs)上。对比例1偶联的具体步骤与实施例1基本相同，两者区别仅在于：偶联原理是利用Traut's试剂在mEVs表生成巯基(-SH)，利用交联剂MBS在多肽18-4上生成马来酰亚胺基团，然后马来酰亚胺与巯基生成稳定的硫醚键。具体步骤为：步骤(1)中：将D-mEVs与10倍质量的Traut’s试剂混合，室温下孵育1h，得到混合液A。另将化学合成的荧光标记的FITC-多肽18-4与10倍质量的3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液(MBS，浓度为10mg/mL)混合，于室温下共同孵育30min，得到混合液B。其余步骤同实施例1。
试验例1mEVs的鉴定
1.1、mEVs的产率
从牛奶中采用酸处理法和差速离心法提取mEVs，mEVs的产率是评估牛奶是否可以作为载体来源的重要指标。分别采用BCA蛋白分析试剂盒对mEVs进行蛋白定量，由此得到实施例1中从750mL、1000mL及1500mL牛奶中提取的mEVs的含量，其含量分别为2.83±0.24mg、5.38±0.17mg、7.26±0.33mg。将其换算成每100mL牛奶中mEVs含量后，结果如图2所示。
由图2可知，从750mL、1000mL及1500mL牛奶中提取的mEVs的含量依次为377.33±32μg/100mL，538.00±17μg/100mL，484.00±22μg/100mL。可见1000mL的mEVs产率明显高于750mL及1500mL的产率。原因可能是提取过程中产生了损失，牛奶在浓缩过程中可能有大量囊泡黏附于滤膜及超滤管中，导致重悬过程中黏附于内壁上无法彻底重悬。牛奶量多时，mEVs浓度过高时可能会大量聚集，导致过滤时mEVs被滤膜截留，造成损失，因此在进行mEVs提取时，采用的牛奶量不宜过大，需要与装置和仪器的处理能力相匹配。
1.2、粒径、电位、标志性蛋白、形貌以及稳定性
使用粒度仪测量实施例1提取的mEVs的粒径和电位，并通过蛋白免疫印迹法试验来检测mEVs中是否含有EVs所具有的标志性蛋白。然后使用透射电子显微镜(TEM)对提取的mEVs的形貌进行表征。结果如图3所示。由图3可知，mEVs的水合粒径为125.63±2.45nm(参见图3A)，mEVs的Zeta电位为-12.76±1.38mV(参见图3B)，仪器得出的多分散性指数(PDI)为0.23±0.05。说明本发明制备的mEVs粒径大小较为均一，可用于后续试验研究。标志性蛋白检测结果如图3C所示，在所提取的mEVs中成功检测出EVs标志性蛋白条带TSG101，且条带显示蛋白含量丰富，这进一步验证了从牛奶中提取mEVs的可能性。图3D为mEVs的TEM形貌图。由图3D可知mEVs具有明显的囊泡结构，且具有磷脂双分子层结构，形状接近圆形，呈现茶托或者一侧有凹陷的半球形结构，mEVs的直径在80～110nm左右，粒径分布比较均匀，进一步说明从牛奶中提取mEVs具有可行性。透射电镜观察得到的直径比激光纳米粒度仪测得的水合粒径略小，可能是因为mEVs在水相中存在较大的表面张力，从而使得其水合粒径增加。
进一步采用pH＝7.4的PBS混悬实施例1制备得到的mEVs，放置于4℃冰箱中，在0、1、3、5、7天分别取样检测mEVs的粒径电位，来评价其在PBS中的稳定性。结果如图4所示。由图4可知，将mEVs分散于PBS中，溶液澄清透明，并且放置七天后，仍然保持澄清状态，未发现有大颗粒聚集情况，表明mEVs在PBS中分散性良好。通过在七天内取点进行检测，发现mEVs的电位未发生明显变化。随着时间的增加，粒径逐渐增大。分析原因可能是mEVs发生了轻微的聚集，但这种聚集情况较小，粒径增大的趋势比较缓慢。通过分析粒径电位，可以说明mEVs在pH＝7，温度为4℃的PBS中稳定性良好，能够有效支撑后续载体的应用研究。
试验例2mEVs18-4的鉴定
2.1、偶联情况分析
采用激光共聚焦显微镜来判断实施例1和对比例1制备得到的mEVs18-4的偶联情况，结果分别如图5、6所示。
由图5可知，通过激光共聚焦显微镜来判断本发明实施例1的偶联情况，mEVs用DiD染色，因此在显微镜下呈现红色荧光；多肽用FITC标记，在显微镜下呈现绿色荧光。激光共聚焦显微镜拍摄不同荧光通道的图片后，把两个荧光通道的图片进行合并(Merge)，观察是否共定位，从图中可以看出，本发明合并后的两个通道的荧光发生了有效重叠，并且荧光显示均匀，说明多肽18-4与mEVs成功偶联，且靶向载体分布均匀，偶联效果好，利于后续进行药物的装载和递送。
由图6可知，对比例1的共聚焦图中显示的荧光呈现大量聚集现象，即出现靶向载体大量聚集的现象，不利于后续药物的装载和递送。
2.2、粒径、电位、TEM形貌变化分析
采用试验例1中的相同方法对mEVs18-4的粒径和电位进行分析。试验表明，靶向mEVs18-4成功构建后，水合粒径为130.45±3.48nm，电位为-16.19±0.14mV，PDI为0.18±0.06。说明与多肽偶联后，囊泡的电位的绝对值增大，粒径和PDI没有发生明显的变化。多肽的电位为负值，与mEVs结合后使其电位也往左发生了偏移。使用透射电镜对所制备的靶向囊泡mEVs18-4进行表征，判断连接多肽后对囊泡的结构和形态是否会产生影响。结果如图7所示。由图7可知，在与多肽偶联后，囊泡的结构没有被破坏，形态没有发生明显变化，还是呈现一个茶托或者一侧有凹陷的半球形结构，且直径也没有发生较大变化，说明偶联过程并不会对囊泡的结构产生影响。
试验例3CRISPR/Cas9质粒的提取和验证
3.1、CRISPR/Cas9质粒的设计
构建双gRNA的CRISPR/Cas9系统，质粒由上海吉玛制药技术有限公司合成。该质粒的大小约为9.3kb，原核抗性为氨苄卡那霉素，质粒上有绿色荧光蛋白标签EGFP。由于设计合成的CRISPR/Cas9质粒已经成功转化到大肠杆菌中，因此，需要对含有质粒的大肠杆菌进行培养来扩增质粒，试验时从大肠杆菌中提取得到所需要的质粒。通过核酸定量仪来计算得到质粒的含量。
结果表明200mL大肠杆菌经过过夜培养后提取得到的质粒含量为1.75±0.27mg，其中A260/A280数值在1.8～2.0之间(若数值小于1.8时表示出现了蛋白质污染，大于2.0时表示出现RNA污染)，说明本发明的提取过程没有出现质粒污染，满足使用要求。
3.2、CRISPR/Cas9基因编辑功能的验证
CRISPR/Cas9质粒设计好以后，要判断其对CD24基因是否有基因编辑的能力。因此需要将质粒导入到细胞中，提取细胞中的DNA，通过PCR扩增后进行测序来判断基因编辑功能。通过测序可以判断目的DNA突变缺失情况，测序结果如图8所示。
由图8可知，加深部分为两个靶点位置，通过正向测序和反向测序可以看出，转染CRISPR/Cas9的基因组中，两个靶点位置之间的基因序列发生了碱基缺失情况，而空白质粒组并没有，因此证明设计合成的CRISPR-Cas9质粒具有基因编辑的作用，能够敲除CD24基因，沉默CD24的表达。
试验例4基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体装载CRISPR/Cas9质粒的应用效果
4.1、最佳电穿孔电压的考察
电穿孔是在施加外部电压后，囊泡上会形成亲水孔洞的过程，药物可以从孔洞中进入到囊泡内部，从而达到载药的目的。将mEVs18-4与药物混合后，利用电穿孔方法进行载药。通过对装载药物的含量、粒径电位的变化进行研究，来考察不同电压下的载药效率，选择最佳电穿孔电压条件。
将载药率、包封率、粒径、电位和PDI作为指标，考察利用电穿孔将CRISPR/Cas9质粒和DTX载入到mEVs18-4中的最佳电穿孔电压。分别取质量均为50μg的实施例1的mEVs18-4与CRISPR/Cas9混合均匀，然后转移至规格为2mm的电转杯中。盖子盖紧后将电击杯固定在电穿孔仪上进行电穿孔，电穿孔后于4℃放置20min，以增加药物的载入效率，然后于37℃放置20min，以促进囊泡结构的恢复。DTX的载入方式与CRISPR/Cas9质粒一致。电穿孔仪的电容固定为50μF。
其中，粒径、电位和PDI的测试方法同试验例1，囊泡载药率和包封率的测定过程如下：mEVs18-4载体经电穿孔载CRISPR/Cas9质粒后，加入一定量的DNase I酶将多余的质粒消化，然后用EDTA终止消化，于超高速离心机上15000rpm，90min，4℃条件进行离心。离心所得的载药囊泡使用TRIZOL试剂提取其中的CRISPR/Cas9质粒。电穿孔载多烯紫杉醇(DTX)后，将其用超滤管(MWCO＝100kDa)超滤，所得的滤液采用高效液相测定多烯紫杉醇含量。
其中，包封率和载药率的计算公式如下：包封率(wt.％)＝(装载药物的量/投入药物的量)×100％；载药率(wt.％)＝[装载药物的量/(投入药物的量+投入载体的量)]×100％。
最佳电穿孔电压的考察结果如表1、2以及图9所示。
表1CRISPR/Cas9质粒的最佳电穿孔电压的评价
表2多烯紫杉醇的最佳电穿孔电压的评价
由表1、表2结合图9可知，在电压为700V和900V时，两种药物的载药率与包封率均达到最大，两者无显著性差异(P>0.05)。通过对700V和900V电压下的粒径进行分析，发现电压为900V时的粒径明显增加(*P<0.01)，电位的绝对值也增大。对施加700V和900V电压的mEVs18-4进行TEM观察，发现施加700V电压进行电穿孔后mEVs18-4外表形态无明显变化，没有对结构造成明显的破坏。而经过900V电压进行电穿孔后，mEVs18-4的外表形态变得非常粗糙，内部充实，形态成球型。因此通过载药率、包封率、粒径电位及透射电镜等方面综合考虑，选择700V作为最佳电穿孔电压。
4.2、最佳载药质量比的考察
电穿孔载药过程中，若mEVs18-4过多，会导致无法充分利用囊泡，甚至会产生空载情况；若药物过多，则会导致游离药物过多，载药不充分。为了避免产生浪费，充分利用载体的装载能力，十分有必要考察mEVs18-4与药物之间的质量比例，通过对载药率和包封率进行考察，找出最佳质量比。
固定mEVs的质量为15μg，按3:1、2:1、1:1、1:2、1:3的比例分别均匀混合mEVs18-4和CRISPR/Cas9后，转移至2mm规格的电转杯中。盖子盖紧后将电击杯固定在电穿孔仪上进行电穿孔，电穿孔后于4℃放置20min，然后于37℃放置20min，测定载药率和包封率。
固定mEVs18-4与CRISPR/Cas9质量分别为15μg和7.5μg，改变多烯紫杉醇(DTX)的量，将mEVs18-4与DTX按3:1、2:1、1:1、1:2、1:3的比例混合后，以相同电穿孔方式进行载药，测定载药率和包封率，确定载药的最佳质量比。结果如表3、表4和图10所示。
表3mEVs与CRISPR/Cas9最佳质量比的考察
表4mEVs与DTX最佳质量比的考察
考察CRISPR/Cas9与mEVs18-4之间的质量比，结果如表3和图10A所示，固定载体的质量，改变CRISPR/Cas9质粒的量，随着载体所占比例的增加，载药率和包封率均随之增加，当mEVs18-4与CRISPR/Cas9质量比为2:1时，载药率和包封率均达到最大值。当比例继续增加至3:1时载药率和包封率均降低，主要是由于质粒的浓度太小，导致载药不充分。
进一步固定载体与CRISPR/Cas9质量分别为15μg和7.5μg，改变DTX的量，考察DTX与载体之间的比例。结果如表4和图10B所示。当载体和DTX的比例为1:1时，DTX的包封率最大，当比例为1:2时，载药率达到最大值，但与1:1时的载药量没有显著性差异(P>0.05)。并且从包封率来看，1:2时有大量药物未被包载入囊泡中，造成DTX的浪费。与DTX进行共载时，CRISPR/Cas9的包封率降低，推测是两个药物共载时存在竞争的情况，使得两种药物的包封率和载药量均有所下降。因此，综合考虑DTX和CRISPR/Cas9的载药量和包封率情况，选择mEVs∶CRISPR∶DTX＝2∶1∶2时的比例作为最佳质量比进行后续载药。
4.3、药物释放性能测定
为了探究制剂的药物释放情况，通过模拟体内环境来考察mEVs18-4/CRISPR/DTX的在体内的释药行为。具体操作时：将载药囊泡置于pH为7.4和5.0的环境中来模拟药物的释放行为。具体操作为：取载药后的制剂，根据载药量制备出CRISPR/Cas9和DTX为5μg和20μg的载药囊泡，将载药囊泡分别置于四个经过预先活化的截留分子量为100kDa的透析袋中。配置pH＝7.4和pH＝5.0的PBS缓冲液，将透析袋浸没到盛有PBS缓冲液的50mL离心管中，放于恒温摇床上100rpm，37℃模拟体表温度，进行体外释放试验。在2、4、6、8、10、12、24、48h进行取点检测，并补加相同体积的空白释放介质。检测CRISPR/Cas9的含量采用PicoGreendsDNA方法，高效液相色谱仪检测DTX的浓度。以时间为横坐标，药物的累积释放量为纵坐标作曲线，计算药物的累积释放百分率。结果如图11所示。
由图11A的CRISPR/Cas9药物的体外药物释放图可知，在pH＝7.4和pH＝5.0的条件下，48h的累积释放量分别达到了35.90±0.93％和39.20±0.49％。DTX药物的体外药物释放如图11B所示，在pH＝7.4和pH＝5.0的条件下，48h内的累积释放量分别达到了29.80±0.67％和33.70±0.57％。在pH＝5.0时两种药物的释放速率与pH＝7.4相比均增加，药物的累积释放量更高，这可能是因为在酸性环境中，囊泡的分子结构可能会发生变化，导致药物的释放。但是两种条件下，药物的累积释放量均未达到50％，这也说明无论是中性环境还是肿瘤酸性微环境中，mEVs18-4均能起到保护药物的作用，阻止药物在到达靶部位前释放，具有良好的稳定性。
4.4、载药后形貌和尺寸的考察
分别取适量电穿孔后的载药囊泡(载药囊泡制备时采用前述优选得到的工艺条件，电穿孔电压700V；mEVs∶CRISPR∶DTX＝2∶1∶2)，使用透射电子显微镜对电穿孔及载药后的形貌进行表征。使用激光粒度分析仪对载药囊泡的粒径和电位进行测定。结果如图12和图13所示。
粒径电位测试结果表明，mEVs18-4/CRISPR/DTX的水合粒径为141.50±1.67nm，电位为-21.32±1.36mV，PDI为0.25±0.03。由图12可知，经过电穿孔载药后，粒径增大，电位的绝对值增大，质粒的载入使得囊泡表面的负电荷增加，Zeta电位值进一步减小。在mEVs18 -4/CRISPR/DTX载药体系构建过程中，粒径逐渐增大，电位的绝对值也逐渐增加。电穿孔载药后，对所得的mEVs18-4/CRISPR/DTX制剂进行TEM表征，观察电穿孔后的变化。由图13的TEM图可知，施加700V电压进行电穿孔后，形状没有发生很大的变化，也没有破坏其结构，但其直径有所增加，这与使用激光粒度仪对制剂的检测结果相符。
4.5、电穿孔对CRISPR/Cas9质粒结构完整性的影响分析
为了探究电穿孔载药后，对载入到囊泡中的质粒是否产生影响，使用TRIZOL试剂从载药后的囊泡中提取CRISPR/Cas9质粒，进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图14所示。由图14可知，左侧两条条带的含量为载药时投入的CRISPR/Cas9的量，右侧两条为提取的CRISPR/Cas9的量，从图中可以看出条带位置保持一致，且无明显拖尾现象，这说明电穿孔并没有破坏质粒的结构。对两个条带进行半定量，结果表明载药后的mEVs18-4中CRISPR/Cas9的量占投入CRISPR/Cas9总量的19.97±0.02％，这与包封率相符合。
4.6、电穿孔对靶向囊泡的影响
为了判断电穿孔对多肽与囊泡的连接是否会产生影响，使用激光共聚焦观察多肽与囊泡共定位情况。具体是使用激光共聚焦进行成像，根据是否存在荧光共定位情况来判断电穿孔是否会破坏多肽与囊泡的连接。结果显示，绿色荧光为多肽标记的FITC，红色荧光为DiD对mEVs进行染色后的荧光，两个荧光重合，说明电穿孔没有导致多肽与mEVs之间的连接发生断裂。说明电穿孔不会影响囊泡的结构。
4.7、稳定性分析
4.7.1、血清稳定性分析
本试验将适量新制的mEVs18-4/CRISPR/DTX悬浮在含有10％FBS的DMEM培养液中，置于37℃环境中，在0、3、6、12、24h时取样检测粒径电位，根据粒径电位的变化，评价mEVs18 -4/CRISPR/DTX的稳定性，结果如图15所示。由图15可知，mEVs18-4/CRISPR/DTX制剂在血清中分散性良好，没有出现明显的浑浊现象。并且mEVs18-4/CRISPR/DTX制剂的水合粒径和电位均未发生明显变化。放置24h以后，血清仍然保持澄清状态，未出现明显沉淀浑浊现象，这表明制剂在4℃血清中具有良好的分散性和稳定性。
4.7.2、DNaseⅠ中的稳定性分析
脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)是一种脱氧核苷酸酶，能够对DNA进行水解。将DNaseⅠ酶与制剂共孵育，在不同的时间点提取并观察质粒的琼脂糖凝胶电泳结果，与未载入囊泡的质粒进行对比。具体操作时：取游离CRISPR/Cas9质粒与负载等量CRISPR/Cas9质粒的mEVs18-4/CRISPR制剂，加入到含有DNaseⅠ的溶液中，于37℃条件下孵育0、2、4、6、8、12h。在每个时间点时加入EDTA(5mM)终止消化，使用TRIZOL提取囊泡中未被降解的质粒。通过琼脂糖凝胶电泳试验对未被降解的质粒进行分析，评估mEVs18-4对CRISPR质粒是否有保护能力。结果如图16所示。
由图16可知，游离的质粒在与DNaseⅠ酶孵育后2h内已被完全水解，而制剂中的CRISPR/Cas9质粒与DNaseⅠ酶共孵育8h后仍然有清晰的条带，且在12h后还保留有未被水解的质粒。这表明载体对CRISPR/Cas9质粒具有保护作用，进入体内后能够有效的阻止体内的DNaseⅠ酶对其水解，防止其在到达靶点部位前被降解，更好的发挥药效，并且可以减轻由于药物渗漏而产生的毒副作用，使其能够安全高效的到达靶部位，发挥治疗作用。
试验例5mEVs安全性评价
本发明在细胞和动物水平上对mEVs是否具有生物安全性进行了探究。首先在细胞水平上，通过MTT方法验证了mEVs即使在高浓度下也不会产生明显的细胞毒性。在动物水平上，设置高、中、低三个浓度的mEVs组和LPS(脂多糖)组，生理盐水组作为对照组。在小鼠尾静脉给药期间，不同浓度mEVs组小鼠的体重始终与生理盐水组保持一致，但LPS组的体重出现了降低的趋势。通过检测小鼠的血液生化指标来分析mEVs的毒性，小鼠的血常规与肝肾功能指数均保持在正常范围内，与生理盐水组没有显著性差别。进一步对小鼠的脾脏指数、脾脏免疫细胞、腹腔液淋巴细胞和细胞因子进行检测，三个不同浓度的mEVs组与生理盐水组均没有显著区别，而LPS组的值均显著增大。综上所述，mEVs没有明显的免疫刺激性和毒性，具有良好的生物安全性。
试验例6mEVs18-4/CRISPR/DTX体外细胞学研究
6.1、MTT法测定细胞毒性
采用MTT法测定细胞毒性评价制剂对人源乳腺癌细胞(MCF-7)的细胞毒性作用。设置DTX组、CRISPR/Cas9组、mEVs18-4/DTX组、mEVs18-4/CRISPR组、mEVs18-4/CRISPR/DTX组(载药时采用前述优选得到的工艺条件，电穿孔电压700V；mEVs∶CRISPR∶DTX＝2∶1∶2)，保持用药量一致，每组按照DTX、CRISPR/Cas9或者CRISPR/Cas9+DTX设置如下浓度：0.5、5、10、50、100μg/mL，每组浓度设置3～6个复孔，并设置对照组。结果如图17所示。
由图17可知，设置不同浓度的单独给药组和联合给药组，随着药物浓度的增加，细胞毒性也随之增加，存活率逐渐降低。直接将CRISPR/Cas9质粒加入到细胞培养液中，质粒难以进入细胞或进入细胞的含量极少，因此对细胞产生的抑制作用微弱。抑制效果最好的是mEVs18-4/CRISPR/DTX组，单独给药组mEVs18-4/CRISPR组和mEVs18-4/DTX组的抑制效果明显低于联合给药时的抑制效果，说明联合给药时基因药CRISPR/Cas9和化疗药物DTX能够发挥协同作用，更有利于细胞毒性作用的提高。在mEVs18-4/CRISPR/DTX载药浓度为10μg/mL时，细胞存活率已经低于50％，因此后续试验均采用该浓度的制剂进行试验。
6.2、细胞摄取试验
定性摄取试验：待MCF-7细胞长到密度为80％以上后，胰酶消化得到细胞悬液。将细胞爬片放置到24孔板中，每孔加入7×104个细胞，过夜培养。使用FITC代替DTX载药，设置FITC组、FITC-mEVs组、FITC-mEVs18-4组，FITC的浓度为10μg/mL，待细胞密度达到70％～80％时给药。分别孵育1h、2h、4h后，移去培养液。PBS清洗3遍，使用4％多聚甲醛对细胞进行固定，15min后移去多聚甲醛，用PBS清洗3遍。避光加入1μg/mL的DAPI染液染色15min，孵育完成后使用PBS清洗3遍。将爬片扣出，倒扣在滴有抗荧光衰减封片剂的载玻片上，使用激光共聚焦显微镜进行图像采集并观察细胞摄取情况。结果表明，FITC组加入到细胞后，在4h时细胞的绿色荧光强度依然很弱，这表明细胞对FITC的摄取较低，FITC无法进入到细胞内部，而FITC-mEVs组和FITC-mEVs18-4组的FITC均在细胞内有大量存在，因此说明囊泡可以携带药物进入到细胞内。1h、2h、4h时FITC-mEVs18-4组的绿色荧光强度均明显高于FITC-mEVs组，加入靶向性囊泡后，进入细胞的FITC明显增多，这表明载体mEVs与靶向性多肽连接后，增加了囊泡对细胞的靶向性，更有利于药物进入细胞。
为了分析各组制剂在1、2、4、6h时的细胞摄取情况，使用流式细胞仪对细胞的摄取情况进行分析。定量摄取试验：按照定性摄取操作方法，以每孔1.5×105个细胞的密度将细胞加入到12孔板中，不放置细胞爬片，增加一个6h的时间点和不加制剂的对照组。取消细胞固定及DAPI染色，直接消化离心后使用流式细胞仪对细胞内的荧光强度进行检测。结果如图18所示。由图18可知，在共孵育过程中，FITC-mEVs18-4组和FITC-mEVs组的荧光强度始终高于FITC组(P<0.001)，这说明囊泡能够携带物质进入细胞，提高了药物递送效率。并且FITC-mEVs18-4组在4h时的细胞摄取率已经接近于100％，FITC-mEVs组在6h时细胞摄取率也接近100％，此时两组制剂之间没有显著性差异(P>0.05)，但仍然高于FITC组(**P<0.01)，这表明FITC-mEVs18-4组的制剂具有更高的靶向性。以上结果表明mEVs有利于将内部包裹的物质递送到细胞中，并且靶向性多肽的连接增加了mEVs的靶向性，极大的提高了药物的递送效率。
6.3、细胞转染试验
为了研究载体是否能够有效地将CRISPR/Cas9质粒递送到细胞中，使用激光共聚焦显微镜观察CRISPR/Cas9质粒在细胞中的荧光表达情况，以评价质粒进入细胞情况。其中，定性转染：将MCF-7细胞接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，过夜培养。将细胞分为5组：Control组、CRISPR/Cas9组、Lip3000组(脂质体)、mEVs/CRISPR组、mEVs18-4/CRISPR组，每组质粒10μg。待细胞密度达到50％～60％后，加入制剂，置于培养箱中继续培养24h。于激光共聚焦显微镜下观察荧光表达情况。定量转染定量转染试验方法与定性转染类似，培养24h后，用PBS清洗3遍，消化离心后用PBS重悬细胞，在流式细胞仪上检测荧光强度。定性转染结果表明，Control组无荧光表达，CRISPR/Cas9组基本上没有荧光表达，这说明质粒难以在无外部条件刺激下进入细胞或进入细胞的含量极少。其余三组中，Lip3000试剂是一种常见的转染试剂，在细胞中有少量荧光。mEVs18-4/CRISPR组和mEVs/CRISPR组的荧光表达均比Lip3000组的多，因此说明mEVs更能有效的将CRISPR/Cas9递送到细胞中，并且对CRISPR/Cas9具有保护作用。mEVs18-4/CRISPR组的荧光表达最多，表明靶向多肽的连接增加了EVs的靶向性，提高了CRISPR/Cas9进入细胞的效率。
对转染情况进行定性分析后，进一步通过流式细胞仪对转染情况进行定量分析。结果如图19所示。由图19可知，与定量分析结果一样，mEVs18-4/CRISPR组荧光强度最高，其次为mEVs/CRISPR组，且这两组之间存在显著性差异(***P<0.001)，表明mEVs18-4/CRISPR组的制剂具有良好的靶向性。Lip3000组的荧光强度与囊泡组的荧光强度存在显著性差异(***P<0.001)，证明了囊泡能够有效的将CRISPR/Cas9质粒递送到细胞中，并对CRISPR/Cas9进行保护，有效避免CRISPR/Cas9在进入细胞之前发生降解。
6.4、测序检测CD24基因编辑情况
RISPR/Cas9质粒是通过编辑细胞的DNA来发挥作用的，因此载体将质粒递送到细胞内后，需要检测细胞中CD24基因是否发生变化，进而评估载体的递送能力。将mEVs18-4/CRISPR与细胞共孵育24h，提取细胞DNA，使用PCR技术对DNA进行扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳和回收来对DNA进行纯化，对纯化后的DNA进行测序。试验时，将MCF-7以每孔3×105个细胞接种于6孔板中，培养24h。待细胞密度达到50％～60％时，将质粒为10μg的mEVs18-4/CRISPR制剂加入细胞中，于培养箱中继续培养24h。然后进行DNA提取与PCR操作测定CD24基因编辑情况。细胞测序结果表明，经过正向测序和反向测序后，DNA序列在两个靶点位置之间发生碱基缺失情况，表明CRISPR/Cas9进入细胞后发挥了基因编辑的作用，mEVs18-4可以有效的保护CRISPR/Cas9质粒，递送到细胞内发挥治疗作用。
6.5、WB检测CD24的表达
以每孔3×105个细胞将MCF-7细胞接种于6孔板中，过夜培养。将细胞分为5组：Control组、CRISPR/Cas9组、Lip3000组、mEVs/CRISPR组、mEVs18-4/CRISPR组，每组质粒各10μg。于培养箱中孵育24h后，胰酶消化离心，按六孔板每孔150～250μL加入RIPA裂解液(裂解液中事先按比例加入PMSF)。于冰上或4℃裂解30min。充分裂解后，于4℃离心机上10000×g～14000×g离心3～5min，取上清得到全蛋白。通过MCF-7细胞中CD24蛋白的表达情况进一步分析不同制剂中CRISPR/Cas9质粒的基因沉默情况，评估载体递送效果。结果如图20所示。
由图20可知，CRISPR/Cas9组中CD24蛋白的表达与Control组之间没有显著性差异(P>0.05)，这表明直接将CRISPR/Cas9质粒加入到培养液中，质粒很难进入到细胞发挥基因编辑作用。Lip3000组与CRISPR/Cas9组相比，Lip3000组蛋白表达明显降低(**P<0.01)，但Lip3000组与mEVs/CRISPR组之间没有显著性差异(P>0.05)，说明mEVs能够有效保护CRISPR/Cas9，防止其降解，与常见的转染试剂Lip3000相同，均能促进CRISPR/Cas9进入细胞。mEVs18-4/CRISPR组的蛋白表达最少，证明了靶向多肽能够提高mEVs的靶向效率，增加了细胞的摄取，有利于CRIPR/Cas9发挥基因沉默作用。因此，mEVs18-4/CRISPR制剂能够有效的将CRISPR/Cas9质粒递送到细胞中，抑制CD24基因的表达。
6.6、细胞凋亡试验
以每孔3×105个细胞将MCF-7细胞接种于6孔板中，过夜培养。将细胞分为6组：Control组、CRISPR/Cas9组、DTX组、mEVs18-4/CRISPR组、mEVs18-4/DTX组、mEVs18-4/CRISPR/DTX组(载药时采用前述优选得到的工艺条件，电穿孔电压700V；mEVs∶CRISPR∶DTX＝2∶1∶2，下同)，按照10μg的用药量给药。细胞浓度达到60％～70％后，给药处理，放置于培养箱继续培养24h。根据细胞凋亡试剂盒说明书对细胞进行处理后，使用流式细胞仪进行检测。结果如图21所示。
由图21可知，CRISPR/Cas9组的细胞凋亡率在24h时仅达到了3.38％，与Control组的细胞凋亡率没有显著性差异(P>0.05)，DTX组的细胞凋亡率达到了11.3％。当将CRISPR/Cas9与DTX分别载入到mEVs18-4中，细胞凋亡率分别达到了18.4％和26.5％，细胞凋亡率显著大于游离组，这表明mEVs18-4极大的增加了细胞对制剂的摄取。当CRISPR/Cas9与DTX共同载入mEVs18-4进行给药后，细胞凋亡率达到了49.1％，说明CRISPR/Cas9与DTX联合使用能够提高治疗效果，促使肿瘤细胞大量凋亡。
6.7、细胞侵袭试验
为评估不同制剂对MCF-7细胞侵袭能力的影响，使用基质胶进行探究。将基质胶提前一天从-20℃取出，置于4℃冰箱过夜解冻。MCF-7细胞计数后按照每孔3×105个细胞接种于6孔板中，于培养箱中过夜培养。按照1:30的比例使用无血清的细胞培养液对解冻后的基质胶进行稀释。在预冷的Transwell小室中加入100μL稀释后的基质胶，于培养箱中放置3h后，将上室中多余液体弃去。在上室中每孔加入100μL的DMEM基础培养基，于培养箱放置30min进行基底膜水化，弃去上室多余液体。按照每孔5×104个细胞加入到小室中，下室中加入500μL完全培养基，注意避免底部产生气泡。按照6.6节进行试验分组并加入药物。培养24h后，吸出小室中的培养基，使用PBS清洗三遍，加入4％多聚甲醛进行固定。15min后移去多聚甲醛，用镊子夹取小室在PBS中清洗。用0.1％结晶紫染色5～10min后，在PBS中清洗三遍，用棉签轻轻擦拭上室。使用光学显微镜对细胞穿透下室情况进行拍照观察。结果如图22所示。
由图22可知，CRISPR/Cas9组与Control组之间细胞侵袭数量没有显著性差异(P>0.05)，DTX组、mEVs18-4/CRISPR组、mEVs18-4/DTX组和mEVs18-4/CRISPR/DTX组的细胞侵袭能力逐渐降低，mEVs18-4/CRISPR/DTX组的抑制侵袭作用最强，穿透基质胶的细胞数目与Control组存在着显著性差异(P<0.0001)。结果表明，mEVs18-4能够提高药物的摄取率，CRISPR/Cas9与DTX联合使用能够有效抑制肿瘤细胞的侵袭能力，显著提高肿瘤的治疗效果。
6.8、细胞划痕试验
以每孔3×105个细胞将MCF-7细胞接种于6孔板中，待细胞生长到90％的密度后，使用200μL枪头垂直6孔板底部进行快速划线。PBS清洗后，加入无血清DMEM培养基。在显微镜下随机选取3个视野对图像进行采集，此时记为0h。按照6.6节进行试验分组并加入药物。加药后培养24h后，选择与0h相同的视野下采集图像，观察细胞的迁移情况。划痕面积使用Image J软件进行处理，迁移率根据以下公式进行计算：迁移率(％)＝((0h划痕面积-48h划痕面积)/0h划痕面积)×100％。结果如图23所示。
如图23所示，CRISPR/Cas9组的细胞迁移率与未经过处理的Control组之间没有显著性差异(P>0.05)，推测可能是直接将CRISPR/Cas9与细胞孵育时，细胞摄取太低，质粒无法进入到细胞中发挥作用。mEVs18-4/CRISPR组和mEVs18-4/DTX组的细胞迁移率较低，与对照组和CRISPR/Cas9组均有显著性差异(**P<0.01)，表明mEVs18-4能够有效的保护CRISPR/Cas9质粒，显著提高细胞对CRISPR/Cas9和DTX的摄取，进而抑制细胞的迁移能力。细胞迁移率最低的是mEVs18-4/CRISPR/DTX组，这说明基因药物CRISPR/Cas9与化疗药物DTX的联合使用极大的抑制了细胞迁移，并且从图中可以看出，mEVs18-4/CRISPR组、mEVs18-4/DTX组和mEVs18-4/CRISPR/DTX组的细胞均有脱落死亡的现象，进一步说明mEVs18-4能够促进细胞的摄取，发挥药物治疗肿瘤细胞的作用。并且CRISPR/Cas9与DTX的联合使用极大的提高了治疗效果，抑制细胞的迁移，有效的诱导细胞发生凋亡。
试验例7mEVs18-4/CRISPR/DTX体内药效学研究
本试验所使用的小鼠为BALB/c裸鼠，SPF级别，从北京斯贝福生物科技有限公司购入，雌性，6～8周龄，体重为15～20g。动物饲养室条件为20～25℃、40％～70％的相对湿度，周期为光照和黑暗12h交替。将MCF-7乳腺癌细胞培养传代至合适的密度后，使用胰酶消化离心，细胞沉淀用PBS重悬，再按照1:1的比例与基质胶进行混合，在每只裸鼠的右侧腋下部位接种浓度为1×107个/只的细胞悬液。每天观察接种部位的肿瘤生长情况，当肿瘤的体积为100～200mm3时，可以进行下一步试验研究。
7.1、体内分布研究
为了考察靶向制剂在体内的分布与靶向情况，使用小动物活体成像仪对裸鼠体内制剂的分布进行实时追踪。当BALB/c裸鼠的肿瘤体积达到100mm2后，使用DiR(细胞膜荧光探针)代替CRISPR和DTX进行体内生物分布研究。BALB/c裸鼠分为三组(n＝3)：游离DiR组、DiR-mEVs、DiR-mEVs18-4组。三组制剂中DiR的浓度均为5mg/kg，将制剂通过尾静脉注射到小鼠体内，此时的时间记为0h。使用近红外光活体成像法检测制剂在不同时间(4、8、12、24、48、72h)内在体内的荧光强度。腹腔注射戊巴比妥钠对裸鼠进行麻醉，使用活体成像仪采集裸鼠的X-ray图像和荧光图像，考察体内分布，以评价制剂对肿瘤组织的靶向性和各非靶组织的浓度以评价副作用。结果表明，将制剂通过尾静脉注射到MCF-7乳腺癌小鼠中，游离的DiR在体内的荧光最弱，主要存在于四肢和脑部，肿瘤部位始终未见荧光信号的出现，且在24h时体内的游离DiR几乎被完全清除掉。mEVs组与游离的DiR相比，8h时在肿瘤中检测到荧光信号，但是，有部分荧光信号集中于头部和四肢部位，说明mEVs的靶向性较差，无法完全靶向于肿瘤部位，因此应用于载药时会产生毒副作用，且会降低药效。mEVs18-4组从第4h开始就能观察到有荧光在肿瘤部位聚集，72h时在肿瘤部位仍有少量荧光，这表明mEVs18-4在浓集于肿瘤部位，且滞留时间长，有利于延长药物在肿瘤部位留存的时间，更好的发挥治疗效果。综上所述，靶向性mEVs18-4具有更高的肿瘤靶向性和蓄积能力。
7.2、体内抗肿瘤活性研究
当肿瘤体积已经达到100mm3后，将BALB/c裸鼠随机进行分组，每组小鼠有5只，一共分为6组：Control组、CRISPR/Cas9组、DTX组、mEVs18-4/CRISPR组、mEVs18-4/DTX组和mEVs18 -4/CRISPR/DTX组。按照药物剂量5mg/kg给药，每三天给一次药，共给药五次。在给药期间每隔一天记录小鼠的体重和肿瘤体积大小，在最后一次给药72h后，对小鼠进行脱颈处死。小鼠通过眼球取血来收集全血，将小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织取出，对肿瘤进行称重，计算肿瘤抑制率(IR)。结果如图24、25所示。
由图24和25可知，Control组随着时间的增加，肿瘤生长迅速，CRISPR/Cas9组与Control组相比没有显著性差异(P>0.05)，这表明CRISPR/Cas9进入小鼠体内后，没有发挥明显的抑制作用，推测CRISPR/Cas9在到达肿瘤部位之前就被降解清除，因此无法发挥治疗作用。游离的DTX进入机体后由于是小分子物质很快被机体清除，并且两组游离药物均不具有肿瘤靶向性，因此，对肿瘤的抑制作用较弱。mEVs18-4/CRISPR组的肿瘤生长速度减缓，给药结束后，mEVs18-4/CRISPR组与CRISPR/Cas9组的肿瘤体积和质量具有显著性差异(***P<0.001)，DTX组与mEVs18-4/DTX组之间也表现出相同的趋势。这表明mEVs18-4能够保护CRISPR/Cas9和DTX，避免被机体清除，并且能够靶向肿瘤组织，发挥治疗作用。肿瘤生长速度最为缓慢的是mEVs18-4/CRISPR/DTX组，根据给药结束后肿瘤的体积及重量可以看出，mEVs18-4/CRISPR/DTX组对肿瘤的治疗作用最强，治疗效果最好。综上所述，mEVs18-4增加了药物的靶向性，且CRISPR/Cas9质粒与DTX的联合应用，显著抑制了肿瘤的生长，具有良好的肿瘤治疗作用。
7.3、体内药效学评价
将小鼠肿瘤取出后，用4％多聚甲醛进行固定，石蜡切片，使用TUNEL进行染色，于荧光显微镜下观察肿瘤的凋亡情况，分析制剂的抗肿瘤治疗效果。结果如图26所示。
由图26可知，六组制剂的凋亡比例分别为18.27±0.66％、21.39±5.34％、39.07±3.27％、59.54±4.41％、63.62±1.53％、83.89±4.12％，从凋亡比例可以看出，mEVs18 -4/CRISPR/DTX组的绿色荧光面积最大，凋亡比例最高，证明mEVs18-4/CRISPR/DTX制剂中CRISPR/Cas9与DTX的联合应用对肿瘤具有显著的抑制作用，能够促使肿瘤细胞发生大面积凋亡。
7.4、巨噬细胞含量检测
有研究表明CD24蛋白能够协助肿瘤发挥免疫逃逸的作用，使肿瘤细胞避免被巨噬细胞的吞噬和清除，因此当CD24的表达受到抑制后，会增加肿瘤细胞中巨噬细胞的数目，提高巨噬细胞的吞噬能力。采用流式细胞术检测治疗前后肿瘤组织中巨噬细胞含量。具体步骤：将新鲜获得的肿瘤组织剪成小块，其中一部分于200目细胞滤网上研磨肿瘤组织。加D-Hank′s溶液研磨过滤，收集细胞悬液，在4℃离心机中2000rpm离心15min，收集细胞沉淀。加入适量体积的红细胞裂解液，混悬孵育5min，加入5倍裂解液体积的D-Hank′s溶液进行终止。在4℃离心机中2000rpm离心15min，用D-Hank′s溶液重悬细胞沉淀，清洗三遍。细胞计数，取106个细胞于EP管中，按照说明书加入F4/80抗体进行染色，染色完成后，用PBS清洗细胞3次，使用流式细胞仪测定分析。结果如图27所示。
由图27可知，mEVs18-4/CRISPR组和mEVs18-4/CRISPR/DTX组巨噬细胞的含量明显增加(****P<0.001)，这表明mEVs18-4能够将CRISPR/Cas9递送到肿瘤细胞中，发挥基因编辑作用，敲除CD24基因，抑制CD24蛋白的表达，进而抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，促使巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，进一步发挥治疗作用。
7.5、WB验证CD24蛋白的表达
通过WB试验检测CD24蛋白在小鼠肿瘤细胞中的表达情况。将部分肿瘤组织用预冷的PBS进行清洗，置于冰上，加入RIPA裂解液(RIPA:PMSF＝100:1)裂解30min，于匀浆机中匀浆。在4℃离心机中设置12000rpm转速离心10min，上清液为全蛋白提取物。对全蛋白提取物的浓度进行检测后，进行WB试验。通过WB试验考察肿瘤细胞中CD24蛋白的表达，来评估制剂在体内沉默CD24基因的效果。结果如图28所示，mEVs18-4/CRISPR/DOC组中CD24的蛋白条带与Control组有着显著性差异(****P<0.0001)，mEVs18-4/CRISPR/DTX制剂能够显著降低CD24蛋白的表达。这进一步从蛋白层面表明mEVs18-4能够有效的将CRISPR/Cas9质粒递送到肿瘤细胞中，发挥基因编辑的作用，抑制CD24的表达。
7.6、ELISA检测细胞因子含量
取7.5节提取得到的全蛋白提取物，按照ELISA试剂盒说明书对IL-2、TNF-α和INF-γ的含量进行检测。小鼠体内的细胞因子检测结果如图29所示。由图29可知，mEVs18-4/CRISPR/DTX组的IL-2、INF-γ和TNF-α值相较于Control组显著增加(****P<0.001)，说明该制剂注射入体内后，能够提高机体的免疫功能，产生免疫细胞因子，进一步发挥抗肿瘤治疗作用。
7.7、体内安全性研究
制剂治疗肿瘤必须对其安全性进行评估，毒性较大的制剂即使有良好的抗肿瘤治疗效果也无法广泛应用。体重变化是体内毒性的一个重要的指标，因此为了评估制剂的安全性，对小鼠给药期间体重的变化进行记录。通过小鼠的体重变化、血液生化指标检测和组织器官的形态学变化考察制剂在体内的毒性，评估制剂的安全性。摘取小鼠的眼球来获取全血，将血液流入EDTA-K2润过的采血管中，收集全血进行血常规检测。另外采取同样方法获取全血后，将血液先在室温下放置2h，使用4℃离心机设置转速3000rpm离心15min，取上清测定肝指标(AST和ALT)和肾功能指标(Cr和UREA)通过对试验数据进行分析，以评估制剂的毒性。结果如图30所示。
由图30A可知，随着给药时间的增加，小鼠的体重无明显的变化，表明mEVs18-4/CRISPR/DTX制剂对小鼠没有明显的毒性作用。进一步对小鼠的血液进行血常规检测，如图30B所示，各血常规结果与生理盐水组没有明显变化，如图30C、30D所示，肝肾功能指标ALT、AST、BUN和Cr也均在安全范围内，与生理盐水组之间没有明显差异，这表明mEVs18-4/CRISPR/DTX制剂具有良好的生物相容性。进一步对各组小鼠的心、肝、脾、肺和肾脏器官进行H&E染色，发现各组均未出现明显的病理学异常情况。综上所述，mEVs18-4/CRISPR/DTX制剂对小鼠无明显的毒副作用，具有良好的生物安全性。
综上可知，本发明从牛奶中提取并构建mEVs18-4用于肿瘤靶向以递送CRISPR/Cas9和DTX，体内外试验均证明mEVs18-4/CRISPR/DTX药物递送系统具有良好的生物安全性和抗肿瘤治疗效果。mEVs18-4/CRISPR/DTX递药系统能够有效的抑制CD24基因的表达，提高巨噬细胞的吞噬能力，并且与DTX的联合使用协同提高了对肿瘤细胞的杀伤作用。本发明能够为基因药物与化疗药物联合使用以提高疗效、降低药物的毒副作用提供新的研究方向。

Claims (10)

1.一种靶向肿瘤的药物递送系统，其特征在于，以基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体同时装载CRISPR/Cas9质粒和化疗药物构建得到；
所述基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体为表面化学偶联有多肽18-4的牛奶细胞外囊泡；所述CRISPR/Cas9质粒具有针对目的基因CD24的敲除功能。
2.根据权利要求1所述的靶向肿瘤的药物递送系统，其特征在于，所述牛奶细胞外囊泡是以脱脂牛奶为原料，经酸处理法和差速离心法提取纯化得到；所述牛奶细胞外囊泡的水合粒径为120～130nm。
3.根据权利要求1所述的靶向肿瘤的药物递送系统，其特征在于，所述化疗药物为多烯紫杉醇、阿霉素、甲氨蝶呤、顺铂、长春新碱中的一种或多种；所述肿瘤为乳腺癌。
4.根据权利要求1所述的靶向肿瘤的药物递送系统，其特征在于，所述基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体，采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
(1)将牛奶细胞外囊泡与3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯混合，孵育，得到混合液A；另将多肽18-4与Traut’s试剂混合，孵育，得到混合液B；
(2)将步骤(1)所得混合液A、混合液B进行共孵育，然后离心，即得基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体，记为mEVs18-4。
5.一种如权利要求1～4任一项所述的靶向肿瘤的药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用电穿孔技术将CRISPR/Cas9质粒和化疗药物同时载入到所述基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体中，即得所述靶向肿瘤的药物递送系统。
6.根据权利要求5所述的靶向肿瘤的药物递送系统的制备方法，其特征在于，所述电穿孔的电压为500～900V；电穿孔时，基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体、CRISPR/Cas9质粒和化疗药物的质量比为1～2∶1～2∶2～4。
7.根据权利要求6所述的靶向肿瘤的药物递送系统的制备方法，其特征在于，所述电穿孔的电压为700V；电穿孔时，基于牛奶细胞外囊泡的靶向肿瘤载体、CRISPR/Cas9质粒和化疗药物的质量比为2∶1∶2。
8.根据权利要求6或7所述的靶向肿瘤的药物递送系统的制备方法，其特征在于，电穿孔后所得靶向肿瘤的药物递送系统为载药纳米粒子；载药纳米粒子的水合粒径为135～150nm。
9.如权利要求1～4任一项所述的靶向肿瘤的药物递送系统在制备靶向抗肿瘤药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的靶向肿瘤的药物递送系统在制备靶向抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物为乳腺癌治疗药物。
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