CN113694217B - 一种包含il-15阳离子脂质体复合物和塞来昔布脂质体的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种包含IL‑15阳离子脂质体复合物和塞来昔布脂质体的药物组合物及其制备方法和用途。在所述药物组合物中，所述IL‑15阳离子脂质体复合物为以具有编辑释放细胞因子IL‑15的质粒DNA(pcDNA3.1/IL‑15)为基因药物设计的一种叶酸PEG化DOTAP阳离子脂质体核转运基因药物的传递系统，将所述IL‑15阳离子脂质体复合物与在TIME中靶向释放的塞来昔布脂质体联合使用后，塞来昔布促进NK‑细胞招募至肿瘤微环境中，大大提高NK‑细胞的浸润，IL‑15因子促进肿瘤微环境中NK‑细胞的增殖与活化，Treg细胞数量显著下降，肿瘤微环境发生改变，免疫抑制被一定程度解除，两者联用，能够更好地发挥固有免疫抗肿瘤的作用，发挥安全、低毒的协同肿瘤免疫治疗效果。

Description

一种包含IL-15阳离子脂质体复合物和塞来昔布脂质体的药 物组合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地涉及一种包含IL-15阳离子脂质体复合物和塞来昔布脂质体的药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的一种新的肿瘤治疗策略。其中，基于NK-细胞的免疫治疗技术受到了越来越多的关注。NK-细胞的作用是识别与溶解肿瘤细胞和病毒感染细胞，同时产生免疫调节性细胞因子两大主要功能，是人体抗感染、防自噬和阻止细胞恶性分化的重要免疫调节细胞。肿瘤患者的外周血中NK-细胞的数量和活性明显下降，则若能促进NK-细胞的增殖与活化，产生更多细胞杀伤肿瘤细胞，就能更好地发挥固有免疫抗肿瘤的作用。目前，利用NK-细胞进行免疫治疗有多种策略，但最直接的方案是直接激活NK-细胞使其产生杀伤肿瘤细胞的作用，细胞因子一般用于扩增过继转移的NK-细胞，IL-2是临床应用最广泛的细胞因子。然而，IL-2能够激活Treg细胞，Treg细胞会通过产生免疫抑制细胞因子TGF-β等来阻碍NK-细胞发挥活性。相比之下，IL-15不仅不会激活Treg细胞，而且提供了刺激NK-细胞和细胞毒性CD8+T细胞的额外优势，是更好的选择。
塞来昔布是一种特定的环氧合酶2(COX-2)抑制剂，具有非甾体抗炎的特性，还具有抗肿瘤特性潜在的机制。此外，COX抑制剂可以抑制免疫逃逸的作用从而降低恶性肿瘤的风险。在肿瘤中运用COX1/2抑制剂如塞来昔布能够显著地通过IFN-γ、TNF-α上调CXCL9/10在肿瘤组织的分泌量，从而大大提高NK-细胞的浸润。但是塞来昔布的水溶性差是常规化疗的一个最主要问题，塞来昔布会在胃肠道的溶解，使得这类药物的口服生物利用度较低。
近年来，以阳离子脂质体为主的非病毒载体系统因其制备简便、无目的基因大小限制性、免疫原性低等优点，在基因治疗研究中受到越来越多研究者的青睐，已有大量的文献报导该转导系统介导外源基因的转染，很大程度地提高基因治疗的效果。虽然如此，但是阳离子脂质体仍存在稳定性较差、转染效率低、阻断部分免疫吞噬，易被生物酶降解和被pH环境破坏低肿瘤靶向性等特点，这限制了阳离子脂质体的广泛应用。因此，亟需开发出一种安全性高、靶向性好、转染效率高、稳定性好的用于激活较强的NK免疫作用的方法。
由上述分析可知，IL-15、塞来昔布以及阳离子脂质体非病毒载体系统在治疗肿瘤中各具特色，也各有缺陷，似乎将其结合在一起使用在抗肿瘤方面能够产生更大获益，但遗憾的是现有技术中并没有将塞来昔布脂质体和IL-15阳离子脂质体复合物组合在一起用于NK免疫激活的教导，更没有将这两者组合使用来治疗肿瘤的教导。
发明内容
为了解决上述技术问题，克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种包含IL-15阳离子脂质体复合物和塞来昔布脂质体的药物组合物及其制备方法和用途，其能够增强自身固有免疫抗肿瘤的效果。
具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
在第一个方面中，本发明提供了一种用于NK免疫激活的药物组合物，所述药物组合物包含IL-15阳离子脂质体复合物和塞来昔布脂质体，
其中，所述IL-15阳离子脂质体复合物由以下原料制备而成：pcDNA3.1/IL-15、pDsRed-M-N1、大肠杆菌DH5α新鲜感受态菌液、DSPE-PEG2000-NH2、NHS、DOTAP、叶酸(FA)、基本材料磷脂、PEG修饰磷脂和胆固醇；
所述塞来昔布脂质体由以下原料制备而成：基本材料磷脂、塞来昔布和胆固醇；以及
所述pcDNA3.1/IL-15和所述塞来昔布脂质体的质量比为1：(4-40)；
优选地，所述质量比可以是1：(4-30)、1：(4-25)、1：(4-20)、1：(4-15)或1：(4-10)，或者所述质量比可以是由上述数值范围中的任何整数所限定的范围。
作为可选方式，在上述药物组合物中，对于制备所述IL-15阳离子脂质体复合物而言，所述基本材料磷脂为大豆卵磷脂、氢化卵磷脂或人工合成卵磷脂中的一种或两种，优选为纯度>95％的大豆卵磷脂；
所述DOTAP为(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵；
所述PEG修饰磷脂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；
靶向磷脂为叶酸PEG化修饰的磷脂(磷脂聚乙二醇叶酸)；
DOTAP：基本材料磷脂：胆固醇质量比为8：(2-5)：1；
所述基本材料磷脂与有机溶剂的质量体积比为20mg：(1-2)mL；
DSPE-PEG2000-NH2与FA-COOH的摩尔比为(2-4)：1；
对于制备所述塞来昔布脂质体而言，所述基本材料磷脂为大豆卵磷脂、氢化卵磷脂或人工合成卵磷脂中的一种或两种，优选为纯度>95％的大豆卵磷脂；
所述原料中，塞来昔布：基本材料磷脂：胆固醇的质量比为1：(10-20)：2，优选为1：16：2。
在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的药物组合物的制备方法，所述IL-15阳离子脂质体复合物的制备方法包括以下步骤：
(1)提取质粒DNA：
将pcDNA3.1/IL-15、pDsRed-M-N1质粒分别加入到含有100μL大肠杆菌DH5α新鲜感受态菌液中，进行细菌的转化，取100μL转化pDsRed-M-N1质粒的菌液均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素(Kan)的选择平板上，取100μL转化pcDNA3.1/IL-15质粒的菌液均匀涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的培养基中，然后在37℃条件下倒置培养12-16h，分别从选择平板上挑取一个pc DNA3.1/IL-15、pDsRed-M-N1的DH5α单菌落，进行培养增殖，提取质粒DNA，将新鲜提取的质粒DNA放在4℃冰箱保存；
(2)DSPE-PEG2000-FA的合成：
称取适量DSPE-PEG2000-NH2和FA-COOH，将叶酸(FA)溶解在5mL DMSO中，待完全溶解后加入适量NHS和EDC，再加入1mL三乙胺，在磁力搅拌器上室温条件下搅拌2h，向圆底烧瓶中加入适量的DSPE-PEG2000-NH2，继续室温、氮气保护下反应20h以上；
(3)阳离子脂质体的制备：
将8mg DOTAP，2mg大豆磷脂，1mg胆固醇和1mg DSPE-PEG2000-FA，加入有机溶剂振荡至完全溶解，之后37℃真空旋转蒸发，去除有机溶剂，使溶液在瓶壁上形成均匀的薄膜层，待全部成膜之后，加入Hepes缓冲液，然后进行水化，取出混悬液，用探头超声细胞粉碎仪200W超声处理3min后过0.2μm微孔滤膜进行整粒，即得叶酸PEG修饰的阳离子脂质体溶液(FPCL)，4℃储存，使用相同方法制备普通阳离子脂质体和DSPE-PEG2000修饰的阳离子脂质体溶液；
(4)灭菌磷酸盐缓冲液的制备：
称取8g NaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4·12H2O，以及0.24gKH2PO4，加入超纯水使其溶解，并将体系定容至1L，使缓冲溶液pH值为7.4；以及
(5)基因复合物的制备：
向pIL-15和不同脂质体溶液中分别加入预热至37℃的灭菌磷酸盐缓冲液，稀释至不同浓度，然后将两者进行轻轻混合，涡旋1min至混合均匀，并室温孵育，之后用PBS清洗细胞2次，得质量比wDOTAP/wpDNA不同的FPCL/pIL-15，PCL/pIL-15和/或CL/pIL-15复合物。
作为可选方式，在上述制备方法中，在步骤(3)中，所述有机溶剂选自氯仿，或者氯仿与甲醇的混合溶剂，其中优选使用氯仿与甲醇的混合溶剂，且氯仿与甲醇的体积比为1：1；和/或，在步骤(3)中，水化温度为55-65℃；和/或，在步骤(5)中，混合物时pIL-15和阳离子脂质体溶液的体积比为1:1；和/或，在步骤(5)中，孵育时间为20-30min；和/或，在步骤(5)中，所述质量比wDOTAP/wpDNA为(0-10)：1。
作为可选方式，在上述制备方法中，所述IL-15阳离子脂质体复合物是由pIL-15和阳离子脂质体制备的，pcDNA质粒蛋白表面荷电为负电，采用荷正电的阳离子化脂质体为载体，正负电荷中和压缩进行装载，所述IL-15阳离子脂质体复合物选自普通阳离子脂质体(CL)、DSPE-PEG2000修饰的阳离子脂质体(PCL)，或者叶酸PEG修饰的阳离子脂质体(FPCL)和pIL-15组成的IL-15阳离子脂质体复合物，优选为叶酸PEG修饰的阳离子脂质体(FPCL)和pIL-15组成的IL-15阳离子脂质体复合物(FPCL/pDNA复合物)。
优选地，在叶酸PEG修饰的阳离子脂质体(FPCL)中，基本材料磷脂：靶向磷脂的质量比＝2：1。
作为可选方式，在上述制备方法中，在FPCL/pDNA复合物中，所述质量比wDOTAP：wpDNA为1:1时，包封率达到65％以上；所述质量比wDOTAP：wpDNA达到5:1时，包封率达到90％以上，形状为类球形，粒径大小约100nm。
作为可选方式，在上述制备方法中，所述塞来昔布脂质体的制备方法包括以下步骤：
采用薄膜分散法，分别精密称取大豆磷脂64mg，塞来昔布4mg，胆固醇8mg放置于25mL圆底烧瓶中，加入氯仿和甲醇V:V＝1:1混合溶液振荡至完全溶解，37℃真空旋转蒸发，去除有机溶剂，使溶液在瓶壁上形成均匀的薄膜层，待全部成膜之后加入Hepes缓冲液，进行水化，之后用探头超声细胞粉碎仪200W超声处理3min后过0.22μm微孔滤膜即得塞来昔布脂质体，4℃储存。
作为可选方式，在上述制备方法中，所述水化温度为55-65℃，水化时间为10-20min；当药脂比M药物/M脂质为1：(10-20)时，包封率为59.9％-72.9％，优选地，当M药物/M脂质为1：15时，包封率为72.9％，粒径大小约120nm，Zeta电位约为0mV，形状为类球形。
在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的药物组合物或者采用上述第二个方面所述的制备方法制备得到的药物组合物在制备用于NK免疫激活的药物中的用途，所述药物组合物用于特异性递送至肿瘤细胞微环境部位，招募大量NK-细胞并有效大量地表达分泌出IL-15因子，高效实现NK-细胞的诱导活化与增殖，产生更多细胞杀伤肿瘤细胞，更好地发挥固有免疫抗肿瘤的作用。
在第四个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的药物组合物或者采用上述第二个方面所述的制备方法制备得到的药物组合物在制备治疗肿瘤性疾病的药物中的用途，所述药物组合物用于肿瘤免疫治疗。
本发明人需要特别指出的是，在所述药物组合物中，IL-15阳离子脂质体复合物与塞来昔布脂质体的剂型是相同的，或IL-15阳离子脂质体复合物与塞来昔布脂质体的剂型是不同的。
可以将适当剂量的IL-15阳离子脂质体复合物与塞来昔布脂质体在同一药物组合物中制剂，也可以将IL-15阳离子脂质体复合物与塞来昔布脂质体分别制成不同的药物制剂。在后一种情况下，两者可以同时施用或者分别施用。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
(1)本发明构建塞来昔布脂质体，降低肿瘤免疫抑制，触发CXCL9/10释放，招募NK-细胞浸润肿瘤组织；激活NK-细胞抗肿瘤活性。
(2)本发明构建叶酸PEG化的基因递送系统，将能特异性促进IL-15表达的pcDNA递送至肿瘤细胞微环境部位，实现IL-15对NK-细胞的激活与促进增殖作用，发挥NK-细胞在免疫细胞应答过程中的作用，达到抗肿瘤免疫的目的。
(3)本发明发现叶酸对阳离子脂质体进行修饰能够增强基因递送系统的稳定性，提高转染效率，同时提高其肿瘤靶向性。叶酸PEG化修饰的阳离子脂质体实现了血液循环过程中的空间稳定，避免基因递送系统被网状内皮系统识别，阻断RES效应的免疫吞噬，以及避免生物酶的降解和pH环境的破坏，并实现长循环，同时细胞摄取率也增加。
(4)本发明发现采用pcDNA基因递送系统，利用纳米粒子尺度的EPR效应的被动靶向，以及叶酸配体介导的主动靶向作用，实现肿瘤部位与肿瘤细胞的靶向性及核定位，同时也叶酸配体介导的肿瘤细胞摄取；进入内涵体及溶酶体，在溶酶体中又由于阳离子质子化的“磷脂膜融合作用/脂质海绵效应”(lipid sponge efffct,LSE)，致使载体系统结构被破坏，快速逃逸，释放药物，进入细胞质。
(5)本发明发现塞来昔布脂质体和叶酸PEG化修饰的阳离子脂质体的药物组合物，能够有效地招募更多的NK-细胞到达肿瘤组织部位，同时促进NK-细胞的激活与增殖，Treg细胞数量显著下降，肿瘤微环境发生改变，免疫抑制被一定程度解除，能够更好地发挥固有免疫抗肿瘤的作用。将上述两种脂质体组合应用，能够发挥安全，低毒的协同肿瘤免疫治疗效果。
附图说明
图1：CEL脂质体的形态学表征。
图2：CEL脂质体的Zeta电位。
图3：CEL脂质体的粒径。
图4：CEL溶液和CEL脂质体的泄漏率测定曲线。
图5：0.05～1.0μg/μL浓度的CEL脂质体对4T1-细胞24h和48h的细胞毒性。
图6：流式细胞仪检测CEL脂质体对4T1-细胞摄取的影响。
图7：pcDNA修饰DSPE-PEG2000-FA脂质体的制备工艺。
图8：w/w比为0:1，0.5:1，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，8:1的FPCL/pDNA、PCL/pDNA、CL/pDNA在室温下的粒径。
图9：w/w比为0:1，0.5:1，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，8:1的FPCL/pDNA、PCL/pDNA、CL/pDNA的Zeta电位。
图10：w/w比5:1的FPCL/pDNA复合物的粒径。
图11：Lip、CliL/pDNA、FA-Clip/pDNA和FA-PEG-Clip/pDNA脂质复合物对4T1-细胞的摄取情况。其中，图A为CLSM测定4T1-细胞4h后对不同复合物的摄取情况，图B和图C为流式细胞仪测定4T1-细胞4h后对不同复合物的摄取情况。
图12：FPCL/pDNA脂质复合物处理4T1-细胞的激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)图像。
图13：ELISA法检测不同时间给药后IL-15的表达。
图14：给药后荷瘤小鼠体重及肿瘤体积变化。其中，图A为给药后小鼠肿瘤体外照片，图B为给药后小鼠肿瘤体积变化曲线，图C为荷瘤小鼠体重变化曲线。
图15：联合给药后小鼠肿瘤组织中IL-15的表达情况。其中，图A和图B为WB测定IL-15表达，图C为ELISA检测IL-15的表达。
图16：联合给药后小鼠肿瘤组织中CXCL9和CXCL10的表达。其中，图A为QT-PCR检测CXCL9的表达，图B为QT-PCR检测CXCL10的表达，图C为ELISA检测CXCL9的表达，图D为ELISA检测CXCL10的表达。
图17：联合给药后小鼠肿瘤组织免疫细胞的变化。其中，图A和图B为流式细胞术检测联合给药后小鼠肿瘤组织中免疫细胞的变化，图C为ELISA法检测IL-10的变化。
图18：联合给药后小鼠肿瘤组织中免疫细胞(DC、T、NK、Treg)的变化。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
为了便于更好地阅读本说明书，下面提供了说明书中使用的主要缩略词表(见表1)。
表1：主要缩略词表
Figure BDA0003237205940000051
Figure BDA0003237205940000061
实施例1：塞来昔布脂质体的制备
分别精密称取大豆磷脂64mg，塞来昔布4mg，胆固醇8mg放置于25mL圆底烧瓶中，加入氯仿和甲醇(V:V＝1:1)混合溶液振荡至完全溶解，37℃真空旋转蒸发，待全部成膜之后加入Hepes缓冲液，于60℃水浴中水化10min，用探头超声细胞粉碎仪超声处理(200W，3min)后过0.22μm微孔滤膜即得塞来昔布脂质体。
实施例2：塞来昔布脂质体包封率的测定
选择紫外吸收波长252nm检测塞来昔布。在该波长下测定不同浓度5、10、20、50、100μg/mL塞来昔布的吸收强度值A，以紫外吸收强度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制标准曲线。CEL的标准曲线为A＝0.0242C-0.0172，R2＝0.9909。结果表明CEL在5～100μg/mL范围内线性关系良好。
精密吸取超速离心后的塞来昔布脂质体溶液，放在10mL容量瓶中，然后加入甲醇进行超声破乳后，用紫外分光光度仪测定其紫外吸收强度A，然后在不同药脂比：1:5，1:10，1:15，1:20条件下，依据如下公式测得其包封率。包封率(EE％)＝A1/A′1×100％。不同药脂比下，塞来昔布脂质体包封率结果如下表所示。
表2：药脂比为1:5，1:10，1:15，1:20，CEL脂质体的包封率
Figure BDA0003237205940000062
由表2可知，当药脂比为1:15时，包封率最大，达到72.9％。
实施例3：塞来昔布脂质体制剂学表征
(1)形态观察：取实施例1所制备的塞来昔布脂质体9μL缓慢滴至覆盖碳膜的铜网中央，静置1分钟后用滤纸吸掉多余液体，吸取9μL磷钨酸(2％)负染1分钟，用样上述操作吸去多余液体，放入透射电镜中进行检测并拍照，如图1所示。由图1可观察到，复合物形态规整，形状为类球形，且分布均匀，脂质体粒径在120nm左右。
(2)粒径和电位测定：我们采用马尔文激光粒度仪进行脂质体Zeta电位表征。取不同浓度的脂质体溶液小心加入电位杯中，测定其表面电势，如图2所示。由图2可观察到，塞来昔布脂质体的Zeta电位约为0mV。与马尔文粒度测定仪结果一致。用马尔文激光粒度仪对脂质体进行粒径表征，结果如图3所示。由图3可观察到，粒径达到200nm以下，粒径大小约在120nm左右，符合后续实验要求。
(3)药物泄漏率测定
本实验CEL溶液、CEL Lip的泄漏率测定方法我们选用透析袋法，释放介质选择pH7.4的PBS缓冲液，将一定量CEL溶液、CEL Lip(12KDa)，扎紧的透析袋置于50mL的PBS缓冲液中，在将其放入37℃摇床中，分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、72h吸取5mL释放介质，紫外分光光度法测定塞来昔布的含量，计算累积释放百分率，结果如图4所示。
由图4可观察到，游离的塞来昔布释放很快，累积释放量接近100％，这是因为游离药物分质量小很快透过透析袋。CEL脂质体则表现出缓释行为，随着时间的增加，CEL脂质体释放量缓慢增加，在72h内的泄漏率达到60.12％，这表明我们制备的CEL脂质体在体外具有很好的稳定性，能够实现缓慢释放的特性。
(4)细胞毒性研究
采用MTT法考察了塞来昔布脂质体对4T1-细胞的细胞毒性。
取4T1-细胞分别以5000个/孔接种在96孔板中，培养过夜。待细胞长至75％以上时，弃去原培养液。将新鲜制备的塞来昔布脂质体在超净台内用无菌培养液将其稀释至浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.3，0.5，1.0μg/μL，向各孔中分别加入200μL无菌制剂溶液、每组平行3个孔，对照组则加入等量培养液。在细胞恒温培养箱中继续培养24h，48h后，向每孔中加入20μL MTT溶液(5.0mg/mL)，在培养箱中继续培养4h，弃去培养液，然后向每个孔中加入150μL DMSO，振荡5min后，于酶标仪中在490nm下测定吸光度值并计算细胞存活率。计算结果如图5所示。
由图5可知，塞来昔布脂质体与4T1-细胞共孵育24h后，随着塞来昔布脂质体浓度增加，4T1-细胞存活率没有显著性变化，细胞存活率均在95％以上，这可能是由于塞来昔布在实验浓度范围内对4T1-细胞没有细胞毒性。当孵育48h后，不同浓度塞来昔布脂质体组的4T1-细胞存活率略有下降，但是其细胞存活率仍能达到90％以上。这表明CEL脂质体并不会影响细胞活性。
(5)细胞摄取量的测定
将4T1-细胞接种于6孔板中(5×105个细胞/孔)，于DMEM完全培养基中培养至细胞达到为75％左右，弃去上清液，向每孔加入含有香豆素荧光标记的塞来昔布脂质体复合物的无血清培养液200μL，然后在培养0.5、1、2、4h后，用冷PBS清洗3遍，胰酶进行消化，消化完全后离心(1000rpm，5min)，最后将细胞分散于300μL PBS溶液中，过筛网用流式细胞仪上机检测细胞摄取情况，结果如图6所示。
由图6可知，随着时间的增加，CEL脂质体被摄取的量增加，可以得出CEL脂质体在4T1-细胞中的体外摄取存在时间依赖性，4h时摄取量最多。这表明在制备的塞来昔布脂质体粒径范围内能够很好地被细胞摄取，且随着时间延长更易被捕获。
实施例4：质粒DNA的提取
采用氯化钙法处理大肠杆菌DH5α，使其处于感受态。将pcDNA3.1/IL-15、pDsRed-M-N1质粒分别加入到含有100μL大肠杆菌DH5α新鲜感受态菌液中，进行细菌的转化。取100μL转化pDsRed-M-N1质粒的菌液均匀涂布于含有卡那霉素(Kan，50μg/mL)的选择平板上，取100μL转化pcDNA3.1/IL-15质粒的菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素(Amp，50μg/mL)的培养基中，然后在37℃条件下倒置培养12～16h。分别从选择平板上挑取一个pcDNA3.1/IL-15、pDsRed-M-N1的DH5α单菌落，进行培养增殖。接下来提取质粒DNA，将新鲜提取的质粒DNA放在4℃冰箱内保存。
实施例5：DSPE-PEG2000-FA的合成
按照摩尔比2:1分别称取DSPE-PEG2000-NH2和FA-COOH，首先将叶酸(FA)溶解在5mLDMSO中，待完全溶解后加入适量NHS和EDC再加入1mL三乙胺在磁力搅拌器上室温搅拌2h，向圆底烧瓶中加入适量的DSPE-PEG2000-NH2继续室温、氮气保护下反应20h以上。
实施例6：不同载体及基因复合物的制备
如图7所示。称取8mg DOTAP，2mg大豆磷脂，1mg胆固醇和1mg的DSPE-PEG2000-FA置于10mL茄形瓶中，加入氯仿-甲醇(V:V＝1：1)混合溶液使其完全溶解，37℃真空旋转蒸发，待全部成膜之后，加入Hepes缓冲液，于60℃水浴中水化15min，取出混悬液。用探头超声细胞粉碎仪对该混悬液进行超声处理(200W，3min)后过0.2μm微孔滤膜即得叶酸PEG修饰的阳离子脂质体溶液(FPCL)，4℃储存。使用相同方法制备普通阳离子脂质体和DSPE-PEG2000修饰的阳离子脂质体溶液作为对照。向pIL-15和不同脂质体溶液中分别加入预热至37℃的灭菌磷酸盐缓冲液，稀释至不同浓度，然后将两者进行轻轻混合，涡旋1min至混合均匀，并室温孵育，之后用PBS清洗细胞2次，得到质量比(wDOTAP：wpDNA)分别为0:1，0.5:1，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，6:1，8:1，10:1的FPCL/pIL-15，PCL/pIL-15，CL/pIL-15复合物。
实施例7：IL-15脂质体基因复合物的表征
(1)粒径：用马尔文激光粒度仪对脂质体进行粒径表征，得到结果如图8。由图8可知，发现基因复合物的粒径变化具有一定的质量依赖性。
(2)Zeta电位：我们采用马尔文激光粒度仪进行脂质体Zeta电位表征。取三种不同浓度的脂质体溶液小心加入电位杯中，测定其表面电势，如图9所示。
由图9可知，基因复合物Zeta电位逐渐增大。三种复合物在不同质量比时的电位大小为：PCL/pDNA<CL/pDNA≈FPCL/pDNA。因为细胞膜带有负电，载体若带有一定正电性则有利于复合物与细胞膜结合进而被摄取进入细胞内，但是若是正电性太大的话又会对细胞产生毒性，因此暂时选定质量比为wDOTAP：wpDNA＝5:1进行后续的实验。
(3)形态观察：对实施例6所制备的复合物质量比wDOTAP：wpDNA＝5:1的FPCL/pIL-15复合物进行形态学观察。取制得的脂质体9μL缓慢滴至覆盖碳膜的铜网中央，静置1分钟后用滤纸吸掉多余液体，吸取9μL磷钨酸(2％)负染1分钟，用样上述操作吸去多余液体，放入透射电镜中进行检测并拍照，如图10所示。
由图10可知，复合物形态规整，且分布均匀，形状为类球形，粒径大小约在100nm左右，符合实验研究要求。说明对阳离子脂质体进行叶酸PEG修饰后对整个基因复合物的粒径影响不大，且能够更好地使载体系统功能化。
(4)细胞摄取的研究
本实验选取不同质量比为wDOTAP：wpDNA＝5:1的基因复合物，用共聚焦荧光显微镜及流式细胞仪考察细胞对不同基因复合物行的摄取能力，实验结果如图11所示。由图11可知，空白阳离子脂质Clip相比于普通脂质体Lip更易被4T1-细胞摄取。而对阳离子脂质体进行叶酸修饰后发现(FA-Clip)更易被4T1-细胞所摄取，这表明4T1-细胞对载体的摄取受其表面高表达的叶酸受体所影响，表面叶酸修饰后的载体是借助于叶酸受体介导的内吞作用而被摄取到细胞内的。另外也进行了叶酸PEG修饰的阳离子脂质体(FA-PEG-Clip)的体外摄取考察，发现加入PEG后，荧光量相比于FA-Clip有所降低，但是仍然有较好的摄取效果，这有可能是PEG具有弱的负电性同时也稍微增加了载体的粒径的缘故。相应的我们也运用流式细胞仪测定了4T1-细胞4h后对不同复合物的摄取情况。我们可以直观的发现其摄取结果与上述共聚焦荧光显微镜所得结果相对应。这说明引入叶酸靶头后能够显著的增加细胞对载体的摄取量。
(5)基因脂质体复合物的体外转染与表达
在基因递送系统中，当复合物被摄取进细胞内后，能否实现目标基因的正常表达是最终获得理想治疗效果的关键。我们进行基因复合物的体外转染与表达实验，结果如图12所示。浅灰色代表报告基因表达的浅灰荧光蛋白，深灰色代表细胞核。由图12可以观察到，随着时间的增加FPCL对pDNA的转染效率是增加的，但是随着时间的推移，有些荧光蛋白可能被失活而导致荧光强度下降。
运用ELISA试剂盒对体外4T1-细胞表达IL-15因子进行检测，结果如图13所示。由图13可知，随着时间的增加，ELISA试剂盒测得4T1-细胞上清培养液中IL-15的分泌量较空白对照组具有显著性差异。上述结果表明该载体FPCL对质粒DNA的包载能力很好且能够很好地保护质粒DNA到达细胞核，并可以有效表达相关蛋白。
实施例8：复合物对荷瘤小鼠的治疗
待荷瘤小鼠肿瘤体积长至约150mm3时，将其随机分为4组：盐水、CL/pIL-15、PCL/pIL-15和FPCL/pIL-15组(每组6只荷瘤小鼠)，尾静脉给药，保证每只小鼠注射5μg质粒。每隔1天测量荷瘤小鼠的肿瘤体积和体重。
用Balb/c小鼠作为实验动物模型，将乳腺癌4T1-细胞混悬液直射到小鼠乳房垫下进行原位造模，拍照记录小鼠的肿瘤体积变化。评价FPCL/pIL-15体内抑制肿瘤的情况，结果如图14所示。FPCL/pIL-15组肿瘤抑制作用最明显，这与给药后促进了NK-细胞的增殖与活化有关。生理盐水无明显的肿瘤抑制作用。
实施例9：联合给药后小鼠肿瘤组织内免疫细胞的变化
(1)IL-15的表达情况
在引入IL-15质粒DNA后首先验证联合给药后的IL-15在体内的表达情况，我们运用WB和ELISA试剂盒进行了检测，由图15所示，实验结果表明联合给药后IL-15能够很好地表达出来，说明塞来昔布并不影响IL-15在小鼠体内的表达分泌，这与体外细胞实验结果相一致。
(2)CXCL9，CXCL10的变化
通过上述两种趋化因子的ELISA试剂盒进行检测，实验结果如图16所示。联合给药后可能可以促进CXCL9，CXCL10的表达。因为IL-15能够促进NK-细胞的活化与增殖，同时能够促进IFN-γ和TNF-α的表达，IFN-γ和TNF-α的表达量升高在塞来昔布的作用下又能进一步促进对NK-细胞的招募，所以两者联合应用可能能够起到更好的抗肿瘤效果。
(3)小鼠肿瘤组织内免疫细胞的变化
联合给药后进一步对小鼠肿瘤组织中的免疫细胞进行检测，运用流式细胞仪进行检测的实验结果，如图17所示，我们可以看出，联合给药后免疫细胞更进一步的有所增加，联合给药后的NK-细胞，DC细胞，T细胞都显著增加，其中NK-细胞的百分比达到4.69％。免疫荧光标记实验结果如图18所示，由图18可以看出NK-细胞，DC细胞，T细胞都显著增加，Treg细胞显著降低。可以推测出塞来昔布和IL-15质粒DNA后能够有效地招募更多的NK-细胞到达肿瘤组织部位，同时促进NK-细胞的激活与增殖，与此同时我们还运用ELISA试剂盒检测了肿瘤组织中IL-10的表达情况，联合给药后肿瘤组织中免疫抑制性因子IL-10的表达量是显著降低的，结合免疫荧光实验结果我们可以推测联合给药后能够解除一部分免疫抑制并激活NK-细胞产生一定的抗肿瘤效果。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (3)

1.药物组合物在制备用于NK免疫激活的药物中的用途，其特征在于：所述药物组合物由IL-15阳离子脂质体复合物和塞来昔布脂质体组成，
其中，所述IL-15阳离子脂质体复合物由以下原料制备而成：pcDNA3.1/IL-15、pDsRed-M-N1、大肠杆菌DH5α新鲜感受态菌液、DSPE-PEG2000-NH2、NHS、DOTAP、叶酸（FA）、基本材料磷脂、PEG修饰磷脂和胆固醇；
所述IL-15阳离子脂质体复合物是叶酸PEG修饰的阳离子脂质体（FPCL）和pIL-15组成的IL-15阳离子脂质体复合物，即FPCL/pIL-15复合物，在FPCL/pIL-15复合物中，质量比wDOTAP：wpDNA达到5:1时，包封率达到90%以上，形状为类球形，粒径大小约100 nm，在FPCL中，基本材料磷脂：靶向磷脂的质量比=2:1；
所述基本材料磷脂为纯度>95%的大豆卵磷脂；
所述DOTAP为（2,3-二油氧基丙基）三甲基氯化铵；
所述PEG修饰磷脂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE）-PEG2000；
所述靶向磷脂为叶酸PEG修饰磷脂DSPE-PEG2000-FA；
DOTAP：基本材料磷脂：胆固醇质量比为8:2:1；
所述基本材料磷脂与有机溶剂的质量体积比为20 mg:（1-2）mL；
DSPE-PEG2000-NH2与FA的摩尔比为（2-4）:1；
所述塞来昔布脂质体由以下原料制备而成：基本材料磷脂、塞来昔布和胆固醇；
所述基本材料磷脂为纯度>95%的大豆卵磷脂；
在所述原料中，塞来昔布：基本材料磷脂：胆固醇的质量比为1:16:2，
当M药物/M脂质为1:15时，包封率为72.9%，粒径大小约120 nm，Zeta电位约为0 mV，形状为类球形；以及
所述pcDNA3.1/IL-15和所述塞来昔布脂质体的质量比为1:（4-10），
所述药物组合物用于特异性递送至肿瘤细胞微环境部位，招募大量NK-细胞并大量地表达分泌出IL-15因子，实现NK-细胞的诱导活化与增殖，产生更多细胞杀伤肿瘤细胞，更好地发挥固有免疫抗肿瘤的作用。
2.权利要求1所述的药物组合物在制备治疗肿瘤性疾病的药物中的用途，其特征在于：所述药物组合物用于肿瘤免疫治疗。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
所述IL-15阳离子脂质体复合物的制备方法包括以下步骤：
（1）提取质粒DNA：
将pcDNA3.1/IL-15、pDsRed-M-N1质粒分别加入到含有100 μL大肠杆菌DH5α新鲜感受态菌液中，进行细菌的转化，取100 μL转化pDsRed-M-N1质粒的菌液均匀涂布于含有50 μg/mL卡那霉素（Kan）的选择平板上，取100 μL转化pcDNA3.1/IL-15质粒的菌液均匀涂布于含有50 μg/mL氨苄青霉素（Amp）的培养基中，然后在37℃条件下倒置培养12-16 h，分别从选择平板上挑取一个pcDNA3.1/IL-15、pDsRed-M-N1的DH5α单菌落，进行培养增殖，提取质粒DNA，将新鲜提取的质粒DNA放在4℃冰箱保存；
（2）DSPE-PEG2000-FA的合成：
称取适量DSPE-PEG2000-NH2和FA，将叶酸（FA）溶解在5 mL DMSO中，待完全溶解后加入适量NHS和EDC，再加入1 mL三乙胺，在磁力搅拌器上室温条件下搅拌2 h，向圆底烧瓶中加入适量的DSPE-PEG2000-NH2，继续室温、氮气保护下反应20 h以上；
（3）阳离子脂质体的制备：
将8 mg DOTAP，2 mg大豆磷脂，1 mg胆固醇和1 mg DSPE-PEG2000-FA，加入有机溶剂振荡至完全溶解，之后37℃真空旋转蒸发，去除有机溶剂，使溶液在瓶壁上形成均匀的薄膜层，待全部成膜之后，加入Hepes缓冲液，然后进行水化，取出混悬液，用探头超声细胞粉碎仪200W超声处理3 min后过0.2 μm微孔滤膜进行整粒，即得叶酸PEG修饰的阳离子脂质体溶液（FPCL），4℃储存，所述有机溶剂为氯仿与甲醇的混合溶剂，且氯仿与甲醇的体积比为1：1，水化温度为55-65℃；
（4）灭菌磷酸盐缓冲液的制备：
称取8g NaCl，0.2 g KCl，3.58 g Na2HPO4·12H2O，以及0.24 g KH2PO4，加入超纯水使其溶解，并将体系定容至1 L，使缓冲溶液pH值为7.4；以及
（5）基因复合物的制备：
向pIL-15和阳离子脂质体溶液中分别加入预热至37℃的灭菌磷酸盐缓冲液，稀释至不同浓度，然后将两者进行轻轻混合，涡旋1 min至混合均匀，并室温孵育，之后用PBS清洗细胞2次，得FPCL/pIL-15复合物，混合时pIL-15和阳离子脂质体溶液的体积比为1:1，孵育时间为20-30 min；
所述塞来昔布脂质体的制备方法包括以下步骤：
采用薄膜分散法，分别精密称取大豆磷脂64 mg，塞来昔布4 mg，胆固醇8 mg放置于25mL圆底烧瓶中，加入氯仿和甲醇V:V=1:1混合溶液振荡至完全溶解，37℃真空旋转蒸发，去除有机溶剂，使溶液在瓶壁上形成均匀的薄膜层，待全部成膜之后加入Hepes缓冲液，进行水化，之后用探头超声细胞粉碎仪200W超声处理3min后过0.22 μm微孔滤膜即得塞来昔布脂质体，4℃储存，所述水化温度为55-65℃，水化时间为10-20 min。
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