CN110101853B - 蒲公英型异质纳米囊泡及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种两亲性异质纳米粒,将巯基衍生化的聚乙二醇通过S‑Au共价键连接于异质纳米粒Au‑Fe3O4的Au表面,磷脂磷酸或其盐通过磷酸根连接于异质纳米粒Au‑Fe3O4的Fe3O4表面。所述的两亲性异质纳米颗粒,在水相溶液中能够自组装成蒲公英型异质纳米囊泡,所述囊泡具备独特的细胞膜修饰功效和载体特征,可负载肿瘤相关抗原卵清蛋白不仅可以激活树突状细胞,同时可对肿瘤细胞膜进行改造以增补其表面抗原,最大程度地解决肿瘤下调自身抗原的免疫逃逸问题,可用于肿瘤治疗研究。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术和纳米科技领域,具体涉及一种新颖的蒲公英型异质纳米囊泡及其应用。
背景技术
目前,对于多种重大疾病(尤其是肿瘤)的治疗已进入“细胞治疗时代”,细胞治疗将是生命科学领域未来发展的主要方向之一。细胞表面分子控制着诸多生物事件,如细胞生长和分化、不同细胞之间的交流、可溶性因子的识别以及与细胞外基质的附着或脱离。在细胞表面进行人为的编排和改造,发展调控细胞表型的相关技术,能直接干预这些生物过程,进而达到治疗疾病的目的。综合现有研究报道,除美国食品药品监督管理局(FDA)已批准的涉及T细胞(CAR-T疗法)、DCs(自体细胞免疫疗法)和干细胞(脐带血造血干细胞)的相关疗法以外,还有红细胞、中性粒细胞、NK细胞等也被用于细胞治疗的研究。这些细胞从体内分离,实施离体的改造和增值后,回输入体内,可用于糖尿病和肿瘤等疾病的治疗研究。然而,研究人员虽然可根据患者的个体化情况,在体外对离体细胞实施精确改造,回输后实现对肿瘤的精准打击,但目前在CAR-T治疗过程中引发的细胞因子风暴、实体瘤治疗效果不佳,以及个体化细胞改造过程所需的高昂费用,仍是此类疗法在安全性、有效性和患者接受度等方面不可回避的主要问题。如果针对实体瘤逃避免疫效应的相关机制,发展通用技术,对实体瘤的肿瘤细胞进行在体标记和改造,提高其被免疫系统识别的能力,增强其识别肿瘤细胞的能力(如CAR-T和CAR-NK),则有望提高实体瘤的免疫治疗效果。对细胞表面的改造中直接插入法是细胞膜修饰最简单、有效的方法,且对膜本身的功能几乎不产生影响。设计特定结构的化学分子,通过简单的孵育过程,即可将化学分子直接插入细胞膜磷脂双分子层中,实现多种功能。例如,Blake R. Peterson课题组模拟细胞膜中的脂筏结构,设计、合成了一系列具有“细胞膜锚定区-连接臂-配体识别区”的胆固醇衍生物。其中,细胞膜锚定区为N-烷基胆固醇胺,连接臂为β-氨基丙酸,配体识别区可替换为荧光素、生物素、小肽、间二硝基苯和人造Fc受体等。这些胆固醇衍生物在体外可成功插入细胞膜双分子层,类似于人造受体。配体识别区分别与荧光素抗体、链霉亲和素、与小肽识别的抗体、IgG等特异性结合,介导并增加细胞对化学药物、基因和抗原的内吞。此外,Carolyn R. Bertozzi课题组在糖基化的聚合物末端连接脂质基团,并将其嵌入细胞膜中,模拟粘蛋白样大分子的细胞行为。整体而言,这些化学分子均具有相同的结构特点,即包含与细胞膜组成单元(如脂筏和磷脂)结构类似的亲水段和疏水段,亲、疏水段通过化学键或小分子相连。在细胞层面可以有效地插入膜双分子层,发挥人造受体的功能。然而,上述化学方法通常涉及复杂的化学反应,分子合成难度大。由于缺乏细胞选择性,在体内复杂环境下修饰特定靶细胞的能力有限。基因工程和代谢工程对细胞表面改造可能带来的生物安全性问题,仍有待时间和大样本数据的检验。
异质纳米粒(Janus Particles,JNPs)是一类具有不对称结构和组成的纳米粒子,可以在单个粒子中表现出各组分的化学或物理性质。其中,由金、四氧化三铁纳米粒子组合而成的Au-Fe3O4异质材料,由于其独特的性能而受到广泛关注。《Double-LayeredPlasmonic–Magnetic Vesicles by Self-Assembly of Janus Amphiphilic Gold–Iron(II,III) Oxide Nanoparticles》(Angew.Chem. Int. Ed. 2017, 56,8110 –8114)公开了两种两亲性异质纳米粒 Au@PS-Fe3O4@PEG和Au@PEG-Fe3O4@PS。由于聚合物接枝物在异质纳米粒 Au- Fe3O4表面呈两亲性分布,形成模仿经典两亲性“捆绑块聚合物”性质的双层等离子体-磁性囊泡。通过改变涂覆在其表面的聚合物刷的两亲性,可以很容易地改变其表面的Au和Fe3O4的位置。由于金纳米粒子间的等离子体耦合和铁离子在双囊泡壳中的二倍体相互作用,使囊泡的光学和磁性质得到了极大的增强,证明了在体内作为一种光学和磁共振成象剂的潜力。
现有技术下,尚无具有膜改造功能的异质纳米粒的研究报道。
发明内容
本发明采用Au-Fe3O4异质纳米颗粒对其进行表面化学的合理设计,构建了一类两亲性异质纳米粒以及由其自组装形成的蒲公英型异质纳米囊泡,实现对细胞膜的修饰。
本发明具体技术方案如下:
一种两亲性异质纳米粒,将巯基衍生化的聚乙二醇通过S-Au共价键连接于异质纳米粒Au-Fe3O4的Au表面,磷脂磷酸或其盐通过磷酸根连接于异质纳米粒Au-Fe3O4的Fe3O4表面。
上述异质纳米粒Au-Fe3O4采用油相晶种生长法合成,Fe3O4与Au之间存在异质界面,形成二聚体、壳核结构,或卫星状结构。
本发明所述的两亲性异质纳米粒,巯基衍生化的聚乙二醇:磷脂磷酸或其盐:Au-Fe3O4的质量比为4~1:1:4~1。优选为4:1:4。
优选的,本发明所述巯基衍生化的聚乙二醇选自巯基聚乙二醇甲酯,巯基聚乙二醇羧酸,巯基-聚乙二醇-氨基,巯基聚乙二醇马来酸中的一种或几种,分子量为1000~5000Da。
优选的,所述磷脂磷酸选自1, 2-二豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸、1, 2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱、二月桂酰基磷脂酸,1, 2-二棕榈酰-SN-甘油-3-磷脂酸,1, 2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷脂酸、油酰基-L-α-溶血磷脂酸,1-油酰基溶血磷脂酸中的一种或几种。
优选的,所述Au-Fe3O4异质纳米粒的Au纳米粒粒径为2~15 nm,Fe3O4纳米粒粒径为12~25 nm。
本发明另一目的在于提供一种蒲公英型异质纳米囊泡,由本发明所述的异质纳米粒自组装而成,囊泡内部为磷脂磷酸盐一端形成的疏水空腔,囊泡外部为巯基衍生化的聚乙二醇形成的亲水端。
本发明另一目的在于提供本发明所述的两亲性异质纳米粒或蒲公英型异质纳米囊泡在修饰或改造细胞膜功能中的应用。所述的两亲性异质纳米粒或蒲公英型异质纳米囊泡解离后的两亲性异质纳米粒的疏水端锚定细胞膜表面,亲水端结合功能分子以提高病变细胞的药物递送、免疫治疗、代谢调控能力。所述功能分子选自化学分子、蛋白、多肽、多糖、糖肽、糖蛋白、核酸中的一种或几种,可以是药物、受体、适配体、抗原、抗体、荧光素、生物素、亲和素中的一种或几种。
本发明另一目的在于提供本发明所述的蒲公英型异质纳米囊泡作为免疫疫苗和药物载体在免疫治疗和药物递送系统中的应用。
本发明一种具体的两亲性异质纳米粒及蒲公英型异质纳米囊泡制备方法如下:
将10 mg巯基甲氧基聚乙二醇1000(HS-mPEG1000)溶解于3 mL甲醇中(冰水浴),展开1 h,加入1.5倍摩尔量的硼氢化钠水溶液(1 mg/mL),冰水浴中反应1 h。称取10 mg 1,2-二豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸(PC),量取1 mL的Au-Fe3O4的氯仿溶液(1 mg/mL),将PC和Au-Fe3O4充分混合后滴加入HS-mPEG1000溶液中,避光磁搅拌24 h。挥干有机溶剂并用3 mL蒸馏水复溶,得到两亲性异质纳米粒Au@PEG-Fe3O4@PC。在流动水中透析24 h(透析袋 MWCO 为7,500 Da),除去未反应的侧链后,异质纳米粒发生自组装。将上述透析液于-20 ℃预冻过夜随后冻干,得到蒲公英型异质纳米囊泡(HS-mPEG1000:PC :Au-Fe3O4质量比= 1:1:1),根据PC所占比例将该囊泡简称为PC-1。同法,改变PC的加入量,使HS-mPEG1000:PC的质量比分别为1:0.5,1:0.25和1:0.1,得到的蒲公英型异质纳米囊泡依次简称为PC-0.5,PC-0.25和PC-0.1。使用同等质量的P-PEG1000代替上述PC,同法得到Au@PEG-Fe3O4@PEG(质量比HS-mPEG1000:P-PEG1000 = 1:0.25)作为对照,简称PC-0。
本发明一个具体的方案,提供了一种负载肿瘤相关抗原卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)的蒲公英型异质纳米囊泡。具体制备方法如下:
将巯基聚乙二醇-氨基(SH-PEG1000-NH2)、1, 2-二豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸(PC)和Au-Fe3O4,制备表面带氨基的蒲公英型异质纳米囊泡( SH -PEG1000- NH2:PC :Au-Fe3O4质量比= 1:0.25:1)。制备OVA浓度为0.512 mg/mL的异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记卵白蛋白(FITC-OVA)PBS工作溶液。将1.5 mL该OVA-FITC工作溶液与1mL 1 mg/mL的蒲公英型异质纳米囊泡( NH2-PEG1000-SH:PC 质量比= 1:0.25)水溶液混合,摇床缓慢振摇30 min使OVA-FITC结合到纳米粒的NH2-PEG1000上。离心,移除上清液中游离的OVA-FITC。用2 mL PBS对OVA修饰的纳米粒重悬,得到含0.5 mg/mL 蒲公英型异质纳米囊泡 DNVs-OVA1溶液(异质纳米粒为OVA1/Au@PEG-Fe3O4@PC),4℃保存。改变OVA-FITC的加入量为1 mg和2 mg,同法得到DNVs-OVA2和DNVs-OVA3。
上述异质纳米囊泡PEG与PC质量比优选为1:0.25。
上述蒲公英型异质纳米粒OVA加入量优选为0.768 mg。
优选的,上述蒲公英型异质纳米囊泡可用作细胞表面标记,对肿瘤细胞表面实行抗原增补,具有免疫激活特性,可用于在体肿瘤免疫治疗。
本发明优点:
(1)本发明采用哑铃型Au-Fe3O4异质纳米颗粒作为连接臂,利用其异质、两面的特性,在颗粒两端分别连接亲水和疏水性分子,构建“疏水端细胞膜锚定区-Au-Fe3O4连接臂-亲水端功能分子连接区”的结构,通过完全物理的方式实现对细胞膜双分子层的修饰。两亲性异质纳米粒的疏水端锚定细胞膜表面,亲水端结合功能分子以提高病变细胞的药物递送,免疫治疗,代谢调控能力。
(2)本发明所述的两亲性异质纳米颗粒,在水相溶液中能够自组装成异质纳米囊泡。其中亲水性的巯基甲氧基聚乙二醇(HS-mPEG1000)通过S-Au共价键连接于异质纳米颗粒的Au表面,可用于功能性分子的连接。通过调节亲/疏水分子的连接比例,组装成合适粒径的蒲公英型异质纳米囊泡(简称DNVs),DNVs一方面具备独特的细胞膜修饰功效,蒲公英型异质纳米囊泡与细胞接触后发生膜融合,其两端修饰的亲水和疏水性有机侧链使其具备细胞膜插入能力。另一方面具有载体特征,可负载肿瘤相关抗原卵清蛋白(Ovalbumin,OVA),该体系一方面可以激活树突状细胞,同时可对肿瘤细胞膜进行改造以增补其表面抗原,最大程度地解决肿瘤下调自身抗原的免疫逃逸问题,可用于肿瘤治疗研究。
(3)本发明在上述研究此基础上,引入肿瘤相关抗原性抗原OVA构成完整的肿瘤疫苗。囊泡内部为PC端组成的疏水空腔,可用于疏水功能性分子的包载,如包载荧光分子吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)后可对囊泡进行在体水平的近红外监测。本发明所制备的蒲公英型异质纳米囊泡进入体内后,部分囊泡在体循环过程中可发挥肿瘤疫苗的作用,被DCs和巨噬细胞等抗原提呈细胞识别、吞噬并诱导其成熟,进而激活T细胞,触发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤的杀伤效应,最终实现对实体瘤的免疫治疗;另一部分借助颗粒的小尺寸效应和实体瘤的高通透性和滞留效应(Enhanced Permeability and Retentioneffect,EPR效应)在实体瘤内部蓄积。在肿瘤细胞摄取过程中,纳米颗粒对细胞膜的标记经历了一个结合、锚定和内吞的过程,PEG端所携带的OVA可在一定时间内处于细胞表面,实现肿瘤相关抗原OVA在细胞表面的增补,改善肿瘤细胞的弱抗原性,进一步增加肿瘤细胞被CTL识别的可能性,增强免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。
附图说明
图1 为本发明的蒲公英型异质纳米囊泡合成示意图。
图2 为蒲公英型异质纳米囊泡Au@PEG-Fe3O4@PC(1:1)(简称PC-1)、Au@PEG-Fe3O4@PC(1:0.5)(简称PC-0.5)、Au@PEG-Fe3O4@PC(1:0.25)(简称PC-0.25)、Au@PEG-Fe3O4@PC(1:0.1)(简称PC-0.1) 和 Au@PEG-Fe3O4@PEG(1:0.25)(简称PC-0)的水合粒径大小(n = 3)。
图3 为PC、PEG和DNVs的红外吸收光谱图。
图4 为蒲公英型异质纳米囊泡OVA1/Au@PEG-Fe3O4@PC(1:0.25)(简称DNVs-OVA1)、OVA2/Au@PEG-Fe3O4@PC(1:0.25)(简称DNVs-OVA2)和 OVA3/Au@PEG-Fe3O4@PC(1:0.25)(简称DNVs-OVA3)的水合粒径大小(n = 3)。
图5 为OVA、DNVs及DNVs-OVA1的红外吸收光谱图。。
图6 为蒲公英型异质纳米囊泡Au@PEG-Fe3O4@PC(1:1)(简称PC-1)、Au@PEG-Fe3O4@PC(1:0.5)(简称PC-0.5)、Au@PEG-Fe3O4@PC(1:0.25)(简称PC-0.25)和Au@PEG-Fe3O4@PC(1:0.1)(简称PC-0.1)(含10 µg/mL Au-Fe3O4)与HepG2细胞于37 ℃孵育0 h,2 h,4 h,6 h后暗场显微镜图,标尺为100 µm。
图7 为DNVs-OVA1(含0.2 mg / mL OVA)与HepG2细胞于37 ℃孵育(A)0 h、(B)2h、(C)4 h和(D)6 h后的激光共聚焦显微镜图,标尺为100 µm。
图8 为PBS,OVA(5 µg/mL),DNVs(6.5 µg/mL),DNVs-OVA(含5 µg/mL OVA)及LPS(1µg/mL)处理24 h后的BMDCs中CD80和CD86的表达。
图9 为生理盐水,Au@PEG-Fe3O4@PC-0.25,OVA/Au@PEG-Fe3O4@PC-0.25对于荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价比较:(A)肿瘤体积变化曲线,(B)体重,(C)肿瘤重量变化曲线和(D)第11天小鼠肿瘤实物图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,该实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例 1 本发明所述蒲公英型异质纳米囊泡的制备、表征及对细胞膜的标记主要包括如下三个方面:
(1)将10 mg巯基甲氧基聚乙二醇1000(HS-mPEG1000)溶解于3 mL甲醇中(冰水浴),展开1 h,加入1.5倍摩尔量的硼氢化钠水溶液(1 mg/mL),冰水浴中反应1 h。称取10 mg 1,2-二豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸(PC),量取1 mL的Au-Fe3O4的氯仿溶液(1 mg/mL),将PC和Au-Fe3O4充分混合后滴加入HS-mPEG1000溶液中,避光磁搅拌24 h。挥干有机溶剂并用3 mL蒸馏水复溶,得到两亲性异质纳米粒Au@PEG-Fe3O4@PC。在流动水中透析24 h(透析袋 MWCO 为7,500 Da),除去未反应的侧链后,异质纳米粒发生自组装。将上述透析液于-20 ℃预冻过夜随后冻干,得到蒲公英型异质纳米囊泡(HS-mPEG1000:PC :Au-Fe3O4质量比= 1:1:1),根据PC所占比例将该囊泡简称为PC-1。同法,改变PC的加入量,使HS-mPEG1000:PC的质量比分别为1:0.5,1:0.25和1:0.1,得到的蒲公英型异质纳米囊泡依次简称为PC-0.5,PC-0.25和PC-0.1。使用同等质量的P-PEG1000代替上述PC,同法得到Au@PEG-Fe3O4@PEG(质量比HS-mPEG1000:P-PEG1000 = 1:0.25)作为对照,简称PC-0。
将巯基聚乙二醇-氨基(SH-PEG1000-NH2)、1, 2-二豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸(PC)和Au-Fe3O4,制备表面带氨基的蒲公英型异质纳米囊泡( SH -PEG1000- NH2:PC :Au-Fe3O4质量比= 1:0.25:1)。制备OVA浓度为0.512 mg/mL的异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记卵白蛋白(FITC-OVA)PBS工作溶液。将1.5 mL该OVA-FITC工作溶液与1mL 1 mg/mL的蒲公英型异质纳米囊泡( NH2-PEG1000-SH:PC 质量比= 1:0.25)水溶液混合,摇床缓慢振摇30 min使OVA-FITC结合到纳米粒的NH2-PEG1000上。离心,移除上清液中游离的OVA-FITC。用2 mL PBS对OVA修饰的纳米粒重悬,得到含0.5 mg/mL 蒲公英型异质纳米囊泡 DNVs-OVA1溶液(异质纳米粒为OVA1/Au@PEG-Fe3O4@PC),4 ℃保存。改变OVA-FITC的加入量为1 mg和2 mg,同法得到DNVs-OVA2和DNVs-OVA3。
(2)蒲公英型异质纳米囊泡的表征:
准备PC-1、PC-0.5、PC-0.25、PC-0.1和PC-0的去离子水溶液(含70 µg/mL Au-Fe3O4),于粒径电位仪上测定其水合粒径大小,如图2所示,随着PEG:PC质量比由1:1增加为1:0.25,即随PC的加入量逐渐降低,各囊泡的粒径依次为709.29 ± 4.37,529.54 ±5.50,186.98 ± 2.34和281.56 ± 4.56 nm,发生了由高到低再升高的变化。这是因为当PC加入量较高时(如PC-1和PC-0.5),Au@PEG-Fe3O4@PC单体的尺寸相对较高,当在水溶液中自组装形成囊泡时其水合粒径相对较高。通过减少PC的加入量,发现PC-0.25尺寸降至不到200 nm,与其他组形成了显著性差异,然而,继续降低PC的加入量时,PC-0.1的粒径反而增加。与此同时,对于对照组PC-0,即Au@PEG-Fe3O4@PEG,由于异质纳米粒两端均为亲水侧链,故无法有效形成囊泡结构,其水合粒径降至120.53 ± 3.46 nm。由于纳米颗粒特殊的尺寸效应,当其用于肿瘤治疗时,由于实体瘤的EPR效应而被动靶向进入并积聚在肿瘤部位,也有研究证明,尺寸在30 - 200 nm范围内的纳米粒子可以较多的被肿瘤摄取。基于此,为了使纳米囊泡在体内能够更多地聚集在肿瘤部位,优选出粒径较为合适的PC-0.25,又称其为DNVs。
取PC,PEG,PC-0.25的冻干粉各约5 mg,分别加入适量溴化钾粉末,于红外灯下在玛瑙乳钵中研磨均匀,压片。借助红外光谱仪记录图谱,根据PEG和PC的特征吸收峰定性分析纳米粒子的侧链连接情况如图3,PC结构中含有磷酸基、甲基和酯键,因此其红外吸收光谱中2917 cm-1处为磷酸基中-OH的伸缩振动峰,2881 cm-1处为甲基中-CH3的伸缩峰,1741cm-1处为酯键中C=O的伸缩振动峰。PEG的结构中包含甲基和醚,其中2881 cm-1处为甲基中-CH3的伸缩峰,1108 cm-1处有-C-O-C-的伸缩振动峰。而DNVs同时具备2917,2881,1741和1108 cm-1处的各个特征吸收峰,证实PC和PEG在Au-Fe3O4上成功连接。
准备DNVs-OVA1,DNVs-OVA2和DNVs-OVA3的去离子水溶液(含70 µg/mL Au-Fe3O4),于粒径电位仪上测定其水合粒径大小,如图4所示,当修饰有OVA时,DNVs-OVA1相较于DNVs的粒径产生显著性差异,分别为188.01 ± 1.75 nm和260.99 ± 3.76 nm,说明OVA成功负载于DNVs上。随着OVA的加入量逐渐增加,DNVs-OVA2和DNVs-OVA3的粒径依次增大为273.39± 2.33 nm和293.95 ± 2.28 nm。为了使制备的蒲公英型纳米囊泡粒径大小更适于向肿瘤部位聚集,优选出粒径相对较小的DNVs-OVA1。
取DNVs-OVA1,DNVs-OVA2和DNVs-OVA3的冻干粉各约5 mg,分别加入适量溴化钾粉末,于红外灯下在玛瑙乳钵中研磨均匀,压片。借助红外光谱仪记录图谱,根据特征吸收峰评价OVA的负载情况如图5,OVA在3380、2937、2881、1108和1043 cm-1处有特征吸收峰,DNVs于2917,2881,1741和1108 cm-1处有特征吸收峰,而DNVs-OVA1同时具备上述两者的特征峰,进一步验证了OVA在DNVs上的成功负载。
(3)蒲公英型异质纳米囊泡对细胞膜的标记。
将HepG2肝癌细胞接种于细胞培养皿中(100 mm,Thermo,USA),并置于二氧化碳培养箱(37 ℃,5% CO2,饱和湿度)内培养,孵育过夜至呈单细胞分散的密度。吸除培养基,PBS清洗3次,分别加入5 mL含PC-1,PC-0.5,PC-0.25和PC-0.1(含10 µg/mL Au-Fe3O4)的DMEM培养液(不含血清)。十字形水平晃动将细胞培养液混匀,37 ℃继续孵育0 h,2 h,4 h,6 h后,弃去上清液,用PBS 溶液轻轻洗涤细胞3次。加入适量PBS防止干涸,并置于尼康倒置暗场显微镜下观察拍照,评价异质纳米囊泡的细胞膜修饰能力,如图6。借助Au-Fe3O4独特的光散射特性,对各纳米粒子在细胞中的位置进行追踪,可以看到0 h时,细胞自身具有微弱的散射光,可以看到不太清晰的细胞轮廓。增加孵育时间至2 h后,PC-1,PC-0.5和PC-0.1处理下的细胞膜上仍然观测不到明显的散射光,而PC-0.25处理下的细胞表面有了明显的金黄色散射光,说明PC-0.25此时位于细胞膜表面。为了更进一步追踪4种纳米粒子在细胞中的分布,延长孵育时间至4 h和6 h,可以发现PC-1,PC-0.5和PC-0.1处理下的细胞内部出现散射光,说明这三种纳米粒子在与细胞膜相互作用的过程中没有较长时间的停留,4 h时便可以进入细胞内部。而只有PC-0.25组,在孵育6 h后仍然位于细胞膜上,体现出PC-0.25的长时间细胞膜标记特性。
将HepG2肝癌细胞接种于玻璃底细胞培养皿中(15 mm,NEST),并置于二氧化碳培养箱(37 ℃,5% CO2,饱和湿度)内培养,孵育过夜至细胞密度为70 - 80%。吸除培养基,PBS清洗3次,加入2 mL DNVs-OVA1(含0.2 mg/mL OVA)的DMEM培养液(不含血清)。十字形水平晃动将细胞培养液混匀,37 ℃继续孵育0 h,2 h,4 h,6 h后,弃去上清液,用PBS 溶液轻轻洗涤细胞3次。加入适量PBS防止干涸,并置于激光共聚焦显微镜下观察拍照,评价蒲公英型异质纳米囊泡对肿瘤细胞的抗原增补能力,如图7。当孵育时间为2 h时,细胞表面出现了微弱的绿色荧光(FITC标记的OVA),表明此时有一小部分DNVs-OVA1到达细胞表面。当增加孵育时间至4 h和6 h时,细胞表面的绿色荧光增强,使得细胞呈现出了明显的绿色轮廓,说明有更多的DNVs-OVA1到达细胞膜表面,并且由于DNVs的细胞膜标记特性,使得所负载的OVA可以在一定时间内停留在细胞膜表面。该结果更进一步证明了,DNVs在负载抗原后仍然保持了细胞膜插入特性,使得其亲水端所携带的OVA可以在一定时间内修饰在细胞膜表面,对细胞表面实行抗原增补,改善肿瘤表面弱抗原环境,有望在用于体内治疗时提高免疫系统对肿瘤细胞的识别。
实施例 2 本发明所述蒲公英型异质纳米囊泡的树突状细胞激活能力评价如下:
首先需获取小鼠骨髓细胞。小鼠(6 - 10周龄,雌性)颈椎脱臼法处死,手术取出所有股骨和胫骨,并用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净;用盛有75%酒精的无菌培养皿浸泡2 - 5 min,以消毒灭菌,并将骨移至超净台内,然后用无菌PBS洗2次;将骨移入另一个盛有PBS的新培养皿中,用剪刀剪去骨两端,再用注射器抽取PBS,针头分别从骨两端插入骨髓腔,反复冲洗出骨髓至培养皿中,直至骨完全变白;收集骨髓悬液,用200目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织;滤过液1200 rpm离心5 min,弃上清。
接着大量制备BMDCs,获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至2 ×105/mL;向100 mm细菌培养皿(Petri Dish)中,加入10 mL该浓度细胞,同时加入重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony stimulating factor,GM-CSF)(200 U/mL),并置于二氧化碳培养箱(37 ℃,5%CO2,饱和湿度)培养;第3天时,向培养皿中再加入10 ml含200 U/mL重组小鼠GM-CSF的完全培养液;第6天半量换液,即收集10 mL旧培养液,离心后用10 mL含200 U/mL重组小鼠GM-CSF的完全培养液重悬细胞沉淀,然后再将细胞悬液放回原培养皿;第8天半量换液后直接接种。
将BMDCs以8×105个细胞/皿接种于12孔板(Thermo,USA)过夜,第二天移除培养基,加入2 mL不含或含OVA(5 µg/mL)、DNVs(6.5 µg/mL)、DNVs-OVA1(含5 µg/mL OVA)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,1 µg/mL)的1640培养基(10%血清),置于二氧化碳培养箱(37 ℃,5% CO2,饱和湿度)内继续孵育24 h后,提取全部细胞及培养基,离心,吸取上清液并借助ELISA进行细胞因子IL-6、IL-12的测定;同时,向沉淀中加入100 µL PBS以重悬细胞,调整细胞浓度至5×105 - 1× 106个/mL,向其中分别加入成熟BMDCs表面标志物CD80、CD86所对应的FITC偶联的小鼠CD80单克隆抗体、PE偶联的小鼠CD86抗体,室温孵育15 min后,离心除去未连接的抗体,用PBS重悬后,借助流式细胞仪进行测定,评价CD80、CD86的表达程度,如图8。与PBS组相比,OVA处理后的BMDCs其表面CD80、CD86分子表达上调,并且分泌的细胞因子IL-6、IL-12也显著增多,因此单独的OVA已经可以激活BMDCs。而DNVs处理后的BMDCs与PBS组相比,其表面CD86分子表达具有上调趋势,这表明DNVs由于其自身具备的免疫佐剂特性,在单独使用时也可以激活BMDCs。与此同时,对比OVA和DNVs-OVA1两组实验结果可以发现,DNVs-OVA1处理下的BMDCs可以产生更明显的CD86分子上调,充分证明了DNVs纳米囊泡不仅自身可以产生有效的免疫刺激效果,在负载抗原后还可以进一步提升抗原的免疫激活能力,是用于构建肿瘤疫苗的优良材料。值得注意的是,DNVs-OVA1处理后的BMDCs呈现出与LPS相当的BMDCs激活能力,在CD80、CD86分子的表达上没有显著性差异,这也进一步证明了DNVs-OVA1在体外水平能够较大程度地刺激BMDCs成熟,具有良好的免疫激活特性。
实施例 3 本发明所述蒲公英型异质纳米囊泡的体内药效学研究如下:
ICR小鼠(雌性,4 - 5周龄)安置于标准SPF级条件下饲养(25±2 ℃、恒温、12 h光暗交替)。动物可自由活动和饮食,并定时添加无菌食物和饮用水。Heps细胞腹腔注射至小鼠体内培养,得到腹水小鼠。抽取腹水,按照腹水:生理盐水 = 1:3的比例制备植瘤腹水液。酒精棉擦拭ICR小鼠待接种部位,无菌注射器吸取100 µL细胞悬液,注入皮下,小心拔出注射器既可。随时观察小鼠肿瘤的生长情况。待肿瘤长到200 mm3左右时,Heps荷瘤小鼠模型建立成功。
当Heps荷瘤小鼠的肿瘤体积增长至200 mm3左右时,设为实验的第0 d,将Heps荷瘤小鼠随机分为3组(n = 5),分别于第2、4、6、8、10 d分别尾静脉注射生理盐水、DNVs和DNVs-OVA1给药溶液(给药剂量为DNVs 6 mg/kg)。隔天记录Heps荷瘤小鼠的肿瘤体积和体重。在第11 d,将Heps荷瘤小鼠处死,剥离肿瘤组织并以生理盐水洗净后称重。按照以下公式计算肿瘤体积:V(mm3)=(L × W2)/ 2,其中L为肿瘤长径,W为肿瘤短径。隔天记录小鼠肿瘤体积变化如图9(A)所示。由于没有抗肿瘤药物治疗,生理盐水组Heps 荷瘤小鼠的肿瘤体积增长迅速,第10 d达到1249.42 ± 30.81 mm3。而当给予DNVs后Heps 荷瘤小鼠肿瘤体积增长受到轻微抑制,推测与载体材料自身具备免疫佐剂的性质有关,可以刺激机体产生免疫反应,发挥一定的抗肿瘤作用。在给予DNVs-OVA1纳米囊后,Heps 荷瘤小鼠肿瘤体积增长受到明显抑制,第10 d降为411.63 ± 22.45 mm3。DNVs及DNVs-OVA1组Heps荷瘤小鼠的体重在实验期间均保持不断增加(图9,B),表明DNVs在实验剂量下不会对小鼠产生显著毒性,并且在负载了OVA之后,也能保证DNVs-OVA1处理下的小鼠具有较好的生存质量。在第11 d,剥离肿瘤组织,以生理盐水洗净后称重(图 9,C)并拍照(图 9,D)。各组肿瘤重量由小到大依次为:DNVs-OVA1组(0.27 ± 0.01 g)<DNVs组(0.42±0.02 g)<生理盐水组(0.52 ±0.02 g),其中DNVs-OVA1可以显著抑制实体瘤的生长。
Claims (8)
1.一种两亲性异质纳米粒,其特征在于巯基衍生化的聚乙二醇通过S-Au共价键连接于异质纳米粒Au-Fe3O4的Au表面,磷脂磷酸或其盐通过磷酸根连接于异质纳米粒Au-Fe3O4的Fe3O4表面,巯基衍生化的聚乙二醇:磷脂磷酸或其盐: Au-Fe3O4的质量比为4:1:4,所述的两亲性异质纳米粒,采用油相晶种生长法合成,Fe3O4与Au之间存在异质界面,形成二聚体、壳核结构,或卫星状结构,所述巯基衍生化的聚乙二醇选自巯基-聚乙二醇-氨基SH-PEG1000-NH2或者巯基甲氧基聚乙二醇1000 HS-mPEG1000,所述磷脂磷酸选自1, 2-二豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酸PC。
2.根据权利要求1所述的两亲性异质纳米粒,其特征在于所述Au-Fe3O4异质纳米粒的Au纳米粒粒径为2~15 nm,Fe3O4纳米粒粒径为12~25 nm。
3.一种蒲公英型异质纳米囊泡,其特征在于由权利要求1或2所述的异质纳米粒自组装而成,囊泡内部为磷脂磷酸或其盐一端形成的疏水空腔,囊泡外部为巯基衍生化的聚乙二醇形成的亲水端。
4.根据权利要求1或2所述的两亲性异质纳米粒或权利要求3所述的蒲公英型异质纳米囊泡在制备修饰或改造细胞膜功能物质中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于所述的两亲性异质纳米粒或蒲公英型异质纳米囊泡解离后的两亲性异质纳米粒的疏水端锚定细胞膜表面,亲水端结合功能分子以提高病变细胞的药物递送,免疫治疗,代谢调控能力。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于功能分子选自化学分子、蛋白、多肽、多糖、糖肽、糖蛋白、核酸中的一种或几种。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于功能分子选自药物、受体、适配体、抗原、抗体、荧光素、生物素、亲和素中的一种或几种。
8.权利要求3所述的蒲公英型异质纳米囊泡在制备免疫疫苗和药物载体的应用。
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