CN111346224B - 一种免疫佐剂组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种免疫佐剂组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种佐剂组合物，该佐剂组合物含有0.2％‑0.5％w/v卡波姆、0.1％‑0.5％w/v卵磷脂、0.03％‑0.2％w/v人参皂苷。本发明的佐剂组合物不仅能在保证疫苗长时期澄清、和/或稳定；并且能有效激发其中的灭活抗原和亚单位抗原产生高滴度抗体，进行免疫保护。本发明的佐剂组合物其制备的灭活疫苗或亚单位疫苗可以用作冻干的活病毒抗原的稀释剂，对活病毒抗原无毒杀作用。

Description

一种免疫佐剂组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医用配制品领域，涉及免疫佐剂组合物、其制备方法和应用。
背景技术
"佐剂"意指提高对抗原的体液或细胞免疫应答的物质。佐剂一般用于实现两个目标:抗原从注射部位的控制释放和免疫系统的剌激。由于动物用的含有注射用白油的佐剂有强烈的副反应，人们开发了水性佐剂，例如以商品名卡波姆，型号为934为代表的聚丙烯酸佐剂，包括seppic的商品GEL01佐剂，然而，这类水性佐剂仅对部分抗原有效，对其他抗原效果较差，而且聚丙烯酸溶液在等渗溶液长时间放置容易颗粒变大，形成分层和沉淀，从而影响佐剂效果。
人参皂苷也作兽用佐剂使用，例如“人参茎叶皂甙提高口蹄疫和新城疫油佐剂(李禹涛等2012)，但是人参皂苷发挥佐剂作用需要与油佐剂共同使用时才能体现。
为了减少动物应激，将灭活疫苗作为活疫苗的稀释剂使用从而实现“活+死”的方式，这就需要灭活疫苗的佐剂本身没有杀病毒活性，而皂苷通常有溶血性，例如常用的QuilA，虽然加入胆固醇和卵磷脂后制备成ISCOM后，杀病毒活性降低，但试验发现还是该复合物具有杀病毒活性而不能作为活疫苗的稀释剂。
免疫具有复杂性，相同的抗原与不同佐剂之间联合有些有协同增效作用，有些有拮抗作用，而且不同的抗原由于其免疫机理不同，所选择的佐剂也不同。因此，本领域需要一种免疫佐剂，其与灭活疫苗组成疫苗组合物后稀释活疫苗，在有效期内保持稳定，又对常用的抗原均有显著的增强作用，同时容易制备。虽然现有技术公开的佐剂众多，如何能同时解决这三方面的问题对本领域技术人员来说依然是个难题。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提供一种佐剂组合物，其中，所述佐剂组合物含有0.2％-0.5％w/v卡波姆、0.1％-0.5％w/v卵磷脂、0.03％-0.2％w/v人参皂苷。
本发明人意外发现，卡波姆与卵磷脂溶液中加入人参皂苷，佐剂变得澄清，佐剂稳定性提高，而且在此浓度下单独的人参皂苷并无免疫增强作用，但可以起到稳定剂的作用。加入人参皂苷在一定量的范围(0.03％-0.2％w/v)起到稳定作用，这个量的范围与卡波姆与卵磷脂浓度关系不大，并且发现不是任何有免疫增强作用的化学成分组合。
本发明的佐剂组合物与抗原可以30-70：50的体积比配合，不仅能在4℃保证疫苗长达12个月澄清、稳定，在25℃保证疫苗长达6个月稳定，在37℃保证疫苗3个月稳定；并且能有效激发其中的灭活抗原和亚单位抗原产生高滴度抗体，进行免疫保护。
在本发明的佐剂组合物中，卡波姆含量范围可选自0.2％w/v、0.25％w/v、0.3％w/v、0.35％w/v、0.4％w/v、0.45％w/v、0.5％w/v；卵磷脂含量范围可选自0.1％w/v、0.15％w/v、0.2％w/v、0.25％w/v、0.3％w/v、0.35％w/v、0.4％w/v、0.45％w/v、0.5％w/v；人参皂苷含量范围可选自0.03％w/v、0.04％w/v、0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v、0.1％w/v、0.11％w/v、0.12％w/v、0.13％w/v、0.14％w/v、0.15％w/v、0.16％w/v、0.17％w/v、0.18％w/v、0.19％w/v、0.2％w/v。
作为本发明的一种实施方式，本发明的佐剂组合物中，所述佐剂组合物含有0.2％-0.5％w/v卡波姆、0.1％-0.4％w/v卵磷脂、0.03％-0.2％w/v人参皂苷。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的佐剂组合物中，所述佐剂组合物含有0.2％-0.5％w/v卡波姆、0.1％-0.2％w/v卵磷脂、0.03％-0.2％w/v人参皂苷。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明的佐剂组合物中，所述佐剂组合物含有0.4％w/v卡波姆、0.1％w/v卵磷脂、0.05％w/v人参皂苷。
作为本发明的一种实施方式，本发明的佐剂组合物中，所述佐剂组合物还含有0.05％-0.2％w/v聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
在本发明的佐剂组合物中，本发明的聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物含量范围可选自0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v、0.10％w/v、0.11％w/v、0.12％w/v、0.13％w/v、0.14％w/v、0.15％w/v、0.16％w/v、0.17％w/v、0.19％w/v、0.2％w/v。
本发明的佐剂组合物添加聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物后能进一步激发其中的灭活抗原和亚单位抗原产生高滴度抗体，免疫效果显著。
本发明还提供了一种第一疫苗组合物，其中，所述第一疫苗组合物含有30-70％w/w所述的佐剂组合物和免疫量的灭活抗原或亚单位抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明的第一疫苗组合物中，所述佐剂组合物含量为50％w/w。
在本发明的佐剂组合物中，所述佐剂组合物含量可选自30％w/w、35％w/w、40％w/w、45％w/w、50％w/w、55％w/w、60％w/w、65％w/w、70％w/w。
本发明的第一疫苗组合物可以经一次免疫就能产生保护。
作为本发明的一种实施方式，本发明的第一疫苗组合物中，所述灭活抗原为猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、猪伪狂犬病毒抗原。
本发明的佐剂组合物可以与多种灭活抗原或亚单位抗原组合使用，能有效增强这些抗原的免疫效果。这些抗原可以是猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原、猪细小病毒抗原、多杀巴斯德菌抗原、猪链球菌抗原、猪葡萄球菌抗原、支气管炎博德特菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、肠炎沙门氏菌抗原、猪呼吸道冠状病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪细环病毒抗原、猪巨细胞病毒抗原、脑心肌炎病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪瘟病毒抗原或者其联合。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的第一疫苗组合物中，所述灭活抗原为猪圆环病毒2型SH株灭活全病毒抗原，所述猪圆环病毒2型SH株保藏号为CGMCC No.2389。
猪圆环病毒2型SH株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年3月4日，保藏编号为CGMCC No.2389，公开于CN101240264A。
本发明的第一疫苗组合物中猪圆环病毒2型SH株灭活全病毒抗原能经一次免疫就能产生免疫保护。
作为本发明的一种实施方式，本发明的第一疫苗组合物中，所述第一疫苗组合物含有含有0.2％w/v卡波姆、0.05％w/v卵磷脂、0.015％-0.05％w/v人参皂苷和100ug/mlPCV2蛋白病毒样颗粒抗原。
本发明的第一疫苗组合物中PCV2蛋白病毒样颗粒抗原经一次免疫就能产生免疫保护，其免疫期可长达20周。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的第一疫苗组合物中，所述第一疫苗组合物含有0.2％w/v卡波姆、0.05％w/v卵磷脂、0.025％w/v人参皂苷、0.025％-0.1％w/v聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物和100ug/ml PCV2蛋白病毒样颗粒抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明的第一疫苗组合物中，所述第一疫苗组合物含有0.2％w/v卡波姆、0.05％w/v卵磷脂、0.025％％w/v人参皂苷、0.025％-0.1％w/v聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物和灭活前菌体含量为1.5×109CCU的HN0613株灭活全菌抗原,所述猪肺炎支原体HN0613株保藏号为CCTCC M2012230。
本发明的第一疫苗组合物中HN0613株灭活全菌抗原经一次免疫就能产生免疫保护，且不产生副反应。本发明制备的灭活疫苗在注射中不会引起猪注射部位发炎红肿，且具有较好的稳定性，与疫苗联用可获得较好的免疫效力，可实现大规模生产使用。
在本发明的某些实施例中，第一疫苗组合物可包括一种或多种其它组分，诸如表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的第一疫苗组合物中，所述疫苗组合物进一步包括表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物。
本发明还提供了一种第二疫苗组合物，其中，所述第二疫苗组合物包含所述第一疫苗组合物和免疫量的活病毒疫苗。
本发明的佐剂没有杀病毒活性，可用于猪瘟、猪伪狂犬活疫苗的稀释。本发明的佐剂组合物与灭活抗原或亚单位抗原组合的疫苗复合物可用于稀释活疫苗，参考稀差值均不超过0.7log10(欧洲兽用疫苗标准)。
作为本发明的一种实施方式，本发明的第二疫苗组合物中，所述活病毒疫苗包括猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪瘟活疫苗、伪狂犬病活疫苗。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的第二疫苗组合物中，所述猪繁殖与呼吸综合征活疫苗为JXA1-R株、猪瘟活疫苗为猪瘟病毒兔化弱毒株、所述伪狂犬病活疫苗为Bartha-K61株。
本发明还提供了所述佐剂组合物的制备方法，其中，所述制备方法包括：
a)丙烯酸聚合物在水中溶解制备成丙烯酸聚合物溶液，制备成丙烯酸聚合物水溶液；
b)卵磷脂溶解与乙醇中，制备成卵磷脂乙醇溶液；
c)人参皂苷溶解与水中，制备成人参皂苷水溶液；
d)合并丙烯酸聚合物水溶液、卵磷脂乙醇溶液和人参皂苷水溶液。本发明佐剂没有矿物油和可代谢油，配制方面不需要乳化设备，配制过程简单。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
定义
术语“佐剂”是指当连同抗原投与时，使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。佐剂介导的免疫反应增强可通过所属技术领域中已知的任何方法评估，包括(不限于)以下一种或多种方法：(i)与对单独抗原免疫作用起反应所产生的抗体数相比，对佐剂/抗原组合免疫作用起反应所产生的抗体数增加；(ii)识别抗原或佐剂的T细胞数增加；(iii)一种或多种I型细胞因子的含量增加；和(iv)活激发之后，体内(in vivo)的保护作用。与经单独抗原激发的受试者相比，当受试者经抗原与佐剂激发时，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数(例如抗体效价或T细胞产生增加至少10％，则认为免疫反应增强。在本发明的某些实施例中，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％或至少1000％，则免疫反应增强。
“丙烯酸系聚合物”是指含有丙烯酸系部分的任何聚合物或共聚物。示范性丙烯酸系聚合物包括例如聚丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、丙烯腈和聚丙烯酸的烷基酯。丙烯酸系共聚物的实例包括例如聚丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸-甲基丙烯酸、丙烯酸-丙烯酰胺和聚甲基丙烯酸酯。市售丙烯酸系聚合物的实例包括卡波姆，它是在所属技术领域中通常还指并且已知是与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸的水溶性聚合物。其使用量通常为约0.0001％体积比体积(v/v)至约75％v/v。在其他实施方案中，其使用量为约0.001％v/v至约50％v/v、约0.005％v/v至约25％v/v、约0.01％v/v至约10％v/v、约0.05％v/v至约2％v/v及约0.1％v/v至约0.75％v/v。在另一个实施方案中，其使用量为约0.02％v/v至约0.4％v/v。
术语“卵磷脂”磷脂酰胆碱(卵磷脂)，诸如大豆或卵的卵磷脂。通过水洗粗制植物油，再将得到的水合胶分开并干燥，可取得作为磷脂与三酸甘油酯的混合物的卵磷脂。通过在丙酮清洗移除三酸甘油酯和植物油后，将剩余的不溶于丙酮的磷脂与甘油脂的混合物分馏，可取得精制的产物。或者，可从不同的商品来源取得卵磷脂。卵磷脂使用量通常为与约0.001％v/v至约50％v/v、约0.005％v/v至约25％v/v、约0.01％v/v至约10％v/v、约0.05％v/v至约2％v/v及约0.1％v/v至约0.75％v/v。在另一个实施方案中，其使用量为约0.02％v/v至约0.4％v/v。
术语“人参皂苷”人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物，三萜皂苷。主要存在于人参属药材中，包括人参茎叶皂苷和人参根皂苷。商品化的人参茎叶总皂苷和人参总皂苷其质量标准被中华人民共和国药典收录。人参皂苷使用量通常为，其使用量为约0.03％v/v至约0.2％v/v,约0.01％v/v至约0.05％v/v，约0.05％v/v至约0.1％v/v，约0.03％v/v至约0.2％v/v。
如本文所述，“聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物”其包括但不限于.聚肌苷酸:聚胞苷酸、“PICKCa”聚肌胞钠盐(CAS 42424-50-0)壳寡糖-卡那霉素-聚肌胞钠盐复合物此其中PICKCa用语是一般性地指称由PIC卡那霉素和钙所构成的组合物。(“聚I：C”或“PIC”等用语是指含有聚核糖肌苷和聚核糖胞苷核酸的组合物，亦分别称作为聚肌苷酸-聚胞苷酸)聚肌胞钠盐CAS 42424-50-0壳寡糖-卡那霉素-聚肌胞钠盐复合物。使用量通常为每剂量约1微克至约5000微克。其使用量亦可为每剂量约1微克至约4000微克、每剂量约1微克至约3000微克、每剂量约1微克至约2000微克及每剂量约1微克至约1000微克。其使用量亦可为每剂量约5微克至约750微克、每剂量约5微克至约500微克、每剂量约5微克至约200微克、每剂量约5微克至约100微克、每剂量约15微克至约100微克及每剂量约30微克至约75微克。
术语“疫苗组合物”是可用于在接受者中诱发保护性免疫的组合物。因此，在受试者已接种抗原之后，疫苗可阻止、延缓或减轻暴露给相同或相关抗原的受试者的疾病发展严重程度(相对于未接种疫苗的受试者)。通过疫苗所提供的保护性免疫可以是体液(抗体介导)免疫或细胞免疫，或两者均能产生。
术语“抗原”是指当引入受试者中时，可由宿主的免疫系统识别并且能够诱发免疫反应和产生保护性免疫的药剂。抗原包括(不限于)在病原体的表面或受感染细胞的表面或肿瘤细胞的表面上天然表达的“表面抗原”。抗原可诱发保护性免疫的疾病病原体和/或病状的非限制性实例为猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原、猪细小病毒抗原、多杀巴斯德菌抗原、猪链球菌抗原、猪葡萄球菌抗原、支气管炎博德特菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、肠炎沙门氏菌抗原、猪呼吸道冠状病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪细环病毒抗原、猪巨细胞病毒抗原、脑心肌炎病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪瘟病毒抗原或者其联合。
在某些实施例中，抗原是猪圆环病毒。
在某些实施例中，抗原是猪肺炎支原体。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1制备卡波姆溶液
卡波姆934 1g加入到50ml水中，搅拌使其溶解，再加入1.5g氯化钠溶液，用氢氧化钠溶液调PH至7.0，热压灭菌后备用，含量2％w/v。
实施例2制备卵磷脂乙醇溶液
卵磷脂(PC90，江苏曼氏生物科技股份有限公司生产)5g加入到100ml乙醇中，搅拌使其溶解，0.22微米滤膜过滤后备用，含量5％w/v。
实施例3制备人参皂苷溶液
人参茎叶皂苷(含总皂苷76.7％，吉林省宏久生物科技股份有限公司生产)1g加入到100ml水中，搅拌使其溶解，0.22微米滤膜过滤后备用，含量1％w/v。
实施例4聚肌苷酸:聚胞苷酸水溶液
聚肌苷酸:聚胞苷酸(杭州美亚药业有限公司)1g加入到100ml水中，搅拌使其溶解，0.22微米滤膜过滤后备用，含量1％w/v。
实施例5左旋咪唑水溶液
取盐酸左旋咪唑1.8g加入到80ml水中，搅拌使其溶解，用0.5氢氧化钠溶液调PH至7.0用注射用水定容至100ml，0.22微米滤膜过滤后备用，含量1.8％w/v。
实施例6Quil A溶液
取Quil A 0.6g加入到100ml水中，搅拌使其溶解，0.22微米滤膜过滤后备用，含量0.6％w/v。
实施例7配制佐剂并将佐剂制备成疫苗进行稳定性试验
按照表1的量制备佐剂组合物，制备方法为为卡波姆溶液、卵磷脂乙醇溶液、人参皂苷溶液和聚肌苷酸:聚胞苷酸水溶液、左旋咪唑水溶液Quil A溶液，用PH为7PBS液定容至100ml。卡波姆溶液、卵磷脂乙醇溶液、人参皂苷溶液和聚肌苷酸:聚胞苷酸水溶液的加入顺序没有严格限定。
表1佐剂组合物和对比佐剂组合物的配制
稳定性试验的影响
配制疫苗，进行疫苗稳定性试验。用猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)抗原，加入表1的佐剂，抗原与佐剂的配比为1:1(体积比)，混合后搅拌均匀，置4℃、25℃和37℃条件下观察其性状稳定性，7天内逐天观察、7天到一个月期间，每周观察一次，然后每月观察一次。4℃观察1年，25℃观察6个月，37℃观察3个月。记录稳定性不合格的时间见表2。
表2稳定性试验结果
稳定性试验结果，单用卡波姆配成的佐剂，稳定性试验4℃疫苗会发生明显分层，用卡波姆与卵磷脂佐剂，疫苗不澄清，稳定性试验放置会产生沉淀，卡波姆与左旋咪唑以及卡波姆Quil A组成的佐剂，依然会产生沉淀。但当卡波姆与人参皂苷组成复方后制备的佐剂配制的疫苗疫苗变澄清，加入人参皂苷的量需要一定范围，加入量小(1ml)，用佐剂配制的疫苗依然不澄清，加入量大(30ml)，佐剂配制的疫苗容易产生沉淀。
实施例8、佐剂的圆环病毒在小鼠的免疫增强作用
按照农业部公告第2442号猪圆环病毒疫苗、猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株，II)质量标准项下小鼠免疫法，测定相同抗原采用猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)抗原，佐剂采用表1的佐剂，抗原与佐剂的配比为1:1(体积比)，混合后搅拌均匀以及表1佐剂的对比例1、对比例2、对比例3和试验例2进行试验，
表3佐剂在小鼠上的免疫增强试验
试验结果表明，单用人参皂苷、Quil A、聚肌苷酸:聚胞苷酸、左旋咪唑水溶液、卵磷脂溶液，没有产生佐剂增效作用，小鼠抗体效价没有显著增强，而且人参皂苷+铝胶抗体效价也仅仅是到了1:800，人参皂苷与卡波姆的复方小鼠抗体效价与单用卡波姆的区别不大，但人参皂苷+卡波姆+卵磷脂的组合对小鼠的抗体效价有明显的提高。而人参皂苷+卡波姆+卵磷脂+聚肌苷酸:聚胞苷酸的组合对小鼠的抗体效价有较大的提高。
实施例9本发明的佐剂制备疫苗组合物对猪圆环病毒的防治作用
按照表4制备疫苗，猪圆环抗原选用CN103173470A制备PCV2蛋白病毒样颗粒抗原，最终成品疫苗1ml含有100微克PCV2蛋白按照表4加入佐剂，配制疫苗用PH为7.0PBS液添加到体积，搅拌均匀即可制备成疫苗。挑选21日龄抗体阴性仔猪每组10头注射表4的疫苗，并在免后4周和20周采血，分离血清用biochekELISA检测试剂盒试剂盒进行抗体检测，检测结果见表4。
表4本发明的佐剂制备疫苗组合物对猪圆环疫苗仔猪的抗体检测
判定标准：S/P值≥0.5(滴度1071)判为阳性；S/P≤0.499(滴度1070)，判为阴性
试验结果可以看出，对比疫苗A1～C1三组的佐剂一次免疫均不能维持4个月，而本发明的试验例2～3、6～7佐剂组合物配制的疫苗可以维持20周抗体依然呈阳性，但疫苗C组D组明显抗体效价更高。
实施例10本发明的佐剂制备疫苗组合物对猪支原体肺炎的防治作用
选用猪肺炎支原体HN0613株作为抗原(HN0613株保藏号为CCTCC M2012230，公开于CN104450559A)，按照专利CN104450559A实施例2的方法制备抗原液，最终成品疫苗2ml含有灭活前菌体含量为3×109CCU，按照表5加入佐剂，配制疫苗用PH为7.4PBS液添加到体积，搅拌均匀即可制备成疫苗，选14日龄仔猪45头，共8组，5头/组。免疫组7组，对照组不免疫，第8组不免疫，作为攻毒对照组，具体免疫实施方式见表5。
表5猪支原体肺炎疫苗免疫分组
在免疫后70d，进行猪肺炎支原体进行攻毒试验，免疫组和对照组仔猪用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，)气管注射5mL/头(100MID)，攻毒后观察30天，剖杀试验猪按根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。
表6猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况
疫苗种类 仔猪头数 平均肺病变指数±标准差
疫苗E 5 9.92±1.14
疫苗F 5 9.99±1.31
疫苗G 5 2.67±1.25
疫苗H 5 3.83±1.59
对比疫苗E1 5 9.86±1.45
对比疫苗F1 5 4.43±1.56
对比疫苗G1 5 10.37±1.57
对照组 5 16.20±1.51
试验结果，疫苗E、疫苗F、对比疫苗E1、对比疫苗G1，一针免疫均出现了比较严重的肺病变，而疫苗G和疫苗H组和对比疫苗F1组肺病变积分低，免疫效果较好，但对比疫苗F1组5头猪有1头发生副反应，表现为发热，吃料减少。这说明本发明的试验例6～7佐剂组合物配制的疫苗能对猪肺炎支原体的攻毒进行保护，且免疫后不发生副反应。
实施例11、本发明的佐剂组合物用于疫苗稀释试验
1、制备对比佐剂
对比例I，按照硕士论文“猪支原体肺炎灭活疫苗及活疫苗佐剂研究”董璐佐剂5，含有卡波姆和ISCOM并用猪肺炎支原体HN0613株作为抗原。
对比例II中国专利CN1305524C实施例1制备的佐剂，含有角鲨烷、pluronicL121和卡波姆，猪肺炎支原体HN0613株作为抗原。
2、稀释活疫苗试验
取猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)、猪瘟活疫苗(猪瘟病毒兔化弱毒株)、伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)，用实施例9和实施例10制备的疫苗A～H以及对比疫苗A1、G1同时对上述活疫苗进行稀释，同时用同体积的无菌注射用水对上述活疫苗稀释得参考稀释液(无菌注射用水)，按照使用说明，灭活疫苗部分1头份/瓶(2ml)复原。20±3℃放置3h，依照三种活疫苗各自质量标准的病毒含量测定方法进行测定两种稀释液的种活病毒含量，测定结果见表7。
表7本发明的佐剂配制的疫苗稀释活疫苗试验结果
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本领域规定，通过与参考稀差值均不超过0.7log10(欧洲兽用疫苗标准)，则灭活疫苗或亚单位疫苗稀释活疫苗为合格。因此本发明的疫苗可以用作冻干的活病毒抗原的稀释剂，对比疫苗I、对比疫苗II、对比疫苗G有明显的杀病毒作用，不能当做可以稀释活疫苗的灭活疫苗或亚单位疫苗的佐剂使用，对比疫苗A1仅仅对部分活疫苗可以稀释，不能对三种疫苗均可以稀释。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (15)

1.一种佐剂组合物，其中，所述佐剂组合物含有0.2％-0.5％w/v卡波姆934、0.1％-0.5％w/v卵磷脂、0.03％-0.2％w/v人参茎叶皂苷。
2.根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中，所述佐剂组合物含有0.2％-0.5％w/v卡波姆934、0.1％-0.4％w/v卵磷脂、0.03％-0.2％w/v人参茎叶皂苷。
3.根据权利要求2所述的佐剂组合物，其中，所述佐剂组合物含有0.2％-0.5％w/v卡波姆934、0.1％-0.2％w/v卵磷脂、0.03％-0.2％w/v人参茎叶皂苷。
4.根据权利要求3所述的佐剂组合物，其中，所述佐剂组合物含有0.4％w/v卡波姆934、0.1％w/v卵磷脂、0.05％w/v人参茎叶皂苷。
5.根据权利要求1至4任一项所述的佐剂组合物，其中，所述佐剂组合物还含有0.05％-0.2％w/v聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
6.一种第一疫苗组合物，其中，所述第一疫苗组合物含有30％-70％w/w权利要求1至5任一项所述的佐剂组合物和免疫量的灭活抗原或亚单位抗原。
7.根据权利要求6所述的第一疫苗组合物，其中，所述第一疫苗组合物中佐剂组合物含量为50％w/w。
8.根据权利要求6所述的第一疫苗组合物，其中，所述灭活抗原为猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、猪伪狂犬病毒抗原。
9.根据权利要求8所述的第一疫苗组合物，其中，所述灭活抗原为猪圆环病毒2型SH株灭活全病毒抗原，所述猪圆环病毒2型SH株保藏号为CGMCC No.2389。
10.根据权利要求6所述的第一疫苗组合物，其中，所述第一疫苗组合物含有0.2％w/v卡波姆934、0.05％w/v卵磷脂、0.015％-0.05％w/v人参茎叶皂苷和100ug/ml PCV2蛋白病毒样颗粒抗原。
11.根据权利要求6所述的第一疫苗组合物，其中，所述第一疫苗组合物含有0.2％w/v卡波姆934、0.05％w/v卵磷脂、0.025％w/v人参茎叶皂苷、0.025％-0.1％w/v聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物和100ug/ml PCV2蛋白病毒样颗粒抗原。
12.根据权利要求6所述的第一疫苗组合物，其中，所述第一疫苗组合物含有0.2％w/v卡波姆934、0.05％w/v卵磷脂、0.025％％w/v人参茎叶皂苷、0.025％-0.1％w/v聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物和灭活前菌体含量为1.5×109CCU的猪肺炎支原体HN0613株灭活全菌抗原,所述猪肺炎支原体HN0613株保藏号为CCTCC M2012230。
13.一种第二疫苗组合物，其中，所述第二疫苗组合物包含权利要求4～7任一项的第一疫苗组合物和免疫量的活病毒疫苗。
14.根据权利要求13所述的第二疫苗组合物，其中，所述活病毒疫苗包括猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪瘟活疫苗、伪狂犬病活疫苗。
15.根据权利要求14所述的第二疫苗组合物，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征活疫苗为JXA1-R株、猪瘟活疫苗为猪瘟病毒兔化弱毒株、所述伪狂犬病活疫苗为Bartha-K61株。
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