CN110755607B - 氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗、其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗、其制备方法与应用，其中氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗以两亲性聚合物为载体，包载氧化锌纳米粒子和抗原。该疫苗由两亲性聚合物、抗原和氧化锌纳米粒子组成纳米给药系统。其中两亲性聚合物的特性有利于该体系的药物负载，在免疫细胞中发生内涵体逃逸，提高药物的有效释放量；氧化锌纳米粒子作为免疫佐剂诱导有效的共刺激分子信号表达和促炎性细胞因子响应，显著增强抗原的免疫效果。本发明利用氧化锌免疫佐剂和抗原的联合治疗策略有效促进树突状细胞成熟，可被开发应用于制备多种人类重大疾病的预防免疫和治疗药物中。

Description

氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗、其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，尤其涉及一种氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗、其制备方法与应用。

背景技术

癌症是引起人类死亡的几大原因之一，发病率居高不下，全世界每年有800万人死于癌症，使其成为医疗领域的重大挑战。肿瘤细胞免疫原性弱，易分泌免疫抑制因子，抑制毒性T细胞的分化，使肿瘤细胞在机体内不断生长。现行的肿瘤治疗策略主要通过化疗药物或放疗进行控制，但传统的放化疗方式会产生不可避免的副反应，对机体造成影响。免疫治疗是通过激发患者自身的免疫力进行治疗，具有反应快，副作用小的特点。现有的免疫治疗方式是选择一种抗原或肽段注入机体，以便被机体视为免疫系统的外来入侵者，这种抗原或多肽被抗原提呈细胞摄取，通过其表面的HLAI类或HLAII类分子呈递激活T细胞，达到杀伤肿瘤细胞的作用。

目前，疫苗是被世界卫生组织(WTO)认证的控制传染性疾病(如艾滋病等)或某些慢性疾病(如肿瘤等)的有效手段之一，其通过调控机体自身的免疫系统来达到治疗疾病的效果，主要表现是选择性地激活免疫系统中的T细胞和B细胞，并使其大量增殖，对机体中的病原体产生特异性反应，清除有毒物质。

随后的研究表明，佐剂是疫苗密不可分的一部分，佐剂的加入能够减少疫苗中抗原的用量，增强效应T细胞的反应和抗体滴度，更快地激发免疫保护。铝佐剂包括氢氧化铝或磷酸铝等一系列铝的水溶性盐，可以吸附蛋白、肽段或者病毒，主要诱导Th2型反应发生，对细胞免疫的效果不佳，其发挥作用主要依赖于“抗原储库效应”，只通过在注射部位发生局部效应来招募抗原提呈细胞。Jules T.Freund制备的弗氏完全佐剂，将分枝杆菌去掉后得到弗氏不完全佐剂，这种佐剂副作用较大，被禁止应用到人用疫苗中。其他还有脂质体或免疫刺激复合物，这些免疫佐剂或多或少存在缺陷，目前均处在待优化的阶段。

氧化锌纳米粒子由于其半导体的特性、良好的生物安全性、能与蛋白质等分子以氢键或其他方式螯合，以及反射、散射和吸收紫外线的能力，使其在生物、化学传感方面的应用较为广泛。纳米结构的氧化锌材料被认为是下一代生物应用方面的有效物质，包括在肿瘤治疗、药物释放、抗菌剂以及生物成像探针中的应用。研究表明，氧化锌纳米粒子具有诱导促炎性细胞因子表达，刺激活化记忆性淋巴细胞和辅助型T细胞的功能，可作为一种良好的免疫佐剂材料。

然而，氧化锌纳米粒子和抗原的联合作用存在以下几种困难：(1)如何保证抗原药物和氧化锌纳米粒子在体内中不降解；(2)两种药物难以同时输送到抗原提呈细胞并实现有效释放，导致免疫应答弱或无免疫应答响应。因此，设计一种简单有效的共输递药物体系，使其能够包载氧化锌纳米粒子和抗原药物进入抗原提呈细胞、提高药物在免疫细胞的富集和有效释放，显著增强机体的免疫响应是联合免疫治疗的关键问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗、其制备方法与应用，以期至少部分地解决上述提及的技术问题中的至少之一。

作为本发明的一个方面，提供了一种氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗，其以两亲性聚合物为载体，包载氧化锌纳米粒子和抗原。

作为本发明的另一个方面，还提供了一种如上述的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

将两亲性聚合物、抗原和氧化锌纳米粒子分别溶解或分散于有机溶剂中，充分混合，将所述氧化锌纳米粒子和抗原分别吸附于所述两亲性聚合物上，得到前驱体；

将所述前驱体中含有的所述有机溶剂去除，得到氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗。

作为本发明的再一个方面，还提供了一种如上述的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗在制备肿瘤免疫治疗和/或预防的药物中的用途。

基于上述技术方案，本发明相比于现有技术，具有如下有益效果的其中之一或其中一部分：

本发明将纳米疫苗粒子携载氧化锌纳米粒子和抗原后，可以增加抗原提呈细胞对两种药物的摄取，同时以氧化锌纳米粒子作为佐剂，有效诱导促炎性细胞因子表达，刺激活化记忆性淋巴细胞和辅助型T细胞的功能，辅助抗原药物的免疫应答，有效提高免疫响应；

本发明以两亲性聚合物作为载体，实现对疏水性的氧化锌纳米粒子免疫佐剂和抗原药物的包裹，将两者包裹在两亲性聚合物的核心，避免了在血液循环中的降解问题，所形成的纳米疫苗在机体内稳定存在，延长在机体内循环的半衰期，降低毒副作用；

本发明采用的氧化锌纳米粒子、抗原和两亲性聚合物组成可降解的共载药物纳米疫苗，平均粒径在100nm～200nm之间，尺寸均一，可重复性好，为纳米疫苗体内外实验的可重复性提供保障；

并且，本发明将纳米疫苗的粒径设计处于纳米级，免疫途径中增加抗原提呈细胞对药物的摄取量；而粒径在100nm～200nm之间，小于200nm，有利于纳米疫苗向引流淋巴结迁移，实现药物在免疫细胞的富集；

本发明制备工艺简单，所用的材料生物安全性高，易于操作，无毒性，无免疫原性，还可被开发应用于肿瘤等人类重大疾病的预防和治疗。

附图说明

图1是本发明实施例1氧化锌纳米粒子的透射电镜图；

图2是本发明实施例1氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的透射电镜图；

图3是本发明实施例1-3氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的粒径图；

图4是本发明实施例1氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗与对比例1-2样品、抗原的体外细胞活性对比图；

图5是本发明实施例1氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗与对比例1-2样品、抗原的共刺激分子CD40表达水平对比图；

图6是本发明实施例1氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗与对比例1-2样品、抗原的共刺激分子CD86表达水平对比图；

图7是本发明实施例1氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗与对比例1-2样品、抗原的细胞因子分泌水平对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

作为本发明的一个方面，提供了一种氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗，其以两亲性聚合物为载体，包载氧化锌纳米粒子和抗原。

其中，本发明将疫苗携载氧化锌纳米粒子和抗原后，可以增加抗原提呈细胞对两种药物的摄取，同时以氧化锌纳米粒子作为佐剂，有效诱导促炎性细胞因子表达，刺激活化记忆性淋巴细胞和辅助型T细胞的功能，辅助抗原药物的免疫应答，有效提高免疫响应；

更为重要的，本发明以两亲性聚合物作为载体，是因为两亲性聚合物具有的亲水片段和疏水片段在自组装的过程中，可实现对疏水性的氧化锌纳米粒子免疫佐剂和抗原药物的包裹，将两种药物包裹在两亲性聚合物的核心，以避免在血液循环中的降解问题，所形成的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗在机体内稳定存在，延长在机体内循环的半衰期，降低毒副作用。

在本发明的实施例中，氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的体系浓度为1mM～50mM，优选为5mM～25mM，进一步优选为15mM～20mM。

在本发明的实施例中，氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的工作液为1×PBS，但并不局限于此，还可为超纯水、去离子水或生理盐水。

在本发明的实施例中，氧化锌纳米粒子和抗原的包载量比例为1∶1～1∶10；

作为优选，氧化锌纳米粒子和抗原的包载量比例为1∶1～1∶3；

作为优选，氧化锌纳米粒子和抗原的包载量比例为1∶2。

其中，两亲性聚合物与所述纳米氧化锌粒子的质量比例为1∶1～100∶1。

在本发明的实施例中，氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的平均粒径为100nm～200nm，分散系数小于0.3。

其中，本发明采用的氧化锌纳米粒子、抗原和两亲性聚合物组成可降解的纳米疫苗，平均粒径在100nm～200nm之间，尺寸均一，可重复性好，为纳米疫苗体内外实验的可重复性提供保障；

并且，本发明的疫苗的粒径处于纳米级，实现在免疫途径中增加抗原提呈细胞对药物的摄取量，而且粒径在100nm～200nm之间，小于200nm有利于纳米疫苗向引流淋巴结迁移，实现药物在免疫细胞的富集。

在本发明的实施例中，抗原包括蛋白抗原和多肽抗原；

在本发明的实施例中，两亲性聚合物为疏水片段和多个不同亲水片段共聚得到；

亲水片段包括聚羧基甜菜碱、聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯、聚乙二醇、聚谷氨酸、聚乙烯亚胺中的多种；疏水片段包括聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯中的一种或多种；

作为优选，亲水片段包括聚羧基甜菜碱和聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯；疏水片段包括聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺；

作为优选，两亲性聚合物的聚合度为1～100之间的任意整数；

作为优选，两亲性聚合物的聚合度为10～30之间的任意整数。

值得一提的是，两亲性聚合物采用疏水片段和多个不同的亲水片段聚合得到，即两亲性聚合物的嵌段大于等于三嵌段，其中包括至少两亲水嵌段；这样设计的原因是，在本发明实施例中的两亲性聚合物要利用亲水嵌段同时起到两个作用，其一是作为核外层保护整个纳米疫苗，其二是平衡氧化锌纳米粒子所带来的电荷。这两个作用需要两个不同的亲水嵌段实现，一旦缺少最外层的亲水嵌段，体系毒性会增加，整体作用效果也会下降。

作为本发明的另一个方面，还提供了一种如上述的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的制备方法，制备方法包括如下步骤：

将两亲性聚合物、抗原和氧化锌纳米粒子分别溶解或分散于有机溶剂中，充分混合，将氧化锌纳米粒子和抗原分别吸附于两亲性聚合物上，得到前驱体；

将前驱体中含有的有机溶剂去除，得到氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗。

在本发明的优选实施例中，氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的制备方法具体包括如下步骤：

步骤1：将两亲性聚合物、抗原和氧化锌纳米粒子分别溶解或分散于有机溶剂中，分别得到含有两亲性聚合物溶液、含有氧化锌纳米粒子溶液和含有抗原溶液；

步骤2：将含有两亲性聚合物溶液与含有氧化锌纳米粒子溶液，充分混合，将氧化锌纳米粒子吸附于两亲性聚合物上，得到氧化锌纳米粒子和两亲性聚合物体系；

步骤3：将含有抗原溶液加入到氧化锌纳米粒子和两亲性聚合物体系中，充分混合，将抗原吸附到吸附有氧化锌纳米粒子的两亲性聚合物上，得到前驱体；

步骤4：将前驱体中含有的有机溶剂去除，得到氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗。

更为具体地，步骤2中，充分混合为采用磁力搅拌，进行0.5h～1h；步骤3中，充分混合为室温下磁力搅拌，进行6h。

在本发明的实施例中，有机溶剂包括N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或甲醇中的一种或多种；

作为优选，有机溶剂为二甲基亚砜；

作为优选，两亲性聚合物以1mg/mL～50mg/mL溶解在有机溶剂中；

作为优选，两亲性聚合物以10mg/mL～20mg/mL溶解在有机溶剂中。

在本发明的实施例中，氧化锌纳米粒子和抗原分别吸附于两亲性聚合物的作为内核的疏水片段上。

在本发明的实施例中，采用透析、蒸发或超滤的方法去除有机溶剂；

作为优选，采用透析的方法去除有机溶剂，透析时间为1小时～10小时；

作为优选，采用透析的方法去除有机溶剂，透析时间为2小时～4小时。

在本发明的实施例中，氧化锌纳米粒子为球形，粒径为3nm～5nm；更为具体地，氧化锌纳米粒子多分散指数(PDI)小于0.2，Zeta电位平均值-8mV；

在本发明的实施例中，氧化锌纳米粒子通过以下步骤制备：

将氢氧化钠和醋酸锌分别溶解于热乙醇中，冷却后混合进行沉淀反应，得到氧化锌纳米粒子。

更为具体地，氧化锌纳米粒子通过以下步骤制备：

分别称取适量的氢氧化钠、醋酸锌置于两个圆底烧瓶中，两个烧瓶分别加入适量的乙醇，加热搅拌使氢氧化钠和醋酸锌分别溶解；

将两种溶液置于冰浴中冷却，然后将氢氧化钠溶液加入到含有醋酸锌溶液的圆底烧瓶中，磁力搅拌反应，氧化锌纳米粒子生长；

其中，氢氧化钠和醋酸锌的摩尔比为1∶1～1∶10，优选为4∶5；

其中，溶解温度为40℃～90℃，优选为70℃～75℃；

其中，溶解时间为1h～4h，优选为2h～2.5h；

其中，反应时间为0.5h～4h，优选为1h～2h。

作为本发明的再一个方面，还提供了一种如上述的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗在制备肿瘤免疫治疗和/或预防的药物中的用途。

下面通过实例做进一步说明氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的制备方法，但不局限于下述实施例，任何依据本发明的技术方案所做的等效变换，均属于本发明所保护的范围。

下述实施例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验药品和材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂厂商购买得到的；本发明的下述实施例中所用的抗原为市售商品PEPvIII抗原，但并不局限于该抗原，还可以为市售商品Tau多肽抗原。另外，其他类型的抗原同样适用于本发明。

以下实施例中的定量试验，均进行三次重复试验，所得结果取平均值。

实施例1

球形氧化锌纳米粒子的制备包括如下步骤：

称取醋酸锌203.0mg，氢氧化钠52.0mg于50mL圆底烧瓶中，加入适量乙醇，此时固体为完全溶解，加热温度至70℃～75℃，磁力搅拌2h反应，此时醋酸锌和氢氧化钠溶解在热乙醇中。

溶解后的两种溶液置于冰浴上冷却，冷却后将氢氧化钠溶液加入到含醋酸锌溶液的圆底烧瓶中，磁力搅拌1h使氧化锌纳米粒子生长。反应完成用正己烷沉淀得到白色固体，去上清，置于真空干燥箱中干燥，得到球形氧化锌纳米粒子，在紫外光的激发下，氧化锌纳米粒子可呈绿色光芒。

在本发明的实施例中，氢氧化钠和醋酸锌的反应摩尔比为4∶5。

表征：本实施例采用透射电镜法(TEM)检测氧化锌纳米粒子的粒径，采用动态光散射法(DLS)测定氧化锌纳米粒子的粒度分布。图1为氧化锌纳米粒子的透射电镜图。

如图1所示，氧化锌纳米粒子呈球形，尺寸均一，粒径大致在3nm～5nm左右。

两亲性聚合物采用聚羧基甜菜碱-聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯-聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺，该聚羧基甜菜碱-聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯-聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺的共聚物的亲水片段为聚羧基甜菜碱-聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯，疏水片段为聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺，该聚合物的重复单元的排列方式为嵌段，形成三嵌段两亲性聚合物。

其中聚羧基甜菜碱：聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯：聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺的摩尔比为1∶1∶2。

氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗(PSDP-ZnO/Ag，POAg)的制备包括如下步骤：

(1)称取10mg的两亲性聚合物溶解于1mL的二甲基亚砜中，称取10mg的抗原溶解于1mL的二甲基亚砜中，称取2mg的氧化锌纳米粒子溶解于1mL的二甲基亚砜中备用；

(2)将两亲性聚合物与氧化锌纳米粒子按质量比10∶1先进行混合，磁力搅拌0.5h～1h，再将PEPvIII抗原按照与氧化锌纳米粒子质量比为2∶1的比例加入到体系中，室温下磁力搅拌6小时；

(3)将步骤(2)的溶液经充分混合后，将溶液转入透析袋(分子量3500)，置于500mL的去离子水中透析去除二甲基亚砜，透析4h，制得粒径为120nm左右的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗(PSDP₁₀-ZnO/Ag，POAg)。

表征：本实施例采用透射电镜法(TEM)检测氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的粒径，采用动态光散射法(DLS)测定氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的粒度分布。图2为本实施例1的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的透射电镜图，图3为本实施例1的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的粒径分布图。

如图2所示，氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗呈球形，尺寸均一，粒径大致在100nm～120nm左右；如图3所示，说明氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的粒径为120nm，进一步证实透射电镜表征结果。

实施例2

氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的制备步骤：

(1)两亲性聚合物和抗原溶液的配置如实施例1所述，称取2mg实施例1制备的氧化锌纳米粒子溶解于1mL的二甲基亚砜中备用；

(2)将两亲性聚合物与氧化锌纳米粒子按质量比20：1先进行混合，磁力搅拌0.5h～1h，再将PEPvIII抗原按照与氧化锌纳米粒子质量比为2：1的比例加入到体系中，室温下磁力搅拌6小时；

(3)将步骤(2)的溶液经充分混合后，将溶液转入透析袋(分子量3500)，置于500mL的去离子水中透析去除二甲基亚砜，透析4h，制得粒径为132nm左右的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗(PSDP₂₀-ZnO/Ag)。

实施例3

氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的制备步骤：

(1)两亲性聚合物和抗原溶液的配置如实施例1所述，称取2mg实施例1制备的的氧化锌纳米粒子溶解于1mL的二甲基亚砜中备用；

(2)将两亲性聚合物与氧化锌纳米粒子按30∶1先进行混合，磁力搅拌0.5h～1h，再将PEPvIII抗原按照与氧化锌纳米粒子质量比为2∶1的比例加入到体系中，室温下磁力搅拌6小时；

(3)将步骤(2)的溶液经充分混合后，将溶液转入透析袋(分子量3500)，置于500mL的去离子水中透析去除二甲基亚砜，透析4h，制得粒径为158nm左右的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗(PSDP₃₀-ZnO/Ag)。

对比例1

抗原纳米疫苗(PAg)的制备包括如下步骤：

称取10mg的两亲性聚合物(两亲性聚合物选用聚羧基甜菜碱-聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯-聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺，该聚羧基甜菜碱-聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯-聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺的共聚物的亲水片段为聚羧基甜菜碱-聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯，疏水片段为聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺，该聚合物的重复单元的排列方式为嵌段，其中聚羧基甜菜碱：聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯：聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺的摩尔比为1∶1∶2)溶解于1mL的二甲基亚砜中；称取10mg的抗原溶解于1mL的二甲基亚砜中备用；

将PEPvIII抗原按照与两亲性聚合物质量比为1∶5进行混合，室温下磁力搅拌6h，然后将溶液转入透析袋(分子量3500)，置于500mL的去离子水中透析去除二甲基亚砜，透析4h后得到抗原纳米粒子PAg。

对比例2

对照聚合物纳米疫苗(PDOAg)的制备包括如下步骤：

称取10mg的两嵌段两亲性聚合物(两嵌段两亲性聚合物选用聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯-聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺，该聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯-聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺的共聚物的亲水片段为聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯，疏水片段为聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺，该聚合物的重复单元的排列方式为嵌段，其中聚-2-(二甲氨基)乙基丙烯酸乙酯：聚-N-2-(2-吡啶基二硫)乙基甲基丙烯酸酰胺的摩尔比为1∶2)溶解于1mL的二甲基亚砜中；

(1)两嵌段两亲性聚合物和抗原溶液的配置如本对比例所述，称取2mg实施例1制备的氧化锌纳米粒子溶解于1mL的二甲基亚砜中备用；

(2)将两嵌段两亲性聚合物与氧化锌纳米粒子按质量比10∶1先进行混合，磁力搅拌0.5h～1h，将PEPvlII抗原按照与两亲性聚合物质量比为1∶5进行混合，室温下磁力搅拌6小时；然后将溶液转入透析袋(分子量3500)，置于500mL的去离子水中透析去除二甲基亚砜，透析4h后得到对比例2聚合物纳米疫苗(PDOAg)。

性能测试：

(1)细胞活性检测步骤如下所示：

提取骨髓来源的树突状细胞用于氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的毒性监测。选用C57BL/6小鼠(雌性，4-6周)提取骨髓来源的树突状细胞。

将培养6天的原代树突状细胞按照1×10⁵的细胞密度接种于96孔培养板中，5％CO₂，37℃条件下，孵育培养24h。抗原药物负载率通过BCA蛋白定量检测法确定药物的负载率及加药量，然后将实施例1所采用的抗原(Ag)、对比例1的抗原纳米疫苗(PAg)和实施例1的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的样品(POAg)、对比例2的聚合物纳米疫苗(PDOAg)与全培养基PBS(10％胎牛血清，1％双抗，和1％非必要氨基酸)混合定容至100μL分别加入到96孔培养板中(每个样品设置3个复孔)；放入培养箱中继续培养24h或48h后，倒掉上清液体，每孔加入20μL CCK-8染色液，在37℃，5％CO₂条件的培养箱中再培养2h。利用酶联免疫检测仪OD 450nm波长测量各孔的吸光值。同时以自然生长的细胞组为对照组，考察氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗对免疫细胞的毒性。

结果：本实施例采用CCK-8活性细胞检测法检测氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的细胞毒性，如图4所示，本发明制备的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的细胞活性与PBS全培养基相比，细胞存活率相当，细胞存活率均大于90％，表明疫苗具有良好的生物相容性。

(2)氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗体外刺激骨髓来源树突状细胞成熟实验的步骤如下所示：

提取骨髓来源的树突状细胞，将细胞按照5×10⁴个细胞/孔的密度接种于24孔培养板，待其生长回合度大85％以上时，将实施例1所采用的抗原(Ag)、对比例1的抗原纳米疫苗(PAg)和实施例1的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的样品(POAg)、对比例2的聚合物纳米疫苗(PDOAg)与全培养基(1640培养基)混合定容至500μL加入到各孔中，在37℃，5％CO₂条件的培养箱中培养48h。之后取走上清，收集细胞，用PBS清洗后进行荧光标记：标记CD11c荧光抗体，在4℃放置30min，用流式液清洗后再标记共刺激分子CD40、CD86荧光抗体，染色30min后，1500rpm离心3min，弃上清，加入流式细胞液重悬细胞。

结果：本实施例采用流式细胞仪检测氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗刺激树突状细胞成熟的结果如图5、6所示，本发明所制备的两亲性共聚物包载的氧化锌纳米粒子和抗原能更好的刺激树突状细胞成熟，上调共刺激分子表达，具有很好地抗原提呈能力。

(3)氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗刺激促炎性细胞因子分泌实验。

提取骨髓来源的树突状细胞，将细胞按照5×10⁴个细胞/孔的密度接种于24孔培养板，待其生长回合度大85％以上时，将实施例1所采用的抗原(Ag)、对比例1的抗原纳米疫苗(PAg)和实施例1的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的样品(POAg)、对比例2的聚合物纳米疫苗(PDOAg)与全培养基混合定容至500μL加入到各孔中，在37℃，5％CO₂条件的培养箱中培养48h。收集上清液，ELISA(酶联免疫吸附实验)检测细胞因子IFN-γ的表达水平。

结果：采用ELISA检测氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗对促炎细胞因子分泌的影响，结果如图7所示，本发明制备的纳米疫苗能上调促炎性细胞因子IFN-γ的表达，其中只有抗原药物的Ag组能分泌少量的阳性细胞因子，两亲性聚合物包载之后，细胞因子分泌水平有所上调，加入氧化锌纳米粒子作为免疫佐剂后，免疫细胞分泌的炎性细胞因子水平有大幅提升，证实氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗具有良好的免疫效果，有效诱导免疫应答的发生，且证实了氧化锌纳米粒子是一种有效的免疫佐剂。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗，其特征在于，其以两亲性聚合物为载体，包载氧化锌纳米粒子和抗原;

其中，所述两亲性聚合物包括至少两个不同的亲水嵌段；所述两亲性聚合物为疏水片段和多个不同亲水片段共聚得到；

所述氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的平均粒径为100nm ~200nm，分散系数小于0.3。

2.根据权利要求1所述的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗，其特征在于，所述氧化锌纳米粒子和抗原的包载量比例为1：1~1：10；

其中，所述两亲性聚合物与所述氧化锌纳米粒子的质量比例为1：1~100：1。

3.根据权利要求2所述的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗，其特征在于，所述氧化锌纳米粒子和抗原的包载量比例为1：1~1：3。

4.根据权利要求3所述的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗，其特征在于，所述氧化锌纳米粒子和抗原的包载量比例为1：2。

5.根据权利要求1所述的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗，其特征在于，所述抗原包括蛋白抗原和多肽抗原；

所述亲水片段包括聚羧基甜菜碱、聚-2-（二甲氨基）乙基丙烯酸乙酯、聚乙二醇、聚谷氨酸、聚乙烯亚胺中的多种；所述疏水片段包括聚-N-2-（2-吡啶基二硫）乙基甲基丙烯酸酰胺、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯中的一种或多种；

所述两亲性聚合物的聚合度为1~100之间的任意整数。

6.根据权利要求5所述的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗，其特征在于，所述亲水片段包括聚羧基甜菜碱和聚-2-（二甲氨基）乙基丙烯酸乙酯；所述疏水片段包括聚-N-2-（2-吡啶基二硫）乙基甲基丙烯酸酰胺；

所述两亲性聚合物的聚合度为10~30之间的任意整数。

7.一种如权利要求1至6任一项所述的氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

将两亲性聚合物、抗原和氧化锌纳米粒子分别溶解或分散于有机溶剂中，充分混合，将所述氧化锌纳米粒子和抗原分别吸附于所述两亲性聚合物上，得到前驱体；

将所述前驱体中含有的所述有机溶剂去除，得到氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗；

所述氧化锌、抗原共载药物纳米疫苗的平均粒径为100nm ~200nm，分散系数小于0.3。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在制备前驱体步骤中，所述有机溶剂包括N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或甲醇中的一种或多种；

所述两亲性聚合物以1mg/mL~50mg/mL溶解在所述有机溶剂中。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在制备前驱体步骤中，所述有机溶剂为二甲基亚砜；

所述两亲性聚合物以10mg/mL~20mg/mL溶解在所述有机溶剂中。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在去除有机溶剂步骤中，所述氧化锌纳米粒子和所述抗原分别吸附于所述两亲性聚合物的作为内核的疏水片段上。

11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在去除有机溶剂步骤中，采用透析、蒸发或超滤的方法去除有机溶剂；

采用透析的方法去除有机溶剂，透析时间为1小时~10小时。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述采用透析的方法去除有机溶剂，透析时间为2小时~4小时。

13.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述氧化锌纳米粒子为球形，粒径为3nm ~5nm；所述氧化锌纳米粒子通过以下步骤制备：

将氢氧化钠和醋酸锌分别溶解于热乙醇中，冷却后混合进行沉淀反应，得到氧化锌纳米粒子。

Images