CN117100848A - Plga全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Plga全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗及其制备方法和应用，是以PLGA纳米颗粒为载体，包裹结直肠癌肿瘤细胞裂解物的纳米疫苗。其中，PLGA纳米颗粒为聚乳酸‑羟基乙酸共聚物，结直肠癌肿瘤细胞裂解物由CT‑26结肠癌细胞或HCT116结肠癌细胞经多次冻融、超声破碎得到。该纳米疫苗通过促进树突状细胞成熟，激活广泛、强烈的CD8+T和CD4+T细胞反应，下调免疫负调控分子PD‑1、TIGIT的表达，增加M1型巨噬细胞数量、降低Tregs细胞数量，从而发挥抗结直肠癌作用，且建立了抗结直肠癌个性化疫苗及其制备方法的体系，有利于实现结直肠癌的个性化治疗。

Description

PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本申请属于生物医药及肿瘤治疗技术领域，特别涉及一种PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)，结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，已成为严重威胁人类生命安全的重大疾病之一，在我国，结直肠癌的发病情况也呈现出逐年上升的趋势。传统的治疗方法，包括手术和放化疗等，对早中期结直肠癌的治疗举足轻重。但是，晚期结直肠癌病人的治疗手段(包括各种靶向治疗的药物)则非常有限，这也导致结直肠癌病人整体的5年生存率仍不理想。因此，尽管外科手术、放化疗及生物治疗在CRC的防治中取得了长足的进展，但CRC的预防和治疗依然面临着巨大的挑战，寻找更多的靶点和更有效的药物对于提高结直肠癌的整体疗效至关重要。
治疗性肿瘤疫苗作为肿瘤治疗的一种可行方案，已成为癌症治疗领域的一个研究重点，治疗性肿瘤疫苗旨在诱导患者的免疫系统产生持续的抗肿瘤免疫反应，以达到治疗和预防肿瘤复发或转移的效果。
常规治疗性肿瘤疫苗通过将单一肿瘤相关抗原或抗原肽导入患者体内，激活患者自身免疫系统，产生特异性的抗肿瘤免疫应答，诱导或扩增体内预存的针对靶抗原的细胞免疫和体液免疫反应，并能形成长期的免疫记忆反应，从而达到控制或清除肿瘤的目的。但广泛存在的肿瘤异质性是目前最大的困难之一，不仅仅在肿瘤组织内部，即使是同一种肿瘤类型，在不同患者间也存在着极大的差异，肿瘤疫苗的临床治疗效果存在显著差异性，并且由于肿瘤的免疫逃逸，肿瘤免疫治疗往往受到限制。同时，肿瘤疫苗设计最关键的一环就是抗原的选择，抗原需要从肿瘤细胞中的相关蛋白及或肽中获取最佳抗原候选物，在确定目标抗原方面存在困难，即很难找到合适的肿瘤抗原来识别肿瘤，且过程漫长，容易贻误患者术后的最佳治疗时机。
发明内容
基于此，有必要针对现有的技术中，肿瘤疫苗的临床治疗效果存在显著差异性、肿瘤的免疫逃逸以及在确定目标抗原方面存在困难的问题，有必要提供一种PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗及其制备方法和应用，通过促进树突状细胞成熟，激活广泛、强烈的CD8+T和CD4+T细胞反应，下调免疫负调控分子PD-1、TIGIT的表达，增加M1型巨噬细胞数量、降低Tregs细胞数量，从而发挥抗结直肠癌作用，且建立了抗结直肠癌个性化疫苗及其制备方法的体系，有利于实现结直肠癌的个性化治疗。
本申请解决上述技术问题的技术方案如下：
PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗，是以PLGA纳米颗粒为载体，包裹结直肠癌肿瘤细胞裂解物的纳米疫苗。
优选地，上述PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗中，所述PLGA纳米颗粒为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，化学结构如下：
线性分子式为[C3H4O2]x[C2H2O2]y。
优选地，上述PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗中，所述结直肠癌肿瘤细胞裂解物由结直肠癌细胞经多次冻融、超声破碎得到。
优选地，上述PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗中，所述结直肠癌细胞选自CT-26结肠癌细胞、HCT116结肠癌细胞或MC38结肠癌细胞。
优选地，上述PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗中，所述结直肠癌肿瘤细胞裂解物的包封率为78.22±6.34％。
如上任一项所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法，所述制备方法包括：
S10.将结直肠癌细胞置于液氮、37℃反复冻融4次，随后置于冰上超声破碎，离心收集上清液得到结直肠癌肿瘤细胞裂解物；
S20.将PLGA纳米颗粒溶解于有机溶剂中，加入结直肠癌肿瘤细胞裂解物，超声得到初乳，将初乳加入4％的乳化剂中，超声得到复乳，将复乳加入0.1％的乳化剂中以固化纳米疫苗，磁力搅拌2h至4h，离心收获沉淀则为PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗。
优选地，上述PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法中，所述有机溶剂为二氯甲烷，所述乳化剂为聚乙烯醇PVA。
如上任一项所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗和/或如上任一项所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法在制备结直肠癌防治药物中的应用。
优选地，上述应用中，所制备的药物通过促进树突状细胞成熟，激活CD8+T和CD4+T细胞反应，下调免疫负调控分子PD-1、TIGIT，发挥抗结直肠癌作用，实现防治结直肠癌。
结直肠癌防治药物，通过如上任一项所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法所制备的药物，或，包括如上任一项所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗。
本申请采用的技术方案能够达到以下有益效果：
本申请公开的一种PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗及其制备方法和应用中，采用PLGA纳米颗粒作为疫苗载体负载抗原，一方面可保护抗原不被降解，另一方面其本身还能作为免疫佐剂刺激免疫反应的发生，从而使得负载抗原和佐剂的PLGA纳米颗粒可更好地刺激抗原提呈细胞，以增强免疫应答效果。并且PLGA纳米颗粒负载的抗原为结直肠癌肿瘤细胞裂解物，使得所制备的纳米疫苗为全肿瘤细胞裂解物疫苗，因其包含患者自体突变肿瘤抗原的全部序列，所以可激活多克隆肿瘤特异性CD8+T和CD4+T细胞，从而减少结直肠癌从免疫系统中逃逸的机会，避免结直肠癌免疫治疗受到限制，该纳米疫苗为针对患者自体的个性化疫苗，不存在肿瘤异质性，纳米疫苗中的抗原均来自患者自体，能够与患者自体的结直肠癌相适配识别，不存在不同患者间交叉使用的情况，从而避免临床治疗效果存在显著差异性。由于全肿瘤细胞裂解物的疫苗包括所有潜在的抗原，无需从肿瘤细胞中的相关蛋白及或肽中获取最佳抗原候选物，无需找到合适的肿瘤抗原来识别肿瘤，避免在确定目标抗原方面存在困难而导致过程漫长，从而简化了个性化疫苗的制备过程，避免因疫苗的制备过程漫长而导致贻误患者术后的最佳治疗时机。
同时，PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗通过促进树突状细胞成熟，激活广泛、强烈的CD8+T和CD4+T细胞反应，下调免疫负调控分子PD-1、TIGIT的表达，增加M1型巨噬细胞数量、降低Tregs细胞数量，从而发挥抗结直肠癌作用，且本申请建立了抗结直肠癌个性化疫苗及其制备方法的体系，有利于实现结直肠癌的个性化治疗。
附图说明
图1为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL透射电镜图、粒径分布图、储存稳定性示意图、体外释放曲线示意图；
图2为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL在体外对树突状细胞成熟的影响；
图3为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL的安全性及体内抗结直肠癌效果评价；
图4为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL在体内对树突状细胞成熟的影响；
图5为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL对CD8+T细胞数量的影响；
图6为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL对CD8+T细胞功能的影响；
图7为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL对CD4+T细胞数量的影响；
图8为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL对CD4+T细胞功能的影响；
图9为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL对免疫负调控分子PD-1表达的影响；
图10为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL对免疫负调控分子TIGIT表达的影响；
图11为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL对Treg细胞数量的影响；
图12为本申请实施例提供的纳米疫苗NP-TCL对巨噬细胞数量的影响。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将参照相关实验对本申请进行更全面的描述。实验中给出了本申请的较佳实施方式。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本申请的公开内容理解的更加透彻全面。
为使本申请的目的、技术方案更加清楚明白，通过实验的方式对本申请的内容做进一步详细说明，但不应就此理解为本申请上述主题范围内仅限于以下实验。在不脱离本申请上述技术前提下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的相应替换或变更的修改，均包括在本申请内。
需要说明的是，以下实验研究均是在急性毒性试验、长期毒性试验证明药物安全性基础之上开展，实验研究中的给药剂量均在安全剂量范围之内。下述药效学试验所选取的药品为本申请具有代表性的配方及其制备方法所得的药品；其他药品申请人同样进行了药效学实验，实验结果显示具有相同或类似的效果，但由于篇幅限制，在此不一一列举。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本申请实施例公开PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗(后文简称纳米疫苗)，是以PLGA纳米颗粒为载体，包裹结直肠癌肿瘤细胞裂解物的纳米疫苗。
本申请中，PLGA纳米颗粒为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，也被称为聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)，化学结构如下：
线性分子式为[C3H4O2]x[C2H2O2]y。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是一种可生物降解的高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒，并具有良好的成微粒或纳米粒性能。PLGA已经通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。PLGA除了作为药物递送载体以外，其本身也具有一定免疫佐剂效应，因此又被称为颗粒佐剂。采用PLGA纳米颗粒作为疫苗载体负载抗原，一方面可保护抗原不被降解，另一方面其本身还能作为免疫佐剂刺激免疫反应的发生，从而使得负载抗原和佐剂的PLGA纳米颗粒可更好地刺激抗原提呈细胞，以增强免疫应答效果。
结直肠癌肿瘤细胞裂解物由结直肠癌细胞经多次冻融、超声破碎得到。也就是说，将患者个体结直肠癌细胞经多次冻融、超声破碎得到结直肠癌肿瘤细胞裂解物，这里用到结直肠癌肿瘤细胞裂解物，使得所制备的纳米疫苗为全肿瘤细胞裂解物疫苗，是以患者自体结直肠癌肿瘤细胞裂解物为抗原制备的肿瘤疫苗。因其包含个体突变肿瘤抗原的全部序列，所以可激活多克隆肿瘤特异性CD8+T和CD4+T细胞，从而减少结直肠癌从免疫系统中逃逸的机会，避免结直肠癌免疫治疗受到限制。由于该纳米疫苗是以患者个体结直肠癌细胞裂解物为抗原制备的肿瘤疫苗，因此，该纳米疫苗为针对患者的个性化疫苗，不存在肿瘤异质性，纳米疫苗中的抗原均来自患者个体，能够与个体的结直肠癌相适配识别，且不存在不同患者间交叉使用的情况，从而避免临床治疗效果存在显著差异性。
同时，基于全肿瘤细胞裂解物的疫苗包括所有潜在的抗原，无需从肿瘤细胞中的相关蛋白及或肽中获取最佳抗原候选物，无需找到合适的肿瘤抗原来识别肿瘤，避免在确定目标抗原方面存在困难而导致过程漫长，而且患者自体肿瘤细胞可以从手术切除的肿瘤组织中分离出来，从而简化了个性化疫苗的制备过程，避免因疫苗的制备过程漫长而导致贻误患者术后的最佳治疗时机。
如上文所述，将患者的结直肠癌细胞经多次冻融、超声破碎得到结直肠癌肿瘤细胞裂解物，具体地，结直肠癌细胞可以选自CT-26结肠癌细胞、HCT116结肠癌细胞或MC38结肠癌细胞。
进一步地，为进一步保障所制备的纳米疫苗对于结直肠癌的治疗效果，结直肠癌肿瘤细胞裂解物的包封率为78.22±6.34％。
本申请实施例还公开上述PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法，制备方法包括：
S10.将结直肠癌细胞置于液氮、37℃反复冻融4次，随后置于冰上超声破碎，离心收集上清液得到结直肠癌肿瘤细胞裂解物；
S20.将PLGA纳米颗粒溶解于有机溶剂中，加入结直肠癌肿瘤细胞裂解物，超声得到初乳，将初乳加入4％的乳化剂中，超声得到复乳，将复乳加入0.1％的乳化剂中以固化纳米疫苗，磁力搅拌2h至4h，离心收获沉淀则为PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗。
制备工艺简单，简化了个性化疫苗的制备过程，避免因疫苗的制备过程漫长而导致贻误患者术后的最佳治疗时机。且结直肠癌细胞可利用结直肠癌患者术后或者穿刺标本(优选上文中的CT-26结肠癌细胞或HCT116结肠癌细胞)，从而实现个体化肿瘤治疗。
为保障所制备的纳米疫苗对于结直肠癌的治疗效果，有机溶剂为二氯甲烷，乳化剂为聚乙烯醇PVA。
本申请实施例还公开上述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗和/或上述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法在制备结直肠癌防治药物中的应用。
进一步地，所制备的药物通过促进树突状细胞成熟，激活广泛、强烈的CD8+T和CD4+T细胞反应，下调免疫负调控分子PD-1、TIGIT的表达，增加M1型巨噬细胞数量、降低Tregs细胞数量，从而发挥抗结直肠癌作用。
同时本申请建立了抗结直肠癌个性化疫苗及其制备方法的体系，有利于实现结直肠癌的个性化治疗。
本申请实施例还公开结直肠癌防治药物，该结直肠癌防治药物通过上述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法所制备的药物，或，该结直肠癌防治药物包括上述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗。
以下通过具体的实验过程，进一步说明本申请的技术方案以及技术效果。值得说明的是，在本实验过程中，如无特殊说明，所用设备及测试方法均为本领域常规的设备和方法；在能够满足本申请实验条件要求的前提下，本申请并不限制具体实验动物、菌剂及试剂的来源。整个动物实验的操作过程均严格遵循上海药物研究所动物护理与使用委员会的相关规定。
1、实验动物
C57BL/6雌性小鼠，6-8周，采购自宁夏医科大学实验动物中心，饲喂于宁夏医科大学实验动物中心，饲养环境为SPF级别。
2、材料及设备
MC38结肠癌细胞用DMEM培养基培养，胎牛血清购自BI公司。
样品数据由以下仪器测定：透射电子显微镜为日本H7650，粒径分析仪为英国Malvern，流式细胞仪为美国FACSCelestaTM。
PLGA纳米颗粒，西格玛Sigma-Aldrich。
3、CRC模型小鼠的建立
待MC38结肠癌细胞生长至对数生长期时，胰酶消化，离心洗涤3次，重悬于PBS中，调整细胞浓度为1×107个/mL于PBS中，置于冰上，在30min内完成肿瘤细胞接种，剃除小鼠右侧背部毛发，酒精棉签擦拭，皮下接种MC38结肠癌细胞100μL后，立即用棉签按压入针处，通过小鼠右背部接种体外培养的MC38结直肠癌细胞构建CRC模型小鼠。
4、实验过程
(1)结直肠癌肿瘤细胞裂解物(TCL)的制备
实验前5分钟进行麻醉，等CRC模型小鼠达到理想状态，从CRC模型小鼠体内收集对数生长期的结直肠癌MC38细胞，洗涤，计数后重悬于超纯水中，将结直肠癌MC38细胞置于液氮37℃反复冻融4次，置于冰上超声破碎，离心收集上清液即为TCL。
(2)PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗(NP-TCL)的制备
将PLGA纳米颗粒溶解于二氯甲烷中，加入结直肠癌肿瘤细胞裂解物，超声得到初乳，将初乳加入4％的聚乙烯醇PVA中，超声得到复乳，将复乳加入0.1％的聚乙烯醇PVA中以固化纳米疫苗，磁力搅拌3h，离心收获沉淀则为NP-TCL。收集上清液用于检测包封率，为78.22±6.34％。
检测NP-TCL的粒径，参见图1，a)为NP-TCL透射电镜照片，NP-TCL呈球形结构，分散性良好，分布均匀；b)为NP-TCL粒径检测，约为240nm；
将NP-TCL于4℃储存，于第1/7/14/21天检测粒径变化，参见图1，c)为NP-TCL具备良好的储存稳定性；
将NP-TCL置于37℃摇床震荡，24h后取上清液检测TCL含量，连续检测7天，计算累计释放率，参见图1，d)TCL在第一天的释放量达到40％，此后陆续释放，第七天达到最大的累计释放率，约为70％，具备良好的缓释功能。
(3)对照实验
将CRC模型小鼠随机分为3组，每组5只，分别是CRC模型小鼠对照组(PBS组)、结直肠癌小鼠TCL干预组(TCL组)、结直肠癌小鼠NP-TCL干预组(NP-TCL组)。
PBS组：自C57BL/6雌性小鼠接种MC38结肠癌细胞之日为第1天，分别于第5、14、21天于腹股沟区域皮下皮下注射接种PBS100μL，正常饲喂；
TCL组：自C57BL/6雌性小鼠接种MC38结肠癌细胞之日为第1天，分别于第5、14、21天于腹股沟区域皮下皮下注射接种TCL 100μL，正常饲喂；
NP-TCL组：自C57BL/6雌性小鼠接种MC38结肠癌细胞之日为第1天，分别于第5、14、21天于腹股沟区域皮下皮下注射接种NP-TCL 100μL，正常饲喂。
所有组体外刺激树突状细胞24h后，流式细胞术检测树突状细胞表面CD80、CD88、MHCII的表达水平，ELISA检测树突状细胞分泌的细胞因子IL-6、IL-12p40的水平。
参见图2，a)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能上调树突状细胞表面CD80、CD86、MHCII的表达；b)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能促进树突状细胞分泌IL-6、IL-12p40。
(4)NP-TCL体内抗肿瘤效果及安全性评价
所有组小鼠，自接种MC38结肠癌细胞之日起，隔天记录小鼠体重及肿瘤大小，绘制小鼠生长曲线及肿瘤变化曲线；所有组小鼠，第28天处死小鼠，取出瘤块置于A4纸上，拍照记录、测量重量及体积，体积计算公式如下：肿瘤体积(mm3)＝(长径×短径2)/2；
苏木素-伊红染色检测小鼠心、肝、肾组织的病理变化：
①小鼠脱颈处死后，取肿瘤组织、肝、肾、心、肺等器官，用4％的多聚甲醛固定；
②切片采用低浓度-高浓度的酒精脱去组织中的水分，二甲苯置换出残留的酒精；石蜡包埋组织，将蜡块固定于切片机上，切成适宜的厚度，在热水中将薄片捞至载玻片上，在烘片机中烘干；
③将玻片按照顺序放入二甲苯和酒精中进行脱蜡处理；处理后按照苏木素-盐酸乙醇-水-伊红的顺序进行染色；之后用中性树胶封片，待树胶晾干后，镜下观察拍照。
参见图3，a)肿瘤图像；b)肿瘤重量，与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能降低肿瘤重量；c)肿瘤体积变化，与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能降低肿瘤体积；d)小鼠体重变化，各组小鼠体重未表现出显著差异；e)小鼠心肝肾病理变化，NP-TCL组未引起小鼠心肝肾组织病理损伤，表明其具备良好的安全性。
(5)NP-TCL的抗肿瘤机制探讨
取小鼠脾脏，研磨、过滤，利用淋巴细胞分离液分离小鼠脾脏单个核细胞；
取小鼠腹股沟淋巴结，用注射器橡皮塞研磨，经200目滤网过滤至15mL离心管中，离心洗涤、计数；
取小鼠肿瘤组织，眼科剪将其充分剪碎，加入提前配制好的胶原酶，置于37℃摇床震荡30min，用巴氏吸管反复吹打，直至肉眼看不见组织块，经200目滤网过滤至15mL离心管中，离心洗涤、计数；
流式细胞术检测肿瘤浸润CD8+T、CD4+T细胞的数量及其表达免疫负调控分子PD-1、TIGIT的水平、M1型巨噬细胞的数量；流式细胞术检测小鼠脾脏、淋巴结中树突状细胞表达MHCI、MHCII和CD80的水平，CD8+T细胞的数量及其分泌Granzyme B、TNF-α、IFN-γ的水平，CD4+T细胞的数量及其分泌TNF-α、IFN-γ、IL-17的水平，CD8+T、CD4+T细胞表达PD-1和TIGIT的水平，Treg细胞的数量。
参见图4，a)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能上调淋巴结DC表面MHCII；b)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能上调淋巴结DC表面MHCI；c)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能上调脾脏DC表面CD80；d)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能上调脾脏DC表面MHCI。
参见图5，a)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能增加肿瘤CD8+T细胞数量；b)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能增加淋巴结CD8+T细胞数量；c)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能增加脾脏CD8+T细胞数量。
参见图6，a)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能促进脾脏CD8+T细胞分泌Granzyme B；b)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能促进脾脏CD8+T细胞分泌IFN-γ；c)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能促进脾脏CD8+T细胞分泌TNF-α。
参见图7，a)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能增加肿瘤CD4+T细胞数量；b)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能增加脾脏CD4+T细胞数量；c)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能增加淋巴结CD4+T细胞数量；d)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能增加脾脏Th17细胞数量。
参见图8，a)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能促进脾脏CD4+T细胞分泌TNF-α；b)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能促进淋巴结CD4+T细胞分泌TNF-α；c)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能促进脾脏CD4+T细胞分泌IFN-γ。
参见图9，a)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能下调淋巴结CD8+T细胞PD-1的表达；b)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能下调脾脏CD8+T细胞PD-1的表达；c)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能下调肿瘤CD8+T细胞PD-1的表达；d)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能下调淋巴结CD4+T细胞PD-1的表达；e)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能下调脾脏CD4+T细胞PD-1的表达；f)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能下调肿瘤CD4+T细胞PD-1的表达。
参见图10，a)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能下调脾脏CD8+T细胞TIGIT的表达；b)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能下调淋巴结CD8+T细胞TIGIT的表达；c)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能下调淋巴结CD4+T细胞TIGIT的表达；d)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能下调脾脏CD4+T细胞TIGIT的表达。
参见图11，a)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能降低淋巴结Tregs细胞数量；b)与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能降低脾脏Tregs细胞数量。
参见图12，与PBS、TCL组相比，NP-TCL组能增加肿瘤M1型巨噬细胞数量。
综上所述，本申请公开的一种PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗及其制备方法和应用中，采用PLGA纳米颗粒作为疫苗载体负载抗原，一方面可保护抗原不被降解，另一方面其本身还能作为免疫佐剂刺激免疫反应的发生，从而使得负载抗原和佐剂的PLGA纳米颗粒可更好地刺激抗原提呈细胞，以增强免疫应答效果。并且PLGA纳米颗粒负载的抗原为结直肠癌肿瘤细胞裂解物，使得所制备的纳米疫苗为全肿瘤细胞裂解物疫苗，因其包含患者自体突变肿瘤抗原的全部序列，所以可激活多克隆肿瘤特异性CD8+T和CD4+T细胞，从而减少结直肠癌从免疫系统中逃逸的机会，避免结直肠癌免疫治疗受到限制，该纳米疫苗为针对患者自体的个性化疫苗，不存在肿瘤异质性，能够与患者自体的结直肠癌相适配识别，不存在不同患者间交叉使用的情况，从而避免临床治疗效果存在显著差异性。由于全肿瘤细胞裂解物的疫苗包括所有潜在的抗原，无需从肿瘤细胞中的相关蛋白及或肽中获取最佳抗原候选物，无需找到合适的肿瘤抗原来识别肿瘤，避免在确定目标抗原方面存在困难而导致过程漫长，从而简化了个性化疫苗的制备过程，避免因疫苗的制备过程漫长而导致贻误患者术后的最佳治疗时机。
同时，PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗通过促进树突状细胞成熟，激活广泛、强烈的CD8+T和CD4+T细胞反应，下调免疫负调控分子PD-1、TIGIT的表达，增加M1型巨噬细胞数量、降低Tregs细胞数量，从而发挥抗结直肠癌作用，且本申请建立了抗结直肠癌个性化疫苗及其制备方法的体系，有利于实现结直肠癌的个性化治疗。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗，其特征在于，是以PLGA纳米颗粒为载体，包裹结直肠癌肿瘤细胞裂解物的纳米疫苗。
2.根据权利要求1所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗，其特征在于，所述PLGA纳米颗粒为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，化学结构如下：
线性分子式为[C3H4O2]x[C2H2O2]y。
3.根据权利要求1所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗，其特征在于，所述结直肠癌肿瘤细胞裂解物由结直肠癌细胞经多次冻融、超声破碎得到。
4.根据权利要求3所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗，其特征在于，所述结直肠癌细胞选自CT-26结肠癌细胞、HCT116结肠癌细胞或MC38结肠癌细胞。
5.根据权利要求1所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗，其特征在于，所述结直肠癌肿瘤细胞裂解物的包封率为78.22±6.34％。
6.如权利要求1至5中任一项所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S10.将结直肠癌细胞置于液氮、37℃反复冻融4次，随后置于冰上超声破碎，离心收集上清液得到结直肠癌肿瘤细胞裂解物；
S20.将PLGA纳米颗粒溶解于有机溶剂中，加入结直肠癌肿瘤细胞裂解物，超声得到初乳，将初乳加入4％的乳化剂中，超声得到复乳，将复乳加入0.1％的乳化剂中以固化纳米疫苗，磁力搅拌2h至4h，离心收获沉淀则为PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗。
7.根据权利要求6所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷，所述乳化剂为聚乙烯醇PVA。
8.权利要求1至5中任一项所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗和/或权利要求6至7中任一项所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法在制备结直肠癌防治药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所制备的药物通过促进树突状细胞成熟，激活CD8+T和CD4+T细胞反应，下调免疫负调控分子PD-1、TIGIT，发挥抗结直肠癌作用，实现防治结直肠癌。
10.结直肠癌防治药物，其特征在于，通过权利要求6至7中任一项所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗的制备方法所制备的药物，或，包括权利要求1至5中任一项所述的PLGA全肿瘤裂解物抗结直肠癌纳米疫苗。
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