CN111110653B - 一种巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶及其制备 - Google Patents

一种巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶及其制备，所述水凝胶由透明质酸纳米水凝胶内部原位合成聚吡咯，然后负载药物，获得。然后通过与小鼠巨噬细胞共孵育，得到巨噬细胞包覆的载药纳米水凝胶。本发明制备的巨噬细胞介导的载药纳米水凝胶进行抗癌药物递送时，具有低毒安全、躲避网状内皮系统的吞噬、特异性靶向肿瘤区域等优点，在肿瘤治疗方面具有潜在的应用前景。

Description

一种巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶及其制备
技术领域
本发明属于载药纳米材料及其制备领域，特别涉及一种巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶及其制备。
背景技术
癌症是威胁全球人类生命健康的重要疾病之一，早诊断、早发现、早治疗，将可以大大增加癌症治愈的机会。目前治疗癌症的常规方法包括手术、化疗、放疗、免疫治疗等，化疗作为手术前后辅助治疗癌症的主要手段，仍然具有缺乏特异性、水溶性差、细胞渗透率低、对正常组织细胞具有较强的副作用等缺点。得益于纳米医学技术的迅猛发展，为了克服癌症常规治疗手段存在的局限性，各种不同类型的纳米载体(Nanocarriers)和靶向试剂(Targeting ligands)得到了越来越多的开发和应用。
利用纳米颗粒在肿瘤组织的增强渗透和滞留效应(EPR)可以增加负载的抗癌药物在肿瘤位置的聚积。常用的纳米载体主要包括:(1)聚合物类纳米载体(Polymericnanocarriers)，例如：聚合物胶束(Polymeric micelles)、树状大分子(Dendrimers)、纳米凝胶(Nanogels)、和纳米微球(Nanospheres)等；(2)脂质纳米载体(Lipid nanocarriers),如：脂质体(Liposomes)、磷脂胶束(Phospholipid micelles)；(3)金属/无机纳米载体(Metal and inorganic nanocarriers)，如：金纳米颗粒(Au NPs)、磁性纳米颗粒(Magnetic NPs)、介孔硅(Mesoporous silica)、量子点(quantum dots)等。其中天然高分子成分的纳米凝胶由于其优异的生物相容性、水溶性、可降解性和较高的载药效率在药物传递中具有很大的潜力(Kruti S.Soni,et al.J.Controlled Release,2016,240,109-126)。为了进一步提高药物的递送效率，使纳米载体在癌症的治疗过程中更加安全、有效，还可以通过修饰叶酸(FA)、透明质酸(HA)、抗体(Antibody)、多肽(Peptide)、适配体(Aptamer)等靶向配体，进一步提高纳米载体在肿瘤位置的特异性聚积。
然而，这些人工合成的有机或无机纳米载体均具有一定的“非我(non-self)”特性，仍然存在许多障碍限制了其进一步应用，例如机体自身的生理屏障，肿瘤的异质性，氧含量低、间质液压升高等异常的肿瘤微环境，并且容易在肝脏和脾脏等网状内皮系统(RES)聚积，严重阻碍了纳米药物载体从基础研究向临床应用的转化。在这方面，内源性的天然细胞或细胞膜因为与体细胞具有相似的细胞膜结构，可以被机体识别为“自我(self)”，细胞或细胞膜为纳米药物载体提供了机会来隐藏或伪装，从而削弱免疫原性和毒副作用，使其可以更加友好而安全的穿越体内的生理屏障。另一方面，基于天然细胞对肿瘤细胞的趋化性可以实现不同的生物效应和靶向特异性结合，对肿瘤组织以及转移的癌细胞进行更加精确的追踪定位和可控制的药物释放(Zhibin Li,et al.J.Mater.Chem.B,2018,6,1296-1311)。这些潜质使其作为一种有前景的新型药物递送策略得到了研究学者的关注。
与其它细胞相比，巨噬细胞作为一种吞噬细胞具有天然的吞噬能力(SravanKumar Patel,et al.Theranostics,2015,5,150-172)。而且巨噬细胞具有较好的肿瘤趋向能力(Tumor-homing property)，相关报道指出，巨噬细胞可以识别肿瘤细胞分泌的细胞因子而诱导其迁移到肿瘤位置，如集落刺激因子(CSF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤凋亡因子(TNF)和白细胞介素(IL-1/IL-5)等(Weizhong Zhang,et al.Adv.Mater.,2018,30,1805557)。此外，巨噬细胞表面通常具有大量过表达的CD44受体，利用透明质酸和CD44受体介导的内吞作用可以有效增加细胞载体的药物上载量(Chu-Xin Li,et al.Adv.Mater.,2019,31,1807211)，解决了现有的细胞载体对材料吞噬量十分有限的缺点，外面包裹的天然透明质酸纳米凝胶还可以有效减少负载的抗癌药物对载体细胞的影响。检索国内外相关文献和专利结果表明：巨噬细胞介导的负载聚吡咯和阿霉素的透明质酸纳米水凝胶用于药物靶向递送的方法，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶及其制备，克服现有细胞载体载药量有限、难以将抗癌药物彻底释放等的缺陷，本发明中以透明质酸HA为原料，采用双乳化法制备得到HA NGs，然后用FeCl3.6H2O作为催化剂在HANGs内部原位合成PPy，再负载抗癌药物DOX，最后与巨噬细胞MAs共孵育。
本发明提供一种载药透明质酸纳米水凝胶，所述水凝胶由透明质酸纳米水凝胶内部原位合成聚吡咯，然后通过亲疏水作用负载药物，获得。
本发明的一种载药透明质酸纳米水凝胶的制备方法，包括：
(1)透明质酸纳米水凝胶HA NGs中加入催化剂，搅拌1h，此时溶液呈均匀的铁红色，然后将溶液置于冰浴中，然后加入吡咯Py单体，在冰浴条件下持续反应3-5h，溶液由铁红色渐渐变为深绿色，透析2-3天，冷冻干燥，得到负载聚吡咯的透明质酸水凝胶HA/PPyNGs；
(2)将药物溶液滴加到HA/PPy NGs水溶液中，避光敞口搅拌12-24h，离心，得到载药透明质酸纳米水凝胶。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中透明质酸纳米水凝胶HA NGs由下列方法制备(双乳化法)：
将透明质酸HA钠盐溶于水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐EDC，磁力搅拌反应2-4h以活化HA上的羧基，得到活化好的HA/EDC溶液；然后将HA/EDC溶液在搅拌条件下逐滴加入到琥珀磺酸二辛钠AOT的二氯甲烷DCM溶液中，搅拌反应10-15min，得到乳白色的油包水W/O乳液；其中透明质酸HA钠盐的溶剂水和二氯甲烷DCM的体积比为1-2:4-5；
将W/O乳液逐滴滴加到聚乙烯醇PVA水溶液中，继续搅拌15-30min，形成乳白色的水包油包水W/O/W双乳液，加入交联剂胱胺二盐酸盐Cys反应1-2h后，再冰浴超声5-10min，然后敞开瓶口在通风橱内持续搅拌过夜，以彻底挥发掉有机溶剂DCM，透析2-3天，离心，取下层沉淀重新回溶于超纯水，得到纯化的HA NGs；其中所述透析2-3天是以1000kDa截留分子量的透析袋透析2-3天，离心为：离心转速≥13000rpm，离心时间5min。
所述HA的分子量为48kDa、320kDa或950kDa；HA与EDC和Cys的投料摩尔比为1:0.5:2；HΑ水相与DCM油相、PVA水相的体积比为1:4:15～1:4:30；HA水溶液的浓度为1～2wt％；AOT的DCM溶液的质量百分数为2.5wt％；PVA水溶液的质量百分数为2wt％；加入交联剂Cys的质量百分数为1～3wt％。
所述透明质酸纳米水凝胶HA NGs的制备具体的加料顺序和反应时间分别为，将HA/EDC水溶液逐滴加入到AOT/DCM油相，搅拌10-15min后形成W/O乳液；然后将该W/O乳液逐滴滴加到PVA的水溶液中，搅拌15-30min，形成W/O/W双乳液。最后加入Cys反应1-2h以后，利用超声破碎仪在冰浴中超声5-10min，以使HA NGs的粒径分布更加均匀。
所述步骤(1)中催化剂为六水合三氯化铁FeCl3.6H2O。
所述步骤(1)中HA NGs和Py的质量比为1:0.46；Py的体积和FeCl3.6H2O的质量比为1:5～1:10(μL:mg)。
所述步骤(2)中药物为盐酸阿霉素DOX.HCl；药物溶液的溶剂为甲醇；HA/PPy NGs与盐酸阿霉素的质量比为1:0.2～1:0.5。
所述步骤(2)进一步具体为：向盐酸阿霉素DOX.HCl的甲醇溶液中加入三乙胺去盐酸化，然后将DOX甲醇溶液滴加到HA@PPy NGs水溶液中，避光敞口搅拌12-24h，以挥发掉溶液中的甲醇溶剂，然后5000rpm离心10min，除去未络合的DOX沉淀，上清液即为HA/DOX@PPyNGs。向剩余沉淀中加入1mL甲醇，溶解其中的DOX，通过差减法定量DOX的上载量。
本发明提供一种所述方法制备的载药透明质酸纳米水凝胶。
本发明提供一种巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶，巨噬细胞MAs包覆所述载药透明质酸纳米水凝胶，通过巨噬细胞MAs与载药透明质酸纳米水凝胶孵育获得。
所述巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶由巨噬细胞MAs与所述载药透明质酸纳米水凝胶孵育1-8h，获得。
所述具体为：HA/DOX@PPy NGs对载体巨噬细胞MAs的细胞活力影响，确定对MAs细胞活力无明显影响的浓度范围。然后将MAs与允许浓度范围内的HA/DOX@PPy NGs(含10～40μg/mL DOX)孵育不同时间(1～8h)，优化最佳的材料浓度和吞噬时间。在该浓度和培养时间下制备得到负载材料的巨噬细胞MAs-HA/DOX@PPy(MAHA)，消化以后存于冰盒中，立即进行后续的体内外成像或治疗实验。
所述与MAs孵育的最佳材料浓度为含有20μg/mL DOX的HA/DOX@PPy NGs(其中DOX为HA/DOX@PPy NGs中的DOX)，孵育时间为4h。
本发明提供一种所述巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶在制备化疗和光热治疗协同增强抗肿瘤药物中的应用。
本发明在合成HA NGs过程时，调控了HA与EDC和交联剂Cys的最佳反应投料比为1:0.5:2,使HA上的部分羧基(—COOH)被活化和交联，形成粒径均匀分布的HA NGs。并且研究了HA分子量对NGs的粒径大小、稳定性以及后续PPy包载量的影响，在保证稳定性的前提下通过选用较大分子量的HA适当增加HA NGs的尺寸，以增加光热试剂PPy的上载量，获得更好的光热效果。
本发明选用巨噬细胞作为载体细胞，HA NGs作为负载光热试剂和抗癌药物的载体，用于细胞介导的光热/化疗联合治疗，其中产生的效果包括：(1)巨噬细胞表面具有过表达的CD44受体，利用受体介导的内吞作用提高载体细胞对负载光热试剂和抗癌药物的HA/DOX@PPy NGs摄取量，以为后续肿瘤治疗提供有效的药物浓度。(2)在肿瘤细胞分泌的细胞因子诱导下，巨噬细胞可携带纳米材料往肿瘤位置迁移，同时在迁移过程中巨噬细胞充当伪装外衣，减少网状内皮系统(RES)的内吞，增加纳米材料在肿瘤位置的聚积，起到更好的肿瘤治疗效果。
本发明使用紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)等手段表征制备的纳米凝胶材料(HA@PPy NGs)。利用UV-Vis、激光共聚焦显微镜(Confocal)、体外细胞光热性能和热成像等手段定量和定性分析巨噬细胞对载药纳米凝胶(HA/DOX@PPy NGs)的吞噬情况。然后利用CCK-8法和Transwell迁移实验评价载药纳米凝胶对巨噬细胞载体的细胞活力影响及向肿瘤细胞迁移能力的影响。通过体内热成像观测荷瘤裸鼠肿瘤位置的光热升温情况，利用小动物荧光成像仪监测单独的材料HA/DOX@PPy和巨噬细胞吞噬的材料MAHA分别在小鼠体内的生物分布情况。最后进行裸鼠体内肿瘤模型的光热/化疗联合治疗实验，构建4T1的皮下瘤模型，考察MAHA对4T1肿瘤的联合治疗效果，说明书附图1为本发明制备的巨噬细胞吞噬的透明质酸载药纳米凝胶的合成及应用示意图。具体测试结果如下：
(1)Zeta电势及水动力学直径测试结果
参见说明书附图2a-2d，分别为HA NGs和HA@PPy NGs的水动力学粒径分布和电势变化情况。在附图2a和2b中，随着HA分子量的增加(48,320,950kDa)，制备得到的HA NGs的水动力学粒径呈增加趋势，从243.8nm分别增加到316.7nm和383.0nm，表面电势则略有升高。但是在乳化过程中发现，当HA的分子量达到950kDa时，由于其黏度较大，容易发生破乳现象。于是选取了48kDa和320kDa的HA NGs进行后续PPy负载的研究，结果参见说明书附图2c、2d和附表1，随着Py投料质量比(HA:Py＝1:0.11,1:0.23,1:0.46,1:0.69,1:0.92)的增加，制备的HA@PPy NGs水动力学粒径均先减小后增加，在HA:Py＝1:0.46时粒径最小。但是我们注意到，对于分子量为48kDa的HA NGs，当Py投料比超过1:0.46时出现了一定程度的聚沉；而分子量为320kDa的HA NG，当投料比大于1:0.46时虽然未出现明显的聚沉，但是冻干以后的回溶性较差，因此我们选用分子量为320kDa的HA NGs和HA:Py＝1:0.46的投料比进行后续的实验研究。
参见说明书附图2b，HA@PPy NGs(320kDa)的表面电势随带正电荷的Py投料比的增加而逐渐升高，说明PPy的负载量增加。
(2)UV-Vis光谱测试结果
参见说明书附图2e，为不同Py投料比条件下制备的一系列HA@PPy NGs的紫外-可见吸收光谱图，在800nm附近的近红外光区观察到了PPy的特征吸收峰，显示了PPy的成功负载。从图中可以看到，随着PPy负载量的增加其特征吸收峰越来越明显。当上载了化疗药物DOX以后，则在附图2f中490nm附近出现了DOX的特征吸收峰，表明DOX可以成功负载到HANGs上，制备得到HA/DOX@PPy NGs，经计算其药物包封率(EE％)达95％，药物上载量(LC％)为19.2％。
(3)SEM/TEM测试结果
参见说明书附图3a和3b为优化的HA@PPy NGs(350kDa,HA:Py＝1:0.46)的扫描电镜照片和对应的粒径分布柱状图，其平均粒径为77.3nm。附图3c和3d为HA@PPy NGs的透射电镜照片和粒径分布柱状图，经统计其平均粒径为74.9nm，比SEM结果略小，从图中可以看到HA@PPy NGs的大小分布非常均匀，具有很好的分散性。附图3c中嵌入的照片为放大后的TEM图片。
(4)体外光热性能测试结果
参见说明书附图4a，考察了不同浓度(0.125,0.25,0.5,1,2mg/mL)的HA@PPy NGs在808nm激光照射下的升温情况。在一定功率密度(1W/cm2)下，HA@PPy NGs的升温效应随着浓度的增加逐渐增加，在浓度为1mg/mL时，HA@PPy NGs的温度升高了18.8℃，而水仅增加了0.2℃。参见说明书附图4b，HA@PPy NGs(1mg/mL)的光热稳定性通过五次循环升降温进行测试，用808nm激光照射5min完成一个升温过程，然后关闭激光冷却至起始温度，完成一个降温过程。从图中看出五个循环之间温度变化没有出现明显的差异，表明制备的HA@PPy NGs具有良好的光热稳定性。
根据说明书附图4c中的升温冷却曲线，得到附图4d冷却时间与驱动温度的自然对数的相反数之间的关系，经线性拟合可知HA@PPy NGs的热传递系数为149s，根据公式计算出其光热转换效率为52.7％。
(5)载药纳米凝胶的药物释放测试结果
参见附图5a为HA/DOX@PPy NGs在不同pH条件(pH＝7.4,pH＝5.0)时的药物释放曲线，通过UV-Vis光谱测试490nm处的吸光度，并根据预先绘制的DOX.HCl在对应pH缓冲溶液中的浓度-吸光值标准曲线计算得到。从图中可以看出，在pH＝7.4时，DOX的累积释放量只有21％，而在与肿瘤微环境接近的弱酸性条件(pH＝5.0)下，DOX的累积释放量可以增加到53.5％。
(6)巨噬细胞对载药纳米凝胶的吞噬量测试结果
参见说明书附图5c、5d，不同浓度的HA/DOX@PPy NGs(0,10,20,40μg/mL DOX)与巨噬细胞共孵育一定时间(0,1,2,4,6,8h)，然后通过冻融破碎法将细胞破裂，1500r/min离心5-10min，取上清液测试其中的DOX在490nm处的UV-Vis吸收值，计算吞噬量随孵育时间和孵育浓度的变化。从附图5c和5d中看到巨噬细胞对HA/DOX@PPy的吞噬量随着孵育时间和孵育浓度的增加而增加，在20μg/mL DOX，4h孵育条件时，巨噬细胞的吞噬量达到8.01～9.15μg/mL DOX。
(7)载药纳米凝胶的负载对巨噬细胞载体的影响
参见说明书附图5b为巨噬细胞的CCK-8细胞活力实验，附图5e-5j为Transwell迁移实验。从CCK-8结果看到，free-DOX在5μg/mL浓度下即对巨噬细胞产生了明显的毒性作用，而载药纳米凝胶HA/DOX@PPy NGs在DOX浓度达到20μg/mL时其细胞活力仍可维持在80％以上。在Transwell迁移实验中，上室接种5*104个/孔的巨噬细胞，下室接种5*104个/孔4T1细胞或用空白培养基作为对照，在37℃,5％CO2的培养箱中共培养16-24h，然后用结晶紫染色、拍照、计数。从附图5e的统计数据和5g-5j的相差显微镜照片可以看出，4T1肿瘤细胞的存在可以诱导巨噬细胞向下室迁移，而且吞噬材料后的巨噬细胞MAHA与未吞噬材料的MAs相比，其向4T1细胞的迁移能力未受到明显的影响。
(8)体外细胞及体内肿瘤的热成像测试结果
参见说明书附图6a-6c，是采用808nm激光在不同功率(1W/cm2,1.5W/cm2)下照射吞噬材料前后的巨噬细胞，在体外持续照射5min后得到的升温曲线(附图5a,5b)和热成像照片(5c)。从图中看到，随着激光功率的增加和细胞数量增多，吞噬材料后的巨噬细胞MAHA产生的光热效果逐渐增加，在1.5W/cm2,细胞数量9*106时温度升高了26.7℃，细胞数量5*106时也升高了14.6℃。而未吞噬材料时的巨噬细胞MAs只有微小的温度升高(1.5W/cm2,9*106时仅有3.9℃)，PBS对照组则基本未出现温度变化。这同时也验证了HA/DOX@PPy在巨噬细胞上的成功负载。
参见说明书附图7为荷瘤小鼠的体内热成像结果。巨噬细胞携带载药纳米凝胶组MAHA经808nm激光照射5min后升高了13℃，明显高于其他各组：注射相同量(根据吞噬量换算)的单独载药纳米凝胶组HA/DOX@PPy升高了8.6℃，巨噬细胞组MAs升高6.9℃，PBS组也升高了5.1℃。PBS和MAs组的温度升高是由于生物体本身吸收激光辐射产生的少量热量造成的。
(9)体内治疗效果评价
参见说明书附图8a为联合治疗过程示意图，主要分为5组：PBS组、DOX组、MAs组、HA/DOX@PPy+Laser组、MAHA+Laser组。在裸鼠体内构建4T1皮下瘤模型，待模型长到100mm3左右开始进行治疗，尾静脉注射100uL的材料，其中HA/DOX@PPy和MAHA组配合808nm激光照射5min(1.5W/cm2)，每4天治疗一次，治疗3次。三次治疗结束后至第15天，每组取一只小鼠进行安乐死，然后取心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织分别进行H&E和TENEL染色。附图8b可以看到PBS对照组小鼠的肿瘤体积变化最大，巨噬细胞介导的载药纳米凝胶联合光热治疗MAHA+Laser组肿瘤体积变化最小，表现出了最佳的治疗效果。附图8c小鼠存活率实验验证了这一结果，MAHA+Laser组直至40天时仍有2只存活，而其他组到34天时已全部死亡。参照附图8d说明在整个治疗过程中各组小鼠的体重基本保持稳定，无明显变化。参照说明书附图8e通过H&E和TUNEL染色考察各治疗组小鼠肿瘤的凋亡情况，从图中看出MAHA+Laser组的凋亡最明显，治疗效果最好。
有益效果
(1)本发明反应条件易于实现，合成步骤简单，易操作，原料环保，且成本较低，具有良好的发展前景。
(2)本发明方法使用了较少的有机相，大部分反应在水相中完成，制备过程比较环保，具有较高的药物包封率和光热试剂上载量，而且在一定吞噬量的条件下对巨噬细胞载体的毒性较小，为细胞介导的药物递送和肿瘤联合治疗拓宽了思路。
(3)本发明制备负载聚吡咯和阿霉素的透明质酸纳米水凝胶具有高的药物装载率，良好的生物相容性和水溶性，还具有较高的光热转换效率。借助巨噬细胞介导其向肿瘤位置的递送有效的减少网状内皮系统的吞噬，增加抗肿瘤药物在肿瘤的特异性聚积，减少DOX的毒副作用，为构建安全高效的药物载体，用于肿瘤联合治疗提供了应用前景。
(4)本发明利用巨噬细胞载体介导负载聚吡咯和阿霉素的透明质酸纳米水凝胶向肿瘤的靶向递送，结合聚吡咯的光热作用，一方面赋予其光热杀伤肿瘤的效果，另一方面还可以利用光热作用对载体细胞的损伤促进内部负载的阿霉素的释放，达到化疗和光热治疗联合抗肿瘤效果。
附图说明
图1为本发明制备的MAs-HA/DOX@PPy的合成和应用示意图；
图2为本发明制备的三种分子量的HA NGs水动力学粒径分布图(a)，和负载不同比例的PPy前后表面电势变化(b)，以及分子量48kDa的HA制备的HA@PPy NGs(c)，和分子量320kDa HA制备的HA@PPy NGs(d)的水动力学粒径分布图；HA NGs和不同PPy负载量的HA@PPy NGs的UV-Vis吸收光谱图(e)，HA NGs负载聚吡咯和DOX前后的UV-Vis吸收光谱图(f)；其中“星号”表示优化选取的HA NGs和PPy负载量；
图3为本发明制备的HA@PPy NGs(选用分子量320kDa的HA，HA:Py＝1:0.46)SEM照片(a)及其粒径分布柱状图(b)、TEM照片(c)和粒径分布状图(d)；
图4为本发明制备的HA@PPy NGs体外光热性能分析：一定功率(1W/cm2)、不同浓度下的HA@PPy NGs在808nm激光下照射5min时的升温曲线(a)，连续升温/降温五个循环的光热稳定性(b)，在激光照射阶段和移除激光冷却阶段的温度与时间关系图(c)和线性拟合冷却时间与驱动温度的自然对数的相反数(d)；
图5为本发明制备的HA/DOX@PPy NGs在不同pH下的药物释放曲线(a)，巨噬细胞(RAW264.7)与不同浓度的材料(DOX含量为0,10,20,40μg/mL)孵育不同时间(1,2,4,6,8h)时的吞噬情况(b)(c)，Free-DOX和HA/DOX@PPy NGs对巨噬细胞的细胞活力测试(d)；巨噬细胞向4T1肿瘤细胞的Transwell迁移实验：细胞迁移率(e)、Transwell迁移实验示意图(f)和通过倒置相差显微镜观察到的穿过聚碳酸酯膜到达下室的巨噬细胞数目情况(g-j)；其中未吞噬材料的巨噬细胞(MAs)和吞噬了HA/DOX@PPy NGs材料的巨噬细胞(MAHA)分别接种于上室，4T1细胞或空白培养基分别置于下室，共孵育18h；图(g-j)中标尺(Scale bar)为100μm；
图6为本发明制备的吞噬了HA/DOX@PPy NGs(含DOX 20μg/mL)的巨噬细胞MAHA和未吞噬材料的巨噬细胞MAs，取不同数量(5*106,9*106)的MAHA和MAs细胞在808nm激光、不同功率密度(1W/cm2,1.5W/cm2)下持续照射5min的升温情况(a)(b)，和由红外热成像仪记录得到的热成像照片(c)；
图7为实施例7中尾静脉注射不同材料(PBS，MAs，HA/DOX@PPy，MAHA)后的荷瘤小鼠，在808nm激光下，以1.5W/cm2功率持续照射5min过程中记录得到的热成像照片；
图8分别为荷瘤小鼠的治疗过程示意图(a)，各组小鼠的相对肿瘤体积变化(b)，观察至40天时的小鼠存活率结果(c)和体重变化情况(d)，各组小鼠在治疗结束后第15天获取的肿瘤组织H&E和TUNEL染色结果(e)；标尺(Scale bar)为100μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。小鼠巨噬细胞RAW264.7(MAs)，来自中国科学院细胞库。
实施例1
将不同分子量(48kDa,320kDa,950kDa，华熙生物)的透明质酸钠盐(20mg)分别溶于2mL超纯水中，向其中加入EDC(HA:EDC＝1:0.5，摩尔比)，磁力搅拌反应3h以活化HA上的羧基。表面活性剂AOT(134mg)预先溶于4mL二氯甲烷DCM中，然后将活化好的HA/EDC溶液在搅拌条件下逐滴加入到AOT/DCM溶液中，搅拌10min，形成乳白色的W/O乳液，再将该溶液逐滴滴加到预先溶解好的PVA水溶液(2wt％,30mL)中，继续搅拌15min，形成乳白色的W/O/W双乳液。最后加入交联剂Cys(22.4mg，1mL)反应1h后，再用超声破碎仪冰浴超声10min，然后敞开瓶口在通风橱内持续搅拌过夜，以彻底挥发掉有机溶剂DCM。第二天，将HA NGs水溶液透析2天，然后13000rpm离心5min去掉上清，取下层沉淀重新回溶于超纯水，即得到纯化的HANGs溶液。
由于分子量950kDa的HA黏度过大，在乳化过程中容易破乳，因此选用了48kDa和320kDa的HA NGs进行后续包载PPy的研究。称取FeCl3.6H2O(Py单体与FeCl3.6H2O的比例为1μL:9mg)溶于少量去离子水中，将其加入到86mg HA NGs溶液(5mL)中搅拌1h，此时溶液呈均一的铁红色，然后将上述溶液置于冰浴条件下，再分别加入不同体积(10,20,40,60,80μL，换算为质量比依次为HA NGs:Py＝1:0.11,1:0.23,1:0.46,1:0.69,1:0.92)的吡咯(Py)单体，在冰浴条件下持续反应4h，溶液由铁红色逐渐变为浅绿色，然后变为深绿色。将该溶液透析3天并冷冻干燥，即得到负载不同比例PPy的HA@PPy NGs。
取上述优化的HA@PPy NGs(320kDa，HA:Py＝1:0.46)负载抗癌药物DOX：称取2mgHA@PPy NGs溶于4mL去离子水。称取0.5mg盐酸阿霉素DOX.HCl溶于甲醇溶液，并加入60μL三乙胺去盐酸化，然后将该DOX的甲醇溶液滴加到HA@PPy NGs水溶液中，避光敞口搅拌过夜，挥发掉溶液中的甲醇溶剂，然后5000rpm离心10min，除去下层未络合的DOX沉淀，上清液即为HA/DOX@PPy NGs。向下层沉淀中加入1mL甲醇，溶解其中的DOX，测其在490nm处的紫外吸收值，利用预先绘制的DOX甲醇溶液标准曲线计算未负载上的DOX质量，然后通过差减法得出HA/DOX@PPy NGs中DOX的上载量LCDOX＝19.2％，封装率EEDOX＝95％。
实施例2
对实施例1制备的HA NGs、HA@PPy NGs和HA/DOX@PPy NGs进行表征。不同分子量透明质酸制备得到的HA NGs的水动力学粒径分布和电势变化情况分别如图2a和2b所示，随着HA分子量的增加(48,320,950kDa)，制备得到的HA NGs水动力学粒径呈增加趋势，从243.77nm分别增加到316.67nm和383.0nm，表面电势也略有升高。但是在制备HA NGs过程中发现，当HA的分子量达到950kDa时，由于其黏度较大，在W/O/W乳化过程中容易发生破乳现象。于是选取了48kDa和320kDa的HA NGs进行后续PPy负载量的研究，结果如图2c、2d和表1，随着吡咯单体Py投料质量比(HA:Py＝1:0.11,1:0.23,1:0.46,1:0.69,1:0.92)的增加，制备的HA@PPy NGs水动力学粒径均呈先减小后增加的趋势，这是因为外层的HA NGs带负电荷，内层包裹的PPy则带正电荷，由于正负电荷吸引作用，开始时随着PPy负载量和正电荷的增加会使外层的HA NGs发生一定程度的收缩。而当HA:Py≥1:0.46时，吸引作用发挥到极限，继续增加PPy负载量会由于其粒径增大而撑开外层的HA NGs，于是HA@PPy NGs的水动力学粒径之后又逐渐增加。如图2b，HA@PPy NGs的表面电势随Py投料比的增加而逐渐增加，说明PPy的负载量随之增加。图2e为不同Py投料比条件下制备的HA@PPy NGs的紫外-可见吸收光谱图，在800nm附近的近红外光区观察到了PPy的特征吸收峰，显示了PPy的成功负载，从图中可以看到，随着PPy负载量的增加其吸收峰越来越明显，验证了PPy负载量的增加。与此同时，对于分子量为48kDa的HA NGs，当Py投料比大于1:0.46时出现了一定程度的聚沉；而分子量为320kDa的HA NGs，当投料比超出1:0.46时未出现明显聚沉现象，这说明HA NGs分子量的增加有利于负载更多的PPy，以提高光热转换效率好光热治疗效果。但是PPy负载量过高会使冻干以后的HA@PPy NGs回溶性变差，因此最终选用分子量为320kDa的HA NGs和HA:Py＝1:0.46的投料比作为最优的反应条件制备HA@PPy NGs，以进行后续的实验研究。
如图2f所示，当优化的HA@PPy NGs上载了化疗药物DOX以后，在490nm附近出现了DOX的特征吸收峰，表明DOX可以成功负载到HA NGs，制备得到HA/DOX@PPy NGs。
附图3a和3b为优化的HA@PPy NGs(350kDa,HA:Py＝1:0.46)的扫描电镜照片SEM和对应的粒径分布柱状图，经统计其平均粒径为77.3nm。附图3c和3d则为HA@PPy NGs的透射电镜照片和粒径分布柱状图，经统计其平均粒径为74.9nm，比SEM结果略小，从图中可以看到HA@PPy NGs的大小分布非常均匀，具有很好的分散性。附图3c中嵌入的照片为放大后的TEM图片。
HA@PPy NGs的体外光热性能测试结果如图4所示，附图4a为不同浓度(0.125,0.25,0.5,1,2mg/mL)的HA@PPy NGs在808nm激光照射下的升温情况。在一定的功率密度(1W/cm2)下，HA@PPy NGs的升温效应随着浓度的增加逐渐增加，在浓度为1mg/mL时，HA@PPyNGs的温度升高了18.8℃，而水仅增加了0.2℃。HA@PPy NGs(1mg/mL)的光热稳定性通过五次循环升降温进行测试，其中用808nm激光照射5min完成一个升温过程，然后关闭激光冷却至起始温度，完成一个降温过程，结果如图4b所示，发现五个循环之间没有出现明显差异，表明制备的HA@PPy NGs具有良好的光热稳定性。另外，根据图4c中的升温冷却曲线，得到附图4d冷却时间与驱动温度的自然对数的相反数之间的关系，经线性拟合可知HA@PPy NGs的热传递系数为149s，根据公式计算出其光热转换效率为52.7％。
表1.本发明采用不同分子量HA、负载不同比例的PPy时制备得到的HA@PPy NGs，其水动力学粒径和zeta电势变化情况。
表1：
Figure BDA0002371924600000111
实施例3
载药纳米凝胶HA/DOX@PPy NGs(350kDa,HA:Py＝1:0.46)的药物释放结果如图5a所示。分别选择pH＝5.0的柠檬酸缓冲液和pH＝7.4的磷酸盐缓冲液作为缓释媒介，考察DOX在不同pH环境下的释放性能。首先称取1mg HA/DOX@PPy NGs溶解于1mL对应的缓冲液中，分别置于MWCO＝14000的纤维素膜透析袋内，扎紧透析袋后将其悬浮于装有9mL PBS溶液(pH＝7.4)或柠檬酸缓冲液(pH＝5.0)的50mL离心管中，离心管中的溶液总体积为10mL，每个样品3个平行，然后分别置于37℃恒温摇床中振荡。在设定好的时间点取1mL缓释液于EP管中，测其在490nm处的UV-Vis吸收值，同时再加入1mL新的缓冲液，保持溶液的总体积不变。根据释放出来的DOX吸光值以及free-DOX在对应缓冲液下的浓度-吸光值标准曲线，求出DOX在不同时间点累计释放的药物总量，分析药物的释放动力学特征。其释放曲线参见图5a，从图中可以看出，在pH＝7.4时，DOX的累积释放量只有21％，而在与肿瘤微环境接近的弱酸性条件(pH＝5.0)下，DOX的累积释放量可以增加到53.5％。
实施例4
巨噬细胞(RAW264.7，来自中国科学院细胞库)对载药纳米凝胶HA/DOX@PPy NGs的吞噬情况参见附图5c(孵育浓度为含20μg/mL DOX的HA/DOX@PPy NGs)、5d(孵育时间为4h)。不同浓度的HA/DOX@PPy NGs(0,10,20,40μg/mL DOX)分别与巨噬细胞共孵育一定时间(0,1,2,4,6,8h)后，去掉含材料的培养基，用PBS清洗2-3次，然后将消化下来的细胞通过冻融破碎法，反复三次冻融使细胞彻底破裂以释放出吞噬的DOX，在1500rpm转速下离心5min，去掉沉淀取上清液测试其在490nm处DOX的UV-Vis吸收值。根据预先绘制的free-DOX的浓度-吸光值标准曲线，计算吞噬的DOX随孵育时间和孵育浓度的变化。从附图5c和5d中看到巨噬细胞吞噬材料的量随着孵育时间和孵育浓度的增加而增加，在20μg/mL DOX，4h孵育条件时，巨噬细胞的平均吞噬量达到8.58μg/mL DOX。
实施例5
载药纳米凝胶的负载对巨噬细胞载体是否影响通过CCK-8细胞活力实验和Transwell迁移实验进行了验证。附图5b为Free-DOX和HA/DOX@PPy NGs对巨噬细胞的细胞活力影响，在细胞活力实验中，以10000/孔的密度将巨噬细胞种于96孔板中，加入含有1％双抗和10％FBS的DMEM培养液，于37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。然后去掉旧培养基，换成含有Free-DOX和HA/DOX@@PPy NGs的培养基，并控制DOX终浓度分别为0μg/mL、5μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、80μg/mL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，随后加入含10％的CCK-8(10μL)的DMEM培养基，在培养箱继续培养2～4h。最后用酶标仪测试450nm处每孔的吸光度，其中以PBS处理的细胞作为空白对照，细胞活力记为100％，结果如图5b所示，从CCK-8结果看到，free-DOX在5μg/mL浓度下即对巨噬细胞产生了明显的毒性作用，而载药纳米凝胶HA/DOX@PPy NGs在DOX浓度达到20μg/mL时其细胞活力仍可维持在80％以上。附图5e-5j则为巨噬细胞向4T1肿瘤细胞的Transwell迁移实验，如图5f中Transwell迁移实验示意图所示，在小室的上室接种5*104个/孔的巨噬细胞，下室接种5*104个/孔4T1细胞，并用不含4T1细胞的空白培养基作为对照，在37℃,5％CO2的培养箱中共培养18h。孵育结束后，去掉培养基，用0.1％的结晶紫溶液对上室的巨噬细胞进行染色，然后用PBS小心清洗2-3次，再用润湿的棉签轻轻擦去上室上面未穿过的细胞。最后用倒置相差显微镜拍照、计数。从附图5e的统计数据和5g-5j的照片可以看出，4T1肿瘤细胞的存在可以诱导巨噬细胞向下室迁移，而且吞噬材料后的巨噬细胞MAHA与未吞噬材料的巨噬细胞MAs相比，其向4T1细胞的迁移能力未受到明显的影响。
实施例6
吞噬材料前后的巨噬细胞在体外的光热升温特性参见说明书附图6a-6c。首先将巨噬细胞与含有HA/DOX@PPy NGs(DOX浓度为20μg/mL)的培养基在37℃、5％CO2的培养箱中培养4h，然后去掉培养基，用PBS清洗2-3次，消化细胞、离心、计数，然后分别取5*106和9*106个细胞(MAHA)重悬于含300μL PBS的小EP管中，等量未吞噬材料的巨噬细胞MAs作为对照。采用808nm激光在不同功率(1W/cm2,1.5W/cm2)下照射MAs和MAHA细胞，持续照射5min，得到的升温曲线如图5a(1W/cm2)和5b(1.5W/cm2)，利用红外热成像仪记录的热成像照片如图5c。从图中看到，随着激光功率的增加和细胞数量的增多，吞噬材料后的巨噬细胞MAHA产生的光热效果逐渐增强，在1.5W/cm2,9*106细胞量时温度升高了26.7℃。而未吞噬材料时的巨噬细胞MAs只有微小的温度升高(1.5W/cm2,9*106时仅有3.9℃)，PBS对照组则基本未出现温度变化。这说明负载了HA/DOX@PPy NGs的巨噬细胞MAHA具有较好的光热升温效果，有望应用于体内光热治疗。
实施例7
体内热成像实验：在4-6周雌性裸鼠体内构建4T1皮下瘤模型，分别尾静脉注射100μL PBS和溶于100μL PBS的MAs、HA/DOX@PPy、MAHA，其中注射细胞数量为5*106个/只裸鼠，HA/DOX@PPy的注射量与MAHA中吞噬的HA/DOX@PPy保持一致，根据上述巨噬细胞的吞噬量实验得知，在20μg/mL DOX浓度下孵育4h，每个巨噬细胞吞噬DOX量约为8.01-9.15pg/cell，按平均值8.61pg/cell计算得出，5*106个巨噬细胞约吞噬DOX 43.05μg，于是对应的HA/DOX@PPy NGs(DOX载药量为19.2％)注射量约为0.224mg/只裸鼠。然后用808nm激光、在1.5W/cm2功率下照射各组荷瘤小鼠的肿瘤部位，持续照射5min，用红外摄像仪记录肿瘤部位的升温情况，结果如图7所示。从图中看到，巨噬细胞携带载药纳米凝胶组MAHA经808nm激光照射5min后肿瘤部位温度升高了13℃，明显高于其他各组：注射相同量的HA/DOX@PPy组升高了8.6℃，巨噬细胞MAs组升高了6.9℃，PBS组升高了5.1℃。PBS和MAs组的温度升高应该是由于生物体本身吸收激光辐射产生的少量热量造成的。
实施例8
所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的4-6周的雌性裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。按照2×106 4T1细胞/鼠的剂量在裸鼠右腿后上方注射肿瘤细胞。在肿瘤体积达到1cm3左右(大约在注射肿瘤细胞10天后)时将荷瘤裸鼠随机分为5组(PBS组、DOX组、MAs组、HA/DOX@PPy+L组和MAHA+L组)，每组裸鼠数量为6只，此时记作实验开始的第0天，分别尾静脉注射100μL PBS、100μL DOX和溶于100μL PBS的MAs、HA/DOX@PPy及MAHA，注射细胞数量5*106个/只裸鼠，折算HA/DOX@PPy注射量为0.224mg/只裸鼠，free-DOX注射量为43.5μg/只裸鼠。然后用808nm激光、在1.5W/cm2功率下照射肿瘤部位5min。间隔4天给药一次、随后光热治疗一次，总共治疗3次，治疗过程如图8a。小鼠肿瘤体积和小鼠重量每2天测量一次，肿瘤体积以及相对肿瘤体积用下面的公式(1)和(2)分别计算。
肿瘤体积(V)＝a×b2/2 (1)
a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
相对肿瘤体积＝V/V0 (2)
V和V0分别代表给药后的肿瘤体积和给药前的肿瘤体积。
治疗结束后第15天每组选取一只小鼠进行安乐死，取其主要脏器和肿瘤组织做H&E和TUNEL染色，观察不同材料对各组织器官的影响和肿瘤凋亡情况，剩余的小鼠进行存活率研究。附图8b可以看到PBS对照组小鼠的肿瘤体积变化最大，并且与单独的化疗组(DOX组)和未被巨噬细胞吞噬的单独材料组(HA/DOX@PPy+L)相比，巨噬细胞介导的载药纳米凝胶联合光热治疗MAHA+Laser组肿瘤体积变化最小，表现出了最佳的治疗效果。附图8c小鼠存活率实验验证了这一结果，MAHA+Laser组直至40天时仍有2只存活，而其他组到34天时已全部死亡。参照附图8d说明在整个治疗过程中各组小鼠的体重基本保持稳定，无明显变化。附图8e通过H&E和TUNEL染色看出MAHA+Laser组的凋亡最明显，治疗效果最好。可见本发明制备的巨噬细胞介导的负载聚吡咯和阿霉素的纳米水凝胶MAHA表现出了良好的抗肿瘤活性。

Claims (8)

1.一种载药透明质酸纳米水凝胶的制备方法，包括：
（1）透明质酸纳米水凝胶HA NGs中加入催化剂，搅拌，置于冰浴中，然后加入吡咯Py，在冰浴条件下反应3-5 h，透析，冷冻干燥，得到负载聚吡咯的透明质酸水凝胶HA/PPy NGs；
（2）将药物溶液滴加到HA/PPy NGs水溶液中，避光敞口搅拌12-24 h，离心，得到载药透明质酸纳米水凝胶；
其中所述步骤（1）中透明质酸纳米水凝胶HA NGs由下列方法制备：
将透明质酸HA钠盐溶于水中，加入EDC，搅拌，得到HA/EDC溶液；然后将HA/EDC溶液在搅拌条件下逐滴加入到琥珀磺酸二辛钠AOT的二氯甲烷DCM溶液中，搅拌反应10-15 min，得到油包水W/O乳液；
将W/O乳液逐滴滴加到聚乙烯醇PVA水溶液中，继续搅拌15-30 min，形成水包油包水W/O/W双乳液，加入交联剂胱胺二盐酸盐Cys反应1-2 h后，再冰浴超声，然后敞口条件持续搅拌反应过夜，透析，离心，再溶于水中，得到纯化的HA NGs；
其中HA的分子量为48 kDa或320 kDa，其中HA NGs和Py的质量比为1:0.46。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中透明质酸纳米水凝胶HANGs制备方法中的HA与EDC和Cys的投料摩尔比为1:0.5:2；HA水相与DCM油相、PVA水相的体积比为1:4:15 ~ 1:4:30；HA钠盐水溶液的浓度为1 ~ 2 wt%；AOT的DCM溶液的质量百分数为2.5 wt%；PVA水溶液的质量百分数为2 wt%；加入交联剂Cys的质量百分数为1 ~ 3wt%。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中催化剂为六水合三氯化铁FeCl3.6H2O。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中Py的体积和FeCl3.6H2O的质量比为1:5 ~ 1:10μL:mg。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中药物为盐酸阿霉素DOX.HCl；药物溶液的溶剂为甲醇；HA/PPy NGs与盐酸阿霉素的质量比为1:0.2 ~ 1:0.5。
6.一种权利要求 1所述方法制备的载药透明质酸纳米水凝胶，其特征在于，所述水凝胶由透明质酸纳米水凝胶内部原位合成聚吡咯，然后负载药物，获得。
7.一种巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶，其特征在于，巨噬细胞MAs包覆权利要求1所述方法制备的载药透明质酸纳米水凝胶。
8.一种权利要求7所述巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶在制备化疗和光热治疗协同增强抗肿瘤药物中的应用。
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