CN114159560A - Gsh与ph双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法及应用 - Google Patents

Gsh与ph双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送递送载体的制备方法及应用，以解决肿瘤单一治疗疗效低、化疗毒副作用大、药物递送不可控等问题，为肿瘤的治疗提供新的技术方法。本发明以可降解树状介孔硅为核心，通过在介孔硅表面进行聚多巴胺（PDA）和聚乙二醇（PEG）的修饰，得到具有GSH、PH、光热响应的药物载体（DDMSNs‑NH2‑PEG），装载抗肿瘤药物（如DOX）后，使其具有化疗‑光热协同治疗的作用。本发明方法简单，易于生产，操作简单，反应条件温和，所构建药物递送系统，生物兼容性良好，响应性与联合效应显著，具备实际应用价值，经济和社会效益显著。

Description

GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方 法及应用
技术领域
本发明涉及化学、材料与生物学科交叉领域，特别是一种GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法及应用。
背景技术
恶性肿瘤是世界上死亡率最高的疾病之一。化疗、放疗、光动力治疗（PDT）、光热治疗（PTT）、免疫治疗等肿瘤治疗方法的研究进展迅速，已被应用于肿瘤的临床治疗。化疗作为最常见的抗肿瘤方法，被广泛应于临床。然而化疗的特异性低，副作用大，且易产生多药耐药，对患者的身体和精神都造成很大的伤害。尽管在过去的 20 年里肿瘤的治疗已经取得了很大的进展，但仍存在很多的问题，为了提高抗肿瘤药物的治疗效果，降低其带来的一系列副作用，减少患者的痛苦，迫切需要寻求新的治疗方法。
光热治疗作为一种很有前途的癌症治疗策略，具有疗效高、无创、对正常组织无损伤等优点。PTT利用纳米材料的光热转换性能，可将光能转化为热能，有效抑制肿瘤增殖。聚多巴胺（PDA）是一种生物材料，具有制备工艺简单、生物相容性好、粘附性强、易功能化、光热转换效率高等特点。PDA修饰作为一种简单而通用的材料表面功能化方法，受到越来越多的关注，在药物传递与显像、化疗与其他治疗或诊断方法相结合如PTT、光声成像、磁共振成像（MRI）等领域被广泛研究。PDA固有的光热转换特性，在近红外（NIR）光照下可以产生许多的热量，从而杀死肿瘤细胞。然而，热疗的不均匀分布和间歇性，由于生物组织对光的散射和吸收，仅通过PTT很难完全破坏肿瘤组织。
随着纳米技术的发展，纳米材料逐渐被应用到生物医学领域，在肿瘤治疗方面表现出很大的潜力。由于纳米粒子合适的粒径，可以从肿瘤内皮组织周围的血管中逃逸出来，通过增强通透性和保留（EPR）效应有效地外渗到肿瘤组织中，被动靶向肿瘤。纳米药物递送系统（DDS）是将抗肿瘤药物包埋在纳米材料内部，从而提高药物的溶解度，减少循环过程的泄露，增强对肿瘤的特异性作用。最近的研究表明，纳米载药系统常常受到肿瘤组织环境（乏氧、微酸性、间质高压、免疫耐受）的影响，难以达到预期的效果。刺激响应型载体能够根据环境的变化来改变其特性从而促进纳米载药载体与靶细胞或组织之间的相互作用，克服组织屏障。
不同于各种传统二氧化硅材料，树枝状介孔硅具有较高的比表面积，较大的内部表面可及性，可调节的孔径、孔隙体积和更高的稳定性。自发现以来，树枝状介孔硅在催化、能量存储、超灵敏传感器和生物医学方面都有卓越的表现。树枝状介孔硅（DMSNs）具有很高的生物相容性，且因其较大的孔径适合携带、运输和传递 DNA 与基因等生物大分子。
以纳米材料为载体，进行表面修饰提高载体的响应性、生物相容性和靶向性，使纳米药物载体兼具化疗、光热治疗等功能，构建肿瘤微环境响应及联合治疗的药物递送系统，将成为肿瘤治疗的有效解决方案。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的提供一种GSH与PH双响应、化疗与光热治疗联合治疗药物递送载体的制备方法和应用，以解决肿瘤单一治疗疗效低、化疗毒副作用大、药物递送不可控等问题，为肿瘤的治疗提供新的技术方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，包括以下步骤：
（1）氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2的制备：以表面活性剂为结构导向剂，加入硅源和催化剂，采用一锅法合成可降解树枝状介孔硅DDMSNs，然后将降解树枝状介孔硅DDMSNs在惰性气体或氮气保护下进行氨基化反应，经后处理得到氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2；
（2）药物加载：将氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2分散在含有药物的混合溶液中，室温下避光搅拌一定时间，载药结束后，离心回收得到加载药物后的树枝状介孔硅；
（3）聚多巴胺PDA的包覆：将加载药物后的树枝状介孔硅分散在缓冲液中，然后加入多巴胺 DA，在室温下搅拌反应得到PDA包裹的载体，离心回收，并用去离子水洗涤除去多余的多巴胺，干燥后得到聚多巴胺包覆的树枝状介孔硅药物载体DDMSNs-NH2-PDA；载体表面的多巴胺修饰对载体的光热效应和药物释放都有很大的关系，当多巴胺层较厚时，药物释放很难从载体中释放出来，当多巴胺层较薄时，光热效应有难以达到预期结果；
（4）PEG表面修饰：将步骤（3）得到的聚多巴胺包覆的树枝状介孔硅药物载体DDMSNs-NH2-PDA分散于缓冲液中，然后加入PEG-NH2，室温搅拌反应，反应结束后离心回收材料，并用去离子水洗涤除去所有未反应的试剂，干燥得到药物递送载体DDMSNs-NH2-PDA-PEG。
进一步，氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2的制备方法如下：以表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为结构导向剂，硅酸四乙酯（TEOS）和双［3-（三乙氧基硅）丙基］-四硫化物为硅源（BTES），三乙醇胺（TEA）为催化剂，采用一锅法合成DDMSNs，将DDMSNs超声分散到无水甲苯中，然后逐滴加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)得到混合溶液，在N2保护下，将混合溶液在油浴锅中回流反应，反应结束后，离心、洗涤、干燥得到氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2。
进一步，一锅法合成DDMSNs的方法如下：
将0.034 g TEA和12.5 mL的去离子水加入到100 mL圆底烧瓶中，在80 °C的油浴锅中均匀地磁力搅拌0.5 h，然后加入0.19 g CTAB和0.042 g水杨酸钠（NaSal），继续搅拌1h，待CTAB和NaSal完全溶解，逐滴加入1 mL TEOS和0.8 mL BTES的混合溶液，继续搅拌12h，反应结束后，20000 rpm离心10 min，回收产物，并用乙醇洗涤3次，最后，将淡黄色粉末在40 °C的真空干燥箱中干燥6 h，将干燥后的产物分散在盐酸-乙醇（v/v，1:10）溶液中，在80°C下回流6 h，重复操作三次，除去模板CTAB，回流结束后，用蒸馏水洗至中性，然后在室温下真空干燥过夜。
进一步，氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2的制备方法如下：将50 mg的DDMSNs超声分散到20 mL无水甲苯中，然后逐滴加入200 μL的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)，在N2保护下，将混合溶液在油浴锅中120℃回流12 h，反应结束后，在20000 rpm的转速下离心10 min，之后用无水乙醇洗涤三次，真空干燥过夜得到氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2。
进一步，所述步骤（2）中的药物为阿霉素DOX，混合溶液由水和磷酸盐缓冲液组成，其中水与磷酸盐缓冲液体积比为1:9，浓度为0.2-0.5 mg/mL，离心速率为20000 rpm，离心时间为10 min。
进一步，所述步骤（3）中缓冲溶液为Tris-HCl溶液，pH值为8-10，摩尔浓度为10mM，载体与聚多巴胺的质量比为1:（1-6），搅拌时间为2-6 h。
进一步，所述步骤（4）中缓冲溶液为Tris-HCl溶液，pH值为8-10，摩尔浓度10 mM，加入聚多巴胺包覆的树枝状介孔硅药物载体后的缓冲溶液浓度为0.5-2 mg/mL，聚多巴胺包覆的树枝状介孔硅药物载体与PEG-NH2的质量比为（4-1）:（1-2），PEG-NH2的MW=3000-20000；室温搅拌反应的时间为1-6 h。
利用本发明所述的GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法制得的药物递送载体。
本发明所述的药物递送载体用于构建GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送系统。
本发明所述的GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送系统在肿瘤治疗中的应用。
本发明GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体典型的制备方法如下：
（1）可降解树枝状介孔硅（DDMSNs-NH2）的制备：
以表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为结构导向剂，硅酸四乙酯（TEOS）和双［3-（三乙氧基硅）丙基］-四硫化物为硅源（BTES），三乙醇胺（TEA）为催化剂，采用一锅法合成DDMSNs。将0.034 g TEA和12.5 mL的去离子水加入到100 mL圆底烧瓶中，在80℃的油浴锅中均匀地磁力搅拌0.5 h。然后加入0.19 g CTAB和0.042 g水杨酸钠（NaSal），继续搅拌1 h。待CTAB和NaSal完全溶解，逐滴加入1 mL TEOS和0.8 mL BTES的混合溶液，继续搅拌12 h。反应结束后，20000 rpm离心10 min，回收产物，并用乙醇洗涤3次，最后，将淡黄色粉末在40 °C的真空干燥箱中干燥6 h。将干燥后的产物分散在盐酸-乙醇（v/v，1:10）溶液中，在80 °C下回流6 h，重复操作三次，除去模板CTAB。回流结束后，用蒸馏水洗至中性，然后在室温下真空干燥过夜。将50 mg的DDMSNs超声分散到20 mL无水甲苯中，然后逐滴加入200 μL的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)。在N2保护下，将混合溶液在油浴锅中120 °C回流12h。将氨基化的树枝状介孔硅在20000 rpm的转速下离心10 min，之后用无水乙醇洗涤三次，真空干燥过夜得到DDMSNs-NH2。氨基修饰的不可降解树枝状介孔硅（DMSNs-NH2）按照同样的方法进行制备。
（2）药物加载：
将（1）得到的DDMSNs-NH2分散在含有药物的溶液中，是载体和药物（如DOX）达到合适的比例，室温下避光搅拌一定时间。载药结束后，离心回收载体（如DDMSNs-NH2-DOX），收集上清。然后用PBS洗涤，收集所有上清，用紫外可见分光光度计在测量上清溶液中药物的含量，计算载药量。
（3）聚多巴胺的包覆：
载体表面的多巴胺修饰对载体的光热效应和药物释放都有很大的关系，当多巴胺层较厚时，药物释放很难从载体中释放出来，当多巴胺层较薄时，光热效应有难以达到预期结果。通过反应时间的控制，制备不同聚多巴胺修饰的载体。将（2）加载药物后的树状介孔硅分散在Tris-HCl缓冲液（pH 8-10，10 mM）中。然后加入 DA溶液是载体和DA的质量比1：1至1：6之间，在室温下分别搅拌2-6 h。最后将PDA包裹的载体（如DDMSNs-NH2-DOX-PDA）离心回收，并用去离子水洗涤除去多余的多巴胺。60℃干燥，得到黑色的聚多巴胺修饰的介孔硅药物载体（如DDMSNs-NH2-DOX-PDA）。收集上清，测量上清的吸光度值。对照组DMSNs进行同样修饰，得到DMSNs-DOX-PDA。
（4）PEG表面修饰。
将（3）得到的载体（如DDMSNs-NH2-DOX-PDA）分散于Tris-HCl缓冲液（pH 8-10，10mM）中，使其浓度0.5-2 mg mL-1。然后加入PEG-NH2（MW3000-20000）溶解在Tris-HCl缓冲液中使载体与PEG的质量比为4:1至1:2，室温搅拌1-6 h。最后以15000 rrpm的转速离心15min回收材料，并用去离子水洗涤3次，除去所有未反应的试剂，干燥得到药物递送载体（如DDMSNs-NH2-DOX-PDA- PEG）。收集所有上清，测量上清在的吸吸光度值，并计算载药量。
本发明的有益效果：本发明以可降解树状介孔硅为载体核心，装载抗肿瘤药物（如DOX）后，通过在介孔硅表面进行热敏材料如聚多巴胺（PDA）和表面改性如聚乙二醇（PEG）的修饰，得到具有GSH与PH双重响应及光热转化效应的药物载体，且具有化疗-光热协同治疗的作用。本发明构建的药物递送系统有以下特点：（1）纳米药物载体，结构较为规则，微球粒径主要在100-200 nm，比较有利于药物载体的体内转运及在肿瘤部位聚集及胞内上载。（2）树状介孔硅含有四硫键结构具有GSH响应性能，可被GSH降解分裂成碎片结构，能有效降低载体在体内的长时间蓄积而引发的生理毒性。（3）药物载体外层PDA可吸收近红外将其转化为热量，且PDA可在酸性条件下分解，使得药物载体的在肿瘤微酸环境下打开孔道释放药物，PDA赋予载体光热转换和PH响应的性能。（4）药物载体表面PEG的修饰，能够增强药物载体的分散性及生物相容性。
本发明方法简单，易于生产，操作简单，反应条件温和，所构建药物递送系统，生物兼容性良好，响应性与联合效应显著，具备实际应用价值，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明实施例3制备的药物载体的电镜照片SEM图：（a）DDMSNs-NH2、（b）DDMSNs-NH2-PDA和（c）DDMSNs-NH2-PDA-PEG。
图2为本发明实施例3制备的药物载体Zeta电势图：a、b、c和d分别为DDMSNs、DDMSNs-NH2、DDMSNs-NH2-PDA和DDMSNs-NH2-PDA-PEG。
图3为本发明实施例3制备的药物载体光热效应表征(a)不同浓度（0.1、0.2、0.5和1 mg mL-1）DDMSNs-NH2-PDA-PEG悬浮液在808 nm激光照射下的升温曲线（2 W cm-2）。(b)2mL 1mg mL-1的DDMSNs-NH2- PDA-PEG悬浮液在连续四次开/关照射下的温度变化。
图4为本发明实施例3制备的药物载体的药物释放曲线(a)为DDMSNs-NH2-DOX-PDA-PEG在不同释药条件下的药物释放结果。(b)光热模拟条件下，DDMSNs-NH2-DOX- PDA-PEG。
图5为本发明实施例3制备的药物载体的溶血实验评价；分别为不同浓度（1、5、25、50、100、200、250和500 μg mL-1）的(a) DDMSNs-NH2-PDA和(b) DDMSNs-NH2- PDA-PEG。数据显示为平均值±SD（n=3）。
图6为本发明实施例3制备的药物载体的细胞毒性实验，(a) 为 DOX和DDMSNs-NH2-DOX- PDA-PEG不同浓度下的细胞毒性实验结果；(b) 为细胞活性实验结果和图片。Ⅰ（PBS）、Ⅱ（DOX）、Ⅲ（DDMSNs-NH2-DOX- PDA-PEG）、Ⅳ（DDMSNs-NH2-DOX- PDA-PEG +NIR）。数据显示为平均值±SD（n=3）。
图7为本发明实施例3制备的药物载体的细胞定位、成像实验DDMSNs-NH2-DOX-PDA-PEG以10 μg mL-1 DOX处理4T1细胞不同时间的CLSM图像（a）和溶酶体共定位成像（b）。DAPI、DOX和Lyso-Blue 的荧光被标记为蓝色、绿色和蓝色。标尺：10 μm。
图8为本发明制备的药物载体的流式细胞实验是DDMSNs-NH2-DOX- PDA-PEG处理不同时间的吞噬效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
一种GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2的制备：
以表面活性剂CTAB为结构导向剂，TEOS和BTES为硅源，TEA为催化剂，采用一锅法合成DDMSNs。将0.034 g TEA和12.5 mL的去离子水加入到100 mL圆底烧瓶中，在80 °C的油浴锅中均匀地磁力搅拌0.5 h。然后加入0.19 g CTAB和0.042 g NaSal，继续搅拌1 h。待CTAB和NaSal完全溶解，逐滴加入1 mL TEOS和0.8 mL BTES的混合溶液，继续搅拌12 h。反应结束后，20000 rpm离心10 min，回收产物，并用乙醇洗涤3次，最后，将淡黄色粉末在40 °C的真空干燥箱中干燥6 h。将干燥后的产物分散在盐酸-乙醇（v/v，1:10）溶液中，在80℃下回流6 h，重复操作三次，除去模板CTAB。回流结束后，用蒸馏水洗至中性，然后在室温下真空干燥过夜。将50 mg的DDMSNs超声分散到20 mL无水甲苯中，然后逐滴加入200 μL的APTES。在N2保护下，将混合溶液在油浴锅中120℃回流12 h。将氨基化的树枝状介孔硅在20000 rpm的转速下离心10 min，之后用无水乙醇洗涤三次，真空干燥过夜得到DDMSNs-NH2。氨基修饰的不可降解树枝状介孔硅（DMSNs-NH2）按照同样的方法进行制备。
（2）药物加载：
将50 mg DDMSNs-NH2分散在50 mL 0.2 mg mL-1的DOX溶液中（水：PBS =1:9），室温下避光搅拌12 h。载药结束后，20000 rpm离心10 min，收集上清。然后用PBS洗涤，洗至上清液接近无色，回收得到DDMSNs-NH2-DOX。收集所有上清，用紫外可见分光光度计在488 nm处测量上清溶液中DOX的含量，计算载药量。
（3）聚多巴胺的包裹：
将10 mg DDMSNs-NH2-DOX以1 mg mL-1的浓度分散在Tris-HCl缓冲液（pH 8.5，10mM）中。然后加入10 mg DA溶解成1 mg mL-1的溶液，在室温下搅拌6 h。最后将PDA包裹的DDMSNs-NH2-DOX（DDMSNs-NH2-DOX-PDA）以20000 rpm的转速离心10 min，并用去离子水洗涤3次，除去多余的多巴胺。60℃干燥，得到黑色的聚多巴胺修饰的介孔硅DDMSNs-NH2-DOX-PDA。收集上清，测量上清在488 nm处的吸光度值。对DMSNs进行同样修饰，得到DMSNs-DOX-PDA。
（4）PEG表面修饰：
将（3）得到的聚多巴胺修饰的介孔硅DDMSNs-NH2-DOX-PDA分散于Tris-HCl缓冲液（pH 8.5，10 mM）中，使其浓度0.5 mg mL-1。然后加入PEG-NH2（MW3000）溶解在Tris-HCl缓冲液中使聚多巴胺修饰的介孔硅DDMSNs-NH2-DOX-PD与PEG-NH2的质量比为4:1，室温搅拌6 h。最后以15000rpm的转速离心15 min回收材料，并用去离子水洗涤3次，除去所有未反应的试剂，干燥得到药物递送载体DDMSNs-NH2-DOX-PDA- PEG。收集所有上清，测量上清在的吸吸光度值，并计算载药量。
实施例2
一种GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2的制备同实施例1。
（2）药物加载：
将50 mg DDMSNs-NH2分散在50 mL 0.3 mg mL-1的DOX溶液中（水：PBS =1:9），室温下避光搅拌12 h。载药结束后，20000 rpm离心10 min，收集上清。然后用PBS洗涤，洗至上清液接近无色。收集所有上清，用紫外可见分光光度计在488 nm处测量上清溶液中DOX的含量，计算载药量。
（3）聚多巴胺的包裹：
将10 mg DDMSNs-NH2-DOX以1 mg mL-1的目标浓度分散在Tris-HCl缓冲液（pH 9，10 mM）中。然后加入20 mg DA溶解成2 mg mL-1的溶液，在室温下分别搅拌4 h。最后将PDA包裹的DDMSNs-NH2-DOX（DDMSNs-NH2-DOX-PDA）以20000 rpm的转速离心10 min，并用去离子水洗涤3次，除去多余的多巴胺。60 °C干燥，得到黑色的聚多巴胺修饰的介孔硅DDMSNs-NH2-DOX-PDA。收集上清，测量上清在488 nm处的吸光度值。对DMSNs进行同样修饰，得到DMSNs-DOX-PDA。
（4）PEG表面修饰：
将（3）得到的载体聚多巴胺修饰的介孔硅DDMSNs-NH2-DOX-PDA分散于Tris-HCl缓冲液（pH 9，10 mM）中，使其浓度2 mg mL-1。然后加入PEG-NH2（MW5000）溶解在Tris-HCl缓冲液中使载体聚多巴胺修饰的介孔硅DDMSNs-NH2-DOX-PDA与PEG-NH2的质量比为2:1，室温搅拌2 h。最后以15000 rpm的转速离心15 min回收材料，并用去离子水洗涤3次，除去所有未反应的试剂，干燥得到药物递送载体DDMSNs-NH2-DOX-PDA- PEG。收集所有上清，测量上清在的吸吸光度值，并计算载药量。
实施例3
一种GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2的制备同实施例1。
（2）药物加载：
将50 mg DDMSNs-NH2分散在50 mL 0.5 mg mL-1的DOX溶液中（水:PBS =1:9），室温下避光搅拌12 h。载药结束后，20000 rpm离心10 min，收集上清。然后用PBS洗涤，洗至上清液接近无色。收集所有上清，用紫外可见分光光度计在488 nm处测量上清溶液中DOX的含量，计算载药量。
（3）聚多巴胺的包裹：
将10 mg DDMSNs-NH2-DOX以1 mg mL-1的目标浓度分散在Tris-HCl缓冲液（pH 10，10 mM）中。然后加入40 mg DA溶解成4 mg mL-1的溶液，在室温下分别搅拌2 h。最后将PDA包裹的DDMSNs-NH2-DOX（DDMSNs-NH2-DOX-PDA）以20000 rpm的转速离心10 min，并用去离子水洗涤3次，除去多余的多巴胺。60 °C干燥，得到黑色的聚多巴胺修饰的介孔硅DDMSNs-NH2-DOX-PDA。收集上清，测量上清在488 nm处的吸光度值。对DMSNs进行同样修饰，得到DMSNs-DOX-PDA。
（4）PEG表面修饰：
将（3）得到的聚多巴胺修饰的介孔硅DDMSNs-NH2-DOX-PDA分散于Tris-HCl缓冲液（pH 10，10 mM）中，使其浓度2 mg mL-1。然后加入PEG-NH2（MW5000）溶解在Tris-HCl缓冲液中使聚多巴胺修饰的介孔硅DDMSNs-NH2-DOX-PDA与PEG-NH2的质量比为1:2，室温搅拌1 h。最后以15000 rpm的转速离心15 min回收材料，并用去离子水洗涤3次，除去所有未反应的试剂，干燥得到药物递送载体DDMSNs-NH2-DOX-PDA-PEG。收集所有上清，测量上清在的吸吸光度值，并计算载药量。
为证明样品制备成功，对所得样品进行相关表征。用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）对载体的形态进行表征。使用 Zeta 粒径仪对载体的表面电荷进行测定。通过傅立叶变换红外光谱法（FTIR）对合成样品的官能团进行表征。使用紫外分外光度计和荧光分光光度计对载体进行的光学性质进行评价。对制备的药载进行体外模拟释放评价、光热效应表征。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）用来进行药物载体的细胞摄取和共定位研究。通过酶标仪进行细胞毒性试验。
本发明方法经多次反复实验均取得了一致的结果，相关应用试验资料如下：
实验1
将上述实施例3制备的药物载体，用电镜表征如图1所示，粒径分布均匀、形貌可控适于规模化生产。图2所示载体表面电势变化显著，证明表面修饰成功；图3显示所构建药物载体有良好的光热响应（27.4%）。
实验2
将制得的药物载体在不同条件下进行体外模拟释放研究，如图4所示制备的递药系统GSH和PH响应性显著，且在红外光照射可以显著性加速药物释放，证明递药系统对红外光808nm响应性良好。
实验3
将制得的药物载体进行溶血实验评价，如图5所示制备的递药系统具有良好的血液兼容性。
实验4
将制得的药物载体进行细胞毒性评价，如图6所示制备的递药系统对肿瘤细胞4T1有良好的杀灭效率，且辅助红外光808照射，对细胞4T1的杀灭效率显著增加，药物上载浓度为10 μg mL-1联合808nm激光照射细胞淬火率仅为24.7%。
实验5
将制得的药物载体进行细胞定位、荧光成像评价，通过激光共聚焦荧光成像考察药物递送载体在细胞的上载、转运路径，如图7所示所制备递药系统胞内上载率要高于自由药物。
实验6
将制得的药物载体通过流式细胞评价，考察药物递送载体在细胞的上载率，如图8所示所制备递药系统胞内2h上载率可以达94.21%。
PDA的包封赋予载体光热转换的能力，PEG的表面修饰，能够增强载体的生物相容性。光热实验表明DDMSNs-NH2- PDA-PEG具有良好的光热转换能力（27.4%），能够满足光热治疗的需要。DDMSNs-NH2-DOX- PDA-PEG的体外药物释放实验显示，DOX的药物释放曲线呈现出明显的GSH、pH和光热响应的释放趋势。在一定浓度范围内（5-500 μg mL-1），DDMSNs-NH2-PDA-PEG的溶血率低于2.4%，DDMSNs-NH2- PDA-PEG对不同蛋白（BSA、OVA、HSA和混合蛋白）的蛋白吸附量保持在110-138 μg mg -1，血液兼容性实验表明载体有良好的生物相容性。流式细胞术结果显示DDMSNs-NH2-DOX- PDA-PEG在2 h的细胞摄取效率能够达到94.21%，表明DDMSNs-NH2-DOX- PDA-PEG具有较高的细胞摄取效率。在DOX浓度为10 μg mL-1时，DDMSNs-NH2-DOX- PDA-PEG和DOX对4T1细胞具有相似的细胞存活率（32.8%和35.6%），且在光照条件下4T1细胞的细胞存活率为24.7%。细胞毒性结果表明，与单独化疗相比，化疗-光热疗法联合治疗可显著增强肿瘤抑制作用。DDMSNs-NH2-DOX- PDA-PEG良好的生物相容性和细胞毒性，在化疗-光热联合癌症治疗中具有很大的潜力。
本发明提供了一种GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送系统构建方法。药物递送载体的制备方法简单，成本较低，节能环保，反应条件温和，易于实际生产。本发明可以解决肿瘤单一治疗疗效低、化疗毒副作用大、药物递送不可控等问题，为肿瘤的治疗提供新的技术方法，经济和社会价值显著。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2的制备：以表面活性剂为结构导向剂，加入硅源和催化剂，采用一锅法合成可降解树枝状介孔硅DDMSNs，然后将降解树枝状介孔硅DDMSNs在惰性气体或氮气保护下进行氨基化反应，经后处理得到氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2；
（2）药物加载：将氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2分散在含有药物的混合溶液中，室温下避光搅拌一定时间，载药结束后，离心回收得到加载药物后的树枝状介孔硅；
（3）聚多巴胺PDA的包覆：将加载药物后的树枝状介孔硅分散在缓冲液中，然后加入多巴胺 DA，在室温下搅拌反应得到PDA包裹的载体，离心回收，并用去离子水洗涤除去多余的多巴胺，干燥后得到聚多巴胺包覆的树枝状介孔硅药物载体DDMSNs-NH2-PDA；
（4）PEG表面修饰：将步骤（3）得到的聚多巴胺包覆的树枝状介孔硅药物载体DDMSNs-NH2-PDA分散于缓冲溶液中，然后加入PEG-NH2，室温搅拌反应，反应结束后离心回收材料，并用去离子水洗涤除去所有未反应的试剂，干燥得到药物递送载体DDMSNs-NH2-PDA-PEG。
2.根据权利要求1所述的GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，其特征在于：以表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵为结构导向剂，硅酸四乙酯和双［3-（三乙氧基硅）丙基］-四硫化物为硅源，三乙醇胺为催化剂，采用一锅法合成DDMSNs，将DDMSNs超声分散到无水甲苯中，然后逐滴加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷得到混合溶液，在N2保护下，将混合溶液在油浴锅中回流反应，反应结束后，离心、洗涤、干燥得到氨基修饰的可降解树枝状介孔硅DDMSNs-NH2。
3.根据权利要求1所述的GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的药物为阿霉素DOX，混合溶液由水和磷酸盐缓冲液组成，其中水与磷酸盐缓冲液体积比为1:9，浓度为0.2-0.5 mg/mL，离心速率为20000 rpm，离心时间为10 min。
4.根据权利要求1所述的GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，其特征在于：缓冲溶液为Tris-HCl溶液，pH值为8-10，摩尔浓度为10 mM。
5.根据权利要求1所述的GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中加载药物后的树枝状介孔硅与多巴胺的质量比为1:（1-6），搅拌时间为2-6 h。
6.根据权利要求1所述的GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中加入聚多巴胺包覆的树枝状介孔硅药物载体后的缓冲溶液浓度为0.5-2 mg/mL，聚多巴胺包覆的树枝状介孔硅药物载体与PEG-NH2的质量比为（4-1）:（1-2）。
7.根据权利要求1所述的GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中PEG-NH2的MW=3000-20000；室温搅拌反应的时间为1-6 h。
8.根据权利要求1-7任一所述的GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送载体的制备方法制得的药物递送载体。
9.根据权利要求8所述的药物递送载体用于构建GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送系统。
10.根据权利要求9所述的GSH与PH双响应、化疗与光热联合治疗药物递送系统在肿瘤治疗中的应用。
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