CN117379538A - 一种磁驱动肿瘤抗原捕获系统的构建以及其在肿瘤原位疫苗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁驱动肿瘤抗原捕获系统的构建以及其在肿瘤原位疫苗中的应用。该磁驱动肿瘤抗原捕获系统包括磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子(Fe3O4@Ca/MnCO3/PROTAC)和磁化的DC细胞；其中，磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子用于特异性杀伤肿瘤细胞，释放肿瘤抗原，并原位构建磁化的肿瘤抗原；在磁场驱动下，磁化的DC细胞主动摄取磁化的肿瘤抗原，从而提高抗原捕获和递呈效率，增强疫苗效应。因此，本发明中的磁驱动肿瘤抗原捕获系统可以用于构建肿瘤原位疫苗，用于肿瘤的免疫治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及一种磁驱动肿瘤抗原捕获系统的构建以及其在肿瘤原位疫苗中的应用。
背景技术
近年来，肿瘤原位疫苗的兴起，为解决常规肿瘤疫苗局限性提供了新思路。肿瘤原位疫苗，是指原位杀伤肿瘤细胞，释放肿瘤抗原，被抗原递呈细胞(APC)摄取、加工并递呈给T淋巴细胞，引发特异性抗肿瘤免疫应答。肿瘤原位疫苗，克服了常规肿瘤疫苗的弊端，具有简单、省时、经济、安全、循环性、普适性和动态性等显著优势，成为目前研究热点。近几年，肿瘤原位疫苗研究工作，主要聚焦于：(1)如何引发肿瘤细胞免疫原性死亡，增强其免疫原性；(2)如何逆转免疫抑制性肿瘤微环境。然而，针对肿瘤原位疫苗的这些努力，仍未能解决肿瘤复发和转移问题。究其原因，疫苗级联免疫应答过程复杂、受困于多重限制性因素、而导致效率低下。重新审视肿瘤原位疫苗免疫应答的其他环节发现，在复杂的肿瘤微环境中，作为疫苗免疫应答初始环节的“抗原捕获和递呈”效率低下，严重阻碍了进一步的免疫应答。在肿瘤细胞死亡过程中释放的游离抗原，易于快速清除，淋巴结靶向递送效率有限，又缺乏APC进行原位捕获。因此，仅通过释放抗原，难以有效激活抗肿瘤免疫应答。在复杂的肿瘤微环境中，如何提高抗原捕获和递呈效率，对于启动特异性抗肿瘤免疫应答至关重要。
围绕“如何提高APC对肿瘤抗原的捕获和递呈”，国内外研究人员开展了一些工作。一方面，提出了几种通过“被动靶向引流淋巴结”改善肿瘤抗原捕获和递呈的策略。例如，采用马来酰亚胺基团(MAL)，通过形成稳定的硫醚键与肿瘤释放的大量蛋白抗原结合，并递送至引流淋巴结，改善抗原呈递。采用带正电荷树枝状聚酰胺胺(PAMAM)与肿瘤抗原之间形成的离子键捕获释放的肿瘤抗原，并将其送达引流淋巴结。构建一种核-壳结构的纳米伴侣蛋白，模拟热休克蛋白，通过独特的疏水微结构域有效捕获肿瘤抗原。采用包封了佐剂R848的聚磷酸酯纳米颗粒(约35nm)，捕获释放的肿瘤抗原蛋白，递送到引流淋巴结。然而，采用“被动靶向”引流淋巴结方式，对抗原复合物的尺寸和电荷等要求极其严格。目前普遍认为，仅小粒径(<100nm)、带中性或负电荷的纳米粒子，适于穿过组织屏障到达淋巴结。大颗粒肿瘤抗原(如肿瘤细胞膜)无法通过被动扩散到达淋巴结。此外，由于肿瘤组织脉管系统发达且渗漏性增强，游离的小尺寸抗原易于快速进入脉管系统而流失。另外，研究人员还提出了水凝胶三维网络结构捕获肿瘤抗原的策略。例如，采用粘附性水凝胶，捕获释放的肿瘤抗原，持续释放抗原，招募APC。通过在肿瘤转移灶原位形成凝胶，采用儿茶酚基团捕获肿瘤抗原，达到持续的免疫刺激，招募APC。这种水凝胶三维网络能将肿瘤抗原滞留在肿瘤部位，但肿瘤部位缺少足够数量和活力的APC前来捕获，因此仍无法实现有效抗原递呈。
综上，研究人员已充分认识到通过提升抗原递呈改善疫苗效应的重要性。然而，提升抗原递呈，仅通过对肿瘤抗原进行加工，“被动”扩散到淋巴结或“被动”等待APC前来捕获，难以实现预期效果。因此，针对肿瘤细胞死亡过程中释放的大量抗原，若有数量足够、活力足够的APC，“原位捕获”肿瘤抗原，将增强疫苗效应。然而，免疫抑制性肿瘤微环境限制了APC等免疫细胞的数量和活性。在肿瘤的免疫抑制性微环境中，主要的APC，包括树突状细胞(DC)和巨噬细胞，其数量和活性都严重受限，阻碍了原位肿瘤抗原捕获及递呈。肿瘤部位DC浸润不足且存在功能障碍。肿瘤部位巨噬细胞，甚至被极化成促肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞。不仅如此，现有肿瘤杀伤方式普遍缺乏靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也严重伤及APC等免疫细胞。因此，为提升肿瘤原位疫苗效应，不能单纯依赖肿瘤部位原有的APC，而且，还需改进肿瘤杀伤方式，仅靶向杀死肿瘤细胞，不损伤APC等免疫细胞。
由上述可见，如能找到特异性的肿瘤细胞杀伤方式，增强肿瘤选择性、降低免疫细胞毒性，可显著提升疫苗效应。近年来，旨在特异性杀伤肿瘤细胞的PROTAC药物，为解决该问题提供了契机。PROTAC药物靶向降解肿瘤关键蛋白，是极具前途的抗癌策略。PROTAC药物进入细胞后，其结构中的目标蛋白配体可特异性结合靶蛋白，而另一端可招募E3泛素化连接酶，特异性泛素化靶蛋白，并通过“蛋白酶体系统”降解靶蛋白，因而具有特异性、靶向性、抗耐药等独特优势。已有研究报道，PROTAC药物，不仅可特异性杀伤肿瘤细胞，还可特异性逆转免疫抑制性肿瘤微环境，有望取代其它非靶向杀伤方式，用于肿瘤原位疫苗构建，最大程度地保护肿瘤部位免疫细胞。但在实际应用中，PROTAC药物存在难溶水以及无法控释的缺点，需要设计合适的载体进行递送。
综上所述，若能提升肿瘤部位APC的数量和活性，并促进其“原位捕获”肿瘤抗原，将增强疫苗效应。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种磁驱动肿瘤抗原捕获系统。
本发明的另一目的在于提供所述磁驱动肿瘤抗原捕获系统的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种磁驱动肿瘤抗原捕获系统，包括磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子(Fe3O4@Ca/MnCO3/PROTAC)和磁化的DC细胞(M-DC)；其中，
所述的磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子通过如下方法制备得到：将Fe3O4@Ca/MnCO3纳米粒子加入到水中，得到Fe3O4@Ca/MnCO3悬浮液；将PROTAC药物加入到有机溶剂中，得到PROTAC溶液；然后将PROTAC溶液加入到Fe3O4@Ca/MnCO3悬浮液中，搅拌混合得到Fe3O4@Ca/MnCO3/PROTAC，即所述磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子；
所述的磁化的DC细胞通过如下方法制备得到：将树突状细胞(DC)与Fe3O4纳米粒子共孵育，使其摄入Fe3O4纳米粒子，得到磁化的DC细胞(M-DC)。
所述的水优选为去离子水。
所述的水的用量为按每毫升水配比1～10mg Fe3O4@Ca/MnCO3纳米颗粒计算；优选为按每毫升水配比5mg Fe3O4@Ca/MnCO3纳米颗粒计算。
所述的PROTAC药物包括ARV-825和THAL-SNS-032等中的至少一种；优选为ARV-825。
所述的Fe3O4@Ca/MnCO3纳米粒子与PROTAC药物的质量比为5～10:1；优选为5:1。
所述的有机溶剂优选为二甲基亚砜(DMSO)。
所述的有机溶剂的用量为按每毫升有机溶剂配比100～500mg PROTAC药物计算；优选为按每毫升有机溶剂配比100mg PROTAC药物计算。
所述的搅拌的时间为0.5～3小时。
所述的树突状细胞优选为骨髓来源树突状细胞(BMDC)；优选为从股骨和/或胫骨中分离提取的骨髓来源树突状细胞(BMDC)。
所述的树突状细胞(DC)的细胞密度为1×105～1×107个/mL。
所述的Fe3O4纳米粒子优选为通过如下方法制备得到：将柠檬酸钾和FeCl3溶解在乙二醇中，并在室温下剧烈搅拌0.5～2小时(优选为1小时)，然后加入乙酸钠搅拌0.5～1小时(优选为0.5小时)，再置于180～220℃下(优选为200℃)进行反应，待反应结束后收集产物，洗涤、冷冻干燥，得到Fe3O4纳米粒子。
所述的反应的时间6～24小时；优选为12小时。
所述的洗涤为采用乙醇和水进行洗涤；优选为采用乙醇和水洗涤三次。
所述的Fe3O4纳米粒子的用量为按其在体系的终浓度为0.1～1mg/mL添加计算；优选为按其在体系的终浓度为0.1～0.75mg/mL添加计算；更优选为按其在体系的终浓度为0.1mg/mL添加计算。
所述的共孵育的时间10～15h；优选为12h。
所述的磁驱动肿瘤抗原捕获系统在制备(构建)肿瘤原位疫苗中的应用。
所述的应用通过如下步骤实现：将上述磁驱动肿瘤抗原捕获系统，即磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子(Fe3O4@Ca/MnCO3/PROTAC)和磁化的DC细胞(M-DC)注射到肿瘤中；其中，磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子(Fe3O4@Ca/MnCO3/PROTAC)可释放PROTAC药物，杀死肿瘤细胞，释放肿瘤抗原，而Fe3O4@Ca/MnCO3可捕获释放的肿瘤抗原，形成磁化的肿瘤抗原；采用磁驱动方式，促进磁化的DC细胞捕获和摄取磁化的肿瘤抗原，从而增强抗原递呈和疫苗效应。
所述的肿瘤包括黑色素瘤等。
所述的磁驱动肿瘤抗原捕获系统的使用方式如下：先注射磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子(Fe3O4@Ca/MnCO3/PROTAC)，然后再注射磁化的DC细胞(M-DC)。
所述的磁驱动肿瘤抗原捕获系统中，用于悬浮磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子(Fe3O4@Ca/MnCO3/PROTAC)和磁化的DC细胞(M-DC)的溶剂优选为PBS缓冲液。
所述的PBS缓冲液的pH值优选为7.4。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明提供了一种磁驱动肿瘤抗原捕获系统，由两部分组成：(1)磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子：用于特异性杀伤肿瘤细胞，释放肿瘤抗原，并原位构建磁化的肿瘤抗原；(2)磁化的DC：用于捕获上述磁化的肿瘤抗原。
2、本发明首次利用PROTAC药物的独特优势，用于构建肿瘤原位疫苗，将其用于肿瘤的免疫治疗；该PROTAC药物可特异性杀伤肿瘤细胞，而不伤及其它细胞，能够最大程度地保护肿瘤部位的免疫细胞，包括APC。
3、本发明采用纳米粒子Fe3O4@Ca/MnCO3作为PROTAC药物的载体，吸附PROTAC药物，制得Fe3O4@Ca/MnCO3/PROTAC，可解决其难溶水以及无法控释的缺点，能够提高PROTAC药物的生物利用度，增强其肿瘤杀伤效果；通过持续缓释PROTAC药物，特异性杀伤肿瘤细胞，引发其免疫原性死亡，释放大量肿瘤抗原。
4、在肿瘤原位疫苗的构建中，本发明首次采用磁性纳米粒子Fe3O4@Ca/MnCO3直接捕获肿瘤细胞死亡过程中释放的肿瘤抗原，原位形成磁化的肿瘤抗原，避免了肿瘤抗原的流失，而且能够进一步吸引磁化的APC前来摄取，且该纳米粒子降解释放的Mn2+，不仅可实现磁共振MRI图像引导的抗原追踪，还可作为免疫佐剂，增强肿瘤抗原免疫原性。
5、本发明首次采用骨髓来源树突状细胞(BMDC)，摄入Fe3O4磁性纳米粒子，形成磁化的DC，用于摄取肿瘤原位形成的磁化的肿瘤抗原，采用磁驱动的抗原捕获策略，提高抗原捕获和递呈效率，增强疫苗效应。
6、本发明制备的磁驱动肿瘤抗原捕获系统，可用于构建高效的肿瘤原位疫苗，其中，将磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子(Fe3O4@Ca/MnCO3/PROTAC)注射到肿瘤部位，持续缓释PROTAC药物，特异性杀伤肿瘤细胞，引发其免疫原性死亡，释放大量肿瘤抗原，磁性纳米粒子Fe3O4@Ca/MnCO3通过吸附肿瘤抗原，原位构建成磁化的肿瘤抗原；将磁化的DC注射到肿瘤部位，在磁场驱动下，主动摄取磁化的肿瘤抗原，从而提升抗原递呈效率，增强疫苗效应。
附图说明
图1是磁驱动肿瘤抗原捕获系统的构建方法及作用机制。
图2是Fe3O4@Ca/MnCO3捕获的抗原OVA在注射部位的驻留情况图；其中，A为注射部位的动物荧光活体成像结果；B为注射部位的平均荧光强度。
图3是Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV(ARV是一种PROTAC药物)的表征结果图；其中，A为Fe3O4@Ca/MnCO3和Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV粒子的磁性检测结果；B为Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV的EDS元素分析结果；C为ARV和Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV粒子的红外分析图谱；D为不同浓度的ARV的紫外吸收图谱；E为不同时间下，Fe3O4/Ca@MnCO3粒子对ARV的负载情况；F为不同时间下，Fe3O4/Ca@MnCO3/ARV粒子在不同pH的PBS中，ARV的释放速率。
图4是磁化DC的表征结果图；其中，A为BMDC与磁化BMDC(M-BMDC)的显微镜图；B为不同浓度Fe3O4纳米粒子下，BMDC细胞活力；C为不同时间下，磁化BMDC与Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV纳米粒子共孵育的显微镜图。
图5是BMDC和磁化BMDC(M-BMDC)对Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV磁性纳米粒子摄取的共聚焦显微镜图。
图6是磁驱动肿瘤抗原捕获系统(Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV+磁化DC)的抗肿瘤动物实验结果图；其中，A为小鼠皮下接种B16肿瘤细胞，然后在第7、11、15和18天用指定的制剂进行原位治疗的接种方案示意图；B为肿瘤图片；C为肿瘤重量；D为肿瘤生长曲线；E为实验鼠体重。
图7是磁驱动肿瘤抗原捕获系统(Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV+磁化的DC)所构建肿瘤原位疫苗的免疫应答结果图；其中，A、B和C分别为血清中抗原特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a水平；D和E分别为脾脏中CD8+/CD4+T细胞比例；F和G分别为脾细胞经抗原再刺激后分泌的细胞因子IFN-γ和IL-4水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明实施例中涉及的Fe3O4@Ca/MnCO3纳米粒子根据中国专利申请(申请号为202111495463.6、名称为“一种磁驱动纳米马达Fe3O4/Ca@MnCO3的制备以及其在DC疫苗中的应用”)中记载的方法制备得到。
本发明实施例中涉及的Fe3O4纳米粒子的制备过程为：首先，将柠檬酸钾(0.4克)和FeCl3(0.65克)溶解在乙二醇(40毫升)中，并在室温下剧烈搅拌1小时。随后，加入乙酸钠(1.2g)并搅拌30分钟。然后，将混合物加入高压反应釜中，并在200℃下反应12小时。最后，收集产物，用乙醇和水洗涤三次，并冷冻干燥储存。
本发明实施例中涉及的PROTAC药物ARV-825购自MedChemExpress公司。
本发明实施例中涉及的卵清蛋白(OVA)购自Sigma公司。
实施例1磁驱动肿瘤抗原捕获系统的制备
一、Fe3O4@Ca/MnCO3捕获的抗原在注射部位的驻留
C57BL/6雌性小鼠(4-6周，18-20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司)随机分为两组(n＝4)，分别将Cy5.5-OVA(Cy5.5荧光标记的OVA，购自西安齐岳生物技术有限公司)和Fe3O4@Ca/MnCO3/Cy5.5-OVA(将5mg Fe3O4/Ca@MnCO3纳米粒子加入到1mL Cy5.5-OVA溶液(300μg，用生理盐水配制)中，室温下100rpm搅拌4h，得到Fe3O4@Ca/MnCO3/Cy5.5-OVA)注射至小鼠腹股沟部位。其中各成分的注射量如下：30μgCy5.5-OVA，500μg Fe3O4@Ca/MnCO3。采用小动物生物发光成像系统，观察注射部位的抗原的荧光强度。
结果如图2所示：模型抗原Cy5.5-OVA被Fe3O4@Ca/MnCO3捕获后，可以更持久地驻留在注射部位。这表明，Fe3O4@Ca/MnCO3捕获了肿瘤细胞死亡过程中释放的肿瘤抗原，可将其保留在肿瘤原位，避免其流失。
二、Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV的制备
本实验选择PROTAC药物ARV-825(简称ARV)，可特异性靶向降解关键癌蛋白BRD4，从而特异性杀伤肿瘤细胞，引发免疫原性死亡。
将5mg Fe3O4@Ca/MnCO3纳米颗粒分散在1mL去离子水中，获得Fe3O4@Ca/MnCO3悬浮液；然后将ARV-825(1mg，溶于10μL二甲基亚砜DMSO中)加入悬浮液中，并搅拌3小时，制得Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV。采用磁铁检测Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV和Fe3O4@Ca/MnCO3的磁性。采用能量分散X射线光谱法(EDS)结合SEM，检测Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV纳米颗粒和ARV的元素分析。检测不同浓度的ARV(ARV的浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0mg/mL)的紫外吸收图谱。使用多功能酶标记仪(BIOTEK，USA)在不同时间下(0、0.5、3、6、24、48、72h)检测溶液中的游离ARV-825，计算其负载率。实验设置三次重复。
将Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV(50μg)纳米颗粒悬浮于100μL具有不同pH值(7.4和5.6)的PBS缓冲液中，并在37℃下振荡(50rpm)。在指定的时间间隔(0、6、12、24、48、60、84h)，离心样品以去除上清液，并分别使用100μL pH值为7.4和5.6新鲜PBS缓冲液重悬，然后采用酶标仪检测悬浮液的荧光强度(FI)，检测ARV-825的释放行为。实验设置三次重复。
结果如图3所示：采用Fe3O4@Ca/MnCO3粒子对ARV进行负载，发现Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV悬浮液呈绿色，并具有磁性(图3A)。元素分析结果显示，负载ARV的Fe3O4@Ca/MnCO3粒子含N元素(图3B)。而且，红外图谱显示，其在1641、1451、1086、869和577cm-1处含有ARV的特征峰(图3C)。这些结果均说明，ARV被Fe3O4@Ca/MnCO3粒子成功负载。鉴于ARV在可见光波长412nm下具有最大吸收(图3D)，采用酶标仪对Fe3O4@Ca/MnCO3粒子的ARV负载速率进行检测，发现5mg Fe3O4@Ca/MnCO3粒子能在0.5h内完全吸附1mg ARV，并可长时间对ARV保持稳定负载(图3E)。释放速率检测结果如图3F所示，Fe3O4@Ca/MnCO3粒子具有pH敏感性，可在微酸缓冲液中缓慢释放ARV。
三、磁化DC的制备及其对Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV磁性纳米粒子的捕获
首先，从健康雌性C57BL/6小鼠(4-6周，18-20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司)的股骨和胫骨分离提取骨髓来源的树突状细胞(BMDC)，培养6d。随后，将未成熟BMDC接种于表面低吸附24孔培养板(1×106cells/孔)中，并使用Fe3O4纳米粒子(终浓度为0.1mg/mL)处理12h。低速离心，去除未被BMDC摄取的Fe3O4纳米粒子，收集处理后的BMDC细胞。随后，采用磁铁分离磁化的BMDC(M-BMDC)，采用普通显微镜观察其形貌。采用CCK8实验，检测磁化DC的生物活性，确定F3O4纳米粒子的安全剂量范围。实验设置三次重复。
结果如图4所示：磁化BMDC的形貌如图4A所示，BMDC可摄取大量黑色Fe3O4纳米粒子。采用CCK8检测不同浓度Fe3O4纳米粒子对BMDC细胞的毒性，结果如图4B显示，浓度低于0.75mg/mL的Fe3O4纳米粒子，对BMDC无明显细胞毒性。本发明采用0.1mg/mL Fe3O4纳米粒子构建磁化BMDC。随后，将磁化BMDC与Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV纳米粒子共孵育，采用显微镜观察发现，磁化BMDC可与Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV磁性纳米粒子聚集在一起(图4C)。
四、体外模拟磁化DC对磁化抗原的捕获
首先，将5mg Fe3O4@Ca/MnCO3纳米颗粒加入到1mL模型抗原蛋白－卵清蛋白(OVA)溶液(1mg/mL，以生理盐水为溶剂)中，并在室温下搅拌，制得Fe3O4@Ca/MnCO3/OVA。然后，用BCA试剂盒在不同时间点检测游离OVA，计算OVA的负载量。所制得的0.05mg Fe3O4@Ca/MnCO3/OVA分别与1×105个BMDC和磁化BMDC(M-BMDC)共孵育6h，溶酶体用Lyso-Tracker Red染色15min，并用多聚甲醛固定细胞。然后，用DAPI染色液将细胞染色5min，在激光共聚焦显微镜下观察。实验设置三次重复。
结果如图5所示，普通BMDC吸收Fe3O4@Ca/MnCO3/OVA纳米粒子的数量较少，而磁化BMDC对Fe3O4@Ca/MnCO3/OVA纳米粒子的吸收数量显著增强，且主要分布在细胞溶酶体中。这应该归因于，磁化BMDC与Fe3O4@Ca/MnCO3/OVA磁性纳米粒子之间存在磁吸作用，增加了二者之间的接触，显著增加BMDC对抗原的捕获。
实施例2磁驱动肿瘤抗原捕获系统用于肿瘤原位疫苗的构建及其抗肿瘤疗效
一、基于磁驱动肿瘤抗原捕获系统构建肿瘤原位疫苗及其抗肿瘤研究
在第0天将B16-OVA肿瘤细胞(购自青旗(上海)生物技术发展有限公司)皮下注射(1×106个细胞/只)到C57BL/6雌性小鼠(4-6周，18-20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司)的背部，待其生长至100mm3左右时进行后续实验。
将100μL生理盐水(NC)、ARV、Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV、Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV+DC(即BMDC)和Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV+M-DC(即M-BMDC)(各成分的制备方法与实施例1相同，溶剂均为生理盐水；各成分的注射量分别为：ARV为100μg/只，Fe3O4@Ca/MnCO3为500μg/只，BMDC和M-BMDC均为1×106个/只；其中，Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV和DC细胞的注射顺序为：先注射Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV，再注射BMDC或M-BMDC)在第7、11、15和18天注射到肿瘤中，并每隔一天测量小鼠的肿瘤体积和体重，肿瘤体积＝(宽2×长)/2。在第22天，采集小鼠的肿瘤、血清和脾脏。实验设置三次重复。
结果如图6所示：将B16-OVA肿瘤细胞进行皮下接种，待其生长至100mm3左右时，瘤内注射药剂，间隔4天给药一次，共计三次(图6A)。肿瘤图片显示，单纯ARV对肿瘤的治疗效果不佳，而经Fe3O4@Ca/MnCO3粒子负载后的Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV能够显著抑制黑色素瘤的生长；Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV进一步联合DC和磁化DC，可更显著地抑制肿瘤生长(图6B和6D)，降低肿瘤重量(图6C)，并未显著改变小鼠体重，维持小鼠正常生长(图6E)。
二、基于磁驱动肿瘤抗原捕获系统构建的肿瘤原位疫苗的免疫应答检测
抗原特异性抗体滴度是检测免疫应答水平的关键指标，可以通过ELISA进行测量。因此，本实验采用ELISA法检测上述血清中肿瘤抗原特异性抗体的滴度。
先将上述脾脏研磨成脾细胞，然后将所得脾细胞接种在12孔板中(5×105个细胞/孔)，并用抗原OVA溶液(25μg/mL，2mL/孔)再刺激60小时。收集细胞上清液，使用ELISA试剂盒检测上清液中细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌水平。实验设置三次重复。
此外，将上述脾脏研磨成脾细胞，所得脾细胞(1×106个细胞/小鼠)用荧光染料标记的抗体(APC-anti-CD3，PerCP-Cy5.5-anti-CD8a，FITC-anti-CD4)染色30分钟，并用流式细胞仪检测。实验设置三次重复。
结果如图7所示：与生理盐水和单独ARV相比，Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV+DC和Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV+M-DC组显著增加了血清中抗原特异性抗体(IgG，IgG1和IgG2a)水平；与引入普通DC相比，引入磁化DC可显著增加IgG1抗体水平(图7A、7B和7C)。这说明，在肿瘤原位引入磁化DC，可显著增加免疫应答。此外，脾细胞中CD8+和CD4+T细胞检测结果如图7D和7E所示，与生理盐水组相比，引入DC和磁化DC组可显著增加脾细胞中CD8+/CD4+T细胞比例，这将有助于激活细胞免疫，直接杀伤肿瘤细胞。同时，将脾细胞用抗原进行再刺激，检测脾细胞分泌的细胞因子水平。如图7F和7G所示，与单独生理盐水、ARV和Fe3O4@Ca/MnCO3/ARV组相比，引入DC和磁化DC组显著增加了IFN-γ和IL-4的分泌；其中，与普通DC相比，磁化DC更显著地增加了所构建的原位肿瘤疫苗的细胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平。这些结果表明，负载ARV的Fe3O4@Ca/MnCO3纳米粒子在杀死肿瘤细胞后，成功地在原位构建了肿瘤疫苗，且引入磁化DC，可显著改善抗原捕获及递呈，显著增加疫苗效应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种磁驱动肿瘤抗原捕获系统，其特征在于：包括磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子和磁化的DC细胞；其中，
所述的磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子通过如下方法制备得到：将Fe3O4@Ca/MnCO3纳米粒子加入到水中，得到Fe3O4@Ca/MnCO3悬浮液；将PROTAC药物加入到有机溶剂中，得到PROTAC溶液；然后将PROTAC溶液加入到Fe3O4@Ca/MnCO3悬浮液中，搅拌混合得到Fe3O4@Ca/MnCO3/PROTAC，即所述磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子；
所述的磁化的DC细胞通过如下方法制备得到：将树突状细胞与Fe3O4纳米粒子共孵育，使其摄入Fe3O4纳米粒子，得到磁化的DC细胞。
2.根据权利要求1所述的磁驱动肿瘤抗原捕获系统，其特征在于：
所述的PROTAC药物为ARV-825和THAL-SNS-032中的至少一种；
所述的树突状细胞为骨髓来源树突状细胞。
3.根据权利要求2所述的磁驱动肿瘤抗原捕获系统，其特征在于：
所述的PROTAC药物为ARV-825；
所述的树突状细胞为从股骨和/或胫骨中分离提取的骨髓来源树突状细胞。
4.根据权利要求1所述的磁驱动肿瘤抗原捕获系统，其特征在于：
所述的Fe3O4@Ca/MnCO3纳米粒子与PROTAC药物的质量比为5～10:1；
所述的Fe3O4纳米粒子的用量为按其在体系的终浓度为0.1～1mg/mL添加计算。
5.根据权利要求4所述的磁驱动肿瘤抗原捕获系统，其特征在于：
所述的Fe3O4@Ca/MnCO3纳米粒子与PROTAC药物的质量比为5:1；
所述的Fe3O4纳米粒子的用量为按其在体系的终浓度为0.1～0.75mg/mL添加计算。
6.根据权利要求1所述的磁驱动肿瘤抗原捕获系统，其特征在于：
所述的水的用量为按每毫升水配比1～10mg Fe3O4@Ca/MnCO3纳米颗粒计算；
所述的有机溶剂为二甲基亚砜；
所述的有机溶剂的用量为按每毫升有机溶剂配比100～500mg PROTAC药物计算；
所述的搅拌的时间为0.5～3小时；
所述的共孵育的时间10～15h。
7.根据权利要求1所述的磁驱动肿瘤抗原捕获系统，其特征在于，所述的Fe3O4纳米粒子通过如下方法制备得到：
将柠檬酸钾和FeCl3溶解在乙二醇中，并在室温下剧烈搅拌0.5～2小时，然后加入乙酸钠搅拌0.5～1小时，再置于180～220℃下进行反应，待反应结束后收集产物，洗涤、冷冻干燥，得到Fe3O4纳米粒子；
所述的反应的时间6～24小时；
所述的洗涤为采用乙醇和水进行洗涤。
8.权利要求1～7任一项所述的磁驱动肿瘤抗原捕获系统在制备肿瘤原位疫苗中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用通过如下步骤实现：将磁驱动肿瘤抗原捕获系统，即磁化的肿瘤抗原捕获纳米粒子和磁化的DC细胞注射到肿瘤中。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为黑色素瘤。
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| CN202311143727.0A CN117379538A (zh) | 2023-09-06 | 2023-09-06 | 一种磁驱动肿瘤抗原捕获系统的构建以及其在肿瘤原位疫苗中的应用 |
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| CN117771206A (zh) * | 2023-08-02 | 2024-03-29 | 首都医科大学附属北京儿童医院 | Sting激动剂仿生纳米递送系统及其制备方法和应用 |
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2023
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| CN117771206B (zh) * | 2023-08-02 | 2024-05-28 | 首都医科大学附属北京儿童医院 | Sting激动剂仿生纳米递送系统及其制备方法和应用 |
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