CN117771206B

CN117771206B - Sting激动剂仿生纳米递送系统及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117771206B
Application number: CN202310959965.2A
Authority: CN
Inventors: 梅冬; 张燃; 路肖
Original assignee: Beijing Childrens Hospital
Current assignee: Beijing Childrens Hospital
Priority date: 2023-08-02
Filing date: 2023-08-02
Publication date: 2024-05-28
Anticipated expiration: 2043-08-02
Also published as: CN117771206A

Abstract

本发明属于医药生物领域，涉及STING激动剂仿生纳米递送系统及其制备方法和应用。本发明所述含有STING激动剂的仿生纳米颗粒，包括：外壳、药物载体、活性组分，其中，外壳包裹药物载体，药物载体装载活性组分，其中，外壳为肿瘤细胞膜；其中，药物载体为碳酸锰，采用反向微乳法制备得到；其中，活性组分为STING激动剂，包括天然CDN类STING激动剂。本发明解决现有天然CDN类STING激动剂药物递送系统选择性差的问题。

Description

STING激动剂仿生纳米递送系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药生物领域，涉及STING激动剂仿生纳米递送系统及其制备方法和应用。

背景技术

药物本身缺点：(1)天然CDN类STING激动剂具有亲水性且带负电导致入胞困难，细胞摄取差；(2)耐药性、低稳定性、半衰期差、脱靶效应和毒性，大大降低了它们的治疗效果。

既往药物递送系统缺点：(1)载药量与包封率低；(2)选择性差，易导致药物的脱靶效应，产生全身免疫系统毒性；(3)注射不便，多为瘤内注射，临床转化困难。

发明内容

本发明的目的在于提供STING激动剂仿生纳米递送系统，也称为STING激动剂仿生纳米颗粒。

本发明解决现有天然CDN类STING激动剂药物递送系统选择性差的问题，本研究采用具有同源粘附结构域的癌细胞膜包覆载药纳米粒，使药物具有同源靶向性，实现肿瘤部位的特异性聚集，提高疗效的同时降低全身毒性反应；

本发明所述含有STING激动剂的仿生纳米颗粒，包括：外壳、药物载体、活性组分，其中，外壳包裹药物载体，药物载体装载活性组分，其中，外壳为肿瘤细胞膜；其中，药物载体为碳酸锰，采用反向微乳法制备得到；其中，活性组分为STING激动剂，包括天然CDN类STING激动剂。优选的，STING激动剂为2’3’-cGAMP。

STING激动剂为2’3’-cGAMP为已知成分，可以在市场上购买到。

本发明的另一个目的在于提供STING激动剂仿生纳米颗粒的制备方法。

该方法解决现有药物递送系统载药量与包封率低的问题，通过采用反相微乳法制备碳酸锰载药纳米粒实现。

仿生纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)超声法或反复冻融法制备癌细胞膜外壳；

(2)反相微乳法制备碳酸锰载药纳米粒：

(3)超声-共挤出法制备仿生载药纳米粒。

其中，步骤(1)癌细胞膜外壳，采用超声法制备。

优选的，癌细胞膜外壳的制备包括以下步骤：

1)收集细胞：用细胞橡胶刮刀轻轻取细胞，用4℃冷PBS洗涤2次后，4℃离心获得癌细胞；

2)冰浴：将PMSF加至膜蛋白提取液(市售产品)中，重悬癌细胞，然后，将悬浮液在冰浴中冷却；

3)超声破碎：在冰浴中探头超声，将所得溶液在4℃下1000g离心10min，以去除未破碎的细胞或细胞碎片；

4)离心收集：小心吸液取出上层，离心收集，即得。

其中，步骤(2)反相微乳法制备碳酸锰载药纳米粒，包括以下步骤：

1)Mncl₂·4H₂O、(NH₄)₂C0₃溶液及2’3’-cGAMP母液的配制；

2)量取环己烷、正戊醇、Mncl₂·4H₂O混合均匀，加入2’3’-cGAMP，搅拌；

3)称取CTAB于上述溶液中，超声溶解；

4)边搅拌边滴加入(NH₄)₂C0₃溶液，搅拌；

5)离心，无水乙醇，水交替洗，去除有机溶剂，即得。

优选的，

步骤1)中Mncl₂·4H₂O和(NH₄)₂C0₃母液的摩尔浓度为0.01M～1M，

2’3’-cGAMP母液的摩尔浓度为1～50mM；

步骤2)、4)中环己烷、正戊醇、Mncl₂·4H₂O、2’3’-cGAMP的给药体积分别为0.1～20mL、10～1500μL、2～200μL、1～100μL和2～200μL；

步骤3)中CTAB的量为10～200mg；

步骤中2)、4)中的搅拌时间为0.5～3小时；

步骤5)中的离心条件为10000rpm*5～10min，洗涤次数为5～6次。

其中，(3)超声-共挤出法制备仿生载药纳米粒：

1)将制备好的癌细胞膜与碳酸锰载药纳米粒混匀，超声；

2)将上步的混合物用聚碳酸酯膜机械反复挤压，即得。

根据实施例之一，本发明的制备方法，包括以下步骤：

(1)超声法制备癌细胞膜外壳：

1)收集细胞：用细胞橡胶刮刀轻轻取细胞，用4℃PBS洗涤后，离心获得癌细胞；

2)冰浴冷却：将PMSF(1～10mM，10～100μL)加至膜蛋白提取液(市售)中，随后重悬癌细胞，并将悬浮液在冰浴中冷却30～60分钟；

3)超声破碎：在冰浴中探头超声，超声的功率40～80W，超声时间2～5分钟，将所得溶液在4℃下1000g离心10min；

(4)离心收集：小心吸液取出上层，4℃离心0.5h；

(2)反向微乳法制备载药碳酸锰纳米粒

1)配制Mncl₂·4H₂O和(NH₄)₂C0₃溶液及2’3’-cGAMP母液；

2)量取适量环己烷、正戊醇、Mncl₂·4H₂O混合均匀，加入2’3’-cGAMP母液，搅拌0.5～3小时；

3)称取适量CTAB于上述溶液中，超声溶解；

4)边搅拌边滴加入(NH₄)₂C0₃溶液，搅拌0.5～3个小时；

5)10000rpm*5min离心；

6)无水乙醇，水交替洗5～6次，去除有机试剂即得。

(3)超声-共挤出法制备仿生载药纳米粒

1)将制备好的癌细胞膜与碳酸锰载药纳米粒混匀，超声5～10min；

2)将上步中的混合物用孔径为400nm的聚碳酸酯膜机械反复挤压10～20次，然后用200nm的聚碳酸酯膜进行反复挤压10～20次，即得。

本发明的另一个目的在于提供STING激动剂仿生纳米颗粒的药物应用。

STING激动剂仿生纳米颗粒应用于肿瘤治疗，同时解决现有药物注射不便，临床转化困难的问题，通过细胞膜包被，增加药物的循环稳定性，实现了药物静脉可注射性，易于临床转化。

本发明的仿生纳米颗粒在制备治疗肿瘤中的应用。

本发明相对于现有技术，具备以下有益效果：

(1)药物高包封：采用反相微乳法制备的碳酸锰纳米粒，电镜下具有典型的介孔结构，可以实现药物60％以上的高包封；

(2)载药材料生物可降解，安全性高：介孔碳酸锰纳米粒具有优异的肿瘤微环境(TME)响应特性，即在低pH值、高浓度谷胱甘肽与H₂O₂的肿瘤微环境中，碳酸锰可与H₂O₂发生反应，实现生物降解，同时释放氧气和二氧化碳，改善乏氧环境；

(3)肿瘤靶向性强：癌细胞表达具有同源粘附结构域的表面粘附分子，癌细胞膜涂层可增强纳米颗粒的同源靶向能力，实现肿瘤部位的特异性聚集，降低全身毒副反应，增强治疗效果；

(4)可静脉注射，生物安全性高，易于临床转化：生物膜具有良好的生物相容性，可保护药物不被降解，提高药物稳定性，基于此，本研究通过将癌细胞膜包覆在载药纳米颗粒表面，突破性的实现了天然CDN类药物可静脉注射的能力，摆脱了瘤内注射这一给药方式的限制，更加贴近临床，易于临床转化。

对于文中出现的一些技术术语或缩写作进一步的解释和说明：

PBS：磷酸盐缓冲液

PMSF：苯甲基磺酰氟

2’3’-cGAMP：2’3’-环鸟苷酸-腺苷酸

附图说明

图1.外标2’3’-cGAMP液相检测结果

图2.STING激动剂仿生纳米粒液相检测结果

图3.STING激动剂仿生纳米粒

图4.STING激动剂仿生纳米粒粒径检测图

图5.BMDC成熟情况

图6.ELISA检测细胞因子分泌情况

图7.体外血液相容性检测实验结果

图8.小鼠生存曲线

图9.小鼠体重变化

图10.细胞因子IL-6检测结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述的产品及其制备方法作进一步阐述,但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1STING激动剂仿生纳米粒的制备及包封率测定

1、超声法制备癌细胞膜外壳

(1)收集细胞：用细胞橡胶刮刀轻轻取细胞，用4℃冷PBS洗涤2次后，离心获得癌细胞；

(2)冰浴冷却：将1mM PMSF(在提取试剂加入样品前2-3min加入)膜蛋白提取液(市售)重悬癌细胞。然后，将悬浮液在冰浴中冷却30～60分钟；

(3)超声破碎：在冰浴中探头超声步骤(3)中探头超声的条件为功率40～80W，超声时间2～5分钟(脉冲:定时2秒，关机3秒)，将所得溶液在4℃下1000g离心10min，以去除未破碎的细胞或细胞碎片；

(4)离心收集：小心吸液取出上层，14000g 4℃离心0.5h。将获得的细胞膜片段保存在-80℃下进行进一步分析，采用BCA蛋白测定试剂盒测定细胞膜蛋白浓度。

2、反向微乳法制备载药碳酸锰纳米粒

(1)配制Mncl₂·4H₂O和(NH₄)₂C0₃溶液及2’3’-cGAMP母液；

(2)量取适量环己烷、正戊醇、Mncl2·4H2O混合均匀，加入2’3’-cGAMP母液，搅拌0.5～3小时；

(3)称取适量CTAB于上述溶液中，超声溶解；

(4)边搅拌边滴加入(NH4)₂C0₃溶液，搅拌0.5～3个小时；

(5)10000rpm*5min离心；

(6)无水乙醇，水交替洗5～6次，去除有机试剂即得。

3、超声-共挤出法制备仿生载药纳米粒

(1)将制备好的癌细胞膜与碳酸锰载药纳米粒混匀，超声5～10min；

(2)将步骤3.1中的混合物用孔径为400nm的聚碳酸酯膜机械反复挤压10～20次，然后用200nm的聚碳酸酯膜进行反复挤压10～20次，即得。

4、将制备的含STING激动剂的仿生纳米粒加适量盐酸破坏，使其释放，离心，去除杂质，过0.22μm滤膜后使用高效液相色谱法检测2’3’-cGAMP浓度，并使用如下公式计算包封率：

包封率％＝系统中包封药量/投药量×100％(液相检测结果见图1和图2)

如图所示，本发明所制备的STING激动剂仿生纳米粒的包封率可达64.23％。

实施例2、STING激动剂仿生纳米粒的理化性质表征试验

1、供试材料：示例1制备的STING激动剂仿生纳米粒及碳酸锰载药纳米粒；

2、试验方法及结果

(1)形态表征：采用透射电镜(TEM)对STING激动剂仿生纳米粒的形态进行了表征。具体方法如下：将制备的纳米混悬液适当稀释，滴至铜网上，静置后用滤纸吸干多余液体，再滴加磷钨酸染色，自然干燥后，置透射电镜下观察粒子形态并拍照。透射电镜结果见图3。

TEM图像显示，STING激动剂仿生纳米颗粒表面上存在膜结构，展示了一种典型的核-壳结构，证明了细胞膜的成功包覆；膜包覆下的碳酸锰纳米粒显示出典型的介孔结构，有利于药物的成功包载；

(2)粒径检测：动态光散射法(DLS)对STING激动剂仿生纳米粒的粒径进行了检测，检测结果见图4。

动态光散射法(DLS)测得的STING激动剂仿生纳米粒平均粒径约为205nm，PDI为0.068，表明STING激动剂仿生纳米粒具有良好的粒径分布。

实施例3、STING激动剂仿生纳米粒的体外免疫刺激实验

实验步骤：

1、提取小鼠BMDC细胞并使用GM-CSF及IL-4诱导，于37℃，5％ CO2培养箱培养；

2、第2，4，6天，分别半量换液，并于第6天孵药；

3、药物孵育24h后，取细胞，使用FCM分析CD11c，CD80，CD86来判断成熟BMDC的百分比；取上清暂存于-80℃，使用ELISA试剂盒分析其中的TNF-a、IL-6、IFN-β含量。实验结果见图5和图6。

树突细胞的成熟是T细胞活化的关键推动力。CD80、CD86等刺激因子的高表达是树突细胞成熟的标志。本发明检测了各制剂处理后树突细胞的体外免疫刺激活性，发现STING激动剂仿生纳米粒处理后CD80阳性和CD86阳性树突细胞的百分比明显高于其他组，表明STING激动剂仿生纳米粒具有更强的树突状细胞诱导成熟的能力。

实施例4、STING激动剂仿生纳米粒的体外溶血性考察

实验步骤：配制红细胞悬液，并各取200uL制剂溶液加入到1ml红细胞悬液，轻轻震摇均匀后37℃孵育，最后取出4℃下离心，观察上清液的颜色。红细胞溶解后会释放血红素，于540nm测定其吸光度(空白对照加入200uL的PBS(pH7.4)，阳性对照加入200uL的TritonX-100溶液)。

溶血率计算公式：溶血率(％)＝((A样-A阴))/(A阳-A阴))×100％。其中，A样为制剂组吸光度，A阴为PBS吸光度，A阳为TritonX-100吸光度。

实验结果见图7.

血红素吸光度值也证实了与TritonX-100相比，各制剂组组释放了较少的血红素，溶血率计算结果各组均<5％，证明STING激动剂仿生纳米粒具有血液安全性。

实施例5、STING激动剂仿生纳米粒的药效学评价试验

1、建立荷瘤小鼠模型：鼠高危神经母细胞瘤9464D细胞系培养于含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM(高糖)培养液中，贴壁后，取对数生长期的细胞，PBS冲洗，再用含0.25％EDTA的胰酶消化，终止消化后，1000rpm离心5min，基础培养基重悬后调整细胞浓度为1.0×10^6·50μL-1/只接种到C57BL/6N小鼠右后臀部。

2、给药方案：当肿瘤体积达到50～60mm3时，将小鼠随机分组，分别向小鼠静脉注射200μL的各制剂，其中STING激动剂仿生纳米粒按照实施例1方法制备。监测肿瘤体积，观察小鼠的生存状态，注射部位是否有明显可见的毒性反应，绘制小鼠生存期曲线图；同时测量体重，绘制体重随时间变化的曲线。小鼠生存曲线见图8；体重随时间变化见图9；血清细胞因子检测见图10。

根据实验结果可见，通过将细胞膜覆盖在碳酸锰载药纳米粒表面，在增加STING激动剂肿瘤部位靶向性，明显改善治疗肿瘤的效果的同时，实现了天然CDN类药物可静脉注射性能，且在后续的血清细胞因子检测中，也未发现明显的全身免疫系统毒性，表明其具有良好治疗效果的同时也具有较强的生物安全性。

实施例6、筛选实验

Mn浓度	粒径	包封率	载药量
				10～1000mM	205±10nm	64.23％±5％	3.6％±5％
0.1～5mM	209±10nm	21.78±7％	1.3％±0.7％
				0.01～0.5mM	180±10nm	7.98±3％	0.4±0.08％

以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出的是，本发明的实施方式并不受所述实施例的限制。在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，这些也应视为本发明发保护范围。

Claims

1.一种含有STING激动剂的仿生纳米颗粒，其特征在于，该仿生纳米颗粒包括外壳、药物载体、活性组分，外壳包裹药物载体，药物载体装载活性组分，其中，外壳为癌细胞膜；药物载体为碳酸锰，采用反相微乳法制备得到；活性组分为STING激动剂，包括天然CDN类STING激动剂。

2.根据权利要求1所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，STING激动剂为2’3’-cGAMP。

3.根据权利要求2所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

(1)超声法或反复冻融法制备癌细胞膜外壳；

(2)反相微乳法制备碳酸锰载药纳米粒：

1)Mncl₂·4H₂O、(NH₄)₂C0₃溶液及2’3’-cGAMP母液的配制；

2)量取环己烷、正戊醇、Mncl₂·4H₂O混合均匀，加入2’3’-cGAMP母液，搅拌；

3)称取CTAB于上述溶液中，超声溶解；

4)边搅拌边滴加入(NH₄)₂C0₃溶液，搅拌；

5)离心，无水乙醇、水交替洗，去除有机溶剂，即得；

(3)超声-共挤出法制备所述仿生载药纳米颗粒。

4.根据权利要求3所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，(2)反相微乳法制备碳酸锰载药纳米粒中：

2’3’-cGAMP母液摩尔浓度为1～50mM；

步骤2)中环己烷、正戊醇、Mncl₂·4H₂O、2’3’-cGAMP的用量分别为0.1～20mL、10～1500μL、2～200μL、1～100μL，步骤4)中(NH₄)₂C0₃的用量为2～200μL；

步骤3)中CTAB的量为10～200mg；

步骤中2)、4)中的搅拌时间为0.5～3小时；

步骤5)中的离心条件为10000rpm*5～10min，洗涤次数为5～6次。

5.根据权利要求3所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，(1)超声法制备癌细胞膜外壳：

2)冰浴：将PMSF加至膜蛋白提取液中，重悬癌细胞，然后，将悬浮液在冰浴中冷却；

4)离心收集：小心吸液取出上层，离心收集，即得。

6.根据权利要求3所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，(3)超声-共挤出法制备仿生载药纳米颗粒：

1)将制备好的癌细胞膜与碳酸锰载药纳米粒混匀，超声；

2)将上步的混合物用聚碳酸酯膜机械反复挤压，即得。

7.根据权利要求2所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

(1)超声法制备癌细胞膜外壳：

1)收集细胞：用细胞橡胶刮刀轻轻取细胞，用4℃PBS洗涤2次后，离心获得癌细胞；

2)冰浴冷却：将1mM PMSF膜蛋白提取液重悬癌细胞，然后，将悬浮液在冰浴中冷却30分钟；

4)离心收集：小心吸液取出上层，4℃离心0.5h；

(2)反相微乳法制备载药碳酸锰纳米粒：

1)配制Mncl₂·4H₂O和(NH₄)2C0₃溶液及2’3’-cGAMP母液；

3)称取适量CTAB于上述溶液中，超声溶解；

4)边搅拌边滴加入(NH₄)₂C0₃溶液，搅拌0.5～3个小时；

5)10000rpm*5min离心；

6)无水乙醇、水交替洗5～6次，去除有机试剂即得；

(3)超声-共挤出法制备仿生载药纳米颗粒：

8.权利要求2所述的仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)超声法制备癌细胞膜外壳；

(2)反相微乳法制备碳酸锰载药纳米粒：

1)Mncl₂·4H₂O、(NH₄)₂C0₃溶液及2’3’-cGAMP母液的配制；

3)称取CTAB于上述溶液中，超声溶解；

4)边搅拌边滴加入(NH₄)₂C0₃溶液，搅拌；

5)离心，无水乙醇、水交替洗，去除有机溶剂，即得；

(3)超声-共挤出法制备仿生载药纳米颗粒。

9.权利要求1-2任一项所述的仿生纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。