CN113209359A - 一种烷基化壳聚糖止血微胶囊及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种烷基化壳聚糖止血微胶囊的制备方法，包括以下步骤：提供包括长链烷基化壳聚糖和葡聚糖的混合溶液作为分散相；将所述分散相经过高压电场微流控喷入凝固浴中，形成微胶囊，所述凝固浴包括阴离子聚合物、聚乙二醇和碱性化合物；将所述微胶囊在戊二醛溶液中孵育后冷冻干燥，得到烷基化壳聚糖止血微胶囊。本发明以长链烷基化壳聚糖为原料，长碳链与细胞膜的磷脂双分子层极性相近，可以嵌入细胞膜中，形成壳聚糖‑血细胞凝胶网络结构，增强了壳聚糖的止血效果。而且，使用微流控技术以阴离子聚合物作为辅料，得到的烷基化壳聚糖止血胶囊尺寸大小均匀。

Description

一种烷基化壳聚糖止血微胶囊及其制备方法
技术领域
本发明涉及止血材料技术领域，尤其涉及一种烷基化壳聚糖止血微胶囊及其制备方法。
背景技术
近年来，创伤治疗(wound treatment)作为一项基础的医疗问题受到越来越多的重视，并成为生物医学工程和药物制剂学等领域的研究热点。生物伤口愈合是一个复杂的过程，包括止血、发炎、增殖和重塑四个阶段，每个阶段作用功能不同但又高度协调，并且可以直接影响后续整体的愈合结果。而止血作为其第一个生理阶段，在治疗创伤时有着举足轻重的地位。未及时控制的创伤性大出血是战伤和日常事故导致休克和死亡的一个重要原因，所以快速止血对于挽救伤员生命、提高存活率和后期恢复非常重要。迄今为止，常用的传统止血材料或多或少都有一定的缺陷，比如长时间使用止血带会导致一些并发症，特别是远端肢体缺血、梗塞以及机械神经损伤等；又或者绷带和敷料会粘附在伤口组织上，在移除时往往会造成二次损伤。因此，各种损伤小、副作用少的新型止血剂已被作用于伤口愈合的止血阶段，包括微米或纳米纤维、多孔泡沫、复合膜、止血粉和功能性水凝胶等。在这些不同类型的材料中，止血微胶囊(Hemostatic Microcapsule,HM)因其在治疗效果和安全性等方面的固有优势而受到越来越多的关注。
天然有机化合物具有更好的生物相容性，可以避免矿物质中金属离子诱导的体内毒性问题，并且部分天然生物材料已被证明在快速止血和创伤治疗等方面具有极大潜力。壳聚糖(Chitosan,CS)是一种天然有机高分子多聚糖，具有抗炎、抑菌等生物活性及良好的生物相容性，其表面存在大量的氨基，具有阳离子特性，通过这些正电荷的作用与带负电荷的红细胞表面物质发生粘附聚集，从而快速形成血凝块进行止血。有研究表明，由壳聚糖经聚电解质络合反应制备的止血材料，具有无毒、生物相容性好、免疫原性低、可生物降解等优点，可以作为一种优良的生物材料应用于创伤止血领域。
然而壳聚糖这种止血材料在实际使用中也暴露出一些问题，一方面由于壳聚糖表面具有较多的亲水性结构，很难与细胞紧密贴合，影响微胶囊与创口的贴合性及微胶囊包载药物的后续释放；另一方面，仅依靠壳聚糖静电力结合红细胞而发挥的止血作用，对于严重创伤导致的急性大出血治疗效果不佳。此外，传统制备微胶囊的技术，如薄膜乳化法等，往往导致较大的批次差异，而且由于传统制备过程较为复杂，并且对制备所得微胶囊的尺寸大小不均一。
发明内容
本发明的目的在于提供的烷基化壳聚糖止血微胶囊及其制备方法，本发明制备得到的烷基化壳聚糖止血微胶囊尺寸大小均一。
本发明提供了一种烷基化壳聚糖止血微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
提供包括长链烷基化壳聚糖和葡聚糖的混合溶液作为分散相，所述长链烷基化壳聚糖中长链烷基的碳原子数12～16；
将所述分散相由微流控设备喷出，喷出的分散相液体经过高压电场喷入凝固浴中，形成微胶囊，所述凝固浴包括阴离子聚合物、聚乙二醇和碱性化合物；
将所述微胶囊在戊二醛溶液中孵育后冷冻干燥，得到烷基化壳聚糖止血微胶囊。
优选的，所述长链烷基化壳聚糖为十二烷基化壳聚糖、十四烷基化壳聚糖或十六烷基化壳聚糖。
优选的，所述十二烷基化壳聚糖的取代度为10％～40％。
优选的，所述分散相中长链烷基化壳聚糖的质量浓度为1.0％～1.5％；
所述分散相中葡聚糖的质量浓度为3.0％～8.0％。
优选的，所述分散相还包括止血药物、抗菌药物或促进愈合药物。
优选的，所述药物在分散相中的浓度为10000～100000IU/10ml。
优选的，所述所述阴离子聚合物为海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇和卡拉胶中的一种或几种。
优选的，所述高压电场的电压为0.8×104V～2.5×104V。
优选的，所述微流控的装置包括高压电源、注射器、与所述注射器出液口连通的毛细管、与所述注射器连接的注射泵、与所述高压电源电连接的电线圈以及接收件；
所述毛细管还与所述高压电源电连接。
优选的，所述将所述分散相经过高压电场微流控滴入凝固浴中包括：
将所述分散相置于注射器中，将盛装有分散相的注射器置于注射泵内；
将凝固浴置于接收件内；
启动注射泵，待流速稳定后开启高压电源，待所述毛细管尖端稳定喷出液滴后，将盛有凝固浴的接收件置于电线圈下方，收集微胶囊。
优选的，所述凝固浴中阴离子聚合物的质量浓度为0.3％～2.0％、聚乙二醇的质量浓度为3.0～8.0％％、碱性化合物的质量浓度为2.0％～6.0％。
优选的，所述分散相的流速为10mL/h～25mL/h。
优选的，所述戊二醛溶液的质量浓度为0.3％～3.0％％。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的烷基化壳聚糖止血微胶囊，所述微胶囊包括壳层和实心内核，所述实心内核包括烷基化壳聚糖，或烷基化壳聚糖和包封在所述烷基化壳聚糖内的药物，所述药物包括止血药物、抗菌药物和促进愈合药物中的一种或多种；所述壳层包括固化烷基化壳聚糖和由烷基化壳聚糖和阴离子聚合物结合得到的复合物，所述壳层的厚度为10～50μm，所述微胶囊的粒径为60～600μm。
本发明提供了一种烷基化壳聚糖止血微胶囊的制备方法，包括以下步骤：提供包括长链烷基化壳聚糖和葡聚糖的混合溶液作为分散相；，所述长链烷基化壳聚糖中长链烷基的碳原子数12～16；将所述分散相经过高压电场微流控喷入凝固浴中，形成微胶囊，所述凝固浴包括阴离子聚合物、聚乙二醇和碱性化合物；将所述微胶囊在戊二醛溶液中孵育后冷冻干燥，得到烷基化壳聚糖止血微胶囊。本发明提供的制备方法以长链烷基化壳聚糖为原料，在壳聚糖侧链的氨基上引入长链烷基的碳链，长碳链与细胞膜的磷脂双分子层极性相近，因此可以嵌入细胞膜中，形成一种壳聚糖-血细胞凝胶网络结构，增强了壳聚糖的止血效果。本发明将所述分散相喷出，喷出的分散相液体经过高压电场的作用分裂成均匀的细小液滴作为微胶囊的模板，然后落入凝固浴中，凝固浴中阴离子聚合物可以与带正电荷的长链烷基化壳聚糖在静电力的作用下结合，形成了较为稳定的复合物作为微胶囊雏形，以便进一步交联固化和干燥。本发明使用的微流控设备喷出分散相，所述微流控设备中的微通道可以使分散相均匀喷出，因此所制备的微胶囊尺寸大小均一，粒径分布较窄。
本发明提供的制备方法还可以通过在分散相中添加定量的止血、抗菌和促愈合的药物中的一种或多种，来实现对药物的可控包封，在止血、抗菌、促进愈合等方面会取得较好的疗效。
附图说明
图1为本发明实施例中烷基化壳聚糖的合成路线示意图；
图2为本发明实施例制备所得烷基化壳聚糖的FTIR图谱；
图3为微流控技术平台示意图与实物图；
图4为烷基化壳聚糖止血微胶囊光学显微镜图像(左)与扫描电子显微镜图像(右)；
图5为壳聚糖、烷基化壳聚糖及其微胶囊的溶血率结果；
图6为壳聚糖、烷基化壳聚糖及其微胶囊的细胞活性结果；
图7为壳聚糖、烷基化壳聚糖及其微胶囊的MTT体外药效共聚焦成像结果；
图8为壳聚糖、烷基化壳聚糖及其微胶囊大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率；
图9为制备所得烷基化壳聚糖及其微胶囊的体外凝血时间；
图10为制备所得烷基化壳聚糖及其微胶囊的体外凝血实物图。
具体实施方式
本发明提供了一种烷基化壳聚糖止血微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
提供包括长链烷基化壳聚糖和葡聚糖的混合溶液作为分散相；
将所述分散相经过高压电场微流控喷入凝固浴中，形成微胶囊，所述凝固浴包括海藻酸钠、聚乙二醇和碱性化合物；
将所述微胶囊在戊二醛溶液中孵育后冷冻干燥，得到烷基化壳聚糖止血微胶囊。
本发明提供包括长链烷基化壳聚糖和葡聚糖的混合溶液。在本发明中，所述长链烷基化壳聚糖优选为十二烷基化壳聚糖、十四烷基化壳聚糖或十六烷基化壳聚糖；所述十二烷基化壳聚糖的取代度优选10％～40％，更优选具体为10％、20％、30％或40％。在本发明的实施例中，所述长链烷基化壳聚糖的制备方法优选包括以下步骤：
提供壳聚糖溶液；
将脂肪醛滴加进所述壳聚糖溶液中，在酸性条件下进行缩合反应，得到亚胺化壳聚糖；
将所述亚胺化壳聚糖与还原剂混合进行还原反应，得到长链烷基化壳聚糖。
在本发明中，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度优选为10.0g/L；所述壳聚糖溶液中优选包括壳聚糖、乙酸溶液和乙醇。所述乙酸溶液的质量浓度优选为2％；所述乙酸溶液与乙醇的体积比优选为1:1。
得到壳聚糖溶液后，本发明将脂肪醛滴加进所述壳聚糖溶液中进行缩合反应，得到亚胺化壳聚糖。在本发明中，所述脂肪醛优选包括十二醛、十四醛或十六醛；所述十二醛又名月桂醛。在本发明中，所述酸性条件由乙酸溶液提供。所述滴加时壳聚糖溶液的温度优选为35℃；所述滴加优选为逐滴滴加。所述脂肪醛和壳聚糖的比例按照脂肪醛中醛基和壳聚糖中氨基的摩尔比计算，优选为0.125～0.5:1，更优选为0.125:1、0.25:1或0.5:1。所述缩合反应的时间优选为4h。
所述缩合反应后，本发明优选将反应液冷却至室温，得到亚胺化壳聚糖。
得到亚胺化壳聚糖后，本发明将所述亚胺化壳聚糖与还原剂混合进行还原反应，得到长链烷基化壳聚糖。在本发明中，所述缩合反应的反应液不进行后处理，直接与还原剂混合。在本发明中，所述还原剂优选为硼氢化钠，所述硼氢化钠与脂肪醛中醛基的摩尔比优选为3:1。在本发明中，所述还原剂优选以还原剂溶液的形式使用，所述混合优选为将所述还原剂溶液滴入亚胺化壳聚糖中。所述还原反应的温度优选为室温；所述还原反应的时间优选为3h。
在本发明中，所述壳聚糖烷基化的过程如图1所示，壳聚糖与脂肪醛缩合得到亚胺化壳聚糖，再经硼氢化钠还原，得到烷基化壳聚糖。
所述还原反应后，本发明优选将得到的还原反应产物进行后处理，得到长链烷基化壳聚糖。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：
调节所述还原反应产物的pH值至10，析出固体；
将所述固体离心洗涤，得到中性固体；
将所述中性固体溶解于醋酸溶液中，得到溶液低温保存后加压抽滤，得到除杂固体；
将所述除杂固体的pH值调至10，离心分离沉淀；
将所述沉淀水洗至中性后冷冻干燥，得到长链烷基化壳聚糖。
本发明优选向所述还原反应产物中加入氢氧化钠溶液调节pH值，所述氢氧化钠溶液的质量浓度优选为2％。
在本发明中，所述离心洗涤优选为甲醇洗三次和乙醇洗三次，最后水洗至中性；
得到中性固体后，本发明优选将所述中性固体溶解在质量浓度为2％的醋酸溶液中；所述低温保存的温度优选为4℃；所述低温保存的时间优选为30min。
在本发明中，调节所述除杂固体的pH值优选为将所述除杂固体加入至氢氧化钠溶液中，调节pH值＝10。
在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-60℃；所述冷冻干燥的时间优选为28h。
在本发明中，所述分散相中长链烷基化壳聚糖的质量浓度优选为1.5％，所述葡聚糖的质量浓度优选为5.0％。在本发明中，所述葡聚糖与分散相中的聚乙二醇形成的双水相体系，以保证液滴的形貌。
在本发明中，所述分散相优选还包括药物，所述药物优选为止血药物、抗菌药物和促进愈合药物中的一种或多种；本发明对所述药物的具体种类没有特殊的限定，在本发明的实施例中，所述促进愈合药物可具体为人表皮生长因子(VEGF)；所述止血药物可具体为肝素钠。在本发明中，所述药物在分散相中的质量浓度优选为10000～100000IU/10ml，更优选为50000IU/10ml。
本发明在分散相中加入药物，长链烷基化壳聚糖会对药物进行包埋，且具有较高的包埋率(包封率在80％以上)，能够更进一步促进药效的发挥。
得到分散相后，本发明将所述分散相由微流控设备喷出，喷出的分散相液体经过高压电场喷入凝固浴中，形成微胶囊。在本发明中，所述凝固浴包括阴离子聚合物、聚乙二醇和碱性化合物。在本发明中，所述阴离子聚合物优选包括海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇和卡拉胶中的一种或几种。在本发明中，所述凝固浴中阴离子聚合物的质量浓度优选为0.3％～2.0％，更优选为0.5％～1.0％、聚乙二醇的质量浓度优选为3.0％～8.0％，更优选为5.0％～6.0％、碱性化合物的质量浓度优选为2.0％～6.0％，更优选为3.0％～4.0％。在本发明中，所述碱性化合物优选为氢氧化钠。
在本发明中，所述微流控设备优选包括高压电源、注射器、与所述注射器出液口连通的毛细管、与所述注射器连接的注射泵、与所述高压电源电连接的电线圈以及接收件；
所述毛细管还与所述高压电源电连接，具体的所述毛细管的出口处与高压电源电连接。
所述装置的结构如图3所示。在本发明的一个方案中，所述接收件为培养皿。本发明对所述电线圈的大小没有特殊的限定，能够通过液滴即可；在本发明的一个实施例中，所述电线圈的直径为8cm。在本发明中，所述电线圈与接收件的距离为2cm
在本发明中，所述所述分散相由微流控设备喷出，喷出的分散相液体经过高压电场喷入凝固浴中优选包括：
将所述分散相置于注射器中，将盛装有分散相的注射器置于注射泵内；
将凝固浴置于接收件内；
启动注射泵，待流速稳定后开启高压电源，待所述毛细管尖端稳定喷出液滴后，将盛有凝固浴的接收件置于电线圈下方，收集微胶囊。
本发明采用电场力辅助射流断裂，产生尺寸大小均一可控的液滴，从而形成大小均一、形态良好的微胶囊。
本发明将上述技术方案所述分散相置于注射器内，并将注射器置于注射泵内，所述注射器的出口连接有毛细管，所述毛细管的出口固定使液滴向下滴入凝固浴中。
本发明启动注射泵，注射器中的分散相通过毛细管喷出，待观察到液滴均匀喷出说明流速稳定，流速稳定后开启高压电源。在本发明中，所述流速优选为10mL/h～35mL/h，更优选为15mL/h～25mL/h。在本发明中，调节电压优选为0.8×104V～4.5×104V，更优选为2.5×104V，电线圈电连接高压电源，电线圈固定于所述毛细管出口的下方，优选距离所述毛细管出口1cm
待所述毛细管尖端稳定喷出液滴后，本发明将收集件置于电线圈下方收集液滴，所述收集件内盛有上述技术方案所述凝固浴。本发明优选边收集边搅拌，所述搅拌的速率优选为600rpm。
收集得到微胶囊后，本发明将所述微胶囊在戊二醛溶液中孵育后冷冻干燥，得到烷基化壳聚糖止血微胶囊。本发明优选将所述微胶囊水洗至中性后再进行孵育。在本发明中，所述戊二醛溶液的质量浓度优选为0.3％～3.0％，更优选为1.0％～2.0％；所述孵育优选为将待孵育体系置于100rpm摇床震荡摇晃；所述孵育的时间优选为2h。本发明采用戊二醛与烷基化壳聚糖反应进行交联固化，增强了微胶囊的机械强度与稳定性。
所述孵育后，本发明优选将得到的孵育微胶囊水洗，所述水洗的次数优选为3～5次。
在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-60℃；所述冷冻干燥的时间优选为28h。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的烷基化壳聚糖微胶囊，所述微胶囊包括壳层和实心内核，所述实心内核包括烷基化壳聚糖，或包括烷基化壳聚糖和包封在所述烷基化壳聚糖内的药物，所述药物包括止血药物、抗菌药物和促进愈合药物中的一种或多种；所述壳层包括固化烷基化壳聚糖和由烷基化壳聚糖和阴离子聚合物结合得到的复合物，所述壳层的厚度为10～50μm，所述微胶囊的粒径为60～600μm。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的烷基化壳聚糖微胶囊及其制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、准确称量CS粉末1.0g，加入50mL 2wt％的乙酸溶液中，待壳聚糖溶解后再加入50mL的乙醇，放入35℃水浴锅中，搅拌混匀得到壳聚糖溶液；
2、取月桂醛，按照-NH2：-CHO＝1：0.125的摩尔比例，逐滴滴加进壳聚糖溶液中，搅拌反应4h后，冷却至室温；
3、准确称量0.1g的NaBH3加入到10mL纯水中溶解后，按照NaBH3：-CHO＝3：1的摩尔比例，在不断搅拌中将NaBH3溶液缓慢滴入步骤2得到的反应液中，室温下搅拌反应3h；
4、在步骤3反应所得溶液中加入2wt％的NaOH溶液至pH＝10，析出产物，离心洗涤，依次用甲醇洗三次、乙醇洗三次，水洗至中性；
5、将步骤4所得产物溶解在2wt％醋酸中，充分溶解后，放入4℃保存30min，减压抽滤滤去杂质，加入2wt％的NaOH溶液搅拌至pH＝10，离心分离沉淀，沉淀水洗至中性；
6、步骤5将所得产物进行冷冻干燥28h，得到十二烷基化壳聚糖，取代度为10％。
实施例2
按照实施例1的技术方案制备得到十二烷基化壳聚糖(取代度为20％)，不同的是，本实施例中月桂醛的用量按照-NH2：-CHO＝1:0.25加入。
实施例3
按照实施例1的技术方案制备得到十二烷基化壳聚糖(取代度为40％)，不同的是，本实施例中月桂醛的用量按照-NH2：-CHO＝1:0.5加入。
通过红外光谱测定实施例1～3得到的烷基化壳聚糖：采用KBr压片法，将制备所得烷基化壳聚糖与溴化钾粉末混合，研成细碎粉末，制成半透明的薄片，将其放入红外光谱仪器中进行测试，扫描范围为4000～400cm-1。壳聚糖和不同取代度(实施例1～3)的十二烷基壳聚糖的红外光谱图如2所示，图2中CS表示壳聚糖，ACS-1为实施例1制备得到的十二烷基化壳聚糖，ACS-2为实施例2制备得到的十二烷基化壳聚糖，ACS-3为实施例3制备得到的十二烷基化壳聚糖，由图2可以看出，与壳聚糖相比，烷基化后1590cm-1处表征壳聚糖氨基的特征峰消失，说明在N位上发生了取代反应；随着取代度的增加(实施例1到实施例3的变化)，2920cm-1和2850cm-1左右处的烷基伸缩峰增强；此外，1461cm-1处出现了新的吸收峰说明壳聚糖分子内已引入-CH2-和-CH3基团，随着取代度的增加，烷基化趋势越来越明显。以上结果说明接枝反应确实发生在壳聚糖的氨基上，得到的产物是十二烷基化壳聚糖。
实施例4～6
构建微流控操作平台，选用LongerPump注射泵及高压电源作为产生微流控液滴的主要平台部件，采用电场力辅助射流断裂，产生尺寸大小均一可控的液滴。操作平台及微胶囊制备过程如图3所示。
1、配置1.5wt％的实施例1～3烷基化壳聚糖和5.0wt％的葡聚糖的混合溶液作为分散相，将分散相装入注射器内并置于注射泵内；
2、配置0.5wt％的海藻酸钠、6.0wt％的聚乙二醇和4.0wt％NaOH的混合溶液作为固化所用的凝固浴，置于毛细管下方的收集池中；
3、启动注射泵调节流速为25mL/h，待流速稳定后，开启高压电源，调节电压2.5×104V，待毛细管尖端稳定喷出液滴后，将收集池置于毛细管下方，边搅拌边收集；
4、微胶囊收集好后水洗至中性，放入1wt％的戊二醛中，震荡摇晃2h后，水洗3～5次，冷冻干燥得到烷基化壳聚糖止血微胶囊，对应实施例1～3的烷基化壳聚糖制备得到的烷基化壳聚糖止血微胶囊分别命名为HM-1、HM-2和HM-3。
本发明通过荧光倒置显微镜和扫描电子显微镜考察烷基化壳聚糖止血微胶囊粒径、表面形态以及具体形貌，结果如图4所示，图4中左图为荧光显微图像，右图为扫描电子图像，由图4可以看出，本发明制备的烷基化壳聚糖止血微胶囊粒径尺度较为均一，分散度较好，平均粒径为165.71±4.35μm。
测试例
1、烷基化壳聚糖止血微胶囊的安全性评价
1.1、溶血率实验：将新鲜采集的抗凝全血在室温以3000rpm转速离心10min，除去上层血浆与淡黄色部分后，用PBS将底层红细胞清洗3次。之后，用PBS配制成体积分数为2％的红细胞悬浮液。将500μL此2wt％的红细胞悬浮液分别与等体积的PBS和去离子水以及2mg壳聚糖、烷基化壳聚糖、烷基化壳聚糖止血微胶囊混匀后，37℃下温育2h。将温育后的样品和红细胞混合液在3000rpm转速下离心5min，采集上清液，用酶标仪检测570nm处吸光度，并重复测试三次，根据如下公式计算各组溶血率。
Figure BDA0003039158410000101
式中，Hemolysis为溶血率；Abs、Abs0、Absl分别为样品、PBS、去离子水与红细胞反应后的吸光值。
实验结果如表1和图5所示，壳聚糖与制备所得三种长链烷基化壳聚糖及其微胶囊的溶血率均<2.5％，符合国家药包材标准YBB00032003-2015溶血检查法的规定(样品溶血率应不超过5％)。
表1本发明实施例制备得到的烷基化壳聚糖和烷基化壳聚糖止血微胶囊的溶血率测试结果
Figure BDA0003039158410000102
1.2、细胞毒性实验：在人胚肺成纤维细胞MRC5中进行MTT测定。首先用MEM培养基配置样品浸提液，将样品经20min紫外消毒后，用MEM培养基37℃浸泡24h，浸泡样品浓度为0.4g/m，浸泡结束后，用0.45μm滤膜过滤灭菌后加入等体积含20％胎牛血清(FBS)的MEM培养基制备得到样品的浸提液；然后将MRC5细胞用0.25wt％胰酶37℃消化1min后，用培养基重悬细胞，将细胞密度调整为5×104个/ml，每孔加入100μL MRC5细胞接种在96孔板中，放入含体积浓度5％CO2、温度为37℃的培养箱中培养24h；24h后，在培养基分别加入100μL实验组用的样品浸提液中，同时设置正常培养对照组和溶剂对照组，放入CO2培养箱中继续培养48h；
①48h后，取一部分细胞，吸弃原培养液，分别将100μL无菌培养基和10μL无菌的MTT溶液加入96孔板中，放入培养箱中继续培养4h；吸弃MTT和培养基，加入SDS裂解液使沉淀重复溶解后，用酶标仪测定490nm处的吸光度，根据下列公式计算各组细胞增殖率。
Figure BDA0003039158410000111
式中，RGR为细胞相对增殖率；A0为溶剂对照组吸光度值；A1为正常培养对照组吸光值；A2为实验组吸光度值。
②48h后，取另一部分细胞，将荧光细胞染料AM和PI分别加入培养液中，继续孵育10min，用荧光显微镜观察染色细胞。其中活细胞可以被AM标记后变为绿色，死细胞被PI标记后变为红色。
细胞增殖率实验结果如表2和图6所示，壳聚糖与制备所得三种烷基化壳聚糖及其微胶囊的细胞增值率均大于80％，细胞毒性分级均为1级。结果表明，烷基化壳聚糖及其微胶囊均表现出良好的生物相容性。
表2本发明实施例制备得到的烷基化壳聚糖和烷基化壳聚糖止血微胶囊的细胞增值率测试结果
项目 CS ACS-1 ACS-2 ACS-3 HM-1 HM-2 HM-3
细胞增殖率(％) 94.46 94.21 86.90 87.1 86.92 87.57 88.67
MTT体外药效共聚焦成像结果如图7所示，由图7可以看出：与空白对照组相比，经样品浸提液培养后的绿色活细胞数量相差不大，并且细胞形态轮廓饱满，透明度好。无论是对照组还是实验组，荧光图片中几乎不见红色，这说明死细胞数量特别少，表明在培养过程中细胞少有死亡。综上所述，烷基壳聚糖及其微胶囊均无细胞毒性，具有生物安全性，可以作为医用材料应用。
1.3、抗菌性能评价：选择金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)分别作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两种不同的模型菌进行抑菌试验。首先，将材料与5mL的PBS细菌悬浮液(1×104CFU/mL)在无菌管内孵育4h；将孵育后的100μL细菌悬液涂布于固体琼脂糖培养基表面，37℃孵育24h，通过计数固体琼脂糖培养基上的菌落，记录存活细菌数。以没有经过任何处理的细菌为对照组，计算抑菌率，实验结果如表3和图8所示：阳性药物沸石粉(zeolite)对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能不明显；CS是一种天然高分子抗菌材料,对对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为74.57％和85.78％；而改进后的烷基化壳聚糖由于表面正电荷的氨基被取代，抗菌能力有所下降；但是将其制备成单分散烷基化壳聚糖止血微胶囊后，由于其粒度分布更加均匀，比表面积增大，吸附能力增强，烷基化壳聚糖止血微胶囊抗菌性能有所增强，HM-2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别达到82.45％和90.23％。
表3本发明实施例制备得到的烷基化壳聚糖和烷基化壳聚糖止血微胶囊的抑菌性能测试结果
Figure BDA0003039158410000121
1.4、止血愈合效果评价
体外凝血实验：取一定量的样品放入试管中，37℃预温1min，加入1ml抗凝血，37℃继续孵育3min，加入40μl CaCl2溶液(浓度为0.2mol/L)，同时开始计时，每隔10s取出试管并倾斜45°，观察凝血情况，直至血液完全凝固，倾斜90°也无血流流动时，记录为全血凝固时间。每个样品重复3次，以未添加样品的血液为对照组。体外凝血实验结果如表4和图9～10所示，与空白相比，本发明制备所得烷基化壳聚糖及其微胶囊的凝血效果确有明显增强，而且与阳性药物沸石粉(zeolite)相比，3号微胶囊止血效果有明显改善(p<0.05)。
表4本发明实施例制备得到的烷基化壳聚糖和烷基化壳聚糖止血微胶囊的体外凝血测试结果
项目 CG CS Zeolite ACS-1 ACS-2 ACS-3 HM-1 HM-2 HM-3
全血凝固时间(s) 677 360 210 233 190 163 207 183 160
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种烷基化壳聚糖止血微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
提供包括长链烷基化壳聚糖和葡聚糖的混合溶液作为分散相，所述长链烷基化壳聚糖中长链烷基的碳原子数12～16；
将所述分散相由微流控设备喷出，喷出的分散相液体经过高压电场喷入凝固浴中，形成微胶囊，所述凝固浴包括阴离子聚合物、聚乙二醇和碱性化合物；
将所述微胶囊在戊二醛溶液中孵育后冷冻干燥，得到烷基化壳聚糖止血微胶囊。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述长链烷基化壳聚糖为十二烷基化壳聚糖、十四烷基化壳聚糖或十六烷基化壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述十二烷基化壳聚糖的取代度10％～40％。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述分散相中长链烷基化壳聚糖的质量浓度为1.0％～2.5％；
所述分散相中葡聚糖的质量浓度为3.0％～8.0％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分散相还包括止血药物、抗菌药物和促进愈合药物中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述药物在分散相中的浓度为10000～100000IU/10ml。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述阴离子聚合物为海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇和卡拉胶中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微流控的装置包括高压电源、注射器、与所述注射器出液口连通的毛细管、与所述注射器连接的注射泵、与所述高压电源电连接的电线圈以及接收件；
所述毛细管还与所述高压电源电连接。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述将所述分散相经过高压电场微流控滴入凝固浴中包括：
将所述分散相置于注射器中，将盛装有分散相的注射器置于注射泵内；
将凝固浴置于接收件内；
启动注射泵，待流速稳定后开启高压电源，待所述毛细管尖端稳定喷出液滴后，将盛有凝固浴的接收件置于电线圈下方，收集微胶囊。
10.根据权利要求1或9所述的制备方法，其特征在于，所述凝固浴中阴离子聚合物的质量浓度为0.3％～2.0％、聚乙二醇的质量浓度为3.0％～8.0％、碱性化合物的质量浓度为2.0％～6.0％。
11.权利要求1～10任意一项所述制备方法得到的烷基化壳聚糖止血微胶囊，所述微胶囊包括壳层和实心内核，所述实心内核包括烷基化壳聚糖，或烷基化壳聚糖和包封在所述烷基化壳聚糖内的药物，所述药物包括止血药物、抗菌药物和促进愈合药物中的一种或多种；所述壳层包括固化烷基化壳聚糖和由烷基化壳聚糖和阴离子聚合物结合得到的复合物，所述壳层的厚度为10～50μm，所述微胶囊的粒径为60～600μm。
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