KR20110118859A - 코어-쉘 구조의 성장인자 전달체, 그의 제조방법 및 세포 분화 또는 증식을 위한 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 분화 및 증식에 필수적인 생리활성 성장인자를 담지할 수 있는 전달체의 제조방법에 관한 것으로, 성장인자를 포함한 2종의 성분을 하나의 캐리어에 담지함으로서 복수의 성장인자들이 개별적으로 시차를 두고 방출(temporally controlled release)될 수 있는 구조로 고안된 것이 특징이다. 구체적으로, (1) 제1 성분을 담지한 고분자 미립구(microsphere)를 제조하고 나서, 상기 고분자 미립구를 전기적하(electrodropping)방식으로 제2 성분이 포함된 다른 고분자층에 도입(encapsulation)하여 코어-쉘 구조를 가진 마이크로캡슐 형태의 전달체를 제조하는 단계, 또는 (2) 제1 성분을 담지한 고분자 용액을 전기적하 방식으로 제2 성분이 포함된 다른 고분자 내에 도입하여 마이크로캡슐 형태의 전달체를 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 복수의 성장인자를 담지한 마이크로캡슐형 전달체를 줄기세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 줄기세포 분화방법을 제공한다.

Description

코어-쉘 구조의 성장인자 전달체, 그의 제조방법 및 세포 분화 또는 증식을 위한 그의 용도{CORE-SHELL STRUCTURED DELIVERY SYSTEM FOR GROWTH FACTORS, A PREPARATION METHOD THEREOF, AND USE THEREOF FOR THE DIFFERENTIATION OR PROLIFERATION OF CELLS}

본 발명은 성장인자를 포함한 세포 분화 및 증식에 필요한 성분들을 효과적으로 전달할 수 있는 마이크로캡슐 형태의 전달체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 이를 통해 줄기세포와 조직세포의 증식 및 분화효율을 크게 개선할 수 있을 것으로 기대된다.

재생의학(regenerative medicine)의 핵심 분야로서 줄기세포 분화유도 및 조절에 대한 기초 및 응용연구가 광범위하게 진행되고 있으며 줄기세포의 임상연구도 활발하게 이루어지고 있다.

하지만, 줄기세포의 분화에 영향을 미치는 외부성장인자들에 대해서는 아직까지 그 이해가 부족한 상태이다. 예를 들면 줄기세포 분화에 필수적인 성장인자들을 in vitro나 in vivo에 적용할 때 필요한 농도, 지속시간 및 적용 위치에 대한 기본적인 이해 및 정보가 거의 전무한 실정이다.

따라서 성장인자를 담지한 전달체를 제작할 때는 가급적 장시간에 걸쳐 지속적인 방출이 가능한 형식으로 디자인하는 것이 일반적이다. 하지만 이러한 방식을 취하게 되면 다량의 성장인자를 전달체에 담지시키게 되어 세포에 유해할 수 있다. 또한, 성장인자에 지속적으로 노출됨으로 인해 외부 신호에 대한 줄기세포의 민감성이 크게 저하될 수 있고, 나아가 원하지 않는 방향으로의 분화가 유도될 개연성이 있다.

따라서 성장인자 전달시스템의 관건은 최소한의 양으로 줄기세포의 분화효율을 극대화시키는 것인데 이 때 필수적인 사항은 시간 및 위치에 따라 성장인자 전달이 차별화되어야 한다는 점이다. 왜냐하면 실제 생체 내에서 줄기세포는 항상 성장인자에 노출된 상태로 있는 것이 아니라 적절한 시점 및 장소에서 최소한의 노출로 소기의 목적을 달성하는 지극히 효과적인 메카니즘을 가지고 있을 것으로 예상되기 때문이다. 따라서 이러한 생체내 메카니즘을 모방하기 위해서는 단일 성장인자가 아니라 복수의 성장인자들이 개별적으로 시간적 또는 공간적으로 차별화되어 줄기세포에 전달될 수 있는 전달체 개발이 요구된다.

종래 기술에 따르면, 성장인자는 마이크로 혹은 나노사이즈의 미립구 표면에 부착되거나 내부에 담지된 형태의 전달체로부터 방출되는 형식을 취하거나, 고분자와 성장인자간의 물리적인 혼합을 통해서 전달될 수 있었다. 전달체 제조에는 생체적합성이 검증된 합성 또는 천연 고분자들이 사용되었으며, 단독 또는 복합화된 형태로 제조되었다.

가장 흔한 형태는 고분자를 이용해서 미립구를 제조하는 것이다. 생분해성 고분자를 이용한 미립구의 제조방법으로는 상분리법(미국 특허 제4,675,189호), 분무건조법(미국 특허 제6,709,650호), 용매증발 건조법(미국 특허 제4,652,441호) 및 저온 용매추출법(미국 특허 제5,019,400호) 등이 알려져 있으며, 또한 고분자 용매로서 디클로로메탄 또는 클로로포름 대신에 수용성 유기용매인 아세트산, 락트산, 아세톤 등을 사용하여 생체 및 세포적합성을 개선하면서 약물의 담지효율을 개선한 방법들이 있다(미국 특허 제5,100,699호).

한편 연구논문에서도 성장인자를 포함하는 미립구를 제조하고 이를 지지체 내에 포함시키거나 미립구 단독으로 줄기세포의 분화를 유도하는 연구결과들이 발표되어왔다. Chen 등은 두 개의 성장인자, 골 형성 단백질(bone morphogenic protein-2, BMP-2)과 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF)를 각각 젤라틴 미립구에 봉입하고 하이드로겔과 섞은 후 동결건조를 통해 지지체를 제조하였다(Chen et al., Biomaterials, 2009). Elisseff 등은 전환성장인자(transforming growth factor-beta, TGF-β)와 IGF를 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA) 미립구내에 포함시킨 후, 하이드로겔에 도입하여 연골세포를 배양하고 그 효과를 증명하였다(Elisseff et al., J Orthopedic Research, 2001). 한편 Jakelene 등은 각각의 성장인자를 포함하는 PLGA 미립구를 개별적으로 제조하고 이들을 삼차원 형태로 응집시킨 지지체를 구현하여 이로부터 개별적 성장인자의 특이적 방출패턴을 보고하였다(Jakelene et al., Biomaterials, 2008). 또한 Park 등은 전환성장인자가 포함된 젤라틴 미립입자를 제조한 후 하이드로겔과의 복합화를 통해 줄기세포의 분화능을 검증하였다(Park et al., Biomaterials, 2007).

그러나 위에서 언급된 접근법들은 대부분 단일성장인자를 포함하는 전달체이거나, 2종의 성장인자를 사용하더라도 단일 입자 내에 담지하는 형태인데, 이러한 경우 2종의 성장인자의 지속적 방출은 가능할지라도 이들의 방출패턴을 시간적으로 차별화시켜 줄기세포에 전달하는 데에는 한계가 있다. 본 발명이 선행기술과 구별되는 특징은, 복수의 성장인자들을 코어-쉘에 각각 담지시킴으로써 하나의 마이크로캡슐로부터 시간차 방출이 가능하다는 점이다. 이러한 성장인자들의 시간차 방출이 줄기세포에 미치는 영향은 현재 알려진 바가 거의 없으며, 본 발명에 따른 마이크로캡슐 성장인자 전달체를 이용함으로써 줄기세포 분화기전 연구에 크게 도움이 될 것으로 기대된다.

따라서, 본 발명의 목적은 기존의 성장인자 전달시스템의 문제점을 극복하고 줄기세포 분화효과를 개선시키고자 하는 것으로서, 성장인자를 포함한 세포 분화 또는 증식에 필요한 복수 성분들의 시간차 방출이 가능한 마이크로캡슐형 전달체를 개발하기 위한 것이다.

본 발명은 성장인자를 포함한 세포 분화 또는 증식에 필요한 2종의 성분들을 담지할 수 있고 각각의 시간차 방출이 가능한 전달체에 관한 것으로서, 구체적으로 코어-쉘 구조를 갖고, 상기 2종의 성분들이 코어와 쉘에 각각 담지되어 있는 마이크로캡슐형 성장인자 전달체를 제공한다. 본 발명은 기존의 성장인자 전달체에 비해, 하나의 전달체로부터 복수의 성장인자가 시차를 두고 방출됨으로써 줄기세포 분화를 더욱 효과적으로 유도하거나 조절할 수 있으며, 또한 줄기세포의 분화기전 이해에도 도움을 줄 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 성장인자 전달체는 조직세포 증식에도 효과적으로 적용될 수 있음으로써, 조직세포 재생 촉진에 기여할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “마이크로캡슐”은 고체 또는 약제생리활성 물질이 중심핵에 위치한 입자를 의미하는 것이다. 본 발명에 따른 마이크로캡슐은 그 직경이 대략 25O ~ 4OOμm, 바람직하게는 1OO ~ 2OOμm이다. 직경이 너무 클 경우 다양한 적용, 예를 들면 세포이식용 3차원 지지체내 복합화에 제한이 있고, 너무 작을 경우 다루기가 쉽지 않고 성장인자의 방출조절이 어려울 수 있다.

상기 코어 및 쉘은 생체 내에서 분해될 수 있는 무독성 고분자라면 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로 생분해성 합성 고분자 또는 천연 고분자일 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 대표적인 합성 고분자로는 예를 들어, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 락트산-카프로락톤 공중합체(PLCL), 폴리아미노산(poly(amino acid)), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 생분해성 폴리우레탄(biodegradable polyurethane) 및 이들의 공중합체 등을 들 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 생분해성 고분자는 중량평균 분자량이 5,000 내지 1,000,000 g/mol, 보다 바람직하게는 10,000 내지 500,000 g/mol 범위인 것을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용될 수 있는 대표적인 천연 고분자로는 예를 들어, 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 피브린(fibrin), 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 히알루론산 유도체(HA derivatives), 셀룰로오스(cellulose), 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives), 자가조립 펩타이드(self-assembled peptides) 및 이들의 복합체(composites) 등을 들 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 성장인자를 포함한 세포 분화 또는 증식에 필요한 2종의 성분들을 코어 및 쉘에 각각 담지하는 코어-쉘 구조의 마이크로캡슐형 전달체에 관한 것이다. 상기 성장인자는 예를 들어, 전환 성장인자(transforming growth factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 표피 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 상피 성장인자(epidermal growth factor), 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1), 안지오포이에틴-2(angiopoietin-2), 뉴로트로핀(neurotrophins), 태반 성장인자(placental growth factor, PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)) 등으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 성장인자 전달체에 담지되는 2종의 성분은 모두 성장인자일 수 있고, 어느 하나만이 성장인자일 수 있다. 2종의 성분이 모두 성장인자인 경우, 양자는 서로 다른 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 성장인자 전달체에 담지되는 2종의 성분 중 어느 하나만이 성장인자인 경우, 나머지 성분은 예를 들어, 헤파린, 동물 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬, 적혈구 증강제, 인터페론, 난포 자극 호르몬, 황체 호르몬, 고세릴린 아세테이트, 투프로레인 아세테이트, 데카펩틸의 황체 호르몬 방출 호르몬 작용제, 덱사메타손, 아스코르베이트-2-포스페이트, 베타 글리세로포스페이트, 인슐린, 글루코스, 팍클리탁셀, 라파마이신, 항염증제 등으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 본원 명세서 중에서 "복수의 성장인자"라고 언급할 때에는, 위 성분들을 포함하는 의미로 해석되어야 한다.

본 발명에서 언급되는 줄기세포는 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가 필요할 경우 혈관, 신경, 심근, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 가능성을 갖춘 세포를 의미하는 것이다. 이러한 줄기세포의 예로서 배아줄기세포, 골수줄기세포, 지방줄기세포, 제대혈줄기세포, 말초혈액줄기세포, 조혈모줄기세포, 근육줄기세포, 신경줄기세포, 유도만능줄기세포 등을 들 수 있다. 이처럼 줄기세포는 필요할 경우에만 분화능을 발휘하는데, 이는 분화에 필요한 시점 및 장소에 따라 적절한 성장인자들에 노출됨으로써 가능해진다. 본 발명은 성장인자를 포함한 세포 분화 또는 증식에 필요한 2종의 성분들을 코어 및 쉘에 각각 담지함에 따라 복수의 성장인자를 각각 시간적 또는 공간적으로 줄기세포에 차별화되어 전달됨으로써, 실제 인체내 줄기세포 분화 메커니즘을 효과적으로 모방할 수 있는 전달체를 제공한다.

본 발명에 따라 복수의 성장인자들을 코어 및 쉘에 각각 담지하는 마이크로캡슐형 전달체를 이용하게 되면, 적은 양의 성장인자로도 줄기세포의 분화효율을 극대화할 수 있다. 또한, 다량의 성장인자를 담지하지 않게 됨에 따라, 세포독성을 최소화하며, 다량의 성장인자에 노출됨에 따라 야기될 수 있는 외부 신호에 대한 줄기세포의 민감성 저하를 방지할 수 있다. 또한, 다량의 성장인자로 인해 줄기세포가 원하지 않는 방향으로 유도될 가능성도 낮아진다.

본 발명에 따른 마이크로캡슐형 성장인자 전달체는 쉘에 담지된 성장인자의 방출을 보다 지연시키기 위해 서방성 코팅으로 피복할 수 있다. 쉘 부분의 코팅층은 물리적 흡착 또는 화학적 반응을 유도하여 형성시킬 수 있으며 두께 또한 조절이 가능하다. 일단 코팅층이 형성되면 마이크로캡슐 내 성장인자의 확산에 따른 방출속도를 상당히 낮출 수 있다. 상기 서방성 코팅으로는 예를 들어, 키토산, 프로타민, 젤라틴, 콜라겐, 폴리에틸렌이민(polyethylene imine, PEI), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 히알루론산(hyaluronan) 등을 사용할 수 있지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 마이크로캡슐형 성장인자 전달체의 기계적 물성을 강화하기 위하여, 제조된 마이크로캡슐을 가교제로 처리할 수 있다. 상기 가교제로는 예를 들어, 에틸디메틸아미노프로필 카르보디이미드, 제니핀, 글루타르알데히드 등을 사용할 수 있지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 생체적용을 위해서 독성이 심한 것은 배제하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 성장인자를 포함한 세포 분화 또는 증식에 필요한 2종의 성분들을 담지할 수 있는 코어-쉘 구조의 마이크로캡슐형 성장인자 전달체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 성장인자 전달체 제조방법은 (1) 세포 분화 또는 증식에 필요한 제1 성분을 담지한 고분자 미립구(microsphere)를 제조하고 나서, 상기 고분자 미립구를 전기적하(electrodropping) 방식으로 세포 분화 또는 증식에 필요한 제2 성분이 포함된 다른 고분자층에 도입(encapsulation)하여 코어-쉘 구조를 가진 마이크로캡슐 형태의 전달체를 제조하는 단계, 또는 (2) 세포 분화 또는 증식에 필요한 제1 성분을 담지한 고분자 용액을 전기적하 방식으로 세포 분화 또는 증식에 필요한 제2 성분이 포함된 다른 고분자 내에 도입하여 마이크로캡슐 형태의 전달체를 제조하는 단계를 포함한다.

상기 제1 성분 및 제2 성분은 모두 성장인자일 수 있고, 어느 하나만이 성장인자일 수 있다. 이들 성분들에 대해서는 앞서 기재된 설명을 참조할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로캡슐형 성장인자 전달체 제조방법의 일실시태양에 따르면, 세포 분화 또는 증식에 필요한 제1 성분을 담지한 고분자 미립구를 제조하고 나서, 상기 고분자 미립구를 전기적하 방식으로 세포 분화 또는 증식에 필요한 제2 성분이 포함된 다른 고분자층에 도입하여 코어-쉘 구조의 마이크로캡슐형 전달체를 제조한다.

상기 미립구는 상분리법, 분무건조법, 용매증발 건조법 및 저온 용매추출법 등의 공지된 방법을 통해 제조될 수 있는데, 본 발명에서 언급되는 "미립구"는 용매에 녹은 고분자를 생리활성물질과 함께 유화(분산)시킨 후 에멀젼 상태로 만든 뒤 용매증발을 통해 고분자를 경화시켜 얻어지는 고형화된 입자를 말한다.

특정 실시태양에 있어서, 상기 미립구는 내부에 상호 연결된 다수의 기공을 갖는 동시에 표면은 덮혀져 있는 구조를 가질 수 있지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 표면이 덮힌 구조는 본 발명에 따른 마이크로캡슐형 성장인자 전달체 중 코어에 담지된 제1 성분이 투여 초기에 과도하게 방출되는 것을 제어가능하게 하고, 내부의 다공성 구조는 상기 제1 성분이 지속적으로 방출되는 효과를 발휘할 수 있게 한다. 본 발명을 상기 실시태양에 따라 구현하는 경우, 미립구의 크기는 50 내지 100 μm이고, 다공도가 최소 0에서 최대 98%인 범위가 바람직하다. 상기와 같은 미립구를 제조하는 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 대한민국 특허출원 공개번호 제10-2009-0131975호 및 미국 특허출원 공개번호 제2009/0317478호에 잘 기재되어 있다.

본 발명에 따른 마이크로형 성장인자 전달체의 코어 부분을 고분자 미립구를 사용하여 제조하는 경우, 미립구를 다양한 형태(morphology)로 미리 만들어서 마이크로캡슐 내에 담지할 수 있는 장점이 있다. 또한, 미립구의 형태가 변함에 따라 방출패턴이 차별화되는 경우, 최적의 미립구 형태를 확인함으로써 원하는 방출 프로파일을 신뢰도 있게 제공할 수 있는 마이크로캡슐을 제공할 수도 있다.

본 발명에 따른 마이크로캡슐형 성장인자 전달체를 제조하는 다른 실시태양에 따르면, 세포의 분화 또는 증식에 필요한 제1 성분을 담지한 고분자 용액을 전기적하 방식으로 세포의 분화 또는 증식에 필요한 제2 성분이 포함된 다른 고분자 내에 도입하여 코어-쉘 구조의 마이크로캡슐 형태의 전달체를 제조한다.

제1 성분을 담지한 고분자 용액은, 유기용매에 생분해성 고분자 및 제1 성분을 함께 포함시키거나, 생분해성 고분자만 용해시킨 후 거기에 제1 성분을 현탁시켜 제조할 수 있다.

상기 생분해성 고분자를 용해시키는데 사용될 수 있는 유기용매로는 고분자의 종류에 따라 달라질 수 있지만, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 사염화탄소, 아세톤, 다이옥산, 테트라하이드로푸란, 헥사플루오로이소프로판올 등을 예로 들 수 있다. 그 중에서도 메틸렌클로라이드와 클로로포름을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 마이크로캡슐형 성장인자 전달체의 코어 부분을 고분자 용액을 사용하여 제조하는 경우, 정확하게 하나의 코어 부분과 이를 둘러싼 쉘의 구성이 가능하다. 또한, 전체적인 마이크로캡슐의 크기 조절이 보다 용이하다.

본 발명에 있어서, 제1 성분을 담지한 고분자 미립구 또는 고분자 용액을 제2 성분을 담지한 고분자 내로 도입하는 것은 전기적하 방식을 통해 수행하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

전기적하법은 전기적인 힘에 의해 액체를 작은 액적들로 분산시키는 방법으로서, 마이크로 및 나노사이즈의 입자를 제조하는데 유용하게 사용된다. 구체적으로, 고전압의 전기장을 걸어줌으로써 고분자 용액을 하전시키고, 전하를 띤 고분자 용액을 미세관을 통해 분사한다. 미세관을 통해 이동한 고분자 용액은 바늘 끝에서 콘-제트(cone-jet)를 형성하게 되는데, 이 때 점도가 높은 고분자는 섬유(fiber) 형태로 분산되지만, 점도가 적당한 고분자의 경우에는 마이크로사이즈의 구형입자를 얻을 수 있다.

전기 적하시 조건은 적하시키는 고분자의 종류, 분자량, 흐름속도, 적용된 전압 등에 따라 달라지지만, 본 발명에 적용된 예는, 전압은 5,000 - 10,000 V, 분사속도는 코어 부분은 0.1 - 1.2 ml/시이고 쉘 부분은 0.03 - 0.5 ml/시이다. 그리고 노즐 사이즈는 코어 부분은 20 내지 26 게이지, 쉘 부분은 15 내지 18 게이지 정도이다. 동축 분사 시스템에서는 코어 부분의 노즐 사이즈는 쉘 부분의 그것보다 반드시 작아야 한다.

상기 전기적하에는 동축(coaxial) 분사 시스템이 사용될 수 있다. 구체적으로, 제1 성분을 담지한 고분자 미립구 또는 고분자 용액은 안쪽 바늘을 통해 적하되고, 제2 성분을 담지한 고분자 용액은 바깥쪽 바늘을 통해 적하되며, 제2 성분을 담지한 고분자 용액이 먼저 바깥쪽에서부터 가교됨으로써, 쉘 구조를 형성한다.

코어 부분을 고분자 미립구를 사용하여 제조하는 경우, 위와 같이 쉘 구조가 형성됨에 따라, 내부는 제1 성분이 담지되어 있고 외부는 제2 성분이 담지되어 있는 코어-쉘 구조의 마이크로캡슐형 전달체가 제조된다. 하지만, 코어 부분을 고분자 용액을 사용하여 제조하는 경우, 위와 같이 쉘 구조가 형성되더라도, 내부는 여전히 유기용매와 함께 액체 상태로 존재하기 때문에, 상기 유기용매를 제거하고 고분자의 고형화를 유도하기 위해 용매증발 등의 추가 처리가 필요할 수 있다.

제1 성분을 담지하는 고분자 미립구 또는 고분자 용액과 제2 성분을 담지하는 고분자 용액은 동시에 배출되는데 이는 마이크로캡슐 내 코어-쉘 구조를 형성을 위해 필수적이다. 서로 다른 고분자 용액은 각각의 바늘을 통해 따로 흐르지만 배출되기 직전 동축의 바늘 끝에서 서로 합쳐지면서 코어-쉘 구조를 형성하면서 떨어지게 된다.

본 발명은 또한, 상기 예시한 방법에 따라 제조되는 마이크로캡슐형 전달체를 이용하여, 복수의 성장인자들의 개별적 방출거동을 in vitro에서 확인하는 단계를 포함하는, 복수의 성장인자들의 개별적 방출거동 확인 방법을 제공한다. 상기 방법은, 코어와 쉘에 포함된 성장인자의 위치를 변경하여 방출패턴을 변경 이전의 것과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법에 따르면, 복수의 성장인자들의 개별적 방출거동을 확인할 수 있을 뿐 아니라, 특정 성장인자 조합의 방출 거동을 최적으로 제어할 수 있는 생분해성 고분자를 선택할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 예시한 방법에 따라 제조되는 마이크로캡슐형 전달체를 이용하여, 복수의 성장인자들이 줄기세포를 분화하는 효과를 in vitro에서 확인하는 단계를 포함하는, 복수의 성장인자들의 줄기세포 분화능 측정 방법을 제공한다. 복수의 성장인자가 시간차이를 두고 줄기세포에 전달될 경우 줄기세포의 분화에 미치는 영향에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다. 따라서, 상기 방법을 이용함으로써, 특정 성장인자 조합이 갖는 줄기세포 분화능을 보다 간편하게 검토할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 복수의 성장인자를 담지한 마이크로캡슐형 전달체를 줄기세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 줄기세포 분화방법을 제공한다. 본 발명에 따른 성장인자 전달체를 이용하면, 고가의 성장인자를 다량으로 사용하지 않고도 효율적으로 줄기세포를 분화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 복수의 성장인자를 담지한 마이크로캡슐형 전달체는 조직세포 증식에도 효과적으로 적용될 수 있음으로써, 손상된 조직세포 재생 촉진에 기여할 수 있다.

본 발명에 따른 복수의 성장인자를 담지한 마이크로캡슐형 전달체는 줄기세포 분화능의 극대화 및 조직세포(예를 들어, 심근세포, 신경세포, 연골세포, 조골세포, 파골세포, 간세포, 췌장세포, 내피세포, 상피세포, 평활근세포, 추간판세포(intervertebral disc cell) 등) 증식과 분화 촉진을 통해 난치성 질환치유 및 손상된 인체조직의 재건 및 재생에도 유용하게 사용될 수 있다. 이에, 본 발명은 본 발명에 따른 복수의 성장인자를 담지한 마이크로캡슐형 전달체를 유효성분으로 함유하는 난치성 질환 치유 및 조직 재건 또는 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명은 기존의 단일성장인자가 포함된 전달체 개념에서 벗어나 하나의 전달체로부터 복수의 성장인자가 시간차를 두고 줄기세포에 전달될 수 있는 복수성장인자 전달체 개념을 도입한 것이 특징이다. 성장인자 방출을 다양하게 조절할 수 있는 본 발명에 따른 시스템을 통해 줄기세포의 분화능을 크게 개선시킬 수 있을 뿐 아니라, 성장인자를 이용한 줄기세포 분화기전을 연구하는 데 도움이 될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 따른 복수성장인자 전달체는, in vitro에서의 줄기세포 분화능의 극대화 및 조직세포 증식과 분화를 통해 난치성 질환치유 및 손상된 인체조직의 재건 및 재생에도 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1A는 PLGA 미립구를 전기적하 방식으로 알지네이트 내로 도입시키기 위한 예시적인 동축 시스템의 모식도이고,
도 1B는 상기 도 1A과 같은 시스템을 통해 제조된 본 발명에 따른 마이크로캡슐(실시예 2)의 광학 이미지이고,
도 1C는 PLGA 에멀젼을 전기적하 방식으로 알지네이트 내로 도입시키기 위한 예시적인 동축 시스템의 사진이고,
도 2는 상기 도 1C와 같은 시스템을 통해 제조된 본 발명에 따른 마이크로캡슐(실시예 3)의 광학 이미지이고,
도 3은 골 형성단백질(BMP-2)을 함유한 PLGA 코어와 덱사메타손을 함유한 알지네이트 쉘로 구성된 마이크로캡슐(M1) 및 덱사메타손을 함유한 PLGA 코어와 골 형성단백질(BMP-2)을 함유한 알지네이트 쉘로 구성된 마이크로캡슐(M2)의 시간에 따른 방출 프로파일이고,
도 4는 골 형성단백질(BMP-2)을 함유한 코어와 덱사메타손을 함유한 쉘로 구성된 마이크로캡슐(M1) 및 덱사메타손을 함유한 코어와 골 형성단백질(BMP-2)을 함유한 쉘로 구성된 마이크로캡슐(M2)를 이용해서 쥐의 골수유래 줄기세포의 골 세포로의 분화효과를 RT-PCR을 통해 확인한 결과로서, 타입 I 콜라겐(Col Ia), 알칼리성 포스파타제(ALP), 오스테오칼신(OC) 및 오스테오폰틴(OP)의 mRNA 전기영동 사진(A) 및 정규화된 발현도 그래프(B)이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

< 실시예 1> 고분자 PLGA 미립구 제조

본 실시예에서는 W1/O/W2 다중에멀젼 방법으로 고분자 미립구를 제조하였다. 우선, 생분해성 고분자인 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Germany, 50:50)를 용해시킬 수 있는 적당한 유기용매에 생분해성 고분자와 생리활성물질을 함께 현탁시킨다. PLGA 200 mg을 유기용매인 클로로포름 4ml에 녹인 후 4.5% 우태혈청(BSA) 과 BMP-2를 3 mg을 넣었다. 에멀젼화를 위해 계면활성제인 4.5% PVA를 첨가한 후 90초 동안 초음파 처리한 후 이 용액을 0.2% PVA 용액에 넣고 교반기를 이용하여 실온에서 4시간 정도 빠르게 교반시켰다. 이 후 유기용매인 클로로포름을 완전히 증발시킨 뒤 고형화된 미립구를 수거하여 세척한 후 동결건조 하였다.

< 실시예 2> PLGA 미립구의 알지네이트내 캡슐화

실시예 1에서 얻어진 PLGA 미립구를 알지네이트를 이용하여 캡슐화하였다. 알지네이트를 이용한 고분자 미립구의 캡슐화는 동축바늘 (coaxial needle)을 이용한 전기적하(electrodropping)방법을 통해 이루어졌다. 동축바늘의 안쪽 바늘은 약 100 ㎛ 사이즈의 PLGA 미립구가 통과할 수 있도록 20게이지가 사용되었으며 바깥쪽에는 17게이지를 사용하였다. 캡슐화는 각각 80-120cp 와 500-600cp의 점도를 갖는 알지네이트가 이용되었는데, 1 mL의 알지네이트 용액 (0.5%, w/v)에 10 mg의 미립구를 넣어 현탁하고 1cc 주사기를 이용하여 동축 시스템 내 안쪽바늘에 위치시키고 바깥쪽 바늘은 500-600cp 알지네이트 용액에 덱사메사손을 첨가하여 20cc 주사기를 통해 주입하였다. 동축 시스템으로부터의 알지네이트 용액의 방출은 두 개의 주압기 펌프(syringe pump)를 이용하였고 각각 펌프의 흐름속도(flow rate)는 안쪽바늘에서 0.1 ml/h, 바깥쪽은 0.5 ml/h로 고정하였다. 마이크로캡슐 크기를 줄이기 위해 알지네이트 용액의 적하시 8000V의 고전압을 걸어주었다. 이렇게 전기 적하되는 알지네이트 용액은 회전하고 있는 1M CaCl2 용액에 떨어지게 되고 바깥쪽부터 가교(crosslinking)가 형성되어, 최종적으로 마이크로캡슐 코어는 BMP-2를 포함하는 PLGA 미립구로 구성되고, 쉘은 덱사메사손이 포함된 알지네이트 층으로 구성된 복수성장인자 전달체가 제조되었다(도 1B). 이들의 사이즈는 200-300μm 범위였다.

< 실시예 3> PLGA 고분자용액의 알지네이트내 캡슐화

본 실시예에서는 PLGA 미립구 대신 PLGA 용액을 코어 층에 포함하는 복수성장인자 전달체를 만드는 방법을 제시한다. 폴리락트산-글리콜산 공중합체 PLGA 0.3g을 클로로포름 8 ml에 용해시킨 후 성장인자인 BMP-2 (100 ng)를 첨가하였다. 성장인자가 고르게 분포되도록 하기 위해 초음파 분쇄기를 30% 출력으로 30초 동안 작동하여 에멀젼(emulsion)을 유도하였다. 이렇게 만들어진 용액을 10cc 주사기를 이용하여 동축 시스템 내 안쪽 바늘에 위치시켰다. 또한 바깥쪽 바늘에는 0.5 % 알지네이트 용액(50 ml)에 덱사메사손 5 mg을 첨가하여 20 ml 주사기를 통해 채워주었다. 실시예 2에서와 동일하게 두 개의 주압기 펌프(syringe pump)를 이용하여 안쪽바늘에서는 0.6 ml/h, 바깥쪽에서는 0.3 ml/h의 흐름속도를 유지시켰다. 고전압하에서 동축 시스템으로부터 적하되는 알지네이트 용액은 회전하고 있는 1M CaCl2 용액에 떨어지게 되고 바깥쪽부터 가교되어 내부는 PLGA, 외부는 알지네이트층인 마이크로캡슐을 형성하며 대략 300-400 ㎛의 직경을 가진다. 이 후 코어부분의 PLGA에 포함된 용매를 제거하고 고분자의 고형화를 유도하기 위해 마이크로캡슐을 300 ml PVA (0.25%, w/v)에서 4시간 동안 교반하였고, 물기를 제거한 뒤 데시케이터에서 유기용매를 완전히 증발시켰다. 최종적으로 BMP-2가 담지된 코어와 덱사메사손이 담지된 쉘로 구성된 마이크로캡슐이 제조되었다(도 2).

< 실시예 4> 본 발명에 따른 마이크로캡슐을 통한 복수성장인자들의 방출거동 평가

마이크로캡슐 형태의 복수성장인자 전달체의 코어에 포함된 BMP-2와 쉘에 존재하는 덱사메타손의 방출거동을 시험하기 위해, 실시예 3을 통해 제조된 마이크로캡슐을 PBS 용액에 담궈 4주간 방출패턴을 관찰하였다(M1). 또한, BMP-2와 덱사메타손의 위치를 변경하여 방출패턴을 서로 비교 실험하였다(M2). 얻어진 방출패턴은 도 3에 나타나 있다.

< 실시예 5> 본 발명에 따른 마이크로캡슐을 이용한 줄기세포 분화시험

골 형성단백질(BMP-2)을 함유한 코어와 덱사메타손을 함유한 쉘로 구성된 마이크로캡슐(M1) 및 덱사메타손을 함유한 코어와 골 형성단백질(BMP-2)을 함유한 쉘로 구성된 마이크로캡슐(M2)를 이용해서 쥐의 골수유래 줄기세포의 골 세포로의 분화효과를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 구체적으로, 골 분화 특이적 마커들인 타입 I 콜라겐(Col Ia), 알칼리성 포스파타제(ALP), 오스테오칼신(OC) 및 오스테오폰틴(OP)의 발현 정도를 시간에 따라 측정하였고, 그 결과를 도 4에 정성적(A) 및 정량적(B)으로 나타내었다.

줄기세포를 포함하는 알지네이트 비드를 만들기 위해서 클린 벤치 내에서 3 ml 알지네이트 용액(1%, w/v), 래트 골수유래 줄기세포(BMSC; 5 x 106) 그리고 복수성장인자 담지 마이크로캡슐(50 mg)을 고르게 섞는다. 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 섞여진 줄기세포를 포함하는 알지네이트 혼합체를 멸균된 5cc 주사기와 15 게이지의 주사바늘을 이용하여 회전하고 있는 0.1M CaCl2 에 떨어뜨림으로써, 알지네이트가 가교되면서 고형화된 비드가 형성된다. 이렇게 제조된 알지네이트 비드는 줄기세포 배양을 위한 3차원 지지체(scaffold) 역할을 하는 것으로서, 생리식염수로 세척한 후 실험그룹별로 각기 다른 조건에서 일정기간 배양하였다. 대조군은 복수성장인자가 담지되지 않은 마이크로캡슐을 포함하는 알지네이트 비드로서 골 분화 배양액(DMEM(1% 페니실린/스트렙타마이신 함유), 10% 우태아혈청, 10mM β-글리세로포스페이트, 50μg/ml 아스코르베이트-2-포스페이트, 덱사메사손) 내에서 4 주간 배양하였다. 한편 두 개의 실험군은 복수성장인자가 담지된 마이크로캡슐(M1 또는 M2)을 각각 포함하는 알지네이트 비드로서 BMP-2와 덱사메사손이 배제된 골 분화 배양액을 이용해서 37℃ 인큐베이터에서 4주간 배양하였다. 한편 줄기세포의 골 분화 특이적 유전자 분석을 위해서 각각 2주 및 4주간 배양된 비드를 각각 1.5 ml 튜브에 넣고 트리졸(Trizol) 1 ml을 첨가하고 마이크로 분쇄기를 이용하여 비드를 해체하였다. 이 후의 과정은 세포에서 RNA를 분리하는 일반화된 프로토콜을 따라서 수행하였다. 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하게 되는데 Maxime RT Premix (Intron)를 이용해서 역전사(reverse transcription)를 수행하여 얻어진 cDNA를 주형으로 사용하여 골 분화 특이적 마커 유전자들인 오스테오칼신(OC), 오스테오폰틴(OP), 타입 I 콜라겐(Col Ia), 알칼리성 포스파타제(ALP)의 발현정도를 PCR을 통해 비교분석하였다.

유전자 발현 결과(도 4)는, 복수성장인자를 담지한 본 발명에 따른 마이크로캡슐을 포함하는 실험군의 경우, 대조군에 비해, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 타입 I 콜라겐의 발현이 상대적으로 강하게 나타난 것을 알 수 있다. 그리고 각기 다른 방출거동을 가진 실험군들인 M1 및 M2 사이에는, 확연한 차이를 보이지는 않지만 M2의 경우, 상대적으로 특히 2주 배양에서 오스테오칼신과 ALP의 발현이 높게 나타났다.

Claims (31)

1. 코어-쉘 구조를 갖고, 세포 분화 또는 증식에 필요한 2종의 성분들이 코어 및 쉘에 각각 담지되어 있으며, 상기 2종의 성분들 중 하나 이상은 성장인자인 성장인자 전달체.
2. 제1항에 있어서, 세포 분화 또는 증식에 필요한 2종의 성분들이 모두 성장인자이며, 각각 독립적으로 전환 성장인자(TGF-β), 섬유아세포 성장인자(FGF), 골 형성 단백질(BMP), 혈관내피 성장인자(VEGF), 표피 성장인자(EGF), 인슐린-유사 성장인자(IGF), 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 신경 성장인자(NGF), 간세포 성장인자(HGF), 상피 성장인자, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 뉴로트로핀, 태반 성장인자(PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 성장인자 전달체.
3. 제1항에 있어서, 세포 분화 또는 증식에 필요한 2종의 성분들 중 어느 하나만이 성장인자이며, 나머지 성분은 헤파린, 동물 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬, 적혈구 증강제, 인터페론, 난포 자극 호르몬, 황체 호르몬, 고세릴린 아세테이트, 투프로레인 아세테이트, 데카펩틸의 황체 호르몬 방출 호르몬 작용제, 덱사메타손, 아스코르베이트-2-포스페이트, 베타 글리세로포스페이트, 인슐린, 글루코스, 팍클리탁셀, 라파마이신 및 항염증제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 성장인자 전달체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로캡슐형인 성장인자 전달체.
5. 제4항에 있어서, 마이크로캡슐의 직경이 100 ~ 400μm인 성장인자 전달체.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 및 쉘 중 어느 하나 또는 양자 모두가 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 락트산-카프로락톤 공중합체(PLCL), 폴리아미노산(poly(amino acid)), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 생분해성 폴리우레탄(biodegradable polyurethane) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 고분자로 제조된 것인 성장인자 전달체.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 및 쉘 중 어느 하나 또는 양자 모두가 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 피브린(fibrin), 히알루론산(hyaluronic acid), 히알루론산 유도체, 셀룰로오스(cellulose), 셀룰로오스 유도체, 자가조립 펩타이드(self-assembled peptide) 및 이들의 복합체(composite)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 고분자로 제조된 것인 성장인자 전달체.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 쉘이 키토산, 프로타민, 젤라틴, 콜라겐, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리-L-라이신, 덱스트란 설페이트 및 히알루론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서방성 코팅으로 피복되어 있는 성장인자 전달체.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 에틸디메틸아미노프로필 카르보디이미드, 제니핀 및 글루타르알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교제가 쉘에 처리된 것인 성장인자 전달체.
10. 세포 분화 또는 증식에 필요한 제1 성분을 포함한 고분자 미립구를 제조하는 단계;
    상기 고분자 미립구를 세포 분화 또는 증식에 필요한 제2 성분이 포함된 다른 고분자 내에 도입하여 코어-쉘 구조의 마이크로캡슐을 제조하는 단계
    를 포함하며,
    상기 제1 성분 및 제2 성분 중 하나 이상은 성장인자인 코어-쉘 구조의 마이크로캡슐형 성장인자 전달체 제조 방법.
11. 제10항에 있어서, 세포 분화 또는 증식에 필요한 제1 성분 및 제2 성분이 모두 성장인자이며, 각각 독립적으로 전환 성장인자(TGF-β), 섬유아세포 성장인자(FGF), 골 형성 단백질(BMP), 혈관내피 성장인자(VEGF), 표피 성장인자(EGF), 인슐린-유사 성장인자(IGF), 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 신경 성장인자(NGF), 간세포 성장인자(HGF), 상피 성장인자, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 뉴로트로핀, 태반 성장인자(PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
12. 제10항에 있어서, 세포 분화 또는 증식에 필요한 제1 성분 및 제2 성분 중 어느 하나만이 성장인자이며, 나머지 성분은 헤파린, 동물 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬, 적혈구 증강제, 인터페론, 난포 자극 호르몬, 황체 호르몬, 고세릴린 아세테이트, 투프로레인 아세테이트, 데카펩틸의 황체 호르몬 방출 호르몬 작용제, 덱사메타손, 아스코르베이트-2-포스페이트, 베타 글리세로포스페이트, 인슐린, 글루코스, 팍클리탁셀, 라파마이신 및 항염증제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 미립구가 상분리법, 분무건조법, 용매증발 건조법 및 저온 용매추출법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미립구가 내부에 상호 연결된 다수의 기공을 갖는 동시에 표면은 덮혀져 있는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
15. 세포 분화 또는 증식에 필요한 제1 성분을 포함한 고분자 용액을 세포 분화 또는 증식에 필요한 제2 성분이 포함된 다른 고분자 내에 도입하여 코어-쉘 구조의 마이크로캡슐을 제조하는 단계를 포함하며,
    상기 제1 성분 및 제2 성분 중 하나 이상은 성장인자인 코어-쉘 구조의 마이크로캡슐형 성장인자 전달체 제조 방법.
16. 제15항에 있어서, 세포 분화 또는 증식에 필요한 제1 성분 및 제2 성분이 모두 성장인자이며, 각각 독립적으로 전환 성장인자(TGF-β), 섬유아세포 성장인자(FGF), 골 형성 단백질(BMP), 혈관내피 성장인자(VEGF), 표피 성장인자(EGF), 인슐린-유사 성장인자(IGF), 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 신경 성장인자(NGF), 간세포 성장인자(HGF), 상피 성장인자, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 뉴로트로핀, 태반 성장인자(PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
17. 제15항에 있어서, 세포 분화 또는 증식에 필요한 제1 성분 및 제2 성분 중 어느 하나만이 성장인자이며, 나머지 성분은 헤파린, 동물 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬, 적혈구 증강제, 인터페론, 난포 자극 호르몬, 황체 호르몬, 고세릴린 아세테이트, 투프로레인 아세테이트, 데카펩틸의 황체 호르몬 방출 호르몬 작용제, 덱사메타손, 아스코르베이트-2-포스페이트, 베타 글리세로포스페이트, 인슐린, 글루코스, 팍클리탁셀, 라파마이신 및 항염증제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분을 포함한 고분자 용액이 용매에 고분자 및 제1 성분을 함께 용해시킴으로써 얻어진 것을 특징으로 하는 제조 방법.
19. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분을 포함한 고분자 용액이 용매에 고분자를 용해시킨 후, 거기에 제1 성분을 현탁시켜 얻어진 것을 특징으로 하는 제조 방법.
20. 제10항 내지 제12항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로캡슐을 제조하는 단계가 전기적하 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
21. 제10항 내지 제12항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 마이크로캡슐을 키토산, 프로타민, 젤라틴, 콜라겐, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리-L-라이신, 덱스트란 설페이트 및 히알루론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서방성 코팅으로 피복하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
22. 제10항 내지 제12항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 에틸디메틸아미노프로필 카르보디이미드, 제니핀 및 글루타르알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교제를 이용하여 성장인자 전달체의 기계적 물성을 강화하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
23. 제10항 내지 제12항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분을 포함한 고분자 및 제2 성분을 포함한 고분자 중 어느 하나 또는 양자 모두가 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 락트산-카프로락톤 공중합체(PLCL), 폴리아미노산(poly(amino acid)), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 생분해성 폴리우레탄(biodegradable polyurethane) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 고분자인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
24. 제10항 내지 제12항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분을 포함한 고분자 및 제2 성분을 포함한 고분자 중 어느 하나 또는 양자 모두가 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 피브린(fibrin), 히알루론산(hyaluronic acid), 히알루론산 유도체, 셀룰로오스(cellulose), 셀룰로오스 유도체, 자가조립 펩타이드(self-assembled peptide) 및 이들의 복합체(composite)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 고분자인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
25. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분을 포함하는 고분자 미립구의 현탁액과 제2 성분을 포함하는 고분자 용액을 동시에 배출하여 마이크로캡슐을 제조하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
26. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분을 포함하는 고분자 용액과 제2 성분을 포함하는 고분자 용액을 동시에 배출하여 마이크로캡슐을 제조하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
27. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 성장인자 전달체, 또는 제10항 내지 제12항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조된 성장인자 전달체를 줄기세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 방법.
28. 제27항에 있어서, 줄기세포가 배아줄기세포, 골수줄기세포, 지방줄기세포, 제대혈줄기세포, 말초혈액줄기세포, 조혈모줄기세포, 근육줄기세포, 신경줄기세포, 유도만능줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포 분화 방법.
29. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 성장인자 전달체, 또는 제10항 내지 제12항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조된 성장인자 전달체를 조직세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 조직세포 증식 및 분화 방법.
30. 제29항에 있어서, 조직세포가 심근세포, 신경세포, 연골세포, 조골세포, 파골세포, 간세포, 췌장세포, 내피세포, 상피세포, 평활근세포 및 추간판세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직세포 증식 및 분화 방법.
31. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 성장인자 전달체, 또는 제10항 내지 제12항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조된 성장인자 전달체를 포함하는 조직 재건 또는 재생을 위한 조성물.

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