KR20160036737A

KR20160036737A - 성장인자를 함유한 생분해용 폴리머-쉘화된 메소포러스 나노구가 삽입된 치료용 폼 스캐폴드

Info

Publication number: KR20160036737A
Application number: KR1020140128458A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 김태현; 모하메드 엘토하미; 김미주
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2016-04-05
Also published as: KR101629563B1

Abstract

본 발명은 약물을 담지할 수 있는 기공크기를 갖는 메소포러스 실리카 나노구 코어 및 생분해성 고분자 쉘을 포함하는 하이브리드 나노전달체; 및 상기 나노전달체가 충진된 3차원 콜라겐 구조물을 구비한 폼 스캐폴드, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약물전달용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 폼 스캐폴드에 삽입된 하이브리드 실리카 나노구는 평균 ~12.2 nm의 높은 기공 평균직경을 가지며, 폴리유산(PLA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)으로 쉘화가 되어 콜라겐 구조물내에 담지된 경우 이에 담지된 약물(예, 산성의 섬유아세포 성장인자(aFGF))은 월등하게 지속가능한 속도로 방출될 수 있다.

Description

성장인자를 함유한 생분해용 폴리머-쉘화된 메소포러스 나노구가 삽입된 치료용 폼 스캐폴드{Therapeutic foam scaffolds incorporating biopolymer-shelled mesoporous nanospheres with growth factors}

본 발명은 메소포러스 실리카 나노구 코어 및 생분해성 고분자 쉘을 포함하는 하이브리드 나노전달체; 및 상기 나노전달체가 충진된 콜라겐 구조물을 구비한 폼 스캐폴드, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약물전달용 조성물에 관한 것이다.

조직 재생은 손상되고 퇴화한 조직 내 조직 기능을 회복하기 위해 차세대 의료용 치료법으로 여겨지는 현재 가장 중요한 패러다임이다. 재생용 치료법에 있어서, 가능한 수단으로는 약물, 성장인자(GF) 및 핵산과 같은 치료용 분자뿐만 아니라 조직 세포, 특히 전구세포 및/또는 줄기세포에 대한 전달시스템이 있다. 나아가 복구 및 재생 프로그램에서 세포의 기능을 현저히 향상시킬 수 있는 조절 가능하고 지속 가능하며 심지어 요구에 따른 및 표적 특이적인 약물 전달 시스템이 고안되고 있다. 3차원으로 배열된 매트릭스는 조직세포를 적절히 담지하고 골격화하여, 줄기세포 치료뿐만 아니라 조직-유사 구조의 생체 외 조작을 허용한다. 많은 생물학적 분자가 줄기세포기능 및 조직 재생 과정에 관여하므로, 세포 및 생물학적 분자 사이의 조절된 상호작용은 특별히 중요하다. 이러한 맥락에서 치료 가능성을 내포하는 3-D 스캐폴드는 조직 복구 및 재생에 있어서 표적된 기능에 대한 줄기세포의 잠재력을 조절하기 위한 이상적인 시스템으로 간주된다.

생물학적 분자들 중, 성장인자(growth factors; GF)는 줄기세포 기능 및 조직 재생에 관련된 가장 잘 알려진 자극제 또는 조절제 중 하나이다. GF에 대한 전달 시스템의 범위는 생분해성 폴리머(biopolymer) 나노/마이크로입자, 덴드리머(dendrimer) 및 무기 나노전달체를 포함한다. 단백질의 경우, 크기가 상대적으로 크고(화학물 약물 또는 유전자와 비교하였을 때), 3-D 단백질 구조를 안전하게 보존하기 위해 물에 기반한 공정 조건이 요구되므로, 따라서 친수성의 전달체가 선호된다. 조직 복구 및 재생 과정에 요구되는 지속적인 투여량을 제공하기 위하여 수 주 내지 수 개월에 걸친 상대적으로 장기간 방출이 고도로 요구된다. 적절한 전달시스템 없이는, 생리적인 조건에서 GF의 짧은 반감기로 인해 GF를 고용량으로 연속 처리하는 것이 불가피하다.

지금까지의 연구는 GF를 담지할 수 있는 메소포러스 실리카 나노구(MSN)에 집중되어 왔다. 실리카계 나노물질류인 MSN은 예를 들면 화학물, 단백질 및 유전자와 같은 다양한 치료용 분자를 담지하기에 효과적인 전달체로 여겨져 왔다. 나노입자 평균직경은 세포 내 침투를 허용하는 효과적인 크기인 수십 내지 수백의 나노미터의 범위에서 조절가능하다. 특히, 나노구를 통해 존재하는 메소기공 채널은 분자를 수용할 수 있는 넓은 공간과 면적을 제공한다. 따라서, 메소기공의 평균직경 및 구조는 담지효율을 결정하는 데 특별히 중요하다. GF의 경우, 상대적으로 큰 평균직경(분자량에서 수십 킬로달톤)으로 인해, MSN의 확대된 메소기공이 메소기공 구조 내에 이들을 삽입하는데 보다 효과적일 수 있다. 또한, 표면을 쉽고 적절하게 조절하여 약물 분자에 친화도를 제공할 수 있고 때때로 분자 프로브(molecular probe)와 화학적 연결도 허용할 수 있다. 이러한 점들이 GF을 담지하기위한 매력적인 후보로서 MSN을 특징짓는다.

만족스러운 생물학적 작용을 성취하기 위하여, GF의 전달은 장기간, 일반적으로 수주 내지 수개월을 필요로 한다. 그러나, MSN으로부터 단백질을 포함하는 생체분자의 방출은 일반적으로 수일 내지 1주에 완료된다. 또한, 이는 항생제 및 항암제와 같은 몇 가지 형태의 약물의 경우에서 지속가능한 것으로 수용되는 반면, GF에 대하여 조직 재생에 있어서 생체 내 효능을 향상시키기 위해서는 보다 연장된 방출 프로파일이 실질적으로 요구된다. GF가 메소기공 채널 내에 삽입되고 기공 표면에 흡착되었음에도 불구하고, GF의 해리 및 메소기공 채널을 통한 확산이 생물학적 이온성 매질에서 발생할 수 있다.

본 발명은 메소포러스 실리카 나노구 코어 및 생분해성 고분자 쉘을 포함하는 하이브리드 나노전달체; 및 상기 나노전달체가 충진된 콜라겐 구조물을 구비한 폼 스캐폴드, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 제1양태는 약물을 담지할 수 있는 기공크기를 갖는 메소포러스 실리카 나노구 코어 및 생분해성 고분자 쉘을 포함하는 하이브리드 나노전달체; 및 상기 나노전달체가 충진된 3차원 콜라겐 구조물을 구비한 폼 스캐폴드를 제공한다.

본 발명의 제2양태는 제1양태의 폼 스캐폴드의 제조방법으로서, 1) 염화 나트륨을 포함하는 반응 용액을 이용하여 메소포러스 실리카 나노구(MSN)를 제조하는 단계; 2) 아민 작용기를 갖도록 메소포러스 실리카 나노구를 처리하는 단계; 3) 상기 아민 작용기를 갖는 메소포러스 실리카 나노구를 생분해성 고분자로 쉘화하는 단계; 및 4) 상기 제조된 메소포러스 실리카 나노구를 콜라겐 구조물에 삽입하는 단계를 포함하는 것이 특징인 폼 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제3양태는 제2양태의 제조방법에 따른 폼 스캐폴드를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명에 따른 3차원 콜라겐 구조물을 구비한 폼 스캐폴드는, 약물을 담지할 수 있는 기공크기를 갖는 메소포러스 실리카 나노구 코어 및 생분해성 고분자 쉘을 포함하는 하이브리드 나노전달체; 및 상기 나노전달체가 충진된 3차원 콜라겐 구조물을 구비한다.

본 발명에 따른 3차원 콜라겐 구조물을 구비한 폼 스캐폴드의 설계는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.

본 발명자들은, 줄기세포의 잠재능이 조직 재건 및 재생에서 표적화된 기능을 수행하도록 하는 이상적인 시스템은 치료능을 프로세싱하는 3차원(3-D) 스캐폴드라고 인식하였다.

약물을 담지할 수 있는 기공크기를 갖는 메소포러스 실리카 나노구(MSN), 바람직하게는 확장된 메소포러스 실리카 나노구(enlarged mesopore silica nanosphere, eMSN)의 외부 표면을 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리유산(PLA)와 같은 생분해성 폴리머로 캡슐화하여 나노전달체를 형성함으로써, 상기 메소포러스 기공 및/또는 채널 내에 삽입된 약물(예, 성장인자)을 보다 지속적으로 방출한다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이때, 분산된 묽은 폴리머 용액을 MSN에 전기방사하여 생분해성 박막을 제조할 수 있다.

나아가, 조직 공학 매트릭스에 대해 전달 시스템으로 콜라겐 3차원(3D) 폼 스캐폴드 안에 상기 나노전달체의 삽입할 수 있다. 예컨대, 산성의 섬유아세포 성장인자(aFGF)를 상기 콜라겐 및/또는 메소포러스 실리카 나노구의 기공 내에 담지한 폼 스캐폴드로 골아세포 전구 세포를 처리하여, 실험관내 및 생체내에서 세포 및 조직 침투의 방출 효과를 조사한 결과, 상기 성장인자의 방출 지속시간이 월등하게 증가하였다(실험예 4 및 5).

본 발명에 있어서, 메소포러스 실리카 나노구의 평균직경은 2 내지 20 nm의 범위를 가질 수 있다.

본 발명자는 일반적인 메소포러스 실리카 나노구(mesopore silica nanosphere, MSN)의 기공내에 성장인자와 같은 부피가 큰 생체물질들을 담지하기 위해, 예컨대 이를 NaCl 수용액으로 처리하여 기공을 확장시켰으며, 이와같이 확장된 기공을 갖는 것을 확장된 메소포러스 실리카 나노구(enlarged mesopore silica nanosphere, eMSN)로 지칭한다.

상기 생분해성 고분자 쉘은 생분해성 고분자 용액을 전기방사하여 메소포러스 실리카 나노구 표면에 쉘형태로 형성시킬 수 있다.

상기 생분해성 고분자는 고분자 자체가 박테리아, 조류(藻類), 곰팡이와 같은 자연계에 존재하는 미생물에 의해 물과 이산화탄소 또는 물과 메탄가스로 완전히 분해되는 고분자일 수 있으며, 종류에는 천연고분자 및 합성고분자가 있다.

상기 천연고분자는 천연 물질, 동물, 인체에서 유래한 고분자로서 매우 우수한 생체 적합성을 가진다. 천연고분자의 종류에는 젤라틴(gelatin),콜라겐(collagen), 피브린(fibrin), 엘라스틴(elastin), 알긴산(alginate), 하이알루론산(hyaluronic acid)가 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리유산(PLA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리하이드록시밸러레이트(PHV), 폴리디옥사논(PDO) 및 폴리트리메틸렌카보네이트(PHV)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는 상기 생분해성 고분자는 폴리유산(PLA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다.

상기 전기방사는 고분자용액을 주사기에 넣고 높은 전압하에서 콜렉터에 방사하면 주사기와 콜렉터 사이에 형성된 전기장의 크기에 따라 나노 구조를 갖는 방법이다. 상기 전기방사는 나노 섬유의 크기를 조절할 수 있음, 고분자용액의 농도, 전압, 방사거리에 따라 나노섬유의 크기를 조절할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에 따른 폼 스캐폴드는, 상기 하이브리드 나노전달체, 콜라겐 또는 둘다에 약물을 담지할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약물의 비제한적인 예로는 골 형성 단백질(BMP), 섬유아세포 성장인자(FGF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈관 내피 성장인자(VEGF)와 같은 성장인자, 항생 소염제인 베타락탐계 항생물질(페니실린류, 세팔로스포린류), 테트라사이클린류 항생물질(테트라사이클린, 메타사이클린, 미노 사이클린 등), 아미노글리코사이드계 항생물질(카나마이신, 젠타마이신, 리보스타마이신, 토브라마이신, 네오마이신 등), 린코사이드계 항생물질(린코마이신, 클린다마이신), 반코마이신, 세파렉신, 세파클러, 세파만돌 등의 항생물질, 헤파린, 파크리탁셀, 티클로피린 등의 항혈전제, 및 인슐린과 같은 단백질 또는 호르몬, 특히 조직재생 또는 줄기세포 분화와 관련된 약물인 것이 바람직하다.

예컨대, 소혈청알부민(BSA) 또는 산성섬유모세포성장인자(aFGF) 등이 있다.

본 발명에 따른 폼 스캐폴드의 제조방법은 1) 염화 나트륨을 포함하는 반응 용액을 이용하여 메소포러스 실리카 나노구(MSN)를 제조하는 단계; 2) 아민 작용기를 갖도록 메소포러스 실리카 나노구를 처리하는 단계; 3) 상기 아민 작용기를 갖는 메소포러스 실리카 나노구를 생분해성 고분자로 쉘화하는 단계; 및 4) 상기 제조된 메소포러스 실리카 나노구를 콜라겐 구조물에 삽입하는 단계를 포함한다.

상기 단계 1)는 메소포러스 실리카 나노구의 기공크기를 확장시키기 위한 단계로서, 염화 나트륨은 1.0 중량% 이하로 첨가할 수 있다. 1.0 중량%를 초과하면 나노구의 기공구조가 파괴되는하는 단점이 있다.

상기 단계 2)에서, 메소포러스 실리카 나노구의 표면을 아민기로 개질할 수 있다. 상기 개질은 3-아미노프로필 트리에톡시실란(3-aminopropyl triethoxysilane; APTES) 용액을 사용하여 개질하며, APTES 용액의 농도를 조절하여 아민기 개질 정도를 조절할 수 있으며, APTES를 0.5 내지 5 부피%로 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 아민기가 잘 개질될 수 있도록, 교반 또는 환류하는 것이 바람직하다.

상기 단계 4)의 콜라겐 구조물은 0.2 내지 0.8 %w/v 콜라겐 용액:인산완충식염수(PBS)를 1:3 내지 1:6 중량비로 혼합하여 형성될 수 있다.

이때, 상기 콜라겐 용액은 용매가 아세트산 또는 염산인 것일 수 있다.

도 1에 도시된 바와 같이, 메소포러스 실리카 나노구를 약물 함유 용액에 담근 후, 생분해성 고분자로 쉘화하여 하이브리드 나노전달체를 형성시키고, 한편 일정한 형태의 용기 내에서 상기 하이브리드 나노전달체, 약물 및 콜라겐 용액을 혼합한 후 용매를 제거하여 약물이 담지된 3차원 폼 스캐폴드를 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 폼 스캐폴드는 약물 전달체로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 폼 스캐폴드에 삽입된 하이브리드 실리카 나노구는 평균 ~12.2 nm의 높은 기공 평균직경을 가지며, 폴리유산(PLA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 생분해성 고분자로 쉘화가 되어 콜라겐 구조물을 형성하였을 경우 약물(예, 산성의 섬유아세포 성장인자(aFGF))은 월등하게 지속가능한 속도로 방출될 수 있다.

도 1은 세포 배양 및 조직 공학에 대한 나노전달체@스캐폴드 결합 시스템 뿐만 아니라 GF의 지속적인 전달에 대한 eMSN@생분해성 폴리머 나노전달체 시스템의 개략적인 설계이다.
도 2는 본 발명에 따른 (a, b) 확장된 모형 단백질 BSA가 담지된 기공 평균직경(평균 ~12.2 nm)를 갖는 아민화된 eMSN의 TEM 이미지, (c) ζ-전위 플롯(plot)이 표면 잠재력을 높은 음의 값(-32 mV)로부터 양의 값(+28 mV)으로 극적으로 변하게 하는 eMSN의 아민화 및 BSA 담지가 실질적으로 값(+11 mV)을 줄였다는 것을 나타낸 그래프, BSA 담지 전후의 아민화된 eMSN의 (d) N₂ 흡착/탈착 플롯 및 (e) 기공 평균직경 분포를 나타내는 그래프 및 (f) 거의 완전히 가득찬 큰 기공을 보이는 BSA 담지 후에 아민화된 eMSN의 TEM 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따른 아민화된 eMSN에 담지된 BSA의 양을 나타낸 그래프이다:(a) 다양한 담지 시간 및 사용된 eMSN의 초기 양; (b) 고착된 BSA(0.4 mg)에서 사용된 eMSN의 양에 대한 플롯.
도 4는 본 발명에 따른 eMSN이 PLA 또는 PEG 용액(0.1% 또는 0.25%의 다양한 농도)에 분산된 혼합 용액을 전기방사에 의해 제조한 다양한 eMSN@생분해성 폴리머 나노전달체의 SEM 이미지(a, b) 및 TEM 이미지(c-f)이다: (a, c) eMSN@01PEG; (e) eMSN@01PLA; (b, d) eMSN@025PEG; (f) eMSN@025PLA. 또한, 방출 패턴이 지속적인 생분해성 층의 효과를 나타낸 처리를 하지 않은 eMSN 또는 생분해성 코팅한 eMSN의 나노전달체 샘플(eMSN@01PEG 및 eMSN@01PLA)로부터 BSA 방출 연구를 나타낸 그래프(g)이다.
도 5는 본 발명에 따른 (a, b) 3-D 콜라겐 스캐폴드내에 삽입된 eMSN@01PLA의 SEM 모폴로지의 다른 확대를 나타낸 도 및 (c) 나노전달체@콜라겐 스캐폴드 전달 시스템을 사용한 단백질 방출 연구를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 eMSN@01PLA 나노전달체내에 담지된 aFGF의 ELISA assay kit에 의해 측정된 aFGF 방출 특징을 나타낸 그래프(a), 나노전달체@스캐폴드로부터 방출된 aFGF의 효과를 조사하기 위해 간접적인 삽입(b) 및 직접적인 삽입(c)을 사용한 세포 증식 분석을 나타낸 도, 3, 7 및 14일 동안 배양한 세포성장 모폴로지를 나타낸 도(d), 2주 동안 쥐 피하 조직에 aFGF를 포함("+aFGF")하거나 포함하지 않은("-aFGF") 나노전달체@스캐폴스 시스템의 생체내 동물 연구(e, f)를나타낸 도이다. (e)에서 확대한 상자의 이미지가 (f)이고 스캐폴드 내에 분포된 세포의 존재를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발며의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 메소포러스를 포함하는 아민화된 MSN( mesoporous silica nanosphere)의 제조

PEG(Mw 350,000), PLA(Mw 40,000), 아미노프로필트리에톡시 실란(APTES), 테트라에틸 오쏘실리케이트(TEOS), 수산화암모늄(NH₄OH, 28%) 및 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)는 시그마-알드리치로부터 구매하여 추가적인 정제 없이 사용하였다. eMSN(enlarged-pored MSN)는 종래 당업계에 공지된 방법을 약간 변형한 방법으로 제조하였다. 구체적으로, 동일한 템플레이트로서 사용한 4.57g CTAB 및 0.73g NaCl을 89.42 g 물, 122.03 g 에탄올 및 26.16 g NH₄OH 용액에 용해한 후에, TEOS 8.4g을 첨가하였다. 초음파발생장치(20 Hz, 240 W)를 사용하여 상기 용액을 5분 동안 초음파 처리하고, 이어서 500 rpm으로 20시간 동안 실온에서 교반하여 균일한 현탁액을 수득하였다. 10,000 rpm에서 현탁액을 원심분리하여 고체 나노입자를 회수하였다. 나노입자를 70% 에탄올 및 아세톤으로 세척하였다. 세척한 나노입자를 60℃에서 밤새도록 건조하고, 이어서 1℃/min의 가열속도로 4시간 동안 600℃에서 하소하였다. 상기 eMSN의 아민화는 APTES를 사용하여 수행하였다: 실온에서 24 시간 동안 300 rpm에서 교반하면서 1 g 나노입자 및 1 g APTES를 0.1 M HCl 아세톤 용액 2 ml에 첨가하였다. 이후 아세톤으로 세척하고 추가적 사용을 위해 60℃에서 건조하였다.

확장된 크기의 메소기공을 갖는 아민화된 eMSN의 전형적인 형태를 TEM으로 확인하고, 그 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다. 명암대조에서 메소기공 영역은 나노입자 전체에 분포되었다. 상기 제조예에 따라 제조된 eMSN의 ζ-전위는 -32 mV였으며, 아민화된 eMSN에서 +28 mV의 양의 값으로 급격히 변화하였다(도 2c). 예비 연구로부터, 아민화하지 않은 제조된 자체로의 하이드록실-표면화된 eMSN에는 BSA를 담지할 수 없으나, 단지 아민화된 eMSN에만 BSA를 담지할 수 있음을 확인하였다. 아민화된 eMSN의 N₂ 흡착/탈착 등온선 곡선은 메소포러스 물질의 전형적인 거동으로 나타내었다(도 2d). 아민화된 eMSN의 기공 평균직경은 평균 12.2 nm였다(도 2e). 하기 표 1에 eMSN에 대한 기공 평균직경, 표면적 및 기공 부피를 포함한 BET 결과를 요약하였다.

	기공 평균직경 (nm)	기공 부피 (cm³/g)	표면적 (m²/g)	제타 전위 (mV)
(아민화된) eMSN	12.2	0.57	251	+28 mV
담지된 BSA	3.36	0.05	109	+11 mV

GF-전달 시스템의 생산에 있어서, 본 발명자들은 나노구의 메소기공을 확장시키고자 하였으며, NaCl를 사용하여 마이셀 형성에서 보조 화학물로써 CTAB를 부분적으로 대체함으로써(25% NaCl) 이를 가능하게 하였다. 사실상, NaCl의 첨가는 마이셀의 평균직경을 확장하는데 중요한 역할을 하며, 따라서 계면활성제의 제거 후에, 증가된 크기의 마이셀은 궁극적으로 증가된 메소기공 공간을 형성하였다. 오직 CTAB를 사용하여 수득한 일반적인 MSN은 ~3-4 nm의 기공 평균직경을 가지는 한편, eMSN은 12.2nm의 기공 평균직경을 나타내었다. 그러므로, 수득한 나노구의 확장된 기공은 큰 단백질 분자의 삽입을 가능케 하였다. 또한, 기공 부피 및 표면적을 포함하는 높은 메소공극율(mesoporosity) 수준은 다량의 단백질 분자의 삽입할 수 있는 공간을 제공할 수 있다. 모델 단백질로서 BSA를 선택하였으며, 이는 분자량 ~66 kDa 및 14×4×4 nm³의 크기를 갖는 생물학적 단백질 중에서 상대적으로 커다란 크기를 갖는 단백질이다. 이론적으로, 본 발명에 따른 eMSN의 내부 기공 평균직경(12.2 nm의 평균 값을 가짐)은 부분적으로 메소기공 구조 내에 단백질 삽입을 허용하는 것으로 유추되며, 따라서, 이는 표적 단백질, 예컨대, GF의 경우, 상기 표적 단백질은 BSA보다 훨씬 더 작으므로 상기 메소기공에 보다 효과적으로 삽입될 수 있음을 나타내는 것이다.

실험예 1: 단백질/성장인자 담지

예비 시험(pilot test)으로부터, BSA 분자는 전하-전하 반발 때문에 아민화 하지 않은 eMSN에는 담지되지 않음을 확인하였다. 아민화된 eMSN를 사용하였을 때, 상당량의 BSA 분자를 삽입할 수 있었다. 먼저, Beer-Lambert를 사용하여 BSA에 대한 검정 곡선을 얻었다. BSA 농도 범위는 50 μg/ml로부터 600 μg/ml까지 변화시켰다. UV-vis 분광광도계(Libra S22, Biochrom)를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. BSA 담지 시험에 있어서, 먼저 담지 시간을 결정하였다. BSA는 다른 농도(0.25, 0.5 및 1 mg/ml)로 물에 용해시켰다. BSA 용액 내에, 1 mg의 아민화된 eMSN를 넣고 10초 동안 초음파 처리하고 12시간까지 각기 다른 시간 동안 37℃에 방치하였다. 각 인큐베이션 시간에서, 나노입자를 원심분리하고, 상층의 투명한 용액을 이용하여 단백질의 잔존량을 확인하였다. 결과를 배양 시간의 함수으로써 도시하고 ~3 내지 6시간에서 포화점을 결정하였다. 담지 시험은 각 조건에서 5번 반복하여 수행하였다(n=5).

이에 기초하여, 흡착 등온선, 즉, 수배지(water medium)에 초기에 첨가된 단백질의 농도에 대한 나노입자 내에 봉입된 BSA 양을 도시한 곡선을 이용하여 나노입자의 BSA 담지 용량은 단백질의 농도를 결정하였다. BSA 담지 용량은 물질균형식에 따라 표시하였다:

q_e = (C₀ - C_e) × (V/W)

여기서 q_e는 스캐폴드 샘플에 흡착된 BSA의 용량(μg/mg)이고, C₀ 및 C_e는 각각 BSA의 초기 및 평형 농도(μg/mg)이고, V는 용액의 부피(ml)이고 W는 사용된 스캐폴드의 중량(mg)이다.

q_e 대 C_e 곡선을 도시한 후, 변형된 Langmuir 등온선 모델을 적용하여 곡선 조정을 최적화하였고, 식 q_e = KC_e/(1 + KC_e)에 따라, 이로부터 미지의 변수 K(속도상수)를 결정하였다. 데이터는 흡착된 BSA의 백분율로 나타내었다.

아민화된 eMSN내에 BSA의 담지에 대한 결과에 기초하여, 특정 성장인자 aFGF(acidic fibroblast growth factor)를 도입하였다. aFGF는 공지된 방법으로 E.coli로부터 생산하였다. 이어서, 10 mg 아민화된 eMSN을 인산완충염용액(PBS) 용액에 용해시킨 1 μg aFGF 용액에 담그었다. 이때, 나노입자의 양은 모든 aFGF 분자를 담지하기에 충분하였다. 이는 aFGF는 평균직경이 BSA보다 작고 음으로 하전되었으며, 사용된 aFGF의 양은 나노입자 내에 최대로 담지될 수 있는 BSA 양에 비해 훨씬 적다는 점을 기초로 하여 결정하였다.

BSA를 담지한 후에, ζ-전위 또한 더 적은 양의 값인 +11 mV로 변화하였고, eMSN 내의 큰 평균직경의 메소기공은 거의 완전히 사라졌으며(도 2c 및 2e), 이는 BSA 분자에 의한 메소기공 공간의 효과적인 채움을 나타내는 것이다. BSA-담지된 eMSN의 TEM 이미지는 담지되지 않은 입자에 대한 TEM 이미지와 대조적으로 큰 기공의 채워짐을 나타내었다(도 2f). BSA-담지된 eMSN에 대한 BET 결과도 함께 상기 표 1에 나타내었다.

eMSN의 다양한 초기 양에서 담지 시간에 대하여 아민화된 eMSN에 대한 BSA의 담지 거동을 추가로 관찰하였다. BSA 분자는 모든 경우에 대해 ~3 내지 6시간 후에 담지 포화를 나타내었고, 이때, 담지된 양은 초기 eMSN 사용량이 0.25 mg, 0.5 mg 및 1.0 mg일 때, 각각 ~0.23 mg, 0.32 mg 및 0.37 mg이었으며, eMSN의 양이 증가함에 따라 단백질 담지 양은 증가하였다(도 3a). 1.2 내지 1.8 mg의 eMSN을 사용하였을 경우 BSA(0.4 mg)는 거의 완전히 담지되었고, 이때 담지 효율은 ~22 내지 32 중량%였다(도 3b). 실험적 등온선 곡선은 공지의 Langmuir 등온선 모델(점선으로 표시)에 잘 맞았으며, 이때, 속도상수는 5.8×10^-3(R²=0.98)로 결정되었다.

메소기공 평균직경 및 부피와 함께, 담지하기 위한 생체분자와의 eMSN의 표면 친화도는 고안시 고려해야 할 다른 인자이다. BSA는 중성 pH에서 음으로 하전되므로(25℃, 물에서 등전점 4.7을 가짐), 나노구의 표면을 ATPES를 사용하여 아민기로 기능화하였다. 일반적으로, eMSN는 다수의 하이드록실기의 존재로 인해 음으로 하전되어, 전하-전하 반발의 결과로서 BSA 담지를 허용하지 않는다. 그러나, 표면 아민화로 인해, 22 내지 32%의 담지 효율로 상당량의 BSA를 담지할 수 있었다. 일반적으로 관찰되는 값이 10 내지 20%인 바, 상기 담지 효율의 수준은 작은 메소기공 평균직경(3 내지 5 nm)을 갖는 일반적인 MSN과 비교하여 상대적으로 더 높았다. 이는 메소기공 구조 내에 더 많은 양의 BSA 분자를 담지하는 데 있어서 양으로 하전된 표면과 함께 확장된 기공의 효과적인 역할을 나타내는 것이다.

eMSN의 표면 쉘형성은 BSA의 방출 프로파일에 대해 눈에 띠는 영향을 나타내었다. 쉘이 없는 eMSN로부터의 BSA 방출은 ~8일에 완료된 반면, 생분해성 폴리머층이 형성된 eMSN(eMSN@생분해성 폴리머)으로부터의 방출은 수 주 내지 한 달까지 지속되었다. eMSN@생분해성 폴리머로부터 BSA의 방출 메커니즘과 관련하여, 물 확산 및 생분해성 폴리머층 분해 모두가 방출 프로파일에 관여하는 것으로 사료된다. 다시 말해, 생분해성 폴리머층을 통한 및/또는 메소포러스 채널 내의 물 확산은 BSA 분자의 느린 확산 방출을 유도할 수 있다. 상기 공정의 진행에 있어서, 생분해성 폴리머층의 분해 및 가능한 붕괴는 물과 BSA의 직접적인 접촉을 허용하여, 메소기공 채널을 통한 BSA의 방출을 가속화할 수 있다. 상기 방출 패턴에 기초하여, 상대적으로 보다 낮은(감소된) 방출 속도를 갖는 구간은 주로 생분해성 폴리머 코팅층의 존재에 기인함을 확인하였다. 이와 대조적으로, 상대적으로 빠르게 방출하는 구간은 코팅 분해 및 붕괴에 기인함을 확인하였다. 이들 영역에서 방출 속도는 쉘이 없는 eMSN 자체로부터의 BSA 방출에 대해 기록된 패턴과 보다 유사하였다. BSA의 느린 방출 성능은 2종의 다른 생분해성 폴리머 조성물을 사용하였을 때 나타난 반면, 다른 분해 속도를 갖는 다른 타입의 생분해성 폴리머를 도입하여 효과적으로 방출 프로파일을 조절할 수 있다. 또한, 생분해성 폴리머층의 두께를 조절하는 것 역시 방출에 있어서 확산 장벽을 조절하는 다른 방법이다. BSA 방출에 대한 결과로부터, eMSN@생분해성 폴리머 나노전달체 시스템이, 조직 재생의 목적에 있어서, 성장인자의 전달에 효과적인 것으로 여겨지는 수 주 내지 한 달에 걸쳐 장기간 성능으로, 단백질과 같은 커다란 생체분자의 전달에 잠재적인 유용성을 가짐을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 세포 배양 및 조직 공학을 위한 3-D 스캐폴드 매트릭스로써 본 발명에 따른 신규한 나노전달체를 활용하고자 하였다.

실시예 1: 전기방사에 의한 생분해성 코팅 및 콜라겐을 함유하는 3-D 스캐폴드

단백질-담지된 eMSN을 전기방사 공정을 통해 생분해성 폴리머층으로 코팅하였다. PLA와 PEG를 각각 0.1% or 0.25%의 농도로 디클로로메탄(PLA에 대해) 또는 물(PEG에 대해)에 용해시켜 PLA 또는 PEG 용액을 준비하고, 단백질-담지된 eMSN은 1% 농도로 첨가하고 10 초 동안 초음파 처리하여 생분해성 폴리머/단백질-담지된 eMSN의 균일한 혼합물을 생성하였다. 혼합물을 실린지에 넣고, 수조에서 0.4 ml/시간에서 구동하는 실린지 펌프를 사용하여 10 kV/10 cm 전기장 세기의 높은 DC 전기장하에 전기방사하였다. 전기방사 공정 후, 생성된 나노입자를 회수하여, 밤새도록 건조하였다.

생분해성 폴리머-코팅된 단백질-담지된 eMSN을 콜라겐에 삽입하여 3-D 나노전달체/스캐폴드 시스템을 제조하였다. 콜라겐 용액(아세트산에 0.5% w/v 콜라겐 함유)을 PBS와 1:3의 중량비로 혼합한 후, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 콜라겐 피브릴(fibril) 형성을 유도하였다. 원심분리 후, 콜라겐 피브릴 용액을 모아 나노입자와 균질화하는데 사용하였다. 30초 동안 볼텍싱(vortexing)하여 나노입자를 10 중량%로 콜라겐 피브릴 용액과 혼합한 후, 용액을 원통형 금형(5 mm 직경 × 3mm 높이)에 붓고 -80℃에서 밤새도록 동결시키고, 3일 동안 동결건조하여 3-D 다공성 폼 구조를 제조하였다.

3-D 스캐폴드에 대해, eMSN@생분해성폴리머를 대표적인 나노전달체로 사용하였다. 콜라겐 스캐폴드 안에 삽입된 나노전달체의 형태를 도 5에 나타내었다. 잘 발달된 매크로기공 구조를 갖는 스캐폴드가 형성되었음을 확인하였다(도 5a). 보다 고배율로 관찰한 표면의 이미지는 콜라겐 매트릭스 내에 포매된(embedded) eMSN@생분해성 폴리머 나노전달체의 존재를 나타내었다(도 5b).

콜라겐은 3-D 세포 매트릭스로써 우수한 생체적합성 소재이므로, 이를 eMSN@ 생분해성 폴리머 시스템에 도입하였다. 제조된 콜라겐 폼 스캐폴드 자체는 동결건조 공정 후 고도의 매크로다공성이었다. 기공 채널 이외에, 콜라겐 폼의 팽윤 거동이 세포가 성장하고 영양이 공급되기에 충분한 기공 공간을 제공하는 것으로 확인되었다. 콜라겐 스캐폴드는 물에 기초한 온화한 조건에서 제조할 수 있으므로, 치료용 분자를 내부에 직접 삽입할 수 있고, 전달 창고(delivery depot)로 사용할 수 있다. 조직 세포에 대한 스캐폴드의 생물학적 역할과 더불어, 나노전달체를 둘러싼 콜라겐 매트릭스는 나노전달체 내부의 단백질 방출 프로파일에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 단백질(리소자임 또는 BSA)이 콜라겐 폼 안에 직접 삽입되는 경우, 이는 7-12일에 걸쳐 방출되는 것으로 나타났다. 중요한 것은 방출 기간은 BSA에서 보다 리소자임에서 보다 더 긴 것으로 관찰되었으며, 이는 리소자임이 콜라겐 매트릭스와 보다 강한 이온결합을 형성함을 나타내는 것으로, 이로부터 양으로 하전된 치료용 분자를 콜라겐과 함께 사용하여 방출 기간을 연장시킬 수 있음을 확인하였다. 그러나, 단백질을 나노전달체 내부에 삽입하였을 경우, 이의 방출은 한 달 이상 지연될 수 있으며, 이러한 방출 패턴은 나노전달체로부터의 방출 패턴과 유사한 것으로, 콜라겐 스캐폴드에 의한 방출 기간의 연장은 수일 정도로 방출 역학(release kinetics)을 변화시키지는 못하는 것으로 나타났다.

이러한 점에서, 본 발명자들은, 제1단백질은 폴라겐 스캐폴드 내에 직접 삽입되고 제2단백질은 나노전달체 내에 미리-담지되는 것인, 나노전달체@콜라겐을 사용하는 이중 단백질 전달 시스템을 고안하였다. 예컨대, 제1단백질은 초기의 짧은 기간 내에 치료 작용을 목표로 하는 한편(도 1에 도시한 GF2), 제2단백질은 지연된 생물학적 활동을 도출하기 위한 보다 장기간 전달을 위한 것일 수 있다(도 1에 도시한, GF1). 인간 조직 내에 가장 풍부하게 존재하는 주된 구조적 단백질로서 콜라겐은 다른 종류의 세포 외부 매트릭스 단백질을 수용할 수 있고 많은 성장인자와 높은 친화도를 갖는 것으로 확인되었으므로, 이들 단백질을 효과적으로 담지할 수 있다. 형태는 하이드로겔이며 따라서 성장인자의 방출이 상대적으로 빠르므로, 리소자임 및 성장인자와 같은 양으로 하전된 단백질과 상당히 강한 결합을 형성하며 일주일에 걸친 방출을 보여주었다.

전달 시스템으로부터 지속적인 단백질 방출을 확인한 후에, 본 발명자들은 aFGF를 사용하는 시스템의 생물학적 치료 효능을 확인하고자 하였다. 활동적인 강한 세포 증식 및 혈관 형성에 관여를 나타내는 것으로 이를 확인하였다. 상기 aFGF는 음으로 하전된 단백질이므로, 아민화된 eMSN에 대한 담지 거동을 나타낼 것임을, BSA에 대한 결과에 기초하여, 알 수 있었다.

실험예 2: 샘플 특성분석

샘플의 미시적 형태를 주사전자현미경(SEM; S3000H, Hitachi)으로 관찰하였다. 나노입자 샘플의 메소기공 구조는 투과전자현미경(TEM; JEM-3010, JEOL)으로 확인하였다. TEM을 위한 샘플은 에탄올에 샘플을 분산하고 구멍이 뚫린 Cu/탄소 그리드에 떨여뜨려 준비하였다. 샘플의 기공 구조는 Quantachrome system(2SIMP-9, Quantachrome)를 사용하여 77K에서 질소 기체 흡착/탈착 등온선으로부터 분석하였다. 샘플은 진공배관에서 200℃로 밤새도록 전처리하였다. Barrett-Joyner-Halenda 방법 및 Halsey 방정식을 이용하여 데이터를 분석하였다. 등온선의 흡착 가지의 분석으로부터 기공 평균직경 분포 곡선을 얻고, 최대 상대 압력(P/P₀)에서 흡착된 양으로부터 기공 부피를 계산하였다. zeta(ζ) 전위 측정에 의해 나노입자의 표면 전기적 전위를 조사하였다. 샘플의 ζ-전위를 Zetasizer Nano ZS laser Doppler 전기영동 장치(Malvern Instruments, UK)로 측정하였다. 샘플을 pH 7의 탈이온수에 분산시키고 ζ-전위를 20 V/cm의 적용전기장세기로 25℃에서 5번 측정하였다(각 측정은 40번 운행을 평균함). 장치는 Helmholtz-Smoluchowsky 방정식에 따라 자동으로 전기영동이동도(U) 및 ζ-전위를 계산하였다:

ζ = Uη/ε,

여기서 ζ는 제타 전위이고, U는 전기영동이동도, η는 분산된 배지 점성도이고, ε는 유전상수이다.

전기방사 공정을 통하여 생분해성 폴리머(PEG 또는 PLA)로 eMSN을 캡슐화한 후에, 샘플을 SEM 및 TEM으로 확인하고 그 결과를 도 4에 도시하였다. 0.1% 농도에서, 나노입자는 잘 회수되었으며, 이는 원래의 eMSN과 유사한 구 형태 및 평균직경을 보존하였다(도 4a). eMSN의 외부 표면은 생분해성 폴리머 PEG(도 4c) 및 PLA(도 4e)의 박막에 의해 둘러싸였다. 두께는 매우 균일하고 생분해성 폴리머 조성물에 의존적이었다. 예컨대, PEG에 대해 평균 16.2 nm(±5.3 nm) 및 PLA에 대해 평균 5.2 nm(±2.1 nm)의 두께로 형성되었다. 상기 생분해성 폴리머 농도에서 나노입자 사이에 뚜렷한 응집은 없었다. 0.25% 농도에서, 일부 입자들은 완전하게 분리되지 않았으나, 오히려 생분해성 폴리머를 통해 고도로 상호연결되었다(도 4b). TEM 이미지에 의해 확인된 바와 같이, 두께는 실질적으로 증가하였다. 예컨대, PEG에 대해 40-50 nm(도 4d) 및 PLA에 대해 10-20 nm(도 4f)로 두께가 증가하였다.

나노전달체 내에 담지된 BSA 분자의 방출 거동을 확인하였다(도 4g). 아민화된 eMSN 자체로부터의 BSA 방출은 거의 8일 내에 완결되는 것으로 나타났으나, 초기 폭발적(burst) 방출을 나타내지 않고 상대적으로 지속가능한 방출 패턴을 나타내었다. 초기 선형 방출은 시간에 따라 곡선화하며, 이 단계에서 가능하게는 확산이 지배적인 경향을 보였다. 대조적으로, eMSN을 생분해성 폴리머로 코팅하였을 때, BSA 방출 프로파일은 실질적으로 연장되고, 패턴은 2종의 생분해성 폴리머 코팅 모두에 대해 다른 방출 속도를 갖는 몇몇 단계를 나타내었다. 전체 방출 패턴은 약 5개의 다른 단계로 구성되었다. 구체적으로, PEG 코팅(eMSN@01PEG)에 대해, 1일 동안 1차 초기 짧은 지연(1st initial short lag), 4일까지 2차 선형 방출, 7일까지 3차 고도로 감소된 방출, 14일까지 4차 상당히 증가된 방출 및 마지막으로 17일까지 5차 감소된 방출이 기록되었다. PLA 코팅(eMSN@01PLA)에 대해, 방출 패턴의 5개의 다른 단계가 eMSN@01PEG에 관찰된 것과 유사하게 기록되었다. 그러나, 총 방출 기간은 24일까지 마지막 방출을 포함하여 훨씬 더 지속적이었다. 특히, 감소된 방출 속도(3번째 및 5번째 영역)를 나타내는 영역이 PEG 코팅에서 관찰된 것보다 훨씬 더 길게 지속되었다. 마지막 단계는 10일 동안 지속되었다. 2-3주에 걸친 연장된 BSA 방출 패턴은 아민화된 eMSN 자체로부터의 BSA 방출(7일)에 대해 관찰되는 것과는 대조적이며, 이는 본 발명의 신규한 시스템이 단백질의 장기간 전달에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다..

실험예 3: BSA 및 aFGF 방출 연구

BSA의 방출연구를 위하여, 3가지 다른 나노전달체 그룹을 사용하였다: 비코팅(eMSN); 0.1% PEG-코팅된 eMSN(eMSN@01PEG); 및 0.1% PLA-코팅된 eMSN (eMSN@01PLA). 각 샘플 25 mg을 5 ml PBS에 담그고, 다른 기간(1일 내지 30일) 동안 37℃에서 약간 휘저으면서 인큐베이션하였다. 각 인큐베이션 시간에서, 샘플을 원심분리하고, 상층액의 분액(aliquot, 3 ml)을 UV-vis 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 분석하여 나노입자로부터 방출된 BSA를 검출하였다. 각 분석에서, 신선한 배지의 3 ml를 재주입하고, 다음 실행을 위해 24일까지 방출 시험을 계속하였다. 나노전달체/스캐폴드 시스템의 경우에 대해, 콜라겐 스캐폴드와 결합시킨 eMSN@01PLA(eMSN@01PLA@Col)를 대표적인 샘플 그룹으로 사용되었다. 스캐폴드 샘플(5 mm 직경 × 3 mm 높이)을 10 ml PBS에 담근 후, 26일까지 다른 기간 동안 37℃에서 약간 휘저으며 인큐베이션하였다. 미리 결정된 시점에, 각 샘플을 원심분리하고, 상층액 분액(3 ml)을 UV-vis 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 분석하여 나노전달체/스캐폴드로부터 방출된 BSA를 검출하였다. 각 분석에서, 신선한 배지의 3 ml를 재주입하고, 다음 실행을 위해 26일까지 방출 시험을 계속하였다. 또한, BSA가 함유되지 않은 나노전달체/스캐폴드에 대해서도 동일한 실험을 수행하고 이를 정확한 검출을 위한 공백대조군(blank control)으로 사용하였다. 각 조건에 대해 5번 반복하여 실험하였고, 이를 평균하였다(n=5).

도 5c에는 각 샘플 그룹에 대해 관찰된 단백질 방출 프로파일을 나타내었다. 단백질(리소자임 또는 BSA)을 콜라겐 스캐폴드 내에 직접 담지하였을 때, 상대적으로 짧은 기간 동안 방출되었고, 방출 기간은 BSA(~7일)보다 리소자임(~12일)에서 약간 보다 길어졌다. 그러나, 단백질을 나노전달체 내에 담지하고, 콜라겐 스캐폴드 내에 캡슐화하였을 때, 방출 속도는 상당히 지속되었다. 나노전달체를 포매시킨 콜라겐 스캐폴드 또한 BSA의 방출을 추가적으로 연장하는 것으로 나타났다(나노전달체 vs 나노전달체@콜라겐으로부터 BSA 방출로 비교하였을 경우).

BSA 방출 프로파일을 기초로, 후보 성장인자 aFGF를 적용하고 그 결과를 도 6a에나타내었다. 도 6a에 나타난 바와 같이, 콜라겐 스캐폴드에 포매된 eMSN@01PLA 나노전달체로부터 aFGF의 방출을 한 달에 걸쳐 관찰하였다. 결과는 초기 폭발적 방출 없이 고도로 지속적인 속도의 프로파일을 나타내었으며, 추가로 31일까지 연속적인 방출을 나타내었다. 방출 패턴은 3일까지의 초기 지연, 이후 7일까지 방출속도의 추가적인 증가, 및 한 달까지 방출의 최종 감속(slow down)으로 구성되는 3단계로 구성되는 것으로 확인되었으며, 제1 및 제2 단계는 상대적으로 보다 일찍 끝났음에도 불구하고, 이는 전술한 BSA 방출에서 관찰된 것과 유사한 패턴의 프로파일이었다. 또한, 콜라겐 스캐폴드 및 둘러싼 PLA 층의 효과는 나노전달체@스캐폴드 시스템의 방출 패턴에 반영되었다.

실험예 4: 세포 배양 및 확산 분석

aFGF-담지된 나노전달체/스캐폴드 시스템의 생물학적 기능 연구를 위해, 마우스 골아세포 전구체 세포주 MC3T3-E1(American Type Culture Collection, USA)을 사용하였다. MC3T3-E1 세포를 10% 소태아혈청(FBS; Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS; Gibco)을 포함하는 알파-최소필수배지(α-Minimum Essential Medium; α-MEM; Gibco, USA)에 37℃, 5% CO₂ 분위기에서 유지하였다. 배지는 1주일 당 3차례 교환하고, 세포는 준컨플루언시에서(at subconfluency) 계대배양하였다.

MC3T3-E1을 12-웰 플레이트의 각 웰에 10,000 세포의 밀도로 정상 배지(1% PS 및 10% FBS를 함유한 α-MEM)와 함께 분주하였다. 분주된 세포는 12시간 동안 웰 플레이트에 부착하도록 두고, 이후 배양배지를 즉시 기아배지(starvation medium, 1% PS 및 1% FBS를 함유한 α-MEM)로 교환하였다. 나노전달체/스캐폴드 시스템으로부터 aFGF 방출의 효과를 확인하기 위하여, 먼저 간접적인 분석법을 사용하였다. 이를 위하여, 시험하고자 하는 스캐폴드(aFGF를 함유한 eMSN@01PLA@Col; '+aFGF' 또는 aFGF를 함유하지 않는 eMSN@01PLA@Col; '-aFGF')를 세포 배양 삽입물(BD Biosciences, NJ, USA)을 사용하여 웰에 걸쳐 두어 분주된 세포와 간접적으로 접촉하도록 하였다. 또한, 직접적인 시험에서는, 세포를 나노전달체/스캐폴드 시스템 샘플과 직접 접촉시켜 배양하였다. 세포는 매 2-3일마다 배양배지를 교환하면서 14일까지 배양하였다. 각 배양기간(3일, 7일 및 14일)에, 세포를 회수하여, CCK-8 세포 계수 키트(Dojindo Molecular Technologies, Japan)을 사용하여 iMark microplate reader(Bio-Rad, USA)로 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 증식 수준을 확인하였다. 시험은 각 조건에서 3번씩 수행하였다(n=3).

세포의 형태는 LSM 700 공초첨 레이저 현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 관찰하였다. 각 배양기간에서, 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정하고 세포 내 F-actin을 Alexa Fluor 546 팔로이딘(Molecular Probes, USA)으로, 세포핵을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(Molecular Probes)로 염색하였다.

시험관내 세포 거동에 대한 aFGF 방출의 효과를 확인하여 도 6에 나타내었다. 세포 증식은 삽입물을 사용하는 간접 배양 방법에 따른 aFGF의 영향에 의해 현저하게 향상되었고(도 6b), 이로부터 나노전달체@스캐폴드 시스템으로부터 방출된 aFGF의 생물학적 활성을 확인하였다. 또한, 전달 시스템과 직접 접촉하여 배양된 세포는 aFGF의 존재에 의해 유사하게 역시 자극되었다(도 6c). 세포가 aFGF-담지된 전달 시스템 상에서 보다 더 확산 및 증식함에 따라, SEM 이미지 역시 나노전달체@스캐폴드로부터 전달된 aFGF의 효과를 나타내었다(도 6d). 오직 나노전달체@스캐폴드를 포함하는 세포는 14일의 기간까지도 매우 제한적인 세포골격 과정을 나타낸 반면, aFGF-담지된 나노전달체@스캐폴드를 포함하는 세포는 상당한 세포골격 확대와 더불어 활발하게 증식하여, 배양 7일 이내에 거의 완전히 표면을 덮었다.

전달 시스템으로부터의 장기간 성장인자 방출을 재확인하기 위하여, 본 발명자들은 추가적인 시험관 내 세포 실험을 고안하였다. aFGF는, 줄기 세포의 범위를 포함하여, 세포증식에서 큰 효능을 나타내므로, 골아세포 전구체 세포주의 시험관 내 증식에 대한 aFGF 방출의 효과를 조사하였다. 간접 및 직접 배양 실험 모두 전달 시스템이 주로 2주까지 동안 증식 잠재력을 갖는 치료적 활성을 갖는 스캐폴딩 조직 세포에 효과적인 역할을 함을 입증하였다. 이 단계에서 세포 증식은 거의 컨플루언스에 도달하였으며, 연장된 배양은 현재의 결과만큼 효과적이지 못한 것으로 나타났다.

실험예 5: 마우스 피하 모델에서 생체 내 조직 반응

동물실험에 위한 실험 프로토콜은 단국대학교 실험동물윤리위원회의 승인을 받았다. 피하조직 내로 생체재료의 이식을 위해, Sprague-Dawley 수컷 랫트를 사용하였다. 사용된 샘플 그룹은 aFGF가 담지되거나("+aFGF") 또는 담지되지 않은("-aFGF") eMSN@01PLA@Col이었다. 각 스캐폴드 샘플은 무균조건 하에서 원통형(8 mm 직경 × 3 mm 높이)으로 제조하였다. 실험동물을 80 mg/kg 케타민 및 10 mg/kg 자일라진의 근육내 주사하여 마취하였다. 5 mm 절개를 등 가운데에 형성하고, 등 부분에 가위를 이용하여 각 동물에 척추로부터 측면에 두 개의 작은 피하 주머니를 만들었다. 각 동물에 두 개의 샘플을 이식하고 절개는 4-0 비흡수성 단사봉합사(Prolene)로 봉합하였다. 총 4마리의 실험동물을 사용하였다(각 그룹 당 4마리). 마취로부터 회복한 후, 실험동물을 12시간 명암 순환(light/dark cycle; 오전 8시부터 오후 8시까지 조명)에 유지하고 표준 펠렛 사료 및 물을 무제한(ad libitum) 제공하였다.

이식 2주 후에, 랫트를 치사시켰다. 조직학 분석을 위해 샘플의 피하 조직 및 주변 조직을 수거하여, 즉시 실온에서 10% 중성 포르말린(neutralized buffered formalin)에 24시간 동안 담그고, 단계별 농도의 에탄올로 탈수시키고, 이등분하여 파라핀에 포매시켰다. 회전식 마이크로톰(rotary microtome)를 사용하여 ~5μm 두께의 조직학적 샘플을 준비하여, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, 광학 현미경하에 관찰하였다.

랫트 피하 조직에서 생체 내 성능을 조사하였다. 도 6e에 나타난 바와 같이, 조직학적 관찰 결과는 2가지 나노전달체@스캐폴드 그룹 모두에서 어떤 눈에 띄는 염증성 징후 또는 조직 거부도 나타나지 않았으며, 이는 정상적인 치유과정이 관여함을 나타내는 것이다. aFGF를 포함하지 않는 그룹에서, 스캐폴드의 중심부로 세포의 깊숙한 침투 없이 오직 얇은 표면 영역만이 섬유아세포와 같은 세포로 침범되었다(4개의 반복 샘플에는 없음). 그러나, aFGF를 포함하는 그룹에서는 세포의 상당한 침범이 있었고, 스캐폴드의 중심부는 충분히 세포로 채워져, 기공 채널을 통해 균일한 세포 분포가 유도되었다. 확대된 이미지(도 6f)는 그룹 간의 세포의 존재에서의 차이를 보여주였다(-aFGF에서 세포의 제한된 침투 및 준 표면 영역에서의 존재 vs. +aFGF에서 세포의 완전한 침투 및 균일한 분포).

시험관 내 발견에 기초하여, 본 발명자들은 aFGF-전달 나노전달체@스캐폴드 시스템의 생체 내 성능을 확인하고자 하였다. 스캐폴딩 샘플을 시험관 내 실험과 동일한 기간 동안(2주) 랫트 피하 조직에 이식하였다. 2주의 기간은 시험관 내 실험 결과를 반영하여 생체 내 환경에서 다시 선택하였으며, 세포 유사분열 및 혈관신생과 같은 조직 재생의 상대적으로 초기 상태에 관련하여서와 같이, aFGF의 치료적 효과를 얻기에 적절한 것으로 확인되었다. 조직학적 관찰로부터, aFGF-함유 그룹에서, 스캐폴드의 중심부가 세포로 완전하게 채워진, 세포의 상당한 침투가 있었으며, 이는 기공 채널을 통한 균일한 세포 분포를 유도하였다. 이는 2주의 이식 기간 동안 기공 채널을 통한 섬유아세포 이동 및 이어지는 증식을 자극하는 aFGF의 효과에 주로 기인한다. 스캐폴드 채널을 통한 효과적인 세포 침투는 손상된 조직의 재생 과정에서 특별한 중요성을 갖는 것으로 여겨지며, 이는 조직 재생 영역의 적용에 있어서 aFGF를 전달하는 나노전달체@스캐폴드 시스템의 효능을 나타내는 것이다.

실험예 6: 통계

데이터는 평균 ± 1 표준편차(SD)로 나타내었다. 시험그룹 간의 통계학적 유의성(p ＜ 0.05)을 확인하기 위하여 스튜던트 티 테스트를 수행하였다.

세포와의 시험관 내 aFGF-전달의 성능 결과로부터, 상기 전달 시스템은 효과적인 조직 공학을 위한 전제조건인 성장 잠재력을 자극하는, 다수의 세포를 확보하기 위한 줄기 세포의 배양에서 치료용 스케폴드로서 유용함을 확인하였다. 나아가, 특정 세포 및 조직 기능을 달성하기 위해 다른 성장인자 또는 다른 형태의 치료용 생체분자의 사용 또한 고안될 수 있다. 이중 성장 인자 전달의 접근법도 나노전달체@스캐폴드 시스템 내에서 가능하다. 예컨대, GF2로써 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 GF1으로써 골형성 단백질(BMP)를 사용하여 신생혈관 형성을 위한 초기 VEGF 전달 및 지속적인 기간 동안 골형성 발달 및 골 매트릭스 형성을 위한 추가적인 자극을 달성할 수 있다.

Claims

약물을 담지할 수 있는 기공크기를 갖는 메소포러스 실리카 나노구 코어 및 생분해성 고분자 쉘을 포함하는 하이브리드 나노전달체; 및 상기 나노전달체가 충진된 3차원 콜라겐 구조물을 구비한 폼 스캐폴드.
제1항에 있어서, 메소포러스 실리카 나노구의 평균직경은 8 내지 15 nm의 범위인 폼 스캐폴드.
제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 전기방사에 의해 쉘화된 것인 폼 스캐폴드.
제3항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리유산(PLA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 폼 스캐폴드.
제1항에 있어서, 상기 하이브리드 나노전달체, 콜라겐 또는 둘다에 약물을 담지하는 것인 폼 스캐폴드.
제5항에 있어서, 상기 약물은 소혈청알부민(BSA) 또는 산성섬유모세포성장인자(aFGF)인 폼 스캐폴드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폼 스캐폴드의 제조방법으로서,
1) 염화 나트륨을 포함하는 반응 용액을 이용하여 메소포러스 실리카 나노구(MSN)를 제조하는 단계;
2) 아민 작용기를 갖도록 메소포러스 실리카 나노구를 처리하는 단계;
3) 상기 아민 작용기를 갖는 메소포러스 실리카 나노구를 생분해성 고분자로 쉘화하는 단계; 및
4) 상기 제조된 메소포러스 실리카 나노구를 콜라겐 구조물에 삽입하는 단계를 포함하는 것이 특징인 폼 스캐폴드의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 4)의 콜라겐 구조물은 0.2 내지 0.8 %w/v 콜라겐 용액:인산완충식염수(PBS)가 1:1 내지 1:5 중량비로부터 형성된 것인 폼 스캐폴드의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 콜라겐 용액은 용매가 아세트산인 것인 폼 스캐폴드의 제조방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폼 스캐폴드를 포함하는, 약물 전달용 조성물.