KR102132915B1 - 단백질 고흡착능과 지속적인 방출능을 가진 나노복합지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생분해성 고분자인 PLA 기질에 생활성 유리 나노입자 나노복합지지체(BGn/PLA)를 합성하여 생분해성이 높고 우수한 생체 적합성을 가지며, 적재된 단백질을 지속적으로 방출할 수 있도록 제어된 나노복합지지체, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 생활성 유리 나노입자/생분해성 고분자인 PLA 나노복합지지체(BGn/PLA)에 성장인자와 같은 단백질을 적재하여 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물에 관한 것이다.

Description

단백질 고흡착능과 지속적인 방출능을 가진 나노복합지지체 및 이의 제조방법 {Ultrahigh protein adsorption capacity and sustained release of nanocomposite scaffolds and their manufacturing method}

본 발명은 생분해성 고분자인(PLA) 기질에 생활성 유리 나노입자 (BGn)를 합성하여 200 내지 500μm의 기공크기를 가지고, 생활성 유리 나노입자는 생분해성 고분자를 기준으로 100 내지 200 중량%인 것인, 나노복합지지체(BGn/PLA) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

지지체는 뼈를 포함한 손상된 조직과 병이 있는 조직을 복구하고 재생하기 위해 개발되었다. 뼈 지지체는 골전구/줄기 세포의 정착과 성장을 지원하고 뼈 형성 세포로의 분화를 가능하게 한다. 표면 화학, 기공 구조 및 기계적 견고함을 비롯한 지지체의 성질은 세포의 운명을 좌우하며 궁극적으로 뼈 형성 능력을 좌우한다. 따라서, 골조직 재생에 유리한 지지체의 물리 화학적 성질을 개선시키기 위한 많은 노력이 있었다.

이러한 특성 중에서, 지지체가 성장 인자 같은 신호 분자를 적재하고 전달할 수 있는 능력을 보유하면, 손상된 골 결손의 재생 잠재력이 상당히 개선될 수 있다. 성장 인자 전달 지지체를 설계할 때 고려해야 할 두 가지는 (ⅰ) 지지체가 성장 인자를 얼마나 많이 적재할 수 있는지, (ⅱ) 지지체가 어떻게 이러한 성장인자를 지속적 방출 및 제어적 방출시킬지에 관한 것이다.

그러나, 합성 생체 고분자 지지체의 경우, 단백질 분자에 대한 친화성이 낮아서 적재 능력이 저하된다. 또한 인공 지지체를 제조하기 위한 합성경로는 일반적으로 유기용제를 필요로 하기 때문에 성장 인자를 직접 부하하기 어렵다. 이를 극복하기 위해 몇 가지 접근법이 사용되어왔다. 예를 들어, 지지체의 표면을 성장 인자가 잘 흡착되도록 변형시켰다. 복잡한 방식으로 내부에 성장인자를 적재하는 마이크로 캡슐 또는 미세 입자가 지지체내에 혼입되었다. 또한, 코어-껍질(core-shell) 기술은 종종 성장 인자를 적재하는데 사용되었다. 그러나 적재의 어려움뿐만 아니라 수기간(몇 주에서 몇 달)에 걸쳐 지속적으로 성장 인자를 방출하는 것에도 어려움이 있었다.

한편 생활성 유리(bioactive glass)는 Ca 및 Si 이온의 방출을 통한 골 형성 및 혈관 신생과 같은 세포 반응을 자극하는 역할을 수행한다. 생활성 유리 나노입자(BGn)은 이러한 생활성 유리가 나노크기의 기공을 갖는 다공성 구조로 제조되어 비표면적 및 공극률을 증가시켜 생분해성을 높이고 생체적합성을 부여하고(대한민국 등록특허 10-0831348) 골융합과 생분해를 통해 골재생을 유도하여 결과적으로 조골세포의 분화 및 증식을 촉진하여 뼈 기질의 강도를 높일 수 있는 것으로 알려져 있다.

그러나 생체 적합성 고분자에 생활성 유리 나노 입자를 도입하여, 적재된 단백질을 지속적으로 방출할 수 있도록 제어된 나노복합지지체를 제조할 수 있을지에 대해 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자는 생체 적합성 고분자에 다공성 생활성 유리 나노입자(BGn)를 도입하여 지지체를 제조하면, 성장 인자를 다량 적재할 수 있고 장기간 지속적으로 방출할 수 있는 능력을 현저히 향상될 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명자는 생분해성 고분자인(PLA) 기질에 다공성 생활성 유리 나노복합지지체(BGn/PLA)를 합성하여 생분해성이 높고 우수한 생체 적합성을 갖으며 적재한 단백질의 지속적 및 제어된 방출이 가능한 나노복합지지체를 합성하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 SiO₂ 및 CaO를 포함하는 생활성 유리 나노입자(BGn, bioactive glass nanoparticle) 및 생분해성 고분자(biodegradable polymer)를 포함하는 나노복합지지체로서, 상기 나노복합지지체는 200 내지 500μm의 기공크기를 가지고, 상기 생활성 유리 나노입자는 상기 생분해성 고분자를 기준으로 100 내지 200 중량%포함되어, 상기 생활성 유리 나노입자가 상기 생분해성 고분자의 표면까지 분포된 것인, 나노복합지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노복합지지체에 성장인자를 적재한 나노복합지지체를 포함하는 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) BGn을 실온에서 1 내지 10분간, 바람직하게는 5분간 초음파 처리하에 균질화시키는 단계; (b) 균질화된 용액에 생분해성 고분자를 교반하여 용해시키는 단계; (c) 소금결정 용해과정을 이용해 마크로크기의 포어구조를 가지는 스캐폴드를 만드는 단계; 및 (d) 상기 용액을 동결건조시키는 단계를 포함하는, 상기 나노복합지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노복합지지체 또는 이에 양전하를 띄는 단백질을 포함하는 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물을 제조하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노복합지지체에 성장인자를 적재한 나노복합지지체를 분리된 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내 줄기세포의 증식 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 하나의 양태로서, 본 발명은 SiO₂ 및 CaO를 포함하는 생활성 유리 나노입자(BGn, bioactive glass nanoparticle); 생분해성 고분자(biodegradable polymer)를 포함하는데, 생활성 유리 나노입자는 생활성 유리 나노 입자를 생분해성 고분자 중량비 대비 50% 이상인 대량 포함함으로써, 고분자 내부에 나노입자가 묻혀 존재하기 보다는 고분자의 표면에까지 두껍게 분포하는 형태를 띄며, 200 내지 500 μm의 균일한 기공크기를 가지는 것을 특징으로 한다. 기존의 단백질 방출 지지체의 경우에는 단백질의 적재양이 상당히 적고, 적재양이 늘더라도 몇주간의 지속적인 방출이 어려웠던 문제점이 있었으나, 본 발명의 나노 복합 지지체는 단백질의 흡착이 높고, 이후 수용액에서 탈착이 되더라도 더디게 되며, 탈착된 단백질이 지지체의 마이크로 기공구조를 통해 외부로 방출되어 몇주간 서서히 방출되는 형태가 나타나는 것에 특징이 있다.

이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 용어 "생분해성 고분자(biodegradable polymer)"란 생체 내 또는 자연 환경하에서 스스로 분해되는 고분자를 총칭하며 특히 의료용의 목적으로 생체내에서 분해되는 생분해성 고분자를 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 생분해성 고분자는 폴리락트산(PLA, poly lactic acid), 폴리글리콜산(poly glycolic acid, 폴리카프로락톤(PCL, polycaprolactone), 폴리프로필렌(poly propylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리우레탄(polyurethane), 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나가 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "생활성 유리(bioactive glass)"는 유리-세라믹 생체재료(biomaterial)를 의미하는 것으로 생활성 유리는 생체적합성 때문에 조직재생을 위한 임플란트, 지지체로 널리 이용된다. 생활성 유리는 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 합성할 수 있으며 이는 업계에서 잘 알려져 있다. 생활성 유리 용액은 액상의 생활성 유리와 촉매, 용매 등을 포함하며 본 발명의 한 구체예에서 생활성 유리 용액은 칼슘, 인 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다. 칼슘 성분과 인 성분을 포함함으로써 인체 골조직과 지지체간에 화학적 유사성을 갖도록 할 수 있다. 생활성 유리 용액은 생체 활성유리, 촉매, 용매, 칼슘 및 인을 혼합하여 전자교반하여 제조할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 생활성 유리는 테트라알킬 오르토실리케이트일 수 있다. 예를 들어, 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS) 또는 테트라메틸 오르토실리케이트일 수 있다. 또한 용매는 메탄올, 촉매는 염산, 칼슘클로라이드 및 트리에틸포스페이트(TEP)를 사용할 수 있다. 생활성 유리는 용해로 유래된 것 및 졸-겔로 유래된 것의 두 가지 종류가 있다. 본 발명에서는, 실리카를 기초로 한 졸-겔로 유래된 생활성 유리를 사용할 수 있다. 생활성 유리 나노입자(BGn, bioglass nanoparticle)는 나노수준의 입자로 만든 것으로, 더 넓은 표면적과 더 많은 기공을 가져 생분해성 및 단백질 흡착능이 향상되게 된다. 일반적으로 생활성 유리 나노입자는 SiO₂ 및 CaO를 주성분으로 하고, Na₂O, P₂O₅ 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 생활성 유리 나노입자는 SiO₂가 75 내지 95 중량부를, CaO는 5 내지 25 중량부를 차지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 만약 SiO₂ 중량부가 96 이상일 경우, 소량의 칼슘으로 인해 생활성이 저해될 수 있으며, 또한, CaO의 중량부가 25 이상일 경우 다량의 칼슘 때문에 나노입자의 형상이나 크기를 균일하게 만드는데 문제가 발생할 수 있다.

생분해성 고분자 용액과 생활성 유리 용액을 혼합할 때 생활성 유리 나노입자의 비율을 조절할 수 있다. 또한 생활성 유리의 함량을 조절함으로써 생체고분자/생활성 유리 나노입자 나노복합지지체의 생물학적 분해속도를 조절할 수 있다. 생활성 유리 나노입자의 비율이 높아질수록 단백질의 흡착능이 향상되며 적재한 단백질의 선형방출 및 지속적 방출이 유지되는 기간이 길어지게 된다. 본 발명의 일 실시예에서 생활성 유리 나노입자는 생분해성 고분자를 기준으로 50 내지 200 중량%로 포함할 수 있으며 바람직하게는 100 내지 200 중량%를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 나노복합지지체는 기공크기가 200 내지 500μm를 갖도록 제어될 수 있다. 이 경우, 성장인자들을 가장 높은 흡착능으로 적제할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "비표면적(specific surface area)"는 분체, 입자체의 단위 중량 또는 단위 부피당 겉넓이를 의미한다. 비표면적은 또 분체의 입도를 나타내는 특성값으로서 이용된다. 1g의 분체가 갖는 표면적 S _w (cm²/g)로 나타내는 것이 가장 많지만, 단위 부피에 대한 표면적 S _v (cm²/cm³)로 나타내는 것도 있다. 입자가 작아지는데 따라 이 값은 커지며 계면 현상에 있어 중요한 값이 된다. 본원 일 실시예에서 비표면적이 넓을수록 실제 나노복합지지체의 표면적이 증가됨을 확인할 수 있으며, 생활성 유리 나노입자의 함량이 생분해성 고분자를 기준으로 100 내지 200 중량%로 증가됨에 따라 비표면적은 20 내지 60 m² g^-1의 범위를 가질 수 있으며, 바람직하게는 25 내지 50 m² g^-1의 범위를 갖고, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "접촉각"은 친수성을 나타내는 인자로 사용될 수 있다. 생활성 유리 나노입자의 함량이 증가될수록 나노복합지지체의 친수성이 증가하여 접촉각이 감소될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 생활성 유리 나노입자의 함량이 생분해성 고분자를 기준으로 100 내지 200중량%로 증가됨에 따라 접촉각은 20 내지 60°의 범위를 가질수 있으며, 바람직하게는 30 내지 60°의 범위를 갖고, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "소금결정 용해 과정"은 토양 용액 중에서 염류가 녹아 물층으로 빠져나가는 염류 용탈 작용중의 하나의 예시이다. 이때 녹아나오는 염류에는 칼슘, 칼륨, 철, 마그네슘 또는 염화나트륨일 수 있으며 이에 제한되지 않는다.

본원발명의 일 실시예에서는 BGn/PLA의 나노복합지지체를 제조하고 외형적 및 내부적 특성을 확인하였다. 먼저 BGn의 구형 나노입자는 잘 생성되었고, 입자는 80-110 nm 크기(평균 95 nm)로 분포하였고, ζ- 포텐셜, pH 7.4에서 -18mV, 세공 부피는 0.415 cm³ g^-1, 비표면적은 830 m² g^-1 세공 크기는 3.2 nm를 가져 높은 다공성을 나타내었다(도 1b 내지 도 1d). 다음으로 BGn에 PLA를 혼합하여 만든 BGn/PLA 나노복합지지체는 생활성 유리 나노입자를 생분해성 고분자를 기준으로 50 내지 200 중량%로 함유하도록 제조하였으며, 200 내지 500 μm의 유사한 크기의 공극을 갖는 다공성 구조를 띄었다(도 2b).

본원발명의 다른 실시예에서는 생활성 유리 나노입자를 생분해성 고분자를 기준으로 50 내지 200 중량% 함량을 갖는 경우, 30 내지 60°의 범위를 띄었으며, 생활성 유리 나노입자의 함량이 증가하는 경우 접촉각이 감소하여 나노복합지지체의 친수성이 증가함을 확인하였다(도 3a). 또한 생활성 유리 나노입자를 생분해성 고분자를 기준으로 50 내지 200 중량% 함량을 갖는 경우, 비표면적이 25 내지 50 m² g^-1의 범위를 띄었으며, 생활성 유리 나노입자의 함량이 증가하는 경우 비표면적이 증가하여 나노복합지지체의 표면적이 증가함을 확인하였다(도 3b). 따라서 BGn/PLA 나노복합지지체는 넓은 표면적과 유사한 크기의 공극을 갖는 다공성 구조를 가져 많은 단백질들을 나노복합지지체 내부에 적재하여 약물전달에 이용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 다른 양태로서, 상기 나노복합지지체에 양전하를 띄는 단백질을 적재한 나노복합지지체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 나노복합지지체에 성장인자를 적재한 나노복합지지체를 포함하는 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물을 제공한다.

본원에서 사용된 용어 "성장인자"는 세포, 조직의 수·중량을 증가시키는 작용이 있는 단백질성의 생리 활성물질을 의미하며 특이적 수용체를 매개하여 표적세포에 작용하게 된다. 이러한 성장인자로는 FGF-2(Fibroblast growth factor-2), FGF-18(Fibroblast growth factor-18), BMP-2(Bone morphogenetic protein-2), BMP-7(Bone morphogenetic protein-7), NGF(Nerve growth factor), BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), PDGF(Platelet-derived growth factor), SDF-1(Stromal derived factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β), EGF(Epidermal growth factor) 및 IGF-1(Insulin growth factor-1) 가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 성장인자는 본 발명의 나노복합지지체에 우수한 흡착능력을 갖도록 적재될 수 있다. 이들의 성장인자가 적재된 나노복합지지체를 개체에게 투여할 경우, 성장인자가 지속적으로 방출되어 개체의 간엽줄기세포와의 상호작용에 기인하여 조직 이식 또는 재생 촉진을 유도할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "리소자임"은 분해 효소중 하나로 세균의 세포벽에 있는 무코다당류를 분해하는 작용을 한다. 일반적으로 그람양성균의 세포벽을 구성하는 아미노당을 함유하는 다당류 분자를 기질로 하여 이를 특이적으로 분해하고, 일부 세균의 세포벽도 분해할 수 있는 양성자를 띄는 단백질을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "Cyt c"는 넓은 뜻으로는 헴c를 함유하는 시토크롬을 총칭하며 일반적으로는 고등동식물, 효모, 곰팡이 등의 미토콘드리아에 주로 존재하며 전자전달에 작용하는 양전하를 띄는 단백질을 의미한다.

본 발명의 나노복합지지체는 BGn은 다량 포함하고 특히 고분자 표면까지 넓게 덮고 있는 구조로 인해 많은 양의 양전하를 띄는 단백질을 흡착할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "0차 반응(zero-order kinetics)"은 반응이 일어날 때 반응의 속도가 반응물의 농도와 관계없이 진행되는 반응을 일컫는다. 이러한 0차 방출은 시간에 따른 반응물의 농도가 직선적으로 감소되는 선형 방출을 갖게 된다. 상기 "선형 방출"의 특성을 갖는 의약품은 시간에 따라 일정한 약물을 방출할 수 있어 치료에 있어서 강한 이점으로 작용하게 된다.

본원에서 사용된 용어 "지속적 방출(sustained release)"는 약물이 장시간에 걸쳐 작용할 수 있도록 서서히 약이 방출되는 것을 말한다. 지속적 방출의 경우 투여 횟수를 줄일 수 있어 약물에 의한 부작용을 경감할 수 있는 등의 장점이 많다. 본 발명에서는 약물의 방출이 지속적으로 방출되어 5 내지 30일에 걸쳐 일어날 수 있으며, 바람직하게는 7 내지 21일에 걸쳐 일어날 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "간엽줄기세포"는 조혈모세포와 함께 골수에 존재하는 성체 줄기세포로서, 골수 또는 제대혈 등으로부터 얻을 수 있으며, 비교적 분리 및 증식이 쉽다. 간엽줄기세포는 다양한 수용성 인자를 분비하여 다양한 중배엽성 세포 계통 (연골아세포, 골아세포, 섬유아세포, 지방세포) 및 조직으로 분화가 가능하기 때문에 조직 손상의 치료에 이용하고자 하는 시도가 이루어지고 있으며, 이식 및 자가면역질환 모델에서 면역 관용 및 억제효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일실시예에서 사용된 간엽줄기세포는 골수에서 유래될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 BGn/PLA 나노복합지지체에 Cyt C를 적재하여 BGn 함량에 따른 적재양을 분석하였다. Cyt C의 양은 BGn의 함량이 증가함에 따라 크게 증가했다. 순수 PLA의 경우 5.5 μg mm^-3 50% BGn의 경우 <25.3 μg mm^-3 <100% BGn << 102.3 μg mm^-3 및 200% BGn의 경우 274.1 μg mm^-3의 Cyt C를 흡착할 수 있었다(도 4a). 이는 BGn 함량이 증가할수록 높은 다공성을 띄어 더 많은 단백질을 흡착할 수 있음을 시사하였다. 또한 나노복합지지체는 음전하를 띠는 단백질 (BSA)보다 양전하를 띠는 단백질(Cyt C 및 리소자임)과 선택적으로 결합하며 BGn의 음전하를 띄는 Si-OH가 주로 선택적 결합에 기여하는 것을 밝혔다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 BGn/PLA 나노복합지지체에 Cyt C를 적재하여 BGn 함량에 따른 Cyt C의 방출패턴을 분석하였다. 순수 PLA에서 Cyt C 방출은 거의 7일 이내에 이루어졌으나, BGn/PLA 나노복합지지체에서 Cyt C 방출은 오랜기간 동안 계속되었다(도 5a). 이러한 BGn/PLA 나노복합지지체에서 Cyt C의 방출은 3일 이후 거의 0차반응 속도를 띄어 선형방출이 나타났으며 50% BGn에 대해 0.32, 100% BGn에 대해 0.96, 200% BGn 스캐 폴드에 대해 2.92의 선형성을 나타냈다(R²> 0.98). 또한 BGn/PLA 나노복합지지체는 비슷한 방출 프로파일을 나타냈으며 BGn 함량이 높을수록 더 긴 기간동안 단백질 방출을 유지하는데 효과적임을 확인할 수 있었다(도 5b). 따라서 BGn/PLA 나노복합지지체의 BGn 함량 조절을 통해 단백질 방출 기간을 조절할 수 있고 함량을 높여 더욱 긴 기간 동안 적재한 단백질을 지속적으로 방출하도록 할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 BGn/PLA 나노복합지지체에 성장인자 중 하나인 FGF2를 적재하고 이의 방출패턴을 분석하였다. FGF2의 방출은 최대 28일동안 고도로 지속되는 방식으로 이루어졌으며, 28일까지 방출된 FGF의 양은 결과적으로 ~7 μg이었으며 하루에 ~250 ng임을 확인할 수 있었으며 이는 세포 자극 및 상처치유에 치료학적으로 허용될 수 있는 양에 해당한다(도 6).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 BGn/PLA에 적재된 성장인자의 방출이 생물학적 결과에 미치는 영향을 줄기세포의 증식으로 확인하였다. BGn/PLA 나노복합지지체는 세포막을 통해 간엽줄기세포(MSC, mesenchymal stem cell)와 반복적으로 상호작용하였으며, 최대 3주기간 동안 지속적으로 방출되는 FGF2가 세포증식을 자극하여 간엽줄기세포 증식이 25 내지 30% 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 7a 내지 도 7c). 따라서, BGn/PLA 나노복합지지체에 성장인자를 적재하여 줄기세포의 증식을 유도하고 이로 인해 조직이식 또는 재생 촉진에 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 양태로서, (a) BGn을 실온에서 1 내지 10분간, 바람직하게는 5분간 초음파 처리하에 균질화시키는 단계; (b) 균질화된 용액에 생분해성 고분자를 교반하여 용해시키는 단계; (c)소금결정 용해과정을 이용해 마크로크기의 포어구조를 가지는 스캐폴드를 만드는 단계 및 (d) 상기 용액을 동결건조 시키는 단계를 포함하는, 상기 나노복합지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서 상기 나노복합지지체 또는 이에 양전하를 띄는 단백질을 포함하는 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물을 제조하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 나노복합지지체에 성장인자를 적재한 나노복합지지체를 분리된 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내 줄기세포의 증식 방법을 제공한다.

본 발명은 생분해성 고분자인 PLA 기질에 생활성 유리 나노입자 나노복합지지체(BGn/PLA)를 합성하여 생분해성이 높고 우수한 생체 적합성을 가지며, 적재된 단백질을 지속적으로 방출할 수 있도록 제어된 나노복합지지체, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또한 생활성 유리 나노입자/생분해성 고분자인 PLA 나노복합지지체(BGn/PLA)는 성장인자와 같은 단백질을 적재하여 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 나노복합지지체를 만들기 위해 PLA와 함께 사용한 BGn의 특성에 관한 것이다. 도 1a는 저배율 및 고배율의 TEM 이미지를 나타낸 것이며, 도 1b는 크기 분포, 도 1c는 pH에 따른 ζ-전위 변화(pH 7.4에서 수직선은 -18mV에 해당한다.)를 나타낸 것이며, 도 1d는 BET 방법에 의해 분석된 비표면적을 포함하는 다공성 성질, 기공 크기 및 기공 부피를 나타낸 것이다.
도 2a는 다양한 BGn 함량에 따른 BGn/PLA 지지체의 SEM 이미지를 나타낸 것이며 도 2b는 기공율측정기(porosimeter)로 측정한 지지체의 다공성을 나타낸 것이며, 도 2c는 BGn과 관련된 Si-O-Si 결합이 나타난 지지체의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 BGn/PLA 지지체의 특성에 관한 것이다. 접촉각을 60초까지 기록하였고, BGn 혼입에 따라 대표 이미지에서 유의미한 감소를 보였다. 지지체의 비표면적을 N₂ 흡입/탈착 곡선으로 측정하였으며 BGn 혼입에 따라 증가를 보였다. 도 3a는 접촉각 측정에 따른 친수성에 관한 것이고, 도 3b는 BET 방법에 의한 비표면적에 관한 것이다.
도 4a는 BGn/PLA 지지체에 단백질 적재에 관한 것으로 Cyt C를 모델 단백질로 하여 측정하였다. 도 4b는 다른 전하를 갖는(pH 7.4에서 양전하를 갖는 리소자임 vs. 음전하를 갖는 BSA)다른 단백질들에 대한 데이터는 Cyt C 와 대조적으로 테스트하였는데 BGn함량이 높을수록 적재양이 증가하였음을 보여준다; BGn/PLA 지지체는 선택적으로 양전하를 띄는 단백질을 적재한다.
도 5는 지지체로부터 Cyt C의 방출에 관한 것으로, 28일까지 누적적으로 기록하였다. 도 5a는 절대적 방출 양을 나타내고, 도 5b는 처음 적재양 대비 상대적 방출양을 나타낸다. 나노복합지지체로부터 Cyt C 방출은 순수 PLA 지지체에 대비하여 고도로 지속적(테스트기간 동안 연속적으로)인 방출을 나타냈다. 나중 단계(3일 후)의 데이터는 선형 관계(0차 방출)를 잘 나타내며, 역학적 파라미터(Q0, K0)는 그래프 (a) 아래에 표시하였다.
도 6은 지지체(대표적 조성인 BGn 100%를 사용함)에서 FGF2 성장인자가 방출되고, 28일까지 누적적으로 측정하였다. 방출 프로파일은 28일에 걸쳐 고도로 지속적인 패턴을 나타내며, 전체 방출양은 ~50 %정도에 해당한다.
도 7은 FGF2의 느린 방출에 따른 rMSC 분화에 대한 효과를 나타낸다. 도 7a는 트랜스웰 막에 함유된 FGF2가 담긴 지지체가 테스트기간 동안 유지되고 rMSC의 배지를 매주(3주까지) 교체해주는 실험에서 rMSC가 증식하는 3일을 측정하는 실험 도식을 나타낸 것이다. 도 7b는 매주(1 주, 2 주 및 3 주) 측정한 세포의 증식을 나타내며 도 7c는 실험 3주째에 찍힌 대표적 세포 이미지를 나타낸다. FGF2를 방출하는 지지체는 FGF가 없는 지지체보다 유의미하게 높은 증식 수준을 나타내었고, FGF-2에 의한 rMSC에 대한 자극(20-30% 증가)은 3주까지 지속되었다. 통계적으로 유의미한 차이가 나타났다(** p <0.01 (ANOVA, n = 4).

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 재료의 준비 및 분석방법

1-1. 실험재료 수득처

테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS, C₈H₂O₄Si, 98%, Sigma-Aldrich), 칼슘 나이트레이트 테트라하이드레이트(Ca(NO₃)_{2 ·}4H₂O, 99%, Sigma-Aldrich), 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB, C₁₉H₄₂BrN≥98%, Sigma-Aldrich), 암모늄 하이드록사이드(NH₄OH, 수중 28.0% NH₃≥99.99% metal basis), 무수 메탄올(CH₄O, 99.8%, Sigma-Aldrich), 1,4-디옥산(C₄H₈O₂, Sigma), 클로로포름(CHCl₃, 대-정), 염화나트륨(NaCl, 대-정)을 수득한대로 사용하였다. 폴리-L/D-락트산(PLA; LESOMER@LR708, L-락타이드:D, L-락타이드 분자의 비율 = 70:30, Mn = 910 000)을 Evonic으로부터 구매하였다. Micro BCA™ 단백질 검정 키트는 Thermo scientic로부터 수득하고, 세포 카운팅 키트-8(CCK-8)를 Dojin molecular technologies, INC. 에서 구매하였다. 사용한 단백질인 사이토크롬 C (Cyt C, C2037), 리소자임 (Lysozyme, 62971)은 Sigma aldrich로부터, 소혈청알부민(BSA)은 Equitech Bio, INC.로부터 수득했다.

1-2. 데이터 분석 방법

데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 통계 분석은 일원 분산 분석 (ANOVA)을 수행하였으며, 유의 수준은 p <0.01로 고려된다.

실시예 2. BGn / PLA 나노복합지지체 지지체의 제조 및 그 특성

2-1. 다공성 생활성 유리 나노입자( MBGn , Mesoporous bioactive glass nanoparticle)의 합성

85% SiO₂-15% CaO 몰조성을 기반으로 다공성 생활성 유리 나노입자는 다공성 구조의 탬플릿으로서 CTAB를 사용하는 초음파화학의 졸-겔 방법에 의해 제조되었다. 간단히, 13.72 mmol의 CTAB 및 0.76 mmol의 Ca(NO3)_{2 ·}4H₂O를 120mL의 무수 메탄올에 용해시키고, 이어서 NH₄OH를 사용하여 pH를 12.5로 조정하였다. 또 다른 4.3 mmol의 TEOS를 30 mL의 무수 메탄올로 희석한 다음 격렬하게 교반하고 20분 동안 초음파처리하여 용액에 첨가하였다. 24시간 동안 교반한 후 생성된 침전물을 분리하고 물과 에탄올로 반복적인 원심 분리/재분산(5000 rpm, 5분)을 한 후 70 ℃에서 하루 동안 건조시켰다. 분말을 공기 흐름 하에서 600 ℃로 5시간 동안 열처리하였다. 제조된 나노입자는 추가 사용을 위해 진공 하에 보관하였다.

2-2. BGn / PLA 나노복합지지체의 제조

BGn/PLA 나노복합지지체의 제조를 위해, BGn을 실온에서 5분간 초음파 처리하여 혼합용매(1:4 v/v의 클로로포름 및 1,4-디옥산) 중에서 먼저 균질화시키고, 이 때 3% w/v PLA를 교반하면서 용해시켰다(PLA에 대한 BGn%는 0, 50, 100 및 200% w/w로 설정됨). 그 용액을 원통형 플라스틱 몰드 (직경 5mm)에 붓고 NaCl 입자(크기를 200-500mm 사이에서 선택)를 채웠고 이는 지지체의 기공생성중합체로써 사용되었다. -20 ℃로 얼려서 -120 ℃에서 3일간 동결 건조하여 혼합용매를 제거하였다. 지지체를 절단(직경 5mm×높이 3mm)하고 증류수에서 NaCl 입자를 완전히 침출한 다음 추가 사용할 때까지 건조시켰다.

2-3. BGn / PLA 나노복합지지체의 특성 확인

고해상도 투과 전자 현미경(HR-TEM, JEM-3010, JEOL, Japan)을 이용하여 형태, 다공성 구조 및 나노입자의 크기를 관찰하였다. 입자 크기 분포는 image J 소프트웨어(NIH)에 의한 TEM 이미지(n=200 입자)로부터 결정되었다. 상이한 pH 값에서 나노입자의 표면 전하는 레이저 도플러 전기 영동 장치(Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, UK)를 사용하여 제타(ζ) 전위를 측정하였다. ζ 전위를 25℃에서 물에서 측정하였으며, 5번 측정을 위해 20 Vcm^-1의 적용 필드 강도(applied field strength)로 측정하였다. 장치는 자동으로 전기영동 이동도(U)를 계산하고 ζ 전위는 헬름홀츠-스몰루코우스키(Helmholtz-Smoluchowsky)방정식에 따라 얻었다: ζ = Uη/ε

여기서 η는 분산 매체 점도이고 ε은 유전 상수이다.

지지체의 비표면적(m²g^-1)은 표면적 분석기(Micromeritics, 3Flex)를 사용하여 Brunauer-Emmett-Teller(BET) 방법으로 측정하였다. 지지체의 형태와 BGn의 존재를 필드 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM, S-4300, JEOL)으로 관찰하였다. 수은 공극측정기 (PM33, Quantachrome)를 사용하여 지지체의 다공성을 측정했다. 에너지 분산 X-선 분광법(EDX, Bruker)을 사용하여 지지체의 BGn 성분을 확인하였고 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR; 640-IR, Varian)을 사용하여 화학적 작용기 및 BGn과 중합체 사이의 가능한 상호작용에 대해 평가하였다. 데이터 분석은 실시예 1-2와 같이 실시하였다.

실시예 2-4. BGn / PLA 나노복합지지체의 외형적 특성

PLA를 이용한 나노복합지지체의 제조를 위해, BGn을 생체 활성 나노성분으로 혼입하였다. BGn의 나노형태를 TEM 이미지(도 1a)로 검사하였다. 높은 다공성 구조를 갖는 구형 나노입자는 잘 생성되었고, 입자는 80-110 nm 크기(평균 95 nm)로 분포하였다(도 1b). BGn의 ζ- 포텐셜은 pH 값이 증가함에 따라 서서히 감소하여 pH 7.4에서 -18 mV를 기록했는데 이는 중성 pH에서 나노입자가 음전하를 띠는 것을 의미한다(도 1c). BET로 분석했을 때, BGn은 세공 부피(0.415 cm³ g^-1), 비표면적(830 m² g^-1) 및 세공 크기(3.2 nm)를 포함하여 높은 다공성을 나타냈으며(도 1d), 높은 다공성 BGn은 생물학적 분자를 적재하는데 효과적일 수 있다.

다음으로, BGn을 PLA 내에 혼입하였으며, 나노복합지지체를 마이크로 다공성 구조로 제조하기 위해 소금결정 용해(salt leaching)공정을 도입하였다. BGn(PLA에 대한)의 함량을 0, 50, 100 및 200 중량%로 다양하게 제조하였다. BGn/PLA 지지체의 형태를 SEM으로 검사하였다(도 2a). 저배율에서, 모든 지지체는 유사한 형태, 즉 약 200 내지 500 μm의 공극 크기를 갖는 고도의 다공성 구조를 나타냈다. 수은 침입 기공율측정기(porosimeter)로 측정한 지지체의 다공성은 97.0-98.5%의 유사한 범위를 나타냈다(도 2b). 면밀히 검토해 보면, 나노복합지지체에 BGn이 존재함을 확인하였다. 응집된 작은 크기의 나노입자가 표면에 모였으며, 이는 순수 PLA 지지체의 매끄러운 표면과 대비된다. 표면상에 풍부하게 존재하는 BGn은 다공성 지지체의 계면 특성을 결정하고, 따라서 생물학적 분자 및 세포와의 상호 작용에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 나노복합체의 EDS 분석은 Si와 Ca에 상응하는 추가 피크를 보였으며(도 1의 ESI에서와 같이 순수 PLA 골격의 피크와 함께), 원자 피크 강도는 BGn 함량이 증가함에 따라 점진적으로 증가했다. BGA 함량이 증가함에 따라 피크 강도가 증가하는 나노복합지지체의 FT-IR 스펙트럼은 PLA와 같이 사용할 때 BGn과 관련된 화학 결합(462 cm^-1에서의 Si-O-Si)의 발달을 나타냈다(도 2c ).

실시예 2-5. BGn / PLA 나노복합지지체의 내재적 특성

BGn/PLA 지지체의 친수성 및 비표면적, 단백질 흡착에 중요한 특성을 추가로 조사하였다. 접촉각을 물방울 방법으로 지지체에서 측정하였다(도 3a). 접촉각이 모든 지지체에 대해 60초까지 감소되는 것을 기록하였다. BGn의 존재는 측정된 모든 시간지점에서 접촉각을 유의미하게 감소시켰다. 초기 접촉각은 60초 후 68 ° (순수 PLA) ~ 68 ° (50% BGn) > 56 ° (100% BGn) > 46 ° (BGn 200 °) 및 65 ° (순수 PLA)> 58 ° BGn) > 45 ° (100% BGn) > 31 ° (BGn 200%)으로 기록되었다. 상기 결과는 수용액에서 BGn/PLA 지지체 내로 신속하게 물이 침투하여 BGn 혼입으로 소수성 생체 고분자 지지체가 고도로 친수성이 됨을 보여준다. 각 지지체 샘플에 물방울의 대표도는 BGn-혼입된 나노복합지지체에서 물의 빠른 흡수를 뒷받침한다.

지지체(PLA, 50% BGn 및 100% BGn)의 비표면적을 BET 방법으로 추가로 분석 하였다(도 3b). 이 분석은 측정 중 부서지기 쉬운 성질 때문에 200% BGn에서는 실시할 수 없었다. N₂ 흡착/탈착 곡선은 BGn/PLA 나노복합지지체가 순수한 PLA보다 높은 기체 부피를 가짐을 보여줬고 이는 더 많은 기체를 흡착함을 보여준다. 곡선을 기반으로, 지지체의 비표면적을 추론할 수 있다. BGn의 혼입은 지지체의 비표면적을 24 m² g^-1(순수 PLA) ~ 24 m² g^-1 (50% BGn) <48 m² g^-1 (100% BGn)으로 상당히 향상시켰다. 이는 표면에서 BGn 함량의 증가로 비표면적이 증가하였고 이로 인해 BGn의 높은 다공성 구조가 N₂ 가스 분자를 효과적으로 흡착할 수 있음을 시사한다. 지지체의 비표면적의 증가는 생체 분자와의 상호작용 수용력을 향상으로 이어진다.

실시예3 . BGn / PLA 나노복합지지체의 단백질 적재 및 방출 테스트

3-1. 실험 방법

단백질 적재를 위해 Cyt C를 모델 단백질로 사용했다. 6 mg (0, 50, 100 및 200% BGn)의 각 지지체를 실온에서 24시간 동안 100 μg mL^-1 Cyt C를 함유한 1 mL 수용액(증류수)에 담그고 단백질의 방출 거동에 접근하는 동안(멀티 믹서, SLRM-3, SeouLin Bioscience)를 F4 모드와 15 rpm으로 물리적으로 회전시켰다. Cyt C가 완전히 적재될 때, 추가의 용액(100 μg mL^-1 Cyt C) 또한 지지체(특히 100 및 200% BGn)에 적재하였다. 상청액을 상이한 시점 (1, 3, 7, 14, 21 및 28 일)에서 수집하고 BCA 검정 키트를 사용하여 분석하였다. 적재된 양은 다중-검출 마이크로 플레이트 판독기(Molecular devices corporation)를 사용하여 595 nm에서 읽은 흡광도에 의해 계산되었다. 리소자임과 BSA를 포함한 다른 유형의 단백질도 100% BGn 지지체를 사용하여 테스트하여 단백질의 다른 전하의 효과를 조사했다. 각 조건 (n=3)에 대해 3개의 복제 샘플을 테스트했다.

지지체로부터의 Cyt C의 방출 거동을 15 rpm으로 회전하면서 각 지지체를 1 mL D.W.에 담그어 측정하였다. 각 테스트 기간(1, 3, 7, 14, 21 및 28일)에 상청액을 수집하여 595 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 매 실행마다 배지를 새로 교체해주었다. 데이터 분석은 실시예 1-2와 같이 실시하였다.

3-2. BGn 함량에 따른 BGn / PLA 나노복합지지체의 Cyt C 적재양 분석

나노복합지지체가 성장 인자를 로드하는 능력은 모델 단백질로 Cyt C를 사용하여 평가하였다. 원통 지지체의 다른 조성을 Cyt C 용액에 담그고 적재 된 양을 측정하였다(도 4a). Cyt C의 양은 BGn의 함량이 증가함에 따라 크게 증가했다. 순수 PLA의 경우 5.5 μg mm^-3 50% BGn의 경우 <25.3 μg mm^-3 <100% BGn << 102.3 μg mm^-3 및 200% BGn의 경우 274.1 μg mm^-3의 Cyt C를 흡착할 수 있었다. 비교를 위해 순수한 PLA와 100% BGn 나노복합체를 사용하여 다른 단백질 (양전하를 띤 리소자임과 pH 7.4의 음전하를 띠는 BSA)도 시험하였다(도 4b). 리소자임은 100% BGn 나노복합체에서 순수한 PLA보다 훨씬 더 많이 적재되었다(100% BGn의 경우 5.4mg의 순수 PLA 경우 18.6mg). 다른 한편, BSA 적재는 두 지지체 모두에서 유사했다. 적재 결과에 근거하여, 나노복합지지체는 음전하를 띠는 단백질 (BSA)보다 유리한 양전하를 띠는 단백질(Cyt C 및 리소자임)과 선택적으로 결합하며 BGn의 음전하를 띄는(Si-OH)가 주로 선택적 결합에 기여하는 것을 밝혔다. 나노복합지지체(순수한 PLA의 5 내지 20 배 이상)에 실질적으로 강화된 단백질 적재는 성장 인자 저장 및 전달체계에 대한 지지체의 유용성을 강화시킨다.

3-3. BGn 함량에 따른 BGn / PLA 나노복합지지체의 Cyt C 방출 패턴 분석

다음으로, 지지체로부터의 단백질 방출을 장기간 조사하였다. 지지체로부터 Cyt C의 방출을 최대 28일 동안 기록하였다(도 5a). 순수 PLA에서 Cyt C 방출은 거의 7일 이내에 이루어졌다. 그러나, 나노복합지지체에서 Cyt C 방출은 오랜기간 동안 계속되었다. 방출 패턴은 2단계 프로파일, 즉 초기에는 급속(3일 이내) 및 그 이후(3일부터 시험기간까지)지속되었다. 특히, 3일 후의 방출은 거의 0차 반응속도를 따르는 것으로 나타났다. 모든 나노복합지지체의 데이터는 50% BGn에 대해 0.32, 100% BGn에 대해 0.96, 200% BGn 스캐 폴드에 대해 2.92의 선형성을 나타냈다(R²> 0.98).

단백질 방출의 선형 프로파일은 지지체의 이상적인 전달 시스템으로 여겨진다. 방출양은 또한 적재양에 대해 표준화한 후에 나타내었다(도 5b). 모든 나노복합지지체의 방출 프로파일은 비슷한 거동을 보였다. 그러나, 방출 속도는 BGn 함량이 증가함에 따라 약간 낮아져 나노복합지지체의 방출 속도가 유사함을 보여준다. 그러나, 높은 BGn 함량은 더 긴 기간 동안 단백질 방출을 유지하는데 매우 효과적이었다. 28일 후 Cyt C의 방출%는 순수 PLA(거의 모두 방출되었으며 7일까지 버스트 방출)와는 대조적으로 약 30% (BGn 200%), 50% (BGn 100%) 및 60% (BGn 50%)가 방출되었다.

이러한 단백질의 적재 및 방출 결과를 바탕으로 조직재생 과정에 널리 사용되는 후보 성장인자 FGF2에 대해 적재양 및 방출경향에 대해 추가로 실험하였다.

실시예 4. FGF2 성장인자의 적재 및 방출

4-1. 실험 방법

성장 인자의 연구를 위해, 녹색 형광 단백질로 표지된 FGF2(FGF2-GFP)의 재조합 형태를 다른 곳에서 기술된 바와 같이 제조하였다. FGF2(멸균 인산 완충 생리 식염수 중 40 mg mL^{- 1})를 실온에서 어두운 곳에서 온화한 진탕(Digital reciprocating shaker, SHR-1D, DAIHAN scientific)을 하면서 2mg의 각 지지체에 24시간 동안 적재하였다. 상청액을 수집하고, 다중 검출 마이크로 플레이트 판독기(Molecular devices corporation)를 사용하여 형광 강도를 측정하였으며, 이는 FGF2의 완전한 적재를 보여주었다. 지지체로부터의 FGF2의 방출을 1 mL PBS (pH 7.4)에 진탕시키면서 침지하여 시험하였다. 미리 정해진 시간 (3일, 7일, 14일 및 28일)에 상청액을 수집하고 형광 강도를 분석하였다. 배지를 매회 새로 교체해주고 각 조건 (n=3)에 대해 3개의 복제 샘플을 테스트하였다. 데이터 분석은 실시예 1-2와 같이 실시하였다.

4-2. 실험 결과

GFP로 표지된 FGF2를 대표적인 나노복합지지체(100% BGn) 상에 적재하고, 그의 방출 프로파일을 최대 28일 동안 고도로 지속되는 방식으로 방출시켰다. Cyt C 방출에서 관찰된 것과 유사한 선형 방출은 투여하고 짧은 시간 후에 잘 나타났다. 7일째, 14일째, 21일째, 28일째에 FGF2의 방출량은 3.0, 4.5, 5.9, 7.3 μg이었으며, 28일 동안의 총 방출량은 48%였고, FGF2가 그 후에 계속 방출될 것임을 시사했다. 이러한 양의 FGF2는 세포 자극 및 상처 치유에 대해 치료학적으로 허용 가능하다고 여겨진다.

실시예 5. 간엽줄기세포 ( MSC , mesenchymal stem cell)의 배양 및 분화

5-1. 실험 방법

FGF2 방출이 생물학적 결과에 미치는 영향을 MSC의 증식으로 확인하였다. 쥐의 골수 유래 MSCs(Sprague Dawley, 5주, Dayun, South Korea)를 사용하였고, 분리 및 배양 프로토콜은 이전 연구에 기술되어 있다. 세포를 37℃, 5% CO₂를 함유한 습기 많은 대기에서 10% 소태아 혈청(FBS, Corning)과 1% 페니실린(P/S)을 첨가한 α-최소 필수 배지(α-MEM, Gibco)로 만든 성장 배지에서 배양하였다. 배지는 2일마다 교체해주었다.

나노복합지지체의 세포 독성을 CCK분석을 사용하여 확인하였다. 간단히 말해서, 1X10⁴ 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰에 도말하였다. 각 지지체를 포함하는 세포 배양 삽입부(투명 PET 막, 24웰, 8.0 mm 공극 크기)를 각 웰에 넣고 7일 동안 배양하였다. 각 시점(1, 3, 및 7 일)에서, 세포 생사판별을 제조자의 지시에 따라 CCK 검정 키트를 사용하여 조사하였다.

그 다음 지지체로부터의 FGF2 방출 효과를 조사하였다. 이를 위해 1X10⁴ 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰에 도말하고 24시간 동안 배양하였다. 지지체(FGF2가 있거나 없는 100% BGn 및 대조군으로서 순수한 PLA)를 함유하는 트랜스웰 삽입부를 웰에 넣고 배양하였다. 초기 3일 동안의 세포 증식은 CCK 분석에 의해 측정되었다. 그런 다음 지지체로부터의 FGF2 방출 효과를 확인하였다. 이를 위해 1X10⁴ 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰에 도말하고 24시간 동안 배양하였다. 지지체(FGF2가 있거나 없는 100% BGn 및 대조군으로서 순수한 PLA)를 함유하는 트랜스웰 삽입부를 웰에 넣고 배양하였다. 초기 3일 동안의 세포 증식을 CCK 분석에 의해 측정하였다. 그 후, 사용된 인공 지지체를(세포가 없는) 신선한 배지에 4일 동안 연속적으로 담그고, 다음 실행의 세포 배양에 사용하고, 매회마다 세포의 배지를 교체해주었다; 결과적으로, 매주 초기 3일 동안 FGF2 방출 효과를 새로운 세포를 사용하여 확인할 수 있었다. 분석을 3주까지 수행하였다. 각 조건 (n=3)에 대해 3 개의 복제 샘플을 테스트했다. 광학 현미경(형광 현미경, Olympus, IX71) 하에서 세포 성장 영상을 관찰하였다. 데이터 분석은 실시예 1-2와 같이 실시하였다.

5-2. 실험 결과

rMAC 증식을 통해 나노복합지지체로부터 서서히 방출되는 FGF2의 생물학적 효과를 실험하였다. 지지체(FGF2 제외)의 사전비교 테스트는 CCK (ESI, 도. S2 †)로 분석한 바와 같이 유의미한 세포 독성을 나타내지 않았다. 일정 기간(3일) 동안 매주 세포의 배지를 교체해주면서(최대 3 주까지) 개요로 설명된 것처럼(도 7a) FGF2가 적재된 지지체는 트랜스웰 세포막을 통해 rMSC와 반복적으로 상호작용하였다. 1주째, 배양 3일 후에 FGF2가 적재된 지지체는 FGF2가 없는 지지체보다 유의미하게 높은 세포 증식(~ 20% 증가)을 나타냈다(도 7b).

2주째에 rMSC의 배지를 교체해준 후, 3일 동안 배양하였다. 세포 증식은 또한 1주째 관찰된 경향을 반영할 때, FGF2가 있는 군과 없는 군에서 유의미한 차이가 있었다. 3주째에 배지를 교체해준 rMSCs는 이전 주에서 관찰된 rMSC와 유사한 증식 거동을 보였다. 관찰된 그룹 간의 세포 증식의 25-30% 증가는 지지체에서 지속적으로 방출되는 FGF2(최대 3 주)가 시험기간 동안 세포 증식을 자극하는 역할을 지속한다는 것을 시사한다. 세포의 광학 이미지는 FGF2-방출 지지체에 의해 자극된 세포 증식을 잘 반영하였다(도 7c).

여기서 FGF2는 성장인자 적재 및 지속 방출에 대한 지지체의 용량을 평가하기 위한 모델 성장인자로 사용되었고, 생물학적 효과를 MSC의 증식으로 분석하였다. 실제로, FGF2는 세포 증식, 호밍 및 혈관 신생과 같은 뼈 재생의 초기단계에서 줄기세포 행동을 자극하는 것으로 알려져 있다. 추가 연구로서, 세포의 골 형성 및 성숙에 관여하는 다른 성장 인자(예: 뼈 형태 형성 단백질 및 FGF18)는 궁극적으로 MSC가 뼈 계열 및 미네랄화가 되도록 도움이 될 수 있는 지지체를 통한 성장 인자의 장기 방출 효과를 잘 나타내는 것으로 여겨진다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

1. SiO₂ 및 CaO를 포함하는 생활성 유리 나노입자(BGn, bioactive glass nanoparticle) 및 생분해성 고분자(biodegradable polymer)를 포함하는 나노복합지지체로서,
   상기 나노복합지지체는 200 내지 500μm의 기공크기를 가지고;
   상기 생활성 유리 나노입자는 상기 생분해성 고분자를 기준으로 100 내지 200 중량%포함되어, 상기 생활성 유리 나노입자가 상기 생분해성 고분자의 표면까지 분포되고;
   상기 나노복합지지체의 기공에 양전하를 띄는 단백질을 적재(load)하고;
   상기 단백질의 선형방출이 0차 반응속도를 따라 7 내지 28일에 걸쳐 지속적으로 방출되는 것이 특징인, 양전하 띄는 단백질 방출용 나노복합지지체.
2. 제1항에 있어서, 생활성 유리 나노입자는 75 내지 95 중량부의 SiO₂ 및 5 내지 25 중량부의 CaO를 포함하는 것인, 나노복합지지체.
3. 제1항에 있어서, 접촉각이 30 내지 60 °인, 나노복합지지체.
4. 제1항에 있어서, 비표면적(specific surface area)이 25 내지 50 m² g^-1인, 나노복합지지체.
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6. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 성장인자(growth factor), 리소자임 및 Cyt C로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 나노복합지지체.
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9. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는, 폴리락트산(PLA, poly lactic acid), 폴리글리콜산(poly glycolic acid, 폴리카프로락톤(PCL, polycaprolactone), 폴리프로필렌(poly propylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리우레탄(polyurethane)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노복합지지체.
10. 제8항의 나노복합지지체를 포함하는, 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 조직 이식 또는 재생 촉진은 간엽줄기세포 증식에 의한 것인, 조성물.
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13. 제1항의 나노복합지지체를 포함하는, 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물을 제조하기 위한 키트.
14. 제8항의 나노복합지지체를 분리된 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내 줄기세포의 증식 방법.

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