RU2692768C1

RU2692768C1 - Пористые биополимерные микросферы для контролируемого высвобождения положительно заряженных белков и способ получения микросфер

Info

Publication number: RU2692768C1
Application number: RU2017147026A
Authority: RU
Inventors: Вера Владимировна Воинова; Антон Павлович Бонарцев; Константин Вольдемарович Шайтан
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-06-27

Abstract

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, в частности к пористым биополимерным микросферам для применения в качестве носителя для положительно заряженных терапевтических белков. Предложенные микросферы обладают свойствами сорбента-катионообменника, выполнены из биосовместимого и биодеградируемого полимера, имеют средний диаметр в диапазоне от 10 до 1000 мкм, имеют сквозную систему пор с общей пористостью от 75 до 99% и средним размером пор от 0,5 до 20 мкм, при этом биосовместимый и биодеградируемый полимер имеет молекулярную массу от 1×10до 1×10Да, получен методом бактериального синтеза и представляет собой поли-3-оксибутират. Также предложены: способ получения таких микросфер, их применение для связывания с положительно заряженными терапевтическими белками и способ получения пористых биополимерных микросфер с положительно заряженным терапевтическим белком. Группа изобретений обеспечивает получение материала в виде микросфер с высокой пористостью, обладающих способностью к контролируемой сорбции и последующему пролонгированному высвобождению положительно заряженного терапевтического белка. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биоразлагаемых и биосовместимых полимерных материалов, предназначенных для использования в медицине, обладающих дополнительным терапевтическим эффектом за счет контролируемого высвобождения терапевтических белков, которые могут быть использованы в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, реконструктивно-восстановительной хирургии, косметологии, стоматологии для восстановления дефектов различных тканей, а также в качестве средства доставки лекарственных веществ, предназначенных для длительной терапии повреждений костной, хрящевой и мягкой соединительной тканей, вызванных различными патологиями, например, для регенерации повреждений костной ткани, осложненных инфекцией.

Уровень техники

Микросферы различного диаметра широко используются в качестве материалов медицинского назначения для восстановления дефектов различных тканей, прежде всего костной, хрящевой и мягкой соединительной, вызванных различными заболеваниями: наследственными патологиями, травмами, инфекциями, хроническими воспалениями, опухолевыми заболеваниями, а также в косметических целях. Однако недостатками таких материалов часто являются недостаточная совместимость с окружающими тканями, неспособность к биоразложению с заданными сроками и отсутствие длительного терапевтического воздействия на область дефекта ткани с целью ее регенерации.

Пролонгированная доставка лекарственных веществ в организм в требуемых дозах позволяет устранить многие недостатки традиционных лекарственных форм, в т.ч. при стимуляции регенерации различных тканей. Такими недостатками, чаще всего, являются повышенная токсичность и нестабильность физиологически активного вещества, неравномерная скорость его подачи, неэффективный расход действующего начала и др. Лекарственные вещества могут быть инкапсулированы в микрочастицы на основе различных биоматериалов с помощью различных известных способов. При введении в организм микрочастицы за счет диффузионных и биодеструктивных механизмов высвобождают лекарственные вещества в течение длительного времени, что обеспечивает продолжительное поддержание терапевтических концентраций лекарственных веществ в крови при системном введении или локально в ткани или органе при местном введении. Тем самым устраняется необходимость многократных инъекций препаратов, снижается их токсичность и побочное действие, повышается эффективность терапии.

Так, различные факторы роста играют большую роль в регенерации костной ткани. В настоящее время костный морфогенетический белок (BMP) (ВМР-2 и ВМР-7) клинически одобрен для применения у пациентов. Другие факторы роста и цитокины, в том числе ВМР-4, трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), сосудистый фактора роста (VEGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), и стромальный ростовой фактор (SDF1) также имеют важное значение для формирования костей. Ростовые факторы и цитокины (в т.ч. перечисленные) играют важную роль и в регенерации хрящевой и мягкой соединительной тканей [Devescovi V. et al. Growth factors in bone repair // La Chirurgia degli organi di movimento. - 2008. - T. 92. - №. 3. - C. 161-168; Linkhart T.A., Mohan S., Baylink D.J. Growth factors for bone growth and repair: IGF, TGFβ and BMP // Bone. - 1996. - T. 19. - №.1. - C. S1-S12]. Многие из биоактивных факторов роста и цитокинов, такие как BMP (ВМР-2, ВМР-7, ВМР-4), bFGF (pI=9,6), PDGF (pI=10,1) являются положительно заряженными (катионными) белками. Среди положительно заряженных белков есть и антибактериальные белки, например, лизоцим, которые широко используются в составе лекарственных препаратов.

Существуют методы инкапсулирования в микросферы различных биоактивных белков: ростовых факторов, ферментов, цитокинов и гормонов, благодаря которым обеспечивается пролонгированное высвобождение этих белков, что способствует ускорению регенерации той или иной ткани и придает биоматериалу другие терапевтические свойства, например, антибактериальное. Однако недостатками этих методов, например, инкапсулирования белков в процессе получения микрочастиц методами одноэтапного или многоэтапного эмульгирования или распылительного высушивания, является использование агрессивных реакционных сред, органических растворителей, жестких физических условий (высокой скорости перемешивания, высокого давления, повышенной температуры), что приводит к снижению биоактивности инкапсулированных белков из-за воздействия на их макромолекулярную структуру или вообще ограничивает использования биоактивных белков, особенно чувствительных к внешним воздействиям.

Пористые микросферы, в т.ч. содержащие биоактивные белки, используют во многих работах для регенерации различных тканей, например, костной, а также для терапии различных заболеваний.

Из уровня техники известен биоматериал на основе пористых керамических микросфер из ортофосфата магния и гидроксиапатита в альгинатном гидрогеле, предназначенный для замещения дефектов при различных костных патологиях и регенерации костной ткани [RU 2497548, 10.11.2013]. Заявлено что биоматериал биосовместим, обладает способностью к полной биодеградации, остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами. Недостатками этого способа является использование в качестве основного материала кальцийфосфатной керамики, которая обладает недостаточно хорошей способностью к биодеструкции и биосовместимостью, а также ограничивает использование этого биоматериала только для регенерации костной ткани, недостаточно высокую пористость (40-75%), которая препятствует диффузии веществ, прорастанию клеток и биодеградации, и отсутствие терапевтического действия за счет высвобождения биологически активных веществ.

Из уровня техники известен биоматериал на основе многослойных микрочастиц сложного состава: β-трикальцийфосфата (20%) и гидроксиапатита (80%), заключенных в полилактидгликолидную полимерную матрицу с добавлением во внутренний слой гиалуроновой кислоты, а во внешний слой лекарственных веществ (гидрокортизона, хлоргексидина и лидокаина) для их пролонгированного высвобождения [RU 2624873, 07.07.2017]. Биоматериал позиционируется как остеопластический, предназначенный для регенерации костной ткани, при ее повреждениях, сопровождающихся инфекционным процессом. Недостатками этого способа является использование в качестве основного материала кальцийфосфатной керамики, которая обладает недостаточно хорошей способностью к биодеструкции и биосовместимостью, а также ограничивает использование этого биоматериала только для регенерации костной ткани, неконтролируемый размер микрочастиц, малая пористость микрочастиц, которая препятствует диффузии веществ, прорастанию клеток и биодеградации, и отсутствие в составе биоматериала терапевтических белков, способных к пролонгированному высвобождению из микрочастиц.

Из уровня техники известен композиционный биоматериал, состоящий из смеси микрочастиц из ксеногенного костного коллагена I типа (0,1-15%), синтетического наноструктурного гидроксиапатита (5-20%) и желатиновых микросфер (5-10%), содержащих рекомбинантный морфогенетический фактор роста костной ткани ВМР-2 и обеспечивающих его пролонгированное высвобождение [RU 2492237, 10.09.2013]. Заявлены остеокондуктивные и остеоиндуктивные свойства этого биоматериала и его применение для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы. Недостатками этого способа является использование в качестве основного материала гидроксиапатита, который обладает недостаточно хорошей способностью к биодеструкции и биосовместимостью, а также ограничивает использование этого биоматериала только для регенерации костной ткани и ксеногенного биоматериала - коллагена, который может обладать вирусной контаминацией и вызывать иммунологические реакции, неконтролируемый размер микрочастиц, малую пористость микрочастиц, которая препятствует диффузии веществ, прорастанию клеток и биодеградации.

Из уровня техники известна фармацевтическая композиция на основе композиционных микросфер диаметром 800-900 мкм, содержащих фермент супероксиддисмутазу (10-30 мкг/мг), введенный в пористые кальций карбонатные ядра, которые заключают в свою очередь в альгинатные микрокапсулы, что обеспечивает пролонгированное высвобождение биоактивного белка при пероральном введении этого препарата [RU 2583923, 10.05.2016]. Недостатками этого способа является использование в качестве носителя для белка карбоната кальция, что ограничивает использование этой композиции только при пероральном введении, использование метода инкапсулирования белка в ходе формирования микрочастиц носителя с применением органического растворителя (ацетона) и повышенных температур (50°C), что может приводить к изменению макромолекулярной структуры фермента и потери его активности, а также неконтролируемое быстрое высвобождение белка из микросфер - 60% за 24 часа.

Наиболее близким к заявляемому решению является биополимерный материал на основе пористых матриксов из поли-3-оксибутирата (ПОБ) и его сополимера с полиэтиленгликолем, полученных микробиологическим биосинтезом, которые были изготовлены методом выщелачивания с использованием газообразователя карбоната аммония, способных к адсорбции отрицательно-заряженного белка - бычьего сывороточного альбумина [Bonartsev А.Р. et al. Adhesion and growth of bone marrow mesenchymal stem cells on 3D scaffolds from poly(3-hydroxybutyrate)-poly(ethylene glycol) copolymer. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, 2016, 6(1), 42-52]. Однако в связи с тем, что поверхность ПОБ и его сополимеров имеет отрицательный заряд, как и альбумин, то адсорбция белка происходила за счет гидрофобных взаимодействия белка с полимерной поверхностью пористого матрикса, чем объясняется большая доля необратимо сорбированного белка - более 30%, что препятствует использованию этого материала для доставки чувствительных к внешним воздействиям биологически активных белков. В этой работе данный биополимерный материал был использован как носитель для культивирования на нем мезенхимальных стволовых клеток [Bonartsev А.Р., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Makhina Т.K., Zernov A.L., Kudryashova K.S., Feofanov A.V., Akulina E.A., Ivanova E.V., Zhuikov V.A., Volkov A.V., Andreeva N.V., Voinova V.V., Bonartseva G.A., Shaitan K.V., Kirpichnikov M.P. Adhesion and growth of bone marrow mesenchymal stem cells on 3D scaffolds from poly(3-hydroxybutyrate)-poly(ethylene glycol) copolymer. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, 2016, 6(1), 42-52].

Раскрытие изобретения

Технической задачей данного изобретения является получение материала в виде микросфер с высокой пористостью на основе поли-3-оксибутирата или его сополимера с 3-оксивалератом, с 4-метил-3-оксивалератом или полиэтиленгликолем или их композитов различного состава, полученных методом бактериального биосинтеза, обладающих свойствами биосовместимости и биодеградации, обладающих способностью к контролируемой сорбции и последующего пролонгированного высвобождения положительно заряженного терапевтического белка при введении микросфер в различные ткани, что может быть использовано в регенеративной медицине для длительной терапии повреждений различных тканей, вызванных различными патологиями, например, для регенерации повреждений костной ткани, осложненных инфекцией, и для лечения других заболеваний.

Поставленная техническая задача решается путем использования в качестве такого материала микросфер на основе поли-3-оксибутирата, которые характеризуются тем, что имеют средний диаметр от 10 до 1000 мкм, обладают сквозной системой пор с высокой общей пористостью от 75 до 99% и заданным средним размером пор от 0,5 до 20 мкм и получены методом двухэтапного эмульгирования смеси раствора поли-3-оксибутирата или его сополимера в органическом растворителе и водного раствора порообразователя карбоната аммония в водном растворе с эмульгатором, что придает полученным микросферам большую площадь полимерной поверхности, последующей обработки микросфер раствором щелочи, их ионизации и уравновешивания в буферном растворе, что придает поверхности микросфер (как внешней, так и внутренней) свойства сорбента-катионообменника, для того чтобы микросферы были способны сорбировать из водного раствора положительно заряженные белки и затем высвобождать их длительное время с заданной кинетикой.

Изготовление биополимерного материала в форме микросфер обеспечивает удобную для средства доставки терапевтических белков форму, благодаря которой материал можно вводить парентерально инъекционным способом с помощью шприца или канюли. Сама сферическая форма микросфер, их сквозная высокая пористость и относительно малый размер пор микросфер значительно увеличивает полимерную поверхность, на которой может сорбироваться белок.

В качестве полимерного материала для изготовления микросфер использованы биоразлагаемые и биосовместимые полимеры: поли-3-оксибутират (ПОБ) и сополимер поли-3-оксибутирата с 3-оксивалератом (ПОБВ) различной молекулярной массы (от 1×10³ до 2×10⁶), а в случае сополимера - с различным содержанием мономеров 3-оксивалерата (от 0 до 30%), а также сополимеры ПОБ с 4-метил-3-оксивалератом (с содержанием 4-метил-3-оксивалерата до 5 мол. %), полиэтиленгликолем (с содержанием полиэтиленгликоля до 1 мол. %). Разработан эффективный метод контролируемого микробиологического получения биосовместимых и биоразлагаемых полимеров, относящихся к классу поли-3-оксиалканоатов. Разработанный способ биосинтеза ПОБ и его сополимеров позволяет получать полимер с заданным узким распределением молекулярной массы и с заданным мономерным составом. Для этого в ходе биосинтеза штамм-продудент биополимера Azotobacter chroococcum 7Б выращивают на питательной среде, содержащей сахарозу в качестве источника углерода, минеральные соли и дополнительный источник углерода (предшественник мономеров в составе сополимера ПОБ или регулятор молекулярной массы): ацетат натрия, соли карбоновых кислот (пропионовой, валериановой, 4-метилвалериановой) и полиэтиленгликоля 300 в определенной концентрации, а также при различной рН среды и при различном уровне аэрации [Патент РФ №2194759, 20.12.2002; Патент РФ №2201453, 27.03.2003; Патент РФ №2307159, 27.09.2007; Bonartsev А.Р., Zharkova П., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina Т.K., Voinova V.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47(2), 173-184; Бонарцев А.П., Бонарцева Г.А., Шайтан K.B., Кирпичников М.П. Поли-3-оксибутират и биополимерные системы на его основе. Биомедицинская химия, 2011 г., т. 57, вып. 4, стр. 374-391].

Использование этих биополимеров для разработки новых лекарственных форм представляется многообещающим, ввиду его уникальных свойств: высокой биосовместимости с тканями и органами человека, способности к полному биоразложению с образованием нетоксичных продуктов, а также способности к образованию полимерной поверхности со слабым отрицательным зарядом за счет экспонирования карбоксильных групп, что позволяет придать ей свойства сорбента-катионообменника для положительно заряженных белков [Бонарцев А.П., Бонарцева Г.А., Шайтан К.В., Кирпичников М.П. Поли-3-оксибутират и биополимерные системы на его основе. Биомедицинская химия, 2011 г., т. 57, вып. 4, стр. 374-391].

Микросферы, содержащие терапевтический белок и способные к его пролонгированному высвобождению готовят в 3 этапа. На 1-ом этапе изготавливают сами пористые полимерные микросферы. Для этого готовят раствор полимеров бактериального поли-3-оксиалканоата (ПОА) - поли-3-оксибутирата или его сополимера с 3-оксивалератом (с содержанием 3-оксивалерата до 30 мол. %), с 4-метил-3-оксивалератом (с содержанием 4-метил-3-оксивалерата до 5 мол. %), полиэтиленгликолем (с содержанием полиэтиленгликоля до 1 мол. %) или их смесей в различных соотношениях (по весу) в хлороформе в общей концентрации полимера от 50 до 200 мг/мл (вес./об.). Готовят 4-10% (вес./об.) суспензию карбоната аммония в воде и гомогенизируют ее на роторном гомогенизаторе до достижения стабильной суспензии (приблизительно 5±1 минут при 15000±2000 об/мин), после чего переносят ее полностью в стеклянный стакан с раствором ПОА в хлороформе (концентрация 25-150 мг/мл), при соотношении растворов 2:3±1. После чего гомогенизируют еще 20±5 минут при 15000±2000 об/мин. Затем готовят в стеклянном стакане 1±0,5% (вес./об.) раствор поливинилового спирта (ПВС) в дистиллированной воде, с помощью верхнеприводной мешалки с перемешивающим элементом пропеллерного типа перемешивают раствор при скорости от 250 до 1000 об/мин. Полученную сложную коллоидную смесь по каплям добавляют в раствор ПВС при постоянном перемешивании, при этом на 1 часть эмульсии берут 10±1 частей раствора поливинилового спирта. Перемешивание проводят до полного испарения хлороформа (более 3±0,5 часов). Затем перемещают стакан на магнитную мешалку с подогревом и перемешивают еще 35±5 мин при температуре 35±5°C для полного разложения порообразователя и выхода газов, а также для дополнительной отгонки хлороформа. Затем жидкость, содержащую сформированные полимерные микросферы, центрифугируют на настольной центрифуге при 500±100 об/мин для отделения микросфер от раствора эмульгатора ПВС, супернатант максимально отбирают. Полученные микросферы промывают от эмульгатора и других примесей 3-4 раза дистиллированной водой. Промытые микросферы замораживают в жидком азоте и лиофилизируют с помощью лиофильной сушилки. Полученные микросферы просеивают через лабораторные сита У1-ЕСЛ с тканью из сетки по ГОСТ 6613-86 с размером ячеек 40, 94 мкм, 315 или 900 мкм для дополнительного более точного разделения микросфер по их диаметру.

На втором этапе проводят модификацию поверхности пористых микросфер путем ее гидрофилизации и ионизации. Для этого сухие микросферы снова помешают в дистиллированную воду и проводят их деаэрацию при пониженном давлении, используя лиофильную сушилку до полного насыщения микросфер водой. Лишнюю воду удаляют, сливая ее через капроновый фильтр с размером ячеек 100 мкм. Готовят 133±5 мМ водный раствор NaOH (или KOH). Микросферы инкубируют в растворе 133±5 мМ NaOH (или KOH) в соотношении 1:10±1 по объему в течение 1±0,1 час при перемешивании при комнатной температуре. Раствор щелочи сливают через капроновый фильтр. Готовят фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) с конечными концентрациями солей: NaCl - 137 мМ, KCl - 2,7 мМ, NaH₂PO₄ - 10 мМ, KH₂PO₄ - 1,76 мМ, рН=7,4 и 10-кратный ФСБ. Отмывают микросферы от раствора щелочи раствором ФСБ×10, инкубируют 15±1 мин при перемешивании при комнатной температуре, после чего буферный раствор сливают через капроновый фильтр и с помощью рН-метра контролируют величину рН буферного раствора ФСБ×10. Если рН ФСБ×10 выше, чем значение 7,4, повторяют процедуру отмывки. Проводят 6-7 последовательных процедур отмывки микросфер до тех пор, пока рН ФСБ×10 после отмывки не будет равен 7,4. После отмывки микросфер проводят их ионизацию. Для этого к микросферам добавляют ФСБ×10 и инкубируют при +4±1°C в холодильной камере в течение 12±1 час. Готовят буферный раствор ФСБ 1/8 из ФСБ×10 путем разведения в 80 раз. Микросферы освобождают от ФСБ×10, сливая его через капроновый фильтр. Затем микросферы уравновешивают буфером ФСБ×1/8, для чего к микросферам добавляют буферный раствор ФСБ×1/8 в соотношении 1:10±1 по объему, переносят вместе с буфером в диализный мешок с размером пор 3,2 кДа, оснащенный зажимами. В стеклянный стакан наливают буферный раствор ФСБ×1/8, помещают в него диализный мешок, содержащий микросферы, и инкубируют в течение 6±1 час при температуре +4±1°C на магнитной мешалке. Через указанное время буферный раствор сливают и заменяют новым ФСБ×1/8. Помещают в него диализный мешок, содержащий микросферы, и снова инкубируют в течение 6±1 час при температуре +4±1°C на магнитной мешалке. После инкубации микросферы переносят из диализного мешка в пробирку и хранят при температуре +4°C в ФСБ×1/8 до проведения процедуры иммобилизации белка.

На микросферах диаметром 5 мкм с помощью метода лазерного светорассеивания было показано, что их обработка NaOH приводит к увеличению отрицательного поверхностного заряда микросфер (дзета-потенциала) с -0,8 мВ до -12,4 мВ. Такая обработка микросфер приводит к увеличению сорбционной емкости микросфер за счет придания полимерной поверхности микросфер свойств сорбента-катионообменника по отношению к положительно-заряженного белку-стандарту лизоциму в 23 раза с 0,5 мг/100 мг микросфер до 11,5 мг/100 мг микросфер, а также снижению доли необратимо адсорбированного белка почти в 7 раз с 38% до 5,5%. Кроме того, преимуществом этого способа является то, что для иммобилизации белка в микросферах не используют никаких дополнительных веществ, а также не применяются жесткие условия воздействия на них (высокая температура, давление, воздействие электромагнитного излучения и др.), которые могут ухудшить биосовместимость поли-3-оксибутирата или его сополимера.

На третьем этапе проводят иммобилизацию положительно заряженного белка. Сливают ФСБ×1/8, в котором находились микросферы. Затем к микросферам добавляют предварительно подготовленный белок путем уравновешивания с помощью диализа в том же буферном растворе ФСБ×1/8. Инкубируют 1±0,1 час при перемешивании при +4±1°C. Такая процедура обеспечивает последующее пролонгированное высвобождение 50% сорбированного на микросферах белка в модельной среде - однократном фосфатно-солевом буфере в течение 13.5 суток при смене буфера для инкубации каждые 12 часов.

Краткое описание чертежей

Предложенное изобретение характеризуется следующими графическими материалами.

На Фиг. 1 представлено фото пористой микросферы из поли-3-оксибутирата, полученное на сканирующем электронном микроскопе при разном увеличении. Видно, что микросферы обладают разветвленной сложной пористой структурой высокой пористости со сквозными порами размером от 2-3 мкм не только на их поверхности, но и в объеме. Пористые микросферы из примера 1 (сканирующая электронная микроскопия, а - ув. ×200, б - ув. ×2000, в - ув. ×5000).

На Фиг. 2 представлен график кинетики высвобождения положительно-заряженного белка, лизоцима, из микросфер из примера 1, обработанных по способу из примера 2 и сорбирующих белок по способу из примера 3, способные к связыванию 5,3 мг лизоцима при инкубации в растворе этого белка в однократном фосфатно-солевом буфере с концентрацией 1 мг/мл при комнатной температуре в течение 1 часа, что обеспечивает последующее пролонгированное высвобождение 50% сорбированного на микросферах белка в модельной среде - однократном фосфатно-солевом буфере в течение 13.5 суток.

Осуществление изобретения

Используемые для получения микросфер биоразлагаемые и биосовместимые полимеры: поли-3-оксибутират (ПОБ) и сополимер ПОБ с 3-оксивалератом (ПОБВ) различной молекулярной массы (от 1×10⁴ до 1×10⁶), а в случае сополимера - с различным содержанием мономеров 3-оксивалерата (от 0 до 30%), а также сополимер ПОБ с 4-метил-3-оксивалератом, и сополимер ПОБ с полиэтиленгликолем были получены методом контролируемого биосинтеза с использованием высокоэффективного штамма-продуцента Azotobacter chroococcum 7Б [Патент РФ №2194759, 20.12.2002; Патент РФ №2201453, 27.03.2003; Патент РФ №2307159, 27.09.2007; Bonartsev А.Р., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina Т.K., Voinova V.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47(2), 173-184]. Все остальные используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°C. Диаметр полученных микросфер, размер пор и пористость контролировали с помощью сканирующей электронной микроскопии с использованием электронного микроскопа JSM-6380LA (Jeol, Япония) с предварительным напылением золота на исследуемые образцы в течение 15 мин с помощью установки IB-3 (Giko, Japan) при силе тока 15 мА и программы обработки изображений ImageJ. Сорбционную емкость по отношению к положительно-заряженному белку-стандарту, лизоциму, а также кинетику высвобождения этого белка из микросфер определяли при помощи спектрофотометрического метода при длине волны 280 нм на спектрофотометре UV-1601PC (Shimadzu, Япония). Термины: «биосовместимый», «биоразлагаемый», «сорбент», «катионообменник», «емкость сорбента», «обратимая сорбция белка», «необратимая сорбция белка», «высвобождение белка» употребляются в соответствии с их общепринятыми определениями [Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1985; Биосовместимые материалы: Учебное пособие / Под. ред. В.И. Севостьянова, М.П. Кирпичникова. Москва. Медицинское информационное агентство, 2011, 540 стр.].

Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, которые не являются единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.

Пример 1.

Способ получения пористых полимерных микросфер состоит из нескольких последовательных этапов. Готовят раствор поли-3-оксибутирата с молекулярной массой 3.55×10⁵, полученного бактериальным биосинтезом, в хлороформе в общей концентрации 112,5 мг/мл (вес./об.) в объеме 8 мл в стеклянном стакане на 50 мл, для чего готовят навеску в 90 мг. Готовят 100 мл 1% (вес./об.) раствора ПВС в дистиллированной воде в стеклянном стакане на 200 мл. Помещают диспергирующий элемент роторного гомогенизатора Т 25 digital Ultra-Turrax в стеклянный стакан на 50 мл. Стеклянной пипеткой на 10 мл переносят 8 мл раствора ПОБ в хлороформе с концентрацией 112 мг/мл в стеклянный стакан. В это время готовят 5% (вес./об.) суспензию карбоната аммония в воде в объеме 4,4 мл в стеклянном стакане на 50 мл и переносят ее полностью стеклянной пипеткой на 10 мл в стеклянный стакан с раствором ПОБ в хлороформе. После чего гомогенизируют эту смесь 15 минут при 15000 об/мин до получения стойкой водно-масляной эмульсии. Помещают перемешивающий элемент пропеллерного типа верхнеприводной мешалки R2R 2021 в стакан на 200 мл, содержащий 100 мл раствора ПВС, таким образом, чтобы перемешивающий элемент располагался в жидкости примерно в центре стакана и примерно на равном расстоянии от дна стакана и поверхности жидкости. Затем полученную в результате гомогенизации сложную коллоидную смесь по каплям добавляют в раствор ПВА при постоянном перемешивании на верхнеприводной мешалке R2R 2021 при скорости 450 об/мин. Перемешивание проводят более 3 часов до полного испарения хлороформа. Затем перемещают стакан на магнитную мешалку MSH-300 с подогревом и перемешивают еще 30 мин при температуре 60°C для полного разложения порообразователя и выхода газов, а также для дополнительной отгонки хлороформа. Затем жидкость, содержащую сформированные полимерные микросферы, центрифугируют на настольной центрифуге 5804R при 500 об/мин для отделения микросфер от раствора эмульгатора ПВС в стаканах для центрифугирования на 20 мл, супернатант максимально отбирают. Затем добавляют к осажденным микросферам 20 мл дистиллированной воды и с помощью центрифугирования их промывают от эмульгатора и других примесей 3-4 раза. Промытые микросферы замораживают в жидком азоте, переносят в стеклянные колбы на 100 мл и лиофилизируют, используя лиофильную сушилку Freeze dryer ALPHA 1-2 LDplus. Полученные микросферы просеивают через лабораторные сита У1-ЕСЛ с тканью из сетки по ГОСТ 6613-86 с размером ячеек 94 мкм и 900 мкм. В дальнейшем используют те микросферы, которые не прошли через сита с размером ячеек 94 мкм и прошли через сита с размером ячеек 900 мкм.

Получили микросферы со средним диаметром 560±170 мкм, обладающие сквозной пористостью с пренебрежительно малой долей закрытых пор, общую пористость 93% и средним размером пор 2,6±0,6 мкм (Фиг. 1).

Пример 2.

Способ обработки микросфер из примера 1, состоящий из нескольких последовательных этапов: 1) инкубации микросфер в 133 мМ водном растворе NaOH в соотношении 1:10 по объему в течение 1 часа при перемешивании при комнатной температуре; 2) отмывки микросфер и их инкубации в 10-кратном фосфатно-солевом буфере при +4°C в течение 12 час для ионизации их полимерной поверхности; 3) двукратной последовательной инкубации микросфер в 0.125-кратном фосфатно-солевом буфере в соотношении 1:10 по объему с помощью диализа при +4°C в течение 6 часов для уравновешивания полимерных микросфер в буферном растворе и придания полимерной поверхности микросфер свойств сорбента-катионообменника, обладающего сорбционной емкостью по отношению к положительно-заряженному белку-стандарту, лизоциму - 11,5 мг лизоцима на 100 мг микросфер (сух.вес.) с долей необратимо сорбированного белка - 5,5% (вес).

Пример 3.

Микросферы из примера 1, обработанные способом, описанном в примере 2, способные к связыванию 5,3 мг лизоцима при инкубации в растворе этого белка в однократном фосфатно-солевом буфере с концентрацией 1 мг/мл при комнатной температуре в течение 1 часа, что обеспечивает последующее пролонгированное высвобождение 50% сорбированного на микросферах белка в модельной среде - однократном фосфатно-солевом буфере в течение 23 суток (Фиг. 2).

Claims

1. Пористые биополимерные микросферы для применения в качестве носителя для положительно заряженных терапевтических белков, характеризующиеся тем, что они обладают свойствами сорбента-катионообменника, выполнены из биосовместимого и биодеградируемого полимера, имеют средний диаметр в диапазоне от 10 до 1000 мкм, имеют сквозную систему пор с общей пористостью от 75 до 99% и средним размером пор от 0,5 до 20 мкм, при этом биосовместимый и биодеградируемый полимер имеет молекулярную массу от 1×10⁴ до 1×10⁶ Да, получен методом бактериального синтеза и представляет собой поли-3-оксибутират.

2. Способ получения микросфер по п.1, включающий:

- эмульгирование водного раствора карбоната аммония в растворе поли-3-оксибутирата в хлороформе до получения стойкой эмульсии;

- смешение полученной эмульсии с водным раствором поливинилового спирта с последующим эмульгированием полученной водно-масляной эмульсии посредством ее перемешивания при комнатной температуре до формирования биополимерных микросфер с продолжением процесса перемешивания до полного прекращения выделения газов;

- выделение микросфер из водно-масляной эмульсии центрифугированием;

- промывание микросфер от остатков эмульгатора поливинилового спирта;

- лиофилизация полученных микросфер с их разделением по размеру и обработка поверхности микросфер водным раствором щелочи с последующей ее ионизацией и уравновешиванием в буферном растворе для увеличения ее сорбционной емкости.

3. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что используют водный раствор карбоната аммония с концентрацией от 4 до 10 мас.% и раствор поли-3-оксибутирата в хлороформе с концентрацией от 25 до 150 мг/мл, при этом соотношение указанных растворов по объему составляет соответственно 2:3±1.

4. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что при смешении эмульсии с водным раствором поливинилового спирта их берут в соотношении по объему соответственно 1:10±1.

5. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что эмульгирование водного раствора карбоната аммония проводят с помощью роторного гомогенизатора при 15000±2000 об/мин в течение 20±5 мин.

6. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что используют 1±0,5 об.% водный раствор поливинилового спирта.

7. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что перемешивание водно-масляной эмульсии осуществляют с помощью верхнеприводной мешалки с перемешивающим элементом пропеллерного типа при скорости от 250 до 1000 об/мин в течение 3±0,5 часов.

8. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что перемешивание для удаления газов осуществляют с помощью магнитной мешалки с подогревом при температуре 35±5°С в течение 35±5 мин.

9. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что выделение микросфер из водно-масляной эмульсии осуществляют центрифугированием при 500±100 об/мин в течение 10±1 мин.

10. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что разделение микросфер по размеру осуществляют через сита с размером ячеек 40 мкм, 94 мкм, 315 мкм или 900 мкм.

11. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что обработку поверхности микросфер осуществляют посредством инкубации микросфер в 133±5 мМ водном растворе NaOH или KOH в соотношении по объему соответственно 1:10±1 в течение 1±0,1 часа при перемешивании при комнатной температуре с последующей отмывкой микросфер 10-кратным фосфатно-солевым буфером и ионизацией поверхности микросфер с помощью инкубации в фосфатно-солевом буфере; после чего осуществляют инкубацию микросфер в фосфатно-солевом буфере для уравновешивания поверхности микросфер и придания микросферам свойств сорбента-катионообменника, обладающего емкостью по отношению к катионному белку-стандарту - лизоциму не менее 5 мг лизоцима на 100 мг микросфер с долей необратимо сорбированного белка менее 10 вес.%.

12. Способ по п.11, характеризующийся тем, что ионизацию поверхности микросфер осуществляют путем инкубации в 10-кратном фосфатно-солевом буфере при +4±1°С в течение 12±1 часов.

13. Способ по п.11, характеризующийся тем, что уравновешивание поверхности микросфер осуществляют путем по меньшей мере двукратной последовательной инкубации микросфер в 0,125-кратном фосфатно-солевом буфере в соотношении по объему соответственно 1:10±1 с помощью диализа при +4±1°С в течение 6±1 часов.

14. Применение микросфер по п.1, полученных способом по п.2, для связывания с положительно заряженными терапевтическими белками.

15. Применение по п.14, характеризующееся тем, что в качестве положительно заряженных терапевтических белков используют лизоцим, различные типы костного морфогенетического белка, фактора роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста.

16. Способ получения пористых биополимерных микросфер с положительно заряженным терапевтическим белком с обеспечением его контролируемого высвобождения при введении в организм, включающий инкубацию микросфер по п.1, полученных способом по п.2, в растворе положительно заряженного терапевтического белка в однократном фосфатно-солевом буфере с концентрацией от 10 мкг/мл до 10 мг/мл при постоянном перемешивании с содержанием микросфер 10±1 мг/мл при комнатной температуре в течение 1±0,1 часа.