RU2692768C1 - Пористые биополимерные микросферы для контролируемого высвобождения положительно заряженных белков и способ получения микросфер - Google Patents
Пористые биополимерные микросферы для контролируемого высвобождения положительно заряженных белков и способ получения микросфер Download PDFInfo
- Publication number
- RU2692768C1 RU2692768C1 RU2017147026A RU2017147026A RU2692768C1 RU 2692768 C1 RU2692768 C1 RU 2692768C1 RU 2017147026 A RU2017147026 A RU 2017147026A RU 2017147026 A RU2017147026 A RU 2017147026A RU 2692768 C1 RU2692768 C1 RU 2692768C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microspheres
- positively charged
- producing
- aqueous solution
- solution
- Prior art date
Links
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 116
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 title claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 9
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 31
- 229920000070 poly-3-hydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 29
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 15
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 13
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 13
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 10
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 9
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 9
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 9
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 7
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 6
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 claims description 5
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 claims description 5
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 claims description 3
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 2
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 claims description 2
- 239000002569 water oil cream Substances 0.000 claims 3
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 claims 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 16
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 16
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 15
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCC(O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 11
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 10
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 10
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 5
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589152 Azotobacter chroococcum Species 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 3
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical group [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 3
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004604 Blowing Agent Substances 0.000 description 2
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 description 2
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000004068 calcium phosphate ceramic Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000000278 osteoconductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane-2,5-dione Chemical compound O=C1COC(=O)CO1 RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOAHYOWLXYZJSN-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C(O)CC(O)=O BOAHYOWLXYZJSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical compound CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010001488 Aggression Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061363 Skeletal injury Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001734 carboxylic acid salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229940068886 polyethylene glycol 300 Drugs 0.000 description 1
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, в частности к пористым биополимерным микросферам для применения в качестве носителя для положительно заряженных терапевтических белков. Предложенные микросферы обладают свойствами сорбента-катионообменника, выполнены из биосовместимого и биодеградируемого полимера, имеют средний диаметр в диапазоне от 10 до 1000 мкм, имеют сквозную систему пор с общей пористостью от 75 до 99% и средним размером пор от 0,5 до 20 мкм, при этом биосовместимый и биодеградируемый полимер имеет молекулярную массу от 1×10до 1×10Да, получен методом бактериального синтеза и представляет собой поли-3-оксибутират. Также предложены: способ получения таких микросфер, их применение для связывания с положительно заряженными терапевтическими белками и способ получения пористых биополимерных микросфер с положительно заряженным терапевтическим белком. Группа изобретений обеспечивает получение материала в виде микросфер с высокой пористостью, обладающих способностью к контролируемой сорбции и последующему пролонгированному высвобождению положительно заряженного терапевтического белка. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биоразлагаемых и биосовместимых полимерных материалов, предназначенных для использования в медицине, обладающих дополнительным терапевтическим эффектом за счет контролируемого высвобождения терапевтических белков, которые могут быть использованы в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, реконструктивно-восстановительной хирургии, косметологии, стоматологии для восстановления дефектов различных тканей, а также в качестве средства доставки лекарственных веществ, предназначенных для длительной терапии повреждений костной, хрящевой и мягкой соединительной тканей, вызванных различными патологиями, например, для регенерации повреждений костной ткани, осложненных инфекцией.
Уровень техники
Микросферы различного диаметра широко используются в качестве материалов медицинского назначения для восстановления дефектов различных тканей, прежде всего костной, хрящевой и мягкой соединительной, вызванных различными заболеваниями: наследственными патологиями, травмами, инфекциями, хроническими воспалениями, опухолевыми заболеваниями, а также в косметических целях. Однако недостатками таких материалов часто являются недостаточная совместимость с окружающими тканями, неспособность к биоразложению с заданными сроками и отсутствие длительного терапевтического воздействия на область дефекта ткани с целью ее регенерации.
Пролонгированная доставка лекарственных веществ в организм в требуемых дозах позволяет устранить многие недостатки традиционных лекарственных форм, в т.ч. при стимуляции регенерации различных тканей. Такими недостатками, чаще всего, являются повышенная токсичность и нестабильность физиологически активного вещества, неравномерная скорость его подачи, неэффективный расход действующего начала и др. Лекарственные вещества могут быть инкапсулированы в микрочастицы на основе различных биоматериалов с помощью различных известных способов. При введении в организм микрочастицы за счет диффузионных и биодеструктивных механизмов высвобождают лекарственные вещества в течение длительного времени, что обеспечивает продолжительное поддержание терапевтических концентраций лекарственных веществ в крови при системном введении или локально в ткани или органе при местном введении. Тем самым устраняется необходимость многократных инъекций препаратов, снижается их токсичность и побочное действие, повышается эффективность терапии.
Так, различные факторы роста играют большую роль в регенерации костной ткани. В настоящее время костный морфогенетический белок (BMP) (ВМР-2 и ВМР-7) клинически одобрен для применения у пациентов. Другие факторы роста и цитокины, в том числе ВМР-4, трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), сосудистый фактора роста (VEGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), и стромальный ростовой фактор (SDF1) также имеют важное значение для формирования костей. Ростовые факторы и цитокины (в т.ч. перечисленные) играют важную роль и в регенерации хрящевой и мягкой соединительной тканей [Devescovi V. et al. Growth factors in bone repair // La Chirurgia degli organi di movimento. - 2008. - T. 92. - №. 3. - C. 161-168; Linkhart T.A., Mohan S., Baylink D.J. Growth factors for bone growth and repair: IGF, TGFβ and BMP // Bone. - 1996. - T. 19. - №.1. - C. S1-S12]. Многие из биоактивных факторов роста и цитокинов, такие как BMP (ВМР-2, ВМР-7, ВМР-4), bFGF (pI=9,6), PDGF (pI=10,1) являются положительно заряженными (катионными) белками. Среди положительно заряженных белков есть и антибактериальные белки, например, лизоцим, которые широко используются в составе лекарственных препаратов.
Существуют методы инкапсулирования в микросферы различных биоактивных белков: ростовых факторов, ферментов, цитокинов и гормонов, благодаря которым обеспечивается пролонгированное высвобождение этих белков, что способствует ускорению регенерации той или иной ткани и придает биоматериалу другие терапевтические свойства, например, антибактериальное. Однако недостатками этих методов, например, инкапсулирования белков в процессе получения микрочастиц методами одноэтапного или многоэтапного эмульгирования или распылительного высушивания, является использование агрессивных реакционных сред, органических растворителей, жестких физических условий (высокой скорости перемешивания, высокого давления, повышенной температуры), что приводит к снижению биоактивности инкапсулированных белков из-за воздействия на их макромолекулярную структуру или вообще ограничивает использования биоактивных белков, особенно чувствительных к внешним воздействиям.
Пористые микросферы, в т.ч. содержащие биоактивные белки, используют во многих работах для регенерации различных тканей, например, костной, а также для терапии различных заболеваний.
Из уровня техники известен биоматериал на основе пористых керамических микросфер из ортофосфата магния и гидроксиапатита в альгинатном гидрогеле, предназначенный для замещения дефектов при различных костных патологиях и регенерации костной ткани [RU 2497548, 10.11.2013]. Заявлено что биоматериал биосовместим, обладает способностью к полной биодеградации, остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами. Недостатками этого способа является использование в качестве основного материала кальцийфосфатной керамики, которая обладает недостаточно хорошей способностью к биодеструкции и биосовместимостью, а также ограничивает использование этого биоматериала только для регенерации костной ткани, недостаточно высокую пористость (40-75%), которая препятствует диффузии веществ, прорастанию клеток и биодеградации, и отсутствие терапевтического действия за счет высвобождения биологически активных веществ.
Из уровня техники известен биоматериал на основе многослойных микрочастиц сложного состава: β-трикальцийфосфата (20%) и гидроксиапатита (80%), заключенных в полилактидгликолидную полимерную матрицу с добавлением во внутренний слой гиалуроновой кислоты, а во внешний слой лекарственных веществ (гидрокортизона, хлоргексидина и лидокаина) для их пролонгированного высвобождения [RU 2624873, 07.07.2017]. Биоматериал позиционируется как остеопластический, предназначенный для регенерации костной ткани, при ее повреждениях, сопровождающихся инфекционным процессом. Недостатками этого способа является использование в качестве основного материала кальцийфосфатной керамики, которая обладает недостаточно хорошей способностью к биодеструкции и биосовместимостью, а также ограничивает использование этого биоматериала только для регенерации костной ткани, неконтролируемый размер микрочастиц, малая пористость микрочастиц, которая препятствует диффузии веществ, прорастанию клеток и биодеградации, и отсутствие в составе биоматериала терапевтических белков, способных к пролонгированному высвобождению из микрочастиц.
Из уровня техники известен композиционный биоматериал, состоящий из смеси микрочастиц из ксеногенного костного коллагена I типа (0,1-15%), синтетического наноструктурного гидроксиапатита (5-20%) и желатиновых микросфер (5-10%), содержащих рекомбинантный морфогенетический фактор роста костной ткани ВМР-2 и обеспечивающих его пролонгированное высвобождение [RU 2492237, 10.09.2013]. Заявлены остеокондуктивные и остеоиндуктивные свойства этого биоматериала и его применение для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы. Недостатками этого способа является использование в качестве основного материала гидроксиапатита, который обладает недостаточно хорошей способностью к биодеструкции и биосовместимостью, а также ограничивает использование этого биоматериала только для регенерации костной ткани и ксеногенного биоматериала - коллагена, который может обладать вирусной контаминацией и вызывать иммунологические реакции, неконтролируемый размер микрочастиц, малую пористость микрочастиц, которая препятствует диффузии веществ, прорастанию клеток и биодеградации.
Из уровня техники известна фармацевтическая композиция на основе композиционных микросфер диаметром 800-900 мкм, содержащих фермент супероксиддисмутазу (10-30 мкг/мг), введенный в пористые кальций карбонатные ядра, которые заключают в свою очередь в альгинатные микрокапсулы, что обеспечивает пролонгированное высвобождение биоактивного белка при пероральном введении этого препарата [RU 2583923, 10.05.2016]. Недостатками этого способа является использование в качестве носителя для белка карбоната кальция, что ограничивает использование этой композиции только при пероральном введении, использование метода инкапсулирования белка в ходе формирования микрочастиц носителя с применением органического растворителя (ацетона) и повышенных температур (50°C), что может приводить к изменению макромолекулярной структуры фермента и потери его активности, а также неконтролируемое быстрое высвобождение белка из микросфер - 60% за 24 часа.
Наиболее близким к заявляемому решению является биополимерный материал на основе пористых матриксов из поли-3-оксибутирата (ПОБ) и его сополимера с полиэтиленгликолем, полученных микробиологическим биосинтезом, которые были изготовлены методом выщелачивания с использованием газообразователя карбоната аммония, способных к адсорбции отрицательно-заряженного белка - бычьего сывороточного альбумина [Bonartsev А.Р. et al. Adhesion and growth of bone marrow mesenchymal stem cells on 3D scaffolds from poly(3-hydroxybutyrate)-poly(ethylene glycol) copolymer. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, 2016, 6(1), 42-52]. Однако в связи с тем, что поверхность ПОБ и его сополимеров имеет отрицательный заряд, как и альбумин, то адсорбция белка происходила за счет гидрофобных взаимодействия белка с полимерной поверхностью пористого матрикса, чем объясняется большая доля необратимо сорбированного белка - более 30%, что препятствует использованию этого материала для доставки чувствительных к внешним воздействиям биологически активных белков. В этой работе данный биополимерный материал был использован как носитель для культивирования на нем мезенхимальных стволовых клеток [Bonartsev А.Р., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Makhina Т.K., Zernov A.L., Kudryashova K.S., Feofanov A.V., Akulina E.A., Ivanova E.V., Zhuikov V.A., Volkov A.V., Andreeva N.V., Voinova V.V., Bonartseva G.A., Shaitan K.V., Kirpichnikov M.P. Adhesion and growth of bone marrow mesenchymal stem cells on 3D scaffolds from poly(3-hydroxybutyrate)-poly(ethylene glycol) copolymer. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, 2016, 6(1), 42-52].
Раскрытие изобретения
Технической задачей данного изобретения является получение материала в виде микросфер с высокой пористостью на основе поли-3-оксибутирата или его сополимера с 3-оксивалератом, с 4-метил-3-оксивалератом или полиэтиленгликолем или их композитов различного состава, полученных методом бактериального биосинтеза, обладающих свойствами биосовместимости и биодеградации, обладающих способностью к контролируемой сорбции и последующего пролонгированного высвобождения положительно заряженного терапевтического белка при введении микросфер в различные ткани, что может быть использовано в регенеративной медицине для длительной терапии повреждений различных тканей, вызванных различными патологиями, например, для регенерации повреждений костной ткани, осложненных инфекцией, и для лечения других заболеваний.
Поставленная техническая задача решается путем использования в качестве такого материала микросфер на основе поли-3-оксибутирата, которые характеризуются тем, что имеют средний диаметр от 10 до 1000 мкм, обладают сквозной системой пор с высокой общей пористостью от 75 до 99% и заданным средним размером пор от 0,5 до 20 мкм и получены методом двухэтапного эмульгирования смеси раствора поли-3-оксибутирата или его сополимера в органическом растворителе и водного раствора порообразователя карбоната аммония в водном растворе с эмульгатором, что придает полученным микросферам большую площадь полимерной поверхности, последующей обработки микросфер раствором щелочи, их ионизации и уравновешивания в буферном растворе, что придает поверхности микросфер (как внешней, так и внутренней) свойства сорбента-катионообменника, для того чтобы микросферы были способны сорбировать из водного раствора положительно заряженные белки и затем высвобождать их длительное время с заданной кинетикой.
Изготовление биополимерного материала в форме микросфер обеспечивает удобную для средства доставки терапевтических белков форму, благодаря которой материал можно вводить парентерально инъекционным способом с помощью шприца или канюли. Сама сферическая форма микросфер, их сквозная высокая пористость и относительно малый размер пор микросфер значительно увеличивает полимерную поверхность, на которой может сорбироваться белок.
В качестве полимерного материала для изготовления микросфер использованы биоразлагаемые и биосовместимые полимеры: поли-3-оксибутират (ПОБ) и сополимер поли-3-оксибутирата с 3-оксивалератом (ПОБВ) различной молекулярной массы (от 1×103 до 2×106), а в случае сополимера - с различным содержанием мономеров 3-оксивалерата (от 0 до 30%), а также сополимеры ПОБ с 4-метил-3-оксивалератом (с содержанием 4-метил-3-оксивалерата до 5 мол. %), полиэтиленгликолем (с содержанием полиэтиленгликоля до 1 мол. %). Разработан эффективный метод контролируемого микробиологического получения биосовместимых и биоразлагаемых полимеров, относящихся к классу поли-3-оксиалканоатов. Разработанный способ биосинтеза ПОБ и его сополимеров позволяет получать полимер с заданным узким распределением молекулярной массы и с заданным мономерным составом. Для этого в ходе биосинтеза штамм-продудент биополимера Azotobacter chroococcum 7Б выращивают на питательной среде, содержащей сахарозу в качестве источника углерода, минеральные соли и дополнительный источник углерода (предшественник мономеров в составе сополимера ПОБ или регулятор молекулярной массы): ацетат натрия, соли карбоновых кислот (пропионовой, валериановой, 4-метилвалериановой) и полиэтиленгликоля 300 в определенной концентрации, а также при различной рН среды и при различном уровне аэрации [Патент РФ №2194759, 20.12.2002; Патент РФ №2201453, 27.03.2003; Патент РФ №2307159, 27.09.2007; Bonartsev А.Р., Zharkova П., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina Т.K., Voinova V.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47(2), 173-184; Бонарцев А.П., Бонарцева Г.А., Шайтан K.B., Кирпичников М.П. Поли-3-оксибутират и биополимерные системы на его основе. Биомедицинская химия, 2011 г., т. 57, вып. 4, стр. 374-391].
Использование этих биополимеров для разработки новых лекарственных форм представляется многообещающим, ввиду его уникальных свойств: высокой биосовместимости с тканями и органами человека, способности к полному биоразложению с образованием нетоксичных продуктов, а также способности к образованию полимерной поверхности со слабым отрицательным зарядом за счет экспонирования карбоксильных групп, что позволяет придать ей свойства сорбента-катионообменника для положительно заряженных белков [Бонарцев А.П., Бонарцева Г.А., Шайтан К.В., Кирпичников М.П. Поли-3-оксибутират и биополимерные системы на его основе. Биомедицинская химия, 2011 г., т. 57, вып. 4, стр. 374-391].
Микросферы, содержащие терапевтический белок и способные к его пролонгированному высвобождению готовят в 3 этапа. На 1-ом этапе изготавливают сами пористые полимерные микросферы. Для этого готовят раствор полимеров бактериального поли-3-оксиалканоата (ПОА) - поли-3-оксибутирата или его сополимера с 3-оксивалератом (с содержанием 3-оксивалерата до 30 мол. %), с 4-метил-3-оксивалератом (с содержанием 4-метил-3-оксивалерата до 5 мол. %), полиэтиленгликолем (с содержанием полиэтиленгликоля до 1 мол. %) или их смесей в различных соотношениях (по весу) в хлороформе в общей концентрации полимера от 50 до 200 мг/мл (вес./об.). Готовят 4-10% (вес./об.) суспензию карбоната аммония в воде и гомогенизируют ее на роторном гомогенизаторе до достижения стабильной суспензии (приблизительно 5±1 минут при 15000±2000 об/мин), после чего переносят ее полностью в стеклянный стакан с раствором ПОА в хлороформе (концентрация 25-150 мг/мл), при соотношении растворов 2:3±1. После чего гомогенизируют еще 20±5 минут при 15000±2000 об/мин. Затем готовят в стеклянном стакане 1±0,5% (вес./об.) раствор поливинилового спирта (ПВС) в дистиллированной воде, с помощью верхнеприводной мешалки с перемешивающим элементом пропеллерного типа перемешивают раствор при скорости от 250 до 1000 об/мин. Полученную сложную коллоидную смесь по каплям добавляют в раствор ПВС при постоянном перемешивании, при этом на 1 часть эмульсии берут 10±1 частей раствора поливинилового спирта. Перемешивание проводят до полного испарения хлороформа (более 3±0,5 часов). Затем перемещают стакан на магнитную мешалку с подогревом и перемешивают еще 35±5 мин при температуре 35±5°C для полного разложения порообразователя и выхода газов, а также для дополнительной отгонки хлороформа. Затем жидкость, содержащую сформированные полимерные микросферы, центрифугируют на настольной центрифуге при 500±100 об/мин для отделения микросфер от раствора эмульгатора ПВС, супернатант максимально отбирают. Полученные микросферы промывают от эмульгатора и других примесей 3-4 раза дистиллированной водой. Промытые микросферы замораживают в жидком азоте и лиофилизируют с помощью лиофильной сушилки. Полученные микросферы просеивают через лабораторные сита У1-ЕСЛ с тканью из сетки по ГОСТ 6613-86 с размером ячеек 40, 94 мкм, 315 или 900 мкм для дополнительного более точного разделения микросфер по их диаметру.
На втором этапе проводят модификацию поверхности пористых микросфер путем ее гидрофилизации и ионизации. Для этого сухие микросферы снова помешают в дистиллированную воду и проводят их деаэрацию при пониженном давлении, используя лиофильную сушилку до полного насыщения микросфер водой. Лишнюю воду удаляют, сливая ее через капроновый фильтр с размером ячеек 100 мкм. Готовят 133±5 мМ водный раствор NaOH (или KOH). Микросферы инкубируют в растворе 133±5 мМ NaOH (или KOH) в соотношении 1:10±1 по объему в течение 1±0,1 час при перемешивании при комнатной температуре. Раствор щелочи сливают через капроновый фильтр. Готовят фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) с конечными концентрациями солей: NaCl - 137 мМ, KCl - 2,7 мМ, NaH2PO4 - 10 мМ, KH2PO4 - 1,76 мМ, рН=7,4 и 10-кратный ФСБ. Отмывают микросферы от раствора щелочи раствором ФСБ×10, инкубируют 15±1 мин при перемешивании при комнатной температуре, после чего буферный раствор сливают через капроновый фильтр и с помощью рН-метра контролируют величину рН буферного раствора ФСБ×10. Если рН ФСБ×10 выше, чем значение 7,4, повторяют процедуру отмывки. Проводят 6-7 последовательных процедур отмывки микросфер до тех пор, пока рН ФСБ×10 после отмывки не будет равен 7,4. После отмывки микросфер проводят их ионизацию. Для этого к микросферам добавляют ФСБ×10 и инкубируют при +4±1°C в холодильной камере в течение 12±1 час. Готовят буферный раствор ФСБ 1/8 из ФСБ×10 путем разведения в 80 раз. Микросферы освобождают от ФСБ×10, сливая его через капроновый фильтр. Затем микросферы уравновешивают буфером ФСБ×1/8, для чего к микросферам добавляют буферный раствор ФСБ×1/8 в соотношении 1:10±1 по объему, переносят вместе с буфером в диализный мешок с размером пор 3,2 кДа, оснащенный зажимами. В стеклянный стакан наливают буферный раствор ФСБ×1/8, помещают в него диализный мешок, содержащий микросферы, и инкубируют в течение 6±1 час при температуре +4±1°C на магнитной мешалке. Через указанное время буферный раствор сливают и заменяют новым ФСБ×1/8. Помещают в него диализный мешок, содержащий микросферы, и снова инкубируют в течение 6±1 час при температуре +4±1°C на магнитной мешалке. После инкубации микросферы переносят из диализного мешка в пробирку и хранят при температуре +4°C в ФСБ×1/8 до проведения процедуры иммобилизации белка.
На микросферах диаметром 5 мкм с помощью метода лазерного светорассеивания было показано, что их обработка NaOH приводит к увеличению отрицательного поверхностного заряда микросфер (дзета-потенциала) с -0,8 мВ до -12,4 мВ. Такая обработка микросфер приводит к увеличению сорбционной емкости микросфер за счет придания полимерной поверхности микросфер свойств сорбента-катионообменника по отношению к положительно-заряженного белку-стандарту лизоциму в 23 раза с 0,5 мг/100 мг микросфер до 11,5 мг/100 мг микросфер, а также снижению доли необратимо адсорбированного белка почти в 7 раз с 38% до 5,5%. Кроме того, преимуществом этого способа является то, что для иммобилизации белка в микросферах не используют никаких дополнительных веществ, а также не применяются жесткие условия воздействия на них (высокая температура, давление, воздействие электромагнитного излучения и др.), которые могут ухудшить биосовместимость поли-3-оксибутирата или его сополимера.
На третьем этапе проводят иммобилизацию положительно заряженного белка. Сливают ФСБ×1/8, в котором находились микросферы. Затем к микросферам добавляют предварительно подготовленный белок путем уравновешивания с помощью диализа в том же буферном растворе ФСБ×1/8. Инкубируют 1±0,1 час при перемешивании при +4±1°C. Такая процедура обеспечивает последующее пролонгированное высвобождение 50% сорбированного на микросферах белка в модельной среде - однократном фосфатно-солевом буфере в течение 13.5 суток при смене буфера для инкубации каждые 12 часов.
Краткое описание чертежей
Предложенное изобретение характеризуется следующими графическими материалами.
На Фиг. 1 представлено фото пористой микросферы из поли-3-оксибутирата, полученное на сканирующем электронном микроскопе при разном увеличении. Видно, что микросферы обладают разветвленной сложной пористой структурой высокой пористости со сквозными порами размером от 2-3 мкм не только на их поверхности, но и в объеме. Пористые микросферы из примера 1 (сканирующая электронная микроскопия, а - ув. ×200, б - ув. ×2000, в - ув. ×5000).
На Фиг. 2 представлен график кинетики высвобождения положительно-заряженного белка, лизоцима, из микросфер из примера 1, обработанных по способу из примера 2 и сорбирующих белок по способу из примера 3, способные к связыванию 5,3 мг лизоцима при инкубации в растворе этого белка в однократном фосфатно-солевом буфере с концентрацией 1 мг/мл при комнатной температуре в течение 1 часа, что обеспечивает последующее пролонгированное высвобождение 50% сорбированного на микросферах белка в модельной среде - однократном фосфатно-солевом буфере в течение 13.5 суток.
Осуществление изобретения
Используемые для получения микросфер биоразлагаемые и биосовместимые полимеры: поли-3-оксибутират (ПОБ) и сополимер ПОБ с 3-оксивалератом (ПОБВ) различной молекулярной массы (от 1×104 до 1×106), а в случае сополимера - с различным содержанием мономеров 3-оксивалерата (от 0 до 30%), а также сополимер ПОБ с 4-метил-3-оксивалератом, и сополимер ПОБ с полиэтиленгликолем были получены методом контролируемого биосинтеза с использованием высокоэффективного штамма-продуцента Azotobacter chroococcum 7Б [Патент РФ №2194759, 20.12.2002; Патент РФ №2201453, 27.03.2003; Патент РФ №2307159, 27.09.2007; Bonartsev А.Р., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina Т.K., Voinova V.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47(2), 173-184]. Все остальные используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°C. Диаметр полученных микросфер, размер пор и пористость контролировали с помощью сканирующей электронной микроскопии с использованием электронного микроскопа JSM-6380LA (Jeol, Япония) с предварительным напылением золота на исследуемые образцы в течение 15 мин с помощью установки IB-3 (Giko, Japan) при силе тока 15 мА и программы обработки изображений ImageJ. Сорбционную емкость по отношению к положительно-заряженному белку-стандарту, лизоциму, а также кинетику высвобождения этого белка из микросфер определяли при помощи спектрофотометрического метода при длине волны 280 нм на спектрофотометре UV-1601PC (Shimadzu, Япония). Термины: «биосовместимый», «биоразлагаемый», «сорбент», «катионообменник», «емкость сорбента», «обратимая сорбция белка», «необратимая сорбция белка», «высвобождение белка» употребляются в соответствии с их общепринятыми определениями [Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1985; Биосовместимые материалы: Учебное пособие / Под. ред. В.И. Севостьянова, М.П. Кирпичникова. Москва. Медицинское информационное агентство, 2011, 540 стр.].
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, которые не являются единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.
Пример 1.
Способ получения пористых полимерных микросфер состоит из нескольких последовательных этапов. Готовят раствор поли-3-оксибутирата с молекулярной массой 3.55×105, полученного бактериальным биосинтезом, в хлороформе в общей концентрации 112,5 мг/мл (вес./об.) в объеме 8 мл в стеклянном стакане на 50 мл, для чего готовят навеску в 90 мг. Готовят 100 мл 1% (вес./об.) раствора ПВС в дистиллированной воде в стеклянном стакане на 200 мл. Помещают диспергирующий элемент роторного гомогенизатора Т 25 digital Ultra-Turrax в стеклянный стакан на 50 мл. Стеклянной пипеткой на 10 мл переносят 8 мл раствора ПОБ в хлороформе с концентрацией 112 мг/мл в стеклянный стакан. В это время готовят 5% (вес./об.) суспензию карбоната аммония в воде в объеме 4,4 мл в стеклянном стакане на 50 мл и переносят ее полностью стеклянной пипеткой на 10 мл в стеклянный стакан с раствором ПОБ в хлороформе. После чего гомогенизируют эту смесь 15 минут при 15000 об/мин до получения стойкой водно-масляной эмульсии. Помещают перемешивающий элемент пропеллерного типа верхнеприводной мешалки R2R 2021 в стакан на 200 мл, содержащий 100 мл раствора ПВС, таким образом, чтобы перемешивающий элемент располагался в жидкости примерно в центре стакана и примерно на равном расстоянии от дна стакана и поверхности жидкости. Затем полученную в результате гомогенизации сложную коллоидную смесь по каплям добавляют в раствор ПВА при постоянном перемешивании на верхнеприводной мешалке R2R 2021 при скорости 450 об/мин. Перемешивание проводят более 3 часов до полного испарения хлороформа. Затем перемещают стакан на магнитную мешалку MSH-300 с подогревом и перемешивают еще 30 мин при температуре 60°C для полного разложения порообразователя и выхода газов, а также для дополнительной отгонки хлороформа. Затем жидкость, содержащую сформированные полимерные микросферы, центрифугируют на настольной центрифуге 5804R при 500 об/мин для отделения микросфер от раствора эмульгатора ПВС в стаканах для центрифугирования на 20 мл, супернатант максимально отбирают. Затем добавляют к осажденным микросферам 20 мл дистиллированной воды и с помощью центрифугирования их промывают от эмульгатора и других примесей 3-4 раза. Промытые микросферы замораживают в жидком азоте, переносят в стеклянные колбы на 100 мл и лиофилизируют, используя лиофильную сушилку Freeze dryer ALPHA 1-2 LDplus. Полученные микросферы просеивают через лабораторные сита У1-ЕСЛ с тканью из сетки по ГОСТ 6613-86 с размером ячеек 94 мкм и 900 мкм. В дальнейшем используют те микросферы, которые не прошли через сита с размером ячеек 94 мкм и прошли через сита с размером ячеек 900 мкм.
Получили микросферы со средним диаметром 560±170 мкм, обладающие сквозной пористостью с пренебрежительно малой долей закрытых пор, общую пористость 93% и средним размером пор 2,6±0,6 мкм (Фиг. 1).
Пример 2.
Способ обработки микросфер из примера 1, состоящий из нескольких последовательных этапов: 1) инкубации микросфер в 133 мМ водном растворе NaOH в соотношении 1:10 по объему в течение 1 часа при перемешивании при комнатной температуре; 2) отмывки микросфер и их инкубации в 10-кратном фосфатно-солевом буфере при +4°C в течение 12 час для ионизации их полимерной поверхности; 3) двукратной последовательной инкубации микросфер в 0.125-кратном фосфатно-солевом буфере в соотношении 1:10 по объему с помощью диализа при +4°C в течение 6 часов для уравновешивания полимерных микросфер в буферном растворе и придания полимерной поверхности микросфер свойств сорбента-катионообменника, обладающего сорбционной емкостью по отношению к положительно-заряженному белку-стандарту, лизоциму - 11,5 мг лизоцима на 100 мг микросфер (сух.вес.) с долей необратимо сорбированного белка - 5,5% (вес).
Пример 3.
Микросферы из примера 1, обработанные способом, описанном в примере 2, способные к связыванию 5,3 мг лизоцима при инкубации в растворе этого белка в однократном фосфатно-солевом буфере с концентрацией 1 мг/мл при комнатной температуре в течение 1 часа, что обеспечивает последующее пролонгированное высвобождение 50% сорбированного на микросферах белка в модельной среде - однократном фосфатно-солевом буфере в течение 23 суток (Фиг. 2).
Claims (21)
1. Пористые биополимерные микросферы для применения в качестве носителя для положительно заряженных терапевтических белков, характеризующиеся тем, что они обладают свойствами сорбента-катионообменника, выполнены из биосовместимого и биодеградируемого полимера, имеют средний диаметр в диапазоне от 10 до 1000 мкм, имеют сквозную систему пор с общей пористостью от 75 до 99% и средним размером пор от 0,5 до 20 мкм, при этом биосовместимый и биодеградируемый полимер имеет молекулярную массу от 1×104 до 1×106 Да, получен методом бактериального синтеза и представляет собой поли-3-оксибутират.
2. Способ получения микросфер по п.1, включающий:
- эмульгирование водного раствора карбоната аммония в растворе поли-3-оксибутирата в хлороформе до получения стойкой эмульсии;
- смешение полученной эмульсии с водным раствором поливинилового спирта с последующим эмульгированием полученной водно-масляной эмульсии посредством ее перемешивания при комнатной температуре до формирования биополимерных микросфер с продолжением процесса перемешивания до полного прекращения выделения газов;
- выделение микросфер из водно-масляной эмульсии центрифугированием;
- промывание микросфер от остатков эмульгатора поливинилового спирта;
- лиофилизация полученных микросфер с их разделением по размеру и обработка поверхности микросфер водным раствором щелочи с последующей ее ионизацией и уравновешиванием в буферном растворе для увеличения ее сорбционной емкости.
3. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что используют водный раствор карбоната аммония с концентрацией от 4 до 10 мас.% и раствор поли-3-оксибутирата в хлороформе с концентрацией от 25 до 150 мг/мл, при этом соотношение указанных растворов по объему составляет соответственно 2:3±1.
4. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что при смешении эмульсии с водным раствором поливинилового спирта их берут в соотношении по объему соответственно 1:10±1.
5. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что эмульгирование водного раствора карбоната аммония проводят с помощью роторного гомогенизатора при 15000±2000 об/мин в течение 20±5 мин.
6. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что используют 1±0,5 об.% водный раствор поливинилового спирта.
7. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что перемешивание водно-масляной эмульсии осуществляют с помощью верхнеприводной мешалки с перемешивающим элементом пропеллерного типа при скорости от 250 до 1000 об/мин в течение 3±0,5 часов.
8. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что перемешивание для удаления газов осуществляют с помощью магнитной мешалки с подогревом при температуре 35±5°С в течение 35±5 мин.
9. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что выделение микросфер из водно-масляной эмульсии осуществляют центрифугированием при 500±100 об/мин в течение 10±1 мин.
10. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что разделение микросфер по размеру осуществляют через сита с размером ячеек 40 мкм, 94 мкм, 315 мкм или 900 мкм.
11. Способ получения микросфер по п.2, характеризующийся тем, что обработку поверхности микросфер осуществляют посредством инкубации микросфер в 133±5 мМ водном растворе NaOH или KOH в соотношении по объему соответственно 1:10±1 в течение 1±0,1 часа при перемешивании при комнатной температуре с последующей отмывкой микросфер 10-кратным фосфатно-солевым буфером и ионизацией поверхности микросфер с помощью инкубации в фосфатно-солевом буфере; после чего осуществляют инкубацию микросфер в фосфатно-солевом буфере для уравновешивания поверхности микросфер и придания микросферам свойств сорбента-катионообменника, обладающего емкостью по отношению к катионному белку-стандарту - лизоциму не менее 5 мг лизоцима на 100 мг микросфер с долей необратимо сорбированного белка менее 10 вес.%.
12. Способ по п.11, характеризующийся тем, что ионизацию поверхности микросфер осуществляют путем инкубации в 10-кратном фосфатно-солевом буфере при +4±1°С в течение 12±1 часов.
13. Способ по п.11, характеризующийся тем, что уравновешивание поверхности микросфер осуществляют путем по меньшей мере двукратной последовательной инкубации микросфер в 0,125-кратном фосфатно-солевом буфере в соотношении по объему соответственно 1:10±1 с помощью диализа при +4±1°С в течение 6±1 часов.
14. Применение микросфер по п.1, полученных способом по п.2, для связывания с положительно заряженными терапевтическими белками.
15. Применение по п.14, характеризующееся тем, что в качестве положительно заряженных терапевтических белков используют лизоцим, различные типы костного морфогенетического белка, фактора роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста.
16. Способ получения пористых биополимерных микросфер с положительно заряженным терапевтическим белком с обеспечением его контролируемого высвобождения при введении в организм, включающий инкубацию микросфер по п.1, полученных способом по п.2, в растворе положительно заряженного терапевтического белка в однократном фосфатно-солевом буфере с концентрацией от 10 мкг/мл до 10 мг/мл при постоянном перемешивании с содержанием микросфер 10±1 мг/мл при комнатной температуре в течение 1±0,1 часа.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017147026A RU2692768C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Пористые биополимерные микросферы для контролируемого высвобождения положительно заряженных белков и способ получения микросфер |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017147026A RU2692768C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Пористые биополимерные микросферы для контролируемого высвобождения положительно заряженных белков и способ получения микросфер |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2692768C1 true RU2692768C1 (ru) | 2019-06-27 |
Family
ID=67038261
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017147026A RU2692768C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Пористые биополимерные микросферы для контролируемого высвобождения положительно заряженных белков и способ получения микросфер |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2692768C1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2740086C1 (ru) * | 2019-12-13 | 2021-01-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Полимерный материал (гидрогель) на основе бактериального альгината для размещения пробиотических бактерий и способ его получения |
RU2740380C1 (ru) * | 2019-12-24 | 2021-01-13 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Биоинженерная конструкция на основе бактериального альгината и пробиотических бактерий и способ ее получения |
WO2023061201A1 (zh) * | 2021-10-12 | 2023-04-20 | 北京蓝晶微生物科技有限公司 | 一种可注射聚羟基脂肪酸酯微球及其制备方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2530577C2 (ru) * | 2012-11-23 | 2014-10-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Фармацевтическая композиция из полимерных микрочастиц с модифицированной кинетикой высвобождения плохорастворимых лекарственных веществ |
-
2017
- 2017-12-29 RU RU2017147026A patent/RU2692768C1/ru active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2530577C2 (ru) * | 2012-11-23 | 2014-10-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Фармацевтическая композиция из полимерных микрочастиц с модифицированной кинетикой высвобождения плохорастворимых лекарственных веществ |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Bonartsev A. et al. 3D-Scaffolds from Poly(3-hydroxybutyrate)Poly(ethylene glycol) Copolymer for Tissue Engineering / Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, 2016, v.6, N.1, pp.42-52. * |
Bonartsev A. et al. 3D-Scaffolds from Poly(3-hydroxybutyrate)Poly(ethylene glycol) Copolymer for Tissue Engineering / Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, 2016, v.6, N.1, pp.42-52. Бонарцев А.П. и др. Биосинтез сополимера поли-3-оксибутират-со-3-окси-4-метилвалерата штаммом Azotobacter chroococcum 7Б / ACTA NATURAE, 2016, Т.8, N.3 (30), с.85-96. Vesna Milacic et al. Lysozyme release and polymer erosion behavior of injectable implants prepared from PLGA-PEG block copolymers and PLGA/PLGA-PEG blends / Pharmaceutical Research, 2014, v.31, N.2, pp.436-448. * |
Vesna Milacic et al. Lysozyme release and polymer erosion behavior of injectable implants prepared from PLGA-PEG block copolymers and PLGA/PLGA-PEG blends / Pharmaceutical Research, 2014, v.31, N.2, pp.436-448. * |
Бонарцев А.П. и др. Биосинтез сополимера поли-3-оксибутират-со-3-окси-4-метилвалерата штаммом Azotobacter chroococcum 7Б / ACTA NATURAE, 2016, Т.8, N.3 (30), с.85-96. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2740086C1 (ru) * | 2019-12-13 | 2021-01-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Полимерный материал (гидрогель) на основе бактериального альгината для размещения пробиотических бактерий и способ его получения |
RU2740380C1 (ru) * | 2019-12-24 | 2021-01-13 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Биоинженерная конструкция на основе бактериального альгината и пробиотических бактерий и способ ее получения |
WO2023061201A1 (zh) * | 2021-10-12 | 2023-04-20 | 北京蓝晶微生物科技有限公司 | 一种可注射聚羟基脂肪酸酯微球及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Barati et al. | Spatiotemporal release of BMP-2 and VEGF enhances osteogenic and vasculogenic differentiation of human mesenchymal stem cells and endothelial colony-forming cells co-encapsulated in a patterned hydrogel | |
Shen et al. | Sequential and sustained release of SDF-1 and BMP-2 from silk fibroin-nanohydroxyapatite scaffold for the enhancement of bone regeneration | |
Venkatesan et al. | Alginate composites for bone tissue engineering: A review | |
US8268344B2 (en) | Particle-containing complex porous materials | |
Wang et al. | Processing silk hydrogel and its applications in biomedical materials | |
Subhapradha et al. | Polymer coated mesoporous ceramic for drug delivery in bone tissue engineering | |
Bernhardt et al. | Proliferation and osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells on alginate–gelatine–hydroxyapatite scaffolds with anisotropic pore structure | |
Li et al. | Functional microspheres for tissue regeneration | |
US20060222680A1 (en) | Method of preparing crosslinked collagen microspheres | |
Pan et al. | Polydopamine-assisted BMP-2-derived peptides immobilization on biomimetic copolymer scaffold for enhanced bone induction in vitro and in vivo | |
Zhang et al. | An ionically crosslinked hydrogel containing vancomycin coating on a porous scaffold for drug delivery and cell culture | |
RU2692768C1 (ru) | Пористые биополимерные микросферы для контролируемого высвобождения положительно заряженных белков и способ получения микросфер | |
Zhang et al. | Porous nanofibrous scaffold incorporated with S1P loaded mesoporous silica nanoparticles and BMP-2 encapsulated PLGA microspheres for enhancing angiogenesis and osteogenesis | |
Wei et al. | Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-Printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair | |
US7524514B2 (en) | Biomimetic composition reinforced by a polyelectrolytic complex of hyaluronic acid and chitosan | |
Miszuk et al. | Elastic mineralized 3D electrospun PCL nanofibrous scaffold for drug release and bone tissue engineering | |
Yao et al. | Nanoclay-functionalized 3D nanofibrous scaffolds promote bone regeneration | |
Zheng et al. | Hyaluronic acid-based materials for bone regeneration: A review | |
Szwed-Georgiou et al. | Bioactive materials for bone regeneration: biomolecules and delivery systems | |
Wang et al. | Osteogenic growth peptide-loaded 3D-printed PCL scaffolds for the promotion of osteogenesis through the ERK pathway | |
Yang et al. | Controllable dual‐release of dexamethasone and bovine serum albumin from PLGA/β‐tricalcium phosphate composite scaffolds | |
Wu et al. | Role of hydrogels in bone tissue engineering: how properties shape regeneration | |
CN110124103B (zh) | 一种用于组织修复的活性物质缓释材料体系及其制备方法 | |
Aravamudhan et al. | Collagen nanofibril self-assembly on a natural polymeric material for the osteoinduction of stem cells in vitro and biocompatibility in vivo | |
CN114853965A (zh) | 一种具有生物活性的水凝胶材料及其制备方法和应用 |